KR101508215B1 - 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항산화용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항산화용 약학적 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 삼채 잎 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물이 의적인 항산화활성을 나타내고, 세포독성이 없으며, 멜라닌(mealnin)의 생성을 저해시키고, 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 유의적으로 억제하므로, 상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 항산화용 또는 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항산화용 조성물{Composition for antioxidant and whitening comprising extracts or fractions of allium hookeri as an active ingredient}

본 발명은 삼채(allium hookeri) 뿌리 및 잎 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 미백 및 항산화용 약학적 조성물, 및 건강기능식품에 관한 것이다.

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적이고 물리적인 기능을 가지는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지 즉, 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하(hypodermis)로 나누어진다. 멜라닌은 피부의 표피층에 존재하는 색소로서, 표피의 기저층에 존재하는 멜라노사이트(melanocyte)로부터 만들어져 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동한다. 생체 내에는 멜라닌을 분해하는 효소가 없고, 다만 케라티노사이트가 표피에서 떨어져 나갈 때 같이 피부에서 떨어져 나가는 것으로 제거된다.

멜라닌 합성 과정을 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜라노좀이라는 소포체에서 먼저 티로시나제(Tyrosinase) 라는 효소에 의해 티로신이 도파(DOPA)를 거쳐 도파퀴논(DOPAquinone)으로 전환되고, 도파퀴논으로부터 자동 산화 반응과 효소 반응으로 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 이렇게 생성된 멜라닌은 멜라노좀을 통해 케라티노사이트로 옮겨지고 여기에서 약 28일간의 각화 과정을 거치면서 피부 표면으로 나와 각질과 함께 소실된다.

멜라닌은 햇빛 UV의 빛 에너지를 흡수하여 UV에 의한 손상으로부터 진피 이하의 피부 기관을 보호하는 역할을 하며, 피부 생체 내에 생겨난 유해산소 및 프리라디칼 등을 잡아주는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호해주는 유용한 역할을 수행한다. 또한, 피부 세포 내의 멜라닌량에 따라 사람의 피부색을 결정한다. 멜라닌 색소가 많은 사람은 갈색 또는 검은 색 피부를 갖는 반면, 멜라닌 색소가 적은 사람은 흰색의 피부를 갖게 된다.

그러나 멜라닌이 비정상적으로 적게 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 일광, 호르몬 변화, 염증 또는 약제 등에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되거나 각화작용이 원활히 이루어지지 않아 멜라닌이 완전히 없어지지 않으면 피부에 손상을 줄 뿐만 아니라 피부의 색소가 침착되어 기미, 주근깨를 형성하며, 이와 같은 병변으로부터 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 따라서, 이러한 색소 침착 현상을 방지하기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다.

오늘날 동양권의 여성들은 백옥같이 하얗고 깨끗한 피부를 선호하며 이를 미의 중요한 기준으로 삼고 있기 때문에 피부색소 이상 침착의 치료 및 미용욕구 충족을 위한 미백제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있다.

현재 피부미용을 위한 미백제의 개발에 있어서, 생성된 멜라닌 색소를 환원시켜 탈색하는 방법과 멜라닌 색소를 형성하는 효소인 티로시나제의 활성을 억제하는 방법이 알려져 있다. 그러나 멜라닌 색소를 환원시키기 위해 사용되는 토코페롤이나 비타민류 등을 사용한 미백제는 멜라닌 색소의 탈색효과가 미미한 것으로 알려져 있다. 따라서 티로시나제의 활성을 저해시킴으로써 멜라닌 색소의 생성을 억제하는 저해제가 주목받고 있다.

종래의 화장품 분야에서는 미백 성분으로서, 예를 들면, 코지산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질, 하이드로퀴논(Hydroquinone), 비타민 C(L-Ascorbic acid) 및 이들의 유도체와 각종 식물 추출물이 사용되어 왔다.

그러나, 상기 티로시나아제 효소활성을 억제하는 물질은 처방제 중에서의 안정성이 나빠 분해되어 착색되거나, 이취의 발생, 생체 레벨에서의 효능, 효과의 불분명 및 안전성 문제 등으로 그 사용이 제한되고 있는 실정이다. 코지산은 티로시나제의 활성 부위에 존재하는 구리 이온을 흡착시켜 효소활성을 저해하지만, 화장품에 배합 시 불안정성, 피부 부작용의 문제 및 최근 동물실험 결과 간암을 유발한다고 밝혀져 화장품 원료로 사용이 중지되었다. 비타민 C 및 그 유도체는 산화가 잘되는 불안정성 때문에 화장품 원료로서 사용이 어려우며, 하이드로퀴논은 피부에 대한 미백효과는 탁월하지만 알레르기를 유발하는 성질, 멜라닌 생성 세포에 대한 독성, 피부에의 영구 탈색화 등 피부에 대한 자극성이 높으며, 최근 발암성 물질로 규정되어 사용이 금지되어 각 나라별로 제한적인 농도만 허가하고 있다. 또한, 알부틴은 하이드로퀴논에 글루코피라노사이드(Glucopyranoside)가 결합된 유도체로 하이드로퀴논 사용 시 나타나는 부작용이 적으면서 인체에 대한 독성은 없이 멜라닌 색소의 합성을 억제하는 작용이 있어, 멜라닌 색소 침착이 증가되는 피부 질환의 치료제로서의 이용 가능성이 제시되었으나, 피부 효소에 의해 일부 분해되는 단점이 있다.

