WO2004044564A1

WO2004044564A1 - 測定装置及び蛍光測定方法

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Publication number: WO2004044564A1
Application number: PCT/JP2003/014421
Authority: WO
Inventors: Shinya Nakajima
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2002-11-14
Filing date: 2003-11-13
Publication date: 2004-05-27
Also published as: CN100498296C; US7256892B2; JP3903000B2; ATE541203T1; EP1562037A1; AU2003284547A1; EP1562037B1; US20060108540A1; EP1562037A4; JP2004163312A; CN1711469A

Abstract

波長の異なる光を照射可能な光源ユニット１と、複数の色素が混合された試料６からの透過光又は放射光の強度に応じた電気信号を出力する受光ユニット２と、演算部３とを有する測定装置を用いる。演算部３は予め算出した補正係数を用いて、透過光又は放射光の蛍光強度を色素毎に算出する。補正係数は、色素のいずれか一つが混合され、混合された色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、波長の異なる光を照射したときに、受光ユニット２が出力する電気信号に基づいて算出する。

Description

測定装置及び蛍光測定方法

技術分野

本発明は、複数の色素が混合された試料に、各色素に対応する波長の光を照射した場合における、色素毎の透過光又は放射光の強度を測定す明

る測定装置に関し、特には、複数の蛍光色素が混合された試料に、各蛍光色素の励起波長の光を照射し、この光によって励起された蛍光を測定書

する蛍光測定装置及び蛍光測定方法に関する。

背景技術

近年、蛍光測定、吸光度測定、又は反射率測定を用いて、各種の成分分析や遺伝子診断等が行なわれている。例えば、蛍光測定を用いた成分分析では、色素（蛍光色素）を混合した試料に光を照射し、この光により励起された蛍光の蛍光強度を測定することによって、色素（蛍光色素）が標識された物質が検出される。

吸光度測定を用いた成分分析では、例えば、特開平 9一 2 1 7 4 9号公報に開示されているように、色素を混合した試料に、色素に対応した波長の光を照射し、このときの透過光の強度を測定して吸光度を算出することにより、色素が標識された物質が検出される。反射率測定を用いた成分分析では、透過光の代わりに散乱光の強度を測定して反射率を算出することにより、色素が標識された物質が検出される。

また、このような成分分析によって複数の物質を検出する場合は、検出対象となる物質に応じて、種類の異なる複数の色素が試料に混合され、各色素に対応する光が別々に試料に照射される。蛍光測定を用いる場合では、例えば、特表 2 0 0 0— 5 0 3 7 7 4号公報に開示されているように、励起波長及び蛍光波長がそれぞれ異なる複数の色素（蛍光色素）が混合された試料に、各色素の励起波長の光を別々に照射し、色素毎の蛍光強度を測定することによって成分分析が行なわれる。

また、吸光度測定を用いる場合では、吸収波長がそれぞれ異なる複数の色素が混合された試料に、各色素の吸収波長の光を別々に照射し、透過光の強度を色素毎に測定することによって成分分析が行なわれる。しかしながら、通常、色素の励起波長や吸収波長、反射波長はある程度の幅を有している。このため、蛍光測定を用いる場合は、使用されている色素（蛍光色素）間で励起ピーク波長が近接していると、ある色素がその励起波長の光によって励起したときに、他の色素まで励起してしまう場合がある。この場合、得られる蛍光強度は、励起した各色素の蛍光強度の合成値となってしまい、正確な成分分析や遺伝子診断等を行なうのが困難となる。

また、吸光度測定や反射測定を用いる場合であっても同様であり、得られる透過光や散乱光の強度が、各色素の透過光や散乱光の強度の合成値となり、正確な成分分析や遺伝子診断等を行なうのが困難となる。本発明の目的は、透過光や放射光の強度の合成値から色素毎の実際の強度を分離して測定できる測定装置及び蛍光測定方法を提供することにめる。発明の開示

上記目的を達成するために本発明にかかる測定装置は、複数の色素が混合された試料に波長の異なる光を照射したときの透過光又は放射光の強度を前記色素毎に測定する測定装置であって、波長の異なる光を前記試料に照射可能な光源ュニットと、前記透過光又は前記放射光を受光し、受光した光の強度に応じた電気信号を出力する受光ュニットと、演算部とを有し、前記演算部は、前記複数の色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ユニットによって波長の異なる光を照射したときに前記受光ュニッ卜が出力する電気信号に基づいて算出される補正係数を用いて、前記透過光又は前記放射光の強度を前記色素毎に算出することを特徴とする。

