WO2004038018A1 - 分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 - Google Patents

分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 Download PDF

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WO2004038018A1
WO2004038018A1 PCT/JP2003/013420 JP0313420W WO2004038018A1 WO 2004038018 A1 WO2004038018 A1 WO 2004038018A1 JP 0313420 W JP0313420 W JP 0313420W WO 2004038018 A1 WO2004038018 A1 WO 2004038018A1
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WO
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cells
polypeptide
cell
acid sequence
sequence
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PCT/JP2003/013420
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French (fr)
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Yasuko Minaki
Yuichi Ono
Yoshimasa Sakamoto
Eri Mizuhara
Tomoya Nakatani
Yoshimi Takai
Original Assignee
Eisai Co., Ltd.
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Definitions

  • the present invention relates to a novel gene 65B13 expressed in dopamine-producing neurons after mitotic arrest. By detecting the expression of the gene, dopaminergic neuron progenitor cells used in the transplantation therapy for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease (PD) can be efficiently separated.
  • PD Parkinson's disease
  • Parkinson's disease is a neurodegenerative disease of the extrapyramidal system caused by specific loss of dopaminergic neurons in the midbrain substantia nigra (HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE, Volume 2, Edition 23). , Isselbacer et aL, McGraw-Hill Inc., NY (1994) pp.227 5-7).
  • L-D0PA (3,4-dihydroxyphenylalanine) is orally administered to compensate for the decrease in the amount of dopamine produced, but the effect is not good. It has been known.
  • neuronal progenitor cells may differentiate into heterogeneous cell populations.
  • Parkinson's disease it is necessary to selectively transplant dopamine-producing diaurones among catecholamine-containing diaurones.
  • transplanted cells that have been proposed for use in the treatment of Parkinson's disease include striatum (Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 6: 615-31; i T JP2003 / 013420
  • a reporter that expresses fluorescent proteins under the control of a promoter / enhancer of a tyrosine hydroxylase gene or the like expressed in dopaminergic neurons is used.
  • a method to visualize and concentrate or isolate or identify dopaminergic neurons alive by introducing the Yuichi gene into each cell of the cell population and isolating the fluorescent cells Japanese Patent Laid-Open No. 2002-51775) Gazette
  • the step of introducing a foreign gene is indispensable.
  • the presence of a reporter gene is problematic from the viewpoint of toxicity and immunogenicity. Disclosure of the invention
  • the dopaminergic neuron progenitor cells that have been induced to differentiate in the midbrain or in vitro of aborted fetuses are a mixture of various cells.
  • the safety in neural circuit formation it is desirable to isolate only the target cell type, and considering the risk of tumor formation, isolate neuronal cells after mitotic arrest before use. Is considered good.
  • the survival of the cells in the brain to which the cells are transplanted and the ability to form a correct network it is possible to increase the therapeutic effect by isolating earlier progenitor cells. It is expected. Therefore, the present inventor attempted to isolate a gene specific to dopaminergic neuron progenitor cells.
  • N-RDA representat ion al di f ference analys
  • RDA Li s syn NA (1995) Trends Genet. 11: 303-7
  • 65B13 was considered to be transiently expressed in neural progenitor cells immediately after mitotic arrest. Furthermore, when the expression in the midbrain was compared with the expression of tyrosine hydroxylase (THros), a marker gene of dopamine-producing neurons, the expression region in the dorsal-abdominal axis direction was completely consistent. In the midbrain, 65B13 was thought to be specific and transiently expressed in dopaminergic neuron progenitor cells immediately after mitotic arrest (Figs. 10 and 11).
  • THros tyrosine hydroxylase
  • the cells obtained in this manner are those in which only progenitor cells after mitotic arrest have been isolated 'and only the target cell type has been isolated. Even in this case, the safety is high, and since the earliest progenitor cells are used, a high therapeutic effect is expected in terms of survival rate and network formation ability. Even if the initial progenitor cells immediately after division do not achieve the best therapeutic effect and the cells are required to be used in a mature state, the initial progenitor cells obtained by this method can be Since it suffices to mature to the optimal differentiation stage by 7'0, it becomes possible to easily prepare the material at the differentiation stage suitable for the targeted transplantation treatment (Fig. 12).
  • pure dopaminergic neuron progenitor cells are effective in isolating dopamine-producing neuron progenitor cells and genes specific for each stage of maturation from progenitor cells to neurons, and searching for PD treatment targets.
  • progenitor cells since the earliest progenitor cells can be obtained by the method of the present invention, it is possible to elucidate the maturation process of dopaminergic neurons and use them in screening systems and the like using maturation as an index.
  • a polynucleotide comprising a sequence selected from the following ⁇ - ⁇ nucleotide sequences encoding 13 polypeptides or antigenic fragments thereof.
  • nucleic acid sequence comprising nucleotides 177 to 2280 of SEQ ID NO: 1, or nucleotides 127 to 2079 of SEQ ID NO: 2, or a sequence complementary to the nucleic acid sequence
  • nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4, or a sequence complementary to the nucleic acid sequence
  • nucleic acid sequence encoding a sequence lacking a signal sequence portion in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4, or a sequence complementary to the nucleic acid sequence
  • a host cell comprising the polynucleotide according to [1] or the vector according to [2],
  • a method for selecting dopaminergic neurons comprising a step of contacting the antibody according to [6] with a cell sample considered to contain dopaminergic neuron progenitor cells,
  • a method for selecting dopaminergic neurons comprising the step of contacting a peptide comprising at least the extracellular region of the polypeptide according to [4] with a cell sample considered to contain dopaminergic neuron precursor cells.
  • a method comprising a step of detecting, and isolating a gene specifically expressed in the cell, using a cell differentiated, induced or proliferated from
  • a screening method using maturity as an index comprising the step of contacting a test substance with the progenitor cell according to [10], and differentiation or proliferation of the progenitor cell by contact T JP2003 / 013420
  • the polynucleotide of the present invention can be used for obtaining an antigen for preparing an antibody that can be used for selecting dopaminergic neuron progenitor cells by genetic engineering techniques.
  • the polynucleotide of the present invention encodes a 65B13 polypeptide that is specifically expressed in dopaminergic neuron progenitor cells immediately after mitotic arrest, and the 177th to 2280th bases of SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 and 2) Or a nucleic acid sequence containing nucleotides 127 to 2079 of SEQ ID NO: 2 (FIGS. 3 and 4), or a sequence complementary to the nucleic acid sequence.
  • polynucleotide refers to a polymer consisting of a plurality of bases or base pairs such as deoxyliponucleic acid (DNA) or liponucleic acid (RNA), including DNA, cDNA, genomic DNA, chemically synthesized DNA and RNA. .
  • DNA deoxyliponucleic acid
  • RNA liponucleic acid
  • non-natural bases such as 4-acetylcytidine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uridine, 2, _0-methylcytidine, 5-force lpoxymethylaminomino-2-thiouridine, 5-carboxymethylamino Methyluridine, dihydrouridine, 2'-0-methyl pseudouridine,) 3-D-galactosylkyeosin,, -0-methylguanosine, inosine, N6-isopentenyladenosine, 1-methyladenosine, 1-methylpsin Iduridine, 1-methylguanosine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanosine, 2-methyladenosine, 2-methyldanosine, 3-methylcytidine, 5-methylcytidine, N6-methyladenosine, 7-methylguanosine , 5-methylaminomethyluridine, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouridine, / 3-D-mannoshi Lucioeosin,
  • the polynucleotide of the present invention encodes a 65B13 polypeptide that is specifically expressed in dopaminergic neuron progenitor cells immediately after mitosis, SEQ ID NO: 3 or 4 (FIGS. 1, 2 or 3, 4, respectively). Or a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence described in FIG. 5 or a sequence complementary to the nucleic acid sequence. In addition to the nucleic acid sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2, the nucleic acid sequence encoding such amino acid sequence differs from the sequence described in SEQ ID NOs: 1 and 2 due to the degeneracy of the genetic code. Is included.
  • the polynucleotide of the present invention is also a nucleic acid sequence encoding a sequence lacking the signal sequence portion in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 or 4. Including. In the amino acid sequences described in SEQ ID NOs: 3 and 4, the first 17 amino acid residues correspond to the signal sequence.
  • the polynucleotide of the present invention further comprises an amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 that encodes a 65B13 polypeptide that is specifically expressed in dopamine-producing neuronal progenitor cells immediately after mitosis, or an antigenic fragment thereof.
  • amino acid substitution means a mutation in which one or more amino acid residues in the sequence are changed to different types of amino acid residues.
  • amino acid sequence encoded by the polynucleotide of the present invention is modified by such substitution, it is preferable to perform conservative substitution when it is necessary to retain the function of the protein.
  • a conservative substitution is a change in sequence to encode an amino acid with similar properties to the amino acid before substitution.
  • amino acids are, for example, nonpolar amino acids (Ala, lie, Leu, Met, Pe, Pro, Trp, Val), uncharged amino acids (Asn, Cys, Gin, Gly, Ser, Tr, Tyr) Acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, His, Lys), neutral amino acids (Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, He, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val), Aliphatic amino acid (Ala, Gly), Branched amino acid (l ie, Leu, Val), Hydroxyamino acid (Ser, Thr), Amide type amino acid (Gln, Asn), Sulfur-containing amino acid (Cys, Met), aromatic amino acids (His, Phe, Trp, Tyr), heterocyclic amino acids (His, Trp), imino acids (Pro, 4Hyp) and the like.
  • nonpolar amino acids Alphatic amino acids
  • Amide type amino acid Gln, As
  • the substitution between Ala, Val, Leu and lie, between Ser and Thr, between Asp and Glu, between Asn and Gin, between Lys and Arg, and between Phe and Tyr is a property of the protein.
  • Is preferred as a substitution for retaining are not particularly limited, as long as the amino acid encoded by the polynucleotide has 65B13 antigenicity.
  • a polynucleotide encoding an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 4 is described in “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd”. ed. (Cold Spring Harbor Press (1989)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997); especially Sect ion 8.1-8.5), Hashimoto- Goto et al. 1995) -1 o-
  • Enzymol. 85: 2763-6 etc. can be prepared according to a method such as site-directed mutagenesis.
  • the polynucleotide of the present invention encodes a 65B13 polypeptide that is specifically expressed in dopamine-producing neuronal progenitor cells immediately after mitosis, or an antigenic fragment thereof, 177th to 2280th in SEQ ID NO: 1.
  • a nucleotide sequence or a nucleic acid sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid sequence comprising the 12th to 2079th bases of SEQ ID NO: 2 or a sequence complementary to the nucleic acid sequence is there.
  • 65B13 isoforms having two kinds of sequences described in SEQ ID NOs: 1 and 2 were obtained, but there are other alternative forms of alternative isoforms and allelic variants.
  • Such isoforms are also included in the polypeptide of the present invention.
  • a polynucleotide is a colony hybridization using a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence comprising nucleotides 177 to 2280 of SEQ ID NO: 1 or nucleotides 127 to 2079 of SEQ ID NO: 2 as a probe.
  • Animals such as humans, mice, rats, rabbits, hamsters, chickens, pigs, rabbits, goats, hidges, etc., by known hybridization methods such as plaque hybridization, Southern blot, etc. From one cDNA library and one genomic library.
  • cDNA library For information about creating a cDNA library can be referred to "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2 nd ed. " (Cold Spr ing Harbor Press (1989 )). Alternatively, a commercially available cDNA library and genomic library may be used.
  • a guanidine ultracentrifugation method (Chirwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-) is obtained from cells, organs, tissues, etc. that express the polynucleotide of the present invention. 9), total RNA was prepared by a known technique such as AGPC method (Chomczynski and Sacchi (1987) Anal. Biochem. 162: 156-9), and mRNA Puriiic Purify nRNA using ation Kit (Pharmacia) etc.
  • a kit for directly preparing mRNA such as QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia), may be used.
  • cDNA is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • Kits for cMA synthesis such as AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (Seikagaku), are also commercially available.
  • cDNA is obtained by PCR. 5,-RACE method (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-900 2; Belyavsky et al. (1989) Nucleic Acids Res 17: 2919-32) may be synthesized and amplified.
  • hybridization conditions in the present invention for example, "2XSS 0.1% SDS, 50", “2XSSC, 0.1% SDS, 421", “1XSS 0.1% SDS, 37 ° C”, and more stringent end conditions include, for example, Conditions such as “2XSSC, 0.1% SDS, 65 ° C”, “0.5X SSC, 0.1% SDS, 42 ° C”, “0.2XSS (:, 0.1% SDS, 65 ⁇ ”, etc. can be mentioned.
  • Rapid-hyb buffer Amersham Life Science
  • pre-hybridization is performed at 68 ° C for 30 minutes or more, and then the probe is added and kept at 68 ° C for 1 hour or more.
  • the prehybridization and hybridization temperatures can be 60, and the stringent conditions can be 68.
  • probe concentration, probe length, reaction time, etc. in addition to such conditions such as the salt concentration and temperature of the buffer, Conditions for obtaining mouse 65B13 isoforms, allelic mutants, and corresponding genes derived from other species can be set.
  • the polynucleotide to be hybridized is at least 50% or more, preferably 70% or more, with respect to the nucleic acid sequence containing nucleotides 177 to 2280 of SEQ ID NO: 1, or nucleotides 127 to 2079 of SEQ ID NO: 2.
  • identities are found in the BLAST algorithm (Altschul (1990) Proc. Nai l. Acad. Sci. USA 87: 2264-8; Karl in and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-7).
  • BLAS® is used as a program for determining the identity of amino acid sequences
  • BLASTN is used for nucleotide sequences
  • Confirmation of the base sequence of the polynucleotide of the present invention can be performed by sequencing by a conventional method. For example, it can be carried out by the method of mining the dideoxynucleotide chain (Sanger et al. (1977) Proc. Nail. Acad. Sci. USA 74: 5463). It is also possible to analyze the sequence using an appropriate DNA sequencer.
  • the present invention provides a nucleotide chain consisting of at least 15 bases that is complementary to the polynucleotide of the present invention.
  • “complementary sequence” means that at least 15 contiguous bases in the nucleotide sequence are perfectly paired with the saddle type. 2003/013420
  • T in the base sequence of the polynucleotide of the saddle type is T (U for RA), A for T or U, G for C, and C for G Correspondingly, a chain is formed.
  • the homology can be determined in the same manner as in the case of the above-mentioned hybridized polynucleotide.
  • Such a nucleotide chain of the present invention can be used as a probe for detecting or isolating the polynucleotide of the present invention and a primer for amplifying.
  • a probe when used as a probe, it is preferably composed of 15 to 100, preferably 15 to 35 bases, and when used as a primer, it is composed of at least 15, preferably 30 bases.
  • a primer it can be designed in a form in which a restriction enzyme recognition sequence, a tag, etc. are added to the sequence complementary to the target sequence in the 3 'end region and the 5' end side. .
  • the nucleotide chain of the present invention can be hybridized to the polynucleotide of the present invention.
  • mutations of the polynucleotide of the present invention in cells can be detected. Such mutations may cause abnormalities in the activity or expression of the polypeptide of the present invention in some cases, and thus are considered useful for disease diagnosis and the like.
  • the nucleotide chain of the present invention specifically cleaves an antisense nucleic acid and mRNA that suppresses expression of the polynucleotide of the present invention in cells by binding to mRNA or DNA. Liposomes that block by this are included. Antisense suppresses target gene expression by: (1) inhibition of transcription initiation by triple-strand formation, and (2) formation of a hybrid with a local open loop structure site formed by RNA polymerase.
  • the antisense nucleic acid contained in the nucleotide chain of the present invention may be a nucleic acid that suppresses gene expression by any of the mechanisms (1) to (11) described above, that is, a translation region of a target gene that inhibits expression.
  • an antisense sequence for the sequence of the untranslated region may be included.
  • DNA encoding an antisense nucleic acid can be used linked to appropriate regulatory sequences that allow its expression.
  • the antisense nucleic acid does not need to be completely complementary to the translated or untranslated region of the target gene, and may be any nucleic acid that effectively inhibits the expression of the gene.
  • Such an antisense nucleic acid has a chain length of at least 15 bp or more, preferably lOO bp or more, more preferably 500 bp or more, usually within 3000 bp, preferably within 2000 bp, more preferably within lOOObp, and the target. It is preferably 90% or more, more preferably 95% or more, identical to the complementary strand of the gene transcript.
  • Such an antisense nucleic acid can be prepared by the phosphoronate method (Stein (1988) Nucleic Acids Res. 16: 3209-21) based on the polynucleotide of the present invention.
  • a lipozyme is a general term for catalysts having RNA as a constituent component, and is roughly classified into a large liposome and a small liposome.
  • Large liposomes are enzymes that cleave the phosphate bond of nucleic acids and leave a 5'-phosphate and 3'-hydroxyl group at the reaction site after the reaction.
  • ribozyme (1) Group I intron RNA that undergoes transesterification reaction at the 5'-splice site with guanosine, (2) Group II intron RA that undergoes self-splicing in a two-step reaction via a Lalyt structure, and (3) Hydrolysis It is classified as an RNA component of liponuclease P, which cleaves the tRNA precursor from the 5 'side by the degradation reaction.
  • small liposomes are relatively small structural units (about 40 bp) that cleave RNA to produce 5'-hydroxyl groups and 2'-3 'cyclic phosphates. Small liposomes include hammerhead type (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett.
  • Lipozymes are known to be modified and synthesized in a variety of ways, and various improvements are known.For example, by designing the liposomal substrate binding site to be complementary to the RNA sequence near the target site, The base sequence I: A hammerhead type lipozyme that recognizes and cleaves UU or UA can be made (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett.
  • Hairpin-type liposomes can also be designed and manufactured according to known methods (Kikuchi and Sasaki (1992) Nucleic Acids Res.
  • a vector comprising the polynucleotide of the present invention.
  • the vector of the present invention is useful for retaining the polynucleotide of the present invention in a host cell or for expressing a polypeptide encoded by the polynucleotide.
  • This vector is a plasmid, cosmid, virus, bacteriophage temporary, black-learning for base Kuta one, includes various vectors such as expression vectors (Molecular C1 oning, A Laboratory Manual 2 nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989); Currant Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987)).
  • control sequence includes a promoter, a ribosome binding site, and a terminator if the host cell is prokaryotic, and a promoter and terminator if the host cell is eukaryotic. Evening, transcription factors, poly A signals that stabilize transcripts, splicing and polyadenylation signals are included. Such control sequences include all the components required for the expression of the polynucleotide linked thereto.
  • the vector of the present invention preferably contains a selectable marker.
  • the target polypeptide is used as the target polypeptide. It can also be incorporated into an expression vector in such a way as to be added.
  • a signal peptide may be a signal peptide consisting of 17 amino acid residues that are naturally added to 65B13, or derived from a heterologous protein.
  • a linker may be added, and a start codon (ATG) or stop codon (TM, TAG or TGA) may be inserted as necessary.
  • the vector of the present invention is preferably an expression vector.
  • “Expression vector” refers to a construct capable of expressing a polypeptide encoded in an expression vector in a host cell of interest in vitro.
  • the expression vector of the present invention includes a clone vector, a binary vector, an integrating vector, and the like. In the process of expression, the coding sequence in the expression vector can be translated into nNA, and the mRNA can be translated into the polypeptide of the present invention. Periplasm or extracellular secretion.
  • a vector that enables the expression of a polypeptide in W / r is BEST (Promega).
  • promoters that enable expression in prokaryotic hosts such as .I araB (Better et al. (1988) Science 2 40: 1041-3), lacZ (Ward et al. (1989) Nature 341: 544 -6; Ward et al. (199 2) FASEB J. 6: 2422-7), trp, tac, trc (fusion of lac and tn)).
  • trpA-derived, phage-derived, rrnB liposomal RA-derived promoters can be used.
  • the vector for E can be used.
  • coli preferably has “ori” for amplifying the vector in the host and a marker gene for selecting the transformed host. It is preferable to use a drug resistance gene that makes it possible to discriminate the host using drugs such as ampicillin, tetracycline, kanamycin, and chloramphenicol.
  • the pelB signal sequence (Lei et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 4379) can be used for the purpose of secreting the polypeptide into the periplasm.
  • PEGFP pBluescript (Stratagene), pET (Invitrogen; the host expresses T7 polymerase And BL21 is preferred).
  • pGEM-T pDIRECT, pT7 and the like can be exemplified as a vector for subcloning or excision.
  • Examples of bacterial hosts other than E. coli include those of the genus Bacillus, and PUB110 and PC194 vectors are exemplified. More specifically, it is possible to list pPL608, pKTH50, etc. derived from Bacillus subtilis. Others, such as PseudoEonas putida ⁇ Pseud omonas cepacia, Brevibacteriwn )) Genus (pAJ43 (Gene 39: 281 (1985)), etc.), Corynebacterium glutamicinn (D) ⁇ , pacterium (pCSll (JP 57-183799 A); CBlOKMol. Gen. Genet. 196: -19-
  • Streptococcus (pHV1301 (FEMS Microbiol. Lett. 26: 2 39 (1985)), pGKKAppl. Environ. Microbiol. 50: 94 (1985)), etc.), Lactobacillus (pAMj31 (J Bacteiol. 137: 614 (1979))), Rhodococcus rhodochrous, etc. (J. Gen. Microbiol. 138: 1003 (1992)), Streptomyces liv idans, Streptomyces virginiae, etc. of Streptomyces: A Laboratory Manual, Hopwood et al., Cold Spring Harbor Laboratories (1985); pIJ486 (Mol. Gen. Genet.
  • examples of the regulatory element that enables expression in a eukaryotic host include the A0X1 and GAL1 promoters when yeast is used as the host.
  • yeast-derived expression vectors include Picia Expression Kit (Invitrogen), pNVIK SP-Q01, and the like. Vectors usable in yeast are described in detail in Adv. Biochei. Eng. 43: 75-102 (1990), Yeast 8: 423-88 (1992) and the like. More specifically, in Saccharomyces genus such as Saccharomyces ce / eF /, YRp, YEp, YCp, and Yip vectors can be used.
  • integration vectors that can introduce multiple copies of genes and can stably maintain genes are useful.
  • Kluyveromyces genus such as Kluyveromyces, 5. 2 m system vector derived from cereWWae, pKDl system vector (J. Bacteriol. 145: 382-90 (1981)), pGKll derived vector, Kryberomyces autonomous growth gene KARS
  • the first vector such as the vector described in Mol. Cell. Biol. 6: 80 (1986), pAUR22 -20-
  • adenovirus late promoter When mammalian and other animal cells are used as hosts, adenovirus late promoter (Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946), CAG promoter (Niwa et al. ( 1991) Gene 108: 193-200), CMV i ⁇ ediate early promotion (Seed and Aruffo (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365-9), EFla mouth motor (Mizushima et al (1990) Nucleic Acids Res. 18: 5322; Kim et al. (1990) Gene 91: 217-23), HSV TK promoter, SRa promoter (Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol.
  • SV40 promoter (Mulligan et al. (1979) Nature 277: 108), SV40 early promotion (Genetic Engineering Vol. 3, Williamson ed., Academic Press (1982) pp.83-141), SV40 late promo evening-(Gheysen and Fiers (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 385-94), RSV (Rous sarcoma virus)-LTR promo evening (Cullen (1987) Methods Enzymol. 152: 684 -704) MMLV-LTR promoter, CMV enhancer, S V40 Enhancer, globin intron, etc. can be used.
  • the vector contains a drug resistance gene that enables discrimination by drugs such as neomycin and G418.
  • a vector such as pCHOI having a DHFR gene that compensates for the deficiency of CH0 that lacks the nucleic acid synthesis pathway as a host. 13420
  • the number of copies can be amplified by methotrexate ( ⁇ ).
