JP2015508494A - マイクロ流体システムにおける生物学的試料の高解像度、瞬時広ダイナミックレンジ、多色発光検出のためのシステムおよび方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、マイクロ流体分析器／器具および方法のための高分解能、広ダイナミックレンジ、多色検出プラットフォームを提供する。検出プラットフォームは、細胞または生物学的試料からの発光の検出のために、複数の高利得半導体光学センサを使用する。これらのセンサからのデジタル化された出力は、各色に対する所定のアルゴリズムを使用して、信号処理ユニットにおいて組み合わせられ、重み付けされ、これらの高利得半導体光学センサの各々における分解能を最適化する一方、検出プラットフォームのダイナミックレンジを拡張させる。

Description

本発明は、概して、広ダイナミックレンジにわたって、細胞または生物学的試料からの発光を検出するための高分解能検出システムおよび方法を備えるマイクロ流体プラットフォームに関する。

試料から放出および散乱される光は、その細胞または生物学的内容物を決定するために、広く使用されている。例えば、免疫学、生化学、および血液学における様々なアッセイのために、高分解能で、瞬時に、生物学的試料の広光学検出範囲の分析を可能にする多色検出システムを有することが望ましい。多色検出プラットフォームにおける多センサ出力を組み合わせる事前に定義されたアルゴリズムは、エンドユーザに、詳細な技術の知識の必要なく、最小限の相互作用を伴ってこれらのアッセイを実行し、拡張されたダイナミックレンジにわたってそれを高分解能でそれを分析する能力を提供する。

光検出器は、何らかの形態の発光によって刺激される場合に被試験試料からのこの光を検出および定量化するために必要とされる。フォトダイオード、フォトダイオードのアレイ、ＣＣＤ、および他の固体センサが、この光を定量化するために使用されることができる。しかしながら、光電子増倍管（ＰＭＴ）が、そのような光成分を検出するための現在最適な光検出器である。これは、その下端（ｌｏｗ−ｅｎｄ）感度と、その内部利得構造（＞１０ｅ６）によってＰＭＴのダイナミックレンジにわたって分解する能力に起因する。

しかしながら、ＰＭＴは、高価であって、超高電圧動作を必要とし、そのサイズのため診療現場用診断器具および環境に好適ではなく、複雑かつ高価な光学配列を必要とし、ＰＭＴベースの器具では、特殊かつ高価な保守を必要とするという多数の問題が存在する。ＰＭＴの実践的な光学ダイナミックレンジは、典型的に、３ディケード（ｔｈｒｅｅ ｄｅｃａｄｅ）であって、したがって、試料から放出または散乱される光を定量化するための感度のその光レンジを調節することは、バイアス電圧が、各特定の器具の使用において、訓練された熟練したオペレータによって調節されることを必要とする。

アバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）、ガイガーモードアバランシェフォトダイオード、およびこれらのガイガーモード検出器のアレイ（シリコン光電子増倍管、または省略してＳｉＰＭと称される）等の高利得半導体光学センサにおける近年の進歩により、それらが、そのような分析器において、ＰＭＴに取って代わりつつある。例えば、本発明の出願人に譲渡され、参照によって本明細書に援用される欧州特許出願公開第２２９３０３２号Ａ１（特許文献１）は、そのような前述の問題を解決するために、ＳｉＰＭおよび他の進歩を使用する統合型サイトメトリセンサシステムについて説明している。主要な利点は、より低いコストおよび小さいサイズ、より低い電圧動作、より高速の起動時間、増加した半導体統合（ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）のための範囲、およびより少ない保守要件に関する。これらの進歩は、臨床フローサイトメトリのゴールドスタンダードな基準方法等の高度な中心的実験技法を、様々な感染疾患、慢性および急性疾患、ウイルスおよび血液の病気についての患者の血液のスクリーニングのための分散型診療現場環境にもたらす可能性を広げる。

ＰＭＴと同様に、ＡＰＤおよびＳｉＰＭのような内部利得構造を含む固体センサは、その感度領域が、その動作電圧を改変することによって、被試験試料のために選択されることを可能にする。これは、その降伏電圧に関して、その電圧バイアスを設定することによって、ある程度制御される。

バイアス電圧を降伏電圧よりも高く設定する（ＳｉＰＭをガイガーモードにする）ことによって、これらの高利得半導体光学センサは、より暗い光を検出するが、明光（ｂｒｉｇｈｔ ｌｉｇｈｔ）の存在下では、容易に飽和し得る。バイアス電圧を降伏電圧に向かって、またはそれを下回って低下させる（ＳｉＰＭをその線形動作モードにする）ことによって、より明るい光が、飽和が生じる前に検出されることができるが、固体センサは、結果として、より暗い光にあまり敏感ではなくなる。

高利得半導体光学センサのバイアスを低下させることは、そのダイナミックレンジを拡張し、分解能を減少させることを犠牲にして、より明るい光の検出を可能にする。これは、バイアス電圧の減少に伴うセンサの内部利得の減少と、その結果としての光学センサの出力光電流および感度の減少のためである。分解能とダイナミックレンジとの間のこの妥協は、類似するが別個の高光レベル強度を有する生物学的試料または細胞間で分解するために、異なるバイアスレベルでバイアスがかけられた２つまたはそれよりも多くのセンサを使用する光学システムの能力を制限し、それによって、システムのレンジおよび／または分解能を制限する。欧州特許出願公開第２２９３０３２号Ａ１（特許文献１）は、ＳｉＰＭ等の高利得半導体光学センサに基づく統合型多色サイトメトリセンサにおける広ダイナミックレンジ動作のために、センサのバイアス電圧を調節するそのような方法を使用する。この方法に関する問題は、バイアスの減少がシステムの分解能を最小限にすることである。