また、本発明にかかる測定装置は、前記試料に、前記色素として励起波長の異なる複数の蛍光色素が混合されており、前記受光ユニットが、前記蛍光色素による蛍光を受光し、受光した前記蛍光の蛍光強度に応じた電気信号を出力し、前記演算部が、前記複数の蛍光色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された蛍光色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ュニットによって前記複数の蛍光色素それぞれの励起波長の光を照射したときに前記受光ュニッ卜が出力する電気信号に基づいて算出される補正係数を用いて、前記試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を算出する態様であっても良い。この態様においては、本発明にかかる測定装置は蛍光測定装置として機能する。

また、蛍光測定装置として機能する態様においては、前記試料に混合される前記複数の蛍光色素に 1〜nの番号を付し、前記光源ュニッ卜が k ( 1 , 2 , ··· , n ) 番の蛍光色素の励起波長の光を前記試料に照射したときに前記受光ュニットが出力する前記電気信号の出力値を X _k、前記 k番の蛍光色素の蛍光強度を Y _kとしたときに、前記補正係数が下記式（ 1 ) を満たす行列（ a _u ( i = 1 , 2 ··· , η ; j = 1 , 2 , ···， η ) ) であり、前記演算部は、下記式（1 ) に前記行列（a _u ) と前記出力値 X i X nとを代入して、前記蛍光強度 Y i Y nを前記蛍光色素毎の蛍光強度として算出するのが好ましい態様である。

更に、蛍光測定装置として機能する態様においては、前記光源ュニットが照射する光の光量を検出して前記演算部に信号を出力する光量モニ夕を有し、前記演算部は、前記光量モニタが出力した信号に基づいて、前記出力値ェ〜。又は行列要素 a i i 〜 a _{n n}を補正するのも好ましい態様である。

次に、上記目的を達成するために本発明にかかる蛍光測定方法は、波長の異なる光を照射可能な光源ュニットと、蛍光色素による蛍光を受光し、受光した前記蛍光の蛍光強度に応じた電気信号を出力する受光ュ二ッ卜とを用いて、励起波長の異なる複数の蛍光色素が混合した試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を測定する蛍光測定方法であって、補正係数を用いて、前記試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を算出する工程を有し、前記補正係数は、前記複数の蛍光色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された蛍光色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ュニッ卜によって、前記複数の蛍光色素それぞれの励起波長の光を照射したときに前記受光ユニットが出力する電気信号に基づいて、算出されたものであることを特徴とする。上記本発明にかかる蛍光測定方法においては、前記試料に混合される前記複数の蛍光色素に l〜nの番号を付し、前記光源ユニットが k ( 1 , 2 , …， n ) 番の蛍光色素の励起波長の光を前記試料に照射したときに前記受光ュニットが出力する前記電気信号の出力値を X _k、前記 k番の蛍光色素の蛍光強度を Y _kとしたときに、前記補正係数が上記式（ 1 ) を満たす行列（a i j ( i = 1 , 2 ·'·， n ; j = 1 , 2， …， n ) ) であり、上記式（ 1 ) に前記行列（a u ) と前記出力値ェ〜。とを代入して、前記蛍光強度丫ェ〜丫を前記蛍光色素毎の蛍光強度として算出するのが好ましい態様である。

更に、上記本発明にかかる蛍光測定方法においては、前記光源ュニットが照射した光の光量に基づいて、前記出力値ェ〜又は行列要素 a 〜 a _{n n}を補正するのが好ましい態様である。

また、本発明は、上記の本発明にかかる蛍光測定方法を具現化するためのプログラムであっても良い。このプログラムをコンピュータにインストールして実行することにより、本発明にかかる蛍光測定方法を実行できる。なお、本明細書において，「色素」には、吸光度測定や反射率測定で用いられる色素に加え、蛍光測定で用いられる蛍光色素も含まれる。「色素」のうち蛍光色素のみを意味する場合は「蛍光色素」とする。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の測定装置の一態様である蛍光測定装置を示す構成図である。

