WO2004018744A1 - 結晶核の製造方法および結晶化条件スクリーニング方法 - Google Patents

結晶核の製造方法および結晶化条件スクリーニング方法 Download PDF

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WO2004018744A1
WO2004018744A1 PCT/JP2003/010681 JP0310681W WO2004018744A1 WO 2004018744 A1 WO2004018744 A1 WO 2004018744A1 JP 0310681 W JP0310681 W JP 0310681W WO 2004018744 A1 WO2004018744 A1 WO 2004018744A1
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laser
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crystallization
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Takatomo Sasaki
Yusuke Mori
Masashi Yoshimura
Hiroaki Adachi
Hiroshi Masuhara
Youichiroh Hosokawa
Kazufumi Takano
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Osaka Industrial Promotion Organization
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C30—CRYSTAL GROWTH
    • C30B—SINGLE-CRYSTAL GROWTH; UNIDIRECTIONAL SOLIDIFICATION OF EUTECTIC MATERIAL OR UNIDIRECTIONAL DEMIXING OF EUTECTOID MATERIAL; REFINING BY ZONE-MELTING OF MATERIAL; PRODUCTION OF A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; SINGLE CRYSTALS OR HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; AFTER-TREATMENT OF SINGLE CRYSTALS OR A HOMOGENEOUS POLYCRYSTALLINE MATERIAL WITH DEFINED STRUCTURE; APPARATUS THEREFOR
    • C30B29/00—Single crystals or homogeneous polycrystalline material with defined structure characterised by the material or by their shape
    • C30B29/54—Organic compounds
    • C30B29/58—Macromolecular compounds
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S117/00—Single-crystal, oriented-crystal, and epitaxy growth processes; non-coating apparatus therefor
    • Y10S117/903—Dendrite or web or cage technique
    • Y10S117/904—Laser beam

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing crystal nuclei and a method for screening crystallization conditions.
  • a first object of the present invention is to provide a technique capable of easily and efficiently producing high-quality crystals, and to provide a technique capable of easily determining crystallization conditions.
  • This is the second purpose.
  • a method for producing a crystal nucleus according to the present invention comprises: a picosecond pulse laser and a femtosecond pulse laser for a solution in which a solute to be crystallized is dissolved. This is a method of generating a crystal nucleus by irradiating at least one of the pulse lasers.
  • the screening method for crystallization conditions of the present invention comprises: a picosecond pulse laser and a femtosecond pulse laser for a solution in which a solute to be crystallized is dissolved.
  • At least one of a step of irradiating at least one of the pulse lasers, a step of determining whether crystal nuclei are generated by the laser irradiation, and a step of determining whether a solute is changed by the laser irradiation is changed by the laser irradiation.
  • the generation of crystal nuclei is observed by irradiating the pulse laser, and if the crystal nuclei are generated, it can be determined that the conditions of the solution and the like are suitable for crystallization.
  • the state of the solute is observed by irradiating the pulse laser, If the quality has changed, it can be determined that the conditions such as the solution are suitable for crystallization.
  • the change in the solute is, for example, a change in the three-dimensional structure (denaturation).
  • a supersaturated solution is irradiated with at least one of a picosecond pulse laser and a femtosecond pulse laser, crystal nuclei are generated, but the mechanism is unknown.
  • the present inventors presume as follows. That is, at the focal point of the pulse laser, a high density of photons is concentrated, so that several photons collide with one solute molecule or solvent molecule, and the phenomenon of absorbing light (multiphoton absorption) has a high probability. Occur. As a result, when the pulsed laser is focused, an explosion phenomenon (laser ablation) is induced at the focal point due to rapid light absorption. Crystal nucleation is thought to occur as a perturbation. Then, the following three mechanisms can be considered.
  • the pulse laser causes photothermal conversion, and the solution near the focal point evaporates instantaneously, resulting in crystal nuclei as a result of solute concentration.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of a laser irradiation apparatus used in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a configuration diagram showing an example of an apparatus for measuring the magnitude of a shock wave due to laser irradiation.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing an example of a relationship between a shock wave of a pulsed laser and the movement of a particle.
  • FIG. 4 is a graph showing a relationship between a moving distance of a particle due to a shock wave measured by the apparatus and a focal point of a laser beam.
  • FIG. 5 is a graph showing the relationship between the intensity of the shock wave and the laser intensity measured by the above-mentioned device.
  • FIG. 6 is a configuration diagram of a laser irradiation apparatus used in another embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a configuration diagram of a laser irradiation apparatus used in still another embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a photograph of a protein crystal generated in one example of the present invention.
  • FIG. 9 is a photograph of a protein crystal generated in another example of the present invention.
  • FIG. 10 is a photograph of a protein crystal generated in still another example of the present invention.
  • FIG. 11 is a photograph of a protein crystal generated in still another example of the present invention.
  • FIG. 12 is a photograph of a protein crystal generated in still another example of the present invention.
  • FIG. 13 is a photograph of a protein crystal generated in still another example of the present invention.
  • FIG. 14 is a schematic diagram of the stirring device used in Reference Example 2.
  • FIGS. 15A and 15B are photographs showing crystals obtained by the conventional method
  • FIGS. 15C and 15D are photographs showing the crystals obtained in Reference Example 2.
  • FIG. 16 is a sectional view showing an example of the container of the present invention.
  • FIG. 17 is a perspective view showing an example of the plate of the present invention.
  • FIG. 18 is a view showing another example of the container of the present invention, wherein A is a plan view and B is a plan view.
  • FIG. 19 is a view showing still another example of the container of the present invention, where A is a plan view and B is a cross-sectional view.
  • FIG. 20 is a sectional view showing still another example of the container of the present invention.
  • the present invention will be described in more detail.
  • at least one of a picosecond pulse laser and a femtosecond pulse laser is focused into a solution by a lens, and a single or multiple local lasers are focused at the focusing position. It is preferable to cause an explosion phenomenon, thereby generating a crystal nucleus, and it is also preferable to change a solute according to the explosion phenomenon.
  • the light density (photon flux) of the pulse laser is, for example, 5 ⁇ 10 5 (watt) or more, and preferably 2 ⁇ 10 9 (watt) or more.
  • the upper limit of the light density of the pulse laser is not particularly limited, but is, for example, 10 18 (watt) or less, preferably 10 15 (watt) or less, and more preferably 10 12 (watt) or less. is there.
  • the laser conditions are set according to the time width, for example, as follows. be able to.
  • the pulse laser includes a picosecond pulse laser and a femtosecond pulse laser, and among them, the femtosecond laser is particularly preferable.
  • Pulsed laser irradiation may be performed singly or may be performed repeatedly.
  • the number of pulsed laser irradiations is not particularly limited, but is, for example, in the range of 1 (single shot) to 1,000,000 shots. Also, repeat multiple
  • the laser repetition frequency in the case of irradiation is, for example, in the range of 1/10000000 Hz to 1 kHz.
  • the irradiation time is not particularly limited, and is, for example, in the range of 1 second to 1 hour.
  • the solution in which the solute to be crystallized is dissolved is preferably a supersaturated solution, and more preferably a low supersaturated solution.
  • the concentration of the protein solution is, for example, 200 to 500%, preferably 100 to 300%, and more preferably 50 to 200%.
  • the concentration of the organic solution is, for example, 20 to 50%, preferably 10 to 30%, and more preferably 5 to 20%.
  • the proteins targeted by the present invention include, for example, lysozyme, glucose isomerase, xinylase, myoglobin, catalase, trypsin, human lysozyme, photoactive yellow protein, phosphoenolpyruvate lipoxylase, and liponuclease.
  • FIG. 1 shows an example of an apparatus for performing the method of the present invention.
  • this apparatus has a phytom-second laser irradiation means 1, a mechanical shirt 1, a half-wave plate 3, a polarizer 4, a condenser lens 5, and a thermostatic water bath 8.
  • a constant temperature water tank 8 contains water 9, in which a sample container 6 containing a solution 7 in which a solute to be crystallized is dissolved is arranged.
  • the solubility of the solution 7 is lowered by gradually lowering the temperature to make the solution 7 in a supersaturated state.
  • the crystal growth is accelerated.
  • the laser beam 10 is irradiated from the laser beam irradiation means 1
  • the laser beam 10 passes through the mechanical shirt 1, the half-wave plate 3, the polarizer 4, and the condenser lens 5, and in the solution 7.
  • the light is condensed, and an explosion occurs due to rapid light absorption, which induces crystal nucleation.
  • a high quality single crystal can be obtained by slowly growing it over time based on this crystal nucleus.
  • screening crystallization conditions prepare a plurality of solutions in which the concentration of the solution, the composition ratio of the solute, and the temperature conditions are slightly changed, irradiate them with laser light, and observe the solution. Then, when the generation of crystal nuclei and the change in the solute can be confirmed, the solution is determined to be suitable for the crystallization conditions. Otherwise, it is determined that the crystallization conditions are not suitable.
  • the screening method of the present invention is preferably used as a primary screening for determining crystallization conditions.
  • the solution in which the solute to be crystallized is dissolved generates the crystals while agitating the solution by moving a container containing the solute, and grows the crystals.
  • the solution in which the solute to be crystallized is dissolved instead of directly stirring the solution itself, by rotating, vibrating, or oscillating the container containing the solution, indirectly stirring the solution, it is easy and gentle stirring.
  • the convection of the solution Can be freely controlled, so that stirring suitable for crystal formation can be selected.
  • the movement is not particularly limited, and includes rotation, vibration, swing, and the like, and may be a combination of two or more of these.
  • the degree of the movement is not particularly limited, and is appropriately determined according to the type of the polymer solution and the like. In the case of circular motion, for example, it is 10 to 1000 rpm, preferably 30 to 200 rpm, and more preferably 50 to 100 rpm.
  • the container is not particularly limited, and for example, a beaker, a petri dish, and a plate having a plurality of holes can be used.
  • the generation and growth of crystals can be performed, for example, by bringing the solution into a supersaturated state.
  • the supersaturated state may be obtained, for example, by evaporating the solvent in the solution.
  • Evaporation is not particularly limited, and includes spontaneous evaporation, evaporation by heating, evaporation by drying under reduced pressure, freezing by freeze drying, and the like.
  • another container containing a reservoir solution in which components other than the solute are dissolved at a higher concentration than the solution is prepared, and in this container and the container containing the solution to be crystallized, steam is removed.
  • the evaporation of the solution to be crystallized can be promoted under mild conditions, which is particularly preferable for biomolecules such as easily denatured proteins.
  • Such a method is usually called a vapor diffusion method.
  • the field of crystal growth is not particularly limited.
  • the grown crystals sediment because they are heavier than the solution and move to the bottom of the vessel.
  • Such a method is usually referred to as a sitting drop method.
  • crystals form at the bottom of the vessel. If it gets longer, it may stick here and interfere with collection. Therefore, it is preferable that a liquid having a higher specific gravity than the solution to be crystallized is put into the container, and crystals are grown at an interface between the liquid having a higher specific gravity and the solution.
  • a method is usually referred to as a floating-drop method.
  • the substance to be crystallized is not particularly limited, and examples thereof include resins, proteins, saccharides, lipids, and nucleic acids.
  • the container of the present invention is a container used for the production method or screening of the present invention.
  • the containers of the present invention are the following three types of containers.
  • the first container of the present invention is a container used for the method for producing a crystal nucleus or a crystal of the present invention or a container used for screening of the crystallization conditions of the present invention, wherein the first container for containing a solution of the substance to be crystallized is provided.
  • This container promotes the evaporation of the solvent in the solution of the crystallization target substance by the so-called vapor diffusion method and promotes the generation of crystals of the crystallization target substance.
  • vapor diffusion method By irradiating one room with a single laser beam, crystal nuclei are forcibly generated, and crystallization conditions are screened. Further, a plurality of the first containers may be formed in one plate.