이들 미백 물질들 외에 천연물 특히 식물 중에서 미백 활성 성분을 찾기 위한 연구도 계속 이루어져 왔고, 그 중 상백피(일본공개특허 소 55-44375호, 소 64-26507호, 소 64-83009호, 평 1-25687호, 평 5-139950호 및 대한민국 공개특허 제92-002109호, 제97-021273호), 감초(일본공개특허 소 60-214721호, 소 60-214728호, 소 63-23809호, 소 64-63506호, 평 1-149706호 및 대한민국 공개특허 제92-002109호, 제97-025601호), 작약(일본공개특허 소 61-246109호 및 대한민국 공개특허 제92-002111호), 계피(일본공개특허 소 63-30403호, 평 5-139954호), 고삼(일본공개특허 소 64-26507호 및 대한민국 공개특허 제92-002110호), 갈근(일본공개특허 소 60-214727호, 소 64-16709호), 당귀(일본공개특허 소 56-92211호, 평 4-26610호), 목단피(일본공개특허 소 60-214721호, 소 61-50915호, 소 61-246109호), 반하(일본공개특허 평 2-207028호, 대한민국 공개특허 제96-033442호), 알로에(일본공개특허 소52-44375호, 평 2-207030호, 평 5-139950호)등 다수의 식물 추출물 및 생약재 추출물 등이 티로시나제에 작용하여 멜라닌 생성을 억제한다는 사실이 밝혀졌으나, 이들 역시 안전성, 변색 가능성 등의 측면에서 화장품이나 의약품에 유효 농도 이상으로 사용하는 데는 많은 문제점을 갖고 있으며, 아직 뛰어난 효과를 나타내지도 못하고 있는 실정이다.

인간을 포함한 모든 호기성 생물체는 산소(O₂)를 이용하여 에너지 대사를 진행하며 생존하고 있다. 그러나 생체 내 산소가 각종 물리적, 화학적, 생물학적인 스트레스를 받으면 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O₂-) 과산화수소(H₂O₂), 히드록시 라디칼(hydroxy radical, ㆍOH) 등의 유해한 활성 산소종(active oxygen species)으로 변하여 인체에 치명적인 생리적 장애를 일으키고 심할 경우는 질병을 유발하고 생명을 잃게 한다.

생체는 활성 산소종을 제거하는 자기 방어 기구로부터 항산화기구(antioxidative mechanism)를 발달시키면서 진화하여 왔다고 생각되지만, 조직의 방어능을 초월한 활성 산소종의 발생은 단백질, DNA, 효소 및 T 세포와 같은 면역계통의 인자를 손상시켜 각종 질환의 원인이 된다. 또한, 활성 산소종은 세포 생체막의 구성 성분인 불포화 지방산을 공격하여 과산화 반응을 일으키고 이로 인해 생체 내 축적된 과산화 지질은 노화와 각종 질병을 유발하는 것으로 알려져 있다(Halliwell, B., Drugs 42:569, 1999; Fukuzawa, K and Takaishi, Y., J. Act. Dxyg. Free Rad. 1:55, 1990; Neuzil, J., Gebicki, J. M. and Stocker, R., Biochem. J. 293:601, 1993; Sies, H., ed., Oxidative stress, 1985; Steinberg. D., et al., N. Engl. J. Med. 320:915. 1989).

최근 노화와 성인병 질환의 원인이 활성 산소종에 기인된 것이라는 학설이 인정됨에 따라 활성 산소종을 조절할 수 있는 물질로 알려진 항산화제의 개발 연구가 활발히 진행되어 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutase), 퍼옥시다아제(peroxidase), 카탈라아제(catalase), 글루타치온 퍼옥시다아제(glutathione peroxidase) 등의 항산화 효소와 토코페롤(tocopherol), 아스코베이트(ascorbate), 카로테노이드(carotenoid), 글루타치온(glutathione) 등의 천연물 유래의 저분자 항산화 물질에 대한 많은 연구가 이루어지고 있으며(Chang, S. S., et al., J. Food Sic. 42:1102, 1977; Hammerschmidt, P. A. and Pratt, D. E., J. Food Sic. 43:556, 1964), 2,6-디-tert-부틸-4-히드록시 아니졸(2,6-di-tert-butyl-4-hydroxyanisole, BHA) 등의 합성 항산화제가 많이 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다(Kitahara, K., et al., Chem Pharm. Bull. 40:2208, 1992; Hatano, T., Natural Medicines 49:357, 1995; Masaki, H., et al., Biol. Pharm. Bull. 18:162, 1995).

그러나 합성 항산화제에 대한 소비자의 기피 성향과 합성 항산화제가 대량으로 투여된 동물 실험에서 발암성이 보고되고 있어(Branen, A. L., JAOCS 52:59, 1975) 합성 항산화제의 사용이 점점 제한되고 있다. 이로 인하여 효력이 탁월하고 보다 안전한 새로운 천연 항산화제의 개발이 절실히 요구된다.

삼채(allium hookeri)는 히말리야 산맥의 언저리인 해발 1400-4200m 초고랭지에서 자라는 식물로 미얀마나 부탄 등에서는 뿌리부추로 불리는데, 우리나라에서는 생긴 모양과 맛이 어린 인삼을 닮았다고 해서 삼채라고 불리거나, 쓴맛, 단맛, 매운맛 등 3가지 맛이 있다고 해서 삼채라고 불린다.

