WO2004048498A1 - 抗酸化剤、皮膚外用剤、化粧料及び食料品 - Google Patents

抗酸化剤、皮膚外用剤、化粧料及び食料品 Download PDF

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WO2004048498A1
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antioxidant
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acerola
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PCT/JP2003/014885
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Kenichi Nagamine
Miki Hayashi
Kaori Yamasaki
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Nichirei Biosciences Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to an antioxidant containing an extract of acerola seed as an active ingredient, an external preparation for the skin using the same, a cosmetic and a food product.
  • antioxidants have been used in the past to control the above-described oxidation of unsaturated fatty acids and peroxidation and prevent deterioration in quality.
  • Antioxidants act on peroxide radicals generated during oxidation to stop the chain reaction of oxidation, or to act on free radicals to stop the oxidation reaction.
  • a synthetic antioxidant such as, for example, butylhydroxyanisole (BHA) or butylhydroxytoluene (BHT) has been generally used.
  • BHA butylhydroxyanisole
  • BHT butylhydroxytoluene
  • these synthetic antioxidants are oil-soluble, so that it is difficult to use them in water.
  • collagen and hyaluronic acid are known as substances that act on water retention, flexibility and elasticity of the skin. Collagen makes up 90% of the dermis in the skin and is distributed throughout the dermis, causing the skin to retain moderate elasticity and strength. Also, hyaluronic acid It is widely distributed in living organisms such as the skin, synovial fluid, vitreous body, and ligament, and is responsible for adhesion of cells, protection of cells, formation of skin tissue, moisture retention of tissues, and maintenance of flexibility in the skin. Collagenase is known as an enzyme that degrades collagen in the body, and hyaluronidase is known as an enzyme that produces hyaluronic acid. When these reduce collagen ⁇ hyaluronic acid ⁇ ! It is said that the tension disappears and skin aging phenomenon such as blemishes and sagging occurs.
  • the fruit of acerola has recently become known as a plant containing abundant vitamin C, and is currently used as a beverage and health food in countries around the world.
  • acerola fruits containing abundant vitamin C are expected to be used in cosmetics in anticipation of the antioxidant effect of vitamin C contained in the extract (Japanese Patent No. 2814094 (Tokuheihei) 2-200610), JP-A-2000-212026, JP-A-2000-212027, JP-A-2000-212032).
  • An object of the present invention is to make it possible to effectively use acerola seed, which has been mostly discarded in the past, to be excellent in safety, and to exhibit an antioxidant effect exhibiting an excellent antioxidant effect when used in cosmetics and foodstuffs. To provide an agent.
  • Another object of the present invention is to provide a stable external antioxidant and collagenase activity inhibitory agent that is highly safe and can be expected to inhibit hyalinum nidase activity, and can be expected to prevent skin aging and wrinkles. And cosmetics. It is another object of the present invention to provide a foodstuff with excellent safety that can be expected to have a stable antioxidant effect.
  • the present inventors first intensively studied the usefulness of acerola seed, which had been conventionally discarded after squeezing fruit juice. As a result, they have found that an extract obtained from acerola seeds has a strong antioxidant ability, a collagenase activity inhibiting ability, and a hyaluronal nidase activity inhibiting ability, thereby completing the present invention.
  • an antioxidant containing a extract of acerola seed as an active ingredient, and further a collagenase activity inhibitor or a hyaluronidase activity inhibitor.
  • a skin external preparation or a cosmetic containing the antioxidant and further a skin external preparation containing at least one of the antioxidant, the collagenase activity inhibitor, and the hyaluronidase activity inhibitor.
  • cosmetics are provided.
  • Figure 1 is a photograph showing the result of measuring the antioxidant activity of each fraction obtained by fractionating the Asparagus seeds extract prepared in Example 1 by force lamb chromatography using thin-layer chromatography, using thin-layer chromatography. It is.
  • FIG. 2 is a graph showing the change over time of the absorbance of the Asparagus seed extract prepared in Examples 2 to 5 for measuring the acidification rate.
  • FIG. 3 is a graph showing the oxidation rate on day 14 of the Asparagus seed extract prepared in Examples 2 to 5.
  • FIG. 4 is a graph showing the oxidation rate of the acerola seed extract prepared in Example 6 on day 20.
  • FIG. 5 is a graph showing the time course of the absorbance of the acerola seed extract prepared in Example 8 for measuring the acidification ratio.
  • FIG. 6 is a graph showing the iridescence ratio of the acerola seed extract prepared in Example 8 on day 7.
  • FIG. 7 is a graph showing the change over time in the absorbance for measuring the oxidation rate of the compounds prepared in Formulation Example 5 and Comparative Formulation Example 1 performed in Example 9.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of a DPPH radical scavenging test performed in Example 10 for a lotion of Formulation Example 5 for 6 months.
  • FIG. 9 is a daraf showing the results of a DPPH radical scavenging test performed in Example 10 for six months of the lotion of Formulation Example 6.
  • the antioxidant of the present invention contains an extract of acerola seed as an active ingredient, and the extract is also useful as an active ingredient of a collagenase activity inhibitor and a hyaluronidase activity inhibitor.
  • Acerola seeds are seeds of acerola (Acerola, scientific name: Malpighia emarginata DC) native to the Atlantic Power Island of the West Indies.
  • Acerola's pulp is known to be rich in vitamin C and is used in foods and cosmetics, but its seeds have hardly been found to be used effectively.
  • the extract of acerola seed is not particularly limited as long as it is extracted using an extraction solvent, for example, as long as it has an antioxidant function such as linoleic acid autoxidation inhibitory ability and DFPH radical scavenging action.
  • the extraction method and conditions are not particularly limited. There are no restrictions on the production location and varieties of acerola seeds. For example, production locations include Okibashi and Brazil.
  • the extract of acerola seed is, for example, an extract obtained by milling raw acerola seed, a dried product or a frozen product thereof, and adding water and Z or an organic solvent, and an obtained extract. Concentrate, or a fractionated product obtained by further fractionating and purifying the extract or concentrate by liquid-liquid extraction or column chromatography, etc. , Paste, and solid.
  • the organic solvent used to obtain the extract may be either a hydrophilic organic solvent or a hydrophobic organic solvent.
  • the hydrophilic organic solvent include alcohols such as methyl alcohol, ethyl alcohol, glycerin, propylene glycol, and 1,3-butylene glycol; acetone, tetrahydrofuran, acetonitrile, 1,4-dioxane, pyridine, dimethyl sulfoxide, N , N-dimethylformamide, acetic acid and the like.
  • hydrophobic organic solvent examples include known organic solvents such as hexane, cyclohexane, carbon tetrachloride, chlorophonorem, dichloromethane, 1,2-dichloroethane, getyl ether, ethinole acetate, benzene, and toluene. .
  • organic solvents can be used alone or in combination of two or more.
  • water and / or Hydrophilic organic solvents especially methanol, ethanol, 1,3-butylene glycol, water, or mixtures or combinations thereof are preferred.
  • the temperature is 5 to 95 ° C, preferably 10 to 90 ° C, more preferably 15 to 85 ° C, and the extraction can be suitably performed at room temperature. Higher temperatures tend to increase extraction efficiency.
  • the extraction time is from several hours to several days, and the amount of the solvent used for the extraction is usually 1 to 20 times, preferably 2 to 10 times the weight of the raw material.
  • the extraction operation is not particularly limited, and may be performed according to a conventional method. In order to improve the extraction efficiency, the extraction can be performed by shaking extraction or by using an extractor equipped with a stirrer or the like.
  • the acerola seeds may be immersed in the extraction solvent, or the extract may be stirred and shaken with the extraction solvent without being immersed in the extraction solvent, and the treated liquid may be filtered, centrifuged or decanted. Then, an extraction treatment can be performed by separating into an extract and an extraction residue, and the extraction residue may be further subjected to the same extraction treatment.
  • the obtained extract may be used as it is, but if necessary, may be further subjected to concentration treatment and Z or fractionation / purification treatment.
  • the concentration treatment is not particularly limited, and may be, for example, solvent removal, 7 and / or a soluble content recovery process utilizing solubility in an organic solvent, an insoluble content recovery process, and a liquid-liquid distribution with a water-hydrophobic organic solvent.
  • Examples of the method include a treatment, a recrystallization treatment, a reprecipitation treatment, a treatment for collecting a precipitate generated by cooling, and a method of combining two or more kinds of treatments selected from these.
  • the fractionation / purification treatment is not particularly limited, and examples thereof include normal phase and reverse phase or reverse phase chromatography.
  • the extract of acerola seed as an active ingredient of the antioxidant of the present invention preferably contains quercitrin. Further, the extract of acerola seed as an active ingredient of the collagenase activity inhibitor and the hyaluronan nidase activity inhibitor may contain quercitrin.
  • the amount of the extract of acerola seed, which is an active ingredient can be appropriately selected depending on the form of use and the like.
  • the skin external preparation and the cosmetic of the present invention contain the antioxidant of the present invention.
  • the type of the cosmetic is not particularly limited, and examples thereof include skin care cosmetics such as cosmetic lotions, emulsions, creams, packs, and detergents; makeup cosmetics such as lipsticks and foundations; Hair cosmetics and the like are mentioned, and the dosage form is not particularly limited and is arbitrary.
  • skin care cosmetics such as cosmetic lotions, emulsions, creams, packs, and detergents
  • makeup cosmetics such as lipsticks and foundations
  • Hair cosmetics and the like are mentioned
  • the dosage form is not particularly limited and is arbitrary.
  • Examples of the external preparation for skin include ointments, various skin preparations, and the like.
  • the compounding ratio of the antioxidant of the present invention, further, the collagenase activity inhibitor or the hyaluronidase activity inhibitor depends on the type, amount, and form of other components to be mixed. Although it can be appropriately selected according to the conditions and the like, it is usually 0.001 to 20% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight, based on the total weight of the external preparation for skin or the cosmetic, in terms of the dry matter of the acerola seed extract.
  • the skin external preparation or the cosmetic of the present invention may contain various other components which are usually used as a skin external preparation raw material or a cosmetic raw material, as long as the desired effects of the present invention are not impaired.
  • Other components include, for example, water, oils, surfactants, lubricants, alcohols, water-soluble polymers, gelling agents, humectants, buffers, preservatives, anti-inflammatory agents, thickeners, fragrances , Vitamins, and antioxidants other than the antioxidant of the present invention. At the time of use, one or more of these can be appropriately selected and blended.
  • the food of the present invention may contain the antioxidant of the present invention, and the type of the food is not particularly limited, and examples thereof include candy, beverage, jam, and chewing gum.