  • the second container of the present invention is a container used for the method for producing a crystal nucleus or a crystal of the present invention or a container used for screening of the crystal conditions of the present invention.
  • a second chamber for storing a reservoir solution in which only a component other than the crystallization target substance in the solution of the crystallization target substance is dissolved at a higher concentration than the solution of the crystallization target substance; and And a passage through which gas can pass, and a plurality of the first rooms, which communicate with one or more of the second rooms through a plurality of the passages.
  • the plurality of passages are containers having at least one of different passage diameters or passage lengths, respectively, and a part or the whole of the first chamber is in the solution of the substance to be crystallized.
  • the one ray can be irradiated
  • Such as in a container is transparent or semi-transparent.
  • This container promotes the evaporation of the solvent of the solution of the substance to be crystallized by the so-called vapor diffusion method, and promotes the generation of crystals of the substance to be crystallized. Since either or both are different, multiple vapor diffusion conditions can be set at the same time. In this process, the optimum conditions for crystallization are screened, and crystals are generated under those conditions.
  • a plurality of the second containers may be formed in one plate.
  • the third container of the present invention is a container used for the method for producing a crystal nucleus or crystal of the present invention or a container used for screening of the crystal conditions of the present invention, wherein the solution of the substance to be crystallized and the crystallization
  • This container promotes the evaporation of the solvent of the solution of the crystallization target by the so-called vapor diffusion method, and generates crystals of the crystallization target at the interface between the solution of the crystallization target and the immiscible high specific gravity liquid.
  • the solution of the substance to be crystallized may be small.
  • the immiscible high specific gravity liquid located in the large volume portion of the first chamber is stirred with, for example, a magnet stirrer, the solution of the target substance to be crystallized is indirectly stirred. It is possible to stir and further promote crystallization.
  • the shape of the lower large volume portion is an inverted truncated cone or inverted pyramid shape
  • the shape of the upper small volume portion is a cylinder or a square tube,
  • the two are connected.
  • a droplet of the solution of the crystallization target substance is formed on the tip opening of the upper small volume portion, and in this state, the crystallization target substance is formed. It is possible to evaporate the solvent of this solution.
  • a plurality of the third containers may be formed in one plate.
  • the substance to be crystallized is not particularly limited, and includes, for example, a resin, a protein, a saccharide, a lipid, and a nucleic acid.
  • the container of the present invention is applied to protein crystallization.
  • Proteins include, for example, chicken egg white lysozyme, human lysozyme, glucose isomerase, xinalase, phosphoenolpyruvate lipoxylase, liponuclease, prostaglandin F2 synthetic enzyme, adenosine deaminase,
  • One example is the transport of major foreign substances.
  • the apparatus shown in FIG. 1 was used in Examples 1 and 2, Comparative Example 1 and Reference Example.
  • This device focuses a high-power femtosecond titanium sapphire laser 10 by a lens 5 with a focal length of 170 dragons and irradiates it to a sample solution 7 in a thermostatic water bath 8.
  • the thermostatic bath 8 can control the temperature with an accuracy of ⁇ 0.05.
  • Laser 10 has a wavelength of 800 nm and a time width of 120 fs.
  • the repetition frequency of laser oscillation can be adjusted from 1 kHz to 1 Hz.
  • the repetition frequency is adjusted to 20 Hz, and the single pulse is extracted by opening the mechanical shutter 22 for 50 ms from the pulse train.
  • the laser light intensity can be adjusted by the half wavelength 3 and the polarizer 4. In this apparatus, it is possible to irradiate the laser pulse intensity to the sample solution 7 250 J / pulse (2 X 1 0 9 wa tt). (Example 1)
  • DAST 4-dimetyl amino-N-metyl-4-N-sti ibazolium tosylate
  • Teflon container 6 having a capacity of 200 ml together with 200 ml of methanol and a rotor.
  • Solution 7 was divided into three parts to form a growth solution. 'At this time, the rotor was removed. After 16 hours of solution preparation, the mixture was heated at 55 ° C for 10 hours, and then lowered by 3 ° C every hour to 23 ° C.
  • Chicken egg white lysozyme was used for crystal nucleation.
  • the solution was prepared by adding 0.467 g of sodium acetate trihydrate to 50 ml of distilled water, adjusting the pH to 4.5 by adding acetic acid, and then adding 1.25 g of sodium chloride and 1.25 g of chicken egg white lysozyme.
  • the sample solution 7 adjusted to room temperature was placed in a 100 ml Teflon container 6, kept in a constant temperature water bath 8 at 40 ° C. for 24 hours, and completely dissolved. Thereafter, the mixture was cooled to 25 ° C in 5 hours, and impurities were removed with a membrane filter.
  • the light intensity 250 a J / pulse (2 X 1 0 9 watt) of Fuemuto Byopa pulse laser solution 7 in a minute are sequentially irradiated and observed changes. Irradiation conditions were such that the repetition frequency of the laser was changed, and the two glass bottles were irradiated at 50 Hz and 100 Hz, respectively. As a control, the four glass bottles were not irradiated with the laser. One day after the laser irradiation, it was visually confirmed that crystals had precipitated in the solution at 50 Hz and 100 Hz. No crystals were found in the solution without laser irradiation.
  • Example 2 Using a protein solution under the same conditions as in Example 2, a YAG laser (wave Irradiation of 1064 ns (5 ns) was attempted to generate crystal nuclei.
  • the protein solution was prepared by adding 0.467 g of sodium acetate trihydrate to 50 ml of distilled water, adjusting the pH to 4.5 by adding acetic acid, and then adding 1.25 g of sodium chloride and 1.25 g of hen egg white lysozyme. In addition, it was prepared.
  • the sample solution 7 adjusted to room temperature was placed in a 100 ml Teflon container, and kept at 40 ° C. for 24 hours in a thermostatic water bath to completely dissolve the sample solution.
  • the solution was sequentially irradiated with a YAG laser for 1 minute into the solution, and the change was observed.
  • Irradiation conditions were such that the laser repetition frequency was changed, and irradiation was performed at 10 Hz, 20 Hz, 50 Hz, 100 Hz, 500 Hz, and 1000 Hz, respectively.
  • Four glass bottles were not irradiated with laser light as a control.
  • the laser intensity was 1.2 mJ / pu 1 se.
  • One day after the laser irradiation no precipitation of crystals could be confirmed.
  • the temperature was lowered to 16 ° C in 10 hours, kept for 12 hours, and confirmed that no crystals were precipitated.
  • the laser was irradiated again.
  • the erecting microscope 11 includes a stage 28 on which an object to be observed is placed, a condenser lens 29 and an objective lens (100 times, numerical aperture 1.25) 26, and the stage On top of 28, a micro mouth tip 27 is arranged.
  • a light source lamp 13 is disposed below the condenser lens 29 under the erecting microscope 11, and a CCD camera 12 for detecting this light is disposed above the microscope 11.
  • a pulse laser irradiation device 21 is disposed outside the erecting microscope 1 1, and the laser 1 2 2 passes through the 1 Z 2 wave plate 23 and the polarizer 24 into the erecting microscope 1 1
  • the light path is bent at a right angle by the dichroic mirror 25, and the light is irradiated into the microchip 7 on the stage 28.
  • a high-power femtosecond titanium sapphire laser (800 nm, 120 is) using chirp amplification is used.
  • the microchip 27 contains a dispersion of polystyrene fine particles (diameter lm).
  • the laser 22 when the laser 22 is irradiated, the laser 22 condenses on the polystyrene fine particle dispersion in the microchip 27 disposed on the stage 28.
  • the state inside the microchip 27 is observed with the CCD camera 12.
  • the effect of shock waves on polystyrene fine particles was investigated. That is, the polystyrene fine particle dispersion was irradiated with a single shot of a femtosecond titanium sapphire laser under the conditions described above.
  • the shock wave expected to be generated at the focal point of the laser diffuses in three dimensions, and the fine particles are pushed away from the focal point of the laser.
  • FIG. 3 schematically shows the relationship between the force applied to the polystyrene fine particles by the shock wave from the pulse laser irradiation.
  • ⁇ indicates the force of the shock wave received by the fine particles.
  • R Indicates the force generated by the shock wave
  • R Indicates the initial position of the fine particles
  • R indicates the position of the fine particles from the center of the shock wave
  • r indicates the radius of the fine particles
  • 32 indicates laser light
  • 33 indicates polystyrene fine particles
  • 34 indicates laser light.
  • FIG. 4 is a graph showing the relationship between pulsed laser irradiation and the movement distance of fine particles due to the shock wave.
  • the horizontal axis indicates time
  • the vertical axis indicates the position (R) of the fine particle from the center of the shock wave.
  • R the position of the fine particle from the center of the shock wave.
  • L indicates the moving distance of the fine particles
  • the black circle indicates the irradiation time of the pulse laser.
  • the force (F .;) generated by the shock wave can be estimated from the relationship of the moving distance ⁇ ). Shock wave force received by fine particles: f- F .
  • the vertical axis indicates the force of the shock wave (F 0 ), and the horizontal axis indicates the laser light intensity (1).
  • a shock wave was confirmed at 6 On] / pulse or more. Since the explosion threshold depends on the probability of multiphoton absorption, it is related by the instantaneously arriving light density (I), not by the laser intensity, which is defined as the total energy of the laser.
  • the laser intensity (W) of the pulse laser having a time width ( ⁇ t) of 120 fs was 60 nJ / pulse
  • the light density (I) is as follows.
  • the time width (A t) becomes ⁇ t ⁇ W / 5 X 1 0 5.
  • a pulse laser having a time width of nanoseconds or less is preferable, more preferably picoseconds or less, and optimally femtoseconds or less.
  • the present invention is not construed as being limited by these reference examples. Further, in this reference example, it is assumed that an explosion phenomenon occurs at the laser focal point and a shock wave is generated, but the present invention is not limited to this.
  • polystyrene fine particles were used to visualize the shock wave.
  • the weight of polystyrene microparticles is l.lxl0_12g, which is more than 100 million times the weight of protein.
  • proteins can change their density even with shock waves that are much weaker than polystyrene microparticles.
  • the light density and laser intensity of the pulse laser defined by the visualization of the polystyrene fine particles do not limit the lower limit in the present invention.
  • This example is an example in which hen egg white lysozyme (14 kDa) was crystallized.
  • the conditions of the protein solution were 25 mg Zm 1 lysozyme, 2.5% sodium chloride, 0.1 M sodium acetate, pH 4.5, and prepared at room temperature. From this solution, impurities were removed with a membrane filter. Crystallization was performed by a batch method using a laser irradiation apparatus and a crystallization plate shown in FIG. As shown in the figure, in this laser irradiation apparatus, the laser irradiated from the femtosecond laser irradiation apparatus 101 passes through a mirror 102, a wave plate 103, a polarizer 104, and a shutter 105.
  • the objective lens (10 ⁇ ) is condensed by 108, and is irradiated to the crystal growth container 107 of the crystallization plate 109.
  • the crystallization plate 109 utilizes a vapor diffusion method, and has a crystal growth container part 107 for storing a protein solution and a server one solution part 106 communicating with the crystal growth container part 107.
  • the server solution is a solution in which the same components as the remaining components except for the protein are dissolved in the protein solution, thereby promoting the evaporation of the protein solution.
  • 110 is a sealing tape
  • 111 is a transparent glass. Then, the crystal growth container 107 can be observed with the naked eye with an eyepiece 112.
  • Laser irradiation was performed in a clean room with temperature and humidity control (temperature 23 ° C ⁇ 2 ° (: Humidity 65% ⁇ 5%).