図 2は、図 1に示す蛍光測定装置で行なわれる蛍光測定処理を示すフ口—チャートである。図 3は、図 1に示す蛍光測定装置で行なわれる補正係数算出処理を示すフローチヤ一トである。図 4は、図 1に示す蛍光測定装置で行なわれる光量補正値算出処理を示すフローチャートである。

発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の測定装置及び蛍光測定方法の一例について図面を参照しながら説明する。なお、以下においては、本発明の測定装置が蛍光測定装置である例について説明している。先ず、本発明の測定装置の一態様である蛍光測定装置の構成について図 1を用いて説明する。図 1は、本発明の測定装置の一態様である蛍光測定装置を示す構成図である。

図 1に示す蛍光測定装置は、試料 6から放射される蛍光の蛍光色素毎の蛍光強度を測定する装置である。図 1に示すように、蛍光測定装置は、光源ユニット 1、受光ユニット 2、演算部 3、表示部 4、反応容器 5及び光量モニタ 7を備えている。

反応容器 5には、複数の蛍光色素が混合された試料 6が添加される。図 1の例では、試料には下記の表 1に示す 4種類の蛍光色素が混合されている。なお、本発明において試料に混合される蛍光色素は下記の表 1 に示すものに限定されず、その数も限定されるものではない。本発明では、蛍光測定の目的等に応じて、必要な数の適切な蛍光色素を選択できる。

(表 1 ) 蛍光色素名 FAM JOE TAMRA ROX

励起ピーク波長

4 7 0 5 0 0 5 3 0 5 6 0

[nm]

蛍光ピーク波長

5 2 0 5 5 0 5 8 0 6 1 0

[nm] 光源ユニット 1は、波長の異なる光を照射可能に構成されており、試料に混合される蛍光色素の励起波長の光を照射することができる。図 1 の例では、光源ュニット 1は、発光素子 1 1 a〜 1 1 dと、ダイクロイックミラー 1 2 a〜 1 2 dと、全反射ミラ一 1 3とを備えている。

発光素子 1 1 a〜 1 1 dは、演算部 3の指示に応じて発光し、試料 6 に混合された蛍光色素を励起させるための光を出射する。発光素子 1 1 a〜 l I dは、各発光素子の出射方向が平行となるように配置されている。発光素子 1 1 a〜 1 1 dが出射する光の波長は、互いに異なっており、試料に混合されている蛍光色素のいずれかの励起波長に設定されている。具体的には、発光素子 1 1 aは F A Mの励起波長の光を、発光素子 1 1 bは J〇Eの励起波長の光を、発光素子 1 1 cは T A M R Aの励起波長の光を、発光素子 1 1 dは R O Xの励起波長の光を出射する。

ダイクロイツクミラー 1 2 a〜 1 2 dは、特定波長以下の波長の光だけを反射する（ハイパス）特性を有しており、ダイクロイツクミラ一 1 2 a、 1 2 b、 1 2 c、 1 2 dの順で、反射可能な光の最大波長が大きくなっている。

このため、発光素子 1 1 a〜 l 1 dそれぞれから出射された光は、同一の光路を通って全反射ミラ一 1 3に入射し、これに反射されて反応容器 5に入射する。また、発光素子 1 1 a〜 1 1 dが出射した光の光量は、光量モニタ 7によってモニタされる。光量モニタ 7は、発光素子 1 1 a 〜 1 1 dが出射した光の光量を検出して、演算部 3に信号を出力する。なお、図 1の例では、使用される蛍光色素が上述したように 4種類であるため、光源ユニット 1を構成する発光素子の数も 4つである。また、発光素子の数に合わせてダイクロイツクミラーの数も 4つである。但し、本発明においては、発光素子及びダイクロイツクミラーの数はこれに限定されず、使用される蛍光色素の数に応じて決定される。また、発光素子 1 1 a〜 l i dとしては、発光ダイォードゃ半導体レーザを用いるのが好ましいが、キセノンランプやハロゲンランプを用いることもできる。受光ユニット 2は、反応容器 5から放出された蛍光を受光し、受光した蛍光の蛍光強度に応じた電気信号を出力する。図 1の例では、受光ュニットは、受光素子 1 4 a〜1 4 dと、ダイクロイツクミラー 1 5 a〜 1 5 dと、全反射ミラ一 1 6とを備えている。

