JPH06317526A - 多波長測光装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】本発明の目的は、フォトマル間の入射蛍光強度
の差がフォトマルのダイナミックレンジから逸脱する場
合にも正確な測定値を得ることのできる多波長測光装置
の提供にある。 【構成】被検査体Ｓからの分岐する光分岐素子２１と、
この光分岐素子２１で分岐された光が入射する複数の波
長選択素子２２，２４と、これら各波長選択素子２２，
２４により選択された波長の光強度を夫々検出する複数
の光電変換器２３，２５と、これら各光電変換器２３，
２５の出力に基づいて前記各光電変換器２３，２５の感
度を個々に制御する感度制御手段３２と、この感度制御
手段３２が感度制御した光電変換器２３，２５の出力を
当該光電変換器２３，２５の基準感度での測定値に補正
する補正手段３２，３６とを具備して構成される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、複数の光電変換器を備
えた多波長測光装置に係り、さらに詳しくは光強度に応
じてダイナミックレンジを変更する多波長測光装置に関
する。

【０００２】

【従来の技術】被検査体となる細胞に所定の蛍光試薬を
投与して、その細胞に励起光（波長３４０ｎｍ）を照射
すると、その細胞の蛍光像が図６に示す如く変化する蛍
光スペクトルの光を発することが知られている。この蛍
光スペクトルの２波長間の比は細胞内に含まれるカルシ
ウムイオン濃度に応じた値となる。そこで上記蛍光像を
２波長測光して２波長間の測光値の比を求めることによ
り、細胞内のカルシウムイオン濃度を測定することがで
きる。２波長測光機能を備えた蛍光顕微鏡装置が特開平
２−２８５４２号公報に記載されている。

【０００３】図５は、特開平２−２８５４２号公報に記
載された蛍光顕微鏡装置の概略的な構成を示している。
この蛍光顕微鏡装置は水銀ランプ１の光をＮＤフィルタ
ーユニット２，励起フィルタユニット３及びダイクロイ
ックミラー４を介して試料５に照射する。試料５に所定
の蛍光試薬を投与しておき、波長３４０ｎｍの励起光を
励起フィルタユニット３で選択しておけば、励起された
試料５からカルシウムイオン濃度等に応じて蛍光スペク
トルが図６に示す如く変化する光が発せられる。試料５
からの光はダイクロイックミラー４を通過し吸収フィル
タユニット６を介してＴＶカメラ７に入射する。

【０００４】透過波長が４１０ｎｍ，４６０ｎｍの２つ
の吸収フィルター６ａ，６ｂを吸収フィルタユニット６
に設け、吸収フィルター６ａ，６ｂを所定速度で光路上
に交互に挿入することにより波長４１０ｎｍの蛍光強度
と波長４６０ｎｍの蛍光強度とに応じた信号がＴＶカメ
ラ７から出力される。この２信号の比からカルシウムイ
オン濃度を測定できる。

【０００５】ところで、互いに異なる２波長の蛍光強度
を測定するため、励起光の強度や試料５の状態によって
は、一方の波長の光強度がＴＶカメラ７のダイナミック
レンジに入らなくなる場合もある。

【０００６】そこで上述した蛍光顕微鏡装置では、ＴＶ
カメラ７のダイナミックレンジを有効に使用するため、
ＮＤフィルタユニット２で励起光強度を調整している。
また、２つの光電子増倍管（以下、フォトマルと呼称す
る）を使って２波長測定を行う蛍光顕微鏡装置が特開昭
５５−７４４４８号公報に記載されている。この公開公
報に記載された蛍光顕微鏡装置は、図７に示すように構
成され、光源１０からの光を励起フィルター１１，ダイ
クロイックミラー１２を介して試料１３に入射し、その
試料１３からの蛍光をダイクロイックミラー１２，ハー
フミラー１４を介して光分割プレート１５に入射してい
る。光分割プレート１５で分割された一方の光を吸収フ
ィルター１６を介してフォトマル１７で検出し、もう一
方の光を吸収フィルター１６と異なる透過波長域を持つ
吸収フィルター１８を介してフォトマル１９で検出して
いる。