삼채에는 비타민A, C, 칼슘, 철분 등이 풍부하고, 혈액순환개선과 항암작용에 효과 있는 유황성분이 마늘보다 6배 많은 것으로 알려져 있고, 삼채의 유황성분은 피부노화방지하고 강력한 항암작용하며, 섬유소를 함유해 피를 맑게 하고 배변을 촉진하는 기능과 통증완화 작용, 염증을 삭히는 작용을 한다는 것이 알려져 있으며, 또한 삼채는 각종 피부병치료, 아토피질환, 당뇨에도 효과가 있으며, 콜레스테롤 합성억제하고 혈전 분해작용한다는 것이 알려져 있으나, 삼채의 항산화 및 미백효과에 대해서는 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 최근 인체에 관한 안전성의 문제로 합성 원료보다는 천연물에서 유래하여 개발하는 연구에 관심이 높아지면서 합성 원료를 대체할 적절한 미백 및 항산화 효과를 나타내는 물질을 개발하고자 하는 노력한 결과, 삼채 추출물 또는 이의 분획물이 유의적인 항산화활성을 나타내고, 세포독성이 없으며, 멜라닌의 생성을 저해시키고, 티로시나아제 활성을 억제함을 확인함으로써, 상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 항산화 및 미백용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 삼채(allium hookeri) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 미백용 화장료 조성물, 약학적 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 삼채(allium hookeri) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 미백용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명은 삼채(allium hookeri) 추출물 또는 이의 분획물은 유의적인 항산화활성을 나타내고, 세포독성이 없으며, 멜라닌(mealnin)의 생성을 저해시키고, 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 유의적으로 억제하므로, 상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 항산화용 또는 미백용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 삼채(allium hookeri) 잎 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물의 총 폴리페놀(total polyphenol) 화합물 함량을 나타낸 도이다.
도 2는 삼채 잎 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물의 총 플라노이드(flavonoid) 함량을 나타낸 도이다.
도 3은 삼채 잎 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물의 세포 생존능을 나타낸 도이다.
도 4는 삼채 잎 또는 뿌리 추출물, 또는 이의 분획물의 멜라닌(melanin) 생성 억제효과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 삼채(allium hookeri) 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 삼채에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계;

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 삼채의 추출물을 제조하는 단계; 및

4) 단계 3)의 삼채 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 삼채 분획물을 제조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 삼채는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 삼채는 잎 또는 뿌리가 모두 이용가능하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 추출용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 알코올로는 C₁ 내지 C₂ 저급 알코올을 이용하는 것이 바람직하며, 저급 알코올로는 에탄올 또는 메탄올을 이용하는 것이 바람직하다. 추출방법으로는 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류 추출을 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 추출용매를 건조된 삼채 분량에 1 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 2 내지 3배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 추출온도는 20℃ 내지 100℃인 것이 바람직하고, 20℃ 내지 40℃인 것이 더욱 바람직하고, 실온인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 10 내지 48시간인 것이 바람직하며, 15 내지 30시간인 것이 더욱 바람직하고, 24시간인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 3 내지 4회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하고, 3회인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 또는 물인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 삼채 추출물을 물에 현탁시킨 후 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, n-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며, 에틸아세테이트 분획물임이 더욱 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 삼채 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 삼채의 뿌리 또는 잎을 이용하여 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 제조한 후, 항산화 효과를 확인하기 위하여, 총 폴리페놀(total polyphenol) 화합물 함량을 확인한 결과, 삼채 메탄올 추출물 경우 잎에서 19.08±0.14 GAE mg/g, 뿌리에서 11.65±0.36 GAE mg/g에 해당하는 페놀성 화합물을 함유하고 있고, 잎에서 뿌리보다 2배 정도 많은 페놀성 화합물을 갖고 있는 것을 확인하였다. 또한, 용매별 분획물 결과는 에틸 아세테이트층이 잎에서 116.24±7.46 GAE mg/g, 뿌리에서 171.07±7.55 GAE mg/g로 가장 높은 수치를, 물 층에서 잎에서 11.02±0.09 GAE mg/g, 뿌리에서 4.97±0.00 GAE mg/g로 가장 낮은 수치를 나타내 용매 분획시 에틸 아세테이트 분획물에 폴리페놀 함량이 다량 존재함을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 이는 특히 약용 식물로 잘 알려진 음양곽의 81.2 mg/g, 인진쑥의 60 mg/g보다도 훨씬 높은 폴리페놀 함량으로 높은 폴리페놀 화합물을 통한 천연 항산화제로써 활용 가능한 것을 확인하였다.

또한, 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 총 플라보노이드(total flavonoid) 함량을 확인한 결과, 삼채 분획물 중에서 에틸 아세테이트 층이 잎에서 163.94±2.85 mg/100g, 뿌리에서 895.58±1.83 mg/100g으로 월등히 높은 총 플라보노이드(total flavonoid)를 함유하고 있음을 확인하였다(도 2 참조).

또한, 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, DPPH radical 소거활성 및 ABTS radical 소거활성을 확인한 결과, 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 유의적인 DPPH radical 소거활성 및 ABTS radical 소거활성을 나타내고, 특히 삼채 에틸아세테이트 분획물은 양성대조군인 아스코르브산과 비교하여 현저히 우수한 DPPH radical 소거활성 및 ABTS radical 소거활성을 나타냄을 확인하였다(표 1 및 표 2 참조).

또한, 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 항산화력을 측정하기 위하여, FRAP(Ferric reducing antioxidant potential) 분석을 수행한 결과, 삼채 에틸아세테이트 분획물은 현저하게 높은 FRAP 값을 나타내는 것을 확인하였다(표 3 참조).

또한, 본 발명자들은 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 미백 효과를 확인하기 위하여, 티로시나아제(Tyrosinase) 억제효과 및 melanin생성 억제효과를 확인한 결과, 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 양성대조군으로 사용된 알부틴보다 유의적으로 높은 티로시나아제(Tyrosinase) 억제효과 및 melanin생성 억제효과를 나타내어 피부 미백효과를 나타내는 기능성 화장품 원료 및 식품의 효소적 갈변화를 방지하는 기능성 제품으로 활용될 수 있음을 확인하였다(표 4 및 도 4 참조).