  • COS cells having SV40 T antigen gene on the chromosome are used as hosts, SV40 replication origin such as pcD, adenovirus, ushipapy roman virus (BPV), polio
  • SV40 replication origin such as pcD, adenovirus, ushipapy roman virus (BPV), polio
  • a vector having a replication origin such as a single virus can be used.
  • aminoglycoside transferase (APH), thymidine kinase (TK), xanthating guanine phospholiposyltransferase (Ecogpt) dihydraulate folate reductase are the best choices for gene copy number amplification.
  • a gene encoding (dMr) or the like may be included.
  • Suitable vectors include, for example, Okayama-Berg expression vectors pcDVl (Pharmacia), pCDM8 (Nature 329: 840-2 (1987)), pRc / CMV, pcDNAU pcDNA3 (Invitrogen), pSPORTl (GIBCO BRL) , pSV2d fr (Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981)), pEF-BOS (Nucleic Acids Res.
  • an adenovirus vector such as PAdexkw and a retrovirus vector such as pZIPneo are listed.
  • Vector 1 is adenovirus method, electroporation (electroporation) method (Cy to technology 3: 133 (1990)), cationic ribosome method (force photonic liposome D0TAP (Boehringer Mannheim), etc.), positively charged polymer Introduction method, electrostatic type liposome method, internal type liposome method, method using particle gun, ribosome method, lipofection (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Virus vectors derived from those other than adenovirus and retrovirus such as adeno-associated virus, symbis virus, sendai virus, togavirus, paramyxovirus, box virus, poliovirus, herpes virus, lentivirus, vaccinia virus, etc. It is also possible to use a vector manufactured in the above. In vivo administration may be performed by ex vi method or in method.
  • insect expression systems are also known as systems for expressing heterologous polypeptides.
  • Autographa ca / or / 2 nuclear polyhedrovirus is a vector, Spodoptera / r3 ⁇ 4'per cells, Ft can express foreign genes in Triclwplusia / arrae cells.
  • the target foreign gene is cloned into a non-essential region of the virus. For example, it may be linked under polyhedrin promo control.
  • the polyhedrin gene is inactivated, a recombinant virus lacking the coat protein is produced, and is targeted in cells such as Awi / o / j era frugipe rdaH Trichoplusia / a / rae infected with the virus.
  • the polypeptide is expressed (Smith (1983) J. Virol. 46: 584; Engelhard (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224-7).
  • Bac_to-BAC baculovirus expression system Bigco BRL
  • pBacPAK8 are known as insect cell-derived expression vectors.
  • vectors using the 35S promoter of cauliflower mosaic virus can be used.
  • a method for introducing a vector into a plant cell a PEG method, an electroporation method, an agrobacterium method, a particle gun method and the like are known.
  • the present invention provides a host comprising the polynucleotide or vector of the present invention.
  • a host comprising the polynucleotide or vector of the present invention.
  • the hosts of the present invention include prokaryotic and eukaryotic cells derived from archaea, bacteria, fungi, plants, insects, fish, amphibians, octopus, birds, mammals.
  • the host of the present invention contains a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention in a cell.
  • the polynucleotide need not be in a naturally occurring position on the genome of the host cell, whether under the control of its own promoter or integrated into the genome, as an extrachromosomal structure. It may be held.
  • Bacterial hosts include. '(JM109, DH5o !, HB101, XLlBlue), Serratia marces cens. Bacillus subtilis, etc., Escherichia genus, Streptococcus spp. Gram negative bacteria can be exemplified.
  • Eukaryotic hosts include yeast and other fungi, higher plants (o ⁇ a / aZ> ac TM -derived cells), insects (Drosophila S2, Sporopodoptera Sf9, Sf21, Tn5), fish, amphibians (African Xenopus oocytes) (Vail e et al. (1981) Nature 291: 358-40))> Reptiles, birds, mammals (CH0 (L Exp. Med. 108: 945 (1995)), especially dMr-CH0 (Proc) Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20 (1980) and CHO K-1 (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • COS COS
  • Hela COS
  • C127. 3T3, BHK, HEK29 3
  • Bowes melanoma cells COS
  • Mieguchi Vero
  • Namalwa Namal a KJM-HBT56 37
  • plant potato, tobacco, corn, rice, Burana, soybean, tomato, wheat, barley, rye, alfalfa, flax etc.
  • fungi also include expression systems that use cells such as the filamentous fungus A3 ⁇ 4oe zozozo / w genus 3 ⁇ 4t ⁇ 7zous / etc. as hosts. is there. 3 013420
  • polypeptide of the present invention is a peptide polymer encoded by the polynucleotide of the present invention.
  • a preferred example is a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 4.
  • the amino acid residue constituting the polypeptide of the present invention may be a naturally occurring one or a modified one.
  • Modifications of amino acid residues include: acylation, acetylation, amidation, arginylation, GPI anchor formation, cross-linking, force loxylation, cyclization, formation of covalent cross-links, glycosylation, oxidation, lipid or fat Derivative covalent bond, cystine formation, disulfide bond formation, selenoylation, demethylation, proteolytic treatment, nucleotide or nucleotide derivative covalent bond, hydroxylation, pyroglutamate formation, flapine covalent bond , Prenylation, covalent attachment of the heme moiety, covalent attachment of phosphatidylinositol, formylation, myristoylation, methylation, ubiquitination, iodination, racemization, ADP-liposylation, sulfation, phosphorylation, etc. Illustrated.
  • the polypeptides of the present invention include precursors with a signal peptide moiety, mature proteins lacking
  • Peptide sequences added to the polypeptide of the present invention include influenza agglutinin (HA), dartathione S transferase (GST), substance P, multiple histidine tags (6XHis, lOXHis, etc.), protein C fragment, maltose binding protein ( MBP), immunoglobulin constant region, ⁇ -tubulin fragment, -galactosidase, ⁇ -tag, c_myc fragment, E-tag (epitope on monoclonal phase), FLAG (Hopp et al. (1988) Bio / Tehcnol.
  • lck tag pl8 HIV fragment
  • HSV_ tag human herpes simplex virus glycoprotein
  • SV40T antigen fragment T7-tag (T7 ge nelO protein)
  • VSV-GP fragment Vesicular stomatitis virus glycoprotein
  • Sex Azukasuru can select an array or the like.
  • the present invention provides a fragment of the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide fragment of the present invention is the same as a part of the polypeptide of the present invention, and is a polypeptide fragment comprising at least 8 amino acid residues (for example, 8, 10, 12, or 15 amino acid residues or more) It is.
  • Particularly preferred fragments include polypeptide fragments lacking the amino terminus, force lupoxyl terminus, and transmembrane domain.
  • polypeptide fragment of the present invention may be any fragment as long as it has the antigenicity of the polypeptide of the present invention.
  • the antigenic determinant of the polypeptide is a method of analyzing hydrophobic Z hydrophilicity on the amino acid sequence of the protein (Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Biol.
  • polypeptides and polypeptide fragments of the present invention can be produced by known gene recombination techniques or by chemical synthesis methods.
  • the produced protein may or may not be glycosylated depending on the type of host selected, and the molecular weight, isoelectric point Etc. may be different.
  • a polypeptide is expressed using a prokaryotic cell such as E. coli as a host, the resulting polypeptide is produced in a form in which a methionine residue is added to the N-terminus that the polypeptide originally had.
  • a prokaryotic cell such as E. coli
  • the resulting polypeptide is produced in a form in which a methionine residue is added to the N-terminus that the polypeptide originally had.
  • polypeptides having different structures are also included in the polypeptides of the present invention.
  • Cultivation can be performed for about 15 to 200 hours at 6 to 8 and 30 to 40 ° C.
  • medium can be exchanged as needed, and aeration and agitation can be performed.
  • the desired DNA is introduced into animals or plants to produce the polypeptide in vivo.
  • the DNA encoding the polypeptide encodes a protein that is specifically secreted into the milk such as ⁇ -casein. It binds to DNA and allows the target polypeptide to be expressed as a fusion protein.
  • DNA encoding the fusion protein is introduced into the goat embryo.
  • D Embryo introduced embryo into the uterus of the female goat. The transgenic goat born from this goat, or its progeny, secretes the desired polypeptide into the milk. If necessary, hormones can be administered to increase milk production (Ebert et al. (19 94) Bio / Technology 12: 699-702) 0
  • Polypeptide production systems for transgenic plants using plants such as tobacco are known.
  • a desired polypeptide-encoding DNA is incorporated into a vector suitable for plant expression such as PM0N530 and introduced into a bacterium such as Agrobacterium / mz / e / ac e.
  • the desired polypeptide can be isolated from the leaves of the transgenic plant by infecting a plant with DNA introduced into a plant such as / aZ » ⁇ ? And regenerating the plant. (.. Julian et al (1994 ) Eur J. Immunol 24:. 131-8) 0 other ways, methods of regenerating the plant by introducing DNA into protoplasts using PEG (Gene Transfer to plants, Potrykus and Spangenberg ed.
  • the plant that produces the polypeptide of the present invention using the seeds, fruits, tubers, tuberous roots, strains, cuttings, callus, protoplasts, etc. of the plant in the same manner.
  • the host can be propagated.
  • the polypeptide of the present invention produced by gene recombination technology is prepared by first using a medium when the polypeptide is secreted outside the cell, particularly a body fluid in the case of a transgenic organism, If it is produced inside, lyse the cells and collect the lysate. And it is well-known as a protein purification method salting out, distillation, various chromatographies, gel electrophoresis, gel filtration, ultrafiltration, recrystallization, acid extraction, dialysis, immunoprecipitation, solvent precipitation, solvent extraction, ammonium sulfate Alternatively, the desired polypeptide is purified by appropriately combining ethanol precipitation and the like.
  • ion exchange such as anion or force thione exchange, affinity, reverse phase, adsorption, gel filtration, hydrophobicity, hydroxyapatite, phosphocellulose, lectin chromatography, etc.
  • ion exchange such as anion or force thione exchange, affinity, reverse phase, adsorption, gel filtration, hydrophobicity, hydroxyapatite, phosphocellulose, lectin chromatography, etc.
  • a naturally occurring polypeptide may be purified and obtained.
  • an antibody against the polypeptide of the present invention which will be described later, can be used to purify by affinity chromatography (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Sect ion 16. 1-16. 19).
  • a purification method using a Daryuthion column when using a fusion protein with GST and a nickel column when using a fusion protein with a histidine tag can also be used.
  • unnecessary portions can be cleaved using thrompine or factor Xa after purification, if necessary.
  • polypeptide fragment of the present invention can be produced by cleaving the polypeptide of the present invention using an appropriate enzyme such as a peptidase in addition to the above-described synthesis and genetic engineering techniques.
  • an appropriate enzyme such as a peptidase in addition to the above-described synthesis and genetic engineering techniques.
  • the present invention provides an antibody against the polypeptide or polypeptide fragment of the present invention.
  • Antibodies of the present invention include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, single chain antibodies (scFV) (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol.113, Rosenburg and Moore ed., Springer Verlag (1994) pp.269-315), humanized antibody, multispecific antibody (LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt.
  • the antibody of the present invention may be modified with PEG or the like, if necessary.
  • the antibody of the present invention can be produced as a fusion protein with 8-galactosidase, maltose binding protein, GST, green fluorescent protein (GFP), etc., and can be detected without using a secondary antibody. Also good. Further, the antibody may be modified so that the antibody can be recovered using avidin, streptavidin, or the like by labeling the antibody with biotin or the like.
  • the antibody of the present invention can be produced using the polypeptide of the present invention or a fragment thereof, or a cell expressing them as a sensitizing antigen.
  • a short one of the polypeptides of the present invention or a fragment thereof is used as an immunogen by binding to carriers such as sushi serum albumin, keyhole limbet, mocyanin, and ovalbumin. 2003/013420
  • polypeptide of the present invention or a fragment thereof, known adjuvants such as aluminum adjuvant, complete (or incomplete) Freund's adjuvant, and Bordetella pertussis adjuvant may be used to enhance the immune response to the antigen.
  • adjuvants such as aluminum adjuvant, complete (or incomplete) Freund's adjuvant, and Bordetella pertussis adjuvant may be used to enhance the immune response to the antigen.
  • Polyclonal antibodies for example, immunize a mammal with the polypeptide of the present invention or a fragment thereof together with an adjuvant as needed, and obtain serum from the immunized animal. Mammals used here are not particularly limited, but rodents, maggots, and primates are common.
  • the sensitized antigen is diluted and suspended as appropriate with Phosphate-Buffered Salin (PBS) or physiological saline, etc., mixed with an adjuvant as necessary, and then emulsified intraperitoneally or subcutaneously. It is done by injection. Thereafter, the sensitizing antigen mixed with Freund's incomplete adjuvant is preferably administered several times every 4 to 21 days. Antibody production can be confirmed by measuring the desired antibody level in the serum by a conventional method.
  • PBS Phosphate-Buffered Salin
  • physiological saline physiological saline
  • the serum itself may be used as a polyclonal antibody or further purified.
  • “Current Protocols in Molecular Biology” John Wiley & Sons (198 7) Section 11. 12-11. 13) can be referred to.
  • the spleen is removed from the animal immunized as described above, immune cells are separated from the spleen, and fused with appropriate myeloma cells and polyethylene glycol (PEG) or the like.
  • PEG polyethylene glycol
  • myeloma cells include, in particular, cells that make it possible to select fused cells with drugs.
  • the fused hyperidoma is selected by culturing in a culture solution (HAT culture solution) containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine that die other than the fused cells.
  • HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine that die other than the fused cells.
  • a clone is selected that produces an antibody that binds to the peptide or fragment thereof.
  • the selected clone is transplanted into the abdominal cavity of a mouse or the like, and ascites is collected to obtain a monoclonal antibody.
  • “Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons (1987) Section 11.4-11.11) can also be referred to.
  • Hypridoma also sensitizes human lymphocytes initially infected with EB virus with an immunogen at 7 n 0, and fuses sensitized lymphocytes with human-derived myeloma cells (such as U2 66) It can also be obtained by a method for obtaining a hyperidoma that produces human antibodies (Japanese Patent Laid-Open No. 63-17688). Human antibodies can also be obtained using antibody-producing cells produced by sensitizing a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes (W092 / 03918; W093-02227; W094 / 02602; / 25585; W0 96/33735; ⁇ / 34096; Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-56 etc.). An example in which a hybridoma is not used is a method in which an oncogene is introduced into immune cells such as antibody-producing lymphocytes and immortalized.
  • Antibodies can also be produced by gene recombination techniques (see Borrebaeck and Larrick (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers LT D., UK). To do so, first, a gene encoding the antibody is cloned from a hyperidoma or antibody-producing cells (sensitized lymphocytes, etc.). The obtained gene is incorporated into an appropriate vector, the vector is introduced into a host, and the host is cultured to produce antibodies. Such recombinant antibodies are also included in the antibodies of the present invention.
  • Representative recombinant antibodies include a chimeric antibody comprising a non-human antibody-derived variable region and a human antibody-derived constant region, a non-human antibody-derived complementarity determining region (CDR), and a human antibody-derived framework region ( (FR) and constant region (Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reichmann et al. (1988) Nat ure 332: 323-9; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods Enzymol. 203: 99 121 (1991)).
  • the antibody fragment of the present invention can be produced by treating the aforementioned polyclonal or monoclonal antibody with an enzyme such as papain or pepsin.
  • Multispecific antibodies of the present invention include bispecific antibodies (BsAb), diapodes (Db) and the like.
  • Multispecific antibodies are: (1) a method in which antibodies of different specificities are chemically coupled by heterobifunctional linkers (Paulus (1985) Behring Inst. Mill. 78: 118-32), (2) Methods for fusing hybridomas that secrete different monoclonal antibodies (Mi 11 ste in and Cuello (1983) Nature 305: 537-9), (3) mice with different monoclonal antibody light and heavy chain genes (4 types of DNA) Transfection of eukaryotic expression systems such as myeloma cells, followed by isolation of bispecific monovalent moieties (Zi thigh ermann (198 6) Rev. Physio. Biochem. Pharmacol.
  • Db is a dimeric antibody fragment composed of two divalent polypeptide chains that can be constructed by gene fusion, and can be prepared by a known method (Holliger et al. (199 3) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; EP404097; TO93 / 11161).
  • Antibodies and antibody fragments can be collected and purified using proteins A and G, as well as by protein purification techniques described in detail in ⁇ Polypeptide production> (Ant ibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)).
  • protein A when protein A is used for purification of the antibody of the present invention, protein A columns such as Hyper D, P0R0S, Sepharose FF (Pharmacia) are known and can be used.
  • the concentration of the obtained antibody can be determined by measuring its absorbance or by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or the like.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Antigen binding activity of antibodies can be measured by photometric measurement, fluorescent antibody method, enzyme immunoassay (EIA), radioimmunoassay (RIA), ELISA, and the like.
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • ELISA the antibody of the present invention is immobilized on a carrier such as a plate, the polypeptide of the present invention is added, and then a sample containing the target antibody is added.
  • a sample containing an antibody a culture supernatant of antibody-producing cells, a purified antibody, and the like can be considered.
  • a secondary antibody that recognizes the antibody of the present invention is added, and the plate is incubated. The plate is then washed and the label attached to the secondary antibody is detected.
  • antigen binding activity can be measured by adding an enzyme substrate such as P-nitrophenyl phosphate and measuring the absorbance. It can.
  • a commercially available system such as BIAcore (Pharmacia) can also be used for antibody activity evaluation.
  • the antibody of the present invention can be used for purification of the polypeptide of the present invention and fragments thereof. It can also be used to obtain dopaminergic neuron progenitor cells that can be suitably used for cell transplantation therapy for Parkinson's disease and the like.
  • the present invention provides a method for selectively obtaining dopaminergic neuron progenitor cells immediately after division arrest as a uniform population. More specifically, the polypeptide of the present invention is selected by contacting an antibody against the 65B13 polypeptide of the present invention with a cell sample predicted to contain dopaminergic neuron progenitor cells and selecting cells that bind to the antibody. Cells expressing the peptide, that is, dopaminergic neuron progenitor cells immediately after mitosis can be obtained (see FIGS. 12 to 14). Prior to contact with cells, the antibody can be immobilized on a suitable carrier and used. Alternatively, the cells bound to the antibody can be selectively recovered by bringing the cells into contact with each other and binding them, followed by purification using antibody affinity. For example, when the antibody of the present invention is bound to piotin, it is placed on a plate or column bound with avidin or streptavidin. In addition, purification can be performed by adding them.
  • 65B13 has an adhesion molecule-like structure with an Ig domain (see Fig. 6), and it is known that cells expressing 65B13 adhere to each other when expressed in cultured cells. Since it does not adhere to cells that do not express 65B13, adhesion via 65B13 is considered to be a homotropic bond. Due to such properties of 65B13 polypeptide, dopamine-producing neuron progenitor cells can also be selected by using, in particular, the extracellular region of 65B13 polypeptide. For example, it is possible to obtain dopaminergic neuron progenitor cells by immobilizing the extracellular region of 65B13 polypeptide on a suitable carrier and bringing it into contact with the cells.
  • a method for selecting a dopaminergic neuron comprising a step of contacting a peptide containing at least the extracellular region of the polypeptide of the present invention with a cell sample considered to contain a dopaminergic neuron progenitor cell.
  • dopaminergic neuron precursor cells using a promo overnight for 65B13 (see, for example, JP-A-2002-51775).
  • a vector containing a construct in which a gene encoding a detectable marker such as GFP is linked to a promoter portion obtained by 65B13 expression region analysis described below can be transfected into a cell.
  • a gene encoding a marker can be knocked into the 65B13 locus. In both cases, the expression of the marker gene is detected specifically for dopaminergic neuron progenitor cells, enabling the selection of specific cells.
  • the cell sample used here is preferably a culture medium containing cells in the ventral region of the midbrain or dopaminergic neurons induced to differentiate in vitro. differentiation of dopaminergic neurons in vitro, known ES cells, bone marrow stromal cells, 0
  • the cell sample used for selecting the dopaminergic neuron progenitor cells of the present invention may be a group of cells separated or cultured by any method.
  • the carrier for immobilizing the antibody or polypeptide of the present invention must be harmless to cells.
  • synthetic or natural organic polymer compounds, glass beads, silica gel, alumina, activated carbon and other inorganic materials, and those whose surfaces are coated with polysaccharides, synthetic polymers, etc. are conceivable.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and examples thereof include membrane, fiber, granule, hollow fiber, non-woven fabric, porous shape, honeycomb shape, etc.
  • the thickness, surface area, thickness, length, shape, The contact area can be controlled by varying the size. ⁇ Dopaminergic neuron progenitor cells>
  • the cells obtained in this way are dopaminergic neuron progenitor cells immediately after mitotic arrest, so they are safer and more viable than conventional mixed cell populations or dopaminergic neurons introduced with foreign genes. It is preferable for transplantation treatment of neurodegenerative diseases such as PD in terms of rate and network formation ability. Furthermore, since the cell (s) of the present invention obtained by this method is a progenitor cell immediately after division, it can be differentiated to an appropriate stage by selecting conditions such as medium in in W / ro. Is also possible 3 013420
  • the transplantation of neuronal progenitor cells obtained by the method of the present invention 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ , more preferably 5 to 6 ⁇ 10 4 neurons are transplanted.
  • the first method includes stereotaxic surgery in which a cell suspension is transplanted into the brain. Alternatively, the cells may be transplanted by microsurgery.
  • the transplantation method of neuronal tissue Backlund et al. (Backlund et al. (1985) J. Neurosurg. 62: 169-73), Lindval l et al. (Lindval l et al. (1987) Ann. Neurol. 22: 457- 68), Madrazo et al. (Mad razo et al. (1987) New Engl. J. Med. 316: 831-4).
  • the cells of the present invention include dopaminergic neuron progenitor cell-specific genes and genes specific for each maturation stage from progenitor cells to dopaminergic neurons, PD treatment target search, dopaminergic neuron It can also be used for elucidation of the maturation process and screening using maturity as an indicator. ⁇ Comparison of gene expression levels>
  • the dopaminergic neuron progenitor cell immediately after mitosis obtained using the antibody of the present invention can be used as a material for isolating a gene specifically expressed in the cell. Furthermore, a gene specifically expressed in a cell obtained by differentiating, inducing or proliferating the dopamine-producing neuron progenitor cell of the present invention can be examined and isolated. It is also possible to examine genes required for the differentiation of dopaminergic neurons in vivo by examining genes that have different expression levels in differentiated Z-induced / proliferated cells and the original progenitor cells. it can. Since such genes can be candidates for treatment of diseases caused by any defect in dopamine-producing neurons, it is very useful to determine and isolate such genes.
  • RNA is processed, transported, and cytoplasmic in individual cells by performing hybridization on total RNA or polyA3 ⁇ 4NA prepared from cells using labeled probes specific for specific RNA sequences. It is possible to examine the location where local localization occurs. In addition, the size of RNA can be determined by size fractionation by gel electrophoresis or the like. Quantitative fluorescence in //// Hypridation (FISH) and digital image microscopy can also be used to visually capture RNA transcripts with //? '/ ⁇ / (Femino et al. (199 8) Science 280: 585-90), which can be used in the present invention.
  • FISH Hypridation
  • digital image microscopy can also be used to visually capture RNA transcripts with //? '/ ⁇ / (Femino et al. (199 8) Science 280: 585-90), which can be used in the present invention.
  • reverse transcription PCR When reverse transcription PCR is used in gene expression analysis, the expression of specific genes can be roughly quantified.
  • the method can also detect and analyze different isoforms of a single RNA transcript.
  • reverse transcription PCR reverse transcription PCR using exon specific primers is first performed, and if amplification products other than the expected product are detected, the mRNA isoform produced by alternative splicing is analyzed. Can be identified.