多センサアプローチが光学検出システムのダイナミックレンジを拡張するために使用されるさらなるシステムは、蛍光を異なる強度を有する複数の経路にわたり複数のセンサ／チャネルに分割することによるそのダイナミックレンジの拡張について概説する米国特許出願公開第２００５／０１５１９６４号（特許文献２）に開示されている。次いで、どのチャネルがその線形レンジにおいて動作しているかが決定され、出力信号が、事後処理技法を使用して、光の強度に従って調節される。

米国特許第５４９１５４８号（特許文献３）は、同様に、２つの光学センサから広ダイナミックレンジ出力を生成し、ある割合の光が第１のセンサに分割され、残りは第２のセンサに伝達され、出力は、デジタル的に組み合わせられ、コンポジット信号を生成する。しかしながら、本発明は、２つの異なるタイプのセンサを使用して、光を検出する。加えて、スイッチの使用は、これらのセンサのうちの一方からのデータのみが１度に使用可能であることを確実にする。

米国特許第６３５５９２１号Ｂ１（特許文献４）は、他の先行技術におけるように、複数のＰＭＴからの出力信号を組み合わせ、ダイナミックを増加させる方法について説明している。また、各ＰＭＴのダイナミックレンジは、個々に、制御回路を使用して、低光レベル検出回路からの出力と、必要に応じて、類似の明光レベル検出回路からの出力とを組み合わせることによって、増加させられることができる。欧州特許出願公開第１９２８１６７号Ａ１（特許文献５）は、同様に、複数の検出器を使用し、標的化された様式において、信号処理ユニットを使用してそのパラメータを調節することを伴う。１つの検出器は、予期される最大レベルの電磁放射についてのダイナミックレンジに調節される一方、他の検出器は、小および中信号レベルについてのより高い信号対雑音比（ＳＮＲ）を得るために、小および中信号レベルについての減少したダイナミックレンジに調節される。これらのシステムは、異なる表面積および活性面積を有する多数の物理的に異なる検出器に依拠し、単一タイプの検出器を使用して機能することはできない。加えて、センサは、単一アレイとして搭載され、ビームスプリッタを使用していない。

本発明の目的は、前述の問題のうちの少なくとも１つを克服するためのシステムおよび方法を提供することである。

欧州特許出願公開第２２９３０３２号Ａ１明細書 米国特許出願公開第２００５／０１５１９６４号明細書 米国特許第５４９１５４８号明細書 米国特許第６３５５９２１号Ｂ１明細書 欧州特許出願公開第１９２８１６７号Ａ１明細書

本発明に従うと、添付の請求項に記載のように、所定のアルゴリズムを使用するＳｉＰＭ等の複数の高利得半導体光学センサの組み合わせを使用して、高分解能を維持する一方、そのダイナミックレンジを拡張する多色検出システムを備えるマイクロ流体プラットフォームが、提供され、方法も、提供される。これらの方法は、システムのダイナミックレンジを、任意の単一の光検出器で達成可能であるものを上回って拡張させる一方、細胞または生物学的試料からの広範囲の光強度の瞬時高分解能検出のための低コストの小型器具を確保する。

要するに、本発明は、ＳｉＰＭ等の高利得半導体光学センサ専用に設計された高分解能、広ダイナミックレンジ、多色およびセンサ検出システムを提供する。これは、ＰＭＴ等の競合高利得光検出器の線形プロファイルと比較した場合の、ＳｉＰＭの非線形内部利得プロファイルのためであり、色ごとに事前に定義されたアルゴリズムが、これらのセンサの高利得領域を選択するために必要とされる。高利得領域が使用され、この半導体ベースのシステムにおいて分解能を維持し、色ごとに、複数のセンサからの出力を組み合わせ、重み付けすることによって、広ダイナミックレンジを提示する。

この多色検出システムは、主に、これらに限定されないが、フローサイトメータおよび遠心マイクロ流体プラットフォーム等のマイクロ流体システムにおける発光検出のために使用されることができる。

本発明は、信号処理ユニットにおける事前に定義されたアルゴリズムを使用して、複数の高利得半導体センサの出力を組み合わせることによって、色の各々について、広ダイナミックレンジを提供しながら、高分解能多色検出システムを提供する。これは、先行技術において行なわれるような、エンドユーザによるセンサバイアス調節の必要性をなくし、特に、ＰＯＣＴおよび臨床研究のための器具の使用を簡略化する。

一実施形態では、マイクロ流体システムにおける多色発光検出システムであって、
マイクロ流体システムにおける細胞または生物学的試料からの発光の検出された色の各々について、光を少なくとも２つの光経路に分割するための手段と、
細胞または生物学的試料から放出された低い光レベルの発光を高分解能で検出するために、発光色成分の各々について、最適な動作電圧または利得でバイアスがかけられるように適合させられた第１の高利得半導体光学センサと、
高利得設定を有する分解能を維持しながら、第２のセンサに入射する光レベルが減衰させられるように、色成分の各々について、より高い光レベルの発光を検出するように適合させられた第２の高利得半導体光学センサと、
信号処理ユニットを使用して、第１および第２の高利得半導体光学センサからの出力を組み合わせ、重み付けすることによって、発色光ごとに処理し、拡張されたダイナミックレンジにわたって、瞬時多色高分解能検出システムを提供するための手段と、
を備える検出システムが、提供される。

任意の特定の着目波長のために、検出システムの光学ダイナミックレンジは、複数の高利得半導体光学センサを使用して、１つまたは複数の点において、発光試料から放出または散乱される光を集光し、光をこれらのセンサに指向することによって、増加させられることができる。色ごとに、これらのセンサの２つまたはそれよりも多くからの同時測定値が、同一の着目試料から収集され、信号処理ユニットにおける事前に定義されたアルゴリズムによって一緒に結合され、色の各々について、広ダイナミックレンジ出力を構築する。各色に対するアルゴリズムは、センサコンビネーションを組み合わせそれに重み付けするアルゴリズム係数が単色線形光源によって決定される初期較正段階で定義される。アルゴリズムは、次いで、色ごとに、信号処理ユニットに適用される。