  • the dosage form is not particularly limited and is arbitrary.
  • the mixing ratio of the antioxidant of the present invention can be appropriately selected according to the type of the food and the type, amount, form, and the like of other components to be mixed in the food.
  • the amount is 0.001 to 20% by weight, preferably 0.01 to 10% by weight in terms of dry matter of acerola seed extract, based on the total amount of food.
  • the food of the present invention can be blended with various other ingredients that are usually used as food materials, as long as the desired effects of the present invention are not impaired.
  • Other components include, for example, 7, alcohols, sweeteners, sour agents, coloring agents, preservatives, flavors, excipients, and the like. Two or more can be blended.
  • the antioxidant of the present invention and furthermore, the hyaluronidase activity inhibitor and the collagenase activity inhibitor, comprising an extract of acerola seed as an active ingredient, are excellent in safety, and have a strong antioxidant action, a hyaluronidase activity inhibitory action or a collagenase activity inhibition. Has an action. Since the external preparation for skin, cosmetics and foodstuffs of the present invention contain the antioxidant of the present invention and furthermore the inhibitor of hyaluronidase activity or collagenase activity, they have anti-aging effect, anti-wrinkle effect and active oxygen. As a result, the effect of maintaining the quality of foodstuffs and preventing odors can be obtained. In addition, the effective use of Asaguchi seeds, which were industrial waste, will be possible.
  • the concentrate (A) was fractionated by silica gel column chromatography using a column packed with silica gel ( ⁇ Corsil C-300: Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: h).
  • each fraction was confirmed by an evaluation method using thin-layer chromatography ( ⁇ ⁇ ). That is, a sample of each fraction was applied to a silica gel thin layer plate and developed with a developing solvent. At this time, using a plate containing a fluorescent indicator (5F Sili Ca Gel 150A: After developing Whatman, the dried plate was irradiated with ultraviolet light to detect the spot of the sample having UV absorption. Is a radical
  • Diphenyl-p-picrylhydradilCDPPH 6X 10- 4 ⁇ methanol was sprayed.
  • the DPH solution is purple in color, but loses its color when radicals are eliminated. For this reason, in the spot part of the substance having the radical scavenging activity, the spot part appears white as a result of the DPPH radical being scavenged.
  • fraction 19 was further purified by reversed-phase high performance liquid chromatography (HPLC).
  • HPLC reversed-phase high performance liquid chromatography
  • the high-quantity mass spectrum was measured, and a precise weight of 447.0917 was obtained.
  • the composition was calculated as a seed.
  • the composition formula C 21 H 19 O u that satisfies the number of carbon atoms 21 observed in the 13 C-NMR spectrum was calculated, and the molecular formula was determined to be C ⁇ HwOu.
  • the result of comparison of the MR spectrum with the spectrum of quercitrin (quercetin-3-rhamnoside) sample showed a match, and the substance separated and purified from the extract of acerola seed was identified as quercitrin. did.
  • Quercitrin is one of the flavonoids, is widely distributed in nature, and is known to be particularly abundant in dokudami. From the above results, it was found that quercitrin was contained in acerola seeds and that the quercitrin was one of the substances involved in the antioxidant activity in the extract.
  • the antioxidant activity of the obtained extract was measured by antioxidant activity measurement using linoleic acid (rodan iron method).
  • test solution in which only 2 ml of 99.5% ethanol and 2 ml of distilled water were added to the reaction solution without adding acerola seed extract was used.
  • Each test solution obtained was stored at 40 ° C in a place at the main test, and the test solution stored at 4 ° C was blinded.
  • the test sample was taken out over time and measured by the following method. went. The test lasted 14 days.
  • the test object 0.1ml, 75% ethanol 9.7 ml, in a mixture of 30% port Dananmoniumu solution 0.1ml, 2X 10 '2 M Shioi ⁇ ferrous (2.2% hydrochloric acid Nada) correctly after adding 0.1ml
  • the absorbance at 500 nm was measured.
  • Blindness was measured in the same manner, and ⁇ absorbance: (absorbance of main test) / (absorbance of blind test) was determined.
  • the absorbance increases as the sample begins to oxidize, and after reaching the highest point, decreases as the sample to be oxidized decreases. Therefore, it can be said that the antioxidant activity is weaker as the absorbance peak starts to be generated earlier.
  • using the oxidation rate The antioxidant activity of each test solution was compared. The oxidation rate was determined by the following equation, assuming that the oxidation of the control ( ⁇ absorbance) was 100%. The higher the oxidation rate, the lower the antioxidant activity.
  • Acidity ratio (%) ( ⁇ absorbance of the material) / [ ⁇ absorbance of the control]) X 100
  • Fig. 2 shows the results of changes in absorbance over time
  • Fig. 3 shows the oxidation rate of each sample solution 14 days after the start of the test.
  • (C-1) is a control
  • (C-2) is ⁇ -tocopherol
  • (C-3) is ⁇
  • (E-2) is the casea seed extract prepared in Example 2
  • (E-3) is the acerola seed extract prepared in Example 3
  • (E-4) is the acerola seed extract prepared in Example 4
  • (E-5) is the acerola seed prepared in Example 5.
  • Each extract is shown.
  • Fig. 2 shows the results of changes in absorbance over time
  • Fig. 3 shows the oxidation rate of each sample solution on day 14 after the start of the test.
  • the aqueous ethanol solution was added, and shaken at room temperature overnight. After filtering the whole amount with the same filter as in Example 2, the filtrate was concentrated to dryness to obtain 2.27 g of an extract.
  • the antioxidant activity was measured in the same manner as in Example 2 using the obtained extract.
  • Fig. 2 shows the results of changes in absorbance over time
  • Fig. 3 shows the oxidation rate of each sample solution on day 14 after the start of the test.
  • FIG. 2 shows the results of the change in absorbance over time
  • FIG. 3 shows the oxidation rate of each sample solution on day 14 after the start of the test.
  • the extract of acerola seed clearly has the effect of inhibiting the oxidation of linoleic acid, and its strength is equal to or greater than that of the representative antioxidants ⁇ -tocopherol and ⁇ . It turned out to be. Furthermore, from the results of Examples 2 to 5, the extraction solvent It can be seen that the strength of the antioxidant activity can be controlled by changing the proportion of ethanol in the aqueous ethanol used.
  • the washed asparagus seeds 760 were crushed, 5-fold weight of methanol was added, and the mixture was stirred at room temperature. The whole amount was centrifuged, filtered, and the filtrate was concentrated to dryness to obtain 12.36 g of an extract. 300 ml of water was added to this extract, 100 ml of hexane was further added, and the mixture was shaken. Then, a separated aqueous layer was collected. The same shaking using hexane was repeated three more times for this aqueous layer.
  • the aqueous layer obtained by removing the hexane layer was shaken by adding 100 ml of ethyl acetate and shaken six times.
  • the separated ethyl acetate layers were collected and concentrated to dryness to obtain a solid content of 0.41 g. Was.
  • FIG. 4 shows the oxidation rate of each sample solution 20 days after the start of the test.
  • (C-1) indicates a control
  • (C-2) indicates a-tocopherol
  • (C-3) indicates BHA
  • (E-6) indicates an acerola seed extract prepared in Example 6.
  • the antioxidant activity of the obtained acerola seed extract was measured by the following method using DPPH radical scavenging. Table 1 shows the results.
  • the sample concentration of the sample solution was changed stepwise to measure the above erasure rate, and the concentration of the sample solution at which the elimination rate of DPPH radical became 50% was determined. Is low! / Means that the radical scavenging ability is higher V ⁇ .
  • the antioxidant activity of the obtained acerola seed extract was measured in the same manner as in Example 2 by the iron-rodan method. However, since the acerola seed extract is a solution, it is diluted with water and ethanol to the required concentration and added. The control of the acerola seed extract is the same as that of the added acerola seed extract. The one containing no acerola seed extract was used. The test period was 7 days.
  • FIG. 5 shows the results of the absorbance change over time
  • FIG. 6 shows the iridescence ratio of each sample solution on day 7 after the start of the test.
  • C-1 shows control
  • C-2 shows human tocopherol
  • C-3) shows BHA
  • E-8) shows acerola seed extract prepared in Example 8.
  • Figures 5 and 6 show that acerola seed extract clearly has the effect of inhibiting the oxidation of linoleic acid, and its strength is equal to or higher than that of tocopherol and ⁇ .
  • the amount of vitamin C in the acerola seed extract prepared above was measured, and the antioxidant effect of the acerola seed extract was measured. It was examined whether or not it was only due to vitamin C that contained.
  • the amount of vitamin C contained in 100 g of the acerola seed extract prepared above was measured. As a result, it was 57 mgZl00g (complexed vitamin C: 56 mg / 100 g + reduced vitamin C: lmgZlOOg).
  • 100 g of the acerola seed extract prepared above was evaporated to dryness to obtain 975 mg of solids.
  • the antioxidant activity was measured in the same manner as in Example 2 by the iron-rodan method.
  • the acerola seed extract of the present example was a solution, it was diluted and added to the reaction solution so as to contain 0.4 mg as a solid as described above.
  • the same composition of the added extract of Acerola seed and containing no Acerola seed extract was used for the control. The measurement was performed for 7 days.
  • antioxidant activity was similarly measured using 0.023 mg (0.4 mgX (57 mg / 975 mg)) of vitamin C contained in 0.4 mg of the solid content.
  • quercitrin which is one of the substances showing the antioxidant action confirmed in Example 1, is evaluated as to whether or not quercitrin is contained in the acerola seed extract prepared as described above. Was measured in the same manner as in Example 1. As a result, it was found that quercitrin was contained.
  • quercitrin has an antioxidant action.
  • the following method was used to determine whether or not the antioxidant eczema activity in the above acerola seed extract was caused solely by quercitrin.
  • quercitrin is a type of polyphenol
  • the amount of polyphenol in the extract of Asparagus seeds prepared above was measured by the Folin-Denis method, and it accounted for 975 mg of solids in 100 g of the extract.
  • the proportion of polyphenol was 25%. Therefore, the amount of quercitrin contained in the solid content of the acerola seed extract prepared above is at most 25%.
  • the antioxidant activity was measured by the rhodane iron method in the same manner as in Example 2 as in the comparative test with vitamin C. At this time, the measurement was performed in 7 days.
  • quercitrin contained in the acerola seed extract is one of the active ingredients having an antioxidant effect of the extract, but the antioxidant activity of the extract is only an effect of quercitrin. Instead, it was found that acerola seed extract was superior to the antioxidant effect of quercitrin alone.