図 1の例では、ダイクロイツクミラー 1 5 a〜l 5 dは、特定波長以上の波長の光だけを反射する（ローパス）特性を有したものであり、ダィクロイツクミラー 1 5 d、 1 5 c、 1 5 b、 1 5 aの順で、反射可能な光の最小波長が大きくなつている。受光素子 1 4 a〜 1 4 dは、フォトダイォードであり、一のダイクロイツクミラーの反射光が一の受光素子の受光面（図示せず）に入射するように配置されている。

このため、反応容器 5から放射された蛍光は、全反射ミラー 1 6で反射された後、その波長に応じてダイクロイツクミラー 1 5 a〜l 5 dのいずれかで反射され、対応する受光素子に入射することになる。この結果、各受光素子から、蛍光の蛍光強度に応じた電気信号が演算部 3に出力される。

演算部 3は、受光ュニット 2から出力された電気信号に基づいて蛍光強度を算出する。算出された結果は、表示部 4に表示される。表示部 4 は、液晶表示装置や C R T等である。

次に、本発明の蛍光測定方法について図 2〜図 4を用いて説明する。なお、本発明の蛍光測定方法は、図 1に示す蛍光測定装置を動作させることによって実行することができる。このため、以下の説明では、図 1 に示す蛍光測定装置の動作について説明する。

図 2は、図 1に示す蛍光測定装置で行なわれる蛍光測定処理を示すフローチャートである。図 2に示すように、最初に、蛍光測定装置の演算部 3は、補正係数が算出されているかどうか判定する（ステップ S 1 ) 。補正係数は、複数の蛍光色素が混合された試料に各蛍光色素の励起波長の光を照射レたときに受光ュニット 2が出力する電気信号から、蛍光色素毎の蛍光強度を算出するための係数である。

なお、本発明における「蛍光色素毎の蛍光強度」とは、従来の蛍光測定で得られる合成値を言うのではなく、試料に光を照射したときに、その光の波長と励起波長が一致する蛍光色素が放射する蛍光のみの蛍光強度をいう。即ち、本発明においては、後述するように上記の補正係数を用いることで、合成値から実際の蛍光強度を分離している。

図 2の例では、補正係数は上記式（1 ) を満たす行例（a .) である。但し、本例では、上記したように試料に混合される蛍光色素は 4種類である。このため、試料に混合される 4種類の蛍光色素に、励起波長の短い順に 1〜4の番号を付し、光源ユニット 1が k ( 1 , 2 , 3， 4) 番の蛍光色素の励起波長の光を試料に照射したときに受光ュニット 2が出力する電気信号の出力値を X_k、 k番の蛍光色素の蛍光強度を Y_kとすると、補正係数は下記式（2 ) を満たす行列（_{a i j} ( i = l， 2 , 3 , 4 ； j = 1， 2 , 3 , 4 ) ) となる。

an a Υ Γ

G U Yl (2)

y₃ s

A. ステップ S 1において補正係数が未だ算出されていないと判断した場合は、演算部 3は補正係数算出処理を行ない（ステップ S 2) 、その後、以下のステップ S 3を実行する。なお、ステップ S 2の補正係数算出処理の具体的な内容については、後述する。一方、ステップ S 1において補正係数が算出されていると判断した場合は、演算部 3は、発光素子 1 1 a〜 l 1 dそれぞれから光を出射させて光量モニタ 7によって光量を測定し、測定した光量に変動があった場合は、後述の出力値 Xi〜X₄を補正するための光量補正値を算出する (ステップ S 3) 。なお、ステップ S 3の具体的な内容については、後述する。

次に、演算部 3は、蛍光強度を測定するため、光源ユニット 1の各発光素子に試料への励起波長の光の照射を行なわせる（ステップ S 4) 。次いで、演算部 3は、受光ユニット 2が出力する電気信号を受信し、その出力値 X_k (k= l〜4) を取得する（ステップ S 5) 。

なお、図 1〜図 4の例においては、受光ユニット 2から出力された電気信号の出力値は、受光素子 14 a〜 14 dが出力した電気信号の電流値を I /V変換し、これによつて得られた電圧値を更に AZD変換して得られるデジタル値であるが、本発明はこれに限定されるものではない。受光ユニット 2から出力された電気信号の出力値は、受光素子 14 a〜 14 dが出力した電気信号の電流値を A/D変換して得られるデジタル値であっても良い。