複数のセンサからのデータを信号処理ユニットにパスするために、発光刺激により高利得半導体光学センサからパスされた光電流は、最初に、トランスインピーダンス増幅器または類似の構成を使用して、増幅され、電圧に変換される。出力は、アナログ／デジタルコンバータを使用してデジタル化され、次いで、信号処理ユニットにパスされ、これらの個々の出力を処理し、色ごとに、コンポジット出力を作り出す。ダイナミックレンジの拡張は、光を複数の高利得半導体光学センサに分割することによって可能であるが、これらの各々に対する利得設定は、各色に対するアルゴリズムを定義する際の事前較正シーケンスの一部として、ダイナミックレンジ全体にわたって、高分解能を維持するように最適化される。

システムの一次センサ（単数または複数）は、高分解能を維持する適切な利得設定を選択することによって、低光強度を検出し、システムの感度を最大限にするように最適化される。さらなるセンサ（単数または複数）が、次いで、より明るい発光レベルを検出するように、類似の高利得設定で使用され、これらのセンサ（単数または複数）に入射する光は、センサの出力を飽和させずに、センサの最適な利得設定の分解能を維持するように減衰させられる。

これは、そのバイアス電圧によって決定されるように、高分解能を提供する最適な利得領域を有するため、ＳｉＰＭのような高利得半導体光学センサにとって、特に重要である。デジタル化され、次いで、事前に定義されたアルゴリズムによって組み合わせられるこれらのセンサからの出力は、着目される広光レンジにわたって、瞬時、高分解能、多色発光検出を提供する。この高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムは、マイクロ流体ベースの器具において事前に構成され、被試験試料の各々について、センサの最適な利得を設定する際のエンドユーザの介入の必要性を軽減する。これは、現在の器具／分析器において必要とされるようないかなるユーザ介入も伴わずに、数ディケードのダイナミックレンジにわたって、生物学的試料の定量化を可能にする。

一実施形態では、集光された発光は、コーティングされたビームスプリッタまたはダイクロイックミラーと、必要に応じて、さらなる光学フィルタとを使用することによって、特定の着目波長に分割される。これらのミラーおよびフィルタは、高利得半導体光学センサおよびさらなる光学構成要素でグループ化され、必要に応じて、フィルタセル（ｆｉｌｔｅｒ ｃｅｌｌ）を作り出す。

一実施形態では、試料から集光された光は、集光光学素子を使用して、単一光経路に指向させられ、２つよりも多くの高利得半導体光学センサに集束される。光電流出力は、これらのセンサからデジタルドメインに変換され、信号処理ユニットにおいて、所定のアルゴリズムを使用して一緒にマージされ、コンポジット出力を生成する。

他の実施形態は、複数の場所または集光点からの試料から集光され、高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するようにマージされる光を示す。

各実施形態における重要な基準は、特に、光バジェットが限定される低光レベル検出システムに対して、検出システムのセンサ（単数または複数）によって集光された光の量を最大限にすることである。

一実施形態では、第１および第２の光学センサは、信号を発生し、色の各々について、広ダイナミックレンジ高分解能信号を生成するための信号処理手段にフィードされるように適合させられる。

一実施形態では、検出システムにおけるセンサは、ＳｉＰＭである。

一実施形態では、１つよりも多くの集光点が使用され、発光試料から放出される光を集光し、色ごとに、高分解能、広ダイナミックレンジ出力を生成する。

一実施形態では、試料から放出される光は、コレクタに結合され、光レベルを減衰させるように適合させられた少なくとも１つのフィルタを通過させられ、色の各々について、該第２の高利得半導体光学センサに送達される。

一実施形態では、コレクタは、試料からの光を集光し、ビームスプリッタに指向させられるように適合させられる。

一実施形態では、コレクタは、レンズシステムを備える。

一実施形態では、ビームスプリッタは、色の各々について、光を該第１および第２の高利得半導体光学センサに送達するための２つよりも多くの出力ポートとともに適合させられる。

一実施形態では、ビームスプリッタは、コーティングされていないミラーを備え、該コーティングされていないミラーは、第１のポートを介して、下端光レベルを検出する第１の高利得半導体光学センサに、最大量の光を送達するように適合させられる一方、試料の明るい光成分は、該第２の高利得半導体光学センサによって、第２のポートにおいて、同時に検出される。

一実施形態では、該第１および第２のポートから送達される光の量は、コーティングされていないミラーの透過率または反射率に依存する。

本発明の別の実施形態では、異なる波長における発光検出のために適合させられた流体試料または非流体試料における特定の生物学的標的を検出するためのシステムであって、
細胞または生物学的試料から放出される低光レベルの発光を検出するために適合させられた最適な動作電圧または利得でバイアスがかけられる第１の光学センサと、
第２のセンサに入射する光レベルが減衰させられるように、より高い光レベルの発光を検出するように適合させられた第２の光学センサと、
を有し、数ディケードのダイナミックレンジにわたる細胞または生物学的試料の処理が、高分解能で達成される、検出システムを備える、システムが、提供される。

一実施形態では、試料から集光された光は、自由空間において、同一の光経路上の色の各々について、２つよりも多くの高利得半導体光学センサに結合される。これらのセンサのうちの１つまたはそれよりも多くは、光経路におけるニュートラルデンシティーフィルタまたは類似物等の光学構成要素を含み、ここで、二次センサ（単数または複数）に到達する光レベルを低減させる。この光経路の減衰区画におけるセンサに、低光レベルを検出する一次センサと類似する電圧バイアスでバイアスをかけることによって、これは、色の各々について、着目ダイナミックレンジ全体にわたって、高分解能を確実にする。減衰構成要素（単数または複数）は、二次センサ（単数または複数）が、この高分解能／利得設定で飽和しないことを確実にする。