따라서, 본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 유의적인 항산화활성을 나타내고, 세포독성이 없으며, 멜라닌(mealnin)의 생성을 저해시키고, 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 유의적으로 억제하므로, 상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 항산화용 또는 미백용 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.

본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 추출물 또는 이의 분획물이 0.1 내지 50 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 피부용 외용제에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

또한, 본 발명은 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 피부 미백용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 유의적인 항산화활성을 나타내고, 세포독성이 없으며, 멜라닌(mealnin)의 생성을 저해시키고, 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 유의적으로 억제하므로, 상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 항산화용 또는 미백용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 함유하는 조성물은 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 ~ 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 삼채 추출물 또는 이의 분획물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 양을 기준으로 0.0001 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.001 내지 10 ㎎/㎏이며, 하루 1 ~ 6 회 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

아울러, 본 발명은 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 미백용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 유의적인 항산화활성을 나타내고, 세포독성이 없으며, 멜라닌(mealnin)의 생성을 저해시키고, 티로시나아제(Tyrosinase) 활성을 유의적으로 억제하므로, 상기 삼채 추출물 또는 이의 분획물은 항산화용 또는 미백용 건강기능식품으로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 삼채 ( Allium hookeri ) 뿌리 및 잎 추출물의 제조

본 발명자들은 삼채(Allium hookeri)(서울, 경동 시장) 잎 10 kg 또는 뿌리 10 kg 을 건조 및 분쇄하여 분말화한 후, 상기 잎 또는 뿌리에 메탄올 20 ℓ를 가한 후 상온에서 순환시키면서 24시간 동안 추출하여 여과 상층액을 회수하였다. 이 과정을 3회 반복하여 상층액을 모은 후, 감압농축하여 삼채 잎 또는 뿌리 메탄올 추출물 1.2 ㎏을 수득하였다.

< 실시예 2> 삼채 뿌리 및 잎 분획물의 제조

상기 <실시예 1>에서 얻어진 삼채 잎 또는 뿌리 메탄올 추출물 1,068 mg 에 물을 첨가하여 현탁시키고, 동량의 100% 헥산을 가하여 진탕 방치하기를 3회 실시하여 헥산 분획물 363.5 mg을 수득하였다. 그런 다음, 상기 헥산 분획물을 제거하고 남은 물층에 클로로포름을 동량 가하여 진탕 방치하기를 3회 반복하여 클로로포름 분획물 195.9 mg을 수득하였으며, 다시 남은 물층에 에틸아세테이트를 동량 가하여 같은 방법으로 에틸아세테이트 분획물 97.8 mg을 수득하였으며, 또 다시 남은 물층에 부탄올을 동량 가하여 동일한 방법으로 부탄올 분획물 199.9 mg을 수득하였으며, 남은 물층을 농축하여 물 분획물 130.3 mg을 수득하였다

< 실험예 1> 삼채 뿌리 및 잎 추출물 또는 이의 분획물의 항산화 효과 확인

<1-1> 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 총 폴리페놀( total polyphenol ) 화합물 함량 확인

천연물에 많이 함유되어있는 성분인 페놀성 화합물은 대사물질로 수산기를 가지는 방향성 화합물을 총칭하는 것으로, 자유라디칼을 소거하며 체내의 항산화 체계와 함께 자유라디칼로부터 조직을 보호해 주는 역할을 한다.

이에, 본 발명자들은 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 잎과 뿌리에 총 페놀성 화합물 함량은 gallic acid를 표준물질로 표준 검량식에 적용하여 건조시료 중 gallic acid 함량(gallic acid equivalent mg/g)으로 나타내어 총 폴리페놀 화합물 함량을 구하였다.

구체적으로, 폴리페놀 화합물 함량은 페놀성 물질인 인몰리브덴산(phosphomolybdic acid)과 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 Folin-Denis 방법을 이용하여 측정하였다. 1 mg/mL 농도로 메탄올에 용해시킨 시료액 0.2 mL에

Folin-Ciocalteu's 페놀 시약(Sigma, USA) 0.2 mL를 첨가하여 혼합한 후 3분간 실온에서 반응시켰다. 여기에 10% 탄산나트륨(Na₂CO₃) 용액 3 mL를 가하여 암실에서 1시간 동안 방치한 후 상등액을 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선은 갈산(Sigma, MO, USA)을 이용하여 검량 곡선을 작성한 후 함량 계산에 활용하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 삼채 메탄올 추출물의 경우 잎에서 19.08±0.14 GAE mg/g, 뿌리에서 11.65±0.36 GAE mg/g에 해당하는 페놀성 화합물을 함유하고 있고, 잎에서 뿌리보다 2배 정도 많은 페놀성 화합물을 갖고 있는 것을 확인하였다. 또한, 용매별 분획물 결과는 에틸 아세테이트층이 잎에서 116.24±7.46 GAE mg/g, 뿌리에서 171.07±7.55 GAE mg/g로 가장 높은 수치를, 물 층에서 잎에서 11.02±0.09 GAE mg/g, 뿌리에서 4.97±0.00 GAE mg/g로 가장 낮은 수치를 나타내 용매 분획시 에틸 아세테이트 분획물에 폴리페놀 함량이 다량 존재함을 확인할 수 있었다(도 1).