  • Substrate solution 0.39 mg of P Z -peptide (BACHEM ne: h3 ⁇ 4) was dissolved in 1 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7.1, containing 20 mM salted calcium) and used (equivalent to 0.5 mM) .
  • Enzyme solution Dissolve 5 mg of collagenase (TYPE IV, Sigma) in 1 ml of distilled water, dispense 100 portions, and store at 20 ° C. When used, it was diluted 50 times with distilled water and used for the reaction. (Collagenase activity inhibitory assay)
  • the extract of Example 2 was prepared by dissolving it in each extraction solvent to a concentration of 15 mgZml, and the extracts of Examples 3, 4 and 5 at a concentration of 0.5 mg / ml, and used as sample solutions.
  • sample solution 501, collagenase solution 50 ⁇ l and substrate solution 400 were mixed and incubated at 37 ° C for 30 minutes. Then, the reaction was stopped with 1 ml of a 25 mM citrate solution and extracted with 5 ml of ethyl acetate. After centrifugation (3000 rpm, 10 minutes), the absorbance of the ethyl acetate layer at a wavelength of 320 nm was measured using ethyl acetate as a control. As a control, each extraction solvent was used in place of the sample solution, and as a blank, distilled water was added instead of the enzyme solution, and the same operation was performed.
  • Inhibition rate (%) [1— (A-B) / (C-D)] ⁇ 100
  • A absorbance of the sample solution at 320 nm
  • B absorbance of the sample solution blank at 320 nm
  • C absorbance of the control solution at 320 nm
  • D absorbance of the control solution blank at 320 nm
  • the collagenase activity inhibition rate of the extracts of Examples 2 to 5 was determined by the above method. Table 2 shows the results Show two.
  • the collagenase activity inhibitory activity was measured in the same manner as in Reference Example 1. However, since the extract of Example 8 is a solution, diluted with 30 weight 0/0 1,3 Petit glycol water is the extraction solvent as Aserora seed extract is a concentration of 0.5mgZml as a solid This was used as a sample solution.
  • the collagenase activity inhibition rate of the extract of Example 8 was determined as described above, and was found to be 71.5%.
  • the inhibitory effect of the extract prepared in Example 8 on hyalurodidase activity was measured.
  • the measurement of the inhibition of hyalinide nidase activity was carried out by the method of Yukie Maeda et al. (Medical Journal, Vol. 31, 233-237, 1990) to which the Morgan-Elson method was applied.
  • P-Dimethylaminobenzaldehyde (p-DAB) reagent 10 g of p-DAB (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is dissolved in a mixture of 12.5 ml of 10N hydrochloric acid and 87.5 ml of acetic acid, and refrigerated. Immediately before use, the solution was diluted 10-fold with acetic acid.
  • Example 8 Since the extract of Example 8 is a solution, and diluted with 30 weight 0/0 1,3 Petit glycol aqueous solution is extracted solvent such Aserora seed extract at a concentration of lmg / ml as a solid This was used as a sample solution. 0.2 ml of the enzyme was added to 0.2 ml of this sample and the sickle, and the mixture was left at 37 ° C for 20 minutes. Next, add 0.2 ml of the enzyme activation solution, heat at 37 ° C for 20 minutes, add 0.5 ml of the substrate solution and react at 37 ° C for 40 minutes, then add 0.4N sodium hydroxide aqueous solution.
  • Inhibition rate (%) [1-(A-B) / (C-D)] X 100
  • A absorbance of the sample solution at 585 nm
  • B absorbance of the sample solution blank at 585 nm
  • C absorbance of the control solution at 585 nm
  • D absorbance of the control ⁇ blank at 585 nm
  • the rate of inhibition of hyalinidase activity of the extract of Example 8 by the above method was 94.5%.
  • control group Two groups of rats (control group, administration group) were tested with 5 males and 5 males / group, and the administration group was administered 2 g / kg per body weight.
  • the obstruction was applied to the healthy skin of three guinea pigs for 24 hours. At 24 hours, 48 hours and 72 hours after administration, the skin condition was observed and judged.
  • a group of 5 guinea pigs (control group, application group, DNCB group) was tested in accordance with the Adjuvant and Patch Test method in group Z of 5 animals, and the skin condition was evaluated 24 hours and 48 hours after application. Observation was made to determine.
  • a group of 5 guinea pigs (control group, administration group, TCSA group) were tested in accordance with the Ajuvant and Strip method in group 5 of 5 animals, and the skin condition was observed 24 hours and 48 hours after UV irradiation. The judgment was made.
  • the test was performed on 2 groups of non-heron (non-eye-washing group, eye-washing group) and 3 groups of Z animals. After instillation, leave the non-eyewash group as it is, and wash the eyewash group with warm saline for about 1 minute, and then observe the condition of the cornea, iris and conjunctiva after 1, 24, 48 and 72 hours. And AFNOR classification.
  • the pre-incubation method was used to measure S9mi without S9mix and S9mix.
  • CHLZIU cell Using a mammalian cultured cell (CHLZIU cell), three groups (negative control group, test substance group, positive control group) were treated with a short-time treatment method (6-hour treatment: no S9mix added and S9mix added) and The study was performed using a continuous processing method (24 hours and 48 hours).
  • the solution (1) was added little by little to the solution (2), emulsified, cooled with stirring, and cooled to 40 ° C.
  • the stirring was stopped to prepare a uniformly mixed cream.
  • Example 2 100 g of concentrated grapefruit juice, 150 g of sugar, 15 g of honey, 1.5 g of acerola seed extract (A) prepared under the same conditions as in Example 2 and an appropriate amount of flavor were mixed with purified water so that the total amount would be 1000 g. . Then, the mixture was sterilized at 95 ° C for 20 minutes, and aseptically filled in 100 ml bottles to produce grapefruit juice.
  • POP (6) A solution obtained by mixing and stirring 0.6 parts by weight of decyltetradecyl ether, 10.0 parts by weight of ethanol and 0.1 part by weight of methylparaben at 50 ° C, separately adding 0.1 part by weight of sodium citrate and pyrrolidone-potassium A solution prepared by mixing and stirring 1.0 part by weight of sodium acid, 4.4 parts by weight of 1,3-butylene glycol and an appropriate amount of purified water at 50 ° C was added, and the mixture was cooled to 30 ° C with stirring. Further, 2.0 parts by weight of the acerola seed extract prepared in Example 8 was added, mixed and stirred, and finally, an appropriate amount of purified water was added to adjust the total amount to 100 parts by weight. Again, the mixture was stirred and uniformly mixed to prepare a lotion.
  • Example 8 3.5 parts by weight of 1,3-butylene glycol and the acerola seed prepared in Example 8 A lotion was prepared in the same manner as in Formulation Example 5, except that the blending amount of the baby extract was changed to 5.0 parts by weight.
  • a lotion was prepared in the same manner as in Formulation Example 5, except that the amount of 1,3-butylendallicol was changed to 5.0 parts by weight and the extract of acerola seed prepared in Example 8 was not used. .
  • the oxidation inhibitory effect of linoleic acid was measured by the same rhodane iron method as in Example 2.
  • the iridescence-inhibiting action was similarly measured for the lotion prepared in Comparative Formulation Example 1 containing no acerola seed extract.
  • each of the cosmetics prepared in Formulation Example 5 or Comparative Formulation Example 1 was used instead of 0.4 mg of Aspera seed extract added to the reaction solution in Example 2, 2 ml of 99.5% ethanol and 2 ml of distilled water.
  • the test was performed by adding 2 ml of water, 1.8 ml of 99.5% ethanol and 0.2 ml of distilled water.
  • FIG. 7 shows the results of the change in absorbance over time.
  • the oxidation rate of the lotion sample prepared in Formulation Example 5 on the 28th day after the start of the test was 100%, and the oxidation rate ( ⁇ absorbance) of the lotion sample prepared in Comparative Formulation Example 1 on the 21st day was 100%.
  • the result was 7.2%.
  • the lotion of Formulation Example 5 prepared by mixing the acerola seed extract was superior to the lotion of Comparative Formulation Example 1 in linoleic acid. Showed an antioxidant effect, and the effect was maintained after 28 days.
  • the lotions of Formulation Example 5 and Preparation Example 6 containing the Asparagus seed extract showed an excellent DPPH radical scavenging effect, and the effect was 40 ° C. It was not lost after being stored for six months under severe conditions.
  • Formulation Example 6 containing a large amount of the acerola seed extract showed a higher antioxidant effect than that of Formulation 6, and was also excellent in sustainability.
  • the lotion containing the acerola seed extract has an excellent antioxidant effect, which is resistant to long-term storage, especially at high temperatures, and its effect is determined by the amount of the acerola seed extract added. It was confirmed that higher and higher can be expected.