一実施形態では、光は、複数の点から集光され、減衰構成要素が取り付けられるかどうかにかかわらず、色ごとに、１つまたはそれよりも多くのセンサに結合されることができる。複数の集光点からの色の各々について、複数のセンサ出力をインタリーブすることが、高分解能を維持しながら、ダイナミックレンジをさらに向上させるために実施される。

一実施形態では、単一点から集光された光は、高利得半導体光学センサのアレイに結合される。中央センサは、特に光ビームがガウス分布を有する場合、集光された光の最大の割合を受け取る。この構成は、試料からの光の大部分を集光するために使用される中央センサと比較して、隣接する二次センサに集光される光レベルを減衰させる役割を果たす。二次センサに集光された光は、この方法を使用して、効果的に減衰させられるため、高バイアス／利得設定が、出力を飽和せずに、検出システムにおいて分解能を維持するように依然として適用されることができる。色ごとのセンサのアレイからの出力は、次いで、処理ユニットにおいて一緒に結合され、システムから高分解能、広ダイナミックレンジ出力を生成する。センサの配列は、光測定に好適であるように最適化されることができ、ここに示される実施形態に限定されない。

一実施形態では、二次高利得半導体光学センサは、主要センサと異なってもよい。これらは、限定されないが、画素密度、活性面積、センササイズ、光子検出効率（ＰＤＥ）、またはスペクトル受光感度を含む１つまたはそれよりも多くの局面において異なってもよい。

一実施形態では、集光された光を高利得半導体光学センサアレイに結合するレンズは、手動でまたは自動的にのいずれかによって、調節可能であってもよい。一実施形態では、色ごとのセンサアレイの隣接する高利得半導体光学センサのうちのいくつかはまた、減衰フィルタを含んでもよい。

一実施形態では、光は、複数の点から集光可能であるが、必要に応じて、減衰フィルタを含む各色場所に１つだけある高利得半導体光学センサから、集光されることができる。

一実施形態では、試料からの光は、減衰フィルタの有無にかかわらず、複数の点から複数の高利得半導体センサアレイに結合され、色ごとに、高分解能、広ダイナミックレンジ出力を生成することができる。

一実施形態では、ビームスプリッタは、試料から集光された光を同時に分割し、それを高利得半導体センサに色の各々について結合するために使用されることができる。ビームスプリッタの分割比が、試料からより高い光出力成分を検出するために使用される二次センサ（単数または複数）への光を減衰させるために使用される。処理ユニットは、同様に、複数の着目波長に対して、これらの高利得半導体センサから、高ダイナミックレンジ、高分解能出力を送達する。

一実施形態では、光は、複数の点から集光され、複数のビームスプリッタに伝達される。

一実施形態では、複数のセンサは、ビームスプリッタの各ポートからの光を検出することができ、また、光減衰構成要素を含むことができる。

さらなる実施形態では、
細胞または生物学的試料から放出される低光レベルの発光を検出するために適合させられた最適な動作電圧または利得でバイアスがかけられる第１の光学センサと、
第２のセンサに入射する光レベルが減衰させられるように、より高い光レベルの発光を検出するように適合させられた第２の光学センサと、
を備え、数ディケードのダイナミックレンジにわたる細胞または生物学的試料の処理が高分解能で達成される、システムが、提供される。

本発明は、添付の図面を参照して、一例としてのみ与えられるその実施形態の以下の説明からより明確に理解される。
図１は、細胞または生物学的試料から集光され、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサを含む波長固有フィルタセルに分布させられる多色発光を示す配列のブロック図を図示する。集光された光は、複数の光経路間で分割され、分解能を維持するために、全センサにおける高利得設定を保ちながら、各着目発光色についてダイナミックレンジを拡張する。 図２は、どのように、図１に説明される第１の発光色に対する広ダイナミックレンジ信号が作成されるか、を図示する。この発光色に対する高利得半導体光学センサからの出力は、アナログ電圧に変換され、次いで、デジタル化される。これらのデジタル信号は、本発明の一実施形態に従い、これらを組み合わせ、重み付けし、高分解能を有する瞬時広ダイナミックレンジ信号を生成する所定のアルゴリズムを含む信号処理ユニットに転送される。 図３は、本発明で説明される多色検出において使用される高利得半導体光学センサと比較して、業界で標準的な高利得センサ光電子増倍管（ＰＭＴ）の利得対バイアス電圧プロファイル間の差異を図示する。 図４は、そのバイアス電圧または利得を低減させ明るい光信号を検出する場合の、本発明に従う高利得半導体光学センサの分解能限界を図示する。 図５は、明るい光信号を検出するためのバイアス電圧（これに伴う分解能限界）を変化させる方法を使用して、あるいはセンサにおける高内部利得を維持しながらビーム分割または光減衰を使用して、理想的高分解能広ダイナミックレンジ信号を構築するための複数の高利得半導体光学センサからの広ダイナミックレンジ信号の再構築を図示する。 図６は、複数の集光点を使用して、この発光を色ごとに複数の高利得半導体光学センサに伝達する本発明の別の実施形態を図示する。同様に、図１の実施形態に説明されるような１つまたはそれよりも多くのセンサにわたって、ビームスプリッタまたは類似物を使用して、光を分割するステップが、ここでも適用される。この実施形態では、ダイナミックレンジは、多色高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するための方法として、複数の集光点をさらに使用して拡張されることができる。 図７は、高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するためのビーム分割方法の代わりに、複数の集光点を使用する本発明の実施形態を図示する。減衰構成要素が、センサのいくつかで使用され、全体を通して高分解能を維持しながらシステムのダイナミックレンジを拡張させる。 図８は、多色高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するための方法として、任意の集光点で各着目スペクトルレンジについて高利得半導体光学センサのアレイを使用する本発明の別の実施形態を図示する。集光された光ビームによって照らされるセンサアレイの面積は、変動させられ得、これらの出力が、色ごとに所定のアルゴリズムで組み合わせられる場合の、所与のセンサアレイのダイナミックレンジを決定する。

