WO2007088811A1 - バイオセンサとその製造方法 - Google Patents

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WO2007088811A1
WO2007088811A1 PCT/JP2007/051392 JP2007051392W WO2007088811A1 WO 2007088811 A1 WO2007088811 A1 WO 2007088811A1 JP 2007051392 W JP2007051392 W JP 2007051392W WO 2007088811 A1 WO2007088811 A1 WO 2007088811A1
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oxidase
film
water
biosensor
thin film
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PCT/JP2007/051392
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Inventor
Mitsuru Izumi
Hitoshi Ohnuki
Takafumi Saiki
Original Assignee
Tokyo University Of Marine Science And Technology
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/005—Enzyme electrodes involving specific analytes or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a nanosensor as a working electrode of an analyzer for electrochemically analyzing a specific organic substance contained in a sample solution, and a method for manufacturing the same.
  • the measurement method for observing the amount of current flowing to the working electrode is the electrochemical method in the sample solution. It is widely used for detecting active substances. For example, as shown in FIG. 5, from the amount of current flowing between the working electrode and the counter electrode maintained at a constant potential with respect to a reference electrode such as a saturated calomel electrode, electricity such as hydrogen peroxide and oxygen in the sample solution It is common practice to determine the concentration of chemically active substances.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram for explaining an acid reduction cycle occurring on the surface of a nanosensor when a conventional nanosensor is used for electrochemical analysis of the concentration of dalcose in a sample solution.
  • glucose oxidase is immobilized with a polymer or the like on the surface of the working electrode, and the following electrochemical reaction occurs on the surface of the working electrode.
  • glucose oxidase oxidizes glucosidase (Glucose) in the sample solution on the surface of the working electrode and changes it to gluconolactone (Gluconolactone) as shown in Chemical formula 4, and changes the glucose oxidase itself.
  • the active center changes from FAD to FADH.
  • H reacts with oxygen in the sample solution to dehydrogenate and return to FAD.
  • Oxygen (O 2) in the sample solution receives hydrogen (H 2) from FADH and receives hydrogen peroxide (HO).
  • Hydrogen peroxide (HO) is the surface of the working electrode, and hydrogen (2H +) and
  • the working electrode receives the electrons (2e_) generated by the decomposition into oxygen (O 2).
  • glucose is oxidized, and a predetermined current flows between the working electrode and the counter electrode.
  • This amount of current flowing between the working electrode and the counter electrode is proportional to the amount of glucose oxidized in a certain time, and hence the concentration of glucose contained in the sample solution. By doing so, the concentration of glucose contained in the sample solution can be obtained.
  • Patent Document 1 JP-A 62-207951
  • Patent Document 2 Japanese Patent Application No. 1-163649
  • Patent Document 3 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-108813
  • the problem to be solved is that the conventional noise sensor is difficult to eliminate the influence of contaminant components contained in the sample solution when analyzing the sample solution.
  • the biosensor according to the present invention is used as a working electrode of an analyzer for electrochemically analyzing a specific organic substance contained in a sample solution, and has a conductive base material. And an organic thin film covering the substrate, wherein the organic thin film is composed of molecules having a functional group that is positively charged in water or on the water surface.
  • This biosensor is used by holding Prussian blue (PB) and Z or Prussian white (PW) on the organic thin film.
  • PB Prussian blue
  • PW Prussian white
  • the organic thin film for example, a Langmuir 'Projet film (hereinafter referred to as “LB film”) can be used.
  • the organic thin film may hold a hydrogen peroxide-producing enzyme.
  • the peroxyhydrogen generating enzyme include glucose oxidase, ratato oxidase, galato oxidase, uric acid oxidase, ethanol oxidase, cholesterol monooxidase, glycolate oxidase, malate oxidase, and hexose oxidase.
  • the organic thin film can be formed using a cationic organic compound.
  • the anion portion of the organic compound is dissolved in water, the cationic portion is bonded to Prussian blue in water, and the one bonded to Prussian blue is dissolved in water.
  • a compound that floats and develops on the surface of water with a specific gravity smaller than that of water For example, organic compounds having octadecyltrimethylammonium 0 DA, dimethyldioctadecylammonium DODA, etc. as a cation moiety can be given.
  • the organic thin film may be a single layer or may be a laminate of two or more layers.
  • LB film may be a single layer or may be a laminate of two or more layers.
