CN111443121A - 一种电化学生物传感器电极的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：a)普鲁士蓝的制备步骤；b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；c)尿酸酶接枝步骤；d)电极制备步骤，本发明与现有技术相比，选取石墨烯和普鲁士蓝两种导电纳米粒子，通过物理掺杂的手段将其掺入聚砜中空纤维膜中，使电极的阻抗相比于附着聚合物电极的阻抗减小，通过电化学工作站测得的阻抗为70.34，电化学性能显著提高；传感器对尿酸浓度的响应电流有着显著提升，测得的传感器氧化峰电流和扫描速度的相关平方系数为0.9803‑0.9943。
Description
技术领域
本发明属于传感器的制备方法，特别属于电化学生物传感器的制备方法这一技术领域。
背景技术
传统意义的尿酸检测一般通过标准酶比色法进行检测，由于尿酸酶与之对应的底物尿酸有着良好的电化学响应信号，使得尿酸酶在尿酸传感器的制备中受到广泛关注，目前，电极检测的原理大多是将底物对应的酶直接修饰到工作电极上，通过酶促反应来检测电信号，如何将酶修饰在电极表面则引起了业内人士以及广大学者的广泛关注和大力的研究与创新。李长明报道了“一种普鲁士蓝/N-掺杂碳纳米复合材料的制备及应用”(公开号:CN105136885A)，通过碳纳米复合材料的酸化处理、N-掺杂碳纳米复合材料的制备和普鲁士蓝/N-掺杂碳纳米复合材料的制备这三步，制得的复合材料用于制备无酶型尿酸传感器，该发明制得的复合材料有很好的三维空间结构并且对尿酸有很好的催化效果但其缺点在于首先需要在基板上形成工作电极，然后再涂覆普鲁士蓝/N-掺杂碳纳米复合材料，工艺复杂。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种工艺简单的电化学生物传感器的制备方法。
本发明解决技术问题的技术方案为：一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤。
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将K3Fe(CN)6溶解于盐酸溶液中，搅拌10-20min，，再加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，继续搅拌直至PVP完全溶解；升温至80-120℃，保温24-48h，冷却至室温，离心分离，除去上清液，离心清洗三次，烘干得蓝色固体，即得到普鲁士蓝纳米颗粒；K3Fe(CN)6、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的重量比为1:10-1:20；
所述的盐酸的浓度为0.01-0.05M；
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：取适量步骤a制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1-5mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；再加入石墨烯，超声不小于4h，制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子，石墨烯与普鲁士蓝的质量比1:(1-5)；
所述的石墨烯参考Ruoff的文章(Synthesis of graphene-based nanosheetsvia chemical reduction of exfoliated graphite oxide Carbon 2007,45,1558-1565.)方法进行制备；
所述的c)尿酸酶接枝步骤为取已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，并用无水乙醇清洗2-3次，以除去表面杂质，并在真空环境中，放置不小于24h，以除去水分、乙醇；再将中空纤维膜浸没于20-400μM的尿酸酶溶液中，在35-40℃下浸泡5-10h，再浸没于0.1-0.2M的乙醇胺中，在35-40℃下浸泡5-10h，阻断未反应的活性位点，将阻断好的中空纤维膜用去离子水清洗不小于12h，取出清洗好的中空纤维膜，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜；
所述的光引发表面羧基化的中空纤维膜，参照HaijunYu的文章(H.Yu et al./Journal of Membrane Science 342 2009 6–13)制备。
所述的d)电极制备步骤为：取b)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子1-3ml，用注射器将混合纳米粒子注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，注射完成后用滤纸吸取表面液体，于室温下干燥不小于24h，再包覆在不锈钢针外，即制得传感器。
所述的不锈钢针为支撑基材，合成的纳米粒子用于降低整个传感器的阻抗。
本发明通过在膜表面引入羧基来改性聚砜中空纤维膜，由于尿酸酶本身带有氨基基团，可以通过共价键结合的方式与引入羧基的中空纤维膜紧密结合在一起，使尿酸酶固定在中空纤维膜的表面，并以此制备电极，极大增强了附着于膜表面酶于底物的接触面积，并通过酶与底物结合的特异性，使产生的化学信号转化为电信号，从而达到检测尿酸浓度的目的。
本发明选取石墨烯和普鲁士蓝两种导电纳米粒子，通过物理掺杂的手段将其掺入聚砜中空纤维膜中，使电极的阻抗相比于附着聚合物电极的阻抗减小，通过电化学工作站测得的阻抗为70.34，电化学性能显著提高；传感器对尿酸浓度的响应电流有着显著提升，测得的传感器氧化峰电流和扫描速度的相关平方系数为0.9803-0.9943。
附图说明
图1为实施例1b步骤所制的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的阻抗图谱。1为普鲁士蓝，2为普鲁士蓝/石墨烯；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的说明。
实施例1：
一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤。
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将0.15g的K3Fe(CN)6溶解于40mL 0.01mol/L的盐酸溶液中，搅拌10min，为使溶液稳定分散，向溶液中加PVP 3.0g继续搅拌直至PVP完全溶解。反应在反应釜中进行，反应温度为80℃，持续24h，冷却至室温，将混合液离心分离，除去上清液，离心清洗三次，得到产物即为深蓝色的普鲁士蓝溶液，烘干得蓝色固体保存备用，即得到普鲁士蓝纳米颗粒；
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：