이는 특히 약용 식물로 잘 알려진 음양곽의 81.2 mg/g, 인진쑥의 60 mg/g보다도 훨씬 높은 폴리페놀 함량으로 높은 폴리페놀 화합물을 통한 천연 항산화제로써 활용 가능한 것을 확인하였다.

<1-2> 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 총 플라보노이드( total flavonoid ) 함량 확인

페놀 화합물의 한 종류인 플라보노이드는 2개의 방향족 고리와 3개의 탄소로 이루어진 일련의 기본 링 구조(C₆-C₃-C₆)를 갖는 화합물로 심장순환기계 질환 및 항암, 항산화, 항염증에 대한 개선 효과가 있다고 보고되고 있다. 이것은 플라보노이드가 항산화제나 자유라디칼 소거제, 양이온의 킬레이트로 작용하기 때문으로, 기존의 합성 항산화제의 독성, 발암 및 돌연변이 등의 문제점으로 각광받는 천연항산화 물질이다.

이에, 본 발명자들은 삼채 분획물의 총 플라보노이드 함량은 Quercetin을 표준물질로 표준 검량식에 적용하여 건조시료 100 g중 Quercetin 함량(Quercetin equivalent mg/100g)으로 나타내어 총 플라보노이드 화합물 함량을 구하였다.

구체적으로, 총 플라보노이드의 함량 측정은 Davis 방법의 변법(2007. Kor. J. Life Sci. 17:535-539, 2006. J. Kor.Soc. Food Sci. Nutr. 34:132-138)에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출검액 400 ㎕에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 ㎕를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 삼채 분획물 중에서 에틸 아세테이트 층이 잎에서 163.94±2.85 mg/100g, 뿌리에서 895.58±1.83 mg/100g으로 월등히 높은 값을 나타냈고, 물층에서는 잎에서 44.47±2.43 mg/100g, 뿌리에서 31.23±0.23 mg/100g로 가장 낮은 플라보노이드 함량을 보였다(도 2).

<1-3> 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 DPPH radical 소거활성 확인

DPPH 라디칼 소거활성은 항산화 활성을 평가하는 가장 흔한 방법으로 DPPH는 화합물 내 질소 중심의 radical로 radical 전자의 비편재화에 의해 안정한 구조의 radical로 존재하며 517 nm에서 최대 흡수를 나타내며, 환원되면 517 nm에서 흡수가 없어진다. 따라서 DPPH의 환원정도는 환원제의 환원력에 달려있어. 인체 내에서 활성 radical에 의한 노화를 억제하는 작용의 척도로 이용되고 있다.

이에 본 발명자들은 삼채 분획물의 DPPH 라디칼 소거능은 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl, sigma)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과(radical scavenging effect)를 측정하는 Blois법을 활용하였다. 삼채 추출물 또는 분획물을 농도별(0.1, 0.3, 0.5, 0.7 및 1.0 mg/mL)로 제조한 시료 0.2 mL에 0.2 mM DPPH 0.6 mL를 가하고 볼텍스 믹싱(vortex mixing)한 후 실온에서 15분간 반응시키고 분광광도계를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하고 DPPH의 환원에 의한 흡광도 감소를 계산하였다. 무처리군과 처리군의 값을 비교하여 자유 라디칼 소거활성을 결정하였으며, 이때 IC₅₀(mg/mL)은 추출물을 첨가하지 않은 대조군의 값을 50% 감소시키는 추출물의 농도를 나타냈으며, 또한 기존의 항산화제인 아스코르브산(ascorbic acid)의 DPPH 라디칼을 측정하여 비교하였다.

DPPH 라디칼 소거능(DPPH-radicals scavenging activity, %)=(1-A/B)×100

A: 시료 흡광도(absorbance of sample)

B: 대조군 흡광도(absorbance of blank)

그 결과, 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 삼채 분획물 중 가장 활성이 높은 분획물은 에틸아세테이트 분획물로, 뿌리가 0.06±00 mg/mL, 잎이 0.29±0.01 mg/mL의 IC₅₀값이 나타나 에틸아세테이트 분획물 뿌리가 가장 높은 DPPH 라디칼 소거능을 나타내었다. 또한, 아스코르브산의 IC₅₀(0.01 mg/mL)과 비교해 보았을 때, 아스코르브산이 단일물질이라는 점을 감안하면 비교적 높은 DPPH 라디칼 소거능이 있다는 것을 확인하였다. 한편, 그 다음으로 높은 활성을 보이는 분획물은 잎과 뿌리 모두 클로로프름 분획물 > n-부탄올 분획물 > n-헥산 분획물 > 물 분획물 순으로 확인하였다(표 1).

추출물 또는 분획물	DPPH radical scavenging activity IC50(mg/mL)
	잎	뿌리
메탄올 추출물	5.98±0.12	8.19±0.35
n-헥산 분획물	5.46±0.45	2.20±0.07
클로로프름 분획물	0.84±0.02	0.45±0.01
에틸아세테이트 분획물	0.29±0.01	0.06±0.00
n-부탄올 분획물	1.22±0.01	1.06±0.01
물 분획물	5.94±0.63	9.27±0.08

<1-4> 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 ABTS radical 소거활성 확인

ABTS[2, 2'-azinobis(3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)]는 비교적 안정한 free radical로서 혈장에서 ABTS radical의 흡광도가 항산화제에 의해 억제되는 것에 기초하여 개발된 ABTS radical 소거 활성법은 DPPH 방법과 함께 항산화활성을 스크리닝하는데 많이 이용되고 있다. ABTS를 peroxidase, H₂O₂와 반응에 의해 생성된 활성 양이온인 ABTS⁺가 시료 중의 항산화성 물질에 의해 제거되어 radical 특유의 색인 청록색이 탈색되는데 이를 흡광도 값으로 나타내어 추출물의 ABTS 소거 활성을 측정할 수 있다. ABTS radical 소거활성을 평가한 결과는 산화를 50% 억제시키는 농도인 IC₅₀으로 나타내었다.