  • the method for producing a biosensor according to the present invention includes dropping a solution containing the cationic organic compound into an aqueous solution containing Prussian blue (PB) to form a molecule of the cationic organic compound on the surface of the aqueous solution. Expanding the cationic organic compound molecules to form an LB film composed of the cationic organic compound molecules on the surface of the aqueous solution, and forming a conductive substrate on the conductive substrate. And a step of contacting or laminating the LB film on the surface of the substrate by contacting the LB film.
  • PB Prussian blue
  • the base material on which the Langmuir'Blodgett film is accumulated is immersed in an aqueous solution of hydrogen peroxide generating hydrogen peroxide to generate hydrogen peroxide in the Langmuir's mouth jet film.
  • Examples of the hydrogen peroxide generating enzyme include glucose oxidase, ratato oxidase, galactose oxidase, uric acid oxidase, ethanol oxidase, cholesterol oxidase, glycolate oxidase, malate oxidase, hexose oxidase.
  • the LB film can be formed using a cationic organic compound.
  • the cations When the organic organic compound is dropped into water, the cation part of the compound is dissolved in water, the cationic part is bonded to Prussian blue in water, and the compound bonded to Prussian blue is not dissolved in water.
  • Examples thereof include organic compounds having cation moiety such as Octadecyltrimethylammonium ODA and Dimethyldioctadecylammonium DODA.
  • an acid-sodium reduction cycle as shown in Fig. 1 occurs.
  • glucose oxidase oxidizes glucose (Glucose) in the sample solution to gluconolactone, as shown in Fig. 1, and changes the active center of glucose oxidase itself. Changes from FAD to FADH.
  • Oxygen (O 2) in the sample solution receives hydrogen (H 2) from FADH and receives hydrogen peroxide (H 2 O
  • Hydrogen peroxide H 2 O is Prussian blue (PB) and its reduced form Prussia
  • This acid reduction cycle occurs at the level of OV with respect to the AgZ AgCl reference electrode, so that the target component can be measured at a low voltage.
  • the biosensor of the present invention can be measured at a potential of 0 V with respect to the reference electrode (AgZAgCl), there is a concern that the electrochemical reaction of contaminant components other than the target component may be mixed as a signal. There is an advantage that extremely high precision measurement can be performed.
  • the force that takes time for hydrogen peroxide generated by the enzyme to diffuse to the electrode through the layer holding the enzyme is the noise sensor of the present invention. Since the enzyme is held by the LB film whose film thickness is the molecular size level, the time required for hydrogen peroxide to diffuse through the layer holding the enzyme is short, so the response during measurement The advantage is that the speed is extremely fast.
  • the biosensor of the present invention holds the enzyme in the LB film whose film thickness is the molecular size level, one enzyme having a large surface area / volume ratio has a larger substrate (here, Darcox).
  • a practical element can be formed with a small amount of enzyme that has a high probability of interacting with the source.
  • the biosensor of the present invention can be manufactured by a very simple method in which a substrate is coated with an LB film and the LB film is impregnated with an enzyme. There is an advantage.
  • the biosensor of the present invention has a relatively high current density (0.1 ⁇ A / cm 2 with ImM glucose) flowing between the working electrode and the counter electrode, and the current signal is large. It also has the advantage that it can be downsized.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram for explaining an acid reduction cycle occurring on the surface of a biosensor in the case of performing a periodic analysis.
  • FIG. 2 is an explanatory diagram for explaining a process of coating and laminating a Langmuir “program HLB) film on the surface of a substrate.
  • FIG. 3 is a graph showing the relationship between the addition of glucose to a sample solution and the response current.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between the glucose concentration in a sample solution and the response current.
  • FIG. 5 is an explanatory diagram showing a general configuration of an electrochemical analyzer.
  • FIG. 6 is an explanatory diagram for explaining an acid-oxidation reduction cycle occurring on the surface of a nanosensor when a conventional biosensor is used to electrochemically analyze the concentration of dalcose in a sample solution.
  • the biosensor according to the present invention prevents contamination components from causing an oxidation-reduction reaction on the surface of the working electrode, and a current flowing between the working electrode and the counter electrode is used only for the oxidation-reduction reaction of the target component.
  • the purpose of derivation was achieved with a simple configuration without reducing the analysis accuracy of the target component.