取0.0027g步骤a制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；并向其中加入0.0025g石墨烯制备混合溶液，超声4h使溶液充分分散均匀以备用，制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子；
所述的c)尿酸酶接枝步骤为
取0.0022g已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，无水乙醇清洗2次，以除去表面杂质，于真空环境中放置24h，以除去水分，乙醇，取出后浸没于20μM的尿酸酶溶液中，在37℃下浸泡5h后，将膜移出溶液，用0.1mol/L的乙醇胺在35℃下浸泡10h，以阻断未反应的活性位点，再用去离子水清洗12h，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜；
所述的d)电极制备步骤为：
取1mLb)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子，用注射器将混合液体注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，用滤纸吸取表面剩余液体，室温条件下干燥24h，用直径为0.18mm的不锈钢针为支撑基质，将已经尿酸酶固定化的中空纤维膜包覆于支撑基质上，制得传感器1。
实施例2：
一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤。
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将0.15g的K3Fe(CN)6溶解于40mL0.01mol/L的盐酸溶液中，搅拌10min，为使溶液稳定分散，向溶液中加PVP3.0g继续搅拌直至PVP完全溶解。反应在反应釜中进行，反应温度为100℃，持续30h，冷却至室温，将混合液离心分离，除去上清液，离心清洗三次，得到产物即为深蓝色的普鲁士蓝溶液，烘干得蓝色固体保存备用，即得到普鲁士蓝纳米颗粒；
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：
取0.0027g步骤a制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；并向其中加入0.0053g石墨烯制备混合溶液，超声4h使溶液充分分散均匀以备用,制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子；
所述的c)尿酸酶接枝步骤为
取0.0022g已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，无水乙醇清洗3次，于真空环境中除去水分24h，取出后浸没于100μM的尿酸酶溶液中，在37℃下浸泡5h后，将膜移出溶液，用0.1mol/L的乙醇胺在37℃下浸泡5h，再用去离子水清洗12h，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜；
所述的d)电极制备步骤为：
取b)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子2ml，用注射器将混合纳米粒子注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，(为防止混合溶液从两端渗出，先用环氧树脂胶黏剂将中空纤维膜两端封闭)，注射完成后用滤纸吸取表面液体，于室温下干燥36h，用直径为0.18mm的不锈钢针为支撑基质，将已经尿酸酶固定化的中空纤维膜包覆于支撑基质上，即制得传感器2。
实施例3：
一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤。
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将0.15g的K3Fe(CN)6溶解于40mL 0.01mol/L的盐酸溶液中，搅拌10min，为使溶液稳定分散，向溶液中加PVP3.0g继续搅拌直至PVP完全溶解。反应在反应釜中进行，反应温度为110℃，持续24h。冷却至室温，将混合液离心分离，除去上清液，离心清洗三次，得到产物即为深蓝色的普鲁士蓝溶液，烘干得蓝色固体保存备用,即得到普鲁士蓝纳米颗粒；
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：
取0.0027g步骤1制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；并向其中加入0.0073g石墨烯制备混合溶液，超声4h使溶液充分分散均匀以备用,制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子；
所述的c)尿酸酶接枝步骤为
取0.0022g已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，无水乙醇清洗3次洗，于真空环境中放置24h，取出后浸没于200μM的尿酸酶溶液中，在37℃下浸泡5h后，将膜移出溶液，用0.1mol/L的乙醇胺在40℃下浸泡10h，阻断未反应的活性位点，并用去离子水清洗12h，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜；
所述的d)电极制备步骤为：
取1mLb)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子，用注射器将混合液体注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，用滤纸吸取表面剩余液体，室温条件下干燥24h，用直径为0.18mm的不锈钢针为支撑基质，将已经尿酸酶固定化的中空纤维膜包覆于支撑基质上，制得传感器3。
实施例4:
一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤。
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将0.15g的K3Fe(CN)6溶解于40mL 0.01mol/L的盐酸溶液中，搅拌10min，为使溶液稳定分散，向溶液中加PVP 3.0g继续搅拌直至PVP完全溶解。反应在反应釜中进行，反应温度为105℃，持续24h，冷却至室温，将混合液离心分离，除去上清液，离心清洗三次，得到产物即为深蓝色的普鲁士蓝溶液，烘干得蓝色固体保存备用，即得到普鲁士蓝纳米颗粒；
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：