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Abstract

廃棄処理されていたアセロラ種子の有効利用が可能となり、安全性に優れ、皮膚外用剤、化粧料や食料品等に利用して優れた抗酸化作用等を示す抗酸化剤、これを含む皮膚外用剤、化粧料又は食料品であって、アセロラ種子の抽出物を有効成分として含む。

Description

明細書
抗酸化剤、 皮膚外用剤、 ィ匕粧料及び食料品
技術分野
本発明は、 ァセロラ種子の抽出物を有効成分とする抗酸化剤、 これを用いた皮膚外 用剤、 ィ匕粧料及び食料品に関する。
背景技術
食品、 ィヒ粧品、 医薬品等の物品において油脂類を含む場合、 その貯蔵、 保存、 加工 の過程において最も問題になるのは、 空気中の酸素による油脂成分等の酸ィ匕ゃ過酸化 である。 とりわけ、 油脂中に含まれるリノール酸、 リノレン酸等の不飽和脂肪酸は、 酸素により容易に過酸ィ匕されて過酸化脂質やフリーラジカルを生成し、 更には発癌性 物質をも生成することが知られている。 このような酸ィヒゃ過酸化が起こると、 着色、 変色、 変性、 異臭あるいは栄養価の有効性の低下ばかりカゝ、 毒物の生成等が生じ、 製 品の品質の劣化を招く。
そこで、 前述の不飽和脂肪酸の酸化及ぴ過酸ィ匕を神制し、 品質の劣化を防ぐために 従来から種々の抗酸化剤が用いられている。 抗酸化剤は、 酸化の際に生ずるペルォキ シドラジカルに作用し、 酸化の連鎖反応を停止させるか、 あるいはフリーラジカルに 作用して酸化反応を停止させる。 抗酸化剤としては、 従来から、 例えば、 プチルヒド ロキシァニソール (BHA)やプチルヒドロキシトルェン (BHT)等の合成抗酸化剤が一般 に用いられている。 ところが、 近年、 合成抗酸化剤の使用が増えるにつれその安全性 が問題にされ、 消費者の拒否反応が強くなってきていると共にその使用量も減ってい る。 また、 これら合成抗酸化剤は、 油溶性であるため水^ ¾への使用が困難である。
—方、 安全性の高い天然物由来の抗酸ィ匕剤としては、 例えば、 天然ビタミン E (ひ- トコフェロール)、 ビタミン C等が知られている。 しかし、 これら天然物由来の抗酸 ィ匕剤は、 極端な脂溶性又は水溶性という性質を有しているため、 その利用には限度が 生じる。 また、 その活性が長時間安定に持続しない等の欠点もある。
従って、 抗酸化活性が強く、 水への溶解性に富み、 しかも抗酸化活性が長時間安定 である天然物由来の抗酸化剤が強く求められている。
また、 皮膚の水分保持、 柔軟性、 弾力性に作用する物質として、 コラーゲンやヒア ルロン酸などが知られている。 コラーゲンは、皮膚では真皮の 90%を占め、真皮全体 に分布しており、 皮膚に適度な弾性及び強度を保持させる。 また、 ヒアルロン酸は、 皮膚、 関節液、 硝子体、 靭帯など生体に広く分布しており、 皮膚において、 細胞の接 着、細胞の保護、皮膚組織の形成、組織の水分保持、柔軟性の維持などを担っている。 生体内でコラーゲンを分解する酵素としてコラゲナーゼ、 ヒアルロン酸を^!する酵 素としてヒアルロニダーゼが知られているが、 これらによってコラーゲンゃヒアル口 ン酸が^!されその量が減少すると、 皮膚の潤い、 ハリがなくなり、 皮膚の老化現象 であるシヮやたるみが起こるといわれている。
そこで、 皮膚外用剤や各種化粧料に、 皮膚の老化防止やしわ防止作用等を期待して これら酵素の活性を阻害する物質等を配合することが提案され、 従来、 様々なコラゲ ナーゼ活性阻害剤やヒアノレロニダーゼ活性阻害剤が開発されている。
ところで、 ァセロラの果実は、豊富なビタミン Cを含む植物として近年知られるよ うになり、 現在では世界各国で飲料や健康食品として用いられている。 また、 豊富な ビタミン Cを含むァセロラの果実は、その抽出物に含まれるビタミン Cによる抗酸化 作用等を期待して化粧料に用いられるようになっている (特許第 2814094号明細書 (特 開平 2-200610号公報)、 特開 2000-212026号公報、 特開 2000-212027号公報、 特開 2000-212032号公報)。
し力 し、 ァセロラの果実においてィ匕粧品や食料品に利用されているのは、 ビタミン Cを多く含む果肉のみであり、 その種子は、 有効利用の途がほとんど見出されておら ず、 大部分が廃棄されているのが現状である。 最近、 ァセロラ種子を含む植物の種子 を水蒸気蒸留法により処理して得られる水蒸気蒸留水を、 皮膚感触改善効果を期待し てィ匕粧料に配合した組成物が提案されている (特開 2001-226218号公報)が、 更なる有 効利用の途が望まれている。
また、 このようなァセロラの種子は、 その含有成分、 及びその作用等についてもほ とんど知られていない。
発明の開示
本発明の目的は、 従来、 そのほとんどが廃棄されていたァセロラ種子の有効利用が 可能となり、 安全性に優れ、 ィ匕粧料や食料品等に利用して優れた抗酸化作用を示す抗 酸化剤を提供することにある。
本突明の他の目的は、 安定した抗酸化作用、 コラゲナーゼ活性阻害作用ゃヒアル口 ニダーゼ活性阻害作用を期待しうる安全性に優れ、 皮膚の老化防止やしわ防止作用が 期待しうる皮膚外用剤及び化粧料を提供することにある。 本発明の別の目的は、 安定した抗酸化作用を期待しうる安全性に優れた食料品を提 供することにある。
本発明者らは、 上記目的を解決するために、 まず、 従来、 果汁の圧搾後、 廃棄され ていたァセロラ種子の有用性について鋭意検討した。 その結果、 ァセロラ種子から得 られる抽出物が、 強力な抗酸化能、 コラゲナーゼ活性阻害能及ぴヒアル口ニダーゼ活 性阻害能を有することを見出し、 本発明を完成するに至った。
本発明によれば、 ァセロラ種子の抽出物を有効成分として含む抗酸化剤、 更にはコ ラゲナーゼ活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害剤が提供される。
また本発明によれば、 前記抗酸化剤を含む皮膚外用剤又は化粧料が提供され、 更に は前記抗酸化剤、 前記コラゲナーゼ活性阻害剤、 前記ヒアルロニダーゼ活性阻害剤の 少なくとも 1種を含む皮膚外用剤又は化粧料が提供される。
更に本発明によれば、 前記抗酸化剤を含む食料品が提供される。
図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1で調製したァセ口ラ種子抽出物を力ラムクロマトグラフィ一で分 画した各画分の抗酸化活性を薄層クロマトグラフィーを用いて測定した結果を示す写 真の写しである。
図 2は、 実施例 2〜 5で調製したァセ口ラ種子抽出物の酸ィ匕率測定のための吸光度 の経時的変化を示すグラフである。
図 3は、 実施例 2〜 5で調製したァセ口ラ種子抽出物の 1 4日目の酸化率を示すグ ラフである。
図 4は、 実施例 6で調製したァセロラ種子抽出物の 2 0日目の酸化率を示すグラフ である。
図 5は、 実施例 8で調製したァセロラ種子抽出物の酸ィ匕率測定のための吸光度の経 時的変化を示すグラフである。
図 6は、 実施例 8で調製したァセロラ種子抽出物の 7日目の酸ィ匕率を示すグラフで める。
図 7は、 実施例 9で行つた処方例 5及び比較処方例 1で調製した化 »の酸ィ匕率測 定のための吸光度の経時的変化を示すグラフである。
図 8は、実施例 1 0で行った処方例 5の化粧水の 6ヶ月間に亘る DPPHラジカル消 去試験の結果を示すグラフである。 図 9は、実施例 1 0で行つた処方例 6の化粧水の 6ヶ月間に亘る DPPHラジカル消 去試験の結果を示すダラフである。
発明の好ましい実施の態様
以下、 本発明について詳細に説明する。
本発明の抗酸化剤は、 ァセロラ種子の抽出物を有効成分として含み、 該抽出物は、 コラゲナーゼ活性阻害剤及びヒアルロニダーゼ活性阻害剤の有効成分としても有用で あ 。
ァセロラ種子は、 大西洋の力リブ海西ィンド諸島を原産とするァセロラ (Acerola、 学名: Malpighia emarginata DC)の種子である。
ァセロラの果肉はビタミン Cが豊富であることが知られ、食料品、化粧品等に利用 されているが、 その種子は、 その有効利用の途がほとんど見出されていない。
ァセロラ種子の抽出物は、 例えば、 抽出溶媒を用いて抽出したものであれば特に限 定されず、リノール酸自動酸化抑制能や DFPHラジカル消去作用等の抗酸化機能を有 しておれば、 その抽出方法や条件は特に限定されない。 また、 ァセロラ種子の生産地 及び品種についても何ら制限されず、 例えば、 生産地としては、 沖縛、 ブラジルが挙 げられる。
ァセロラ種子の抽出物とは、 例えば、 生のァセロラ種子、 その乾燥物、 或いは凍結 物を、 粉碎して加工し、 水及び Z又は有機溶媒を加えて抽出した抽出物、 得られた抽 出物を濃縮した濃縮物、 また、 前記抽出物や濃縮物を更に液液抽出やカラムクロマト グラフィ一等で分画精製した分画精製物、 これらの乾固物の総称を意味し、 その形態 は液状、 ペースト状、 固体のいずれも含む意である。
前記抽出物を得るために用いる有機溶媒は、 親水性有機溶媒、 疎水性有機溶媒のい ずれでもよい。 親水性有機溶媒としては、 例えば、 メチルアルコール、 ェチルアルコ ール、グリセリン、プロピレングリコール、 1，3-ブチレングリコール等のアルコール； アセトン、 テトラヒドロフラン、 ァセトニトリル、 1,4-ジォキサン、 ピリジン、 ジメ チルスルホキシド、 N，N-ジメチルホルムアミド、酢酸等の公知の有機溶媒が挙げられ る。 疎水性有機溶媒としては、 例えば、 へキサン、 シクロへキサン、 四塩化炭素、 ク ロロホノレム、 ジクロロメタン、 1，2-ジクロロェタン、 ジェチルエーテル、 酢酸ェチノレ、 ベンゼン、 トルエン等の公知の有機溶媒が挙げられる。 これらの有機溶媒は使用に際 しては 1種又は 2種以上を組み合わせて用いることができる。 中でも、水及び/又は 親水性有機溶媒、 特に、 メタノール、 エタノール、 1，3-ブチレングリコール、 水又は これらの混合物や組合せが好ましい。