【０００７】２つのフォトマル１７，１９の各々で検出
された各波長の蛍光強度を成分関係決定装置２０に入力
して互いの強度比をＣＲＴ画面上にプロットし、そのプ
ロット位置（強度比）を検出して標本が目的のものであ
るか否か判断している。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、図５に
示す蛍光顕微鏡装置は、２波長の双方の蛍光強度をＴＶ
カメラ７のダイナミックレンジ内に収めるために励起光
強度をＮＤフィルターを使って調整しているので、光量
損失が大きく、励起光強度が不十分となって良好な蛍光
像が得られなくなる可能性がある。

【０００９】また図７に示す蛍光顕微鏡装置は、励起光
の光量損失はほとんど問題とならないが、各フォトマル
１７，１９の感度が固定となっているため、蛍光強度が
大きすぎてフォトマル１７，１９のダイナミックレンジ
を越えてしまうような場合、又は蛍光強度が小さすぎて
十分な検出精度を得られなくなるような場合には対処で
きないので、そのような時は測定精度が著しく低下する
という問題がある。

【００１０】本発明は以上のような実情に鑑みてなされ
たもので、励起光の光量損失が小さく常に良好な蛍光像
を得ることができると共に、蛍光強度がＴＶカメラやフ
ォトマルのダイナミックレンジから逸脱しているような
場合であっても高い測定精度を実現できる多波長測光装
置を提供することを目的とする。

【００１１】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に本発明の多波長測光装置は、被検査体からの光を複数
に分岐する光分岐素子と、この光分岐素子で分岐された
光の各光路上に配置され各々異なる波長選択特性を持つ
複数の波長選択素子と、これら各波長選択素子により選
択された波長の光強度を夫々検出する複数の光電変換器
と、これら各光電変換器の出力に基づいて前記各光電変
換器の感度を個々に制御する感度制御手段と、この感度
制御手段により感度制御された光電変換器の出力を当該
光電変換器の基準感度での測定値に補正する補正手段と
を具備する構成とした。

【００１２】

【作用】本発明の多波長測光装置では、被検査体からの
光が光分岐素子により複数に分岐され、その分岐された
それぞれの光が対応する各波長選択素子に入射して特定
波長が選択される。そして各波長選択素子で選択された
各波長の光強度が各々対応する光電変換器で検出され
る。各光電変換器の感度は感度制御手段により光電変換
器の出力に基づいて制御される。すなわち、感度制御手
段は光電変換器の出力から入射光強度がダイナミックレ
ンジを越えるほど大きいのか、又は入射光強度が十分な
測定精度が得られないほど小さいのかを判断することが
できる。入射光強度が大きすぎる場合には該当する光電
変換器の感度を下げる。また、入射光強度が小さすぎる
場合には該当する光電変換器の感度を上げる。このよう
な感度制御により入射光強度が光電変換器のダイナミッ
クレンジから逸脱するのを防止することができる。感度
制御手段により感度制御が行われた光電変換器の出力は
補正手段により当該光電変換器の基準感度での測定値に
補正される。

【００１３】

【実施例】以下、本発明の実施例について説明する。図
１は本発明の一実施例に係る多波長測光装置の全体構成
を示している。本実施例の多波長測光装置は、被検査体
としての発光体Ｓからの光をダイクロイックミラー２１
で透過成分と反射成分の２成分に分岐する。ダイクロイ
ックミラー２１の透過光を、その透過光の光路上に配置
された第１の吸収フィルター２２を通して第１のフォト
マル２３に入射する。またダイクロイックミラー２１の
反射光を、その反射光の光路上に配置された第２の吸収
フィルター２４を通して第２のフォトマル２５に入射す
る。第１の吸収フィルター２２は透過成分の有する波長
域のうち特定波長域の光のみを透過する波長選択特性を
有している。第２の吸収フィルター２４は反射成分の有
する波長域のうち第１の吸収フィルター２２と異なる特
定波長域の光のみを透過する波長選択特性を有してい
る。

【００１４】第１のフォトマル２３は電圧制御回路２６
から動作に必要な電圧が印加される。電圧制御回路２６
は後述するＣＰＵから受信する感度指令信号に基づいて
第１のフォトマル２３への印加電圧を制御する。なお第
１のフォトマル２３は、入射光を受光する蛍光面と、そ
の蛍光面から発せられる光電子を増倍する電極群とから
構成されており、電極群両端間の電圧勾配を変化させる
ことにより、光電子増倍率すなわち感度が変化する。同
様に、第２のフォトマル２５は電圧制御回路２７から動
作電圧が印加されており、その印加電圧はＣＰＵからの
感度指令信号に基づいて変化される。