  • Cr was deposited to a thickness of 50 nm on the surface of a glass substrate (manufactured by Corning, No. 7059, 20 mm long, 10 mm wide, 5 mm thick), and gold was deposited to a thickness of 250 nm thereon. I prepared something
  • KC1 potassium chloride
  • Adsorption reaction by electrostatic interaction between DA and Prussian blue (PB) was promoted, and PB nanocrystals in PB aqueous solution were adsorbed to ODA molecule.
  • the barrier was moved horizontally to start compressing ODA molecules on the surface of the PB aqueous solution, and as shown in Fig. 2 (b), a monomolecular film of ODA molecules was formed on the surface of the PB aqueous solution. I let you.
  • the substrate was immersed in a GOx solution prepared in advance for 30 minutes to immobilize GOx in the LB film.
  • the substrate was not washed and stored in a 0.5 mol ZL KC1 solution.
  • KH PO and KC1 are stored in pure water, KH PO is 0.05 mol / L, KC1 is 0.1 mol / L.
  • Measurement conditions were as follows: initial potential 0 V, measurement interval 1 second, measurement time 3600 seconds, sensitivity 1 X 10 _5 A. During the measurement, the measurement solution was always stirred using a stirrer at a speed of 90 rpm.
  • Figure 3 shows the measurement results when 11 layers of LB films are accumulated.
  • the absolute value of the current increased at the same time as dulcose was dropped. That is, a current response corresponding to the glucose concentration was obtained.
  • GOx is immobilized in an organic-inorganic composite LB film containing PB nanocrystals without losing its activity, and hydrogen peroxide generated by GOx's enzymatic reaction is converted by Prussian blue (PB). It is reduced, and the current is increased.
  • the magnitude of the current response to glucose ImM was 0. AZcm 2 .
  • FIG. 4 shows a graph in which the horizontal axis represents the glucose concentration and the vertical axis represents the current response, using the results of FIG. In Fig. 4, it can be seen that the current value increases linearly in proportion to the glucose concentration until the glucose concentration is around 10 mM. Therefore, it is clear that the glucose concentration can be analyzed using the linear relationship between the glucose concentration and the current value change.