抽出条件は特に限定されないが、例えば、温度は 5〜95°C、好ましくは 10〜90°C、 更に好ましくは 15〜85°Cで、常温でも好適に抽出できる。温度が高い方が、抽出効率 が高くなる傾向がある。 抽出時間は、 数時間〜数日間であり、 また、 抽出に使用する 溶媒量は、 原料に対して重量比で通常 1〜20倍量、 好ましくは 2〜10倍量である。 抽出操作も特に限定的ではなく、 常法に従って行えばよレ、。 抽出効率を向上させる ため、 振とう抽出や、 撹拌機等を備えた抽出機を用いても抽出することができる。 例 えば、 ァセロラ種子を抽出溶媒に浸漬するカゝ、 若しくは浸漬せずに、 抽出溶媒と共に 撹拌、 振とうする抽出処理を行レ、、 処理液を、 濾過、 遠心分離又はデカンテーシヨン 等によつて抽出液と抽出残渣に分離することにより抽出処理を行うことができ、 抽出 残渣は更に同様な抽出処理に付しても良い。 得られる抽出液はそのまま用いても良い が、 必要により、 更に濃縮処理及び Z又は分画 ·精製処理することもできる。
前記濃縮処理は特に限定されず、 例えば、 溶媒除去、 7及び/又は有機溶媒に対す る溶解性を利用した可溶分回収処理、 不溶分回収処理、 水一疎水性有機溶媒での液液 分配処理、 再結晶処理、 再沈澱処理、 冷却により生じた析出物を回収する処理等、 若 しくはこれらから選択される 2種以上の処理を組合せる方法等が挙げられる。
前記分画 '精製処理も特に限定されず、 例えば、 順相及ひブ又は逆相クロマトダラ フィ一による処理等が挙げられる。
本発明の抗酸化剤の有効成分としてのァセロラ種子の抽出物は、 クエルシトリンを 含むことが好ましレ、。 また、 コラゲナーゼ活性阻害剤及ぴヒアル口ニダーゼ活性阻害 剤の有効成分としてのァセロラ種子の抽出物は、クエルシトリンを含んでいても良い。 本発明の抗酸化剤、 更にはコラゲナーゼ活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害 剤において、 有効成分であるァセロラ種子の抽出物の使用量は、 使用形態等により適 宜選択することができる。
本発明の皮膚外用剤及び化粧料は、 前記本発明の抗酸化剤を含む。 また、 前記抗酸 化剤、 前記コラゲナーゼ活性阻害剤及び前記ヒアルロニダ一ゼ活性阻害剤の少なくと も 1種を含む皮膚外用剤及び化粧料も提供することができる。
前記化粧料の種類は特に限定されず、 例えば、 ィヒ粧水、 乳液、 クリーム、 パック、 洗净料等のスキンケア化粧料； 口紅、 ファンデーション等のメ一キヤップ化粧料；頭 髪用化粧料等が挙げられ、 その剤型は特に制限されず任意である。 また、 皮膚外用剤 としては、 軟膏、 各種皮膚用薬剤等が挙げられる。
本発明の皮膚外用剤及び化粧料において、 本発明の抗酸化剤、 更にはコラゲナーゼ 活性阻害剤又はヒアルロニダーゼ活性阻害剤の配合割合は、 その種類及ぴ配合される 他の成分の種類や量、 形態等に応じて適宜選択できるが、 通常、 皮膚外用剤又は化粧 料全量に対して、 ァセロラ種子抽出物の乾燥物換算で 0.001〜20重量％、好ましくは 0.01〜10重量％である。
本発明の皮膚外用剤又は化粧料には、 本発明の所望の効果を損なわない範囲で、 通 常、 皮膚外用剤原料や化粧料原料として用いられる種々の他の成分を配合することが できる。 他の成分としては、例えば、水、 油剤、 界面活性剤、潤滑剤、 アルコール類、 水溶性高分子剤、 ゲル化剤、 保湿剤、 緩衝剤、 防腐剤、 抗炎症剤、 增粘剤、 香料、 ビ タミン類、 本発明の抗酸ィ匕剤以外の抗酸化剤等が挙げられる。 使用に際しては、 これ らカゝら 1種又は 2種以上を適宜選択して配合することができる。
本発明の食料品は、 前記本発明の抗酸化剤を含んでおれば良く、 食料品の種類は特 に限定されず、 例えば、 飴、 飲料、 ジャム、 チューインガム等が挙げられる。 また、 その剤型は特に制限されず任意である。
本発明の食料品において、 本発明の抗酸化剤の配合割合は、 食料品の種類及ぴ該食 料品に配合される他の成分の種類や量、 形態等に応じて適宜選択できるが、 通常、 食 料品全量に対して、 ァセロラ種子抽出物の乾燥物換算で 0.001〜20重量％、好ましく は 0.01〜10重量％である。
本発明の食料品には、 本発明の所望の効果を損なわない範囲で、 通常、 食料品原料 として用いられる種々の他の成分を配合することができる。 他の成分としては、 例え ば、 7、 アルコール類、 甘味料、 酸味料、 着色料、 保存料、 香料、 賦形剤等が挙げら れ、 使用に際しては、 これらから適宜選択して 1種又は 2種以上を配合することがで きる。
本発明の抗酸化剤、 更にはヒアルロニダーゼ活性阻害剤及びコラゲナーゼ活性阻害 剤は、ァセロラ種子の抽出物を有効成分とし、安全性に優れ、且つ強力な抗酸化作用、 ヒアルロニダーゼ活性阻害作用又はコラゲナーゼ活性阻害作用を有する。 本発明の皮 膚外用剤、 ィヒ粧料及び食料品は、 本発明の抗酸化剤、 更にはヒアルロニダーゼ活性阻 害剤又はコラゲナーゼ活性阻害剤を含むので、 抗老化作用、 しわ防止作用、 活性酸素 に起因する食料品の品質保持や酸ィ匕防止作用が得られる。 力 Bえて、 産業廃棄物であつ たァセ口ラ種子の有効な利用も可能となる。
実施例
以下、 本発明を実施例により更に詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されな い。
実施例 1
洗浄したァセロラ種子を乾燥後、破砕して得られた粉砕物 6140gに 7倍重量のメタ ノールを加え、 室温で一晚撹拌した。 全量を遠心後、 ろ過し、 ろ液を濃縮乾固して抽 出物 (A)を 225.89g得た。
この抽出物 (A)に水 2000mlを加え、更にへキサン 1200mlを加えて振とうした後、 分液された水層を回収した。 この水層に対し、 へキサンを用いた同様の振とうを更に 2回繰り返した。 へキサン層を除いて得られた水層に、 酢酸ェチル 1200 mlを加えて 振とうすることを 10回繰り返し、 分液された酢酸ェチル層を集めて濃縮乾固し、 濃 縮物 (A)を 11.48g得た。 次に、 濃縮物 (A)を、 シリカゲル (ヮコーシル C-300：和光純 薬ネ: h )を充填したカラムを用いたシリカゲル力ラムクロマトグラフィ一で分画した。 クロ口ホルム、 クロ口ホノレム ：メタノ一ノレ (97 : 3、 9 : 1、 8 : 2、 6 : 4、 4： 6、 2： 8)、 メタノールで順次溶出させた。クロ口ホルム溶出部を 15の画分に分け (画分 1〜15)、 その後のクロロホルム：メタノール溶出部をそれぞれ、 画分 16(97： 3)、 17(9： 1)、 18(8： 2)、 19(6： 4)、 20(4： 6)とした。
各画分の抗酸化活性を、 薄層クロマトグラフィー σι^)を用いた評価法により確認 した。 すなわち、 各画分の試料をシリカゲル薄層プレートに塗付し、 展開溶媒により 展開した。 この際、 蛍光指示薬を含有するプレートを用い ( 5F SiliCa Gel l50A ： Whatman 展開後、 乾燥したプレートに紫外線を照射することで、 UV吸収を もつ試料のスポットを検出した。 その後、 プレートに安定なラジカルである
Diphenyl-p-picrylhydradilCDPPH)の 6X 10—4Μメタノール溶液を噴霧した。 D PH溶 液は紫色を呈しているが、 ラジカルが消去されるとその色を失う。 このため、 ラジカ ル消去活性をもつ物質のスポット部分では、 DPPHラジカルが消去されることでスポ ット部分が白く抜けて見える。
画分 1〜20をシリカゲルプレートに塗付し、 クロ口ホルム：メタノール =9： 1の溶 媒でプレート先端まで展開した後、 DPPH を噴霧した。 結果を図 1に示す。 図 1 より、 ァセロラ種子抽出物には、 抗酸化活性を有する多数の物質が含まれていること がわかる。
このうち、 画分 19を、 逆相系高速液体クロマトグラフィー (HPLC)により更に精製 した。 まず下記溶出条件で粗精製し、 更に以下の条件を行うことで精製した。 HPLC 条件を以下に示す。
カラム： Hydrosphere C-18 [20 X 250mm] (YMC)、 流速： 5ml/分、 温度： 35°C 検出： UV at 254nm、 Eluent： 30%メタノール (0-2min)、 30-100%メタノール (2-32min、 linear), 100%メタノール (32-40min)、 30%メタノール (40-50min)の条件で粗精製し た後、 ァセトニトリル/水 (30/70)で最終精製を行って、 分画精製物 72mgを得た。 得られた分画精製物に対し、 各種スぺクトル測定を行った。 得られたデータを以下 に示す。
マススぺクトル： [M-H]- 447
紫外線吸収スぺクトル：（EtOH) 256.5nm、 352.00mn、 H-NMRケミカルシフト ： 500MHz溶媒 CD3OD、 0.94ppm(d:J=6.1Hz)、 6.91ppm(d:J=8.2Hz), 7.31ppm(d, d:J=8.2，2.1Hz)、 7.34 ppm(d:J=2.1HzX 6.20ppm(d:J=2.1Hz), 6.37ppm(d:J=2.1 Hz)s 3.33ppm(m:J= 9.5，9.3Hz)、 3.41pprn(m:J= 9.5Hz)、 3.74ppm(d,d:J=9.3,3.3 Hz)、 4.21ppm(d,d:J= 3.3Hz)N 5.35ppm(d:J=1.7Hz)、 C-NMRケミカルシフト： 125·8ΜΗζ 溶媒 CD3OD、 17.7ppm、 72.0ppm、 72.1ppm、 72.2ppm, 73.3ppm、 94.8ppm、 99.9ppmヽ 103.6ppm、 106.0ppm、 116.4ppm、 117.0ppm、 122.9ppm、 123.1ppm、 136.3ppm、 146.5ppm、 149.9ppmN 158.6ppm、 159.4ppm、 163.3ppm、 166.0ppm、 179.7ppmQ マススぺクトルにおいて、 脱プロトン化分子と考えられるイオンが m/z447に観 測され、 分子量は 448と考えられた。 H-NM では、 0.94ppmは CH3、 6.91ppm、 7.31ppm、 7.34ppmは 1，2，4-置換ベンゼン、 6.20ppm、 6.37ppmは 1，2，3，5-置換ベン ゼンの ¾に帰属された。 3.33〜5.35ppmには 5種類のピークが観測された。 また、 13C-NM スぺクトルでは 21本のピークが観測され、 70-74ppmの 4本のピークは > CH-0-と考えられ、 179.7ppmには カルボニルに帰属できるピークが観測された。 これらデータよりケルセチン配糖体の可能性が示唆されたため、 更に高^?能マスス ぺクトルの測定及び、 ケルセチン配糖体で分子量 448であるクエルシトリン標品の NMRスぺクトルとの比較を行った。 高^^能マススぺクトル測定を行った結果、 精 密重量 447.0917が得られ、 C、 H、 0を元素種として組成計算を行った。 その結果、 13C-NMRスぺク トルで観測された炭素数 21を満足する組成式 C21H19Ouが算出され、 分子式は C^HwOuと決定された。 更に MRスぺク トルを、 クエルシトリン (ケルセ チン- 3-ラムノシド)標品のスぺクトルと比較した結果、 一致したため、 ァセロラ種子 の抽出物より分離精製された物質はクエルシトリンであると同定した。