  • the laser wavelength was 780 nm and the time width was 200 femtoseconds. (Fs), the repetition frequency of laser oscillation is 1 kHz
  • the laser light intensity was adjusted by a wave plate and a polarizer, and the number of laser beam irradiations was changed by changing the opening and closing time of the shirt.
  • the protein solution 101 was put into the respective crystal growth vessels 107 of the crystallization plate 110, and a laser was focused and irradiated on the solution at room temperature.
  • the generation of crystal nuclei is considered to be a phenomenon that depends on the number of irradiations of one laser pulse.
  • Increasing the number of crystals by increasing the number of irradiations is synonymous with increasing the probability of forming crystals by increasing the number of irradiations.
  • the laser intensity decreases due to an increase in the number of irradiations (incubation effect) due to the laser explosion phenomenon (for example, S. Preuss et al. (Appl. Phys. Lett. 62 (23) ), 7 June 1993 p3049-3051)) o
  • the increase in the number of irradiations decreases the light density of the laser pulse required for crystal formation and the laser intensity.
  • the laser intensity due to multiple laser irradiations is much lower than the lower limit of the laser intensity defined by the movement of the polystyrene fine particles, but the protein molecules are much smaller than the polystyrene fine particles. This is considered to be the effect of the multiple irradiation of the pulse laser. However, these are only inferences of the present inventors and do not limit the scope of the present invention.
  • This example is an example of crystallization of liponuclease H (17 kDa).
  • the protein solution was prepared by dissolving 5 mg Zm1 of liponuclease H in 0.05 M Tris-HCl buffer (pH 9.0) at room temperature. Thereafter, impurities were removed at the membrane fill.
  • 0.2 M Tris-HCl, pH 9.0 was prepared as a server solution (external solution).
  • the crystallization by laser irradiation was performed by the sitting drop vapor diffusion method using the laser irradiation system and crystallization plate shown in Fig. 6. That is, the protein solution 101 was put into the crystal growing vessel part 100, and the external solution 1001 was dispensed into the server solution part 106.
  • the laser was focused and irradiated into the protein solution at room temperature.
  • Laser irradiation was performed in a temperature and humidity controlled clean room (temperature 23 ⁇ 2, humidity 65%, soil 5%).
  • the wavelength of the laser is 780 nm
  • the time width is 200 femtoseconds ( ⁇ s)
  • the laser oscillation repetition frequency is 1 kHz.
  • Laser-Light intensity was adjusted by wave plate and polarizer.
  • the number of laser light irradiations was adjusted by changing the shutter opening / closing time.
  • the pulse intensity of the laser was 1.95 nJ / pulse.
  • Fig. 9 shows a photograph one day after laser irradiation. No crystal precipitation was observed in the unirradiated sample after more than 2 weeks. However, there was a difference in the precipitation state depending on the irradiation conditions of the laser. No crystal nuclei were generated with 8 pulses, whereas crystal precipitation was observed from the solution irradiated with 62 pulses and 4000 pulses. In the solution irradiated with 8 000 pulses, denatured liponuclease H was found.
  • This example is an example of crystallization of glucose isomerase (173 kDa).
  • the protein solution is 20 mg / m1 glucose isomer
  • the enzyme was prepared by dissolving in 0.2M ammonium sulfate solution (pH 7.0) at room temperature. Thereafter, impurities were removed by a membrane filter.
  • a server solution external solution
  • a solution pH 7.0 in which 0.2 M ammonium sulfate and 15% polyethylene dalicol (PEG) 600 were dissolved was prepared. Crystallization by laser irradiation was performed by a sitting drop vapor diffusion method using a laser irradiation apparatus and a crystallization plate shown in FIG.
  • the protein solution 101 was put into the crystal growing container part 100, and the external solution of 100 i1 was dispensed into the server solution part 106. Thereafter, the solution part 106 to 51 of the server was sucked up with a pit and poured into the crystal growth container part 107, and the protein solution and the server solution were sufficiently mixed. Then, the laser was focused and irradiated into the protein solution at room temperature. Laser irradiation was performed in a clean room (temperature: 23 ° C ⁇ 2, humidity: 65% ⁇ 5%) where temperature and humidity were controlled.
  • the laser wavelength is 780 nm
  • the time width is 200 femtoseconds (fs;)
  • the laser oscillation repetition frequency is 1 kHz.
  • the laser light intensity was adjusted with a wave plate and a polarizer.
  • the number of laser beam irradiations was adjusted by changing the shutter open / close time.
  • the pulse intensity of the laser was 1.95 nJZ pulse.
  • the number of pulses was changed to 8 pulses (1/125 seconds), 400,000 pulses (4 seconds), and no irradiation (0 seconds), depending on the opening and closing time of the shirt.
  • the sample was allowed to stand still in a thermostat set at 18 ° C, and the subsequent crystal growth was observed.
  • FIG. 10 shows a photograph one day after the laser irradiation. Crystal precipitation was observed from the solution irradiated with the laser, but no crystal precipitation was observed in the sample not irradiated even after one month or more.
  • glucose isomerase a giant protein having a molecular weight of about 200,000
  • the method of the present invention using laser irradiation is also effective for crystallization of such a giant protein.
  • This example is an example of crystallization of a prostaglandin F2 phosphatase derived from trypanosoma (31 kb).
  • the protein solution was prepared by dissolving 20 mg Zml of the above synthase together with 0.05 M nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP +) in 0.04 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) at room temperature. It was prepared. After that, impurities were removed with a membrane filter.
  • a server solution 0.1 M sodium hydroxide buffer (HE PES—NaH), 2% polyethylene glycol (PEG) 400%
  • a 1.2 M solution of ammonium sulfate (pH 7.5) was prepared.
  • the crystallization by laser irradiation was performed by a hanging drop vapor diffusion method using a laser irradiation apparatus and a crystallization vessel shown in FIG.
  • the laser beam emitted from the femtosecond laser irradiation apparatus 101 passes through a mirror 102, a wave plate 103, a polarizer 104, and a shutter 105.
  • the light is collected by an objective lens (10 ⁇ ) 108 and irradiates the crystal solution 117 in the crystallization vessel 118.
  • the crystal solution 117 can be observed with the naked eye through the eyepiece lens 112, and can also be observed with the CCD 113 camera and the monitor 114.
  • 1 16 is an external solution
  • 1 15 is a glass plate
  • 1 19 is grease.
  • droplets of the crystallization solution obtained by mixing the protein solution 21 and the external solution 21 were formed on the glass plate 115.
  • 500 1 of the external solution 1 16 was placed in the crystallization container 1 18, and the crystallized solution droplets 1 17 were suspended with a glass cover.
  • sealing was performed using grease 119.
  • the crystallization container 1 18 was turned upside down while taking care not to drop the external solution 1 16, and a laser beam was focused and irradiated on the droplet 1 17 of the crystallization solution.
  • the laser irradiation was performed in a clean room with temperature and humidity controlled (temperature 23 ° C ⁇ 2 ° C, humidity 65% ⁇ 5%).
  • the laser wavelength is 780 nm
  • the time width is 200 femtoseconds ( ⁇ s)
  • the laser oscillation repetition frequency is 1 kHz.
  • Laser light intensity was adjusted with a wave plate and a polarizer.
  • the number of laser beam irradiations was adjusted by changing the shutter open / close time.
  • the pulse intensity of the laser was 1.95 nJ / pulse. 62 pulses (1 Z 16 seconds) were emitted by opening and closing the shirt.
  • a sample without laser irradiation was grown.
  • Fig. 11 shows a photograph 7 days after the laser irradiation. Crystal precipitation was observed from the solution irradiated with the laser, but no crystal precipitation was observed even after 3 months or more in the sample not irradiated. In this example, a crystal was formed in a short time by laser irradiation.
  • This example is an example of crystallization native to adenosine kinase (ADA).
  • the protein solution was prepared by dissolving 2 OmgZm 1 of ADA native, in 0.0025 M Hes buffer (pH 7.5) at room temperature. Prepared. Thereafter, impurities were removed at the membrane fill.
  • a solution (external solution) of the solution (1) a solution of 0.2 M sodium citrate, 0.1 M of sodium sodium codylate and 30% isopropanol (pH 6.5) and (2) 0.2 M Of ammonium acetate, 0.1 M sodium citrate and 30% polyethylene glycol (PEG) 4000 (pH 5.6).
  • Crystallization by laser irradiation was performed by the sitting drop vapor diffusion method using a laser irradiation and crystallization plate shown in FIG.
  • the evening protein solution 2H1 was placed in the crystal growth vessel unit 107, and the external solutions 1 and ⁇ of 1001 were respectively dispensed into the server one solution unit 106. Thereafter, the solution portions 106 to 21 of the server were sucked up with a pit and injected into the crystal growth container portion 107. After the protein solution and the external solution were sufficiently mixed, a laser beam was focused and irradiated into the protein solution at room temperature.
  • the pulse intensity of the laser was 1.95 nJ / pulse. 1000 pulses (1 second) were emitted by opening and closing the shutter.
  • a sample without irradiation was grown in the crystal growth vessel unit 107, and the external solutions 1 and ⁇ of 1001 were respectively dispensed into the server one solution unit 106. Thereafter, the solution portions 106 to 21 of the server were sucked up with a
  • Fig. 12 shows a photograph 7 days after the laser irradiation. Crystal precipitation was observed from the solution irradiated with the laser, but no crystal precipitation was observed in the sample not irradiated even after one month or more. Regarding this protein, no crystals have been obtained so far, and in this example, crystallization was realized for the first time.
  • Example 8 This example is an example in which the E. coli major foreign body excretion transporter (AcrB) was crystallized.
  • AcrB is a polytopic membrane protein, and is a trimeric protein in which three monomers consisting of 1049 amino acid residues are intertwined.
  • the protein solution was prepared by adding 0.02 M sodium phosphate (pH 6.2), 10% glycerol and 0.2% dodecyl maltoside to 28 mg / m1 histidine-labeled AcrB. did.
  • As the server solution (outer solution) 14.; 14.6% of polyethylene glycol (PEG) 4000, 0.08 M sodium phosphate (pH 6.2), and 0.02 M sodium citrate Monohydrochloric acid (pH 5.6) was prepared.
  • Crystallization by laser irradiation was performed by the Ningdrop vapor diffusion method using the crystallization vessel and equipment shown in Fig. 6. 2 il of the protein solution was placed in the crystal growth vessel part 107, and the external solution of 50 ⁇ 1 was dispensed into the server solution part 106. Thereafter, the server solution part 106 to 21 was sucked up with a pipette, poured into the crystal growing container part 107, and the protein solution and the external solution were sufficiently mixed.
  • six conditions of growth solutions were prepared at 0.1% increments of PEG 400 from 14.1% to 14.6% in increments of 0.1%, and crystallization was performed with each growth solution. .
  • a high-power femtosecond titanium sapphire laser is focused by an objective lens (magnification: 10 times) in a temperature and humidity controlled clean room (temperature 23 ° C ⁇ 2 ° C, humidity 65% ⁇ 5%). And irradiated in the protein solution. laser
  • the wavelength of — was 780 nm, the time width was 200 femtoseconds (fs), the repetition frequency of the laser oscillation was 1 kHz, and the laser pulse intensity was 800 nJ / pulse. Irradiation of 250 pulses (1Z4 seconds) was performed depending on the opening and closing time of the shutter.
  • a sample without irradiation was grown. After the laser irradiation, the sample was allowed to stand still in a thermostat set at 25, and the subsequent crystal growth was observed.
  • Fig. 13 shows a photograph two days after laser irradiation. As shown in the figure, a crystal growth solution was prepared by changing the concentration of polyethylene glycol (PEG) 4000. In each of the growth solutions, crystal precipitation was observed from the laser-irradiated solution (Fig. 13). In the sample not irradiated, no precipitation of crystals could be confirmed even after one week (not shown).