【００１５】第１のフォトマル２３で検出した測光値は
電流／電圧変換回路２８で電圧信号に変換され、その電
圧信号が比較回路２９に入力する。比較回路２９は第１
のフォトマル２３のダイナミックレンジの最大値近傍に
定められたしきい値Ｖｒｅｆが設定されており、入力す
る電圧信号の電圧値がしきい値Ｖｒｅｆを越えるまでは
電圧信号を出力し、電圧信号の電圧値がしきい値Ｖｒｅ
ｆを越えると電圧信号の出力を停止する。この比較回路
２９から出力される電圧信号はＡ／Ｄ変換器３１を介し
てＣＰＵ３２に入力している。

【００１６】また第２のフォトマル２５で検出した測光
値は、電流／電圧変換回路３３で電圧信号に変換され、
その電圧信号が比較回路３４に入力する。比較回路３４
は第２のフォトマル２５のダイナミックレンジの最大値
近傍に定められたしきい値Ｖｒｅｆが設定されており、
入力する電圧信号に対して上記比較回路３５と同様に動
作する。この比較回路３５から出力される電圧信号はＡ
／Ｄ変換器３５を介してＣＰＵ３２に入力している。

【００１７】ＣＰＵ３２は図２及び図３に示すフローチ
ャートに基づいて第１，第２のフォトマル２３，２５の
感度補正を行うと共に、各フォトマル２３，２５で検出
した蛍光強度と感度特性テーブル３６に格納された感度
特性データとを用いて後述する演算を実施する。

【００１８】感度特性テーブル３６には図４に示すよう
な第１，第２のフォトマル２３，２５の感度特性が格納
されている。図４（ａ）の下段のグラフは第１のフォト
マル２３の感度特性を示している。横軸の印加電圧と縦
軸の蛍光強度との比がフォトマル感度となる。図４
（ｂ）の下段のグラフが第２のフォトマル２５の感度特
性を示している。

【００１９】次に、細胞に所定の蛍光試薬を投与し該細
胞に所定波長の励起光を照射し、図６に示すような蛍光
スペクトルの蛍光像を細胞から発光させ、その蛍光像を
２波長測光して細胞内のカルシウムイオン濃度を測定す
る場合の動作について説明する。

【００２０】先ず、第１のフォトマル２３と第２のフォ
トマル２５を同一感度に設定する。そのため、感度特性
テーブル３６に格納された第１のフォトマル２３の感度
特性と第２のフォトマル２５の感度特性とから双方の感
度が同じになる基準電圧ＨＶ１，ＨＶ２を決定する。本
明細書では、この感度を基準感度と呼ぶ。例えば、基準
電圧ＨＶ１，ＨＶ２に応じた基準感度に、第１のフォト
マル２３のダイナミックレンジの中間値と第２のフォト
マル２５のダイナミックレンジの中間値との中間の値を
用いる。

【００２１】第１のフォトマル２３は電圧制御回路２６
により第１の基準電圧ＨＶ１が印加され、第２のフォト
マル２５は電圧制御回路２７により基準電圧ＨＶ２が印
加される。

【００２２】第１，第２のフォトマル２３，２５に基準
電圧ＨＶ１，ＨＶ２が印加されると、各フォトマルへの
入射光の蛍光強度が電圧信号に変換され、その電圧信号
が各比較回路２９，３４に入力する。電圧信号の信号値
で表された各蛍光強度が各々のフォトマルのダイナミッ
クレンジ内であれば、ＣＰＵ３２により各フォトマルの
測光値の比が演算される。

【００２３】ここで、蛍光像の蛍光スペクトルが図６に
示すような波長分布を示すので、第１の吸収フィルター
２２の選択波長を４１０ｎｍに設定し、第２の吸収フィ
ルター２４の選択波長を４６０ｎｍに設定すれば、又は
４１０ｎｍと４８０ｎｍに設定すれば、２波長間の蛍光
強度比を最も効率良く測定できる。

【００２４】ＣＰＵ３２により演算された２波長間の強
度比は、予め用意された２波長間の強度比とカルシウム
イオン濃度との関係（不図示）から、カルシウムイオン
濃度に変換することができる。

【００２５】今、第１の吸収フィルター２２を透過する
選択波長の蛍光強度が、第１のフォトマル２３の検出上
限レベルを越えたとする。この場合、ＣＰＵ３２は図２
に示すフローチャートに基づいて感度補正処理を実施す
る。すなわち、図４（ａ）の上段に示すように、第１の
フォトマル２３に入射する蛍光強度が、第１のフォトマ
ル２３の検出上限レベルを越えると、それまで比較回路
２９からＣＰＵ３２へ出力されていた電圧信号の出力が
停止される。

