JP4839451B2 - バイオセンサとその製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、試料溶液中に含まれている特定の有機物質を電気化学的に分析する分析装置の作用電極としてのバイオセンサとその製造方法に関するものである。
試料溶液中に含まれている有機物質を電気化学的に分析する手法は広く用いられており、中でも作用電極に流れる電流量を観察する測定法は、試料溶液中の電気化学的に活性な物質の検出に広く用いられている。例えば、図５に示すように、飽和カロメル電極等の参照電極に対して一定の電位に保たれた作用電極と対電極との間に流れる電流量から試料溶液中の過酸化水素や酸素など電気化学的に活性な物質の濃度を求めることは広く行われている。
図６は従来のバイオセンサを用いて試料溶液中のグルコース濃度を電気化学的に分析する場合のバイオセンサ表面で生じている酸化還元サイクルを説明するための説明図である。この例において、作用電極の表面にはグルコースオキシダーゼがポリマー等で固定化されており、作用電極の表面では次のような電気化学的な反応が生じている。
すなわち、作用電極の表面ではグルコースオキシターゼが試料溶液中のグルコース(Glucose)を、化４に示すように酸化させてグルコノラクトン(Gluconolactone)に変化させ、グルコースオキシダーゼ自身の活性中心はＦＡＤからＦＡＤＨ２に変化する。ＦＡＤＨ２は試料溶液中の酸素と反応して脱水素されＦＡＤに戻る。
試料溶液中の酸素（Ｏ２）はＦＡＤＨ２から水素（Ｈ２）を受け取って過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）となり、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は作用電極の表面で、化５に示すように、水素（２Ｈ＋）と酸素（Ｏ２）に分解し、この分解によって生じた電子（２ｅ−）は作用電極が受け取る。
過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の分解によって生じた水素（２Ｈ＋）は対電極（カソード）に移動し、作用電極から対電極に流れてきた電子（２ｅ−）を対電極から、化６に示すように受け取り、酸素（Ｏ２）と結合して水（Ｈ２Ｏ）になる。
以上のようにしてグルコースが酸化され、作用電極と対電極との間には所定の電流が流れる。そして、作用電極と対電極との間に流れるこの電流量は一定時間に酸化されたグルコースの量、従って試料溶液中に含まれるグルコースの濃度に比例しているので、この電流量を測定することによって試料溶液中に含まれるグルコースの濃度を求めることができる。
従来のバイオセンサでグルコースの濃度を分析する場合は、上述したような化学反応を生じさせなければならないが、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の上述したような化学反応を生じさせるためには作用電極に０．６４Ｖ以上の比較的高い電圧をかけなければならない。
しかし、作用電極に０．６４Ｖ以上の比較的高い電圧をかけてしまうと、グルコース以外の他の侠雑成分（例えば血糖値測定では血液中のアスコルビン酸や尿素）も同時にイオン化されて別の酸化還元反応が引き起こされ、グルコースの酸化還元に起因しない電流が流れ、グルコース濃度の正確な測定が困難になってしまうという問題があった。
特開昭６２−２０７９５１号公報
特願平１−１６３６４９号公報
特開２００４−１０８８１３号公報
解決しようとする問題点は、従来のバイオセンサは試料溶液を分析する場合に試料溶液中に含まれている侠雑成分による影響を排除し難い点である。
本発明は、試料溶液中に含まれている侠雑成分による分析結果への影響を排除するため、作用電極の表面にプルシアンブルー微結晶と酸化酵素を、水中または水面上で正に帯電する官能基を有する分子で構成されている膜を用いて保持させ、作用電極と参照電極との間の電位差が非常に低く（０Ｖ付近）なるようにしたことを最も主要な特徴とする。
すなわち、本発明に係るバイオセンサは、試料溶液中に含まれている特定の有機物質を電気化学的に分析する分析装置の作用電極として使用するものであり、導電性を有する基材と、該基材を被覆する有機薄膜とを備え、該有機薄膜は水中または水面上で正に帯電する官能基を有する分子で構成されていることを特徴とするものである。そして、このバイオセンサは該有機薄膜にプルシアンブルー（ＰＢ）及び／又はプルシアンホワイト（ＰＷ）を保持させて使用するものである。前記有機薄膜としては、例えばラングミュア・ブロジェット膜（以下、「ＬＢ膜」という。）を使用することができる。
前記有機薄膜（ＬＢ膜）は過酸化水素生成酵素を保持していてもよい。前記過酸化水素生成酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリコレートオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、グルコノラクトンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、オキザレイトオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ又はアミノ酸オキシダーゼ等、特定の有機物質との接触によって有効に過酸化水素を生成させるものをいう。