  • the method described in Pykett et al. (199 4) Hum. Mol. Genet. 3: 559-64 can be referred to.
  • the present method using the PCR of the present invention is desirable in terms of its speed, high sensitivity, and simplicity. 20
  • the DNA chip is a small array in which oligonucleotides or DNA clones are fixed at high density on the surface of a carrier such as glass.
  • a cDNA clone for each gene of interest or an oligonucleotide specific for the gene is immobilized on a chip to prepare a microarray.
  • RNA is prepared from the dopamine-specific neuron progenitor cells of the present invention or cells differentiated / induced from the cells and subjected to reverse transcriptase treatment to obtain cDNA.
  • the obtained cDNA sample is labeled with a tag such as a fluorescent tag and hybridized to the microarray.
  • a tag such as a fluorescent tag
  • the intensity of the fluorescent signal which means the formation of a hybrid between the labeled cDNA and the cDNA clone or oligonucleotide on the chip, indicates the degree of expression of each sequence in the labeled cDNA, thus enabling quantification of gene expression.
  • mRNA differential display that performs PCR enables the expression of a large number of genes in the dopaminergic neuron progenitor cells of the present invention or cells that have been induced to differentiate from the cells. It can also be analyzed at the same time.
  • a modified oligo dT primer in which one or two base groups at the 3 ′ end are changed in the polyA tail of a specific mRNA is prepared, and the precursor cell of the present invention or a cell differentiated / proliferated from the cell, and expression
  • a reverse transcriptase reaction is performed on total RNA isolated from control cells (Liang et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 3 269-75).
  • mRNA with C immediately before the polyA tail can be selectively amplified, and if it is “CA”, mRNA with TG immediately before can be amplified. it can.
  • the amplified product is electrophoresed on a polyacrylamide gel with a long migration distance and fractionated.
  • SAGE analysis is one of the preferred analysis methods because it can detect the expression of a large number of transcripts simultaneously and does not require a special device for detection.
  • polyANA is extracted from the dopaminergic neuron progenitor cells of the present invention or cells differentiated / induced from the cells by a conventional method.
  • the RA is converted to cDNA using a pyotinylated oligo dT primer and treated with a 4-base recognition restriction enzyme (anchoring enzyme; AE).
  • the AE-treated fragment has a form containing a piotin group at its 3 ′ end.
  • the AE-treated fragment is bound to streptavidin, the bound cDNA is divided into two fractions, and each fraction is ligated to separate double-stranded oligonucleotide adapters (linkers) A and B.
  • This linker is composed of (1) a single-stranded overhang having a sequence complementary to the overhang generated by the action of the anchor enzyme, and (2) an IIS type that serves as a tagging enzyme (TE). 5 'base recognition sequence of restriction enzyme (cleaves at a fixed position 20 bp or less away from the recognition site), and (3) additional sequence sufficient to constitute a specific primer for PCR.
  • the linker-linked cDNA by cleaving the linker-linked cDNA with a tag enzyme, only the cDNA sequence portion becomes a short chain tag in the linker-binding state.
  • two different pools with different linkers are created. Ligate together and PCR amplify using specific primers for linkers A and B. As a result, the amplification product is obtained as a mixture of various sequences including one adjacent sequence tag (ditag) bound to linkers A and B. Therefore, the amplified product is treated with an anchor enzyme, and the released digest portion is ligated in a chain by a normal ligation reaction for cloning.
  • the base sequence of the clone obtained by cloning By determining the base sequence of the clone obtained by cloning, it is possible to obtain a readout of a continuous ditag of a certain length. In this way, the base sequence of the clone is determined. If sequence tag information is obtained, the presence of mRNA corresponding to each tag can be identified.
  • Subtractive hybridization is a method often used for cloning genes that are differentially expressed between various tissues or cells, but the dopaminergic neuron progenitor cells of the present invention, or cells that have been induced / proliferated from them. It can also be used to clone genes that are specifically expressed in
  • test DNA a DNA sample of a cell to be tested among the cells of the present invention is prepared.
  • driver DNA the DNA of the cells to be compared
  • Test DNA and driver DNA can be used in reverse. In any case, the presence of a gene that is present in the test DNA but not in the driver DNA is detected.
  • the prepared test DNA and a large excess of dryper DNA are mixed, denatured into single-stranded DNA, and then annealed.
  • a specific sequence that does not exist in the dripper DNA can be isolated as a double-stranded DNA consisting only of the DNA derived from the test DNA.
  • the RDA method is a method that allows PCR to be used to selectively amplify a sequence in a test DNA that does not exist in the driver DNA, and can be used in the present invention in the same manner as the other methods described above.
  • PCR a method that allows PCR to be used to selectively amplify a sequence in a test DNA that does not exist in the driver DNA, and can be used in the present invention in the same manner as the other methods described above.
  • Genes specific to the dopaminergic neuron progenitor cells detected or isolated as described above, or the cells obtained by differentiating, inducing or proliferating the cells, are firstly vectorized by the various known methods described above. Insertion, sequencing, and expression analysis can also be performed.
  • the present invention provides a screening method comprising the steps of contacting a test substance with the dopaminergic neuron progenitor cells of the present invention, and detecting the differentiation or proliferation of the progenitor cells due to the contact. Since the compound screened by this method has a function of regulating the differentiation and proliferation of dopaminergic neurons, it is a candidate for treatment of diseases caused by any defect in dopaminergic neurons. Can be considered useful.
  • the ⁇ test substance '' may be any compound.
  • Cell differentiation and proliferation can be detected by comparing with the state of the cell when not in contact with the test substance.
  • Cell differentiation and proliferation may be detected by morphological observation under a microscope, or by detecting and quantifying substances such as dopamine produced in the cells.
  • an expression control region of the 65B13 gene is provided.
  • the expression control region of the present invention can be cloned from genomic DNA by a known method using the polynucleotide of the present invention.
  • the transcription start point identification method such as the S1 mapping method (Cell engineering separate volume 8 New cell engineering experiment protocol, Institute of Medical Science, University of Tokyo, Shujunsha (1993) pp. 362- 374 ) Is known and can be used in the present invention.
  • the gene expression control region can be cloned by screening a genomic DNA library using 15 to 100 bp, preferably 30 to 50 bp, as the probe DNA at the 5 'end of the gene. (In the present invention, the sequence 0
  • -42-Number 1 to 176th position of 1 or 1st to 126th base number of SEQ ID NO: 2 or a part thereof. Since the clone thus obtained contains a 5 'untranslated region of lOkbp or more, it is then shortened or fragmented by treatment with exonuclease or the like. Finally, a reporter gene is used to evaluate the presence / absence, strength, control, etc. of the sequence portion containing the shortened expression control region candidate to maintain the activity of the 65B13 expression control region of the present invention. The minimum necessary unit for can be determined.
  • the gene expression control region is a program such as Neural Network (littp: ⁇ w.f itf ly.org./seq tools / promoter.html; Reese et al., Biocoiputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, Hunter and Klein ed , World Scientific Publishing Co., Singapore, (1996)). Furthermore, a program for predicting the minimum activity unit of the expression control region (lit tp: biosci.cbs.umn.edu./sof tware / proscan / promoterscan.htm; Prestridge (1995) J. Mol. Biol. 249: 923- 32) is also known and can be used in the present invention.
  • the 65B13 gene expression region isolated in this way can also be used to produce a desired protein specifically in dopaminergic neuron progenitor cells immediately after mitotic arrest in in.
  • a ligand for the polypeptide of the present invention is provided. Since the polypeptide of the present invention has a transmembrane domain, it is considered that the polypeptide is naturally embedded in a cell membrane. Since it is transiently expressed in dopamine-producing neuronal progenitor cells immediately after mitotic arrest, it may be involved in neuronal maturation. Therefore, ligands that may exhibit functions such as the agonist of the polypeptide of the present invention can be used to control the differentiation of dopamine-producing neurons in vivo and / or ⁇ ? there is a possibility. In identifying a ligand for the polypeptide of the present invention, first, 13420
  • polypeptide of the present invention is contacted with a candidate compound, and the presence or absence of binding is assayed.
  • the polypeptide of the present invention can be immobilized on a carrier or expressed in a state embedded in a cell membrane.
  • candidate compounds gene library expression products, marine organism-derived natural components, extracts of various cells, known compounds and peptides, plant-derived natural components, biological tissue extracts, microorganisms
  • the culture supernatant and a group of peptides J. Mol. Biol. 222: 301-10 (1991) randomly produced by the phage display method and the like are included.
  • the candidate compound may be labeled.
  • FIG. 1 shows the cDNA sequence and amino acid sequence of 65B13-a. The signal sequence and transmembrane region are underlined.
  • FIG. 2 shows the cDNA sequence and amino acid sequence of 65B13-a. The signal sequence and the transmembrane region are underlined. The continuation of Figure 1 is shown.
  • FIG. 3 shows the cDNA sequence and amino acid sequence of 65B13-b. The signal sequence and transmembrane region are underlined.
  • FIG. 4 shows the cDNA and amino acid sequences of 65B13-b. The signal sequence and transmembrane region are underlined. The continuation of Figure 3 is shown.
  • FIG. 5 is a diagram comparing the amino acid sequences of 65B13-a and 65B13_b.
  • FIG. 6 is a schematic diagram of the structure of 65B13.
  • the blackened area indicates the transmembrane region, and Ig indicates the Ig domain.
  • FIG. 7 is a photograph showing the result of analysis of 65B13 mRNA expression in the brain of E12.5 mice by / '/? / Hybridization.
  • A Sagittal section
  • B Parasagittal section.
  • HB hindbrain
  • MB midbrain
  • SC spinal cord
  • CB cerebellar primordium.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of analysis of 65B13 mRNA expression in the E12.5 mouse spinal cord using the ⁇ hybridisation.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of analyzing the expression of 65B13 mRNA and tyrosine hydroxylase (TH) mRNA in the ventral side of the midbrain of E12.5 mice by in w ′ / ff hybridization.
  • FIG. 10 is a schematic diagram showing expression patterns in the midbrain of 65B13.
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing the expression time of 65B13.
  • Fig. 12 is a schematic diagram showing how to isolate and utilize dopaminergic neuron progenitor cells using anti-65B13 antibody.
  • Fig. 13 is a photograph showing the results of analyzing the expression of 65B13 (Cy3), Nurrl (FITC), and TH (Cy5) proteins by immunofluorescence staining using antibodies against each of them.
  • Figure 14 shows staining of a cell group (B) in which dopamine-producing neuron was induced to differentiate from ES cells in the mouse 12.5 days of embryonic midbrain (A) or with mouse 65B13 monoclonal antibody. It is a figure which shows the result of having detected the 65B13 expression cell using the flow cytometry.
  • Example 1 Isolation and sequence analysis of dopaminergic neuron progenitor cell specific gene To isolate dopaminergic neuron progenitor cell specific gene, E12. 5 mouse midbrain ventral and dorsal RNA was used to amplify genes with differential expression by the subtraction (N-RDA) method, and the sequences of the resulting genes were analyzed.
  • N-RDA subtraction subtraction
  • N-RDA method 00 hiring 3420
  • oligonucleotides were annealed and prepared to 100M.
  • ad2A acggaatgatgt (SEQ ID NO: 12)
  • ad3A accagagtctca (SEQ ID NO: 14)
  • ad4S ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt (SEQ ID NO: 15)
  • ad4A acacactcacag (SEQ ID NO: 16)
  • ad5S ccagcatcgagaatcagtgtgacagt (SEQ ID NO: 17)
  • adl3A acgatcgacagt (SEQ ID NO: 20)
  • the ad2S-amplified cDNA was further incubated at 94 ° C for 2 minutes, followed by 5 cycles of PCR for 30 seconds at 94, 30 seconds at 65 ° C, and 2 minutes at 72, and finally 7 2 Incubated at ° C for 2 minutes.
  • CDNA was purified using the Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) and digested with Rsal. 3 ⁇ g was used for each subtraction. ⁇ 4. Tester production
  • the ad2S amplified cDNA was further incubated at 94 ° C for 2 minutes, followed by 5 cycles of PCR at 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally at 72 ° C. Incubated for 2 minutes.
  • CDNA was purified using Qiaquick PCR purification kit (Qiagen) and digested with Rsal.
  • Ad3 was added to 60 ng of Rsal digested cDNA. ⁇ 5. Subtraction 1st time
  • Tester and Driver prepared in 3 and 4 above were mixed, precipitated with ethanol, and dissolved in lxPCR buffer 11. After 5 minutes at 98 ° C, lxPCR buffer + 1 l NaCl was added. After 5 minutes at 98, hybridization was performed at 68 for 16 hours.
  • the hybridized cDNA was incubated for 5 minutes at 72 ° C using ad3S as a primer, and then subjected to 10 cycles of reaction at 94 ° C for 30 seconds, 65 at 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes. Subsequently, it was digested with Mung Bean Nuclease (TAKARA) and purified with Qiaquick PCR purification kit. After further incubation at 94 ° C for 2 minutes, 13 cycles of PCR were performed at 94 ° C for 30 seconds, 65 ⁇ for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally at 72 ° C for 2 minutes. . 13420
  • Subtraction 2xPCR buf fer l ⁇ was added to 8ng of cDNA amplified in the first round. After 98 t 5 min, lxPCR buf ferHM NaCl 2 1 was added. After further 5 minutes at 98 ° C, hybridization was performed at 68 ° C for 16 hours.
  • the hybridized cDNA was digested with Rsal and purified with Qiaquick PCR purification kit. This is a d3S primer94. Incubate for 2 minutes at C, perform 11 cycles of PCR at 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 2 minutes, and finally at 72 ° C for 2 minutes did. Digested with Rsal and added ad4. 1-7. Subtraction 2nd time
  • CDNA 2ng added with adl3 in 8 above was used as a tester and mixed with the driver in 3 above, and subtraction was performed in the same manner as in 5 above.
  • the amplified cDNA was cloned into pCIII (Invitrogen), and the nucleotide sequence was analyzed using an ABI3100 sequence analyzer.
  • RACE was performed by the following method. TJP2003 / 013420
  • RNA from mouse 12.5 day embryonic brain using RNeasy mini kit (Qiagen).
  • MRNA was prepared using ACS mRNA isdolation kit (Miltenyi Biotec). A cDNA library was prepared from the prepared mRNA using the Superscript choice system (Invitrogen) and the pCRII vector (Invitrogen). Plasmid DNA was prepared from this, and PCR was performed using the following primers.
  • TAU2 GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTC (SEQ ID NO: 21)
  • TAU4 CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC (SEQ ID NO: 22)
  • TAD3 AGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG (SEQ ID NO: 23)
  • TAD4 CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG (SEQ ID NO: 24)
  • 65B13 F2 TCCATCTCTCCAAGTGAAGGGTCTTG (SEQ ID NO: 26)
  • PCR conditions were as follows.
  • the nucleotide sequences of the two obtained genes, 65B13_a and 65B13-b, are shown as SEQ ID NO: 1 (FIGS. 1 and 2) and SEQ ID NO: 2 (FIGS. 3 and 4).
  • the coding region of 65B13-a encodes a protein consisting of 700 amino acids, starting from the 177th A of SEQ ID NO: 1 and continuing to the 2278-2280 stop codon.
  • the 17 amino acid residues encoded by the 177th to 228th sequences were signal sequences
  • the 17 amino acid residues encoded by the 1717th to 1767th sequences were transmembrane regions.
  • the coding region of 65B13-b codes for a protein consisting of 650 amino acids starting from the 127th A of SEQ ID NO: 2 to the 2277-2079th stop codon.
  • the 17 amino acid residues encoded by the 127th to 177th sequences were signal sequences, and the 17 amino acid residues encoded by the 1516th to 1566th sequences were transmembrane regions.
  • the amino acid sequences encoded by the 65B13-a and 65B13-b genes are shown as SEQ ID NOs: 3 and 4.
  • 65B13-a and 65B13-b are isoforms by alternative splicing, and 65B13-b has a deletion of 50 amino acids on the N-terminal side of 65B13-a.
  • the protein encoded by the 65B13 gene was considered to be a single transmembrane protein with five Ig domains as shown in Fig. 6 by homology search.
  • mice 12.5 day embryos were embedded with OCT, and fresh frozen sections were prepared. After drying on a slide glass, it was fixed with 4% PFA for 30 minutes at room temperature. After washing with PBS, hybridization (lg / ml DIG-modified RNA probe, 50 formamide, 5xSSC, 1% SDS, 502 / ml yeas t RNA, 50 wg / ml Hepar in) at 65 ° C for 40 hours went. Thereafter, washing (50% formamide, 5 ⁇ SSC, 13 ⁇ 4 SDS) was performed at 65 ° C., and RNase treatment (5 g / ml RNase) was performed at room temperature for 5 minutes. 0. After washing with 2 ⁇ SSC at 65 ° C.
  • 65B13 is the midbrain ventral, cerebellar primordium, posterior It was found to be expressed in the brain and spinal cord (Fig. 7).
  • Ki67 a proliferation marker
  • NCAM a mature marker
  • the ventricular region the ventricular region where Ki 67-positive neural progenitor cells proliferate.
  • 65B13 is expressed, whereas in the mantle layer (man t ie layer; ML) where more mature NCAM-positive progenitor cells exist after mitosis. No expression was observed ( Figure 8). The same applies to areas other than the spinal cord In addition, expression was observed in some cells in VZ. From these expression patterns, 65B13 was considered to be transiently expressed in neural progenitor cells immediately after mitotic arrest.
  • TH tyrosine hydroxylase
  • an anti-65B13 antibody was prepared by the following protocol using the gene sequence encoding the extracellular region of the 65B13 gene, and expression analysis was performed by immunohistochemical staining.
  • a gene sequence encoding the extracellular region of the 65B13 gene was introduced into 293E cells, and the extracellular region of the 65B13 protein was expressed and recovered. After the collected protein was immunized to hamsters, lymphocyte cells were removed and fused with myeloma cells. The fused cells were transplanted into the abdominal cavity of the mouse to obtain ascites, and the anti-65B13 monoclonal antibody was purified.
  • mouse 12.5 day embryos were fixed with 4% A / PBS (-) at 4 for 2 hours, then replaced with 20 sucrose / PBS (-) at 4 ° C, and embedded in OCT . A section having a thickness of 12 ⁇ m was prepared, attached to a slide glass, dried at room temperature for 30 minutes, and again wetted with PBS ( ⁇ ). After that, blocking (Block A PC leakage 00 ⁇ 420
  • Anti-65B13 monoclonal antibody (10ug / mK 2.53 ⁇ 4 block ace / PBS) and anti-TH antibody (Chemicon, 0.7ug / mU 2.5% block ace / PBS) and anti-Nurrl antibody (Santa Cruz, 4ug / ml, 2.5 block ace / PBS) were allowed to react at room temperature for 1 hour, followed by further 4 ° C incubation. 0.
  • Triton X-100 / PBS (-) was washed 4 times at room temperature for 10 minutes.
  • Cy3-labeled anti-hamster IgG antibody, FITC-labeled anti-rabbit IgG antibody, Cy5-labeled anti-mouse IgG antibody (Jackson, 10ug / mK 2.5% Block Ace) were reacted at room temperature for 1 hour, washed in the same manner, and then PBS Washed with (-) at room temperature for 10 minutes and embedded.
  • 65B13-expressing cells were detected by flow cytometry using an anti-65B13 monoclonal antibody.
  • a group of cells containing a dopamine-producing neuron progenitor cell that had been excised from the ventral part of the midbrain from a mouse 12.5 day embryo or that had been induced to differentiate from ES cells in vitro was used as a cell dispersion buffer. After dispersion with (Invitrogen), staining was carried out with anti-65B13 monoclonal antibody (10 ug / ml, 1% urine fetal serum, ImM EDTA / PBS) at 4 for 20 minutes without fixing and permeabilization.
  • a novel gene 65B13 that is specific and transiently expressed in dopamine-producing neuron progenitor cells immediately after mitosis was obtained.
  • 65B13 tissue-derived neuron progenitor cells
  • neuronal progenitor cells immediately after mitotic arrest can be selectively obtained, they can be easily differentiated to the optimal state with in vi / o even when used in the treatment of mature cells. it can.
  • a dopaminergic neuron progenitor cell obtained using the gene of the present invention can be used to isolate a gene that is specifically expressed in the cell.
  • the cells are also useful in developing a medicament for neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease.
  • the early progenitor cells in the formation of neurons called dopamine-producing neuronal progenitors immediately after mitosis, further help to elucidate the various processes involved in the maturation process of neurons. Elucidation of such factors is expected to make a significant contribution to the treatment of neurodegenerative diseases. Furthermore, it can be used for screening for substances that regulate (inhibit or promote) the process using the maturation of the cells as an index.