その後、演算部 3は、出力値 Xi〜X₄を全て取得しているかどうか判定する（ステップ S 6) 。出力値 Xi〜X₄を全て取得していない場合は、演算部 3は、再度ステップ S 4及び S 5を実行する。

一方、出力値 X 〜X₄を全て取得している場合は、演算部 3は、補正係数とステップ S 5で取得した出力値ェ〜とを上記式（2) に代入して、各蛍光色素の蛍光強度 Yi Y を算出する（ステップ S 7) 。なお、ステップ S 3において光量補正値が算出されている場合は、光量補正値によって補正した出力値 Xi〜X₄又は行列（a； j ( i = 1 , 2， 3， 4 ; j = 1 , 2， 3， 4) ) の行列要素を上記式（2) に代入する。以上により、蛍光測定処理が終了し、蛍光色素毎の蛍光強度が表示部

4に表示される。このように、本発明の蛍光測定装置及び蛍光測定方法を用いれば、合成値から実際の蛍光強度を分離できるので、従来に比べて正確な蛍光測定を行なうことができる。

次に、図 3を用いて、図 2のステップ S 2で示した補正係数算出処理について説明する。図 3は、図 1に示す蛍光測定装置で行なわれる補正係数算出処理を示すフローチャートである。

補正係数算出処理は、複数の補正用試料を用いて行なわれる。補正用試料は、試料に混合される蛍光色素のうちの一つのみが混合されたものであり、各補正試料には互いに異なる蛍光色素が混合されている。つまり、図 3の例では、表 1で示したように 4種類の蛍光色素が試料に混合されるため、補正用試料も 4種類必要である。

また、補正係数算出処理は、上記式（2) を展開して得られる下記の式（3) 〜（6) を用いて行なわれる。

a ₁₁Y₁ + a ₁₂Y₂ + a ₁₃Y₃ + a ₁₄Y₄ = X₁ (3)

a₂₁Y₁ + a₂₂Y₂+a₂₃Y₃ + a ₂₄Y₄ = X₂ (4) a₄₁ Y ₁ + a₄₂Y₂ + a₄₃Y₃ + a₄₄Y₄ = X₄ (6)

図 3に示すように、最初に、演算部 3は、補正用試料に各発光素子から光を照射し（ステップ S 1 1) 、更に、このとき受光ユニット 2が出力した電気信号の出力値を取得する（ステップ S 1 2) 。次いで、演算部 3は、この取得した出力値を上記式（3) 〜（6) に代入する（ステップ S 1 3 ) 。

次に、演算部 3は、全ての補正用試料について出力値を取得できたかどうか判定する（ステップ S 14) 。全ての補正用試料について出力値が取得できていない場合は、再度ステップ S 1 1〜S 1 3を実行する。全ての補正用試料について出力値が取得できている場合は、ステップ S 1 5を実行する。

ステップ S 1 1〜S 1 3を具体的に説明する。演算部 3は、先ず、 1 番の蛍光色素（FAM) のみが混合された補正用試料に、光源ユニット 1によって 1番〜 4番の蛍光色素の励起波長の光を照射する。このとき出力された電気信号の出力値を蛍光色素の名称に対応させて F 1〜F 4 とすると、演算部 3は、上記式（3) 〜（6) のェ〜に、出力値 F 1〜F 4を代入する。また、この場合、補正用試料には 1番の蛍光色素しか混合されていないので、上記式（3 ) 〜（6) において Y₂ = Y₃ = Υ₄= 0 (ゼロ）となる。よって、下記式（7 ) 〜（ 1 0 ) が得られる。 a _x！ Y_X = F 1 ( 7 )

Ά _{2 1} Ύ = ¥ 2 ( 8)

a 3 ! Y_X = F 3 ( 9)

a ₄₁Y₁ = F 4 ( 1 0)