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Abstract

　作用電極の参照電極との電位差を０Ｖ付近とすることで、試料溶液中に含まれている侠雑成分が測定結果に影響を及ぼさないようにする。 　試料溶液中に含まれている特定の有機物質を電気化学的に分析する分析装置の作用電極であり、導電性を有する基材と、該基材を被覆する有機薄膜とを備え、該有機薄膜は水中または水面上で正に帯電する官能基を有する分子で構成され、プルシアンブルー（ＰＢ）及び／又はプルシアンホワイト（ＰＷ）を保持していることを特徴とするものである。ここで、前記有機薄膜としては例えば過酸化水素生成酵素を保持したラングミュア・ブロジェット膜（以下、「ＬＢ膜」という。）を使用することができる。

Description

バイオセンサとその製造方法 技術分野
[0001] 本発明は、試料溶液中に含まれている特定の有機物質を電気化学的に分析する 分析装置の作用電極としてのノィォセンサとその製造方法に関するものである。 背景技術
[0002] 試料溶液中に含まれている有機物質を電気化学的に分析する手法は広く用いら れており、中でも作用電極に流れる電流量を観察する測定法は、試料溶液中の電気 化学的に活性な物質の検出に広く用いられている。例えば、図 5に示すように、飽和 カロメル電極等の参照電極に対して一定の電位に保たれた作用電極と対電極との間 に流れる電流量から試料溶液中の過酸化水素や酸素など電気化学的に活性な物 質の濃度を求めることは広く行われて 、る。
[0003] 図 6は従来のノィォセンサを用 V、て試料溶液中のダルコース濃度を電気化学的に 分析する場合のノィォセンサ表面で生じている酸ィ匕還元サイクルを説明するための 説明図である。この例において、作用電極の表面にはグルコースォキシダーゼがポリ マー等で固定化されており、作用電極の表面では次のような電気化学的な反応が生 じている。
[0004] すなわち、作用電極の表面ではグルコースォキシターゼが試料溶液中のダルコ一 ス (Glucose)を、化 4に示すように酸化させてダルコノラタトン (Gluconolactone)に変化さ せ、グルコースォキシダーゼ自身の活性中心は FADから FADHに変化する。 FAD
2
Hは試料溶液中の酸素と反応して脱水素され FADに戻る。
2
[0005] [化 4] グルコースォ
キシタ一ゼ
Glucose + O2 → Lrluconolactone + H2O2
[0006] 試料溶液中の酸素（O )は FADHから水素（H )を受け取って過酸ィ匕水素（H O )となり、過酸化水素 (H O )は作用電極の表面で、化 5に示すように、水素（2H+)と
2 2
酸素 (O )に分解し、この分解によって生じた電子（2e_)は作用電極が受け取る。
2
[0007] [化 5]
H202 → 2H+ + 02 + 2e (アノード）
[0008] 過酸化水素 (H O )の分解によって生じた水素（2H+)は対電極 (力ソード）に移動
2 2
し、作用電極から対電極に流れてきた電子（2e_)を対電極から、化 6に示すように受 け取り、酸素（O )と結合して水 (H O)になる。
2 2
[0009] [化 6]
2H+ + l/202 + 2e → H20 (力ソード）
[0010] 以上のようにしてグルコースが酸ィ匕され、作用電極と対電極との間には所定の電流 が流れる。そして、作用電極と対電極との間に流れるこの電流量は一定時間に酸ィ匕 されたグルコースの量、従って試料溶液中に含まれるグルコースの濃度に比例して いるので、この電流量を測定することによって試料溶液中に含まれるグルコースの濃 度を求めることができる。
[0011] 従来のバイオセンサでグルコースの濃度を分析する場合は、上述したような化学反 応を生じさせなければならないが、過酸化水素 ような化学反応を
2 o )の上述した
2
生じさせるためには作用電極に 0. 64V以上の比較的高い電圧をかけなければなら ない。
[0012] しかし、作用電極に 0. 64V以上の比較的高い電圧をかけてしまうと、グルコース以 外の他の侠雑成分 (例えば血糖値測定では血液中のァスコルビン酸や尿素)も同時 にイオン化されて別の酸化還元反応が弓 Iき起こされ、グルコースの酸ィ匕還元に起因 しない電流が流れ、グルコース濃度の正確な測定が困難になってしまうという問題が めつに。 特許文献 1：特開昭 62— 207951号公報