前記有機薄膜（ＬＢ膜）はカチオン性有機化合物を用いて形成することができる。前記カチオン性有機化合物とは、水に滴下した時、該有機化合物のアニオン部分が水に溶解し、カチオン部分が水中のプルシアンブルーと結合し、このプルシアンブルーと結合したものが水に溶解せず、水より比重が小さく、水面上に浮遊展開する化合物をいう。例えば、オクタデシルトリメチルアンモニウム（Octadecyltrimethylammonium ODA）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（Dimethyldioctadecylammonium DODA）等をカチオン部分として有する有機化合物を挙げることができる。
前記有機薄膜（ＬＢ膜）は１層でもよいが、２層以上積層されていてもよい。前記ＬＢ膜２層以上積層されている場合はバイオセンサから得られる信号電流値が大きくなり、計測が行いやすくなり、またバイオセンサの小型化が可能になるという利点がある。
また、本発明に係るバイオセンサの製造方法は、プルシアンブルー（ＰＢ）を含む水溶液に前記カチオン性有機化合物を含む溶液を滴下して該水溶液の表面にカチオン性有機化合物の分子を展開させる工程と、展開させた該カチオン性有機化合物の分子を圧縮して該水溶液の表面に該カチオン性有機化合物の分子からなるＬＢ膜を生成させる工程と、導電性を有する基材に該ＬＢ膜を接触させて該ＬＢ膜を該基材の表面に被覆又は積層させる工程とを備えたことを特徴とするものである。
ここで、ラングミュア・ブロジェット膜を表面に累積させた前記基材を過酸化水素生成酵素水溶液中に浸漬して該ラングミュア・ブロジェット膜中に過酸化水素生成酵素を含ませるようにする工程を備えてもよい。
前記過酸化水素生成酵素としては、例えばグルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリコレートオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、グルコノラクトンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、オキザレイトオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ又はアミノ酸オキシダーゼ等、特定の有機物質との接触によって有効に過酸化水素を生成させるものをいう。
前記ＬＢ膜はカチオン性有機化合物を用いて形成することができる。前記カチオン性有機化合物とは、水に滴下した時、該化合物のアニオン部分が水に溶解し、カチオン部分が水中のプルシアンブルーと結合し、このプルシアンブルーと結合したものが水に溶解せず、水より比重が小さく、水面上に浮遊展開する化合物をいう。例えば、オクタデシルトリメチルアンモニウム（Octadecyltrimethylammonium ODA）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（Dimethyldioctadecylammonium DODA）等をカチオン部分として有する有機化合物を挙げることができる。
本発明のバイオセンサでは、図１に示すような酸化還元サイクルが生じている。すなわち、バイオセンサの表面ではグルコースオキシターゼが試料溶液中のグルコース(Glucose)を、化１に示すように酸化させてグルコノラクトン(Gluconolactone)に変化させ、グルコースオキシダーゼ自身の活性中心はＦＡＤからＦＡＤＨ２に変化する。ＦＡＤＨ２は試料溶液中の酸素と反応して脱水素されＦＡＤに戻る。
試料溶液中の酸素（Ｏ２）はＦＡＤＨ２から水素（Ｈ２）を受け取って過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）となり、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）はプルシアンブルー（PB）とその還元体であるプルシアンホワイト(PW)との間の酸化還元サイクルを介して還元される。この酸化還元サイクルでは化２に示すような酸化還元反応が生じている。
結局、この酸化還元サイクルにおいて、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は化３に示すような反応により還元され、還元電流を発生させる。そして、この酸化還元サイクルは、Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して、０Ｖのレベルで生ずるため、低い電圧で目的成分の測定が可能となる。
このように、本発明のバイオセンサは、参照極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）に対して０ボルト電位で測定できるので、目的成分以外の侠雑成分の電気化学的反応が信号として混入する心配が無く、極めて高精度な測定ができるという利点がある。
また、酵素を保持している層が厚くなると、酵素により生成された過酸化水素が酵素を保持している層を通って電極まで拡散するのに時間を要するが、本発明のバイオセンサは膜厚が分子の大きさレベルのＬＢ膜で酵素を保持しているので、酵素を保持している層を過酸化水素が拡散するのに要する時間が短く、従って、計測時の応答速度がきわめて速いという利点がある。