図面の詳細な説明
図１は、本発明に提示される多色発光検出システムの基本ブロック図を図示する。ここでは、発光２が、この検出システムが収められるマイクロ流体プラットフォーム（図示せず）における生物学的または細胞試料１から集光される。試料からの発光１は、レンズシステム３を使用して検出システムに伝達される。集光された発光２は、次いで、２つの光経路に沿ってある割合のこの光を方向転換させるビームスプリッタまたはコーティングされていないダイクロイックミラー４に伝達される。各光経路に沿って送られる光の割合は、ビームスプリッタ４の透過率または反射率に依存する。ビームスプリッタ４の分割比は、光の大部分がいずれかの光経路に沿って送られ得るようなものであることができる。光の大部分は、スペクトル敏感なフィルタセル５、１０、および１５に透過されると考える。残りの反射された光は、反射ミラー２３を介して、対応するフィルタセル２４、２９、および３４に送られる。示される各フィルタセルは、必要に応じて、ダイクロイックミラーと帯域通過フィルタとの組み合わせを使用して、波長固有の光を１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサに伝達する。本発明に説明される任意の高利得半導体光学センサシステムでは、スペクトル敏感なフィルタセルの使用の間で、判別するための１からＣ個の発光色が存在することができる。検出された第１の色に対して、光の大部分は、着目波長を反射させ、残りのスペクトルを隣接するフィルタセル１０に透過させるダイクロイックミラー６から成るフィルタセル５を使用して検出される。このフィルタセル５におけるダイクロイックミラー６から反射された光は、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ７および減衰構成要素８を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ９に伝達される。減衰構成要素は、センサにおける高分解能を維持ながら、特定の着目ダイナミックレンジを検出するために、フィルタセルに含まれる。第１の着目色に対するビームスプリッタ４からの残光は、フィルタセル２４によって検出される。同様に、光は、ダイクロイックミラー２５から反射され、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ２６および減衰構成要素２７を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ２８に伝達される。第１の色に対する二次センサ２８は、高利得設定を維持するが、ビームスプリッタ４から生じる光の減少のため、飽和せずに明発光試料を検出することができる。高利得半導体光学センサ９および２８からの出力２０および３９は、次いで、デジタル化され、所定のアルゴリズムを使用してインタリーブされ、この着目スペクトル領域固有の高分解能、広ダイナミックレンジ信号を作り出す（図２の説明参照）。検出システムにおけるＣ個の色のうちの第２の色は、フィルタセル１０および２９を使用して決定される。第１の色からのダイクロイックミラー６および２５から透過された光は、それぞれ、ダイクロイックミラー１１および３０に衝突する。着目スペクトルレンジに対してダイクロイックミラー１１および３０から反射された光は、それぞれ、高利得半導体光学センサ１４および３３に伝達される。これらからの出力２１および４０は、デジタル化され、所定のアルゴリズムを使用してインタリーブされ、第２の着目スペクトル領域固有の高分解能、広ダイナミックレンジ信号を作り出す。帯域通過フィルタ１２および３１ならびに減衰構成要素１３および３２は、必要とされる実施形態では、含まれる。検出システムにおけるＣ番目の発光色は、フィルタセル１５および３４を使用して決定される。それ以前のフィルタセルからのダイクロイックミラーから伝達された光は、各々、ミラー１６および３５に衝突する。着目スペクトルレンジに対してダイクロイックミラー１６および３５から反射された光は、それぞれ、高利得半導体光学センサ１９および３８に伝達される。これらからの出力２２および４１は、デジタル化され、所定のアルゴリズムを使用してインタリーブされ、Ｃ番目の着目スペクトル領域に固有の高分解能、広ダイナミックレンジ信号を作り出す。帯域通過フィルタ１７および３７ならびに減衰構成要素１８および３７は、必要とされる実施形態では、含まれる。関連付けられたフィルタセルを有するさらなるビームスプリッタ４２も、Ｃ個の着目色の各々についてダイナミックレンジを拡張するために追加されることができる。この場合、反射ミラー２３は、ビームスプリッタで置き換えられることができる。

図２は、図１に説明される第１の発光色に対して、どのように広ダイナミックレンジ信号が作成されるかを詳細に図示する。集光された発光２は、同様に、光を２つの経路に分割するビームスプリッタ４に伝達される。同様に、この第１の色に対して、光の大部分は、着目波長を反射させ残りのスペクトルを隣接するフィルタセル（図示せず）に透過させるダイクロイックミラー６から成るフィルタセル５を使用して検出される。このフィルタセル５におけるダイクロイックミラー６から反射された光は、帯域通過フィルタ７および減衰構成要素８を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ９に伝達される。第１の着目色に対するビームスプリッタ４からの残光は、フィルタセル２４によって検出される。同様に、光は、ダイクロイックミラー２５から反射され、帯域通過フィルタ２６および減衰構成要素２７を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ２８に伝達される。センサ構成要素９および２８からの出力２０および３９は各々、アナログフロントエンド（ＡＦＥ）構成要素４３および４７に接続され、トランスインピーダンス増幅器または類似物を使用して、それぞれの光電流２０および３９をアナログ電圧４４および４８に変換する。これらのアナログ信号は、アナログ／デジタルコンバータ（ＡＤＣ）４５および４９を使用いてデジタル化され、これらのデジタル信号４６および５０は、この第１の色に対する所定のアルゴリズムを含む信号処理ユニット５１に伝達される。このアルゴリズムは、着目スペクトルレンジに対して、デジタル出力４６および４９を組み合わせ、重み付けする。これは、この着目色に対する所定の瞬時広ダイナミックレンジ信号５２を生成する。センサ９および２８の高利得設定は、このダイナミックレンジにわたって検出システムにおける高分解能を維持する。