【００２６】ＣＰＵ３２では比較回路２９からの電圧信
号が入力しなくなったことにより、蛍光強度が第１のフ
ォトマル２３の検出上限レベルを越えたことを検知する
（Ｓ１）。

【００２７】第１のフォトマル２３が基準電圧ＨＶ１で
光量超過となると、比較回路２９から電圧信号が再び出
力されるまで（しきい値Ｖｒｅｆを下回るまで）第１の
フォトマル２３の印加電圧を所定の幅で順次下げていく
（Ｓ２）。電圧信号が比較回路２９からＣＰＵ３２へ再
び入力開始したところ（印加電圧ＨＶ１′）で感度制御
を止め、印加電圧ＨＶ１′での電圧信号から蛍光強度Ｉ
_HV1 ′を測定する（Ｓ３）。

【００２８】第１のフォトマル２３だけ感度が下げられ
ているので、基準感度（基準電圧ＨＶ１）での蛍光強度
Ｉ_HV1 を予測する（Ｓ４）。この予測演算処理を図４
（ａ）の感度特性グラフを使って説明する。

【００２９】同図において、 Ｉ_{HV1 -STD}／ＨＶ１：Ｉ_{HV1 -STD}′／ＨＶ１′ ＝ Ｉ_HV1 ／ＨＶ１：Ｉ_HV1 ′／ＨＶ１′ なる関係が成立するので、下式より蛍光強度Ｉ_HV1 を予
測することができる。

【００３０】 Ｉ_HV1 ＝Ｉ_HV1 ′（Ｉ_{HV1 -STD}／Ｉ_{HV1 -STD}′） この予測した蛍光強度Ｉ_HV1 と第２のフォトマル２５で
検出したＩ_HV2 との比を算出してカルシウムイオン濃度
を求める。

【００３１】第２のフォトマル２５が基準電圧ＨＶ２で
光量超過となった場合には、第２のフォトマル２５の印
加電圧を徐々に下げる。そして比較回路３４に入力する
電圧信号がしきい値Ｖｒｅｆを下回る印加電圧で蛍光強
度を測光し、その測光値から上述した第１のフォトマル
２３と同様の予測演算処理により、基準電圧ＨＶ２での
蛍光強度を予測する。

【００３２】一方、ＣＰＵ３２はＡ／Ｄ変換器３１，３
５の出力から各フォトマルでの蛍光強度が検出下限レベ
ルを下回っていないか否か判断している。Ａ／Ｄ変換器
３１，３５の出力は各フォトマルでの蛍光強度をデジタ
ル値で表しているので、ＣＰＵ３２はＡ／Ｄ変換器３
１，３５からのデジタル値と所定値（検出下限レベルの
蛍光強度に対応したデジタル値）とを比較して、フォト
マルでの蛍光強度が検出下限レベルを下回ったことを判
断する。

【００３３】例えば、図４（ｂ）の上段に示すように、
第２の吸収フィルター２４を透過する選択波長の蛍光強
度が第２のフォトマル２５の検出下限レベルを下回る
と、ＣＰＵ３２が図３に示すフローチャートに基づいて
感度補正処理を実施する。すなわち、第２のフォトマル
２５が基準電圧ＨＶ２で光量不足であると判断すると
（Ｔ１）、電圧制御回路２７を制御して第２のフォトマ
ル２５の印加電圧を徐々に上げていく（Ｔ２）。そして
ＣＰＵ３２に入力する蛍光強度のデジタル値が所定値を
越えたならば、その検出下限レベルを越える印加電圧Ｈ
Ｖ２′での蛍光強度Ｉ_HV2 ′を測定する（Ｔ３）。

【００３４】第２のフォトマル２５だけ感度が上げられ
ているので、基準感度（基準電圧ＨＶ２）での蛍光強度
Ｉ_HV2 を予測する（Ｔ４）。この予測演算処理を図４
（ｂ）の感度特性グラフを使って説明する。

【００３５】同図において、 Ｉ_{HV2 -STD}／ＨＶ２：Ｉ_{HV2 -STD}′／ＨＶ２′ ＝ Ｉ_HV2 ／ＨＶ２：Ｉ_HV2 ′／ＨＶ２′ なる関係が成立するので、下式より蛍光強度Ｉ_HV2 を予
測することができる。