特許文献 2：特願平 1— 163649号公報
特許文献 3：特開 2004 - 108813号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0013] 解決しょうとする問題点は、従来のノィォセンサは試料溶液を分析する場合に試料 溶液中に含まれて ヽる侠雑成分による影響を排除し難 ヽ点である。
課題を解決するための手段
[0014] 本発明は、試料溶液中に含まれて!/ヽる侠雑成分による分析結果への影響を排除 するため、作用電極の表面にプルシアンブルー微結晶と酸ィ匕酵素を、水中または水 面上で正に帯電する官能基を有する分子で構成されている膜を用いて保持させ、作 用電極と参照電極との間の電位差が非常に低く（OV付近)なるようにしたことを最も 主要な特徴とする。
[0015] すなわち、本発明に係るバイオセンサは、試料溶液中に含まれている特定の有機 物質を電気化学的に分析する分析装置の作用電極として使用するものであり、導電 性を有する基材と、該基材を被覆する有機薄膜とを備え、該有機薄膜は水中または 水面上で正に帯電する官能基を有する分子で構成されていることを特徴とするもの である。そして、このバイオセンサは該有機薄膜にプルシアンブルー（PB)及び Z又 はプルシアンホワイト（PW)を保持させて使用するものである。前記有機薄膜としては 、例えばラングミュア'プロジェット膜 (以下、「LB膜」という。）を使用することができる。
[0016] 前記有機薄膜 (LB膜)は過酸化水素生成酵素を保持していてもよい。前記過酸ィ匕 水素生成酵素としては、例えばグルコースォキシダーゼ、ラタトースォキシダーゼ、ガ ラタトースォキシダーゼ、尿酸ォキシダーゼ、エタノールォキシダーゼ、コレステロ一 ノレォキシダーゼ、グリコレートォキシダーゼ、マレートォキシダーゼ、へキソースォキ シダーゼ、ダルコノラタトンォキシダーゼ、アミンォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 キサンチンォキシダーゼ、ォキザレイトォキシダーゼ、ザルコシンォキシダーゼ、ゥリ カーゼ、ビラノースォキシダーゼ、グリセロールォキシダーゼ又はアミノ酸ォキシダー ゼ等、特定の有機物質との接触によって有効に過酸ィ匕水素を生成させるものを 、う。 [0017] 前記有機薄膜 (LB膜)はカチオン性有機化合物を用いて形成することができる。前 記カチオン性有機化合物とは、水に滴下した時、該有機化合物のァニオン部分が水 に溶解し、カチオン部分が水中のプルシアンブルーと結合し、このプルシアンブルー と結合したものが水に溶解せず、水より比重が小さぐ水面上に浮遊展開する化合物 をいう。例えば、ォクタデシノレトリメチノレアンモ -ゥム（Octadecyltrimethylammonium 0 DA)、ジメチルジォクタデシルアンモ -ゥム（Dimethyldioctadecylammonium DODA) 等をカチオン部分として有する有機化合物を挙げることができる。
[0018] 前記有機薄膜 (LB膜)は 1層でもよいが、 2層以上積層されていてもよい。前記 LB 膜 2層以上積層されている場合はバイオセンサ力 得られる信号電流値が大きくなり 、計測が行いやすくなり、またバイオセンサの小型化が可能になるという利点がある。
[0019] また、本発明に係るバイオセンサの製造方法は、プルシアンブルー (PB)を含む水 溶液に前記カチオン性有機化合物を含む溶液を滴下して該水溶液の表面にカチォ ン性有機化合物の分子を展開させる工程と、展開させた該カチオン性有機化合物の 分子を圧縮して該水溶液の表面に該カチオン性有機化合物の分子からなる LB膜を 生成させる工程と、導電性を有する基材に該 LB膜を接触させて該 LB膜を該基材の 表面に被覆又は積層させる工程とを備えたことを特徴とするものである。
[0020] ここで、ラングミュア'ブロジェット膜を表面に累積させた前記基材を過酸ィ匕水素生 成酵素水溶液中に浸漬して該ラングミュア ·ブ口ジェット膜中に過酸ィ匕水素生成酵素 を含ませるようにする工程を備えてもよ!、。
[0021] 前記過酸化水素生成酵素としては、例えばグルコースォキシダーゼ、ラタトースォ キシダーゼ、ガラクトースォキシダーゼ、尿酸ォキシダーゼ、エタノールォキシダーゼ 、コレステローノレオキシダーゼ、グリコレートォキシダーゼ、マレートォキシダーゼ、へ キソースォキシダーゼ、ダルコノラタトンォキシダーゼ、アミンォキシダーゼ、コリンォ キシダーゼ、キサンチンォキシダーゼ、ォキザレイトォキシダーゼ、ザノレコシンォキシ ダーゼ、ゥリカーゼ、ピラノースォキシダーゼ、グリセロールォキシダーゼ又はアミノ酸 ォキシダーゼ等、特定の有機物質との接触によって有効に過酸ィ匕水素を生成させる ものをいう。