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Abstract

本発明により、分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的、且つ一過性に発現する新規遺伝子65B13が得られた。細胞における該65B13の発現を指標とすることにより、安全面、生存率及びネットワーク形成能の面でもパーキンソン病を含む神経変性疾患に対する移植治療に適した細胞を選択することが可能となった。

Description

分裂停止後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現している遺伝子 技術分野
本発明は、 分裂停止後のド一パミン産生ニュ一ロンにおいて発現している新規 遺伝子 65B13に関する。 該遺伝子の発現を検出することにより、 パーキンソン病 (PD)等の神経変性疾患の移植治療において用いられるドーパミン産生ニューロン 前駆細胞を効率的に分離することができる。 背景技術
ドーパミン系は、 哺乳動物の脳において重要な運動調節、 ホルモン分泌調節、 情動調節等に関与する非常に重要な系である。 従って、 ド一パミン作動性神経伝 達における異常は、 様々な神経系の障害を引き起こす。 例えば、 パーキンソン病 (PD)は、 中脳黒質のドーパミン産生ニューロンの特異的な脱落が原因で起こる錐 体外路系の神経変性疾患である（HARRISON' S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 第 2巻第 23版， Isselbac er et aL編， McGraw-Hill Inc., NY (1994) pp.227 5 - 7)。 治療法としては、 産生されるドーパミン量の低下を補うために L-D0PA(3， 4-ジヒドロキシフエ二ルァラニン)を経口投与する方法が主として行われているが、 効果の持続性が良くないことが知られている。
最近では失われたドーパミン産生ニューロンを補うために、 ドーパミン産生二 ユーロン前駆細胞を含む 6〜9週齢の中絶胎児の中脳腹側領域を移植する治療法も 試みられている（米国特許第 5690927号； Spencer et al. (1992) N. Engl. J. Me d. 327: 1541-8; Freed et al. (1992) N.Engl. J, Med. 327: 1549-55; Widner et al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1556-63; Kordower et al. (1995) N. En gl. J. Med. 332: 1118-24; Defer et al. (1996) Brain 119: 41-50; Lopez - Loz 03013420
- 2 - ano et al. (1997) Transp. Proc. 29: 977-80)。 しかし、 現在のところ、 この方 法では細胞の供給面、 倫理面 (Rosens tain (1995) Exp. Neurol. 33: 106; Turner et al. (1993) Neurosurg. 33: 1031- 7)で問題があると共に、 感染汚染の危険性、 免疫学的な移植片拒絶 (Lopez- Lozano et al. (1997) Transp. Proc. 29: 977-80; idner and Brudin (1988) Brain Res. Rev. 13: 287-324), 胎児組織が糖分解 よりも脂質代謝に主に依存しているための生存率の低さ（Rosenstein (1995) Exp. Neurol. 33: 106)等の様々な面で問題が指摘されている。
倫理面や供給不足の問題を解決するために、 例えばブタ由来の皮質、 線条、 及 び中脳細胞を用いる方法等も提案されている（例えば、 特表平 10-508487号公報； 特表平 10- 508488号公報;特表平 10-509034号公報参照）。 この方法においては、 細胞表面上の抗原 (MHCクラス I抗原)を改変するという煩雑な操作が必要とされ る。 そこで、 中絶胎児由来の細胞に代えて、 胚性幹細胞 (ES)細胞、 骨髄間質細胞 などの非神経系細胞からの in vitroにおけるド一パミン産生ニューロンの分化系 の利用が有望視されている。 将来的には ES細胞若しくは患者本人の持つ神経幹細 胞からの再生治療の重要性が増してくるものと思われる。 移植片拒絶を解消する 方法としては、 例えば、 セルト一リ細胞を同時に移植することにより、 局在的に 免疫抑制する方法も提案されている（特表平 11-509170号公報;特表平 11-501818 号公報； Sdawry and Cameron (1993) Cell Transplant 2: 123-9)。 MHCがマッチ する血縁者、 他人の骨髄、 骨髄バンク、 及び臍帯血バンク等から移植細胞を得る ことも可能であるが、 患者自身の細胞を用いることができれば、 余計な操作や手 間なしに拒絶反応の問題も解決することができる。
その他、 問題となるのは、 ニューロン前駆細胞が不均一な細胞集団へと分化す る可能性がある点である。 パーキンソン病の治療においては、 カテコールアミン 含有二ユーロンの中でもドーパミン産生二ユーロンを選択的に移植することが必 要である。 これまで、 パーキンソン病の治療に用いることが提案されている移植 細胞としては、 線条体 (Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 6: 615-31 ； i T JP2003/013420
- 3 - dner et al . (1992) N. Engl . J. Med. 327 : 1556-63)、 ヒト胎児神経由来の不死 化セルライン (特表平 8 - 509215号公報；特表平 11-506930号公報；特表 2002- 522 070.号公報)、 NT2Z細胞の有糸分裂後ヒトニユーロン (特表平 9-5050554号公報)、 ニューロン始原細胞 (特表平 11-509729号公報)、 ドーパミン等のカテコールアミ ンを産生するように外来遺伝子によりトランスフエクトされた細胞、 骨髄スト口 マ細胞 (特表 2002-504503号公報;特表 2002-513545号公報)等が挙げられる。 しか しながらいずれも、 ドーパミン産生二ュ一ロンまたはドーパミン産生ニュ一ロン へと分化する細胞のみを含むものではない。
未分化な細胞集団からドーパミン産生ニューロンを選択的に濃縮 ·分離する方 法としては、 ドーパミン産生ニューロンで発現するチロシンヒドロキシラーゼ等 の遺伝子のプロモーター/ェンハンサ一の制御下で蛍光蛋白質を発現するレポ一 夕一遺伝子を細胞集団の各細胞に導入し、 蛍光を発する細胞を分離することによ り、 ドーパミン産生ニューロンを生きたまま可視化して濃縮 '分離、 または同定 する方法 (特開 2002-51775号公報)が提案されている。 この方法は、 外来遺伝子の 導入という工程を不可欠とするものであり、 さらに、 遺伝子治療に用いることを 目的とする場合、 レポーター遺伝子の存在は毒性、 免疫原性の面からも問題であ る。 発明の開示
現時点での PD移植治療における大きな問題の一つは、 中絶胎児の中脳腹側領域 あるいは in vi troで分化誘導したドーパミン産生ニューロン前駆細胞は、 いずれ も多種の細胞の混合物である点である。 神経回路形成における安全性を考えると， 目的の細胞種のみを分離してから用いるのが望ましく、 また腫瘍形成の危険性を 考慮すれば、 分裂停止後の神経細胞を分離してから使用することが良いと考えら れる。 さらに、 細胞の移植先の脳内での生存や、 正しくネットワーク形成する能 力を考えると、 より早期の前駆細胞を分離することにより治療効果を増大させ得 ると期待される。 そこで、 本発明者は、 ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異 的な遺伝子の単離を試みた。
ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、 E12. 5 マウス中脳腹側と背側の RNAを用いてサブトラクション法 (N-RDA; representat ion al di f ference analys i s法; RDA法 (Li s tsyn NA (1995) Trends Genet. 11 : 303-7) を改良（ 「DNA断片の量の均一化方法及びサブストラクシヨン法」 特願 2001-18475 7 (出願日 2001/6/19) )により発現に差のある遺伝子を増幅し、 増幅された遺伝子 の配列解析を行った。 その結果、 新規遺伝子として 65B13が得られた。 該遺伝子 の全長配列を RACE法により決定した結果、 2つのアルタナティプアイソフォーム が得られ、 各々、 65B13-a及び 65B13- bと名付けた。 夫々の塩基配列を配列番号： 1及び 2として、 そして、 各塩基配列によりコードされる蛋白質のアミノ酸配列 を配列番号： 3及び 4として記載する（図 1〜4)。
そして、 これらの遺伝子を用いた //? 5 ひハイブリダィゼ一シヨンによる発現 解析の結果と、 脊髄における増殖マーカ一である Ki 67及び成熟マ一カーである N CAMと比較した結果得られた発現パターンから、 65B13は分裂停止直後の神経前駆 細胞で一過性に発現するものと考えられた。 さらに、 中脳での発現をドーパミン 産生ニューロンのマーカ一遺伝子であるチロシンヒドロキシラーゼ（tyros ine hyd roxyl ase ; TH)の発現と比較したところ背-腹軸方向での発現領域が完全に一致し ており、 65B13は、 中脳では分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞 に特異的、 且つ一過性に発現すると考えられた（図 10及び 11)。
また、 in s i tuハイブリダィゼーシヨンの結果は、 抗 65B13抗体を用いる免疫 染色により裏付けられた （図 13) 。 さらに、 抗 65B13抗体を用いたフローサイト メトリーにより 65B13発現細胞の集団を効率的に分離することができた （図 14) , 上述の結果から、 抗 65B13抗体を用いることにより、 中脳腹側領域または V 7· / 0で分化誘導したドーパミン産生ニュ一ロンを含む培養培地から、 65B13発現 細胞を分離することにより純粋な初期のドーパミンニューロン前駆細胞を得るこ 3 013420
- 5 - とができるものと考えられる。 そして、 このようにして得られた細胞は、 分裂停 止後の前駆細胞のみが分離されたものであり'、 且つ目的の細胞種のみが分離され ていることから、 移植治療に用いた場合であっても安全性が高く、 また、 最も初 期の前駆細胞が用いられることから生存率、 ネットワーク形成能等の面でも高い 治療効果が期待される。 また、 分裂直後の初期の前駆細胞で最高の治療効果が得 られず、 細胞を成熟した状態で利用することが求められる場合であっても、 本方 法により得られた初期の前駆細胞を in 7' 0で最適な分化段階へ培養により成熟 させればよいことから、 目的とする移植治療に適した分化段階の材料を容易に調 製することが可能となる（図 12)。
さらに、 純粋なド一パミン産生ニューロン前駆細胞は、 ドーパミン産生ニュー 口ン前駆細胞及び前駆細胞からニューロンまでの各成熟段階に特異的な遺伝子の 単離、 PD治療のターゲット探索等にも有効である。 また、 本発明の方法により、 最も初期の前駆細胞が得られることから、 ド一パミン産生ニューロンの成熟過程 の解明、 成熟を指標としてスクリーニング系等へ利用することもできる。
より具体的には、 本発明は
[1] 分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現する 65B
13ポリペプチド、 またはその抗原性断片をコードする以下の ω〜ωのヌ クレオチド配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド。
(1)配列番号： 1の 177から 2280番目の塩基、 若しくは配列番号： 2の 127番 目から 2079番目の塩基を含む核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配 列
(2)配列番号: 3若しくは 4記載のアミノ酸配列をコ一ドする核酸配列、 また は該核酸配列に相補的な配列
(3)配列番号: 3若しくは 4記載のアミノ酸配列においてシグナル配列部分を 欠く配列をコードする核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配列
(4)配列番号: 3または 4記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のァ 03 013420
- 6 - ミノ酸が欠失、 挿入、 置換、 または付加されたアミノ酸配列をコードす る核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配列
(5)上記 ωの配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする 核酸配列、
[2] [1]記載のポリヌクレオチドを含むベクター、
[3] [1]記載のポリヌクレオチドまたは [2]記載のベクターを含む宿主細胞、
[4] [1]記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリぺプチド、
[5] [4]記載のポリペプチドの断片であり、 少なくとも 8アミノ酸残基を有する ポリペプチド断片、
[6] [4]記載のポリペプチド、 または [5]記載のポリペプチド断片に対する抗体、 [7] [5]記載のポリぺプチド断片をコードするヌクレオチド鎖、
[8] ドーパミン産生ニューロンを選択する方法であり、 [6]記載の抗体とドーパ ミン産生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させるェ 程を含む方法、
[9] ドーパミン産生ニューロンを選択する方法であり、 [4]記載のポリペプチド の少なくとも細胞外領域部分を含むぺプチドとドーパミン産生ニューロン前 駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含む方法、
[10] [8]または [9]記載の方法により選択された分裂停止直後のド一パミン産生 ニューロン前駆細胞、
[11] ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子及び前駆細胞からド一パ ミン産生ニューロンへの各成熟段階に特異的な遺伝子の単離方法であって、 [10]記載の前駆細胞または該前駆細胞から分化、 誘導若しくは増殖された 細胞を用い、 該細胞において特異的に発現している遺伝子を検出、 単離す る工程を含む方法、 並びに
[12] 成熟を指標としたスクリーニング方法であり、 [10]記載の前駆細胞に対し、 被験物質を接触させる工程、 及び接触による前駆細胞の分化または増殖を T JP2003/013420
- 7 - 検出する工程を含む方法、
に関する。
<ポリヌクレオチド >
本発明のポリヌクレオチドは、 ドーパミン産生ニューロン前駆細胞を選択する のに用いることができる抗体を作成する際の抗原を遺伝子工学的手法により得る 際に使用することができる。 本発明のポリヌクレオチドは、 分裂停止直後のド一 パミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現する 65B13ポリペプチドをコ一ド する、 配列番号： 1 (図 1及び 2)の 177から 2280番目の塩基、 若しくは配列番号： 2 (図 3及び 4)の 127番目から 2079番目までの塩基を含む核酸配列、 または該核酸 配列に相補的な配列を含むものである。
ここで、 「ポリヌクレオチド」 とは、 複数のデォキシリポ核酸 (DNA)またはリポ 核酸 (RNA)等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、 DNA、 cDNA、 ゲノム DNA、 化学合成 DNA及び RNAを含む。 また、 天然以外の塩基、 例えば、 4-ァセチルシチ ジン、 5 -（カルボキシヒドロキシメチル）ゥリジン、 2， _0 -メチルシチジン、 5 -力 ルポキシメチルァミノメチル -2 -チォゥリジン、 5 -カルボキシメチルァミノメチル ゥリジン、 ジヒドロウリジン、 2 ' -0-メチルプソィドウリジン、 ）3 - D-ガラクトシ ルキユエオシン、 ， -0 -メチルグアノシン、 イノシン、 N6-イソペンテニルアデノ シン、 1 -メチルアデノシン、 1 -メチルプソィドウリジン、 1 -メチルグアノシン、 1 -メチルイノシン、 2, 2-ジメチルグアノシン、 2-メチルアデノシン、 2 -メチルダ ァノシン、 3-メチルシチジン、 5-メチルシチジン、 N6 -メチルアデノシン、 7 -メチ ルグアノシン、 5 -メチルアミノメチルゥリジン、 5-メトキシァミノメチル -2 -チォ ゥリジン、 /3 -D-マンノシルキユエオシン、 5-メトキシカルポニルメチル- 2-チォ ゥリジン、 5-メトキシカルポニルメチルゥリジン、 5-メトキシゥリジン、 2-メチ ルチオ - N6-イソペンテニルアデノシン、 N -（（9- /3 - D-リボフラノシル- 2-メチルリ ォプリン -6-ィル）力ルバモイル）トレオニン、 N- ( (9- /3 -D-リポフラノシルプリン - JP2003/013420
- 8 -
6 -ィル) N-メチルカルバモイル）トレオニン、 ゥリジン- 5-ォキシ酢酸-メチルエス テル、 ゥリジン- 5ォキシ酢酸、 ワイブトキソシン、 プソィドウリジン、 キユエォ シン、 2-チオシチジン、 5-メチル -2-チォゥリジン、 2-チォゥリジン、 4-チォゥリ ジン、 5-メチルゥリジン、 N-( (9 - /3 -D-リポフラノシルプリン- 6 -ィル）力ルバモイ ル）トレオニン、 2' -0-メチル -5-メチルゥリジン、 2' -0-メチルゥリジン、 ワイ ブトシン、 3-(3-ァミノ- 3-カルポキシプロピル）ゥリジン等を必要に応じて含むポ リヌクレオチドも包含する。
さらに、 本発明のポリヌクレオチドは、 分裂停止直後のドーパミン産生ニュー ロン前駆細胞に特異的に発現する 65B13ポリペプチドをコードする、 配列番号 3 : 若しくは 4(各々図 1、 2若しくは図 3、 4、 または図 5参照)記載のアミノ酸配列を コードする核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配列を含む。 このようなアミ ノ酸配列をコードする核酸配列は、 配列番号： 1及び 2に記載された核酸配列に加 えて、 遺伝子暗号の縮重により配列番号: 1及び 2記載の配列とは異なる核酸配列 を含むものである。 本発明のポリヌクレオチドを遺伝子工学的な手法によりポリ ペプチドを発現させるのに用いる場合、 使用する宿主のコドン使用頻度を考慮し て、 発現効率の高いヌクレオチド配列を選択し、 設計することができる（Grantham ei al . (1981) Nucleic Acids Res. 9 : 43-74) 0 本発明のポリヌクレオチドはま た、 配列番号: 3または 4記載のアミノ酸配列において、 シグナル配列部分を欠く 配列をコードする核酸配列を含むものを包含する。 配列番号： 3及び 4記載のアミ ノ酸配列では、 最初の 17アミノ酸残基がシグナル配列に該当する。
本発明のポリヌクレオチドは、 さらに、 分裂停止直後のド一パミン産生ニュー ロン前駆細胞に特異的に発現する 65B13ポリべプチド、 またはその抗原性断片を コードする、 配列番号： 3若しくは 4のアミノ酸配列において 1若しくは複数個の アミノ酸が欠失、 揷入、 置換または付加されたアミノ酸配列をコードする核酸配 列、 または該核酸配列に相補的な配列を含む。 1若しくは複数個のアミノ酸が欠 失、 揷入、 置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ポリペプチドで、 元 20
- 9 - のポリペプチドと同じ生物学的活性が維持されることは公知である（Mark et al. (1984) Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 81 : 5662-6 ; Zol ler and Smi th (1982) Nuc leic Acids Res. 10: 6487-500; Wang et al. (1984) Science 224: 1431-3; Dal badie-McFarland et al. (1982) Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 79 : 6409-13) 0 ここで、 アミノ酸の置換とは、 配列中のアミノ酸残基の一つ以上が、 異なる種 類のアミノ酸残基に変えられた変異を意味する。 このような置換により本発明の ポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を改変する場合、 蛋白質の機 能を保持することが必要な場合には、 保存的な置換を行うことが好ましい。 保存 的な置換とは、 置換前のアミノ酸と似た性質のアミノ酸をコードするように配列 を変化させることである。 アミノ酸の性質は、 例えば、 非極性アミノ酸 (Ala, l ie, Leu, Met, P e, Pro, Trp, Val)、 非荷電性アミノ酸 (Asn， Cys, Gin, Gly, Ser, T r, Tyr)、 酸性アミノ酸 (Asp， Glu) , 塩基性アミノ酸 (Arg， His, Lys)、 中性ァ ミノ酸 (Ala, Asn, Cys, Gin, Gly, He, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, T yr， Val)、 脂肪族アミノ酸 (Ala， Gly) , 分枝アミノ酸（l ie, Leu, Val)、 ヒドロキ シアミノ酸 (Ser, Thr) , アミド型アミノ酸 (Gln， Asn)、 含硫アミノ酸 (Cys, Met) , 芳香族アミノ酸 (His, Phe, Trp, Tyr)、 複素環式アミノ酸 (His, Trp) , イミノ酸 (Pro, 4Hyp)等に分類することができる。 中でも、 Ala、 Val、 Leu及び l ieの間、 Ser及び Thrの間、 Asp及ぴ Gluの間、 Asn及び Ginの間、 Lys及び Argの間、 Phe 及び Tyrの間の置換は、 蛋白質の性質を保持する置換として好ましい。 変異され るアミノ酸の数及び部位は特に制限されず、 該ポリヌクレオチドによりコードさ れるアミノ酸が 65B13の抗原性を有していれば良い。
このような配列番号: 3または 4のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のァ ミノ酸が欠失、 挿入、 置換または付加されたアミノ酸配列をコードするポリヌク レオチドは、 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』 （Cold Spring Harbor Press (1989))、 『Current Protocols in Molecular Biology』 (John Wi ley & Sons (1987- 1997)；特に Sect ion8. 1- 8. 5)、 Hashimoto- Goto et al. (1995) - 1 o -
Gene 152 : 271-5, Kunkel (1985) Proc. Nat l. Acad. Sci . USA 82 : 488—92、 Kr amer and Fri tz (1987) Method. Enzymol . 154 : 350-67、 Kunkel (1988) Method.