【００３６】 Ｉ_HV2 ＝Ｉ_HV2 ′（Ｉ_{HV2 -STD}／Ｉ_{HV2 -STD}′） この予測した蛍光強度Ｉ_HV2 と第１のフォトマル２３で
検出したＩ_HV1 との比を算出してカルシウムイオン濃度
を求める。

【００３７】また第１のフォトマル２３の蛍光強度が検
出下限レベルを下回った場合も同様に処理される。この
ように本実施例によれば、蛍光強度が各フォトマルのダ
イナミックレンジ内に収まらない場合に、フォトマル２
３，２５の感度を補正して蛍光強度をダイナミックレン
ジ内に収め、感度特性テーブル３６を使って同一感度で
の蛍光強度比を求めるようにしたので、蛍光強度と各フ
ォトマル２３，２５のダイナミックレンジとの関係に制
限されることなく、幅広い蛍光強度に対して常に高い測
定精度を実現することができる。

【００３８】また光路中にＮＤフィルター等の光量調整
素子を挿入しなくてもダイナミックレンジを適合させる
ことができるので、光量損失が小さくなり、常に良好な
観察を行うことができるものとなる。

【００３９】なお、上記実施例では蛍光標本の蛍光像を
２波長測光する場合について説明したが、蛍光標本以外
の被検査体の検査にも適用することができる。例えば、
結晶基板の不純物を分析する不純物分析装置に用いるこ
とができる。

【００４０】公知の不純物分析装置では、Ａｒレーザの
所定波長の発振光で被検査体を光励起し、光励起された
被検査体から放出される自由励起子光（ＦＥ線）と束縛
励起子光（ＢＥ線）とからなるフォトルミネッセンス光
（ＰＬ光）を分光器で分光し、その分光スペクトルにお
けるＦＥ線とＢＥ線の比から不純物を特定している。

【００４１】このような不純物分析装置に上述した実施
例の多波長測光装置を応用すれば、上述した実施例の効
果を不純物分析装置でも得ることができる。すなわち、
第１の吸収フィルター２２及び第１のフォトマル２３と
第２の吸収フィルター２４及び第２のフォトマル２５
で、ＦＥ線とＢＥ線の強度をそれぞれ測定し、両者の比
をＣＰＵ３２で演算するように構成する。

【００４２】このように構成した不純物分析装置によれ
ば、分光器を用いることなく不純物分析装置を構成する
ことができる。また本発明は２波長測光に限定されるも
のではなく３波長以上の測光にも適用できる。

【００４３】

【発明の効果】以上詳記したように本発明によれば、励
起光の光量損失が小さく常に良好な蛍光像を得ることが
できると共に、蛍光強度がＴＶカメラのダイナミックレ
ンジやフォトマルのダイナミックレンジから逸脱してい
るような場合であっても高い測定精度を実現できる多波
長測光装置を提供できる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例に係る多波長測光装置の全体
構成図である。

【図２】図１に示す多波長測光装置における光量超過時
の動作説明図である。

【図３】図１に示す多波長測光装置における光量不足時
の動作説明図である。

【図４】図１に示す多波長測光装置に備えられた感度特
性テーブルに記憶された感度特性を示す図である。

【図５】従来の蛍光顕微鏡の構成図である。

【図６】蛍光標本が発する光の蛍光強度と波長との関係
を示す図である。

【図７】従来の他の蛍光顕微鏡の構成図である。

【符号の説明】

２１…ダイクロイックミラー、２２…第１の吸収フィル
ター、２３…第１のフォトマル、２４…第２の吸収フィ
ルター、２５…第２のフォトマル、２６，２７…電圧制
御回路、２９，３４…比較回路、３２…ＣＰＵ、３６…
感度特性テーブル。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検査体からの光を複数に分岐する光分
   岐素子と、この光分岐素子で分岐された光の各光路上に
   配置され各々異なる波長選択特性を持つ複数の波長選択
   素子と、これら各波長選択素子により選択された波長の
   光強度を夫々検出する複数の光電変換器と、これら各光
   電変換器の出力に基づいて前記各光電変換器の感度を個
   々に制御する感度制御手段と、この感度制御手段が感度
   制御した光電変換器の出力を当該光電変換器の基準感度
   での測定値に補正する補正手段とを具備したことを特徴
   とする多波長測光装置。