同様に、演算部 3は、 2番の蛍光色素（J OE) のみが混合された補正用試料、 3番の蛍光色素（TAMRA) のみが混合された補正用試料、及び 4番の蛍光色素（ROX) のみが混合された補正用試料それぞれについても、光源ュニット 1によって 1番〜 4番の蛍光色素の励起波長の光を照射し、出力される電気信号の出力値を取得し、取得した出力値を式（3 ) 〜（6 ) に代入する。なお、これらの場合の出力値を、それぞれ J 1〜 J 4、 T 1〜T 4、 R 1〜R 4とすると、下記式（ 1 1 ) 〜 ( 2 2 ) が得られる。

a _{1 2}Y₂= J 1 ( 1 1 )

a ₂₂ Y₂= J 2 ( 1 2 )

a ₃₂ Υ₂= J 3 ( 1 3)

a ₄₂Y₂= J 4 ( 1 4) a ₁₃ Y₃ = T 1 (1 5)

a ₂₃ Y₃ = T 2 (1 6)

3₃Y₃ = T 3 (1 7)

a₄₃Y₃ = T4 (1 8)

a ₁₄Y₄ = R 1 (1 9)

a ₂₄Y₄ = R 2 (20)

a ₃₄Y₄ = R 3 (2 1)

a₄₄Y₄ = R4 (22)

次に、ステップ S I 5において、演算部 3は、ステップ S I 3で得られた上記式（7) 〜（22) を用いて、上記式（2) を満たす行列（a u ( i = 1 , 2, 3, 4 ； j = 1 , 2， 3， 4) ) を補正係数として算出する。

具体的には、演算部 3は、 a _{11 =} a ₂₂= a ₃₃= a₄₄= 1に設定して補正係数の算出を行なう。例えば、： a ₁₂ ： a ₁₃ ： a ₁₄の比は、使用される蛍光色素によって決定されるため、演算部 3は、 a₁₂= J l ZF 1、 a₁₃ = T 1/F 1、 a ₁₄ = R 1 /F 1と算出する。

同様に、演算部 3は、 a ₂₁ = F 2/J 2、 a₂₃ = T 2/ J 2, a ₂₄ =R 2/ J 2と算出する。また、演算部 3は、 a₃₁ = F 3/T 3、 a ₃ ₂= J 3/T 3、 a₃₄ = R 3ZT 3と算出する。更に、演算部は、 a₄₁ =F 4ZR4、 a₄₂= J 4/R4、 a ₄₃ = T 4 Z R 4と算出する。

以上により補正係数算出処理は終了する。なお、本発明において、補正係数算出処理は、蛍光測定装置の製品出荷前に行なうこともできる。この場合は、製品の出荷段階において、予め蛍光測定装置のメモリに補正係数を格納させた態様とするのが好ましい。また、この場合は、図 2 で示した蛍光測定処理において、ステップ S 1及び S 2は実行しなくて良い。次に、図 2のステップ S 3で示した光量に基づく出力値の補正について図 4を用いて説明する。図 4は、図 1に示す蛍光測定装置で行なわれる光量補正値算出処理を示すフローチャートである。

図 4に示す光量補正値算出処理は、発光素子 1 1 a〜 l I dの光量が、経時変化や環境変化によって変動すると、： a _{2 1} ： a _{3 1} ： a ₄₁の比、 ^a i 2 ^{: a} 2 2 ^{: a} 3 2 ^{: a} 42の比、 ^a i 3 : ^a 2 3 ^{: a} 3 3 ^{: a} 43の比、及び a ₁₄ ： a ₂₄ ： a 34 ： a ₄₄の比が影響を受け、正確な蛍光輝度が算出できなくなるのを防止するために行なわれる。

具体的には、図 4に示すように、演算部 3は、最初に、補正係数を決定した時の発光素子 1 1 a、 l i b, 1 1 c及び 1 1 dの光量比を 1 ： 1 : 1 : 1 (基準値）とした場合における現在の発光素子の光量比を、光量モニタからの信号に基づいて測定する（ステップ S 2 1 ) 。

次に、演算部 3は、算出した光量比が 1 : 1 : 1 : 1から変動しているかどうかを判定する（ステップ S 2 2 ) 。変動していない場合は、演算部 3は処理を終了する。一方、変動している場合は、変動幅に応じた光量補正値を算出する (ステップ S 2 3 ) 。