구체적으로, ABTS 라디칼 소거능 측정은 Pellegrin 등의 방법에 의해 측정하였다. 7 mM ABTS와 140 mM 과황산칼륨(K2S2O8)을 5 mL:88 ul로 섞은 후 어두운 곳에서 14~16시간 동안 방치하였다. 이를 무수 에탄올(absolute ethanol)과 1:88의 비율로 섞은 500 ug/mL 농도의 시료용액 50 uL와 734 nm에서 대조군의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS 용액 1 mL를 30초 동안 섞은 후 2.5분간 항온처리(incubation)하고 734 nm에서 흡광도를 측정한 후, IC₅₀으로 나타내었다.

그 결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 삼채 추출물 및 분획물의 ABTS radical 소거 활성을 측정한 결과, 잎과 뿌리 모두 에틸아세테이트 분획물이 가장 낮은 IC₅₀(잎 0.05±0.01 mg/ml, 뿌리 0.01±0.00 mg/ml)으로 높은 활성을 나타내었고, 클로로프름 분획물(잎 0.29±0.15 mg/ml, 뿌리 0.12±0.00 mg/ml), n-부탄올 분획물(잎 0.30±0.00, 뿌리 0.30±0.01 mg/ml), n-헥산 분획물(잎 1.27±0.11 mg/ml, 뿌리 1.14±0.02 mg/ml) 순으로 나타났고, 물 분획물이 가장 낮은 활성을 보였다. 본 실험 결과와 양성 대조군으로 사용한 아스코르브산의 활성 0.003 mg/ml을 비교하였을 때, 에틸아세테이트 분획물은 매우 높은 활성이 있는 것으로 나타났다. n-헥산, 클로로프름, 에틸아세테이트 분획물 층에서는 뿌리가 더 활성이 좋고, n-부탄올 층에서는 유의적 차이가 없었으며, 물 분획물 층과 메탄올 추출물에서는 잎의 활성이 더 좋게 나타나 DPPH radical 소거능과 유사한 결과가 나타났다(표 2).

추출물 또는 분획물	ABTS radical scavenging activity IC50(mg/mL)
	잎	뿌리
메탄올 추출물	2.58±0.07	2.91±0.07
n-헥산 분획물	1.27±0.11	1.14±0.02
클로로프름 분획물	0.29±0.15	0.12±0.00
에틸아세테이트 분획물	0.05±0.01	0.01±0.00
n-부탄올 분획물	0.30±0.00	0.30±0.01
물 분획물	7.92±0.16	12.94±0.10

<1-5> FRAP( Ferric reducing antioxidant potential) 측정

FRAP 분석은 colored ferrous TPTZ 복합체에 의해 ferricion이 ferrous로 전환되어지는 과정을 분석함으로써 시료내의 항산화력을 측정하는 방법으로 낮은 pH에서 환원제에 의해 Fe^{3 +}-TPTZ 복합체가 Fe^{2 +}-TPTZ으로 환원되는 원리에 기초하여 hydroxylation의 정도와 polyphenol에 결합하는 정도를 측정하는 것이다.

구체적으로, 각 추출물 및 분획물의 FRAP 측정은 Benzie 및 Strain의 방법을 참고하여 측정하였다. FRAP 시약(FRAP reagent)은 25 mL 아세테이트 버퍼(300 mM, pH 3.6)를 37℃에서 가온한 후, 40 mM HCl에 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma) 5 mL과 20 mM 황산철(FeSO₄) 2.5 mL을 가하여 제조하였다. 상기 제조된 FRAP 시약 0.9 mL에 1 mg/mL의 농도로 용해시킨 각각의 삼채 추출물 및 분획물 0.03 mL와 증류수 0.09 mL를 넣은 다음 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 593 nm에서 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정하였고, 양성 대조군으로는 비타민 C를 1 mg/mL 농도로 제조하고 FRAP를 측정하여 실험군과 비교하였다.

그 결과, 하기 표 3에 개시된 바와 같이, 열풍건조 삼채 추출물 및 분획물의 FRAP value을 측정한 결과 잎과 뿌리 모두 각 분획물 중 에틸아세테이트 분획물의 FRAP value이 4.00±0.04~10.08±0.41 mM로 가장 높았으며 클로로프름 분획물 > n-부탄올 분획물 > n-헥산 분획물 > 메탄올 추출물 순으로 나타났다. 물 분획물을 제외한 다른 분획물에서는 뿌리의 FRAP value가 높게 나타났다. 아울러, 기존 총 페놀 함량과 FRAP values는 높은 상관관계가 있다고 보고되어 있으므로, 본 발명의 결과에서도 총 페놀 함량과 FRAP values가 비슷한 경향을 보였다. 양성대조군으로 사용한 비타민 C는 1 mg/mL에서 7.04 mM 의 FRAP value 값으로 열풍건조 삼채 분획물 층과 비교해 보았을 때 분획물에서 비교적 높은 활성을 가지고 있었고, 특히 에틸아세테이트층은 단일 물질이 아님에도 항산화 활성이 매우 높아 삼채의 천연 항산화제로서의 가능성을 확인할 수 있었다(표 3).