Enzymol . 85 : 2763- 6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製す ることができる。
さらに、 本発明のポリヌクレオチドは、 分裂停止直後のド一パミン産生ニュー ロン前駆細胞に特異的に発現する 65B13ポリペプチド、 またはその抗原性断片を コードする、 配列番号： 1の 177から 2280番目の塩基、 若しくは配列番号： 2の 12 7番目から 2079番目の塩基を含む核酸配列または該核酸配列に相補的な配列に対 してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列、 を含むポリヌク レオチドである。 本発明の実施例では、 配列番号： 1及び 2記載の 2種類の配列を 有する 65B13のァイソフォームが得られているが、 その他にもアルタナティプア イソフォーム、 及びァレリック変異体が存在する可能性があり、 そのようなアイ ソフォームゃァレリック変異体も本発明のポリぺプチドに含まれる。 このような ポリヌクレオチドは、 配列番号： 1の 177から 2280番目の塩基、 または配列番号： 2の 127番目から 2079番目の塩基を含む核酸配列からなるポリヌクレオチドをプ ローブとして、 コロニ一ハイブリダィゼ一シヨン、 プラークハイブリダィゼ一シ ヨン、 サザンブロット等の公知のハイブリダィゼーシヨン法により、 ヒト、 マウ ス、 ラット、 ゥサギ、 ハムスター、 ニヮトリ、 ブタ、 ゥシ、 ャギ、 ヒッジ等の動 物の cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリ一から得ることができる。 cDNAラ イブラリーの作成方法については、 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』 (Cold Spr ing Harbor Press (1989) )を参照することができる。 また、 市 販の cDNAライブラリー及びゲノムライブラリ一を用いてもよい。
より具体的に、 cDNAライブラリーの作製においては、 まず、 本発明のポリヌク レオチドを発現する細胞、 臓器、 組織等からグァニジン超遠心法 (Chi rwin et al . (1979) Biochemi s try 18 : 5294-9)、 AGPC法（Chomczynski and Sacchi (1987) A nal . Bi ochem. 162 : 156- 9)等の公知の手法により全 RNAを調製し、 mRNA Pur i i ic ation Kit (Pharmacia)等を用いて] nRNAを精製する。 QuickPrep mRNA Purificatio n Kit (Pharmacia)のような、 直接 mRNAを調製するためのキットを利用してもよ い。 次に得られた mRNAから逆転写酵素を用いて cDNAを合成する。 AMV Reverse T ranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (生化学工業）のような cMA合成 のためのキットも市販されている。 その他の方法として、 cDNAは PCRを利用した 5， - RACE法 (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998-900 2; Belyavsky et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2919 - 32)により合成、 及 び増幅させてもよい。 また、 全長率の高い cDNAライブラリーを作製するために、 オリゴキャップ法（Maruyama and Sugano (1994) Gene 138: 171-4; Suzuki (199 7) Gene 200: 149- 56)等の公知の手法を採用することもできる。 上述のようにし て得られた cDNAは、 適当なベクタ一中に組み込む。
本発明におけるハイブリダィゼ一シヨン条件としては、 例えば 「2XSS 0.1% SDS、 50 」 、 「2XSSC、 0.1%SDS、 421」 、 「1XSS 0.1%SDS、 37°C」 、 より ストリンジエンドな条件としては、 例えば 「2XSSC、 0.1%SDS, 65°C」 、 「0.5X SSC、 0.1%SDS、 42°C」 、 「0.2XSS (：、 0.1%SDS、 65^」 等の条件を挙げることが できる。 より詳細には、 Rapid- hyb buffer (Amersham Life Science)を用いた方法 として、 68°Cで 30分以上プレハイブリダィゼーシヨンを行った後、 プローブを添 加して 1時間以上 68°Cに保ってハイブリッド形成させ、 その後、 2XSSC、 0.1 S DS中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 1XSS (：、 0.1%SDS中、 37°Cで 20分の洗浄を 3 回、 最後に、 1XSSC、 0.1%SDS中、 5(TCで 20分の洗浄を 2回行うことも考えら れる。 その他、 例えば Expresshyb Hybridization Solution (CL0NTECH)中、 55°C で 30分以上プレハイブリダィゼ一シヨンを行い、 標識プローブを添加し、 37〜5 5°Cで 1時間以上インキュベートし、 2XSS (：、 0.1%SDS中、 室温で 20分の洗浄を 3回、 1XSSC、 0.1%SDS中、 37。Cで 20分の洗浄を 1回行うこともできる。 ここで、 例えば、 プレハイプリダイゼーシヨン、 ハイブリダィゼーシヨンや 2度目の洗浄 の際の温度を上げることにより、 よりストリンジェントな条件とすることができ る。 例えば、 プレハイブリダイゼ一ション及びハイブリダイゼ一ションの温度を 60で、 さらにストリンジェントな条件としては 68でとすることができる。 当業者 であれば、 このようなバッファ一の塩濃度、 温度等の条件に加えて、 その他のプ ローブ濃度、 プローブの長さ、 反応時間等の諸条件を加味し、 本発明の実施例に おいて得られたマウス 65B13のァイソフォーム、 ァレリック変異体、 及び対応す る他種生物由来の遺伝子を得るための条件を設定することができる。
ハイブリダィゼーシヨン法の詳細な手順については、 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.』 (Cold Spring Harbor Press (1989)；特に Sect ion9. 47-9. 58) 、 『Current Protocols in Molecular Biology』 (John Wi ley & Sons (1987-1997)；特に Sect ion6. 3-6.4)、 『DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Pra ct ical Approach 2nd ed,』 (Oxford Univers i ty (1995)；条件については特に Sect i on2. 10)等を参照することができる。 ハイブリダィズするポリヌクレオチドとし ては、 配列番号： 1の 177から 2280番目の塩基、 または配列番号： 2の 127番目か ら 2079番目の塩基を含む核酸配列に対して少なくとも 50%以上、 好ましくは 7 0%、 さらに好ましくは 80%、 より一層好ましくは 90% (例えば、 95%以上、 さら には 99%)の同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。 こ のような同一性は、 BLASTアルゴリズム（Al t schul (1990) Proc. Nai l . Acad. Sc i. USA 87: 2264-8; Karl in and Al tschul (1993) Proc. Nat l . Acad. Sci. USA 90 : 5873 - 7)によって決定することができる。 このアルゴリズムに基づいたプログ ラムとして、 アミノ酸配列についての同一性を決定するプログラムとしては BLAS Π、 ヌクレオチド配列については BLASTN (Al tschul et al. (1990) J. Mol . Biol. 215 : 403- 10)等が開発されており、 本発明の配列に対して使用することができる < 具体的な解析方法については、 例えば、 ht tp://v . ncbi . nlm. ni . ov.等を参照 することができる。
その他、 遺伝子増幅技術 (PCR) (Current Protocols in Molecular Biology, J oh n Wi ley & Sons (1987) Sect ion 6. 1- 6.4)により、 65B13のァイソフォームゃァ 20
- 1 3 - レリック変異体等、 65B13と類似した構造及び機能を有する遺伝子を、 配列番号： 1及び 2に記載のヌクレオチド配列を基にプライマ一を設計し、 ヒト、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ハムスター、 ニヮトリ、 プタ、 ゥシ、 ャギ、 ヒッジ等の動物の cDNAライブラリ一及びゲノムライブラリ一から得ることができる。
例えば、 BLASTサーチの結果、 本発明のマウス 65B13のヌクレオチド配列に対 して 84%の同一性を有する 3つの機能不明のヒト配列 （GenBank Accession No.： XM— 048304, AL136654，BC007312 ;各ヌクレオチド配列を配列番号： 5、 7、 9、 また該 ヌクレオチド配列から予測されるアミノ酸配列を配列番号: 6、 8、 10として記載 する） は、 マウス 65B13に対するヒトホモログであると考えられる。 このような ヒトホモログは、 本発明の方法により、 ヒトドーパミン産生ニューロン前駆細胞 の選択に使用することができる。 これらの配列は、 記録されている情報から、 全 て第 19染色体上の同じ遺伝子由来の配列と考えられる。 そのうち、 配列番号: 7 に示す AL136654と配列番号： 9に示す BC007312の 2つは cDNA断片であり、 もう 一つの配列番号： 5に示す XMJH8304は、 ゲノム配列から予測された mRNA配列と 考えられた。 これらの予測配列には、 本発明の 65B13とほぼ同じ大きさの 0RFが あり、 予測されたアミノ酸配列の 65B13との同一性は 84%であった。
本発明のポリヌクレオチドの塩基配列の確認は、 慣用の方法により配列決定す ることにより行うことができる。 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェーン夕一 ミネーシヨン法 (Sanger et al. (1977) Proc. Nai l. Acad. Sci. USA 74: 5463) 等により行うことができる。 また、 適当な DNAシ一クェンサ一を利用して配列を 解析することも可能である。
<ヌクレオチド鎖 >
さらに、 本発明により、 本発明のポリヌクレオチドに相補的な、 少なくとも 15 塩基からなるヌクレオチド鎖が提供される。 ここで 「相補的な配列」 とは、 ヌク レオチド配列中の少なくとも 15個の連続した塩基が铸型に対して完全に対になつ 2003/013420
- 1 4 - ている場合のみならず、 そのうちの少なくとも 70%、 好ましくは 80%、 より好ま しくは 90%、 さらに好ましくは 95%以上 (例えば、 97%または 99%)が対になつ ているものも含む。 対になっているとは、 铸型となるポリヌクレオチドの塩基配 列中の Aに対し T (R Aの場合は U)、 Tまたは Uに対し A、 Cに対し G、 そして Gに 対し Cが対応して鎖が形成されていることを意味する。 そして相同性は、 上述の ハイプリダイズするポリヌクレオチドの場合と同様の方法で決定することができ る。
このような本発明のヌクレオチド鎖は、 本発明のポリヌクレオチドを検出また は単離するためのプローブ、 増幅するためのプライマーとして利用することがで きる。 通常、 プローブとして使用する場合には 15〜100、 好ましくは 15〜35個の 塩基より構成されていることが望ましく、 プライマーとして使用する場合には、 少なくとも 15、 好ましくは 30個の塩基より構成されていることが望ましい。 プ ライマーの場合には、 3' 末端側の領域を標的とする配列に対して相補的な配列に、 5' 末端側には制限酵素認識配列、 タグ等を付加した形態に設計することができる。 本発明のヌクレオチド鎖は、 本発明のポリヌクレオチドに対してハイブリダィズ することができる。 さらに、 これらのプロ一ブまたはプライマーを用いて、 細胞 内における本発明のポリヌクレオチドの変異を検出することができる。 このよう な変異は、 場合により本発明のポリペプチドの活性、 または発現の異常を引き起 こすものであることから、 疾病の診断等に有用と考えられる。
また、 本発明のヌクレオチド鎖には、 本発明のポリヌクレオチドの細胞内にお ける発現を mR Aまたは DNAに対して結合することにより抑制するアンチセンス核 酸、 及び、 mRNAを特異的に開裂することにより阻止するリポザィムが含まれる。 アンチセンスが標的遺伝子の発現抑制作用の機構としては、 (1) 3重鎖形成によ る転写開始阻害、 （2)RNAポリメラーゼにより形成される局所的開状ループ構造部 位とのハイプリッド形成による転写抑制、 （3)合成中の RNAとのハイプリッド形成 による転写阻害、 （4)イントロン-ェキソン接合点におけるハイブリツド形成によ るスプライシング抑制、 （5)スプライソゾーム形成部位とのハイプリッド形成によ るスプライシング抑制、 （6)mR Aとのハイプリッド形成による、 mRNAの細胞質へ の移行抑制、 （7)キヤッビング部位またはポリ A付加部位とのハイプリッド形成に よるスプライシング抑制、 （8)翻訳開始因子結合部位とのハイプリッド形成による 翻訳開始抑制、 （9)リボソーム結合部位との八イブリツド形成による翻訳抑制、 (1 0) mRNA翻訳領域またはポリソ一ム結合部位とのハイブリツド形成によるペプチド 鎖の伸長抑制、 並びに（11)核酸と蛋白質の相互作用部位との八イブリツド形成に よる遺伝子発現抑制が挙げられる (平島及び井上『新生化学実験講座 2 核酸 IV 遺伝子の複製と発現』 日本生化学会編、 東京化学同人、 PP. 319-347 (1993))。 本発明のヌクレオチド鎖に含まれるアンチセンス核酸は、 上述の（1)〜（11)のど の機構により遺伝子発現を抑制する核酸であってもよく、 即ち、 発現を阻害する 目的の遺伝子の翻訳領域のみならず、 非翻訳領域の配列に対するアンチセンス配 列を含むものであってもよい。 アンチセンス核酸をコードする DNAは、 その発現 を可能とする適当な制御配列下に連結して使用され得る。 アンチセンス核酸は、 標的とする遺伝子の翻訳領域または非翻訳領域に対して完全に相補的である必要 はなく、 効果的に該遺伝子の発現を阻害するものであればよい。 このようなアン チセンス核酸としては、 少なくとも 15bp以上、 好ましくは lOObp以上、 さらに好 ましくは 500bp以上であり通常 3000bp以内、 好ましくは 2000bp以内、 より好ま しくは lOOObp以内の鎖長を有し、 標的遺伝子の転写産物の相補鎖に対して好まし くは 90%以上、 より好ましくは 95 %以上同一である。 このようなアンチセンス核 酸は、 本発明のポリヌクレオチドを基に、 ホスホロチォネート法 (S tein (1988) N ucleic Acids Res. 16 : 3209- 21)等により調製することができる。
リポザィムとは、 RNAを構成成分とする触媒の総称であり、 大きくラージリポ ザィム（l arge r ibozyme)及びスモールリポザィム（smal l l iboyme)に分類される。 ラージリポザィムは、 核酸のリン酸エステル結合を切断し、 反応後に 5 ' -リン酸 と 3' -ヒドロキシル基を反応部位に残す酵素である。 ラージリボザィムは、 さら に（1)グアノシンによる 5' -スプライス部位でのトランスエステル化反応を行う グループ Iイントロン RNA、 (2)自己スプライシングをラリァット構造を経る二段 階反応で行うグループ IIイントロン R A、 及び (3)加水分解反応による tRNA前駆 体を 5' 側で切断するリポヌクレアーゼ Pの RNA成分に分類される。 それに対し て、 スモ一ルリポザィムは、 比較的小さな構造単位 (40bp程度)であり、 RNAを切 断して、 5' -ヒドロキシル基と 2' -3' 環状リン酸を生じさせる。 スモ一ルリポ ザィムには、 ハンマーヘッド型 (Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225), ヘアピン型（Buzayan (1986) Nature 323: 349; Kikuc i and Sasaki (1992) Nucl eic Acids Res. 19: 6751; 菊地洋（1992)化学と生物 30: 112)等のリポザィムが 含まれる。 リポザィムは、 改変及び合成が容易になため多様な改良方法が公知で あり、 例えば、 リポザィムの基質結合部を標的部位の近くの RNA配列と相捕的と なるように設計することにより、 標的 RNA中の塩基配列 I：、 UUまたは UAを認識 して切断するハンマ一ヘッド型リポザィムを作ることができる（Koizumi et al. (1988) FEBS Lett. 228: 225; 小泉誠及び大塚栄子（1990)蛋白質核酸酵素 35: 21 91; Koizumi et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7059)。 ヘアピン型のリポ ザィムについても、 公知の方法に従って設計、 製造が可能である（Kikuchi and Sa saki (1992) Nucleic Acids Res. 19: 6751; 菊地洋（1992)化学と生物 30: 112) < 本発明のヌクレオチド鎖に含まれるアンチセンス核酸及びリポザィムは、 細胞 内における遺伝子の発現を制御するために、 レトロウイルス、 アデノウイルス、 アデノ随伴ウィルス等のウィルス由来のベクタ一、 リボソーム等を利用した非ゥ ィルスべクタ一、 または naked DNAとして WTO法または//? WTO法により遺 伝子治療に用いることもできる。
本発明のヌクレオチド鎖の塩基配列の確認は、 上述のポリヌクレオチドと同様 の方法により行うことができる。 13420
- 1 7 - 本発明により、 本発明のポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。 本発 明のベクターは、 本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞内に保持したり、 該ポリ ヌクレオチドにコードされるポリペプチドを発現させたりするのに有用である。 本ベクターには、 プラスミド、 コスミド、 ウィルス、 バクテリオファ一ジ、 クロ 一二ング用べクタ一、 発現ベクター等の種々のベクターが含まれる（Molecular C1 oning, A Laboratory Manual 2nd ed.， Cold Spring Harbor Press (1989)； Curre nt Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1987))。 好ましい態 様においては、 ベクターを導入した宿主細胞内で本発明のポリヌクレオチドが発 現されるように制御配列下に結合する。 ここで 「制御配列」 とは、 宿主細胞が原 核生物であればプロモーター、 リボソーム結合部位、 及びターミネータ一を含み、 真核生物の場合は、 プロモーター及びターミネータ一であり、 場合によってトラ ンスァクチべ一夕一、 転写因子、 転写物を安定化するポリ Aシグナル、 スプライ シング及ぴポリアデニル化シグナル等が含まれる。 このような制御配列は、 それ に連結されたポリヌクレオチドの発現に必要とされるすべての構成成分を含むも のである。 また、 本発明のベクタ一は、 好ましくは選択可能なマーカーを含む。 さらに、 細胞内で発現されたポリペプチドを小胞体内腔、 グラム陰性菌を宿主と する場合ペリブラズム内、 または細胞外へと移行させるために必要とされるシグ ナルぺプチドを目的のポリぺプチドに付加するようにして発現ベクターへ組み込 むこともできる。 このようなシグナルペプチドは、 天然において 65B13に付加し ている 17アミノ酸残基からなる、 または異種蛋白質由来のシグナルペプチドであ つてもよい。 さらに、 必要に応じリンカ一の付加、 開始コドン (ATG)、 終止コドン (TM、 TAGまたは TGA)の挿入を行ってもよい。
本発明のベクターは、 好ましくは発現べクタ一である。 「発現ベクター」 とは、 in vitroで、 目的とする宿主細胞内で発現ベクター中にコードされるポリべプチ ドを発現することができる構築物を指す。 クロ一エングべクタ一、 バイナリーべ クタ一、 インテグレイティングベクタ一等が本発明の発現ベクターに含まれる。 発現の過程には、 発現ベクター中のコード配列の翻訳可能な] n NAへの転写、 及び mRNAから本発明のポリペプチドへの翻訳、 さらに場合によっては発現されたポリ ぺプチドの小胞体内腔、 ペリブラズムまたは細胞外への分泌が含まれる。
in W/r におけるポリペプチドの発現を可能にするベクタ一としては、 BEST (Promega)を例示することができる。 また、 . 等の原核細胞宿主における発 現を可能にするプロモーターとしては I araB (Better et al. (1988) Science 2 40: 1041 - 3)、 lacZ(Ward et al. (1989) Nature 341: 544-6; Ward et al. (199 2) FASEB J. 6: 2422-7)、 trp, tac, trc (lacと tn)の融合）等のプロモーターが 挙げられる。 また、 trpA由来、 ファージ由来、 rrnBリポソ一マル R A由来夕ーミ ネ一ターが、 利用可能である。 さらに、 大腸菌用のベクターは、 好ましくはべク 夕一を宿主内で増幅するための 「ori」 、 及び形質転換された宿主を選抜するため のマーカ一遺伝子を持つ。 アンピシリン、 テトラサイクリン、 カナマイシン、 及 びクロラムフエ二コール等の薬剤により宿主の判別を行うことを可能にする薬剤 耐性遺伝子の使用が好ましい。 特に、 ポリペプチドをペリブラズムへ分泌させる ことを目的とする場合、 pelBシグナル配列 (Lei et al. (1987) J. Bacteriol. 1 69: 4379)を使用することができる。 例えば、 M13系ベクター、 pUC系べクタ一、 p BR322、 pCR-Script, pGEX-5X-l (Pharmacia) . pEGFP, pBluescript (Stratagene) , pET(Invitrogen;この場合の宿主は T7ポリメラ一ゼを発現している BL21が好まし い）等のベクターを挙げることができる。 また、 特にサブクローニングまたは切出 し用のベクタ一としては、 pGEM-T、 pDIRECT、 pT7等を例示できる。
大腸菌以外の細菌宿主用としては、 バチルス属のものが挙げられ、 PUB110系、 PC194系のベクターが例示される。 より具体的に、 枯草菌由来の pPL608、 pKTH50 等を挙 、ること力 Sできる。 その他、 PseudoEonas putida^ Pseud omonas cepacia 等のシュ一ドモナス属、 Brevibacteriwn
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、）ゥ ム属（pAJ43(Gene 39: 281 (1985))等）、 Corynebacterium glutamicinn (D )^、 パクテリゥム属 (pCSll(特開昭 57-183799号公報； CBlOKMol. Gen. Genet. 196: - 19 -
175 (1984))等）、 ストレプトコッカス属（pHV1301(FEMS Microbiol. Lett. 26: 2 39 (1985))、 pGKKAppl. Environ. Microbiol. 50: 94 (1985))等）、 ラクトバチ ルス属（pAMj31(J. Bacteiol. 137: 614 (1979))等）、 Rhodococcus rhodochrous 等のロドコッカス属（J. Gen. Microbiol. 138: 1003 (1992))、 Streptomyces liv idans、 Streptomyces virginiae等の ストレプトマイセス属（Genetic anipulat ion of Streptomyces: A Laboratory Manual, Hopwood et al.， Cold Spring Har bor Laboratories (1985)参照; pIJ486(Mol. Gen. Genet. 203: 468-78 (1986))、 pKC1064(Gene 103: 97-9 (1991))、 pUWL-KS(Gene 165: 149-50 (1995)))の細菌を 宿主とするベクタ一系が開発されている。 微生物を宿主として利用できるベクタ —については、 『微生物学基礎講座 8遺伝子工学』 （共立出版)等の文献を参照す ることができる。 ベクターを細菌宿主へ導入するための手法としては、 塩化カル シゥム法 (Mandel and Higa (1970) J. Mol. Biol. 53: 158-62; HAnahan (1983) J. Mol. Biol. 166: 557-80)、 エレクトポレーシヨン法等を採用することができ る。
また、 真核細胞宿主での発現を可能にする調節要素は、 酵母を宿主とする場合 には、 A0X1及び GAL1プロモータ一が例示される。 酵母由来の発現ベクターとし ては、 Pic ia Expression Kit (Invitrogen), pNVIK SP - Q01等が例示できる。 酵母で利用可能なベクターに関しては、 Adv. Biochei. Eng. 43: 75-102 (1990)、 Yeast 8: 423-88 (1992)等に詳述されている。 より具体的には、 Saccharomyces c e/eF / 等のサッカロマイセス属では、 YRp系、 YEp系、 YCp系、 及び Yip系べ クタ一が利用可能である。 特に、 多コピーの遺伝子導入が可能であり、 安定に遺 伝子を保持できるインテグレーションベクタ一（EP537456等）が有用である。 その 他、 Kluyveromyces 等のクルイべロマイセス属では、 5. cereWWae由来 2 m系ベクター、 pKDl系ベクター（J. Bacteriol. 145: 382-90 (1981))、 pGKll 由来ベクター、 クライべロマイセス自律増殖遺伝子 KARS系べクタ一等、 シゾサッ カロマイセス属では、 Mol. Cell. Biol. 6: 80 (1986)に記載のベクタ一、 pAUR22 - 20 -
4(宝酒造）、 チゴサッカロマイセスでは pSB3 (Nucleic Acids Res. 13: 4267 (198 5))由来べクタ一、 Pichia angusta, Pichia joaWo 等のピキア属では Yeast 7: 431-43 (1991)、 Mol. Cell. Biol. 5: 3376 (1985)、 Nucleic Acids Res. 15: 3 859 (1987)等の文献記載のベクター、 Candida maUosa、 C. albicans, C. tropical is, C. ut i lis等のキャンチイダ では、 特開平 8-173170号公報記載のベクター、 また 由来の ARS(Agri. Biol. Chem. 51: 1587 (1987))を利用したべク 夕一、 Aspergillus niger、 Α
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等のァスペルギルス属では、 Trends in Bio technology 7: 283-7 (1989)記載のベクタ一、 トリコデルマ属では菌体外セルラ —ゼ遺伝子由来プロモーター（Bio/Technology 7: 596-603 (1989))を利用したベ クタ一が利用できる。