例えば、発光素子 1 1 a、 l i b, 1 1 c及び 1 1 dの光量比が 1 ： 2 : 3 : 4になっているとする。このとき、光量比を基準値に戻すには、各発光素子の光量をそれぞれ（1 / 1 ) 倍、（1 Z 2 ) 倍、 ( 1 /3 ) 倍、 ( 1 /4) 倍とする必要があるので、光量補正値は（ 1 1 ) 、 ( 1 /2 ) 、 ( 1 / 3 ) 、 ( 1 /4) となる。なお、受光素子 1 4 a〜 1 4 dの感度が低い場合は、光量の変動が蛍光強度に与える影響は小さくなり、感度が高い場合は、その逆となる。よって、光量補正値は、受光素子 1 4 a〜 1 4 dの感度を考慮して決定するのが好ましいと言える。よって、演算部 3は、図 2のステップ S 7において、上記式（2) の X x Χ₂、 Χ₃及び Χ₄の代わりに、 ( 1 / 1 ) Xい ( 1 / 2 ) Χ₂、 ( 1/3) X₃、及び（ 1 Z4) X₄を代入して、蛍光強度丫ェ〜丫を算出する。または、演算部 3は、上記式（2) を満たす行列（_{a i j} ( i = 1 , 2, 3, 4 ； j = 1 , 2, 3， 4) ) の行列要素 a iい a _{i 2}, a _{i 3}、及び a _{i 4}の代わりに、（ lZD a u (l/2) a _{i 2}、 ( 1 Z3) a _{i 3}、 ( 1/4) a _{i 4}を代入して、蛍光強度 Yi Y を算出する。

このように、図 1に示す蛍光測定装置及び蛍光測定方法によれば、発光素子の光量が変動した場合であっても、発光素子の光量を補正して蛍光強度を算出できるので、蛍光測定の精度をよりいっそう向上させることができる。

なお、図 1に示す蛍光測定装置は、光源ュニット 1及び受光ュニット 2と接続されたコンピュータに、図 2に示したステップ S 1〜S 7を具現化するプログラムをインストールし、このプログラムを実行することによって実現することができる。この場合、コンピュータの C P U (central processing unit) は演算部 3として機能する。

上記の実施の形態では、蛍光測定装置及び蛍光測定方法を例に挙げて説明している。但し、本発明はこの例に限定されるものではなく、吸光度測定や反射率測定を用いた測定装置や測定方法であっても良い。つまり、本発明によれば、吸収波長又は反射波長の異なる複数の色素が試料に混合されている場合であっても、上記に示したと同様にして補正係数を算出でき、透過光又は散乱光の強度を色素毎に算出できる。また、この算出された透過光の強度から吸光度を算出でき、散乱光の強度から反射率を算出できる。

産業上の利用可能性

以上のように本発明の測定装置及び蛍光測定方法によれば、試料に複数の色素、例えば蛍光色素が混合されている場合であっても、得られた透過光又は放射光（蛍光）の強度から色素毎の実際の強度を分離することができる。このため、本発明の測定装置及び蛍光測定方法を用いることで、従来よりも更に正確な成分分析や遺伝子診断等を行なうことが可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 複数の色素が混合された試料に波長の異なる光を照射したときの透過光又は放射光の強度を前記色素毎に測定する測定装置であって、波長の異なる光を前記試料に照射可能な光源ユニットと、前記透過光又は前記放射光を受光し、受光した光の強度に応じた電気信号を出力する受光ユニットと、演算部とを有し、

前記演算部は、

前記複数の色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ユニットによつて波長の異なる光を照射したときに前記受光ュニットが出力する電気信号に基づいて算出される補正係数を用いて、前記透過光又は前記放射光の強度を前記色素毎に算出する測定装置。

2 . 前記試料に、前記色素として励起波長の異なる複数の蛍光色素が混合されており、

前記受光ユニットが、前記蛍光色素による蛍光を受光し、受光した前記蛍光の蛍光強度に応じた電気信号を出力し、

前記演算部が、前記複数の蛍光色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された蛍光色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ュニッ卜によって前記複数の蛍光色素それぞれの励起波長の光を照射したときに前記受光ュニッ卜が出力する電気信号に基づいて算出される補正係数を用いて、前記試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を算出する請求,の範囲 1記載の測定装置。