クエルシトリンは、 フラボノィドの一つで自然界に広く分布しており、 特にドクダ ミに豊富に含まれることが知られている。 以上の結果から、 ァセロラ種子にクエルシ トリンが含まれ、 該クエルシトリンが抽出物中の抗酸化活性に関与する物質の 1つで あることが判った。
実細 2
洗浄したァセロラ種子 100gを破砕し、 3倍体積の水を加え、 室温でー晚振とうし た。全量をガラスフィルター、 0.65/z mフィルター及び 0.22/ mフィルターでろ過後、 ろ液を濃縮乾固して抽出物 を得た。
次に、 リノール酸を用いた抗酸化活性測定 (ロダン鉄法)により得られた抽出物の抗 酸ィ匕活性を測定した。
即ち、 2.5%(w/v)リノール酸 (99.5%エタノール赚) 2ml及ぴ 0.05Mリン酸緩衝液 (pH7.0)4mlの反応液に、 ァセ口ラ種子の抽出物 0.4mg、 99.5%エタノール 2ml及ぴ 蒸留水 2mlからなる混液を混合し、褐色ネジロ瓶に入れ 10mlの試験液を調製した。 また、 ァセロラ種子抽出物の代わりに α -トコフエロール又は BHAを用い、 反応液中 にァセロラ種子の抽出物と同量含まれるように同様の操作を行い、 各々試験液を調製 し、 これらを正の対照とした。 コントロールにはァセロラ種子抽出物を添加せず、 99.5%エタノール 2ml及び蒸留水 2mlのみを反応液に添加した試験液を用いた。得ら れた各試験液を喑所にて 40°Cで保存したものを本検、 4°Cで保存したものを盲検とし て、 経時的に被検物を取り出し以下の方法により測定を行った。 試験は 14 Θ間行つ た。
まず、被検物 0.1ml、 75%エタノール 9.7ml、 30%口ダンァンモニゥム水溶液 0.1ml の混液に、 2X 10'2Mの塩ィ匕第一鉄 (3.5%塩酸灘) 0.1mlを加えてから正確に 3分後 500nmにおける吸光度を測定した。盲検についても同様に測定し、 Δ吸光度： (本検の 吸光度)一 (盲検の吸光度)とした。 試料の酸化が始まると吸光度は上昇し、 最高点に達 した後、 酸ィ匕されるべき試料が少なくなるにつれて吸光度は減少する。 従って、 吸光 度のピークが早くできはじめるほど抗酸化活性は弱いといえる。 また、 酸化率を用い て各試験液の抗酸化活性を比較した。 酸化率は、 コント口ールの酸化（Δ吸光度)を 100%として、 以下の式で求めた。 酸化率が高いほど抗酸化活性が低いことを意味す る。
酸ィ匕率 (％)= ( 料の Δ吸光度]/ [コントロールの Δ吸光度]) X 100
吸光度の経時的変化の結果を図 2に、 試験開始後 14日目の各試料溶液の酸化率を 図 3に示す。 図 3において、 (C-1)はコントロール、 (C-2)は α -トコフエロール、 （C-3) は ΒΗΑ、 （E-2)は実施例 2で調製したァセ口ラ種子抽出物、 （E-3)は実施例 3で調製し たァセロラ種子抽出物、 （E-4)は実施例 4で調製したァセロラ種子抽出物、 （E-5)は実 施例 5で調製したァセロラ種子抽出物を夫々示す。
実施例 3
洗浄したァセロラ種子 100gを鶴し、 3倍体積の、 ェタノ一/ 量が 25体積％の 含水エタノールス を加え、 室温でー晚振とうした。 全量を実施例 2と同様なフィ ルターでろ過後、 ろ液を濃縮乾固して抽出物を 1.69g得た。
得られた抽出物を用いて実施例 2と同様に抗酸化活性を測定した。 吸光度の経時的 変化の結果を図 2に、 試験開始後 14日目の各試料溶液の酸化率を図 3に示す。
実施例 4
洗浄したァセロラ種子 100gを破碎し、 3倍体積の、 エタノーノ 量が 50体積0 /0の. 含水エタノール水溶液を加え、 室温で一晩振とうした。 全量を実施例 2と同様なフィ ルターでろ過後、 ろ液を濃縮乾固して抽出物 2.27gを得た。
得られた抽出物を用いて実施例 2と同様に抗酸ィヒ活性を測定した。 吸光度の経時的 変化の結果を図 2に、 試験開始後 14日目の各試料溶液の酸化率を図 3に示す。
実施例 5
洗浄したァセ口ラ種子 100gを破粋し、 3倍体積の、 ェタノ一/ ^量が 75体積％の 含水エタノール水 を加え、 室温でー晚振とうした。 全量を実施例 2と同様なフィ ルターでろ過後、 ろ液を濃縮乾固して抽出物 2.50gを得た。
得られた抽出物を用いて実施例 2と同様に抗酸化活性を測定した。 吸光度の経時的 変化の結果を図 2に、 試験開始後 14日目の各試料溶液の酸ィ匕率を図 3に示す。
図 2及び 3より、 ァセロラ種子の抽出物には明らかにリノール酸の酸化抑制効果が あり、 またその強さは代表的抗酸化剤である α -トコフエロール、 ΒΗΑと比較して、 同等又は同等以上であることが判った。 更に、 実施例 2〜5の結果より、 抽出溶媒と して用いる含水エタノール中のエタノールの割合を変ィヒさせることで、 抗酸化活性の 強さをコントロールできることが判る。
実施例 6
洗浄したァセ口ラ種子 760 を破砕し、 5倍重量のメタノ一ルを加え、 室温でー晚 撹拌した。 全量を遠心後、 ろ過し、 ろ液を濃縮乾固して抽出物 12.36gを得た。 この 抽出物に水 300mlを加え、 更にへキサン 100mlを加えて振とうした後、 分液された 水層を回収した。 この水層に対し、 へキサンを用いた同様の振とうを更に 3回繰り返 した。へキサン層を除いて得られた水層に、酢酸ェチル 100mlを加えて振とうするこ とを 6回繰り返し、 分液された酢酸ェチル層を集めて濃縮乾固し、 固形分 0.41gを得 た。
得られたァセ口ラ種子の抽出物の抗酸化活性を実施例 2と同様に口ダン鉄法により 測定した。 この際、試験期間は 20日間とした。 試験開始後 20日目の各試料溶液の酸 化率を図 4に示す。 図 4において、 （C-1)はコントロール、 （C-2)は a -トコフェロール、 (C-3)は BHA、 （E-6)は実施例 6で調製したァセロラ種子抽出物を夫々示す。
図 4より、 ァセロラ種子の抽出物の酢酸ェチル画分には、 抽出物そのものと同様に 明らかにリノール酸の酸化抑制効果があり、またその強さは、 トコフエロールより も強いことが判った。
実施例 7
洗浄したァセロラ種子 70gを破碎し、 4倍重量の、 1， 3-ブチレングリコーノレ含量が 30重量％の 1， 3-プチレンダリコ一ル水溶液を加え、室温でー晚撹拌した。全量を遠心 後、上清を 0.22μ πιフィルタ一でろ過し、ァセロラ種子の抽出物を溶液として 124.12g 得た。
得られたァセロラ種子の抽出物の抗酸化活性を以下の DPPHラジカル消去による 方法により測定した。 結果を表 1に示す。
Figure imgf000012_0001
にエタノ—ル 1200 μ 1、 検体 400 1 (任意の濃 度に調製)を混合し、 30°C、 5分間プレインキュペートした。 この液に 500 i M DPPH Zエタノール溶液を 800 ^u l添加混合し、 30°C、 30分間放置後、 517nmの吸光度を測 定した。 α -トコフエロールについても同様の操作を行い、 これを正の対照とした。 コ ントロールには、 試料溶液の代わりにその溶媒を用いて同様の操作を行ったものを用 いた。 測定された吸光度から、 次式によりラジカノレ消去率を算出した。 消去率(％)=(1— 料の吸光度]/ [コントロ一ルの吸光度]) X 100
試料溶液の試料濃度を段階的に変更して上記消去率の測定を行い、 DPPHラジカル の消去率が 50%になる試料溶液の濃度を求め、 DPPHラジカル 50%消去濃度とした」 よって、 この数値が低！/、ほどラジカル消去能が高 Vヽことを意味する。
表 1
Figure imgf000013_0001
表 1より、実施例 7の抽出物は α -トコフエロールと同等のラジカル消去能を有する ことが判った。
実施例 8
洗浄したァセロラ種子 1500gを破碎し、 2倍重量の、 1， 3-プチレングリコー/ 量 が 30重量％の 1， 3-ブチレンダリコール水溶液を加え、 室温で一晩撹拌した。 全量を 遠心後、上清を 0.22 ί mフィルタ一でろ過し、ァセ口ラ種子抽出物を溶液として 2327g 得た。
得られたァセロラ種子抽出物の抗酸化活性を、 実施例 2と同様にロダン鉄法により 測定した。 但し、 ァセロラ種子抽出物は溶液であることから、 水とエタノールを用い て必要濃度に希釈して添加し、 ァセロラ種子抽出液のコントロールには、 添加したァ セロラ種子抽出液と同様の溶 袓成でァセロラ種子抽出物を含まないものを用いた。 また、 試験期間は 7日とした。
吸光度の経時的変ィ匕の結果を図 5に、試験開始後 7日目の各試料溶液の酸ィ匕率を図 6に示す。 図 6において、 （C-1)はコントロール、 （C-2)はひ-トコフエロール、 （C-3)は BHA、 （E-8)は実施例 8で調製したァセロラ種子抽出物を夫々示す。