哺乳動物及びその他の動物細胞を宿主とする場合には、 アデノウイルス lateプ 口モータ一（Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946)、 CAGプロモータ 一（Niwa et al. (1991) Gene 108: 193-200), CMV i删 ediate earlyプロモ一夕 一（Seed and Aruffo (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3365 - 9)、 EFlaプ 口モーター（Mizushima et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 5322; Kim et al. (1990) Gene 91: 217—23)、 HSV TKプロモータ一、 SR aプロモーター（Takebe et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8: 466)、 SV40プロモーター (Mulligan et al. (1979) Nature 277: 108)、 SV40 earlyプロモ一夕一（Genetic Engineering Vol. 3, Williamson ed. , Academic Press (1982) pp.83- 141)、 SV40 lateプロモー夕 -(Gheysen and Fiers (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1: 385-94)、 RSV (ラウス肉 腫ウィルス）- LTR プロモ一夕一（Cullen (1987) Methods Enzymol. 152: 684-704) MMLV-LTRプロモーター、 CMVェンハンサー、 SV40ェンハンサー、 及ぴグロビンィ ントロン等を使用することができる。 さらに、 ネオマイシン、 G418等の薬剤によ る判別を可能とする薬剤耐性遺伝子がベクターに含まれていることが好ましい。 そして、 細胞内で遺伝子のコピー数の増加を計る場合には、 例えば核酸合成経路 を欠損した CH0を宿主とし、 その欠損を補う DHFR遺伝子を有する pCHOI等のべク 13420
- 21 - 夕一を採用し、 メトトレキセ一ト（ΜΠ)によりコピー数を増幅させることができる。 一方、 遺伝子の一過性発現のためには、 SV40の T抗原遺伝子を染色体上に有する COS細胞を宿主とし、 pcD等の SV40の複製起点、 またはアデノウイルス、 ゥシパ ピーローマウィルス（BPV)、 ポリオ一マウィルス等の複製開始点を持つベクターを 使用することができる。 さらに、 遺伝子コピー数の増幅のための選択マ一力一と して、 アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)、 チミジンキナーゼ (TK)、 キサ ンチングァニンホスホリポシルトランスフェラ一ゼ (Ecogpt)、 ジヒド口葉酸還元 酵素 (dMr)等をコードする遺伝子を含んでもよい。 適当なベクタ一として、 例え ば、 Okayama- Bergの発現べクタ一 pcDVl(Pharmacia)、 pCDM8 (Nature 329: 840-2 (1987))、 pRc/CMV, pcDNAU pcDNA3(Invitrogen)、 pSPORTl (GIBCO BRL) , pSV2d f r(Mol. Cell. Biol. 1: 854-64 (1981))、 pEF - BOS (Nucleic Acids Res. 18: 5322 (1990))、 pCEP4(Invitrogen)、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV, pBK- CMV、 pOPRSV, p0P13、 pME18S(Mol. Cell. Biol. 8: 466-72 (1988))等が公知である。
特に動物の生体内において本発明のポリヌクレオチドを発現させるためには、 P Adexkw等のアデノウイルスベクタ一、 pZIPneo等のレトロウイルスベクタ一が挙 げられる。 ベクタ一はアデノウイルス法、 エレクトポレーシヨン (電気穿孔)法 (Cy to techno logy 3: 133 (1990))、 カチォニックリボソーム法（力チォニックリポソ ーム D0TAP(Boehringer Mannheim)等）、 正電荷ポリマーによる導入法、 静電気型 リポソ一ム (electrostatic type liposome)法、 内包型リポソーム（internal type liposome)法、 パ一ティクルガンを用いる方法、 リボソーム法、 リポフエクショ ン (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987))、 リン酸カルシウム法 (特開平 2-227075), レセプ夕一介在遺伝子導入法、 レトロウイルス法、 DEAEデキストラ ン法、 ウィルス-リボソーム法 (別冊実験医学『遺伝子治療の基礎技術』 羊土社 (19 97);別冊実験医学 『遺伝子導入 &発現解析実験法』 羊土社 (1997); J. Clin. Inve st. 93: 1458-64 (1994)； Am. J. Physiol. 271: R1212-20 (1996)； Molecular M edicine 30: 1440-8 (1993); 実験医学 12: 1822-6 (1994)； 蛋白質核酸酵素 2: P2003/013420
- 22 -
1806-13 (1997)； Circulation 92(Suppl. II)： 479-82 (1995))、 naked - DNAの直 接導入法等により宿主に導入することができる。 アデノウイルス及びレトロウイ ルス以外由来のウィルスベクタ一、 例えば、 アデノ随伴ウィルス、 シンビスウイ ルス、 センダイウィルス、 トガウィルス、 パラミクソウィルス、 ボックスウィル ス、 ポリオウイルス、 ヘルぺスウィルス、 レンチウィルス、 ワクシニアウィルス 等を元に作製されたべクタ一を利用することもできる。 生体内への投与は、 ex vi 法でも in 法で行ってもよい。
その他、 昆虫発現システムも異種ポリペプチドを発現させる系として知られて おり、 例えば、 Autographa ca /or/2 核ポリへドロシスウィルス（AcNPV)をべク 夕一とし、 Spodoptera /r¾'per 細胞、 ま ftは Triclwplusia /arrae細胞中で 外来遺伝子を発現させることができる。 この際、 目的とする外来遺伝子は、 ウイ ルスの非必須領域にクローニングする。 例えば、 ポリヘドリンプロモ一夕一制御 下に連結してもよい。 この場合、 ポリヘドリン遺伝子は不活化され、 コ一ト蛋白 質を欠く組換えウィルスが産生され、 該ウィルスに感染した Awi/o/j era frugipe rdaH Trichoplusia /a/rae等の細胞中で目的とするポリペプチドが発現さ れる（Smith (1983) J. Virol. 46: 584; Engelhard (1994) Proc. Natl. Acad. S ci. USA 91: 3224-7)。 その他、 昆虫細胞由来の発現ベクターとして、 Bac_to-BAC baculovirus expression system(Bigco BRL)、 pBacPAK8等 公知でめる。
植物細胞を宿主とする場合には、 例えばカリフラワーモザイクウィルスの 35S プロモーター等を利用したベクターが使用可能である。 植物細胞へのベクタ一の 導入法としては、 PEG法、 エレクトポーレシヨン法、 ァグロパクテリゥム法、 パ —ティクルガン法等が公知である。
ベクターへの DNAの挿入は、 制限酵素サイトを利用したリガーゼ反応により行 うことができる（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987) Section 11.4-11.11; Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989) Section 5.61 - 5.63)。 JP2003/013420
23
<宿主 >
本発明により、 本発明のポリヌクレオチドまたはべクタ一を含む宿主が提供さ れる。 本発明のポリペプチドの製造には、 in vitro M in wの産生系が考え られる。 本発明の宿主には、 古細菌、 細菌、 真菌類、 植物、 昆虫、 魚類、 両生類、 八虫類、 鳥類、 哺乳類由来の原核及び真核細胞が含まれる。 本発明の宿主は、 本 発明のポリぺプチドをコ一ドするポリヌクレオチドを細胞内に含むものである。 該ポリヌクレオチドは、 宿主細胞のゲノム上の天然に存在する位置になければよ く、 該ポリヌクレオチド自身のプロモーター支配下にあっても、 ゲノム中に組み 込まれていても、 染色体外の構造として保持されていても良い。
細菌宿主としては、 . '（JM109, DH5o!， HB101, XLlBlue)、 Serratia marces cens. Bacillus subtilis等、 ェシェリシァ属、 ストレプトコッカス属、 ス夕フ イロコッカス属、 セラチア属、 バシルス属等に属するのグラム陽性及びグラム陰 性細菌を例示することができる。
真核宿主には、 酵母等の真菌類、 高等植物 ( o〃 a /aZ>ac™由来細胞）、 昆 虫（ドロソフイラ S2、 スポロドプテラ Sf9、 Sf21、 Tn5)、 魚類、 両生類（アフリカ ッメガエル卵母細胞 (Vail e et al. (1981) Nature 291: 358-40)) > ハ虫類、 鳥類、 哺乳類 (CH0(L Exp. Med. 108: 945 (1995)； 中でも DHFR遺伝子欠損 dMr- CH0(P roc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216-20 (1980)及び CHO K - 1 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60: 1275 (1968))が好適である）、 COS, He la, C127、 3T3、 BHK、 HEK29 3、 Bowesメラノーマ細胞）、 ミエ口一マ、 Vero、 Namalwa, Namal a KJM- HBT56 37 (特開昭 63-299号公報)）、 植物（ジャガイモ、 タバコ、 トウモロコシ、 イネ、 ァ ブラナ、 ダイズ、 トマト、 コムギ、 ォォムギ、 ライ麦、 アルフアルファ、 亜麻等) 等の細胞が含まれる。 真菌類としては、 Sacc romyces属に する Saccharomyces cerevisiae, 力 属等の酵母に加えて、 糸状菌の A¾oe ゾゾゾ/ w属の ¾t ^ ·7ゾ us / 等の細胞を宿主とした発現系も公知である。 3 013420
- 2 4 - 宿主細胞へのベクターの導入は、 エレクトポレーシヨン法 (Chu et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15 : 1311-26)、 カチォニックリボソーム法、 電気パルス穿孔 法（Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons (1987) Sect i on 9. 1-9. 9)、 微小ガラス管を使用した直接注入法、 マイクロインジェクション法、 リポフエクシヨン (Derij ard (1994) Cel l 7: 1025-37; Laib (1993) Nature Gene t ics 5 : 22-30 ; Rabindran et al . (1993) Sc ience 259 : 230-4)、 リポフエクタ ミン法（GIBC0- BRL)、 リン酸カルシウム法（Chen and Okayama (1987) Mol. Cel l. Biol. 7 : 2745-52)、 DEAEデキストラン法 (Lopata et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12 : 5707-17 ; Sussian and Mi lman (1985) Mol . Cel l . Biol. : 1642-3)、 FuGene6試薬 (Boehringer- Mannheim)等により行い得る。
<ポリぺプチド及びその断片 >
本発明の 「ポリペプチド」 は、 本発明のポリヌクレオチドによりコードされる ペプチド重合体である。 配列番号: 3または 4記載のアミノ酸配列を有する蛋白質 を好ましい例として挙げることができる。 本発明のポリペプチドを構成するアミ ノ酸残基は天然に存在するものでも、 また修飾されたものであっても良い。 アミ ノ酸残基の修飾としては、 ァシル化、 ァセチル化、 アミド化、 アルギニル化、 GPI アンカー形成、 架橋、 ァ-力ルポキシル化、 環化、 共有架橋の形成、 グリコシル化、 酸化、 脂質または脂肪誘導体の共有結合化、 シスチンの形成、 ジスルフィド結合 の形成、 セレノィル化、 脱メチル化、 蛋白質の分解処理、 ヌクレオチドまたはヌ クレオチド誘導体の共有結合化、 ヒドロキシル化、 ピログルタメートの形成、 フ ラピンの共有結合化、 プレニル化、 ヘム部分の共有結合化、 ホスファチジルイノ シトールの共有結合化、 ホルミル化、 ミリストイル化、 メチル化、 ュビキチン化、 ヨウ素化、 ラセミ化、 ADP-リポシル化、 硫酸化、 リン酸化等が例示される。 さら に、 本発明のポリペプチドにはシグナルペプチド部分がついた前駆体、 シグナル ぺプチド部分を欠く成熟蛋白質、 及びその他のぺプチド配列により修飾された融 2003/013420
- 25 - 合蛋白質を含む。 本発明のポリペプチドに付加するペプチド配列としては、 イン フルェンザ凝集素 (HA)、 ダルタチオン Sトランスフェラーゼ (GST)、 サブスタンス P、 多重ヒスチジンタグ (6XHis、 lOXHis等）、 プロテイン C断片、 マルトース結 合蛋白質 (MBP)、 免疫グロブリン定常領域、 α-チュ一ブリン断片、 -ガラクトシ ダーゼ、 Β -タグ、 c_myc 断片、 E -タグ (モノクローナルファ一ジ上のェピトープ）、 FLAG(Hopp et al. (1988) Bio/Tehcnol. 6: 1204-10)、 lckタグ、 pl8 HIV断片、 HSV_タグ（ヒト単純へルぺスウィルス糖蛋白質)、 SV40T抗原断片、 T7-タグ (T7 ge nelO蛋白質）、 VSV-GP断片 (Vesicular stomatitisウィルス糖蛋白質)等の蛋白質 の精製を容易にする配列 (例えば、 pcDNA3.1/Myc— His(Invitrogen)のようなべク ターを利用できる）、 組換え技術により蛋白質を生産する際に安定性を付与する配 列等を選択することができる。
さらに、 本発明により本発明のポリペプチドの断片が提供される。 本発明のポ リペプチド断片は、 本発明のポリペプチドの一部と同一であり、 少なくとも 8ァ ミノ酸残基以上 (例えば、 8、 10、 12、 または 15アミノ酸残基以上)からなるポリ ペプチド断片である。 特に好ましい断片としては、 ァミノ末端、 力ルポキシル末 端、 膜貫通ドメインを欠失したポリペプチド断片を挙げることができる。 αヘリ ックス及びひへリックス形成領域、 α両親媒性領域、 /3シート及び )3シート形成 領域、 iS両親媒性領域、 基質結合領域、 高抗原指数領域、 コイル及びコイル形成 領域、 親水性領域、 疎水性領域、 ターン及びターン形成領域、 並びに表面形成領 域を含む断片が本発明のポリペプチド断片に含まれる。 本発明のポリペプチド断 片は、 本発明のポリぺプチドの抗原性さえ有すればどのような断片であつてもよ い。 ポリペプチドの抗原決定部位は、 蛋白質のアミノ酸配列上の疎水性 Z親水性 を解析する方法 (Kyte- Doolittle (1982) J. Mol. Biol. 157: 105 - 22)、 二次構造 を解析する方法 (Chou- Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem 47: 251- 76)により推定 し、 さらにコンピュータ一プログラム（Anal. Biochem. 151: 540-6 (1985))、 ま たは短いぺプチドを合成しその抗原性を確認する PEPSCAN法 (特表昭 60-500684号 13420
- 2 6 - 公報)等により確認することができる。
本発明のポリぺプチド、 及びポリぺプチド断片は公知の遺伝子組換え技術によ り、 また化学的な合成法により製造することができる。 遺伝子組換え技術により 本発明のポリぺプチドまたはポリぺプチド断片を製造する場合、 製造される蛋白 質は、 選択する宿主の種類によってグリコシル化を受ける場合と受けない場合、 さらに分子量、 等電点等が異なる場合がある。 通常、 大腸菌等の原核細胞を宿主 としてポリぺプチドを発現させた場合、 得られるポリぺプチドは本来ポリぺプチ ドが有していた N-末端にメチォニン残基が付加された形で産生される。 このよう な宿主の違いにより、 構造の異なるポリぺプチドも本発明のポリぺプチドに含ま れる。
<ポリペプチドの製造 >
in vi troでポリぺプチドを製造する場合、 in W / トランスレーション（Das s o and Jackson (1989) Nuc leic Ac ids Res. 17 : 3129-44)等の方法に従って、 細胞 を含まない試験管内の系でポリペプチドを製造することができる。 それに対して、 細胞を用いてポリペプチドを製造する場合、 まず、 上述の中から適当な宿主細胞 を選択し、 目的とする DNAによる形質転換を行う。 続いて形質転換された細胞を 培養することにより所望のポリペプチドを得ることができる。 培養は、 選択した 細胞に適した公知の方法により行う。 例えば、 動物細胞を選択した場合には、 DME M (Vi rology 8 : 396 (1959)、 MEM (Science 122 : 501 (1952))、 RPMI 1640 (J. Am. M ed. Assoc. 199 : 519 (1967))、 199 (Proc. Soc. Bi ol . Med. 73 : 1 (1950))、 IMD M等の培地を用い、 必要に応じゥシ胎児血清 (FCS)等の血清を添加し、 pH約 6〜8、 30~40°Cにおいて 15〜200時間前後の培養を行うことができる。 その他、 必要に 応じ途中で培地の交換を行つたり、 通気及び攪拌を行つたりすることができる。 一方、 in ?におけるポリペプチドの生産系を確立するためには、 動物また は植物へ目的とする DNAを導入し、 生体内においてポリペプチドを産生させる。 ャギ、 ブタ、 ヒッジ、 マウス、 ゥシ等の哺乳動物、 カイコ等の昆虫 (Susumu (198 5) Nature 315: 592- 4)等の動物系が公知である（Lubon (1998) Biotechnol. Annu. Rev. 4: 1-54)。 また、 哺乳動物系においてトランスジエニック動物を用いるこ ともできる。
例えば、 所望のポリペプチドをャギの乳汁中に分泌させることを目的とする場 合、 該ポリぺプチドをコ一ドする DNAを βカゼィン等の乳汁中に特異的分泌され る蛋白質をコードする DNAと結合し、 目的ポリペプチドを融合蛋白質として発現 させるようにする。 次に、 融合蛋白質をコードする DNAをャギの胚へ導入する。 D ΝΑを導入した胚を雌ャギの子宮へ移植する。 このャギから生まれるトランスジェ ニックャギ、 またはその子孫は乳汁中に所望のポリペプチドを分泌する。 必要に 応じ、 乳汁量を増やすため、 ホルモンを投与することもできる（Ebert et al. (19 94) Bio/Technology 12: 699-702) 0
タバコ等の植物を用いたトランスジエニック植物のポリペプチド産生系が公知 である。 まず、 所望のポリペプチドコード DNAを PM0N530等の植物発現に適した ベクターに組み込み、 Agrobacterium /mz/e/ac e 等の細菌に導入する。 DNAの導 入された細菌を /aZ» ω?等の植物に感染させ、 植物を再生させることに より、 所望のポリぺプチドを得られたトランスジエニック植物の葉より単離する ことができる（Julian et al. (1994) Eur. J. Immunol. 24: 131-8)0 その他の方 法としては、 PEGを用いプロトプラストへ DNAを導入して植物体を再生する方法 (Gene Transfer to Plants, Potrykus and Spangenberg ed. (1995) pp. 66-74; ィンド型ィネ品種に適する）、 電気パルスによりプロトプラストへ DNAを導入して 植物体を再生する方法 (Toki et al. (1992) Plant Physiol. 100: 1503- 7;日本型 イネに適する）、 パーティクルガン法で植物細胞に直接 DNAを導入し植物体を再生 する方法（Christou et al. (1991) Bio/Technology 9: 957-62)、 ァグロパクテリ ゥムを介し細胞に DNAを導入し植物体を再生する方法 (Hie i et al. (1994) Plant J. 6:271- 82)等が確立されている。 植物を再生する方法については、 Toki et al. 3420
- 2 8 -
(1995) Plant Physiol. 100 : 1503- 7を参照することができる。
トランスジエニック植物が一度得られた後は、 さらに該植物の種子、 果実、 塊 茎、 塊根、 株、 切穂、 カルス、 プロトプラスト等を材料として同じように本発明 のポリぺプチドを産生する植物宿主を繁殖させ得ることができる。
通常、 遺伝子組換え技術により製造された本発明のポリペプチドは、 まず、 ポ リぺプチドが細胞外に分泌される場合には培地を、 特にトランスジエニック生物 の場合には体液等を、 細胞内に産生される場合には細胞を溶解して溶解物を回収 する。 そして、 蛋白質の精製方法として公知の塩析、 蒸留、 各種クロマ卜グラフ ィー、 ゲル電気泳動、 ゲル濾過、 限外濾過、 再結晶、 酸抽出、 透析、 免疫沈降、 溶媒沈澱、 溶媒抽出、 硫安またはエタノ一ル沈澱等を適宜組合せることにより所 望のポリペプチドを精製する。 クロマトグラフィーとしては、 ァニオンまたは力 チオン交換等のイオン交換、 ァフィ二ティー、 逆相、 吸着、 ゲル濾過、 疎水性、 ヒドロキシアパタイト、 ホスホセルロース、 レクチンクロマトグラフィー等が公 知である (Strategies for Protein Puri f icat ion and Characterization: A Labo ratory Course Manual, Marshak et al . ed. , Cold Spring Harbor Laboratory P ress (1996))。 HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができ る。
また、 天然由来のポリペプチドを精製して取得してもよい。 例えば、 後述の本 発明のポリペプチドに対する抗体、 を利用して、 ァフィ二ティーク口マトグラフ ィ一により精製することもできる（Current Protocols in Molecular Biology, Jo hn Wi ley & Sons (1987) Sect ion 16. 1-16. 19)。 また、 GSTとの融合蛋白質とし た場合にはダル夕チオンカラムを、 ヒスチジンタグを付加した融合蛋白質とした 場合にはニッケルカラムを用いた精製法も利用できる。 本発明のポリペプチドを 融合蛋白質として製造した場合には、 必要に応じて精製後にトロンピンまたはフ アクター Xa等を使用して不要な部分を切断することもできる。 さらに、 必要に応 じキモトリプシン、 ダルコシダ一ゼ、 トリプシン、 プロテインキナーゼ、 リシル 03013420
- 29 - ェンドぺプチダーゼ等の酵素を用い得られたポリぺプチドを修飾することも可能 である。
本発明のポリぺプチド断片は、 上述の合成及び遺伝子工学的な手法に加えて、 ぺプチダーゼのような適当な酵素を用いて本発明のポリペプチドを切断して製造 することもできる。 く抗体 >
本発明により、 本発明のポリぺプチドまたはポリぺプチド断片に対する抗体が 提供される。 本発明の抗体にはポリクローナル抗体、 モノクローナル抗体、 キメ ラ抗体、 一本鎖抗体（scFV) (Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-83; The Pharmacology of Monoclonal Antibody, vol.113, Rosenburg and Moore ed. , Springer Verlag (1994) pp.269— 315)、 ヒト化抗体、 多特異性抗 体 (LeDoussal et al. (1992) Int. J. Cancer Suppl. 7: 58-62; Paulus (1985) Behring Inst. Mitt. 78: 118-32; Millstein and Cuello (1983) Nature 305: 5 37-9; Ziimermann (1986) Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; V an Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944-9)、 並びに、 Fab, Fab' 、 F(a b' )2、 Fc、 Fv等の抗体断片が含まれる。 さらに、 本発明の抗体は必要に応じ、 P EG等により修飾されていてもよい。 その他、 本発明の抗体は、 ；8-ガラクトシダ —ゼ、 マルトース結合蛋白質、 GST, 緑色蛍光蛋白質 (GFP)等との融合蛋白質とし て製造され得、 二次抗体を用いずに検出できるようにしてもよい。 また、 ビォチ ン等により抗体を標識することによりアビジン、 ストレプトアビジン等を用いて 抗体の回収を行い得るように改変されていてもよい。
本発明の抗体は、 本発明のポリペプチド若しくはその断片、 またはそれらを発 現する細胞を感作抗原として製造することができる。 また、 本発明のポリべプチ ド若しくはその断片のうち短いものは、 ゥシ血清アルブミン、 キ一ホールリンべ ットへモシァニン、 卵白アルブミン等のキャリアに結合して免疫原として用いて 2003/013420
- 3 0 - もよい。 また、 本発明のポリペプチドまたはその断片と共に、 アルミニウムアジ ュバント、 完全 (または不完全）フロイントアジュバント、 百日咳菌アジュバント 等の公知のアジュバントを抗原に対する免疫応答を強化するために用いてもよい。 ポリクローナル抗体は、 例えば、 本発明のポリペプチドまたはその断片を所望 によりアジュパントと共に哺乳動物に免疫し、 免疫した動物より血清を得る。 こ こで用いる哺乳動物は、 特に限定されないが、 ゲッ歯目、 ゥサギ目、 霊長目の動 物が一般的である。 マウス、 ラット、 ハムスター等のゲッ歯目、 ゥサギ等のゥサ ギ目、 力二クイザル、 ァカゲザル、 マントヒヒ、 チンパンジー等のサル等の霊長 目の動物が挙げられる。 動物の免疫化は、 感作抗原を Phosphate- Buffered Sal in e (PBS)または生理食塩水等で適宜希釈、 懸濁し、 必要に応じアジュバントを混合 して乳化した後、 動物の腹腔内または皮下に注射して行われる。 その後、 好まし くは、 フロイント不完全アジュパントに混合した感作抗原を 4〜21日毎に数回投 与する。 抗体の産生は、 血清中の所望の抗体レベルを慣用の方法により測定する ことにより確認することができる。 最終的に、 血清そのものをポリクローナル抗 体として用いても良いし、 さらに精製して用いてもよい。 具体的な方法として、 例えば、 『Current Protocols in Molecular Biology』 （John Wi ley & Sons (198 7) Sect ion 11. 12- 11. 13)を参照することができる。