また、本発明のバイオセンサは膜厚が分子の大きさレベルのＬＢ膜で酵素を保持しているので、表面積/体積比が大きく、一つの酵素がより多くの基質（ここではグルコース）と相互作用する確率が高く、わずかな酵素量で実用的な素子を形成することができるという利点がある。
また、本発明のバイオセンサは、基板にＬＢ膜を被覆させ、ＬＢ膜に酵素を含浸させるという極めて簡易な方法で製造することができるので、大量に安価に製造することができるという利点がある。
また、本発明のバイオセンサは、作用電極と対電極の間に流れる電流密度が比較的高く（１ｍＭグルコースで０．１μＡ／ｃｍ２）、電流信号が大きいので、計測が行い易く、また、小型化が可能であるという利点がある。
本発明に係るバイオセンサは、作用電極の表面で侠雑成分が酸化還元反応を生じさせないようにし、作用電極と対電極との間で流れる電流を目的成分の酸化還元反応にのみ由来させるようにするという目的を、簡単な構成で、目的成分の分析精度を低下させることなく実現させた。
Ａ．事前準備
プルシアンブルー（ＰＢ）を純水に溶解し、濃度1×１０−５ｍｏｌ／Ｌのプルシアンブルー水溶液（ＰＢ水溶液）を作製した。また、クロロホルムにオクタデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(Octadecyltrimethylammonium bromide)（ＯＤＡ）を溶解し、９．１７×１０−４ｍｏｌ／ＬのＯＤＡクロロホルム溶媒溶液を作製した。
プルシアンブルー（ＰＢ）を純水に溶解し、濃度1×１０−５ｍｏｌ／Ｌのプルシアンブルー水溶液（ＰＢ水溶液）を作製した。また、クロロホルムにオクタデシルトリメチルアンモニウムブロマイド(Octadecyltrimethylammonium bromide)（ＯＤＡ）を溶解し、９．１７×１０−４ｍｏｌ／ＬのＯＤＡクロロホルム溶媒溶液を作製した。
また、ガラス基板（コーニング社製、Ｎｏ．７０５９、縦２０ｍｍ、横１０ｍｍ、厚さ５ｍｍ）の表面にＣｒを厚さ５０ｎｍ蒸着し、その上に金を厚さ２５０ｎｍ蒸着したものを用意した。
また、塩化カリウム（ＫＣｌ）を純水に溶解し、０．５ｍｏｌ／Ｌの水溶液を作成し、このＫＣｌ溶液にグルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）を１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解したＧＯｘ水溶液を作製した。
Ｂ．ＬＢ膜の作製及び積層
前記ＰＢ水溶液中に前記基板を挿入・浸漬させ、ＰＢ水溶液上に前記ＯＤＡクロロホルム溶媒溶液を滴下し、図２（ａ）に示すように、ＯＤＡクロロホルム溶媒溶液をＰＢ水溶液の表面に展開させた。
前記ＰＢ水溶液中に前記基板を挿入・浸漬させ、ＰＢ水溶液上に前記ＯＤＡクロロホルム溶媒溶液を滴下し、図２（ａ）に示すように、ＯＤＡクロロホルム溶媒溶液をＰＢ水溶液の表面に展開させた。
ＯＤＡクロロホルム溶媒溶液をＰＢ水溶液の表面に展開させた後３０００秒間待ち、ＯＤＡとプルシアンブルー（ＰＢ）の静電相互作用による吸着反応を促進させ、ＯＤＡ分子にＰＢ水溶液中のＰＢナノ結晶を吸着させた。
３０００秒経過後、バリアを水平に移動させ、ＰＢ水溶液表面のＯＤＡ分子の圧縮を開始し、図２（ｂ）に示すように、ＰＢ水溶液の表面にＯＤＡ分子の単分子膜を形成させた。
表面圧力を３０ｍＮ／ｍに保ち、図２（ｃ）に示すように、基板を複数回上下させ、図２（ｄ）に示すように、ＯＤＡ分子の単分子膜を基板上に任意の層数だけ積層させた。各積層操作の間では、１２００秒間空気中で待ち、基板を完全に乾かすようにした。
予め用意しておいたＧＯｘ溶液中に基板を３０分間浸漬し、ＬＢ膜内にＧＯｘを固定させた。そして、この基板を洗浄せず、０．５ｍｏｌ／ＬのＫＣｌ溶液中に保存した。
Ｃ．グルコースの測定
上述のようにして形成したバイオセンサを作用電極として、三電極系のアンペロメトリー法による電流応答測定を行った。ここで、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌを、対電極にはＰｔを使用した。
上述のようにして形成したバイオセンサを作用電極として、三電極系のアンペロメトリー法による電流応答測定を行った。ここで、参照電極にはＡｇ／ＡｇＣｌを、対電極にはＰｔを使用した。
純水中にＫＨ２ＰＯ４とＫＣｌを加え、ＫＨ２ＰＯ４が０．０５ｍｏｌ／Ｌ、ＫＣｌが０．１ｍｏｌ／Ｌの溶液を作製した。次に、この溶液にKOH溶液を少しずつ加え、ｐＨ＝７となるように調節した。そして、酸素を吹き込み、溶存酸素が飽和している状態にした。測定はこの溶液中で行った。
測定条件は、初期電位０V、測定間隔１秒、測定時間３６００秒、感度１×１０−５Ａで測定を行った。なお測定中は、スターラを用いて９０ｒｐｍの速さで常に測定溶液の撹拌を行った。
測定開始後（電位印加後）２０００秒間待ち、測定溶液中の電流を安定させた。２０００秒経過後、測定溶液中のグルコース濃度が１ｍｍｏｌ／Ｌ増加するように調節した溶液を１００秒毎に滴下した。
Ｄ．測定の結果