[0022] 前記 LB膜はカチオン性有機化合物を用いて形成することができる。前記カチオン 性有機化合物とは、水に滴下した時、該化合物のァ-オン部分が水に溶解し、カチ オン部分が水中のプルシアンブルーと結合し、このプルシアンブルーと結合したもの が水に溶解せず、水より比重が小さぐ水面上に浮遊展開する化合物をいう。例えば
、ォクタデシノレトリメチノレアンモ -ゥム（Octadecyltrimethylammonium ODA)、ジメチノレ ジォクタデシルアンモ -ゥム（Dimethyldioctadecylammonium DODA)等をカチオン部 分として有する有機化合物を挙げることができる。
発明の効果
[0023] 本発明のバイオセンサでは、図 1に示すような酸ィ匕還元サイクルが生じている。すな わち、バイオセンサの表面ではグルコースォキシターゼが試料溶液中のグルコース（ Glucose)を、ィ匕 1に示すように酸化させてダルコノラタトン (Gluconolactone)に変化させ 、グルコースォキシダーゼ自身の活性中心は FADから FADHに変化する。 FADH
2
は試料溶液中の酸素と反応して脱水素され FADに戻る。
2
[0024] [化 1] グルコースォ
キシタ一ゼ
Glucose + Oi → Lrluconolactone + ¾02
[0025] 試料溶液中の酸素（O )は FADHから水素（H )を受け取って過酸ィ匕水素（H O
2 2 2 2 2
)となり、過酸化水素（H O )はプルシアンブルー (PB)とその還元体であるプルシア
2 2
ンホワイト (PW)との間の酸ィ匕還元サイクルを介して還元される。この酸ィ匕還元サイクル では化 2に示すような酸化還元反応が生じて ヽる。
[0026] [化 2]
K4Fe4(n)[Fe(n)(CN)6]3 + 2¾02→ Fe4 (m)[Fe( n ) (CN) 6]3 + 40H- + 4K+ (PW) (PB)
Fe4 (m)[Fe( n )(CN)6]3 + 4e" + 4K+→ IQFe^ n )[Fe( π ) (CN) 6]3
(PB) (PW) [0027] 結局、この酸ィ匕還元サイクルにおいて、過酸化水素 (H O )は化 3に示すような反
2 2
応により還元され、還元電流を発生させる。そして、この酸ィヒ還元サイクルは、 AgZ AgCl参照電極に対して、 OVのレベルで生ずるため、低い電圧で目的成分の測定が 可能となる。
[0028] [化 3]
Figure imgf000008_0001
[0029] このように、本発明のバイオセンサは、参照極 (AgZAgCl)に対して 0ボルト電位で 測定できるので、目的成分以外の侠雑成分の電気化学的反応が信号として混入す る心配が無ぐ極めて高精度な測定ができるという利点がある。
[0030] また、酵素を保持している層が厚くなると、酵素により生成された過酸化水素が酵素 を保持している層を通って電極まで拡散するのに時間を要する力 本発明のノィォ センサは膜厚が分子の大きさレベルの LB膜で酵素を保持しているので、酵素を保持 している層を過酸ィ匕水素が拡散するのに要する時間が短ぐ従って、計測時の応答 速度がきわめて速 、と 、う利点がある。
[0031] また、本発明のバイオセンサは膜厚が分子の大きさレベルの LB膜で酵素を保持し ているので、表面積/体積比が大きぐ一つの酵素がより多くの基質 (ここではダルコ ース）と相互作用する確率が高ぐわずかな酵素量で実用的な素子を形成することが できるという利点がある。
[0032] また、本発明のバイオセンサは、基板に LB膜を被覆させ、 LB膜に酵素を含浸させ るという極めて簡易な方法で製造することができるので、大量に安価に製造すること ができるという利点がある。
[0033] また、本発明のバイオセンサは、作用電極と対電極の間に流れる電流密度が比較 的高く（ImMグルコースで 0. 1 μ A/cm2)、電流信号が大きいので、計測が行い易 ぐまた、小型化が可能であるという利点がある。
図面の簡単な説明
[0034] [図 1]本発明に係るバイオセンサを用 ヽて試料溶液中のダルコース濃度を電気化学 的に分析する場合のバイオセンサ表面で生じている酸ィ匕還元サイクルを説明するた めの説明図である。
[図 2]基材の表面にラングミュア'プロジヱッ HLB)膜を被覆'積層させる工程を説明 する説明図である。
[図 3]試料溶液へのグルコースの添加と応答電流との関係を示すグラフである。
[図 4]試料溶液中のグルコース濃度と応答電流との関係を示すグラフである。