モノクローナル抗体を産生するためには、 まず、 上述のようにして免疫化した 動物より脾臓を摘出し、 該脾臓より免疫細胞を分離し、 適当なミエローマ細胞と ポリエチレングリコール (PEG)等を用いて融合してハイプリドーマを作成する。 細 胞の融合は、 Mi ls teinの方法（Gal fre and Mi ls tein (1981) Methods Enzymol . 7 3 : 3- 46)に準じて行うことができる。 ここで、 適当なミエローマ細胞として特に, 融合細胞を薬剤により選択することを可能にする細胞が挙げられる。 このような ミエローマを用いた場合、 融合されたハイプリドーマは、 融合された細胞以外は 死滅するヒポキサンチン、 アミノプテリン及びチミジンを含む培養液 (HAT培養 液)で培養して選択する。 次に、 作成されたハイプリドーマの中から、 本発明のポ リペプチドまたはその断片に対して結合する抗体を産生するクローンを選択する。 その後、 選択したクローンをマウス等の腹腔内に移植し、 腹水を回収してモノク ローナル抗体を得る。 また、 具体的な方法として、 『Current Protocols in Mole cular Biologyj (John Wiley & Sons (1987) Section 11.4-11.11)を参照するこ ともできる。
ハイプリドーマは、 その他、 最初に EBウィルスに感染させたヒトリンパ球を 7 n 0で免疫原を用いて感作し、 感作リンパ球をヒト由来のミエ口一マ細胞 (U2 66等）と融合し、 ヒト抗体を産生するハイプリドーマを得る方法 (特開昭 63-17688 号公報）によっても得ることができる。 また、 ヒト抗体遺伝子のレパートリーを有 するトランスジエニック動物を感作して製造した抗体産生細胞を用いても、 ヒト 抗体を得ることができる（W092/03918; W093-02227; W094/02602; 画/ 25585; W0 96/33735; 讓 /34096； Mendez et al. (1997) Nat. Genet. 15: 146-56等）。 ハ イブリド一マを用いない例としては、 抗体を産生するリンパ球等の免疫細胞に癌 遺伝子を導入して不死化する方法が挙げられる。
また、 遺伝子組換え技術により抗体を製造することもできる（Borrebaeck and L arrick (1990) Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers LT D., UK参照)。 そのためには、 まず、 抗体をコードする遺伝子をハイプリドーマ または抗体産生細胞 (感作リンパ球等)からクローニングする。 得られた遺伝子を 適当なベクターに組み込み、 宿主に該ベクターを導入し、 宿主を培養することに より抗体を産生させる。 このような組換え型の抗体も本発明の抗体に含まれる。 代表的な組換え型の抗体として、 非ヒト抗体由来可変領域及びヒト抗体由来定常 領域とからなるキメラ抗体、 並びに非ヒト抗体由来相補性決定領域 (CDR)、 及び、 ヒト抗体由来フレームワーク領域 (FR)及び定常領域とからなるヒト化抗体が挙げ られる（Jones et al. (1986) Nature 321: 522-5; Reichmann et al. (1988) Nat ure 332: 323-9; Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-6; Methods E nzymol. 203: 99 121 (1991))。 本発明の抗体断片は、 上述のポリクローナルまたはモノクローナル抗体をパパ イン、 ペプシン等の酵素で処理することにより製造し得る。 または、 抗体断片を コードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することも可能である（Co et al., (1994) J. Immunol. 152: 2968-76; Better and Horwitz (1989) Methods Enzym ol. 178: 476-96; Pluckthun and Skerra (1989) Methods Enzymol. 178: 497-51 5; Lamoyi (1986) Methods Enzymol. 121: 652-63; Rousseaux et al. (1986) 12 1: 663-9; Bird and Walker (1991) Trends Biotechnol. 9: 132- 7参照）。
本発明の多特異性抗体には、 二特異性抗体 (BsAb)、 ダイアポディ（Db)等が含ま れる。 多特異性抗体は、 （1)異なる特異性の抗体を異種二機能性リンカ一により化 学的にカップリングする方法 (Paulus (1985) Behring Inst. Mill. 78: 118-32)、 (2)異なるモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを融合する方法 (Mi 11 s t e in and Cuello (1983) Nature 305: 537-9)、 （3)異なるモノクローナル抗体の軽 鎖及び重鎖遺伝子 (4種の DNA)によりマウス骨髄腫細胞等の真核細胞発現系をトラ ンスフエクシヨンした後、 二特異性の一価部分を単離する方法（Zi腿 ermann (198 6) Rev. Physio. Biochem. Pharmacol. 105: 176-260; Van Dijk et al. (1989) Int. J. Cancer 43: 944- 9)等により作製することができる。 一方、 Dbは遺伝子 融合により構築され得る二価の 2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーの 抗体断片であり、 公知の手法により作製することができる（Holliger et al. (199 3) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8; EP404097; TO93/11161参照）。
抗体及ぴ抗体断片の回収及び精製は、 プロテイン A及び Gを用いて行う他、 <ポ リペプチドの製造 >の項で詳細に記載した蛋白質精製技術によっても行い得る (Ant ibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbo r Laboratory (1988))。 例えば、 本発明の抗体の精製にプロテイン Aを利用する 場合、 Hyper D、 P0R0S、 Sepharose F.F. (Pharmacia)等のプロテイン Aカラムが公 知であり、 使用可能である。 得られた抗体の濃度は、 その吸光度を測定すること により、 または酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA)等により決定することができる。 03 013420
- 3 3 - 抗体の抗原結合活性は、 光度測定、 蛍光抗体法、 酵素免疫測定法 (EIA)、 放射 免疫測定法 (RIA)、 ELISA等により測定することができる。 ELISA法による測定の 場合、 本発明の抗体をプレート等の担体に固相化し、 次いで本発明のポリべプチ ドを添加した後、 目的とする抗体を含む試料を添加する。 ここで、 抗体を含む試 料としては、 抗体産性細胞の培養上清、 精製抗体等が考えられる。 続いて、 本発 明の抗体を認識する二次抗体を添加し、 プレートのインキュベーションを行う。 その後、 プレートを洗浄し、 二次抗体に付加された標識を検出する。 即ち、 二次 抗体がアル力リフォスファ夕ーゼで標識されている場合には、 P-ニトロフエニル リン酸等の酵素基質を添加して吸光度を測定することで、 抗原結合活性を測定す ることができる。 また、 抗体の活性評価に、 BIAcore (Pharmacia)等の市販の系を 使用することもできる。
本発明の抗体は、 本発明のポリぺプチド及びその断片の精製に使用することが できる。 また、 パーキンソン病等に対する細胞移植治療に好適に使用され得るド —パミン産生ニューロン前駆細胞を得るために利用することもできる。
<ド一パミン産生二ユーロンの選択方法 >
本発明により分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞を選択的に均 一な集団として得る方法が提供された。 より詳細には、 本発明の 65B13ポリぺプ チドに対する抗体とドーパミン産生ニューロン前駆細胞を含むことが予測される 細胞試料とを接触させ、 抗体に結合する細胞を選択することで本発明のポリぺプ チドを発現している細胞、 即ち、 分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆 細胞を獲得できる（図 12から 14参照)。 細胞との接触前に、 抗体を適当な担体に 固定化して用いることも可能である。 または、 細胞と抗体とを接触させ、 結合さ せた後、 抗体のァフィ二ティーによる精製を行うことで、 該抗体と結合した細胞 を選択的に回収することもできる。 例えば、 本発明の抗体がピオチンと結合され ている場合には、 アビジンやストレプトアビジンを結合したプレートやカラムに 対して添加することにより精製を行うことができる。
また、 65B13は Igドメインを持つ接着分子様の構造を有し（図 6参照)、 培養細 胞中で発現させた場合、 65B13を発現させた細胞同士が接着することが判ってい る。 65B13を発現させていない細胞とは接着しないため、 65B13を介した接着はホ モフィリックな結合であると考えられる。 このような 65B13ポリペプチドの性質 から、 65B13ポリペプチドの特に細胞外領域部分を利用し、 ド一パミン産生ニュ 一ロン前駆細胞を選択することもできる。 例えば、 適当な担体上に、 65B13ポリ ペプチドの細胞外領域部分を固定し、 細胞と接触させることによりドーパミン産 生ニューロン前駆細胞を取得することが可能である。 従って、 本発明により、 本 発明のポリペプチドの少なくとも細胞外領域部分を含むペプチドとドーパミン産 生ニューロン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含むド ーパミン産生ニューロンを選択する方法が提供される。
本発明における分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞の分離は、 抗 65B13抗体を用いたフローサイトメトリーにより効率的に行なうことができる (実施例 4、 図 14) 。
その他、 65B13に対するプロモ一夕一を利用してドーパミン産生ニューロン前 駆細胞を選択することもできる（例えば、 特開 2002-51775号公報参照)。 例えば、 後述する 65B13の発現領域解析により得られたプロモーター部分に対し、 GFP等 の検出可能なマーカーをコードする遺伝子を連結した構築物を含むベクタ一を細 胞に対してトランスフエクシヨンすることができる。 その他、 65B13遺伝子座へ マーカーをコードする遺伝子をノックインすることができる。 どちらの場合にも， ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的にマーカー遺伝子の発現が検出される こととなり、 特異的な細胞の選択が可能となる。
ここで使用する細胞試料は好ましくは、 中脳腹側領域の細胞、 または vi tro で分化誘導されたドーパミン産生ニューロンを含む培養培地である。 in vi tro \ おけるド一パミン産生ニューロンの分化誘導は、 公知の ES細胞、 骨髄間質細胞、 0
- 3 5 - 神経由来の不死化セルライン (特表平 8-509215号公報；特表平 U- 506930号公 報；特表 2002-522070号公報)、 ニューロン始原細胞 (特表平 11-509729号公報)等 の細胞を出発材料として、 公知の方法により行うことができる。 通常、 ド一パミ ン産生ニューロンは、 脳のドーパミン産生ニューロン領域から得た組織を神経組 織由来の支持細胞層と共培養することにより分化させることができる。 さらに、 線条体及び皮質等の通常非ドーパミン産生神経組織からドーパミン産生細胞を誘 導する方法も知られている (特表平 10-509319号公報)。 また、 低酸素条件下での 培養により、 より多くド一パミン産生ニューロンを含む細胞が得られるとの報告 も成されている（特表 2002-530068号公報）。 本発明のドーパミン産生ニューロン 前駆細胞の選択に用いる細胞試料は、 如何なる方法により分離または培養された 細胞群であってもよい。
また、 本発明の抗体またはポリペプチドを固定する担体としては、 細胞に対し て無害なものである必要がある。 例えば、 合成または天然の有機高分子化合物、 ガラスビーズ、 シリカゲル、 アルミナ、 活性炭等の無機材料、 及びこれらの表面 に多糖類、 合成高分子等をコーティングしたものが考えられる。 担体の形状には 特に制限はなく、 膜状、 繊維状、 顆粒状、 中空糸状、 不織布状、 多孔形状、 ハニ カム形状等が挙げられ、 その厚さ、 表面積、 太さ、 長さ、 形状、 大きさを種々変 えることにより接触面積を制御することができる。 <ド一パミン産生ニューロン前駆細胞〉
このようにして獲得された細胞は、 分裂停止直後のド一パミン産生ニューロン 前駆細胞であることから、 従来の雑多な細胞集団または外来遺伝子を導入したド ーパミン産生ニューロンと比べて、 安全性、 生存率、 ネットワーク形成能の面で PD等の神経変性疾患の移植治療に好ましいものである。 さらに、 本方法により得 られた本発明の細胞 (群）は、 分裂直後の前駆細胞であることから、 in W /roにお いて培地等の条件を選択することにより適当な段階まで分化させることも可能で 3 013420
- 3 6 - あり、 種々の神経移植治療の材料としても好ましいものである。 本発明の方法に より得られたニューロン前駆細胞の移植では、 1 X 103〜1 X 個、 さらに好まし くは 5〜6 X 104個のニューロンを移植する。 第 1の方法としては、 細胞の懸濁液 を脳に移植する定位脳固定術（s tereotaxic surgery)が挙げられる。 また、 ミクロ 手術 (microsurgery) により細胞を移植しても良い。 ニューロン組織の移植方法に ついては、 Backlund等（Backlund et al. (1985) J. Neurosurg. 62 : 169-73)、 L indval l等 (Lindval l et al . (1987) Ann. Neurol . 22 : 457 - 68)、 Madrazo等（Mad razo et al . (1987) New Engl . J. Med. 316 : 831-4)の方法を参照することがで きる。
さらに、 本発明の細胞は、 ド一パミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子及 び前駆細胞からドーパミン産生ニューロンへの各成熟段階に特異的な遺伝子の単 離、 PD治療のターゲット探索、 ドーパミン産生ニューロンの成熟過程の解明、 並 びに成熟を指標としたスクリーニング等にも利用することができる。 <遺伝子発現レベルの比較 >
本発明の抗体を用いて得られた分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆 細胞は、 該細胞において特異的に発現している遺伝子を単離する材料として使用 することができる。 さらに、 本発明のド一パミン産生ニューロン前駆細胞を分化、 誘導、 または増殖させた細胞に特異的に発現している遺伝子を調べ、 単離するこ ともできる。 また、 分化 Z誘導/増殖させた細胞と元の前駆細胞とにおいて発現 レベルに差違のある遺伝子を調べることによりド一パミン産生ニューロンの生体 内における分ィ匕に必要とされる遺伝子を調べることもできる。 このような遺伝子 はドーパミン産生ニューロンにおける何等かの欠陥が病因となっている疾病の治 療対象候補となり得るので、 当該遺伝子を決定し、 単離することは非常に有用で ある。
本発明のド一パミン産生ニューロン前駆細胞と該細胞から分化 Z誘導 Z増殖さ P2003/013420
- 3 7 - れた細胞若しくはその他の細胞、 または該分化 誘導 増殖された細胞とその他 の細胞との間での遺伝子の発現レベルの比較は、 慣用の細胞//? ハイブリダ ィゼ一シヨン、 ノ一ザンプロットハイブリダイゼーション、 RNAドットブロット ハイブリダィゼ一シヨン、 逆転写 PCR、 RNase保護アツセィ、 DNAマイクロアレイ ハイブリダィゼーシヨン、 遺伝子発現の連続解析（SAGE; serial analysis of gene expression) (Velculescu et al. (1995) Science 270: 484-7) , 差し引きハイプ リダィゼ一シヨン (subtracUve hybridization), 代表差違分析 (representation difference analysis; RDA) (Lisitsyn (1995) Trends Genet. 11: 303- 7)等によ り行うことができる。
細胞 in situハイブリダイゼーションでは、 特定の RNA配列に特異的な標識プ ローブを用い細胞から調製した総 RNAまたは polyA¾NAに対してハイプリダイゼ —シヨンを行うことにより、 個々の細胞における RNAのプロセッシング、 輸送、 細胞質への局在ィヒが起こる場所等を調べることができる。 また、 RNAの大きさを ゲル電気泳動等によりサイズ分画して決定することもできる。 また、 定量的な蛍 光 in ////ハイプリダイゼ一ション (FISH)及びデジタル画像顕微鏡を用いれば、 R NA転写産物を //? '/ζ/で視覚的に捉えることも可能であり（Femino et al. (199 8) Science 280: 585-90)、 本発明において利用することができる。
遺伝子発現の解析で逆転写 PCRを用いた場合、 特定遺伝子の発現を大まかに定 量することができる。 本方法では、 1つの RNA転写産物の種々のァイソフォーム を検出及び解析することも可能である。 逆転写 PCRにおいてはまず、 ェキソン特 異性プライマーを用いた逆転写 PCRを行い、 予想された産物以外の増幅産物が検 出された場合、 それらを解析することにより選択的スプライシングにより生じる mRNAァイソフォームを同定することが可能である。 例えば、 Pykett et al. (199 4) Hum. Mol. Genet. 3: 559- 64等に記載の方法を参照することができる。 特に 大まかな発現パターンを迅速に解析することが求められる場合、 本発明の PCRを 利用した本方法は、 その速さ、 感度の高さ、 簡便さの点からも望ましいものであ 20
- 3 8 - る。
賺チップを使用することにより、 遺伝子発現スクリ一二ングの能率を向上さ せることができる。 ここで、 DNAチップとは、 ガラス等の担体表面上にオリゴヌ クレオチドまたは DNAクローン等を高密度に固定した小型のアレイである。 例え ば、 多重発現スクリーニングを行うためには、 各目的遺伝子に対する cDNAクロー ンまたは該遺伝子特異的なオリゴヌクレオチドをチップに対して固定化し、 マイ クロアレイを作製する。 次に本発明のド一パミン特異的ニューロン前駆細胞、 ま たは該細胞より分化 Z誘導/増殖された細胞より RNAを調製し、 逆転写酵素処理 を行い、 cDNAを得る。 次に、 得られた cDNA試料を蛍光タグ等のタグにより標識 し、 マイクロアレイに対するハイブリダィゼ一シヨンを行う。 その結果、 総標識 cDNA中、 細胞内で活発に発現している遺伝子の割合が高くなり、 あまり発現され ていない遺伝子の割合は低くなる。 即ち、 標識 cDNAとチップ上の cDNAクローン またはオリゴヌクレオチドとのハイプリッド形成を意味する蛍光シグナルの強度 は、 標識 cDNA内での各配列の発現の度合いを示すことなり、 遺伝子発現の定量を 可能成らしめる。
また、 縮重 PCRプライマ一を用いた逆転写: PCRを行う mRNAディファレンシャル ディスプレイにより、 本発明のドーパミン産生ニューロン前駆細胞、 または該細 胞から分化ノ誘導 Z増殖された細胞について多数の遺伝子の発現を同時に解析す ることもできる。 まず、 特定の mRNAの polyA尾部に 3' 末端の 1または 2つの塩 基を変更した修飾オリゴ dTプライマ一を準備し、 本発明の前駆細胞または該細胞 から分化/増殖された細胞、 及び、 発現を比較する対照細胞から単離した総 RNA に対して逆転写酵素反応を行う（Liang et al . (1993) Nuc leic Acids Res. 21 : 3 269-75)。 変更した塩基が 「G」 であれば、 polyA尾部の直前に Cを持つ mRNAを選 択的に増幅することができ、 また 「CA」 であれば、 TGを直前に持つ mRNAを増幅 することができる。 次に、 第 2のプライマーとして、 10塩基程度の長さの任意の 配列を有するものを用意し、 修飾オリゴ dTプライマー及び第 2のプライマーを使 用して PCR増幅反応を行う。 増幅産物を泳動距離の長いポリアクリルアミドゲル を用いて電気泳動し、 サイズ分画する。 このような方法により、 本発明の細胞と 対照細胞とで各細胞に特異的に発現している mRNA由来の cDNAは、 一方の試料を 泳動した場合にのみ検出されるバンドとして検出することができる。 この方法で は、 同定されていない遺伝子の発現についても解析することができる。
SAGE分析は、 多数の転写産物の発現を同時に検出することができ、 また検出に 特殊な装置を必要としない点で好ましい分析方法の一つである。 まず、 本発明の ドーパミン産生ニューロン前駆細胞または該細胞から分化/誘導ノ増殖された細 胞より polyA NAを慣用の方法により抽出する。 次に、 ピオチン化オリゴ dTブラ イマ一を用い、 前記 R Aを cDNAに変換し、 4塩基認識制限酵素（アンカー用酵素； AE)で処理する。 ここで、 AE処理断片は、 その 3' 末端にピオチン基を含んだ形と なる。 次に、 AE処理断片をストレプトアビジンに結合させ、 結合された cDNAを 2 画分に分け、 それぞれの画分を別々の 2本鎖オリゴヌクレオチドアダプター（リン カー) A及び Bに連結する。 このリンカ一は、 （1)アンカー用酵素の作用で生じる 突出部の配列と相補的な配列を有する 1本鎖突出部、 （2)タグ用酵素（tagging enz yme ; TE)となる I IS型制限酵素 (認識部位より 20bp以下の離れた定位置の切断を行 う）の 5 ' 塩基認識配列、 及び (3) PCR用特異的プライマーを構成するのに十分な追 加配列より構成される。 ここで、 リンカ一を連結した cDNAをタグ用酵素で切断す ることにより、 リンカ一結合型の状態で cDNA配列部分のみが短鎖配列タグとなる 次に、 リンカ一の異なる 2種類のプールを互いに連結し、 リンカ一 A及び Bに特 異的プライマーを使用して PCR増幅する。 その結果、 増幅産物はリンカ一 A及び B に結合した 1つの隣接配列夕グ (ダイタグ; di t ag)を含む多様な配列の混在物とし て得られる。 そこで、 増幅産物をアンカ一用酵素により処理し、 遊離したダイ夕 グ部分を通常の連結反応により鎖状に連結し、 クローニングを行う。 クローニン グにより得られたクローンの塩基配列を決定することにより、 一定長の連続ダイ タグの読み出しを得ることができる。 このようにしてクロ一ンの塩基配列を決定 し、 配列タグの情報が得られれば、 それぞれのタグに該当する mR Aの存在を同定 することができる。
差し引きハイブリダィゼーションは、 種々の組織または細胞間で発現の差違の ある遺伝子のクローニングによく用いられる方法であるが、 本発明のドーパミン 産生ニューロン前駆細胞、 またはそれから分化ノ誘導/増殖された細胞において 特異的に発現している遺伝子をクローエングするのにも使用することができる。 まず、 本発明の前記細胞のうちの試験する細胞の DNA試料を調製する（以下、 テス ト DNAと呼ぶ)。 次に、 比較する細胞の DNA (以下、 ドライバー DNAと呼ぶ）を調製 する。 テスト DNA とドライバ一 DNA とを逆に用いることもできる。 いずれにせよ、 テスト DNAに存在し、 ドライバー DNAに存在しない遺伝子の存在が検出される。 次に、 調製したテスト DNA及び大過剰量のドライパー DNAを混合し、 変性させ一 本鎖 DNAとした後にァニーリングさせる。 ァニーリング条件を調節することによ り、 ドライパー DNA中には存在しない特異的な配列をテスト DNA由来の DNAのみ からなる二本鎖 DNAとして単離することができる。 より詳細な方法については、 S aroop et al . (1991) Nuc lei c Acids Res. 19 : 1954及び Yasunaga et al . (19 99) Nature Genet . 21 : 363- 9等を参照することもできる。
RDA法は、 PCRを利用した、 ドライバー DNAに存在しないテスト DNA中の配列を 選択的に増幅することを可能とする方法であり、 上述のその他の方法と同様に本 発明において用いることができる。 より詳細な手順については、 Li s i tsyn (1995)
Trends Genet . 11 : 303-7及び Schut te et al . (1995) Proc. Nat l . Acad. Sc i . USA 92 : 5950-4を参照することができる。
以上のようにして検出、 単離されたドーパミン産生ニューロン前駆細胞、 また は該細胞を分化、 誘導、 または増殖させた細胞に特異的な遺伝子を上述の各種公 知の方法によりべクタ一等に挿入し、 配列決定、 発現解析を行うこともできる。
<前駆細胞の成熟を指標としたスクリ一二ング > P T/JP2003/013420
- 4 1 - 本発明により、 本発明のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に対し、 被験物質 を接触させる工程、 及び接触による前駆細胞の分化または増殖を検出する工程を 含む、 スクリーニング方法が提供される。 本方法によりスクリーニングされる化 合物は、 ドーパミン産生ニューロンの分化、 増殖等を調節する機能を示すことか ら、 ド一パミン産生ニューロンにおける何等かの欠陥が病因となっている疾病の 治療対象候補となり得、 有用と考えられる。
ここで、 「被験物質」 とはどのような化合物であってもよいが、 例えば、 遺伝 子ライブラリーの発現産物、 合成低分子化合物ライブラリー、 合成ペプチドライ ブラリー、 抗体、 細菌放出物質、 細胞 (微生物、 植物細胞、 動物細胞)抽出液、 細 胞 (微生物、 植物細胞、 動物細胞)培養上清、 精製または部分精製ポリペプチド、 海洋生物、 植物または動物等由来の抽出物、 土壌、 ランダムファ一ジペプチドデ イスプレイライブラリーが挙げられる。
細胞の分化や増殖は、 被験物質と接触させない場合における細胞の状態と比較 することにより検出することができる。 細胞の分化や増殖は、 顕微鏡下において 形態学的な観察を行うこと、 または、 細胞で産生されるドーパミン等の物質を検 出、 定量して検出してもよい。
<65B13の発現領域解析 >
本発明により 65B13遺伝子の発現制御領域が提供される。 本発明の発現制御領 域は、 本発明のポリヌクレオチドを利用してゲノム DNAから公知の方法によって クロ一ニングすることができる。 例えば、 S1マッピング法のような転写開始点の 特定方法 (細胞工学別冊 8新細胞工学実験プロトコ一ル， 東京大学医科学研究所 制癌研究部編， 秀潤社 （1993) pp. 362- 374)が公知であり、 本発明において利用で きる。 一般に、 遺伝子の発現制御領域は、 遺伝子の 5 ' 末端の 15〜100bp、 好まし くは 30〜50bpをプローブ DNAとして利用して、 ゲノム DNAライブラリーをスクリ —ニングすることによりクローニングすることができる（本発明においては、 配列 0
- 42 - 番号： 1の 1〜176番目または配列番号: 2の 1〜126番目の塩基全部またはその 1 部)。 このようにして得られるクローンは、 lOkbp以上の 5' 非翻訳領域を含むも のであるので、 次にェキソヌクレアーゼ等により処理し短縮化または断片化する。 最後に、 短縮された発現制御領域の候補を含む配列部分をレポーター遺伝子を利 用して、 その発現の有無、 強さ、 制御等について評価し、 本発明の 65B13の発現 制御領域の活性維持のための最小必要単位を決定することができる。