  • the protein was crystallized by moving the container. In the crystal growth of chicken egg white lysozyme, the solution was stirred. The protein solution was adjusted to PH 4.5 by adding acetic acid to 50 ml of distilled water and 0.467 g of sodium acetate trihydrate, and then adding 1.25 g of sodium chloride and 1.25 g of hen egg white lysozyme. Using. The solution adjusted at room temperature was placed in a 100 ml Teflon container, and kept at 40 ° C for 24 hours in a constant temperature water bath to completely dissolve the solution. Thereafter, the mixture was cooled in 5 hours, and impurities were removed with a membrane filter having a hole diameter of 0.2 / m. On the other hand, the reservoir solution was prepared by adding acetic acid to 50 mL of distilled water and 0.467 g of sodium acetate trihydrate to adjust the pH to 4.5, and then adding 3 g of sodium chloride.
  • the reservoir solution was set to 300 1 for the evening protein solution 3 ⁇ 1 and 10 11, and the difference due to the presence or absence of solution stirring was examined.
  • the crystallization method used was a sitting drop vapor diffusion method.
  • floatin which is a crystal growth at the two-liquid interface using florinate (the above protein solution is also a liquid having a high specific gravity)
  • the florinate solution volume is 10 z 1.
  • the crystal was grown at a constant temperature of 20 ° C.
  • the rotary mechanism used was a rotary shaker (BR-15, manufactured by Taitec). The rotation speed was set at 50 rpm where the solution was gently stirred.
  • Fig. 14 shows a schematic diagram of this stirrer.
  • the well plate 201 was placed on a shaker 202 and rotated to stir.
  • Each well of the well plate 201 is composed of two small wells and one large well.
  • the protein solution and the mouth lint 214 are put, and in the case to which the Sitting-drop method is applied, the protein solution 212 is put.
  • the reservoir contains a reservoir solution 2 13 in which components other than lysium are dissolved at a high concentration. In this method, many solutions can be easily stirred at once.
  • Figure 15 shows the results of crystal growth. There was a clear difference between the number of crystals precipitated and the crystal size depending on whether the solution was stirred. As shown in Figs. 15A and 15B, in the conventional method without stirring the solution, many very small crystals (fine crystals) were deposited. On the other hand, as shown in FIGS. 15C and D, in the growth with the solution stirred, large crystals were obtained with a small number of precipitated crystals. In addition, the solution agitation floating drop method (Fig. 15D) produces less crystals and has a larger crystal size than the solution agitation sitting drop method (see Fig. 15C). Next, an embodiment of the container of the present invention will be described with reference to the drawings. (Example 9)
  • FIG. 16 is a sectional view showing an example of the first container of the present invention.
  • the container 301 has a first room 311 and a second room 313, and the two rooms communicate with each other through a passage.
  • the upper portion of the container 301 is covered with a lid 316 to be in a sealed state, and the bottom portion 315 of the container 301 is so formed as to allow laser light 317 to pass therethrough.
  • the part corresponding to the first room is transparent or translucent.
  • the material of the bottom portion is not particularly limited as long as it transmits a laser beam.
  • a transparent resin such as an acrylic resin, a transparent member such as quartz glass, or a glass can be used.
  • the other parts are not particularly limited, and general resins and glass can be used.
  • the overall size of the container is not particularly limited, and is, for example, 20 to 180 mm in length X 10 to horizontal: L 20 x height 3 to 50 mm, preferably 40 to 15 in length. 0 mm x 20 to 100 x height 5 to 30 mm, more preferably 50 to 130 mm x 30 to 80 x height 10 to 20 mm.
  • the first room 3 1 1 contains a solution 3 1 2 such as a protein solution
  • the second room 3 1 3 contains a reservoir solution 3 1 4 so that the first room 3 11 should be smaller than the room in the second room 3 13.
  • This container 301 is used, for example, as follows.
  • crystallization is judged to be unsuitable, and crystallization may be attempted under other conditions.
  • the conditions of the solution and the like are suitable for crystallization, and if the crystal is grown as it is, Is obtained.
  • the state of the solute is observed by irradiating a pulsed laser, and if the solute has changed, it can be determined that the conditions of the solution and the like are suitable for crystallization.
  • the change in the solute is, for example, a change in the three-dimensional structure (denaturation) in the case of a protein.
  • the type of laser, irradiation conditions, and the like are as described in the manufacturing method and the like of the present invention, and these laser conditions and the like are common to other containers or plates of the present invention. (Example 10)
  • the plate 302 is formed with six first containers 321, which comprises a first chamber 321a and a second chamber 3211b.
  • the two rooms communicate with each other via a passage.
  • the plate 302 is composed of a plate body 322 on which the first container 321 is formed, a bottom portion 323, and a lid 324.
  • the bottom part 3 23 is formed of a transparent or translucent member so that the laser light 3 25 can be irradiated.
  • the material for forming the plate 302, the size of the container 321, and the like are the same as those of the first container described above.
  • the size of the plate 302 is not particularly limited.
  • the length is 20 to 18 O mm X
  • the width is 10 to 120 X height L 50 mm X W 20-; L 00 X H 5-40 mm, more preferably H 50-13 O mm X W 3 It is 0 to 80 X height 10 to 3 O mm.
  • the number of the containers 3 2 1 is 6, but the present invention is not limited to this, and the number of containers 1 to 15 3 6 per plate, preferably 2 to 3 84 And more preferably 4 to 96.
  • the plate 302 is used, for example, as follows. That is, first, the polymer solution is put in the first room 3 21 a of the container 3 2 1 part, and the reservoir solution is put in the second room 3 2 1 b. Evaporation of the solvent is promoted.
  • the pulse laser 325 is irradiated as described above to forcibly generate crystal nuclei.
  • crystal nuclei When crystal nuclei are generated, they can be grown to obtain the desired polymer crystal. If no crystal nuclei are generated, the crystallization conditions are judged to be inappropriate, and crystallization is attempted under the following conditions.
  • different crystallization conditions can be set for each vessel such as changing the concentration of the polymer solution, and laser irradiation can be performed under different conditions for each vessel.
  • the container 303 has a shape in which a cylinder is connected to the bottom of a disk.
  • eight first chambers 331 are formed radially from the center of the circle, and in the cylinder, one second chamber 332 is formed.
  • a passageway 33 extends from each of the first rooms 331, and communicates with the second room 3332.
  • the passages 333 have different passage diameters.
  • the size of the entire container 303 is not particularly limited, and is appropriately determined depending on the size and number of the first room, the size of the second room, and the like.
  • the size of the first room is, for example, 0.5 to 0.5 mm in inner diameter, l to 50 mm in depth, preferably 1 to 5 mm in inner diameter, 3 to 40 mm in depth, more preferably 1 to 3 mm in inner diameter.
  • the depth is 3 to 30 mm, and the number of the first rooms is, for example, 1 to 15 36, preferably 2 to 384, and more preferably 4 to 96.
  • the size of the second room is, for example, 330 mm, depth l ⁇ 50 mm, preferably inner diameter 2 ⁇ 20 mm, depth 2 ⁇ 40 mm, more preferably inner diameter 3 ⁇ 15 mm, depth 3 330 mm.
  • the length of the passage is also not limited, for example, 0.5 to 50 mm, preferably 1 to 30 mm, more preferably; ⁇ 2 Omm.
  • the passages have different diameters, for example, 0.3 to 10 mm, preferably 0.5 to 5 mm, and more preferably 0.5 to 3 mm.
  • the material of the container 303 is not particularly limited.
  • the material is made of resin, glass, or the like. When the first room is irradiated with a laser, the above-described transparent material is transmitted through the portion. It may be made of a translucent member. This container 303 is used, for example, as follows.
  • the polymer solution 334 is put into a plurality of first chambers 33 1, and the reservoir solution 3 35 is put into the second chambers 3 32, and as shown by arrows in the figure,
  • the crystal nuclei may be forcibly generated by irradiating a pulse laser as described above. When crystal nuclei are generated, they can be grown to obtain the desired polymer crystal. If no crystal nuclei are generated, the crystallization conditions are judged to be inappropriate, and crystallization is attempted under the following conditions.
  • FIG. 1 is a plan view
  • FIG. 2 is a cross-sectional view
  • the container 304 has a shape in which a cylinder is connected to the bottom of a disk.
  • Eight first chambers 341 are formed radially from the center of the circle at the periphery of the disk, and one second chamber 342 is formed within the cylinder,
  • a passageway 343 extends from each of the first chambers 341, and communicates with the second chamber 342.
  • the passages 333 have different passage lengths.
  • the size of the entire container 304 is not particularly limited, and is appropriately determined according to the size and number of the first room, the size of the second room, and the like.
  • the size of the first room is, for example, an inner diameter of 0.5 to: L 0 mm, a depth of l to 50 mm, preferably an inner diameter of l to 5 mm, a depth of 3 to 40 mm, more preferably
  • the inner diameter is 1 to 3 mm
  • the depth is 3 to 30 mm
  • the number of the first chambers is, for example, 1 to 15 36, preferably 2 to 3 84, more preferably 4 ⁇ 96.
  • the second room PC orchid recite 1
  • the inner diameter is 1 to 30 mm
  • the depth is 1 to 50 mm
  • the inner diameter is 2 to 20 mm
  • the depth is 2 to 40 mm
  • more preferably the inner diameter is 3 to 15 mm
  • the depth is 3 to 30 mm.
  • the length of the passage is not limited, and is, for example, 0.5 to 50 mm, preferably 1 to 30 mm, and more preferably 1 to 20 mm.
  • the passages have different diameters, for example, 0.3 to: L 0 mm, preferably 0.5 to 5 mm, and more preferably 0.5 to 3 mm.
  • the material of the container 4 is not particularly limited, and is made of, for example, resin or glass.
  • the transparent or transparent material described above is used so that the laser transmits therethrough. What is necessary is just to comprise with a semi-transparent member.
  • the container 304 is used, for example, as follows. That is, first, the polymer solution 344 is put into the plurality of first chambers 34 1, and the reservoir solution 345 is put into the second chambers 342, as shown by arrows in the figure. Vapor diffusion generated by the vapor passing through the passage 343 and moving to the second room 342 promotes evaporation of the solvent in the polymer solution 344.
  • the passage lengths of the passages 343 are different, so that the vapor diffusion conditions of the first room 343 are different. Therefore, in the plurality of first chambers, those in which crystal nuclei have been generated can be continuously grown to obtain the desired polymer crystal. In the first room where no crystal nuclei are generated, it can be determined that the crystallization conditions are inappropriate. Further, when the polymer solution 344 becomes supersaturated, a pulse laser may be irradiated as described above to forcibly generate crystal nuclei. When crystal nuclei are generated, they can be grown to obtain the desired polymer crystal. If no crystal nuclei are generated, the crystallization conditions are judged to be inappropriate, and crystallization is attempted under the following conditions.
  • the passage diameter is changed in Embodiment 11 and the passage length is changed in Embodiment 12, these may be combined. Further, at least one of the container of the embodiment 11, the container of the embodiment 12 and the container of the combination thereof may be formed in plural in one plate. Conditions such as the size of the plate are the same as those of the plate of Example 10 for example.
  • the container 305 has a configuration in which a small container 352 is arranged in a large container 351.
  • the large container 351 has a columnar shape, and its upper part is covered with a lid.
  • the small container 352 includes an inverted truncated cone-shaped main body (large volume) and a cylindrical portion (small volume) connected to the upper part of the main body. I have.
  • the space between the inner wall of the large container 35 1 and the outer wall of the small container 35 2 is the second room for storing the reservoir solution 354.
  • the inside of the small container 51 or the vicinity of the tip end of the cylindrical portion serves as a first room for containing or holding the polymer solution 365.
  • the size of the container 305 is not particularly limited.