図 5及ぴ 6より、 ァセロラ種子抽出物には明らかにリノール酸の酸化抑制効果があ り、 またその強さは、 トコフエロール、 ΒΗΑと比較して、 同等又は同等以上であ ることが判った。
ところで、従来よりビタミン Cが抗酸ィヒ作用を有することが知られているので、上 記で調製したァセロラ種子抽出液中のビタミン C量を測定し、.上記ァセロラ種子抽出 液における抗酸化作用が含有されるビタミン Cのみによるもの力否かを検討した。 まず、 上記で調製したァセロラ種子抽出液 100g中に含有されるビタミン C量を測 定したところ、 57mgZl00g雜化型ビタミン C： 56mg/100g+還元型ビタミン C： lmgZlOOg)であった。 そこで、上記で調製したァセロラ種子抽出液 100gを蒸発乾固 したところ、 固形分 975mgが得られた。 次いで、 実施例 2と同様にロダン鉄法によ り抗酸化活性を測定した。 この際、 本実施例のァセロラ種子抽出物は溶液であること から、上記と同様、反応液中に固形分として 0.4mg含まれるように希釈して添加した。 またコント口一ノレにも上記と同様、 添加したァセ口ラ種子抽出液と同様の溶媒組成で ァセロラ種子抽出物を含まないものを用いた。 なお、 測定は 7日間で行った。 対照と して、 該固形分 0.4mg中に含まれるビタミン C 0.023mg (0.4mgX (57mg/975mg)) を用いて同様に抗酸化活性を測定した。
試験開始後 7日目の酸化率は、 ァセロラ種子抽出物が 1.9%であったのに対して、 ビタミン C単独のものは 115.8%であった。
以上の結果より、 ァセロラ種子抽出物中に含まれるビタミン Cは、該抽出物の抗酸 化作用にはほとんど寄与していないことが判った。
更に、 本発明におけるァセロラ種子抽出物において、 実施例 1で確認した抗酸化作 用を示す物質の 1つであるクエルシトリンについて、 上記で調製したァセロラ種子抽 出物中に含有される力否かを実施例 1と同様に測定した。 その結果、 クエルシトリン を含有 'していることが判つた。
ところで、 従来、 例えば、 特開平 7-300581号公報において、 クエルシトリンが抗 酸ィ匕作用を有することが提案されている。 そこで、 上記ァセロラ種子抽出液における 抗酸ィヒ作用が含有されるクエルシトリンのみによるものか否かを以下の方法で検討し た。
まず、 クエルシトリンはポリフエノールの 1種であるので、 上記で調製したァセ口 ラ種子抽出液中のポリフエノール量を Folin-Denis法により測定したところ、 抽出液 100g中の固形分 975mgに占めるポリフエノールの割合は 25%であった。従って、上 記で調製したァセロラ種子抽出液の固形分中に含まれるクエルシトリン量は、 最大で も 25%である。 この結果に基づいて、 上記ビタミン Cとの比較試験と同様に、 実施 例 2と同様にロダン鉄法により抗酸化活性を測定した。 この際、 測定は 7日間で行つ た。対照として、該固形分 0.4mg中にクエルシトリンが 32% (最大量でも 25%である ので、 それ以上の量)含まれると仮定した場合のクエルシトリン 0.128mgを用いて同 様に抗酸化活性を測定した。 その結果、 試験開始後 7日目の酸化率は、 ァセロラ種子抽出物が 1.9%であったの に対して、 クエルシトリン単独のものは 6.9%であった。
以上の結果より、 ァセロラ種子抽出物中に含まれるクエルシトリンは、 該抽出物の 抗酸化作用の有効成分の 1つではあるが、 該抽出物の抗酸ィヒ作用はクエルシトリンの みの作用ではなく、 しかも、 ァセロラ種子抽出物は、 クエルシトリン単独による抗酸 化作用よりも優れていることが判った。
参者例 1
実施例 2〜5で調製した各ァセロラ種子抽出物について、 以下の方法によりコラゲ ナーゼ活性阻害作用を測定した。
測定方法
〔試薬の調製〕
基質溶液： PZ-ぺプチド (BACHEMネ： h¾)0.39mgを、 0.1Mトリス塩酸緩衝液 (pH7.1、 含 20mM塩ィ匕カルシウム) lmlに溶解して使用した (0.5mMに相当)。
酵素溶液：コラゲナーゼ (TYPE IV、 シグマ社製) 5mgを蒸留水 lmlに溶解させ 100 ずつ分注し、 一 20°Cで保管する。使用時に蒸留水で 50倍に希釈して反応に用いた。 〔コラゲナーゼ活性阻害作用測定法〕
実施例 2の抽出物は 15mgZml、 実施例 3、 4、 5の抽出物は 0.5mg/mlの濃度 となるように、それぞれの抽出溶媒で溶解して調製を行い、これらを試料溶液とした。 これらの試料溶液 50 1、コラゲナーゼ溶液 50 μ 1及ぴ基質溶液 400 を混合し、 37°C で 30分間ィンキュベーションした。 次いで、 25mMクェン酸溶液 lmlで反応を停止 し、酢酸ェチル 5mlで抽出した。 遠心分離 (3000rpm、 10分間)後、酢酸ェチルを対照 として、 酢酸ェチル層の波長 320nmにおける吸光度を測定した。 対照には、 試料溶 液の代わりに各抽出溶媒を用い、 また、 それぞれのブランクとして、 酵素溶液の代わ りに蒸留水を加えて同様の操作を行った。
これらの値からコラゲナーゼ活性阻害率を次式により算出した。
阻害率 (％)= 〔1— (A-B) / (C-D)] X 100
但し、 A：試料溶液の 320nmにおける吸光度、 B：試料溶液ブランクの 320nmにお ける吸光度、 C：対照溶液の 320nmにおける吸光度、 D：対照溶液ブランクの 320nm における吸光度である。
上記方法で実施例 2〜 5の抽出物のコラゲナーゼ活性阻害率を求めた。 結果を表 2 二示す。
表 2
Figure imgf000016_0001
参考例 2
実施例 8で調製したァセロラ種子抽出物について、 参考例 1と同様の方法によりコ ラゲナーゼ活性阻害作用を測定した。但し、実施例 8の抽出物は溶液であることから、 ァセロラ種子抽出物が固形物として 0.5mgZml の濃度となるように抽出溶媒である 30重量0 /01，3-プチレングリコール水 で希釈したものを試料溶液とした。 このよう にして実施例 8の抽出物のコラゲナーゼ活†生阻害率を求めた結果、 71.5%であった。
参考例 3
実施例 8で調製した抽出物のヒアル口-ダーゼ活性阻害作用を測定した。 ヒアル口 ニダ一ゼ活性阻害測定は、 Morgan-Elson法を応用した前田有美恵らの方法 (食衛誌、 31卷、 233-237、 1990年)にて行った。
測定方法 酵素溶液：牛精巣ヒアルロニダーゼ (和光純薬工業 (株)製)を 0.1M酢酸緩衝液 (pH= 4.0)に溶解し最終酵素活性を 400ュニット Zmlに調整した。
酵素活性化溶液： compound 48/80 (シグマ社製） を 0.1M酢酸緩衝液 (pH=4.0) に溶解し最終濃度を O.lmg/mlに調整した。
基質灘：ヒアル口ン酸カリゥム (和光純薬工業 (株)製)を 0.1M酢酸緩衝液 (pH=4.0) に溶解し最終濃度を 0.4mg/mlに調整した。
ホゥ酸溶液：ホゥ酸 4.95gに水 50mlを加え、 1N水酸化ナトリウム溶液で pH=9.1 にし、 水を加えて 100mlに調整した。
P-ジメチルァミノベンズアルデヒド (p-DAB)試薬： 10N塩酸 12.5mlと酢酸 87.5ml の混液に p-DAB (和光純薬工業 (株)製)を 10g溶解し冷蔵保存する。 使用直前に酢酸で 10倍希釈して用いた。
〔ヒアノレ口ニダーゼ活性阻害作用測定法〕 実施例 8の抽出物は溶液であることから、ァセロラ種子抽出物が固形物として lmg /mlの濃度となるように抽出溶媒である 30重量0 /01,3-プチレングリコール水溶液で 希釈したものを試料溶液とした。この試料?鎌 0.2mlに酵素赚 0. lmlを加えて、 37°C で 20分間放置した。 次に、 酵素活性化溶液 0.2mlを加えて 37°Cで 20分間加温し、 さらに基質溶液 0.5mlを加えて 37°Cで 40分間反応させた後、 0.4Nの水酸化ナトリ ゥム水溶液を 0.2ml加えるとともに氷冷して反応を停止させた。ホウ酸溶液 0.2mlを 加えてホットブロックバス (TOYO SEISA USHO、 MODEL ΊΤΒ- 32)により 100〜 120°Cで 5分間加熱後氷冷し、 p-DAB試薬 6mlを加えて 37°Cで 20分間加温して発色 させ、 585nmにおける吸光度を蒸留水を対照として測定した。対照には、試料溶液の 代わりに抽出溶媒を用い、またそれぞれのプランクとして、酵素溶液の代わりに 0.1M 酢酸緩衝液 (pH=4.0)を加えて同様の操作を行った。
これらの値からヒアル口-ダーゼ活性阻害率を次式により算出した。
阻害率(％)= 〔1— (A-B) / (C— D)〕 X 100
但し、 A：試料溶液の 585nmにおける吸光度、 B：試料溶液ブランクの 585nmに おける吸光度、 C：対照溶液の 585nmにおける吸光度、 D：対照^ ブランクの 585mn における吸光度である。
上記方法で実施例 8の抽出物のヒアル口ニダーゼ活性阻害率を求めた結果、 94.5% であった。
参考例 4
1997年 3月 26日付厚生省令第 21号 「医薬品の安全性に関する非臨床試験の実施 の基準に関する省令」 に従ってァセロラ種子抽出物の安全性試験を行なった。 ァセロ ラ種子抽出物としては、 実施例 8で調製したァセロラ種子抽出物を用いた。 結果を表 3に示す。
ラットを用いる単回経口投与毒性試験
ラット 2群 (対照群、 投与群)に対して、 雌雄各 5匹/群にて試験を行レヽ、 投与群に は体重あたり 2g/kg投与した。
モルモットを用いる皮膚一次刺激性試験
モルモット 3匹の健常皮膚に 24時間閉塞貼付を行レ、、 投与後 24時間、 48時間及 び 72時間に、 それぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる 14日間皮膚累積刺激性試験 モルモット 3匹の健常皮膚に、 14日間連続の開放系で 1 日 1回塗布を行い、 試験 期間中の毎日、 塗布前及び塗布後 24時間に、 それぞれ皮膚の状態を観察して判定を 行った。
モルモットを用いる皮膚感作性試験