図３は、高利得半導体光学センサと比較した業界で標準的な高利得センサ光電子増倍管（ＰＭＴ）の利得対バイアス電圧プロファイル間の差異を図示する。ＰＭＴ５７は、ＰＭＴバイアス５４の増加に伴って、線形に増加する内部利得５３プロファイルを生成する。ＳｉＰＭ５６等の高利得半導体光学センサに対する内部利得プロファイルは、図５に示されるように、非線形であって、ＳｉＰＭバイアス５５に伴って大きく変動する。利得プロファイルが、線形であって、ＰＭＴと同様の大きさであるＳｉＰＭについての限定された領域５８が存在する。したがって、高利得半導体光学センサを使用して検出システムにおける高分解能を保持するために、センサのバイアスをこの高利得領域５８内となるように事前調整することが重要である。図４および５に実証されるように、このタイプの検出システムにおけるこの高利得領域５８からのずれは、分解能を犠牲にしてダイナミックレンジを増加させ得る。

図４は、そのバイアス電圧または利得を変動させる場合、分解能とダイナミックレンジとの間の妥協が高利得半導体光学センサのために必要とされることを、図示する。これは、利得がそのバイアスを増加させることによってセンサで増加させられ、類似するが異なる光強度の細胞試料間で分解するその能力を向上させるＳｉＰＭ等の内部利得を有する固体センサにとって、特に重要である。

検出システムにおける高分解能は、バイアス電圧を増加させ、かすかに染色された試料から検出された発光をシステムのノイズフロアを上回るように上昇させながら、より明るい着目試料を個々のセンサの線形レンジ内に保つことによって達成可能であることが、理解される。センサにおける分解能を最大限にすることは、このバイアスをこれらの２つの試料間で検出された発光強度がもはや増加しない点まで増加させることを必要とし、これは、本明細書で高分解能と称される。

しかしながら、この分解能５９におけるこの増加は、センサ出力が、より低い光強度でその飽和限界６１に到達するため、個々の高利得半導体光学センサ９についてダイナミックレンジ６０を犠牲にすることになる。分解能５９は、ここでは、光学センサの光電流出力２０、そのアナログ電圧出力４４、またはそのデジタル化された均等物４６に対応する。飽和限界６１は、光学センサの光電流限界に対応する。センサ９の利得またはそのバイアス電圧が、より明るい光成分を検出し、その飽和限界６１に到達しないように減少させされるにつれて、センサの分解能５９は、そのダイナミックレンジ６０が増加しても減少する。したがって、二次センサ（単数または複数）のバイアス電圧を減少させ、細胞または生物学的試料からより明るい光強度を検出することは、システムのダイナミックレンジを拡張させるにもかかわらず、センサ（単数または複数）の分解能を低下させる。この分解能対ダイナミックレンジの妥協に対処するために、本発明は、ビームスプリッタまたはコーティングされていないミラーを使用する複数のセンサへの光強度の分割を使用し、センサの分解能を高利得モードに維持する。

図５はまた、高利得半導体光学センサの分解能対ダイナミックレンジの妥協を図示する。この図は、第１の着目光レンジ６６にわたる単一センサ６３からの出力応答または分解能５９を示す。第２の着目光レンジ６７にわたる二次センサ６４からの出力応答もまた、示される。この場合に発生させられる出力応答６４は、センサのバイアス電圧または利得を減少させ、センサの出力を飽和させずに、このレンジ６７を調べることによって、そのように行なわれる。これらの６３、６４の組み合わせは、これらの２つの光レンジ６６、６７にわたってＮ個の光学センサが使用される場合、Ｎ番目の着目光レンジ６８まで、広ダイナミックレンジ検出システムを生成する。しかしながら、このシステムは、明るい光成分を有する着目試料間の分解に関して制限される。これらの分解能限界を克服するために、さらなる高分解能を有する理想的広ダイナミックレンジ検出システムが、システムの出力６５によって表され、そこでは、光レンジ６７から６８までにおけるセンサに入射する光は、センサの利得を減少させる代わりに、ビームスプリッタ構成要素または類似物を使用して減衰させられる。着目色ごとのシステムの出力６５は、第１の光レンジ６６にわたるセンサ出力６３の組み合わせであって、これは、説明されるように、それに入射する光レベルが減衰させられた二次センサからの出力とインタリーブされる。

広ダイナミックレンジの定義は、２つまたはそれよりも多くのセンサを使用することによって達成される。出力６５は、範囲全体にわたって第１のセンサの最適な分解能力を保ちながら、検出システムにおいて使用されるセンサの数に応じて、ダイナミックレンジを生成することができる。これは、任意の単一のセンサベースのシステムに対するわずか３ディケードのダイナミックレンジに匹敵する。単一センサ１７のいずれかの飽和限界におけるいかなるロールオフも、処理ユニットにおける色ごとに、所定のアルゴリズムによって、事前に決定され、排除される。