  • the size of the large container 351 is, for example, an inner diameter of 3 to 30 mm and a depth of 5 to 100 mm, preferably an inner diameter of 5 to 25 mm and a depth of 10 to 50 mm.
  • the inner diameter is 10 to 20 mm and the depth is 10 to 30 mm.
  • the size of the small container 352 is, for example, in the inverted truncated cone-shaped main body portion (large volume portion), a maximum inner diameter of 3 to 30 mm, a minimum inner diameter of 0.3 to 5 mm, a height of 4 to 90 mm, and the cylindrical portion. (Small volume part), the inner diameter is 0.3 to 5 mm, and the height is 0.1 to 5 mm.
  • the inverted truncated cone-shaped main body has a maximum inner diameter of 5 to 25 mm, Minimum inner diameter 0.5-3mm, height 9-45mm, cylindrical part (small volume part)
  • the inner diameter is 0.5 to 3 mm and the height is 0.1 to 3 mm. More preferably, the maximum inner diameter is 10 to 20 mm and the minimum inner diameter is 1 in the inverted frustoconical main body (large volume part). 22 mm, height 9 225 mm, inner diameter l ⁇ 2 mm, height 0.1 l2 mm in cylindrical part (small volume part).
  • the material of the container 305 is not particularly limited, and for example, a resin, glass, or the like can be used.
  • This container 304 when laser light is irradiated, a portion through which the laser light passes is formed of a transparent or translucent member, and such a member is as described above.
  • This container 304 is used, for example, as follows. That is, first, the reservoir solution 354 is put into the large container 35 1 (the third room 35 3), and the small container 35 52 is filled with the immiscible high specific gravity liquid 3 56. In addition, a magnet stirrer 307 is arranged at the bottom of the small container 352. Then, a droplet of the polymer solution 355 is arranged at the tip of the cylindrical portion of the small container 352. In this state, the container 304 is placed on the magnetic stirrer 310, and the stirrer 307 is rotated.
  • the action of the reservoir solution 354 promotes the generation of water vapor from the polymer solution 355.
  • the rotation of the stirrer 307 stirs the immiscible high specific gravity liquid 356, and the vibration is transmitted to the polymer solution 355, and the polymer solution 355 is also indirectly stirred.
  • generation of crystal nuclei is promoted.
  • the crystal nucleus of the polymer solution is generated, the growth may be continued as it is to obtain the target crystal, or when the crystal nucleus does not generate, the condition is determined to be inappropriate for the crystallization condition. Crystallization may be attempted under the following conditions.
  • the polymer solution 355 may be irradiated with laser light.
  • a plurality of containers of this embodiment may be formed in one plate. The conditions are, for example, the same as in the plate of Example 10. PT / JP2003 / 010681
  • the method of the present invention is useful for producing or screening crystals of organic substances such as proteins.

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Abstract

本発明は、タンパク質や有機物の結晶を、高品質で効率良く簡単に製造する方法に関する。タンパク質や有機物の溶液を調製し、これをゆっくりと冷却することによって低度の過飽和にする。この過飽和溶液に、フェムト秒レーザー１０を照射する。レーザーの焦点では、局所的な爆発現象が起きて結晶核が生成する。この結晶核を基に、時間をかけて結晶を成長させれば、高品質の結晶が得られる。フェムト秒レーザーとしては、波長８００ｎｍ、時間幅１２０ｆｓ、周波数１ｋＨｚ、出力４００ｍＷのチタンサファイアレーザーが使用できる。

Description

結晶核の製造方法および結晶化条件スクリーニング方法
技術分野
本発明は、 結晶核の製造方法および結晶化条件のスクリーニング方法 に関する。
明
細
背景技術
ボストゲノム研究の進展により、 タンパク質の構造解析が急務になつ てきているが、 そのためには、 タンパク質を結晶化する必要がある。 ま た、 有機結晶は、 次世代デバイス材料として有望視されており、 その高 品質結晶製造技術のニーズが高い。 一般に、 溶液から結晶を析出させる ためには、 溶媒蒸発や温度変化などにより過飽和度を大きくする必要が ある。 しかし、 有機物やタンパク質等のように分子量が大きい物質は、 過飽和度を極めて大きくしないと結晶化しない。 また、 このような極め て大きな過飽和度の溶液では、 一度結晶化が起こると、 結晶が急成長す るため、 得られる結晶の品質に問題があるおそれがある。 また、 このよ うな高分子量物質の結晶化は、 一般に困難であり、 生産性が悪かった。 通常、 結晶化の条件は、 実際に結晶化を試みて、 試行錯誤の結果、 決定 されるが、 これでは、 タンパク質や有機物等のように、 結晶化が必要不 可欠な物質では、 煩雑すぎて、 実用的ではない。 また、 ナノ秒の N d ： Y A Gレ一ザ一を用いて有機結晶を作成する試みがある （Phys i c a l Revi ew Le t t ers 77 ( 1996) p3475 , 特開 2002 - 068899)。 しかしながら、 この方法では、 結晶化は十分でなく、 特にタンパク質の結晶化は困難で ある。 発明の開示
本発明は、 このような事情に鑑みなされたもので、 高品質の結晶を簡 単に効率よく製造できる技術を提供することを第 1の目的とし、 結晶化 条件を簡単に決定できる技術を提供することを第 2の目的とする。 前記第 1の目的を達成するために、 本発明の結晶核の製造方法は、 結 晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、 ピコ秒パルスレーザ一およ びフエムト秒パルスレ一ザ一の少なくとも一方のパルスレーザ一を照射 することにより結晶核を生成させる方法である。 このように、 前記パルスレーザーを照射すれば、 低過飽和溶液であつ ても結晶核が生成するので、 これを基に、 結晶をゆっくり成長させるこ とができ、 その結果、 高品質の結晶が簡単に効率良く製造できる。 本発 明の方法は、 タンパク質の結晶化および有機物の結晶化に最適であるが 、 その他の物質の結晶化にも使用できる。 また、 前記第 2の目的を達成するために、 本発明の結晶化条件のスク リーニング方法は、 結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、 ピコ 秒パルスレーザーおよびフエムト秒パルスレ一ザ一の少なくとも一方の パルスレーザーを照射する工程と、 前記レーザ一照射により結晶核が生 成するか否かを判定する工程および前記レーザー照射により溶質が変化 しているか否かを判定する工程の少なくとも一方とを含む方法である。 このように、 前記パルスレーザーを照射して結晶核の生成を観察し、 結晶核が生成すれば、 その溶液等の条件は、 結晶化に適していると判断 できる。 また、 前記パルスレーザーを照射して溶質の状態を観察し、 溶 質が変化していれば、 その溶液等の条件は結晶化に適していると判断で きる。 前記溶質の変化は、 タンパク質の場合、 例えば、 立体構造の変化 (変性） である。 過飽和溶液に、 ピコ秒パルスレーザ一およびフェムト秒パルスレーザ 一の少なくとも一方のパルスレーザ一を照射すれば、 結晶核が生成する が、 そのメカニズムは不明である。 これについて、 本発明者等は、 以下 のように推測している。 すなわち、 前記パルスレーザーの焦点では、 高 密度の光子が集中するために、 一つの溶質分子もしくは溶媒分子に光子 が数個衝突し、 それらが光を吸収する現象 （多光子吸収） が高い確率で 起こる。 その結果として、 パルスレーザーを集光した時、 その焦点で急 激な光吸収による爆発現象 （レーザーアブレーシヨン） が誘起される。 結晶核生成は、 これが摂動となり起こると考えられる。 そして、 その後 のメカニズムにとしては、 下記の 3つが考えられる。
(1) パルスレーザーにより光熱変換が引き起こされ焦点付近の溶液が瞬 間的に蒸発し、 溶質の濃縮が起こった結果として結晶核が生成する。
(2) パルスレーザーが誘起するアブレーションにより衝撃波が発生し、 それにより溶液が局所的に揺らされた結果として結晶核が生成する。 (3)レーザ一の強度が強くなると溶液中で誘導散乱が引き起こされ、溶液 中に濃度勾配が生成し、 結晶核が生成する。 このように、 本発明によれば、 結晶化が困難なタンパク質や有機物で あって、 容易に効率良く結晶核を生成でき、 これをゆっくり成長させれ ば高品質の結晶が得られる。 また、 本発明によれば、 結晶化条件をスク リーエングでき、 結晶化条件を迅速に決定できる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の一実施例に使用したレーザ一照射装置の構成図であ る。