ＬＢ膜を１１層累積した場合の測定結果を図３に示す。同図に示されるように、グルコースの滴下と同時に、電流の絶対値が増大した。すなわち、グルコース濃度に対応した電流応答が得られた。このことから、ＧＯｘが活性を失わずにＰＢナノ結晶を含む有機-無機複合ＬＢ膜内に固定化されており、ＧＯｘの酵素反応によって生成された過酸化水素が、プルシアンブルー（ＰＢ）によって還元され、電流が増大していることが分かる。グルコース１ｍＭに対する電流応答の大きさは、０．２２μＡ／ｃｍ２であった。
ＬＢ膜を１１層累積した場合の測定結果を図３に示す。同図に示されるように、グルコースの滴下と同時に、電流の絶対値が増大した。すなわち、グルコース濃度に対応した電流応答が得られた。このことから、ＧＯｘが活性を失わずにＰＢナノ結晶を含む有機-無機複合ＬＢ膜内に固定化されており、ＧＯｘの酵素反応によって生成された過酸化水素が、プルシアンブルー（ＰＢ）によって還元され、電流が増大していることが分かる。グルコース１ｍＭに対する電流応答の大きさは、０．２２μＡ／ｃｍ２であった。
図３の結果を用い、横軸にグルコース濃度を、縦軸に電流応答をとったグラフを図４に示す。図４においてグルコース濃度が１０ｍＭ付近までは、グルコース濃度に比例して電流値が直線的に増加していることが分かる。従って、このグルコース濃度と電流値変化の直線的な関係を利用して、グルコース濃度の分析が可能であることがわかる。
Claims (7)
- 試料溶液中に含まれている特定の有機物質を電気化学的に分析する分析装置の作用電極として使用するものであり、導電性を有する基材と、該基材を被覆する有機薄膜とを備え、該有機薄膜はカチオン性有機化合物の分子によって形成されたラングミュア・ブロジェット膜（以下、「ＬＢ膜」という。）からなり、該有機薄膜は過酸化水素生成酵素と、プルシアンブルー（ＰＢ）及び／又はプルシアンホワイト（ＰＷ）を保持しており、該プルシアンブルー（ＰＢ）及び／又はプルシアンホワイト（ＰＷ）はナノサイズの微結晶からなることを特徴とするバイオセンサ。
- 前記過酸化水素生成酵素がグルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリコレートオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、グルコノラクトンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、オキザレイトオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ又はアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする請求項１に記載のバイオセンサ。
- 前記カチオン性有機化合物がオクタデシルトリメチルアンモニウム（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ＯＤＡ）又はジメチルジオクタデシルアンモニウム（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ＤＯＤＡ）をカチオン部分として有する有機化合物であることを特徴とする請求項１又は５に記載のバイオセンサ。
- 前記有機薄膜が１層又は２層以上積層されていることを特徴とする請求項１、５又は７に記載のバイオセンサ。
- プルシアンブルー（ＰＢ）のナノサイズの微結晶を含む水溶液にカチオン性有機化合物を含む溶液を滴下して該水溶液の表面にカチオン性有機化合物の分子を展開させる工程と、展開させた該カチオン性有機化合物の分子を圧縮して該水溶液の表面に該カチオン性有機化合物の分子からなるＬＢ膜を生成させる工程と、導電性を有する基材に該ＬＢ膜を接触させて該ＬＢ膜を該基材の表面に被覆又は積層させる工程と、ＬＢ膜を表面に被覆又は積層させた前記基材を過酸化水素生成酵素水溶液中に浸漬して該ＬＢ膜中に過酸化水素生成酵素を含ませる工程とを備えたことを特徴とするバイオセンサの製造方法。
- 前記過酸化水素生成酵素がグルコースオキシダーゼ、ラクトースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、エタノールオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、グリコレートオキシダーゼ、マレートオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、グルコノラクトンオキシダーゼ、アミンオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、オキザレイトオキシダーゼ、ザルコシンオキシダーゼ、ウリカーゼ、ピラノースオキシダーゼ、グリセロールオキシダーゼ又はアミノ酸オキシダーゼであることを特徴とする請求項１０に記載のバイオセンサの製造方法。
- 前記カチオン性有機化合物がオクタデシルトリメチルアンモニウム（Ｏｃｔａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ＯＤＡ）又はジメチルジオクタデシルアンモニウム（Ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ ＤＯＤＡ）をカチオン部分として有する有機化合物であることを特徴とする請求項１０又は１２に記載のバイオセンサの製造方法。
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