図６は、色Ｃ別にＮ個の高利得半導体光学センサからの発光を集光するための複数の集光点Ｍを使用する本発明の別の実施形態を図示する。同様に、図１に説明されるような１つまたはそれよりも多くのセンサにわたってビームスプリッタまたは類似物を使用する光の分割が、マイクロ流体用途において使用するための多色高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するための方法として、ここで適用される。生物学的または細胞試料１から発する発光６９および７０は、レンズシステム３から７１を使用して、１つまたはＭ個の集光点で集光される。３で集光された発光６９に対して、所定の各色に対してインタリーブされた出力は、図１および２の説明で説明されるとおりである。この実施形態では、ダイナミックレンジはさらに、Ｍ個の集光点からのＮ個のセンサによって決定されたダイナミックレンジをここで用いて、これらのＭ個の集光点から集光することによってさらに拡張される。図１および２で説明される検出システムはまた、Ｍ番目の集光点についてレンズシステム７１に接続される検出システム７２の代表であり得る。図５では、ダイナミックレンジ６０は、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサによって１つの集光点から決定され、ここで、図６に関連して、ダイナミックレンジ６０は、必要に応じて、発光色Ｃの各々に対してＭ個の集光点からのＮ個のセンサを表す。色Ｃの各々について、これらのＮ個のセンサの出力は、結果として生じる拡張されたダイナミックレンジで、図２に関して説明されるように同様にインタリーブされる。

図７は、高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するためのビーム分割方法の代わりに、複数の集光点を使用する本発明の実施形態を図示する。生物学的または細胞試料１から発する発光６９から７０は、１つまたはＭ個の集光点で集光される。第１の集光点から集光される光は、レンズシステム３によって行なわれる一方、レンズシステム７１は、Ｍ番目の集光点からの光を集光する。これらの集光点の各々において、各色について集光された発光は、１つまたはそれよりも多くのセンサに伝達される。一次集光レンズシステム３は、Ｃ個の着目色について、発光をフィルタセル５、１０、および１５に伝達する。第１の着目スペクトル領域に対して、光は、着目波長を反射させ残りのスペクトルを隣接するフィルタセル１０に透過させるダイクロイックミラー６から成るフィルタセル５を使用して検出される。ダイクロイックミラー６から反射された光は、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ７および減衰構成要素８を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ９に伝達される。第２の着目スペクトル領域に対して、光は、着目波長を反射させ残りのスペクトルを隣接するフィルタセル１５に透過させるダイクロイックミラー１１から成るフィルタセル１０を使用して検出される。ダイクロイックミラー１１から反射された光は、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ１２および減衰構成要素１３を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ１４に伝達される。Ｃ番目の着目スペクトル領域に対して、光は、残りの着目波長を反射させる反射ミラー１６から成るフィルタセル１５を使用して検出される。ダイクロイックミラー１６から反射された光は、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ１７および減衰構成要素１８を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ１９に伝達される。典型的に、この第１の集光点におけるセンサ１９は、これらのセンサが発光試料１からのいかなる暗い光成分をも検出するために使用されるため、減衰構成要素を使用しない。いくつかの実施形態では、これは、該当しない。減衰構成要素は、したがって、典型的に、残りのＭ個の集光点に接続されたセンサで使用され、その高内部利得領域においてセンサを維持し、Ｃ個の着目色に対する分解能を持続させながら、広ダイナミックレンジを提供する。したがって、Ｍ番目のもの等のさらなる集光点に対して、レンズシステム７１は、同一のＣ個の着目色について、試料１からの発光をフィルタセル２４、２９、および３４に伝達する。Ｍ番目の集光点の第１の着目スペクトル領域に対して、光は、着目波長を反射させ残りのスペクトルを隣接するフィルタセル２９に透過させるダイクロイックミラー２５から成るフィルタセル２４を使用して検出される。ダイクロイックミラー２５から反射された光は、必要に応じて、帯域通過フィルタ２６および減衰構成要素２７を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ２８に伝達される。Ｍ番目の集光点における第２の着目スペクトル領域に対して、光は、着目波長を反射させ残りのスペクトルを隣接するフィルタセル３４に透過させるダイクロイックミラー３０から成るフィルタセル２９を使用して検出される。ダイクロイックミラー３０から反射された光は、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ３１および減衰構成要素３２を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ３３に伝達される。レンズシステム７１のためのＣ番目の着目スペクトル領域に対して、光は、残りの着目波長を反射させる反射ミラー３５から成るフィルタセル３４を使用して検出される。ダイクロイックミラー３５から反射された光は、必要とされる実施形態では、帯域通過フィルタ３６および減衰構成要素３７を介して、１つまたはそれよりも多くの高利得半導体光学センサ３８に伝達される。

色成分の各々について、これらのＮ個のセンサからの光電流出力２０から３９、２１から４０、および２２から４１は、図２の説明で示されるように、デジタル化され、所定のアルゴリズムを使用してインタリーブされ、高分解能、広ダイナミックレンジ信号を作り出す。

図８は、多色高分解能、広ダイナミックレンジ検出システムを生成するための方法として、任意の集光点において着目スペクトルレンジの各々について高利得半導体光学センサのアレイを使用する本発明の別の実施形態を図示する。生物学的または細胞試料１から発する発光６９から７０は、１つまたはＭ個の集光点で集光され、主要７３および二次７４の高利得半導体光学センサのアレイに集束させられる。主要センサ７３は、最大量の集光された発光を受け取るように、位置付けられ、かつ構成される。二次センサ７４は、主要センサ７３によって集光されなかった光を受け取るように、位置付けられる。主要センサ７３は、最高の光子集光性能を有するべきであって、暗いレベルの発光を測定するために使用される。二次センサは、より明るいレベルの発光のための主要測定システムとなるように設計される。集光された発光は、センサアレイにわたって分散される。集光された発光によって照明される面積は、点線領域７５および７６によって指し示される。アレイは、主要センサが領域７６によって示されるように集光された発光の全部または大部分を受け取るように、構成されてもよい。また、発光のより大きな部分が、照明領域７５を使用して、二次センサ７４にわたって分散されるように構成されてもよい。ビームサイズは、他の実施形態において論じられるように出力が所定のアルゴリズムを使用して組み合わせられ、重み付けされる場合、最終的に、色ごとに各センサアレイと関連付けられたダイナミックレンジを決定する。照明領域は、理想的には、センサアレイの形状に一致し、集光される光の量を最適化するべきである。しかしながら、本実施形態では、ガウスビームが、例証目的のために使用される。図１〜２、６〜７のフィルタセルにおいて使用されるように、この場合、レンズシステム等の減衰構成要素は、照明スポットサイズ７５および７６を調節する。そのようなスポットサイズ調節を達成するために、レンズシステムは、センサアレイに対して移動させられることができるか、または別様に、アレイは、レンズシステムに対して移動させられる。