取0.0027g步骤a制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；并向其中加入0.0098g石墨烯制备混合溶液，超声4h使溶液充分分散均匀以备用,制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子。
所述的c)尿酸酶接枝步骤为
取0.0022g已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，无水乙醇清洗2次，以除去表面杂质，于真空环境中放置24h，以除去水分，乙醇，取出后浸没于300μM的尿酸酶溶液中，在37℃下浸泡5h后，将膜移出溶液，用0.1mol/L的乙醇胺在35℃下浸泡10h，以阻断未反应的活性位点，再用去离子水清洗12h，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜；
所述的d)电极制备步骤为：
取1mLb)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子，用注射器将混合液体注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，用滤纸吸取表面剩余液体，室温条件下干燥24h，用直径为0.18mm的不锈钢针为支撑基质，将已经尿酸酶固定化的中空纤维膜包覆于支撑基质上，制得传感器4。
实施例5:
一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤。
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将0.15g的K3Fe(CN)6溶解于40mL 0.01mol/L的盐酸溶液中，搅拌10min，为使溶液稳定分散，向溶液中加PVP 3.0g继续搅拌直至PVP完全溶解。反应在反应釜中进行，反应温度为120℃，持续24h，冷却至室温，将混合液离心分离，除去上清液，离心清洗三次，得到产物即为深蓝色的普鲁士蓝溶液，烘干得蓝色固体保存备用，即得到普鲁士蓝纳米颗粒；
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：
取0.0027g步骤a制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；并向其中加入0.0129g石墨烯制备混合溶液，超声4h使溶液充分分散均匀以备用，制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子；
所述的c)尿酸酶接枝步骤为
取0.0022g已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，无水乙醇清洗2次，以除去表面杂质，于真空环境中放置24h，以除去水分，乙醇，取出后浸没于400μM的尿酸酶溶液中，在37℃下浸泡5h后，将膜移出溶液，用0.1mol/L的乙醇胺在35℃下浸泡10h，以阻断未反应的活性位点，并用去离子水清洗12h，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜；
所述的d)电极制备步骤为：
取1mLb)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子，用注射器将混合液体注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，用滤纸吸取表面剩余液体，室温条件下干燥24h，用直径为0.18mm的不锈钢针为支撑基质，将已经尿酸酶固定化的中空纤维膜包覆于支撑基质上，制得传感器5。
本发明的检测方法为将制备好的传感器组成三电极系统在0.5mmol的尿酸酶PBS溶液中进行检测，扫描速率为0.01-0.12Vs-1，扫描范围为-0.4-0.8V。
检测结果如表1所示：
表1实施例1～5所制的传感器氧化峰电流和扫描速度的相关平方系数(R2)
如表1所示：随着尿酸酶接枝浓度的增大和扫描速率值的增大，传感器1-5的氧化峰值电流也不断增大，说明了在底物足够的情况下，该传感器随着表面尿酸酶的增加，底物中的尿酸被氧化为尿囊素及过氧化氢的量越多，同时相关平方系数趋近于1也证明了拟合曲线的可靠。
Claims (5)
1.一种电化学生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
a)普鲁士蓝的制备步骤；
b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤；
c)尿酸酶接枝步骤；
d)电极制备步骤；
所述的c)尿酸酶接枝步骤为取已经通过光引发表面羧基化的中空纤维膜，并用无水乙醇清洗2-3次，以除去表面杂质，并在真空环境中，放置不小于24h，以除去水分、乙醇；再将中空纤维膜浸没于20-400μM的尿酸酶溶液中，在35-40℃下浸泡5-10h，再浸没于0.1-0.2M的乙醇胺中，在35-40℃下浸泡5-10h，阻断未反应的活性位点，将阻断好的中空纤维膜用去离子水清洗不小于12h，取出清洗好的中空纤维膜，用滤纸吸去表面残留液体，制得尿酸酶接枝的中空纤维膜。
2.根据权利要求1所述的一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述的a)普鲁士蓝的制备步骤为
将K3Fe(CN)6溶解于盐酸溶液中，搅拌10-20min，，再加聚乙烯吡咯烷酮，继续搅拌直至聚乙烯吡咯烷酮完全溶解；升温至80-120℃，保温24-48h，冷却至室温，离心分离，除去上清液，离心清洗三次，烘干得蓝色固体，即得到普鲁士蓝纳米颗粒；K3Fe(CN)6、聚乙烯吡咯烷酮的重量比为1:10-1:20。
3.根据权利要求2所述的一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述的盐酸的浓度为0.01-0.05M。
4.根据权利要求1所述的一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述的b)普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子的制备步骤为：取适量步骤a制备的普鲁士蓝纳米颗粒，按1mg普鲁士蓝分散于1-5mL水的比例制得普鲁士蓝水溶液；再加入石墨烯，超声不小于4h，制得普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子，石墨烯与普鲁士蓝的质量比1:(1-5)。
5.根据权利要求1所述的一种电化学生物传感器的制备方法，其特征在于：
所述的d)电极制备步骤为：取b)步骤制备的普鲁士蓝/石墨烯混合纳米粒子1-3ml，用注射器将混合纳米粒子注入c)尿酸酶接枝步骤所制备好的尿酸酶接枝的中空纤维膜中，注射完成后用滤纸吸取表面液体，于室温下干燥不小于24h，再包覆在不锈钢针外，即制得传感器。
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