추출물 또는 분획물	FeSO4·H20(mM) (5 mg/mL)1)
	잎	뿌리
메탄올 추출물	0.31±0.01	0.37±0.01
n-헥산 분획물	0.87±0.00	1.12±0.02
클로로프름 분획물	2.83±0.16	3.40±0.08
에틸아세테이트 분획물	4.00±0.04	10.08±0.41
n-부탄올 분획물	1.00±0.06	1.13±0.02
물 분획물	0.18±0.00	0.11±0.00

¹⁾: 샘플 농도

< 실험예 2> 삼채 추출물 또는 이의 분획물의 미백 효과 확인

<2-1> 티로시나아제( Tyrosinase ) 억제효과 확인

자연계에 널리 존재하는 페놀류의 고분자 천연 색소인 멜라닌은 생물체의 종류에 따라 다양하며 페놀류의 효소적 및 비효소적 산화 및 중합반응 등의 다단계 과정을 거쳐 생성된다. 피부에서는 세포 내의 티로시나아제라는 효소가 타이로신(tyrosine)을 기질로 하여 도파퀴논(dopaquinone)을 생성시키고, 생성된 도파퀴논은 아미노산 혹은 단백질 중합반응에 의해 멜라닌이 합성되며, 이것은 자외선, 건조, 극한 온도 등에 대한 피부의 저항력을 높여주지만, 과도한 멜라닌 생성은 인체에 기미, 주근깨, 검버섯 등과 같은 색소 침착을 일으키고, 피부의 노화를 촉진시킨다. 또한 식품에서는 야채나 과식류 특히, 감자의 갈변화 현상을 일으켜 품질을 저하시키는 문제점이 있다. 하지만 이렇게 생성된 멜라닌은 쉽게 파괴 또는 분해가 어려워 이를 억제하기 위한 방법의 일환으로 티로시나아제의 활성을 저해하는 방법이 있다. 본 발명에서는 티로시나아제 효소의 작용 저해효과를 나타내는 대표적인 물질인 알부틴(arbutin)을 양성대조군으로 사용하여 비교하였으며, 삼채 추출물이 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 확인하였다.

구체적으로, 티로시나아제 저해 활성은 Yagi 등의 방법에 따라 측정하였다. 0.175 M 소듐 포스페이트 버퍼(Sodium phosphate buffer, pH 6.8) 0.5 mL에 10 mM L-DOPA를 녹인 기질액 0.2 mL와 시료용액 0.1 mL을 혼합한 용액에 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase, 110 U/mL) 0.2 mL를 첨가하여 25℃에서 2분간 반응시킨

후, 생성된 DOPA 크롬(chrome)을 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나아제 저해 활성은 실험군과 무첨가군의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 나타내었다.

그 결과, 하기 표 4에 나타낸 바와 같이, 열풍건조 삼채의 n-헥산 분획물은 잎에서 53.51±0.55%, 뿌리에서 49.19±0.39%로 분획물중 유의적으로 높은 티로시나아제 억제 활성을 나타내었으며 클로로프름 분획물 > 에틸아세테이트 분획물 > n-부탄올 분획물 > 메탄올 추출물 > 알부틴 > 물 분획물 순서로 티로시나아제를 저해하는 것으로 나타났다. 특히 물 분획물을 제외한 나머지 분획물과 메탄올 추출물은 양성대조군으로 사용된 알부틴보다 높은 활성을 보여 피부 미백효과를 나타내는 기능성 화장품 원료 및 식품의 효소적 갈변화를 방지하는 기능성 제품으로 활용될 수 있음을 확인하였다(표 4).

추출물 또는 분획물	Tyrosinase inhibition activities(%) (2 mg/mL)1)
	잎	뿌리
Arbutin	37.09±1.21
메탄올 추출물	38.47±0.71	36.59±1.44
n-헥산 분획물	53.51±2.55	49.19±2.39
클로로프름 분획물	48.06±1.60	42.11±1.17
에틸아세테이트 분획물	45.49±0.50	40.60±3.94
n-부탄올 분획물	36.65±1.85	35.28±0.78
물 분획물	36.15±0.47	31.77±1.61

¹⁾: 샘플 농도

<2-2> 세포 생존능( cell viability )

멜라닌의 생성은 피부의 표피와 진피사이에 주로 존재하는 melanoytes에서 이루어진다. Melanoma 세포주는 mouse 유래의 멜라닌 생성세포로써 멜라닌을 생합성한다. 삼채 추출물과 용매별 분획물의 멜라닌 생성 억제효과를 밝히고자 우선적으로 B16F10 melanoma cell의 생존율에 미치는 영향에 관하여 관찰하였다.

구체적으로, 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ㎍/mL의 농도로 세포에 처리한 후 72시간 동안 배양한 후, 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 대조군에서의 생존능을 100%로 하여 비교하였을 때 62.5 ㎍/mL 이하 농도의 실험군에서 세포의 사멸이 관찰되지 않았다. 따라서 melanin 생성 억제효과 실험에서는 50 ㎍/mL의 arbutin 및 실험군을 사용하여 실험하였다(도 3).

<2-3> 열풍건조 삼채의 용매 분획별 melanin 생성 억제효과

멜라닌은 자외선 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 하지만 이의 과다 생성은 기미, 주근깨, 검버섯, 피부암 등의 질환을 유발한다. 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포 생존능에 영향을 끼치지 않는 50 ㎍/mL의 농도에서 멜라닌 생성 저해효과를 측정하였다.