本発明は、ポータブル診療現場分析器を含む複数のマイクロ流体分析器具に組み込み可能であることが、理解される。本発明は、本明細書に提示されるそのような器具の様々な実施形態を可能にする。そのような器具として、例えば、免疫アッセイ分析器、臨床血液学分析器、フローおよび走査型サイトメータ、蛍光光度計、および化学分析器が挙げられるが、これらに限定されない。特定の生物学的標的は、マイクロ流体プラットフォームにあることができ、そこで、高分解能を維持しながらの広光レンジにわたる異なる波長における発光検出が、本発明によって達成されることができる。

本発明は、前述の実施形態に限定されず、構造および詳細の両方において変動し得る。

Claims (12)

1. マイクロ流体システムにおける多色発光検出システムであって、
   前記マイクロ流体システムにおける細胞試料または生物学的試料からの発光の検出された色の各々について、光を少なくとも２つの光経路に分割するための手段と、
   前記細胞試料または生物学的試料から放出された低光レベルの発光を高分解能で検出するために、発光色成分の各々について、最適な動作電圧または利得でバイアスがかけられるように適合させられた第１の高利得半導体光学センサと、
   色成分の各々についてより高い光レベルの発光を検出するように適合させられた第２の高利得半導体光学センサであって、高利得設定を有する分解能を維持しながら、前記第２のセンサに入射する光レベルが減衰させられる、第２の高利得半導体光学センサと、
   信号処理ユニットを使用して、前記第１の高利得半導体光学センサおよび第２の高利得半導体光学センサからの出力を組み合わせ、重み付けすることによって発色光ごとに処理し、拡張されたダイナミックレンジにわたって瞬時多色高分解能検出システムを提供するための手段と
   を備える、検出システム。
2. 前記高利得半導体光学センサは、ＳｉＰＭセンサから成る、請求項１に記載の検出システム。
3. コーティングされたビームスプリッタ／ダイクロイックミラーおよび少なくとも１つの光学フィルタを使用して、前記集光された発光を特定の着目波長に分割するための手段を備える、請求項１または２に記載の検出システム。
4. 各色について、前記試料から集光された光を分割し、それを前記高利得半導体センサに結合するために適合させられたビームスプリッタを備え、前記ビームスプリッタの分割比は、前記第２のセンサへの光を減衰させるために使用され、前記試料からより高い光出力成分を検出するために使用される、請求項１に記載の検出システム。
5. １つよりも多くの光学検出点が、前記放出される試料からの光を集光することにより色ごとに広ダイナミックレンジにわたって瞬時高分解能信号を生成するために、使用される、前記請求項のいずれかに記載の検出システム。
6. 前記試料から放出される光は、コレクタに結合され、少なくとも１つの光学構成要素を通過させられることにより、前記光レベルを減衰させ、前記第２の光学センサに送達される、前記請求項のいずれかに記載の検出システム。
7. 前記試料からの光を集光し、各フィルタセルに通過させられる前に、ビームスプリッタへ指向させられるように適合させられたコレクタを備える、前記請求項のいずれかに記載の検出システム。
8. 前記コレクタは、レンズシステムを備える、請求項６に記載の検出システム。
9. 前記ビームスプリッタは、光を各フィルタセルに色ごとに送達するための２つまたはそれよりも多くの出力ポートとともに適合させられる、請求項６または７に記載の検出システム。
10. 前記ビームスプリッタは、コーティングされていないミラーを備え、前記ミラーは、第１のポートを介して、下端光レベルを検出する前記第１の高利得半導体光学センサに最大量の光を送達するように適合させられる一方、前記試料の明るい光成分は、前記第２のセンサによって前記第２のポートで残光を使用して同時に検出される、請求項７に記載の検出システム。
11. 前記第１のポートおよび第２のポートから送達される光の量は、前記コーティングされていないビームスプリッタの透過率または反射率に依存する、請求項９に記載の検出システム。
12. マイクロ流体システムにおける多色発光検出の方法であって、
    前記マイクロ流体システムにおける細胞試料または生物学的試料からの発光の検出された色の各々について、光を少なくとも２つの光経路に分割するステップと、
    前記細胞試料または生物学的試料から放出される低光レベルの発光を高分解能で検出するために、発光色成分の各々について最適な動作電圧または利得で第１の高利得半導体光学センサにバイアスをかけるステップと、
    色成分の各々についてより高い光レベルの発光を検出するように適合させられた第２の高利得半導体光学センサにバイアスをかけるステップであって、高利得設定を有する分解能を維持しながら、前記第２のセンサに入射する光レベルが減衰させられる、ステップと、
    信号処理ユニットを使用して前記第１の高利得半導体光学センサおよび第２の高利得半導体光学センサからの出力を組み合わせ、重み付けすることによって発光色ごとに処理し、拡張されたダイナミックレンジにわたって瞬時多色高分解能検出システムを提供するステップと
    を含む方法。

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