[図 5]電気化学的分析装置の一般的な構成を示す説明図である。
[図 6]従来のバイオセンサを用 、て試料溶液中のダルコース濃度を電気化学的に分 析する場合のノィォセンサ表面で生じている酸ィ匕還元サイクルを説明するための説 明図である。
発明を実施するための最良の形態
[0035] 本発明に係るバイオセンサは、作用電極の表面で侠雑成分が酸化還元反応を生じ させないようにし、作用電極と対電極との間で流れる電流を目的成分の酸化還元反 応にのみ由来させるようにするという目的を、簡単な構成で、 目的成分の分析精度を 低下させることなく実現させた。
実施例 1
[0036] A.事前準備
プルシアンブルー (PB)を純水に溶解し、濃度 1 X 10_5molZLのプルシアンブル 一水溶液 (PB水溶液）を作製した。また、クロ口ホルムにォクタデシルトリメチルアンモ
-ゥムブロマイド (Octadecyltrimethylammonium bromide) (ODA)を溶解し、 9. 17 X
10_4mol/Lの ODAクロ口ホルム溶媒溶液を作製した。
[0037] また、ガラス基板（コ一-ング社製、 No. 7059、縦 20mm、横 10mm、厚さ 5mm) の表面に Crを厚さ 50nm蒸着し、その上に金を厚さ 250nm蒸着したものを用意した
[0038] また、塩ィ匕カリウム (KC1)を純水に溶解し、 0. 5molZLの水溶液を作成し、この C1溶液にグルコースォキシダーゼ（GOx)を lmgZmlの濃度で溶解した GOx水溶 液を作製した。
[0039] B. LB膜の作製及び精層 前記 PB水溶液中に前記基板を挿入 ·浸潰させ、 PB水溶液上に前記 ODAクロロホ ルム溶媒溶液を滴下し、図 2 (a)に示すように、 ODAクロ口ホルム溶媒溶液を PB水 溶液の表面に展開させた。
[0040] ODAクロ口ホルム溶媒溶液を PB水溶液の表面に展開させた後 3000秒間待ち、 O
DAとプルシアンブルー (PB)の静電相互作用による吸着反応を促進させ、 ODA分 子に PB水溶液中の PBナノ結晶を吸着させた。
[0041] 3000秒経過後、バリアを水平に移動させ、 PB水溶液表面の ODA分子の圧縮を 開始し、図 2 (b)に示すように、 PB水溶液の表面に ODA分子の単分子膜を形成させ た。
[0042] 表面圧力を 30mNZmに保ち、図 2 (c)に示すように、基板を複数回上下させ、図 2
(d)に示すように、 ODA分子の単分子膜を基板上に任意の層数だけ積層させた。各 積層操作の間では、 1200秒間空気中で待ち、基板を完全に乾かすようにした。
[0043] 予め用意しておいた GOx溶液中に基板を 30分間浸漬し、 LB膜内に GOxを固定 させた。そして、この基板を洗浄せず、 0. 5molZLの KC1溶液中に保存した。
[0044] C.グルコースの測定
上述のようにして形成したバイオセンサを作用電極として、三電極系のアンべロメト リー法による電流応答測定を行った。ここで、参照電極には AgZAgClを、対電極に は Ptを使用した。
[0045] 純水中に KH POと KC1をカ卩え、 KH POが 0. 05mol/L, KC1が 0. lmol/L
2 4 2 4
の溶液を作製した。次に、この溶液に KOH溶液を少しずつ加え、 pH = 7となるように 調節した。そして、酸素を吹き込み、溶存酸素が飽和している状態にした。測定はこ の溶液中で行った。
[0046] 測定条件は、初期電位 0V、測定間隔 1秒、測定時間 3600秒、感度 1 X 10_5Aで 測定を行った。なお測定中は、スターラを用いて 90rpmの速さで常に測定溶液の撹 拌を行った。
[0047] 測定開始後（電位印加後） 2000秒間待ち、測定溶液中の電流を安定させた。 200 0秒経過後、測定溶液中のグルコース濃度が ImmolZL増加するように調節した溶 液を 100秒毎に滴下した。 [0048] D.測定の結果
LB膜を 11層累積した場合の測定結果を図 3に示す。同図に示されるように、ダル コースの滴下と同時に、電流の絶対値が増大した。すなわち、グルコース濃度に対 応した電流応答が得られた。このことから、 GOxが活性を失わずに PBナノ結晶を含 む有機-無機複合 LB膜内に固定化されており、 GOxの酵素反応によって生成され た過酸化水素が、プルシアンブルー（PB)によって還元され、電流が増大しているこ と力 S分力る。グルコース ImMに対する電流応答の大きさは、 0. AZcm2であつ た。
[0049] 図 3の結果を用い、横軸にグルコース濃度を、縦軸に電流応答をとつたグラフを図 4 に示す。図 4においてグルコース濃度が 10mM付近までは、グルコース濃度に比例 して電流値が直線的に増加していることが分かる。従って、このグルコース濃度と電 流値変化の直線的な関係を利用して、グルコース濃度の分析が可能であることがわ 力る。