구체적으로, 한국 세포주은행(Seoul National University, Seoul, Korea)에서 분양받은 B16F10 멜라노마(mouse B16F10 melanoma) 세포주를 10% 소혈청과 1%의 항생제를 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's Medium)에 1×10⁵세포의 밀도로 접종한 후 배양시켰다(5% CO₂, 37℃, 24시간). 그 후 α-MSH (melanocyte stimulating hormone; 멜라닌세포자극호르몬, 0.34㎍/㎖, 시그마사, 미국)가 처리된 DMEM(10% 소혈청함유) 배지로 갈아준 후 시료를 농도별로 웰에 처리하여 3일간 배양하였다. 3일 후 1.5㎖ 튜브에 배지를 수거하고 세포들을 트립신으로 처리하여 떼어낸 후 배지를 수거한 튜브로 옮겼다. 3,000 rpm에서 30분 동안 원심분리 하여 상층액을 버리고 1N NaOH 250㎕를 처리하여 끓는 물에서 10분 처리 후 가볍게 원심분리 하였다. 다시 10분간 초음파분해(sonication)하여 완전히 멜라닌을 용해한 후 475nm파장에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성양을 측정하였고, 활성비교를 위해 피부미백 고시 기능성원료로 사용되고 있는 알부틴(Arbutin)을 대조군으로 사용하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 무리처군(non-treated group)에 비하여 a-MSH 처리군에서 멜라닌 농도가 유의적으로(p<0.05) 증가한 것으로 보아 a-MSH에 의한 melanogenesis가 성공적으로 유도되었음을 확인하였다. 또한 양성대조군으로 사용한 arbutin 처리 그룹에서 멜라닌 생성량이 유의적으로(p<0.05) 감소되는 것이 관찰되었다. 분획물 중 뿌리의 n-헥산층과 클로로프름층을 처리한 군에서 52.22%, 53.49%, 잎의 n-헥산층과 클로로프름층에서 60.32%, 56.51%로 a-MSH만 처리한 대조군에 비해 melanin 생성을 보이며 61.27%를 생성한 arbutin보다 유의적으로 높은 melanin의 생성억제를 확인하였다. 반면 분획하기 전의 메탄올 추출물과 물 층 분획물에서는 미백활성을 거의 보이지 않는 것으로 나타났다. 이는 삼채를 용매 분획시 용매의 극성에 따라 성분이 이행되는 과정에서 미백활성을 띄는 성분이 n-헥산과 클로로프름 분획층으로 이행되었기 때문이다. 한편, 이전 보고된 더위지기 추출물을 분획하여 50 ㎍/mL 농도에서 melanin 저해활성을 측정한 결과 에탄올 추출물에서 36.8%, 대조구인 ascorbic acid의 17.4%, 물추출물에서 10.5%의 억제효과가 나타난 것과, 죽황 추출물 50 ㎍/mL에서 31%인 것과 비교했을 때 삼채 분획물은 높은 미백 활성을 보인 것으로 확인하였다(도 4).

이상의 결과가 위의 tyrosinase의 결과와 비슷한 것으로 삼채 추출물의 세포내 melanin 생성 저해능이 melanin 생성 과정에서 중요한 역할을 담당하는 단백질인 tyrosinase의 활성 저해에서 기인함을 시사함과 동시에 n-헥산층과 클로로프름층에서 높은 활성을 나타내어 미백활성 보유 물질의 유용한 자원임을 확인하였다.

< 제조예 1> 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 항산화 또는 미백용 화장료 조성물의 제조

<1-1> 유연 화장수의 제조

상기 <실시예 1> 또는 <실시예 2>의 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 유연 화장수는 하기 [표 5]와 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물	10.00
1,3-부틸렌글리콜	1.00
디소듐이디티에이	0.05
알란토인	0.10
디포타슘글리시리제이트	0.05
시트릭애씨드	0.01
소듐시트레이트	0.02
글리세레스-26	1.00
알부틴	2.00
하이드로제네이티드캐스터오일	1.00
에탄올	30.00
보존제	미량
착색제	미량
착향제	미량
정제수	잔량

<1-2> 영양 크림의 제조

상기 <실시예 1> 또는 <실시예 2>의 삼채 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유한 영양크림은 하기 [표 6]의 조성과 같이 제조하였다.

원료	함량(중량부)
본 발명의 삼채 추출물 또는 이의 분획물	10.0
1,3-부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	1.0
D-판테놀	0.1
식물 추출물	3.2
마그네슘알루미늄실리케이트	0.3
PEG-40 스테아레이트	1.2
스테아릭애씨드	2.0
폴리소르베이트 60	1.5
친유형글리세릴스테아레이트	2.0
소르비탄세스퀴올리에이트	1.5
세테아릴알코올	3.0
미네랄오일	4.0
스쿠알란	3.8
카르릴릭/카프릭트리글리세라이드	2.8
식물성 오일	1.8
디메치콘	0.4
디포타슘글리시리제이트	미량
알란토인	미량
소듐 히아루로네이트	미량
토코페릴아세테이트	적량
트리에탄올아민	적량
보존제	적량
착향제	적량
정제수	잔량

Claims (9)

1. 삼채(allium hookeri) 추출물의 n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 삼채 추출물은 삼채 잎 또는 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1항에 있어서, 상기 분획물은 삼채 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
   
6. 삼채 추출물의 n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 약학적 조성물.
   
7. 제 6항에 있어서, 상기 삼채 추출물은 삼채 잎 또는 뿌리 추출물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 약학적 조성물.
   
8. 제 6항에 있어서, 상기 분획물은 삼채 추출물을 n-헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, n-부탄올, 물로 순차적으로 분획하여 얻은 n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 약학적 조성물.
   
9. 삼채 추출물의 n-헥산 분획물 또는 클로로포름 분획물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 건강기능식품.
   

Images