3 . 前記試料に混合される前記複数の蛍光色素に 1〜nの番号を付し、前記光源ユニットが k ( 1 , 2， ··· , n ) 番の蛍光色素の励起波長の光を前記試料に照射したときに前記受光ュニットが出力する前記電気信号の出力値を X_k、前記 k番の蛍光色素の蛍光強度を Y_kとしたときに、前記補正係数が下記式（23) を満たす行列（_{a i j} ( i = l， 2 "', n ; j = 1， 2 , -, η) ) であり、

前記演算部は、下記式（23) に前記行列（_{a i j}) と前記出力値ェ〜X_nとを代入して、前記蛍光強度を前記蛍光色素毎の蛍光強度として算出する請求の範囲 2記載の測定装置。

4. 前記光源ュニットが照射する光の光量を検出して前記演算部に信号を出力する光量モニタを有し、

前記演算部は、前記光量モニタが出力した信号に基づいて、前記出力値 X i〜X_n又は行列要素 a i i〜 a _nnを補正する請求の範囲 3記載の測定装置。

5. 波長の異なる光を照射可能な光源ユニットと、蛍光色素による蛍光を受光し、受光した前記蛍光の蛍光強度に応じた電気信号を出力する受光ユニットとを用いて、励起波長の異なる複数の蛍光色素が混合した試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を測定する蛍光測定方法であって、

補正係数を用いて、前記試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を算出する工程を有し、

前記補正係数は、前記複数の蛍光色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された蛍光色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ュニットによって前記複数の蛍光色素それぞれの励起波長の光を照射したときに前記受光ュニットが出力する電気信号に基づいて、算出されたものである蛍光測定方法。

6. 前記試料に混合される前記複数の蛍光色素に 1〜nの番号を付し、前記光源ユニットが k (1， 2， ···, n) 番の蛍光色素の励起波長の光を前記試料に照射したときに前記受光ュニッ卜が出力する前記電気信号の出力値を X_k、前記 k番の蛍光色素の蛍光強度を Y_kとしたときに、前記補正係数が下記式（24) を満たす行列（_{a i j} ( i = 1 , η ; j = 1， 2, ···, n) ) であり、

下記式（24) に前記行列（_{a i j}) と前記出力値 Xi Xnとを代入して、前記蛍光強度丫ェ〜丫。を前記蛍光色素毎の蛍光強度として算出する請求の範囲 5記載の蛍光測定方法。 '

(24)

7. 前記光源ユニットが照射した光の光量に基づいて、前記出力値〜X_n又は行列要素 a i i〜 a _nnを補正する請求の範囲 6記載の蛍光測定方法。

8. 波長の異なる光を照射可能な光源ユニットと、蛍光色素による蛍光を受光し、受光した前記蛍光の蛍光強度に応じた電気信号を出力する受光ュニットとを用いて、励起波長の異なる複数の蛍光色素が混合した試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度をコンピュータに測定させるプログラムであって、

補正係数を用いて、前記試料から放射される蛍光の前記蛍光色素毎の蛍光強度を算出するステップを有し、

前記補正係数は、

前記複数の蛍光色素のいずれか一つが混合され、且つ、混合された蛍光色素が互いに異なる複数の補正用試料それぞれに対して、前記光源ュニッ卜によって前記複数の蛍光色素それぞれの励起波長の光を照射したときに前記受光ユニットが出力する電気信号に基づいて、算出されたものであるプログラム。

9. 前記試料に混合される前記複数の蛍光色素に 1〜nの番号を付し、前記光源ユニットが k (1, 2， ···， n) 番の蛍光色素の励起波長の光を前記試料に照射したときに前記受光ュニットが出力する前記電気信号の出力値を X_k、前記番の蛍光色素の蛍光強度を Y_kとしたときに、前記補正係数が下記式（25) を満たす行列（_{a i j} ( i = 1, 2-, n ； j = 1 , 2 , ···, η) ) であり、

下記式（2 5) に前記行列（a _u) と前記出力値ェ〜。とを代入して、前記蛍光強度丫ェ〜。を前記蛍光色素毎の蛍光強度として算出する請求の範囲 8記載のプログラム。

1 o. 前記光源ユニットが照射した光の光量に基づいて前記出力値 x_t

〜X_n又は行列要素 a i 〜 a _nnを補正する請求の範囲 9記載のプログラ ' ム。