モルモット 3群 (対照群、塗布群、 DNCB群)に対して、 5匹 Z群にて Adjuvant and Patch Test法に準じて試験を行い、塗布後 24時間及び 48時間に、それぞれ皮膚の状 態を観察して判定を行つた。
モルモットを用いる皮膚光毒性試験
モルモット 10匹の背部皮膚に森川藤凰らの方法に準じて試験を行い、 紫外線照射 後 24時間、 48時間及ぴ 72時間にそれぞれ皮膚の状態を観察して判定を行った。
モルモットを用いる皮膚光感作性試験
モルモット 3群 (対照群、投与群、 TCSA群)に対して、 5匹 Z群にて Ajuvant and Strip 法に準じて試験を行い、紫外線照射後 24時間及び 48時間に、それぞれ皮膚の状態を 観察して判定を行った。
ゥサギを用いる眼粘膜刺激性試験
ゥサギ 2群 (非洗眼群、 洗眼群)に対して、 3匹 Z群にて試験を行った。 点眼後、 非 洗眼群はそのままにし、 洗眼群は微温の生理食塩水で約 1分間洗浄し、 その後 1時間、 24時間、 48時間及び 72時間後に、角膜、虹彩及ぴ結膜の状態について観察し、 AFNOR の区分から判定を行った。
細菌を用いる復帰突然変異試験
プレインキュベーション法により、 S9mi 無添加と S9mix添加の場合について測 定を行った。
•使用菌株： Salmonella typhimurium TA100、 TA98、 TA1535、 TA1537
•使用菌株： Escherichia coli WP2uvrA
哺乳類の培養細胞を用いる染色体異常試験
哺乳類の培養細胞 (CHLZIU細胞)を用いて 3群 (陰性対照群、 被検物質群、 陽性対 照群)に対して、短時間処理法 (6時間処理： S9mix無添加及ぴ S9mix添加)及び連続処 理法 (24時間及ぴ 48時間処理)で検討を行った。 3
Figure imgf000019_0001
処方例 1
グリチルリチン酸ジ力リウム 0.20重量部、 クェン酸 0.10重量部、 クェン酸ナトリ ゥム 0.30重量部、 実施例 7で調製したァセ口ラ種子の抽出物 5.00重量部及び 1,3-プ チレンダリコール 5.00重量部を混合して、 精製水を加えて全体量を 80.0重量部にし て 50°Cで撹拌しながら溶解して抽出物含有水溶液を調製した。
次いで、 テトラオレイン酸 POE(60)ソルビトール 0.90重量部、 モノォレイン酸ソ ルビタン 0.10重量部、 適量の防腐剤及ぴエタノール 10.00重量部を混合して、 50°C で撹拌しながら溶解した。 続いて、 得られた溶液を、 最初に調製した抽出物含有水溶 液に少量ずつ加えて、 50°Cで混和撹拌した。均一に混和したら、更に撹拌しながら 50°C から 30°Cに液温を下げ、 30°Cになったらところで撹拌を止め、適量の香料及ぴ精製水 を加えて全体量を 100.00重量部にした。 再度、 混和撹拌し、 均一に混和させて化粧 水を調製した。
処方例 2
スクヮレン 10.00重量部及ぴ適量の防腐剤を混合し、精製水を加えて全体量を 70.00 重量部に調整し、 80°Cに加温して溶液 (1)を調製した。 また、カルボキシビュルポリマ 一 0.10重量部及ぴキサンタンガム 0.20重量部を適量の精製水に常温で撹拌溶解し溶 液 (2)を調製した。 更に、 トリエタノールァミン 0.10重量部及び 1,3-プチレングリコ ール 5.00重量部を適量の精製水に常温で撹拌溶解し溶液 (3)を調製した。 更にまた、 ヒアル口ン酸ナトリウム 2.00重量部及ぴ実施例 8で調製したァセ口ラ種子の抽出物 5.00重量部を適量の精製水に常温で撹拌溶解し溶液 (4)を調製した。 次いで、適量の精製水に溶液 (1)を少量ずつ加え、 80°Cで混和撹拌し、更に撹拌しな がら、溶液 (2)を加え、続いて赚 (3)を加えた。 均一に混和したら、撹拌しながら溶液 を 50°Cに下げて、 50°Cになったところで、 溶液 (4)を加え、 更に精製水を加えて全体 量を 100重量部に調整した。 溶液が 30°Cになるまで再度撹拌し、 30°Cになったとこ ろで撹拌を止め、 均一に混和された乳液を調製した。
処方例 3
POE(20)ソルビタンモノステアレート 2.00重量部、 POEソルビタンテトラオレェ 一ト 0.50重量部、モノステアリン酸グリセリル 0.50重量部、ステアリン酸 7.00重量 部、 セチルアルコール 3.00重量部、 パノレミチン酸セチル 3.00重量部、 ホホバ油 7.00 重量部、 パラフィン 3.00重量部及び適量の防腐剤を混合して、 80°Cで撹拌しながら 溶解し溶液 (1)を調製した。 一方、 実施例 8で調製したァセロラ種子の抽出物 5.00重 量部、 1，3-プチレングリコール 7.00重量部及ぴ精製水 62重量部を混合して、 80°Cで 撹拌しながら溶解し溶液 (2)を調製した。
次いで、 溶液 (2)に溶液 (1)を少量ずつ加え、 乳化し、 撹拌しながら冷却して 40°Cに 降温したところで撹拌を止め、 均一に混和されたクリームを調製した。
処方例 4
濃縮グレープフルーツジュース 100g、 糖類 150g、 はちみつ 15g、 実施例 2と同様 の条件で調製したァセロラ種子の抽出物 (A)1.5g及び適量の香料に、 全体量が 1000g となるように精製水を混合した。 次いで、 95°Cで 20分間殺菌し、 100mlずつ無菌的 にビンに充填してグレープフルーツジュースを製造した。
処方例 5
POE(30)POP(6)デシルテトラデシルエーテル 0.6重量部、 ェタノール 10.0重量部 及びメチルパラベン 0.1重量部を 50°Cで混合撹拌した溶液に、別途、 クェン酸ナトリ ゥム 0.1重量部、ピロリドン力ルポン酸ナトリウム 1.0重量部、 1，3-プチレングリコー ル 4.4重量部及び適量の精製水を 50°Cで混合撹拌した溶液を加えて、 撹拌しながら 30°Cまで冷却した。 更に、 実施例 8で調製したァセロラ種子の抽出物 2.0重量部を添 加して混合撹拌した後、最後に適量の精製水を加えて全量を 100重量部に調整した。 再度、 撹拌して均一に混和して化粧水を調製した。
処方例 6
1，3-プチレングリコールの配合量を 3.5重量部及ぴ実施例 8で調製したァセロラ種 子の抽出物の配合量を 5.0重量部に変更した以外は処方例 5と同様に化粧水を調製し た。
比較処方例 1
1，3-プチレンダリコールの配合量を 5.0重量部に変更し、 実施例 8で調製したァセ ロラ種子の抽出物を配合しなかった以外は処方例 5と同様、に化粧水を調製した。
実施例 9
処方例 5で調製した化粧水について、 実施例 2と同様のロダン鉄法によりリノール 酸の酸化抑制作用を測定した。 比較として、 ァセロラ種子抽出物を含まない比較処方 例 1で調製した化粧水についても同様に酸ィ匕抑制作用を測定した。
本実施例では、実施例 2において反応液に加えたァセ口ラ種子抽出物 0.4mg、99.5% エタノール 2ml及ぴ蒸留水 2mlの代わりに、 処方例 5又は比較処方例 1で調製した 各化粧水 2ml、 99.5%ェタノール 1.8ml及び蒸留水 0.2mlを加えて試験を行った。 吸光度の経時的変化の結果を図 7に示す。 また、 試験開始後 28 日日の処方例 5で 調製した化粧水試料の酸ィ匕率を、 比較処方例 1で調製した化粧水試料の 21 日目の酸 化率 (Δ吸光度)を 100%として、 実施例 2と同様にして求めた結果、 7.2%であった。 図 7及ぴ前記酸ィ匕率試験の結果から明らかなように、 ァセロラ種子抽出物を配合し て調製した処方例 5の化粧水は、 比較処方例 1の化粧水に比べて優れたリノール酸の 酸化抑制作用を示し、 また、 28日経過後もその作用は持続していた。
これにより、 ァセロラ種子抽出物を配合した化粧水には、 安定性に優れた抗酸化作 用があることが確認された。
実施例 1 0
ァセ口ラ種子抽出物を配合した化粧水の抗酸化作用が、 ィ匕粧水調製後 1力月以上が 経過しても持続し有効であることを確認するため、 処方例 5、 処方例 6及び比較処方 例 1で調製した化粧水を下記条件で 6カゝ月間保存し、 保存後の DPPHラジカル消去 作用の変化を実施例 7と同様な抗酸化試験を行って評価した。
保存方法
処方例 5及び処方例 6の化粧水を調製後、 遮光条件下、 4° ( 、 25°C、 40°Cでそれぞ れ 6か月間保存し、 調製直後、調製 2週間後、及び調製後 1、 2、 3、 4、 6か月経過後 に DPPHラジカル消去試験を実施した。 また、比較として、比較処方例 1の化粧水に ついても同様に、 保存及び試験を行った。 本実施例では、実施例 7において反応液に加えたァセ口ラ種子抽出物 400 μ 1の代わ りに、 処方例 5又は処方例 6で調製した化粧水 400 1を加えて試験を行った。 尚、 DPPHラジカノレ消去率 (％)は、 処方例 5及ぴ処方例 6で調製した化粧水の代わりに、 同条件で保存した比較処方例 1で調製した化粧水を添加した試料の吸光度をコント口 ールとして、 実施例 7と同様にして求めた。
処方例 5及び処方例 6で調製した化粧水について 6力月間行った DPPHラジカル 消去試験の結果を、 各々図 8及び図 9にそれぞれ示す。
図 8及び図 9から明らかなように、 ァセ口ラ種子抽出物を配合した処方例 5及ぴ処 方例 6の化粧水は優れた DPPH ラジカル消去作用を示し、 その作用は、 40°Cという 厳しい条件下で 6力月間保存した後も失われなかった。 また、 ァセロラ種子抽出物の 配合量が多い処方例 6のィヒ粧水の方が高い抗酸化作用を示し、 持続性においても優れ ていた。
以上より、 ァセロラ種子抽出物を配合した化粧水には、 長期間、 特に高温での長期 保存にも強い、 優れた抗酸化作用があること、 そしてその作用は、 ァセロラ種子抽出 物の配合量が高 、ほどより期待できることが確認された。

Claims

請求の範囲
. ァセロラ種子の抽出物を有効成分として含む抗酸化剤。
· ァセロラ種子の抽出物が、 クエルシトリンを含む請求の範囲 1の抗酸化剤。. 請求の範囲 1の抗酸化剤を含む皮膚外用剤。
. 請求の範囲 1の抗酸化剤を含む化粧料。
. 請求の範囲 1の抗酸化剤を含む食料品。
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