図 2は、 レーザー照射による衝撃波の大きさを測定する装置の一例を 示す構成図である。
図 3は、 パルスレーザーの衝撃波と粒子の動きとの関係の一例を示す 模式図である。
図 4は、 前記装置で測定した衝撃波による粒子の移動距離とレーザ一 集光点との関係を示すグラフである。
図 5は、 前記装置で測定した衝撃波の強度とレーザー強度との関係を 示すグラフである。
図 6は、 本発明のその他の実施例に使用したレーザー照射装置の構成 図である。
図 7は、 本発明のさらにその他の実施例に使用したレーザー照射装置 の構成図である。
図 8は、 本発明の一実施例で生じたタンパク質結晶の写真である。 図 9は、 本発明のその他の実施例で生じたタンパク質結晶の写真であ る。
図 1 0は、 本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の 写真である。
図 1 1は、 本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の 写真である。
図 1 2は、 本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の 写真である。
図 1 3は、 本発明のさらにその他の実施例で生じたタンパク質結晶の 写真である。 図 14は、 参考例 2に使用した攪拌装置の概略図である。
図 1 5 Aと図 1 5 Bは、 従来法で得られた結晶を示す写真であり、 図 1 5 Cと図 1 5 Dは、 前記参考例 2で得られた結晶を示す写真である。 図 1 6は、 本発明の容器の一例を示す断面図である。
図 1 7は、 本発明のプレートの一例を示す斜視図である。
図 1 8は、 本発明の容器のその他の例を示す図であり、 Aは平面図、 Bは靳面図である。
図 1 9は、 本発明の容器のさらにその他の例を示す図であり、 Aは平 面図、 Bは断面図である。
図 2 0は、 本発明の容器のさらにその他の例を示す断面図である。 発明を実施するための最良の形態
つぎに、 本発明をさらに詳しく説明する。 前述のように、 本発明では、 ピコ秒パルスレ一ザ一およびフェムト秒 パルスレーザ一の少なくとも一方のパルスレーザーをレンズで溶液中に 集光し、 その集光位置で単発若しくは複数発の局所的な爆発現象を生じ させ、 これによつて結晶核を生成す ¾ことが好ましく、 また前記爆発現 象により、 溶質を変化させることも好ましい。 本発明において、 パルスレーザーの光密度 （光子流量： photon flux ) は、 例えば、 5 X 1 05 (watt) 以上であり、 好ましくは 2 X 1 09 ( watt) 以上である。 パルスレーザーの光密度の上限は、 特に制限されな いが、 例えば、 1 018 (watt) 以下であり、 好ましくは 1 015 (watt ) 以下であり、 より好ましくは 1012 (watt) 以下である。 後述するように、 レーザ一光強度 （W) および時間幅 （A t ) の積が 、 光密度 （ I ) であるから、 レーザーの条件は、 時間幅によって、 例え ば、 以下のように設定することができる。 なお、 パルスレーザ一は、 ピ コ秒パルスレーザ一およびフエムト秒パルスレーザ一があり、 このなか で、 フェムト秒レーザ一が特に好ましい。
(ピコ秒パルスレーザー）
パルス時間幅 レーザー光強度 A レーザー光強度 B (秒） ( J/pulse) _ (J/pulse) 一般的範囲 12
10— 9〜10— 0.5Χ1(Γ3〜0· 5X10一6 2〜2Χ10—3 好的範囲 10一11〜 10一12 0.5X10— 5〜0.5X 10-6 2Χ1(Γ2〜2Χ 10 レーザー光強度 Α ：光密度 （ I ) = 5 X 1 05 (wa t t ) 以上の場合 レーザー光強度 B ：光密度 （ I ) = 2 X 1 09 (wa t t ) 以上の場合
(フエムト秒パルスレーザー）
パルス時間幅 レーザー光強度 A レーザー光強度 B (秒） (J/pulse) _ _ (J/pulse) 一般的範囲 10_12〜10— 15 0.5X10一6〜 0.5X 10-9 2Χ 1(Γ3〜2Χ 10- 好的範囲 ― 1(Τ13〜 -15
10 0.5X10— 7〜0.5X 10—9 2Χ1(Γ4〜2Χ 10 -6 レーザー光強度 Α ：光密度 （ I ) = 5 X 1 05 (wa t t) 以上の場合 レーザー光強度 B ：光密度 （ I ) = 2 X 1 09 (wa t t) 以上の場合
パルスレーザーは、 単発で照射してもよいし、 複数発繰り返して照射 してもよい。 パルスレーザーの照射回数は、 特に制限されないが、 例え ば、 1発 （単発） から 1 0 0 0万発の範囲である。 また、 繰り返し複数 発照射する場合のレーザー繰り返し周波数は、 例えば、 1 / 1 0 0 00 000 Hz〜 l kHzの範囲である。 照射時間も特に制限されず、 例え ば、 1秒から 1時間の範囲である。 パルスレーザーの具体例としては、 例えば、 フェムト秒チタンサファ ィァレーザー、 フエムト秒フアイパーレーザー、ナノ秒'ピコ秒 Nd 3+： YAGレーザー、 ナノ秒 ' ピコ秒 N d 3+： V Y04レーザー、 エキシマ レーザーおよびアレクサンドライトレ一ザ一等がある。 本発明において、 結晶化対象の溶質が溶解している溶液は、 過飽和溶 液であることが好ましく、 より好ましくは低過飽和溶液である。 タンパ ク質溶液の濃度は、 例えば、 200〜5 00 %であり、 好ましくは 1 0 0〜3 00 %であり、 より好ましくは 5 0〜20 0 %である。 有機物溶 液の濃度は、 例えば、 20〜 50 %であり、 好ましくは 1 0〜30 %で あり、 より好ましくは 5〜20 %である。 また、 本発明の対象となる夕 ンパク質としては、 例えば、 リゾチーム、 グルコースイソメラーゼ、 キ シナラ一ゼ、 ミオグロビン、 カタラーゼ、 トリプシン、 ヒトリゾチーム 、 フォトアクティブイエロ一プロテイン、 ホスホエノ一ルピルビン酸力 ルポキシラーゼ、 リポヌクレアーゼ、 プロスタグランジン F 2 α合成酵 素、 アデノシンデァミナ一ゼ、 主要異物排出トランスポーター等がある 。有機物としては、例えば、 4- dimetylamino-N- metyl-4' -Ν- stilbazolium tosylate (DAST)、 メチル二トロア二リン（MNA)、 リン酸エルアルギニン (LAP)等がある。 なお、 後述の実施例に示すように、 本発明の方法によれ ば、 従来、 結晶化が困難であった膜タンパク質が、 結晶化できる。 つぎに、 本発明の方法を実施するための装置の一例を図 1に示す。 図 示のように、 この装置は、 フエトム秒レーザー照射手段 1、 機械シャツ 夕一 2、 半波長板 3、 偏光子 4、 集光レンズ 5、 恒温水槽 8を有する。 恒温水槽 8の中には、 水 9が入っており、 その中に、 結晶化対象の溶質 が溶解した溶液 7が入った試料容器 6が配置される。 恒温水槽 8では、 温度を徐々に低下させることで、 溶液 7の溶解度を低下させて過飽和状 態にする。 この時、 過度の過飽和にすると結晶成長が速くなるので、 低 度の過飽和にする。 そして、 レーザー照射手段 1よりレーザ一光 1 0を 照射すると、 レーザ一光 1 0は、 機械シャツ夕一 2、 半波長板 3、 偏光 子 4および集光レンズ 5を通過し、 溶液 7内で集光し、 ここで急激な光 吸収による爆発現象がおき、 これが結晶核生成を誘引する。 結晶を成長 させる場合は、 この結晶核を基に、 時間をかけてゆっくりと成長させれ ば、 高品質の単結晶が得られる。 また、 結晶化条件をスクリーニングす る場合、 溶液の濃度、 溶質の構成比率、 温度条件を少しずつ変えた溶液 を複数準備し、 それらにレーザー光を照射後、 溶液を観察する。 そして 、 結晶核の生成や溶質の変化が確認できた場合、 その溶液は結晶化条件 に適していると判断し、 そうでない場合は、 結晶化条件不適と判断する 。 本発明のスクリーニング方法は、 結晶化条件決定の一次スクリーニン グとして使用することが好ましい。 本発明において、 結晶化対象の溶質を溶解させた溶液は、 それを入れ た容器を運動させることにより前記溶液を攪拌しながら前記結晶を発生 させ、 これを成長させることが好ましい。 このように、 溶液自身を直接攪拌するのではなく、 それが入った容器 を回転、 振動、 揺動等の運動をさせることにより、 間接的に、 前記溶液 を攪拌すれば、 簡単に穏やかな攪拌を実現でき、 また、 前記溶液の対流 を自在に制御できるため結晶生成に適した攪拌を選択できる。 この結果、 従来は結晶化が難しかったタンパク質のような高分子であっても、 結晶 化が可能となる。 前記運動は、 特に制限されず、 回転、 振動および揺動等があり、 これ らを 2種類以上組み合わせた運動であってもよい。 前記運動の程度も特 に制限されず、 高分子溶液の種類等に応じて適宜決定される。 円運動の 場合、 例えば、 10~ 1000 r p m、 好ましくは 30〜200 r p m、 より好まし くは 50〜1 00 r p mである。 前記容器は、 特に制限されず、 例えば、 ビーカ、 シャーレ、 複数のゥ エルを有するゥエルプレー卜等が使用できる。 結晶の発生 ·成長は、 例えば、 前記溶液を過飽和状態にすることによ り、 実施できる。 過飽和状態は、 例えば、 前記溶液中の溶媒を蒸発させ ればよい。 蒸発は、 特に制限されず、 自然蒸発、 加熱による蒸発、 減圧 乾燥による蒸発、 凍結乾燥による凍結等がある。 この他に、 前記溶質以 外の成分が前記溶液より高濃度で溶解したリザーバー溶液を入れた別の 容器を準備し、 この容器と前記結晶化対象の溶液を入れた容器とにおい て、 水蒸気が移動可能な状態にすると、 前記結晶化対象の溶液の蒸発が 穏やかな条件で促進でき、 特に、 変性しやすいタンパク質等の生体高分 子にとっては、 好ましい。 このような方法を、通常、 蒸気拡散法という。 本発明において、 結晶の成長の場は特に制限されない。 通常、 成長し た結晶は、 溶液より比重が重いため沈降し、 容器底に移動する。 このよ うな方法を、 通常、 S i t t ing drop 法という。 しかし、 容器底で結晶が成 長すると、 ここに貼りついて回収に支障をきたす場合もある。 そこで、 前記容器に、 前記結晶化対象の溶液よりも比重が重い液を入れ、 前記比 重が重い液と前記溶液との界面で結晶を成長させることが好ましい。 こ のような方法は、 通常、 F l oat ing-drop 法という。 容器を運動させて溶液を攪拌する方法において、 結晶化対象の物質は 特に制限されず、 例えば、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および核酸等 がある。 この方法は、 結晶化が特に困難なタンパク質等の生体高分子に 適用することが好ましい。 タンパク質としては、 例えば、 ニヮトリ卵白 リゾチ一ム、 ヒトリゾチーム、 グルコースイソメラーゼ、キシナラーゼ、 ホスホェノールピルビン酸カルポキシラーゼ、 リポヌクレアーゼ、 プロ スタグランジン F 2 α合成酵素、 アデノシンデァミナーゼ、 主要異物排 出トランスポーターなどが挙げられる。 つぎに、 本発明の容器は、 本発明の製造方法若しくはスクリーニング に使用する容器である。 本発明の容器は、 つぎの 3つの種類の容器であ る。 本発明の第 1の容器は、 本発明の結晶核若しくは結晶の製造方法に使 用する容器若しくは本発明の結晶条件のスクリーニングに使用する容器 であって、 結晶化対象物質の溶液を入れる第 1の部屋と、 前記結晶化対 象物資の溶液における結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象 物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液を入れる第 2の部 屋と、 前記第 1の部屋および前記第 2の部屋と連通し、 気体が通過可能 な通路とを有し、 前記第 1の部屋の一部若しくは全部が、 前記結晶化対 象物質の溶液にレーザー光線を照射可能なように透明若しくは半透明で ある容器である。 