遺伝子の発現制御領域は、 Neural Network等のプログラム（littp：〃 w . f itf ly. org./seq tools/promoter. html； Reese et al. , Biocoiputing: Proceedings of the 1996 Pacific Symposium, Hunter and Klein ed. , World Scientific Pub lishing Co., Singapore, (1996))を用いて予測することもできる。 さらに、 発現 制御領域の活性最小単位を予測するプログラム（lit tp：〃 biosci.cbs.umn.edu. /sof tware/proscan/promoterscan. htm; Prestridge (1995) J. Mol. Biol. 249: 923- 32)も公知であり、 本発明において用いることができる。
このようにして単離された、 65B13遺伝子の発現領域は、 in で分裂停止直 後のド一パミン産生ニューロン前駆細胞特異的に所望の蛋白質を産生するのに利 用することもできる。
<リガンドの同定 >
本発明により、 本発明のポリペプチドに対するリガンドが提供された。 本発明 のポリペプチドは膜貫通ドメインを有することから、 天然において細胞膜中に埋 め込まれた状態で存在すると考えられる。 分裂停止直後のドーパミン産生ニュー ロン前駆細胞で一過性に発現されていることから、 ニューロンの成熟に関与して いることが考えられる。 従って、 本発明のポリペプチドに対するァゴニストゃァ ン夕ゴニス卜等の機能を示す可能性があるリガンドは、 ドーパミン産生ニューロ ンの in vivo、 及び//? ^ oにおける分化を制御するのに利用できる可 能性がある。 本発明のポリペプチドに対するリガンドの同定においては、 まず、 13420
- 43 - 本発明のポリペプチドと候補化合物とを接触させ、 結合の有無を検定する。 この 際、 本発明のポリペプチドを担体に固定したり、 細胞膜に埋めこまれた状態に発 現させて用いることもできる。 候補ィ匕合物としては特に制限はなく、 遺伝子ライ ブラリーの発現産物、 海洋生物由来の天然成分、 各種細胞の抽出物、 公知化合物 及びペプチド、 植物由来の天然成分、 生体組織抽出物、 微生物の培養上清、 並び にファージディスプレイ法等によりランダムに製造されたペプチド群（J. Mol. Bi ol. 222: 301-10 (1991))等が含まれる。 また、 結合の検出を容易にするために、 候補化合物は標識しても良い。 図面の簡単な説明
図 1は、 65B13- aの cDNA配列及びアミノ酸配列を示す図である。 シグナル配列 及び膜貫通領域が下線で示される。
図 2は、 65B13-aの cDNA配列及びアミノ酸配列を示す図である。 シグナル配列 及び膜貫通領域が下線で示される。 図 1の続きを示している。
図 3は、 65B13- bの cDNA配列及びアミノ酸配列を示す図である。 シグナル配列 及び膜貫通領域が下線で示される。
図 4は、 65B13- bの cDNA配列及びアミノ酸配列を示す図である。 シグナル配列 及び膜貫通領域が下線で示される。 図 3の続きを示している。
図 5は、 65B13- a及び 65B13_bのアミノ酸配列の比較した図である。
図 6は、 65B13の構造の模式図である。 黒く塗りつぶされた部分は膜貫通領域 を、 また Igは、 Igドメインを示す。
図 7は、 E12.5マウス脳における 65B13mRNAの発現を /'/? / ハイブリダィゼ —シヨンにより解析した結果を示す写真である。 A:矢状断面、 B:傍矢状断面。 HB: 後脳、 MB:中脳、 SC:脊髄、 CB:小脳原基。
図 8は、 E12.5マウス脊髄における 65B13mRNAの発現を ίη ハイブリダィ ゼーシヨンにより解析した結果を示す写真である。 A:65B13、 B:NCAM、 C:65B13、 K i 67、 及び NCAMの発現領域の比較 (各々、 A及び Bの枠内部分を拡大して示す）。 図 9は、 E12. 5マウス中脳腹側における 65B13mRNA、 及びチロシンヒドロキシラ ーゼ (TH)mR Aの発現を in w'/ffハイブリダィゼーシヨンにより解析した結果を示 す写真である。 A: 65B13, B : THo
図 1 0は、 65B13の中脳における発現パターンを示す模式図である。
図 1 1は、 65B13の発現時期を示す模式図である。
図 1 2は、 抗 65B13抗体を用いたドーパミン産生ニューロン前駆細胞の分離及 び活用法を示す模式図である。
図 1 3は、 65B13 (Cy3)、 Nurrl (FITC) 、 TH (Cy5) タンパク質の発現を、 それ ぞれに対する抗体を用いて免疫蛍光染色法にて解析した結果を示す写真である。 図 1 4は、 65B13モノクローナル抗体を用いて、 マウス 12. 5日胚中脳腹側 (A) 、 または で ES細胞からド一パミン産生ニュ一ロンを分化誘導した 細胞群 (B) を染色し、 フロ一サイトメトリ一を用いて 65B13発現細胞を検出した 結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明についてより詳細に検討するが、 本発明はこれらの 実施例により何等限定されるものではない。
[実施例 1]ドーパミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子の単離及び配列解析 ドーパミン産生ニュ一ロン前駆細胞特異的な遺伝子を単離するために、 E12. 5 マウス中脳腹側と背側の RNAを用いてサブトラクシヨン (N-RDA)法により発現の差 のある遺伝子を増幅し、 得られた遺伝子の配列を解析した。
1. N - RDA法 00雇 3420
- 4 5 -
1-1. アダプターの調製
下記のオリゴヌクレオチドをァニーリングさせ、 100 Mに調製した。
(ad2: ad2S+ad2A> ad3: ad3S+ad3A、 ad4: ad4S+ad4A、 ad5: ad5S+ad5A, adl3: ad 13S+adl3A)
ad2S: cagctccacaacctacatcattccgt (配歹 (J番号： 11)
ad2A: acggaatgatgt (配列番号： 12)
ad3S: gtccatcttctctctgagactctggt (配列番号： 13)
ad3A: accagagtctca (配列番号： 14)
ad4S: ctgatgggtgtcttctgtgagtgtgt (配列番号： 15)
ad4A: acacactcacag (配列番号： 16)
ad5S: ccagcatcgagaatcagtgtgacagt (配列番号： 17)
ad5A: actgtcacactg (配列番号： 18)
adl3S: gtcgatgaacttcgactgtcgatcgt (配歹幡号： 19)
adl3A: acgatcgacagt (配列番号： 20)
1 - 2.CDNA合成
マウス 12.5日胚（日本 SLC)中脳腹側及び背側領域より RNeasy mini kit (Qiage n)を用い全 RNAを調製し、 cDNA synthesis kit (TAKARA)を用いて二本鎖 cDNAを 合成した。 制限酵素 Rsalで消化したのち、 ad2を付加し、 ad2Sをプライマ一とし て 72°Cで 5分インキュベートした後、 94でで 30秒、 65°Cで 30秒、 及び 72°Cで 2 分の反応を 15サイクルの PCRを行い、 最後に 72°Cで 2分インキュベートし、 cDN Aを増幅した。 N- RDAの PCRはすべて以下の反応液組成で行った。
lOXExTaq 5 1
Figure imgf000046_0001
ExTaq 0.25 1
IOO M primer 0.5 1 P2003/013420
- 46 - cDNA 2 1
蒸留水 38.25 1
1-3. Driverの作製
ad2Sで増幅した cDNAをさらに、 94°Cで 2分インキュベートした後、 94 で 30 秒、 65°Cで 30秒、 及び 72でで 2分の反応を 5サイクルの PCRを行い、 最後に 7 2°Cで 2分インキュベートした。 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)を用い て cDNAを精製し、 Rsal消化した。 1回のサブトラクシヨンに 3^gずつ使用した。 卜 4. Testerの作製
ad2Sで増幅した cDNAをさらに 94°Cで 2分ィンキュベートした後、 94 で 30秒、 65°Cで 30秒、 及び 72°Cで 2分の反応を 5サイクルの PCRを行い、 最後に 72 で 2分インキュベートした。 Qiaquick PCR purification kit (Qiagen)を用いて cDN Aを精製し、 Rsal消化した。 60ngの Rsal消化 cDNAに ad3を付加した。 卜 5.サブトラクシヨン 1回目
上記 3及び 4で作製した Testerおよび Driverを混合し、 ェ夕ノール沈殿した 後に、 lxPCR buffer 1 1に溶解した。 98°C5分の後、 lxPCR buffer+ΙΜ NaCl 1 lを加えた。 さらに 98で 5分の後、 68 で 16時間ハイブリダィズさせた。
ハイブリダイズさせた cDNAを ad3Sをプライマーとして 72°Cで 5分ィンキュベ ートした後、 94°Cで 30秒、 65でで 30秒、 及び 72°Cで 2分の反応を 10サイクル 行った。 続いて、 Mung Bean Nuclease (TAKARA)で消化し、 Qiaquick PCR purific ation kitで精製した。 さらに 94でで 2分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65^で 30秒、 及び 72°Cで 2分の反応を 13サイクルの PCRを行い、 最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 13420
- 4 7 -
1—6.均一化
サブトラクシヨン 1回目で増幅した cDNA 8ngに 2xPCR buf fer l \を加えた。 98t 5分の後、 lxPCR buf ferHM NaCl 2 1を加えた。 さらに 98°C5分の後、 68°C で 16時間ハイブリダイズさせた。
ハイブリダィズさせた cDNAを Rsalで消化し、 Qiaquick PCR puri f icat ion ki t で精製した。 これを ad3S をプライマーとして 94。Cで 2分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 及び 72°Cで 2分の反応を 11サイクルの PCRを行い、 最後に 72°Cで 2分ィンキュベ一トした。 Rsalで消化し、 ad4を付加した。 1-7.サブトラクシヨン 2回目
上記 6で ad4を付加した cDNA 20ngを Tes terとして、 上記 3の Driverと混合 し、 さらに、 上記 5と同様の方法でサブトラクシヨンを行った。 最終的に Rsal消 化した cDNAに ad5を付加した。 卜 8.サブトラクシヨン 3回目
上記 7で ad5を付加した cDNA 2ngを Tes terとして、 上記 3の Driverと混合し， さらに、 上記 5と同様の方法でサブトラクシヨンを行った。 最終的に Rsal消化し た cDNAに adl3を付加した。 1-9.サブトラクシヨン 4回目
上記 8で adl3を付加した cDNA 2ngを Testerとして、 上記 3の Driverと混合 し、 以下、 上記 5と同様の方法でサブトラクシヨンを行った。 増幅した cDNAを p C I I (Invi trogen)にクローニングし、 ABI3100シーケンスアナライザ一を用いて 塩基配列を解析した。
次に、 N- RDA法により得られた 65B13断片の配列を用い、 以下の方法で RACEを 行った。 TJP2003/013420
4 8
2. MCE法
マウス 12.5日胚脳より RNeasy mini kit (Qiagen)により全 RNAを調製し、 βΜ
ACS mRNA isdolation kit (Miltenyi Biotec)を用いて mRNAを調製した。 調製し た mRNAより、 Superscript choice system (Invitrogen)および pCRIIベクター (I nvitrogen)を用いて cDNAライブラリーを調製した。 これよりプラスミド DNAを調 製し、 以下のプライマーを用いて PCRを行った。
TAU2： GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTC (配列番号 :21)
TAU4: CAGCTATGACCATGATTACGCCAAGC (配列番号： 22)
TAD3: AGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGG (配列番号： 23)
TAD4: CCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGG (配列番号： 24)
65B13 Fl: CTTCCCGTATGCTACCTTGTCTCCAC (配列番号： 25)
65B13 F2: TCCATCTCTCCAAGTGAAGGGTCTTG (配列番号： 26)
65B13 Rl: CCAACAGTCCTGCATGCTTGTAATGA (配列番号： 27)
65B13 R2: TCCTTCAATGTTCAGTTTTGGAGGGG (配列番号： 28)
PCRの条件は次の通りであった。
1st PCR
lOXExTaq 2 Ι
2.5mM dNTP 1.6/ l
ExTaq ΟΛ Ι
lOO^M TAU2または TAD3 0.04 1
IOO M 65B13 Flまたは Rl 0.2 Ι
Figure imgf000049_0001
蒸留水 15.06 1
94°Cで 5分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65でで 30秒、 及び 72°Cで 5 分の反応を 25サイクル行い、 最後に 72°Cで 2分インキュベートした。 続いて、 1 PC蘭 00聽 420
- 49 - 回目の PCRにより得られた産物を 100倍希釈して 2nd PCRを行った。 2nd PCRの 条件は次の通りであった。
2nd PCR
lOXExTaq 5^1
2.5mM dNTP 4^1
ExTaq 0.25^1
ΙΟΟ^Μ TAU4または TAD40.1^1
IOO M 65B13 F2または R2 Ο.δμΐ
1/100 1st PCR産物 1^1
蒸留水 15.06^1
94°Cで 5分インキュベートした後、 94°Cで 30秒、 65°Cで 30秒、 及び 72°Cで 5 分の反応を 25サイクル行い、 最後に 72でで 2分インキュベートした。 増幅され た cDNA断片を pCRIIにクローニングし、 ABI3100シーケンスアナライザーを用い てシーケンスの解析を行った。
得られた 2つの遺伝子、 65B13_a及び 65B13-bのヌクレオチド配列を配列番号： 1(図1及び2)、 及び配列番号： 2 (図 3及び 4)として示す。 65B13-aのコード領域 は、 配列番号： 1の 177番目の Aから始まり、 2278〜2280番目の終止コドンまで 続き、 700アミノ酸からなる蛋白質をコードする。 そして、 そのうち 177番目か ら 228番目までの配列にコードされる 17アミノ酸残基はシグナル配列、 1717番 目から 1767番目までの配列にコードされる 17アミノ酸残基は膜貫通領域であつ た。 それに対し、 65B13-bのコード領域は、 配列番号： 2の 127番目の Aから始ま り、 2277〜2079番目の終止コドンまで続き、 650アミノ酸からなる蛋白質をコ一 ドする。 そして、 そのうち 127番目から 177番目までの配列にコードされる 17ァ ミノ酸残基はシグナル配列、 1516番目から 1566番目までの配列にコードされる 1 7アミノ酸残基は膜貫通領域であった。 65B13- a及び 65B13- b遺伝子にコードされ るアミノ酸配列を配列番号： 3及び 4として示す。 図 5において示すように、 両遺 伝子によりコードされるアミノ酸配列を比較したところ、 65B13- aと 65B13- bと はアルタナティブスプライシングによるアイソフォームであり、 65B13- bは 65B1 3-aに対し N末端側の 50アミノ酸が欠失いることが判明した。 65B13遺伝子によ りコードされる蛋白質はホモロジ一サーチにより、 図 6に示すような 5つの Igド メインを持つ、 一回膜貫通型蛋白質であると考えられた。
[実施例 2] 65B13遺伝子の発現解析
次に、 これらの遺伝子を用いて以下のプロトコールにより ハイブリダ ィゼ一ションによる発現解析を行った。
まず、 マウス 12. 5日胚を OCTで包埋し、 厚さ の新鮮凍結切片を作製した。 スライドガラス上で乾燥させた後に 4%PFAで室温 30分間固定した。 PBSで洗浄 した後、 ハイブリダィゼーシヨン （l g/mlDIG化 RNAプローブ、 50 ホルムアミ ド、 5xSSC， 1%SDS, 50 2 /ml yeas t RNA, 50 w g/ml Hepar in) を 65度で 40時間 行った。 その後、 洗浄 （50%ホルムアミド、 5xSSC, 1¾SDS) を 65度で行い、 RNase 処理 （5 g/ml RNase) を室温 5分間行った。 0. 2xSSCで 65度の洗浄、 lxTBSTで 室温で洗浄の後、 ブロッキング （Bl ocking reagent : Roche) を行った。 アルカリ フォスファタ一ゼ標識抗 DIG抗体 (DAK0) を反応させ、 洗浄 (lxTBST, 2mM Levam i sol e) の後、 NBT/BCIP (DAK0)を基質として発色させた。
そして、 これらの遺伝子を用いた in w'/tfハイブリダィゼ一ションによる発現 解析の結果、 ド一パミン産生ニューロンの発生する時期である E12. 5で、 65B13 が中脳腹側、 小脳原基、 後脳、 及び脊髄で発現していることが判った（図 7)。 脊 髄における発現をさらに増殖マーカ一である Ki67及び成熟マ一カーである NCAM と比較したところ、 Ki 67陽性の神経前駆細胞 (neural progeni tor)の増殖する領 域である脳室領域 (ventricul ar zone ;VZ)内の一部の細胞に 65B13が発現している のに対し、 分裂停止後のより成熟した NCAM陽性の前駆細胞の存在する外套層 (man t ie l ayer ; ML)内には発現が認められなかった（図 8)。 脊髄以外の領域でも同様 に、 VZ内の一部の細胞で発現が認められた。 これらの発現パターンから、 65B13 は分裂停止直後の神経前駆細胞で一過性に発現するものと考えられた。
中脳では、 最も腹側にあたる領域の VZ内のみで発現が認められた。 ドーパミン 産生ニュ一ロンのマ一力一遺伝子であるチロシンヒドロキシラ一ゼ（tyros ine hyd roxyl se; TH)の発現と比較すると、 THは MLにのみ発現しているため同一の細胞 で両者の発現が認められることはないものの、 背-腹軸方向で発現領域が完全に一 致していることが判明した（図 9)。 一般に神経管内の神経細胞は、 まず VZ内で増 殖し、 分化開始と共に分裂を停止し、 その後、 すぐ外側の MLに移動してから成熟 することが知られている。 従って、 ド一パミン産生ニューロンの前駆体は、 TH発 現領域のすぐ内側の VZ内で増殖し、 分裂停止後に外側に移動してから THを発現 するものと考えられている。 この前駆体の増殖する VZ領域が 65B13の発現領域と 一致することから、 65B13は、 中脳では分裂停止直後のドーパミン産生ニューロ ン前駆細胞に特異的、 且つ一過性に発現すると考えられた（図 10及び 11)。 [実施例 3 ] 65B13夕ンパク質の発現解析
次に、 65B13遺伝子のうち、 細胞外領域をコードする遺伝子配列を用いて、 以下 のプロトコ一ルにより抗 65B13抗体を作製し、 免疫組織染色による発現解析を行つ た。
まず、 65B13遺伝子のうち、 細胞外領域をコードする遺伝子配列を 293E細胞に遺 伝子導入して、 65B13タンパク質の細胞外領域を発現させて回収した。 回収したタ ンパク質をハムスターに免疫したのち、 リンパ球細胞を取り出してミエローマ細 胞とフュージョンさせた。 フュージョンさせた細胞をマウスの腹腔内に移植し、 腹水を得て、 抗 65B13モノクローナル抗体を精製した。 次にマウス 12. 5日胚を4% A/PBS (-)で 4で、 2時間固定したのち、 20 ショ糖/ PBS (-)で 4°C、 ー晚置換し、 OCT で包埋した。 厚さ 12umの切片を作製し、 スライドガラスに貼り付けた後、 室温で 3 0分乾燥させ、 PBS (-)で再び湿潤させた。 その後、 ブロッキング （ブロックエー PC漏 00聽 420
- 5 2 - ス） を室温、 20分間行い、 作製した抗 65B13モノクローナル抗体 (10ug/mK 2. 5¾ ブロックエース/ PBS) 、 抗 TH抗体 (Chemicon, 0. 7ug/mU 2. 5%ブロックエース/ PB S) 、 抗 Nurrl抗体 (Santa Cruz, 4ug/ml、 2· 5 ブロックエース/ PBS) を室温、 1時 間反応させた後、 さらに 4°C、 ー晚反応させた。 0. Tri ton X- 100/PBS (-)で、 室 温、 10分間の洗浄を 4回行った。 Cy3標識抗ハムスター IgG抗体、 FITC標識抗ゥサギ IgG抗体、 Cy5標識抗マウス IgG抗体 (Jackson, 10ug/mK 2. 5%ブロックエース） を 室温、 1時間反応させ、 同様に洗浄を行った後、 PBS (-)によって室温、 10分間洗浄 し、 包埋した。
そして、 作製した抗 65B13モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色による発現 解析の結果、 5/ 八イブリダィゼ一シヨンによる発現解析の結果と同様に、 ド ーパミン産生ニューロンの発生する時期である E12. 5で、 中脳腹側に発現が認めら れた (図 1 3 ) 。 ドーパミン産生ニューロンのマーカ一である TH、 Nurrlタンパク 質の発現と比較すると、 65B13タンパク質は TH、 Nurrlタンパク質が発現する中脳 最腹側の VZ側に発現していることから、 65B13タンパク質はド一パミン産生ニュー ロン前駆細胞に発現していると考えられた。
[実施例 4]フローサイトメトリ一による 65B13発現細胞の検出
次に、 抗 65B13モノクローナル抗体を用いて、 フローサイトメトリーによる 65B1 3発現細胞の検出を行った。
まず、 マウス 12. 5日胚より中脳腹側部分を切り出したもの、 または、 in vi tro において ES細胞より分化誘導させたドーパミン産生ニュ一ロン前駆細胞を含む細 胞群を、 細胞分散バッファ一 （Invi trogen) を用いて分散させた後、 固定'透過 処理せずに、 抗 65B13モノクローナル抗体 （10ug/ml、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTA/ PBS) で 4で、 20分間染色した。 その後、 1%ゥシ胎児血清、 ImM EDTA/PBS (-)で 4°C、 3分間の洗浄を 3回行い、 PE標識抗ハムスター IgG抗体 (Pharmingen, 4ug/mK ^ゥ シ胎児血清、 ImM EDTA/PBS) で 4で、 20分間染色し、 同様に洗浄して、 フローサイ トメ一ターにて 65B13発現細胞を検出した。
そして、 作製した抗 65B13モノクローナル抗体を用いたフローサイトメトリーに よる 65B13発現細胞の検出の結果、 65B13タンパク質を発現する集団を検出した (図 1 4 ) 。 固定 ·透過処理することなく、 65B13発現細胞を検出できることから、 セルソーターを付属したフローサイトメータ一を用いることにより、 65B13発現細 胞を生細胞の状態で分離することが可能であると考えられた。 65B13タンパク質は ドーパミン産生ニューロン前駆細胞に発現していると考えられることから、 65B1 3 はド一パミン産生ニュ一ロン前駆細胞の分離に有用であると考えられた。 産業上の利用の可能性
本発明により、 分裂停止直後のド一パミン産生ニュ一ロン前駆細胞に特異的、 且つ一過性に発現する新規遺伝子 65B13が得られた。 細胞における該 65B13の発 現を指標とすることにより、 安全面、 生存率及びネットワーク形成能の面でもパ 一キンソン病を含む神経変性疾患に対する移植治療に適した細胞を選択すること が可能となった。 また、 分裂停止直後のニューロン前駆細胞を選択的に得られる ため、 成熟した細胞の求められる治療等において使用する場合であっても、 in vi /oで最適な状態へと容易に分化させることができる。 さらに、 本発明の遺伝子 を用いて得られるド一パミン産生ニューロン前駆細胞により、 該細胞に特異的に 発現している遺伝子を単離することが可能となった。 該細胞は、 パーキンソン病 等の神経変性疾患に対する医薬を開発する上でも有用と考えられる。 分裂停止直 後のド一パミン産生ニューロン前駆細胞という、 ニューロン形成における初期の 前駆細胞は、 さらに、 ニューロンの成熟過程、 即ち、 成熟過程に関与する種々の 因子を明らかにするのに役立つ。 このような因子の解明は、 神経変性疾患の治療 に大きく貢献することが予期される。 さらに、 該細胞の成熟を指標として、 その 過程を調節（阻害または促進)するような物質のスクリーニングに用いることもで さる。

Claims

W0 2004/038018 PC漏 00聽 420 - 5 4 - 請求の範囲
1 . 分裂停止直後のドーパミン産生ニューロン前駆細胞に特異的に発現する 65B1 3ポリペプチド、 またはその抗原性断片をコードする以下の（1)〜 (4)のヌク レオチド配列から選択される配列を含むポリヌクレオチド。
(1)配列番号： 1の 177から 2280番目の塩基、 若しくは配列番号： 2の 127番目 から 2079番目の塩基を含む核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配列
(2)配列番号: 3若しくは 4記載のアミノ酸配列をコードする核酸配列、 また は該核酸配列に相補的な配列
(3)配列番号: 3若しくは 4記載のアミノ酸配列においてシグナル配列部分を 欠く配列をコ一ドする核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配列 (4)配列番号: 3または 4記載のアミノ酸配列において 1若しくは複数個のァ ミノ酸が欠失、 揷入、 置換、 または付加されたアミノ酸配列をコードする 核酸配列、 または該核酸配列に相補的な配列
(5)上記（1)の配列に対してストリンジェントな条件下でハイブリダィズする 核酸配列
2 . 請求項 1記載のポリヌクレオチドを含むベクタ一。
3 . 請求項 1記載のポリヌクレオチドまたは請求項 2記載のべク夕一を含む宿主 細胞。
4 . 請求項 1記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
5 . 請求項 4記載のポリペプチドの断片であり、 少なくとも 8アミノ酸残基を有 するポリペプチド断片。
6 . 請求項 4記載のポリペプチド、 または請求項 5記載のポリペプチド断片に対 する抗体。
7 . 請求項 5記載のポリペプチド断片をコードするヌクレオチド鎖。
8 . ドーパミン産生ニューロンを選択する方法であり、 請求項 6記載の抗体とド —パミン産生ニューロン前駆細胞 sを含むと考えられる細胞試料とを接触さ せる工程を含む方法。
ドーパミン産生ニューロンを選択する方法であり、 請求項 4記載のポリぺプ チドの少なくとも細胞外領域部分を含むペプチドとドーパミン産生ニューロ ン前駆細胞を含むと考えられる細胞試料とを接触させる工程を含む方法。
· 請求項 8または 9記載の方法により選択された分裂停止直後のドーパミン 産生ニューロン前駆細胞。
. ド一パミン産生ニューロン前駆細胞特異的遺伝子及び前駆細胞からドーパ ミン産生ニューロンへの各成熟段階に特異的な遺伝子の単離方法であって、 請求項 10記載の前駆細胞または該前駆細胞から分化、 誘導若しくは増殖さ れた細胞を用い、 該細胞において特異的に発現している遺伝子を検出、 単 離する工程を含む方法。
. 成熟を指標としたスクリーニング方法であり、 請求項 10記載の前駆細胞に 対し、 被験物質を接触させる工程、 及び接触による前駆細胞の分化または 増殖を検出する工程を含む方法。
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