Claims

請求の範囲
[1] 試料溶液中に含まれている特定の有機物質を電気化学的に分析する分析装置の 作用電極として使用するものであり、導電性を有する基材と、該基材を被覆する有機 薄膜とを備え、該有機薄膜は水中または水面上で正に帯電する官能基を有する分 子で構成されて ヽることを特徴とするバイオセンサ。
[2] 前記有機薄膜がラングミュア'ブロジェット膜 (以下、「LB膜」という。）であることを特 徴とする請求項 1に記載のバイオセンサ。
[3] 前記有機薄膜がプルシアンブルー (PB)及び Z又はプルシアンホワイト (PW)を保 持していることを特徴とする請求項 1又は 2に記載のノィォセンサ。
[4] 前記有機薄膜が過酸ィ匕水素生成酵素を保持していることを特徴とする請求項 1〜3 の！、ずれかに記載のバイオセンサ。
[5] 前記過酸ィ匕水素生成酵素がグルコースォキシダーゼ、ラタトースォキシダーゼ、ガ ラタトースォキシダーゼ、尿酸ォキシダーゼ、エタノールォキシダーゼ、コレステロ一 ノレォキシダーゼ、グリコレートォキシダーゼ、マレートォキシダーゼ、へキソースォキ シダーゼ、ダルコノラタトンォキシダーゼ、アミンォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 キサンチンォキシダーゼ、ォキザレイトォキシダーゼ、ザルコシンォキシダーゼ、ゥリ カーゼ、ビラノースォキシダーゼ、グリセロールォキシダーゼ又はアミノ酸ォキシダー ゼであることを特徴とする請求項 1〜4のいずれかに記載のバイオセンサ。
[6] 前記 LB膜がカチオン性有機化合物力 なり、該カチオン性有機化合物が、水に滴 下した時、該化合物のァ-オン部分が水に溶解し、カチオン部分が水中のプルシア ンブルーと結合し、該プルシアンブルーと結合したものが水に溶解せず、水より比重 力 、さぐ水面上に浮遊展開する化合物であることを特徴とする請求項 1〜5のいず れかに記載のバイオセンサ。
[7] 前記カチオン性有機化合物がォクタデシルトリメチルアンモ -ゥム（Octadecyltrimet hylammonium ODA)又はジメチルジォクタデシルアンモ -ゥム（Dimethyldioctadecyla mmonium DODA)をカチオン部分として有する有機化合物であることを特徴とする請 求項 1〜6の!、ずれかに記載のバイオセンサ。
[8] 前記有機薄膜が 1層又は 2層以上積層されていることを特徴とする請求項 1〜7の V、ずれかに記載のノィォセンサ。
[9] 試料溶液中に含まれて!/ヽる特定の有機物質を電気化学的に分析する分析装置の 作用電極であることを特徴とする請求項 1〜8のいずれかに記載のバイオセンサ。
[10] プルシアンブルー (PB)を含む水溶液にカチオン性有機化合物を含む溶液を滴下 して該水溶液の表面にカチオン性有機化合物の分子を展開させる工程と、展開させ た該カチオン性有機化合物の分子を圧縮して該水溶液の表面に該カチオン性有機 化合物の分子力 なる LB膜を生成させる工程と、導電性を有する基材に該 LB膜を 接触させて該 LB膜を該基材の表面に被覆又は積層させる工程とを備えたことを特 徴とするバイオセンサの製造方法。
[11] LB膜を表面に被覆又は積層させた前記基材を過酸化水素生成酵素水溶液中に 浸漬して該 LB膜中に過酸ィ匕水素生成酵素を含ませる工程を備えたことを特徴とする 請求項 10に記載のバイオセンサの製造方法。
[12] 前記過酸ィヒ水素生成酵素がグルコースォキシダーゼ、ラタトースォキシダーゼ、ガ ラタトースォキシダーゼ、尿酸ォキシダーゼ、エタノールォキシダーゼ、コレステロ一 ノレォキシダーゼ、グリコレートォキシダーゼ、マレートォキシダーゼ、へキソースォキ シダーゼ、ダルコノラタトンォキシダーゼ、アミンォキシダーゼ、コリンォキシダーゼ、 キサンチンォキシダーゼ、ォキザレイトォキシダーゼ、ザルコシンォキシダーゼ、ゥリ カーゼ、ビラノースォキシダーゼ、グリセロールォキシダーゼ又はアミノ酸ォキシダー ゼであることを特徴とする請求項 11に記載のバイオセンサの製造方法。
[13] 前記カチオン性有機化合物がォクタデシルトリメチルアンモ -ゥム（Octadecyltrimet hylammonium ODA)又はジメチルジォクタデシルアンモ -ゥム（Dimethyldioctadecyla mmonium DODA)をカチオン部分として有する有機化合物であることを特徴とする請 求項 10〜 12のいずれかに記載のバイオセンサの製造方法。
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