この容器は、 いわゆる蒸気拡散法により結晶化対象物質の溶液の溶媒 の蒸発を促進し、結晶化対象物質の結晶の生成を促進するものであるが、 結晶化対象物質の溶液が入っている第 1の部屋にレーザ一光を照射する ことにより、 強制的に結晶核を生成させたり、 結晶化条件をスクリー二 ングしたりするものである。 また、 前記第 1の容器を 1つのプレート内に複数形成してもよい。 本発明の第 2の容器は、 本発明の結晶核若しくは結晶の製造方法に使 用する容器若しくは本発明の結晶条件のスクリーニングに使用する容器 であって、 結晶化対象物質の溶液を入れる第 1の部屋と、 結晶化対象物 質の溶液における結晶化対象物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質 の溶液より高濃度で溶解しているリザーバ一溶液を入れる第 2の部屋と， 前記第 1の部屋および前記第 2の部屋と連通し、 気体が通過可能な通路 とを有し、 前記第 1の部屋が複数あり、 これが複数の前記通路により一 つ以上の前記第 2の部屋と連通しており、 前記複数の通路において、 そ れぞれ、 通路径若しくは通路長の少なくとも一つが異なる容器であり、 前記第 1の部屋の一部若しくは全部は、 前記結晶化対象物質の溶液にレ —ザ一光線を照射可能なように透明若しくは半透明である容器である。 この容器は、 いわゆる蒸気拡散法により結晶化対象物質の溶液の溶媒 の蒸発を促進し、結晶化対象物質の結晶の生成を促進するものであるが、 前記複数の通路において、 通路径および通路長のいずれか若しくは双方 がそれぞれ異なるため、 複数の蒸気拡散条件を同時に設定することがで き、 結晶化の最適条件をスクリーニングしたり、 その条件で結晶を生成 させるものである。 前記第 2の容器を、 1つのプレート内に複数形成してもよい。 本発明の第 3の容器は、 本発明の結晶核若しくは結晶の製造方法に使 用する容器若しくは本発明の結晶条件のスクリーニングに使用する容器 であって、 結晶化対象物質の溶液および前記結晶化対象物質の溶液より 比重が重たくかつ前記結晶化対象物質の溶液と混合しない非混合性高比 重液を入れる第 1の部屋と、 結晶化対象物質の溶液における結晶化対象 物質以外の成分のみが前記高分子溶液より高濃度で溶解しているリザー バー溶液を入れる第 2の部屋とを有し、 前記第 2の部屋の中に前記第 1 の部屋が形成され、 前記第 1の部屋において、 下部の大容積部と、 これ より容積が小さい上部の小容積部とを有し、 その上部先端は開口して前 記両部屋の間は気体が通過可能であり、 少なくとも前記第 1の部屋の上 部もしくは先端開口部に結晶化対象物質の溶液を保持し、 かつ前記結晶 化対象物質の溶液にレーザーを照射可能なように容器の一部若しくは全 部が透明若しくは半透明である容器である。 この容器は、 いわゆる蒸気拡散法により結晶化対象物質の溶液の溶媒 の蒸発を促進し、 かつ結晶化対象物質の溶液と非混合性高比重液との界 面で結晶化対象物質の結晶の生成を促進するものであるが、 前記第 1の 部屋の前記小容積部もしくは先端開口部に結晶化対象物質の溶液を保持 するため、 結晶化対象物質の溶液は少量であってもよい。 また、 前記第 1の部屋の前記大容積部に位置する非混合性高比重液を、 例えば、 マグ ネットスターラ一等で攪拌すれば、 間接的に結晶化対象物質の溶液を攪 拌することができ、 さらに結晶化を促進させることが可能である。 前記第 3の容器の前記第 1の部屋において、 前記下部の大容積部の形 状が逆円錐台若しくは逆角錐状台であり、 前記上部の小容積部の形状が 円筒若しくは角筒であり、 前記両者が連結していることが好ましい。 こ のような形状であれば、 前記第 1の部屋において、 前記上部の小容積部 の先端開口の上に結晶化対象物質の溶液の液滴を形成し、 この状態で、 前記結晶化対象物質の溶液の溶媒を蒸発させることが可能である。 また、 前記第 3の容器を 1つのプレート内に複数形成してもよい。 本発明において、 前記結晶化対象物質は、 特に制限されず、 例えば、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および核酸等があり、 このなかで、 タン パク質の結晶化について本発明の容器を適用することが好ましい。 タン パク質としては、 例えば、 ニヮトリ卵白リゾチーム、 ヒ卜リゾチーム、 グルコースイソメラーゼ、 キシナラ一ゼ、 ホスホェノールピルビン酸力 ルポキシラ一ゼ、 リポヌクレアーゼ、 プロスタグランジン F 2 ひ合成酵 素、 アデノシンデァミナーゼ、 主要異物排出トランスポー夕一などが挙 げられる。 実施例
つぎに、 本発明の実施例について比較例と併せて説明する。
(装置）
図 1に示す装置を実施例 1 、 2、 比較例 1および参考例に用いた。 こ の装置は、 高出力フェムト秒チタンサファイアレーザー 1 0を焦点距離 170 龍のレンズ 5により集光し、 恒温水槽 8中の試料溶液 7に照射する 装置である。 恒温水槽 8は、 温度を ± 0. 0 5 の精度で制御できる。 レーザー 1 0の波長は 800nm、 時間幅は 120fsである。 レーザ一発振の繰 り返し周波数は 1 kHzから 1 Hzまで調整できる。 試料溶液 7に単発のレ一 ザ一パルスを照射するときは、 繰り返し周波数を 20Hzに調節し、 そのパ ルス列から機械シャツタ一 2を 50 msだけ開くことにより単発パルスを 抜き出す。 レーザ一光強度は、 半波長 3と偏光子 4により調整できる。 この装置では、 試料溶液 7に対して強度 250 J/pulse (2 X 1 09wa t t ) のレーザーパルスを照射することができる。 (実施例 1 )
DAST (4-dimetyl amino-N-metyl-4 -N-sti Ibazol ium tosylate) 3.5gを 、 メタノール 200mlおよび回転子と共に、 容量 200mlのテフロン容器 6に 入れ、 初期温度 27.0°Cの恒温水槽 8内にて 2時間で 55.0 まで上昇させ、 スターラ撹拌しながら溶解させた。約 5時間後に DASTが溶解しているのを 確認して溶液 7を 3つに分け、 育成溶液とした。' この際、 回転子は取り除 いた。 溶液準備 16時間後に、 55°Cで 10時間加熱後、 毎時間 3°Cずつ下げて 23°Cまで温度を降下させた。 さらに、毎時間 0.〗でで下げ 21.4T まで温度 を降下させた。 この状態で、 フェムト秒レーザーを光強度 250 ； i/pulse (2 X 1 09wa t t)、 繰り返し周波数 1kHzで 2分間照射した。 その後 、 1時間は結晶析出のないことを確認し、その 10時間後に肉眼で結晶が析 出していることを確認した。前記温度を保持したまま、約 6日観察を続け たところ、 最初に発見した結晶は成長し、 更に 2、 3個の結晶を確認した 。 再び強度 250 J/pulse (2 X 1 09wa t t), 繰り返し周波数 1kHz で 1分間レーザ一を照射し、その後 3日間は結晶析出のないことを確認し た。 (実施例 2)
結晶核生成対象として、 ニヮトリ卵白リゾチームを使用した。 その溶 液は、 蒸留水 50mlに酢酸ナトリウム三水和物 0.467gを加え、 これに酢酸 を加えて PH4.5に調整した後、 塩化ナトリゥム 1.25gおよびニヮトリ卵白 リゾチーム 1.25gを加えて調製した。 室温に調整した前記試料溶液 7を、 100mlのテフロン容器 6に入れ、恒温水槽 8にて 40°Cで 24時間保持し、完 全に溶解させた。 その後、 25°Cまで 5時間で冷却し、 メンブランフィルタ にて不純物を除去した。 その溶液 2mlとフロリナート 3mlを、 1 0本の直 径 18mmのネジ蓋付きガラス瓶 6にそれぞれ注入した。 これらのガラス瓶 6を 25°Cに保持した恒温水槽 8内に静置させ、 溶液温度を 15°Cまで 20時 間で降下させた。 この試料溶液 （リゾチーム溶液） 7の飽和点は 23.8°C である。 そして、 結晶の析出がないことを確認して U°Cまで 24時間で降 下させ、 14 で 24時間保持し、 再度、 結晶の析出がないことを確認した 。 そして、 光強度 250 a J/pulse (2 X 1 09w a t t ) のフエムト秒パ ルスレーザーを溶液 7内に 1分間、 順次照射して、 変化を観察した。 照射 条件は、 レーザ一の繰り返し周波数を変化させ、 50Hz、 100Hzで、 それぞ れ前記ガラス瓶 2本ずつ照射し、 コントロールとして 4本の前記ガラス瓶 にはレ一ザ一を照射しなかった。 レーザー照射 1日後に、 50Hz、 100Hzの 溶液中に結晶が析出していることを肉眼で確認した。 レーザ一を照射し ていない溶液では結晶の析出は見られなかった。 また、 結晶の析出が見 られなかった溶液に 500Hz、 1000Hzのレーザーをそれぞれ照射したところ 、 溶液内に、 リゾチームが凝集 （変性） しているのが観察され、 この溶 液は結晶化の可能性ありと判定した。 (比較例 1)
実施例 2と同じ条件のタンパク質溶液を用いて、 YAGレーザー （波 長 1064 、 5 n s ) を照射して結晶核の生成を試みた。 前記タンパク質 溶液は、 蒸留水 50mlに酢酸ナトリウム三水和物 0. 467gを加え、 これに酢 酸を加えて PH4. 5に調整した後、 塩化ナトリゥム 1 . 25gおよびニヮトリ卵 白リゾチーム 1 . 25gを加えて調製した。室温に調整した前記試料溶液 7を 、 100mlのテフロン容器に入れ、 恒温水槽にて 40°Cで 24時間保持し、 完全 に溶解させた。 その後、 25°Cまで 5時間で冷却し、 メンブランフィルタに て不純物を除去した。 その溶液 2mlとフロリナ一ト 3mlを、 1 0本の直径 18醒のネジ蓋付きガラス瓶にそれぞれ注入した。 これらのガラス瓶を 25 °Cに保持した恒温水槽内に静置させ、 溶液温度を 1 5°Cまで 20時間で降下 させた。 この試料溶液 （リゾチ一ム溶液） の飽和点は 23. 8°Cである。 そ して、 結晶の析出がないことを確認して 14 まで 24時間で降下させ、 14 °Cで 24時間保持し、 再度、 結晶の析出がないことを確認した。 そして、 Y A Gレーザーを溶液内に 1分間、 順次照射して、 変化を観察した。 照射 条件は、 レーザーの繰り返し周波数を変化させ、 1 0Hz、 20Hz、 50Hz、 100Hz 、 500Hz, 1000Hzをそれぞれ照射し、 コントロールとして 4本のガラス瓶 にはレーザ一を照射しなかった。レーザー強度は 1 . 2 m J / p u 1 s eであった 。 レーザー照射 1日後、 結晶の析出は確認できず、 さらに過飽和度を大き くするため 1 6°Cまで 10時間で降下させ、 1 2時間保持し、 結晶の析出がな いことを確認して、 再度レーザーを照射した。 照射条件は上記と同じで ある。 この時も結晶の析出は確認できず、 同様に、 1 5 、 14°Cでもレ一 ザ一照射したが、 結局、 結晶の析出および変性を確認できなかった。 こ の例での光強度は、 実施例で用いたフエムト秒パルスレーザーよりも 1 0倍大きいが、 光密度 （光子流量） は 2 . 5 X 1 0 5 (w a t t ) であ り、 実施例の一万分の一であり、 これが原因で結晶核が生成しなかった と推察できる。 (参考例 1 )
図 2に示す装置を用いてパルスレーザーの爆発現象により生じるであ ろう衝撃波を調べた。 この装置は、 パルスレーザ一照射装置を正立顕微 鏡に組み込んだものである。 図示のように、 正立顕微鏡 1 1は、 観察対 象物を置くステージ 2 8と、 コンデンサーレンズ 2 9と対物レンズ （ 1 0 0倍、 開口数 1 . 2 5 ) 2 6を備え、 前記ステージ 2 8の上には、 マ イク口チップ 2 7が配置されている。 また、 正立顕微鏡 1 1下部のコン デンサ一レンズ 2 9下には、 光源ランプ 1 3が配置され、 この光を検出 する C C Dカメラ 1 2が顕微鏡 1 1上部に配置されている。 また、 正立 顕微鏡 1 1外部にパルスレーザー照射装置 2 1が配置されており、 レ一 ザ一 2 2は、 1 Z 2波長板 2 3および偏光子 2 4を通って正立顕微鏡 1 1内に照射され、 ダイクロイツクミラー 2 5によって光路が直角に曲げ られてステージ 2 8上のマイクロチップ 7内に照射されるようになって いる。 前記パルスレーザーとしては、 チヤープ増幅による高出力フエム ト秒チタンサファイアレーザー（800 nm, 120 is)を使用している。 また 、 マイクロチップ 2 7内には、 ポリスチレン微粒子 （直径 l m) の分 散液が入っている。 この装置において、 レーザー 2 2を照射すると、 ス テージ 2 8上に配置されたマイクロチップ 2 7内のポリスチレン微粒子 分散液にレーザー 2 2が集光する。 そして、 マイクロチップ 2 7内の様 子は、 C C Dカメラ 1 2で観察する。 つぎに、 この装置を使い、 ポリスチレン微粒子に対する衝撃波の影響 を調べた。 すなわち、 前述の条件により、 ポリスチレン微粒子分散液内 に単発でフエムト秒チタンサファイアレーザーを照射した。 レーザーの 集光点で発生すると予想される衝撃波は 3次元的に拡散し、 微粒子はレ 一ザ一集光点から遠ざかる方向へ押される。 この衝撃波によるポリスチ レン微粒子の動きを C C Dカメラで観察し、 レーザーの集光点から離れ る距離を調べることにより、 衝撃波の大きさを見積もった。 図 3は、 パ ルスレーザー照射による衝撃波がポリスチレン微粒子に与える力の関係 を模式的に表したものである。 同図において、 ίは微粒子が受ける衝撃 波の力を示し、 F。は衝撃波により発生する力を示し、 R。は微粒子の初 期位置を示し、 Rは衝撃波中心からの微粒子の位置を示し、 rは微粒子 の半径を示し、 3 2はレーザー光を示し、 3 3はポリスチレン微粒子を 示し、 3 4はレーザーの集光点を示し、 3 7はポリスチレン微粒子分散 液を示す。 また、 図 4は、 パルスレーザ一照射と、 その衝撃波による微 粒子の移動距離の関係を示すグラフである。 同図において、 横軸は、 時 間を示し、 縦軸は、 衝撃波中心からの微粒子の位置 （R ) を示し、 R。 は微粒子の初期位置を示し、 Lは微粒子の移動距離を示し、 黒丸はパル スレーザーの照射時間を示す。 このグラフに示すように、 パルスレーザ 一が照射されると、 微粒子が瞬間的に焦点から遠ざかることが解る。 衝 撃波がインパルス応答で 3次元的に等方的に伝搬して、 微粒子が水の粘 性抵抗により停止すると仮定した場合、 以下の式が成立し、 微粒子の初 期位置（R。）と移動距離 α)の関係から衝撃波により発生する力（F。；)を見 積もることができる。 微粒子の受ける衝撃波の力 ： f --F。
微粒子の運動方程式： d2R dR
-o tnr
dt2 dt 微粒子の変位量
L=R(t =∞)-RQ
Fn-r 1
L
このようにして、 数百にのぼる微粒子の動きを観測し、 フェムト秒チ タンサファイアレーザーの光強度と衝撃波により発生する力の関係を求 めた。 その結果を、 図 5のグラフに示す。 このグラフにおいて、 縦軸は 衝撃波の力 （F 0) を示し、 横軸はレーザー光強度 （ 1。） を示す。 図示 のように、 この参考例では、 6 On】/pulse以上で衝撃波を確認できた。 爆発現象の閾値は、 多光子吸収の確率に依存するため、 レーザ一ェネル ギ一の総量として定義されるレーザ一強度ではなく、 瞬間的に到達する 光の密度 （ I ) により関係づけられる。 この参考例では、 時間幅 （Δ t ) 1 2 0 f sのパルスレーザーのレーザー強度 （W) が 6 0 nJ/pulseであ つたから、 その光密度 （ I ) は、 以下のようになる。
I =W/A t = 5 X 1 05 (J/s-pulse = watt) したがって、 この参考例では、 時間幅 （A t ) は、 Δ t <W/ 5 X 1 05となる。 この式とレーザー照射装置の能力とを考慮すると、 ナノ秒 以下の時間幅を持つパルスレーザーが好ましく、 より好ましくはピコ秒 以下、 最適にはフェムト秒以下である。 なお、 この参考例によって、 本 発明は限定的に解釈されない。 また、 この参考例では、 レーザー集光点 で爆発現象が起きて衝撃波が発生すると仮定しているが、 本発明は、 こ れに限定されない。
なお、 この参考例では衝撃波の可視化のためにポリスチレン微粒子を 用いているが、 ポリスチレン微粒子の重量は l.lxl0_12gであり、 蛋白質 の 1億倍以上の重量である。 つまり、 蛋白質はポリスチレン微粒子より も遙かに弱い衝撃波でも、 その密度を変化させる可能性がある。 ポリス チレン微粒子の可視化により定義されたパルスレーザーの光密度とレ一 ザ一強度は、 本発明におけるその下限を限定するものではない。
(実施例 3)
本実施例はニヮトリ卵白リゾチーム （ 14 kD a) を結晶化した実施 例である。 タンパク質溶液の条件は、 2 5mgZm 1のリゾチーム、 2 . 5 %の塩化ナトリウム、 0. 1Mの酢酸ナトリウム、 pH4. 5であ り、 室温で調製した。 この溶液を、 メンブランフィルタにて不純物を除 去した。 結晶化は、 図 6に示すレーザ一照射装置および結晶化プレートを用い 、 バッチ法にて行った。 図示のように、 このレーザー照射装置では、 フ ェムト秒レーザ一照射装置 1 0 1から照射されたレーザーが、 ミラー 1 02、 波長板 1 0 3、 偏光子 1 04およびシャッター 1 0 5を通過して 対物レンズ （1 0倍） 1 08で集光され、 結晶化プレート 1 0 9の結晶 育成容器部 1 0 7に照射されるようになっている。 前記結晶化プレート 1 0 9は、 蒸気拡散法を利用したものであり、 タンパク質溶液を入れる 結晶育成容器部 1 0 7と、 これと連通しているサーバ一溶液部 1 0 6と を有する。 前記サーバー溶液は、 タンパク質溶液において、 タンパク質 を除いた残りの成分と同じ成分が溶解している溶液であり、 これによつ てタンパク質溶液の蒸発が促進される。 同図において、 1 1 0はシーリ ングテープであり、 1 1 1は透明ガラスである。 そして、 前記結晶育成 容器部 1 0 7は、 接眼レンズ 1 1 2で肉眼で観察できるようになつてお り、 また CCD 1 1 3カメラおよびモニター 1 14によっても観察可能 となっている。 レーザ—の照射は、 温度 ·湿度管理したクリーンルーム内 （温度 23 °C± 2° (：、 湿度 6 5 %± 5 %) で行った。 レーザーの波長は 7 80 nm 、 時間幅は 200フエムト秒 （ f s )、 レーザ一発振の繰り返し周波数は 1 kHzである。 レーザ一光強度は、 波長板と偏光子により調節した。 レーザー光の照射回数は、 シャツ夕一の開閉時間を変化させることによ り調整した。 タンパク質溶液 1 0 1を、 結晶化プレート 1 1 0のそれぞれの結晶 育成容器部 1 07に入れ、 室温にて溶液中にレーザーを集光照射した。 レーザ—のパルス強度は 1. 9 5 n J Zパルスであった。 シャッターの 開閉時間により、 8パルス ( 1/1 2 5秒）、 62パルス ( 1/1 6秒) 、 240 00パルス （24秒）、 照射なし （0秒） とし、 パルス数を変化 させた。 レーザ一照射後は 1 8 °Cに設定した恒温槽内に静置して、 その後の結 晶成長を観察した。 レーザー照射 2日後の写真を図 8に示す。 結晶の析 出数が、 レーザー照射回数とともに増加した。 また、 照射していないサ ンプルにおいて、 小さな結晶が非常に多く析出した。 これは、 高過飽和 溶液のために、 結晶核が溶液中の至る所で自然発生したためであり、 一 度に大量の核発生につながった。 これは、 通常の結晶育成においても、 よく観られることであり、 結晶の高品質化、 大型化の障壁となっている 。 一方、 レーザーを照射したサンプルにおいては、 室温の低過飽和溶液 内で結晶核が生成し、 その核が種結晶となり、 成長した。 そのため、 パ ルス数が増加すると、 結晶核の生成量が増加するため、 結果として、 結 晶析出が増加している。
このように、 結晶核の発生はレーザ一パルスの照射回数に依存した現象 であると考えられる。 照射回数の増加により結晶数が増えることは、 照 射回数の増加により結晶が生成する確率が増加することと同義である。 また、 レーザ一による爆発現象が起こるためのレーザ一強度が照射回数 の増加により減少する現象 （インキュベーション効果） が一般に知られ ている （例えば、 S.Preuss 等 (Appl. Phys. Lett. 62 (23), 7 June 1993 p3049-3051))o つまり、 照射回数の増加により、 結晶生成に必要なレ一 ザ一パルスの光密度、 レーザ一強度が減少することが考えられる。 本実 施例においても、 複数発のレーザ一照射によるレーザー強度が、 ポリス チレン微粒子の動きによって定義したレーザー強度の下限を大きく下回 るが、 これは蛋白質分子がポリスチレン微粒子よりも遙かに小さいこと と、 パルスレーザ一の複数発照射の効果であると考えられる。 ただし、 これらは、 あくまでも本発明者等の推察であって、 本発明の範囲を限定 するものではない。
(実施例 4)
本実施例は、 リポヌクレアーゼ H ( 1 7 kD a) の結晶化の実施例で ある。 タンパク質溶液は、 5mgZm 1のリポヌクレア一ゼ Hを、 0. 0 5 Mのトリス塩酸緩衝液 （pH 9. 0) に、 室温で溶解することで調 製した。 その後、 メンブランフィル夕にて不純物を除去した。 また、 サ —バ一液 （外液） として、 0. 2Mのトリス塩酸、 pH 9. 0を作成し た。 レーザー照射による結晶化は、 図 6に示すレーザ一照射装置および 結晶化プレートを用いて、 シッティングドロップ蒸気拡散法にて行った すなわち、 タンパク質溶液 1 0 1を結晶育成容器部 1 0 Ίに入れ、 サーバー溶液部 1 0 6に 1 00 1の外液を分注した。 そして、 室温に てタンパク質溶液中にレーザーを集光照射した。 レーザーの照射は、 温 度 ·湿度管理したクリーンルーム内 （温度2 3 ± 2 、 湿度 6 5 %土 5 %) で行った。 レーザ一の波長は 7 8 0 nm、 時間幅は 2 00フエム ト秒 （ ί s )、 レーザー発振の繰り返し周波数は 1 kH ζである。 レーザ —光強度は、 波長板と偏光子により調節した。 レーザー光の照射回数は 、 シャッターの開閉時間を変化させることにより調整した。 レ一ザ一の パルス強度は 1. 9 5 n J /パルスであった。 シャッターの開閉時間に より、 8パルス ( 1 /1 2 5秒）、 62パルス ( 1/1 6秒）、 40 00 パルス （4秒）、 8 0 00パルス （8秒）、 照射なし （0秒） とし、 パル ス数を変化させた。 レーザ一照射後は 1 4t に設定した恒温槽内に静置して、 その後の結 晶成長を観察した。 レーザ一照射 1日後の写真を図 9に示す。 照射して いないサンプルにおいては、 結晶の析出が 2週間以上経っても見られな かった。 しかしながら、 レーザ一の照射条件により析出状態に違いが見 られた。 8パルスでは、 結晶核が生成しなかったのに対して、 62パル スと 4000パルスを照射した溶液からは、 結晶の析出が観測できた。 また、 8 000パルスを照射した溶液内には、 変性したリポヌクレア一 ゼ Hが見られた。
(実施例 5)
本実施例は、 グルコースイソメラーゼ （ 1 7 3 kD a) の結晶化の実 施例である。 タンパク質溶液は、 20 mg/m 1のグルコースイソメラ ーゼを、 0. 2Mの硫酸アンモニゥム溶液 （pH 7. 0) に室温で溶解 して調製した。 その後、 メンブランフィルタにて不純物を除去した。 ま た、 サーバー液 （外液） として、 0. 2Mの硫酸アンモニゥム、 1 5 % のポリエチレンダリコール （P EG) 6 0 0 0を溶解した溶液 （pH 7 . 0) を調製した。 レ一ザ一照射による結晶化は、 図 6に示すレーザー 照射装置および結晶化プレートを用いて、 シッティングドロップ蒸気拡 散法にて行った。 すなわち、 タンパク質溶液 1 0 1を結晶育成容器部 1 0 Ίに入れ、 サーバー溶液部 1 0 6に 1 0 0 i 1の外液を分注した。 その後、 サーバ 一溶液部 1 0 6から 5 1をピぺットにて吸い上げ、 結晶育成容器部 1 0 7に注入し、 タンパク質溶液とサーバー溶液を十分混ぜた。 そして、 室温にてタンパク質溶液中にレーザーを集光照射した。 レーザーの照射 は、 温度 ·湿度管理したクリーンル一ム内 （温度 2 3°C± 2 、 湿度 6 5 %± 5 %) で行った。 レーザーの波長は 7 8 0 nm、 時間幅は 2 0 0 フェムト秒 （ f s；)、 レーザー発振の繰り返し周波数は 1 kH zである。 レーザ一光強度は、 波長板と偏光子により調節した。 レーザ一光の照射 回数は、 シャッターの開閉時間を変化させることにより調整した。 レー ザ一のパルス強度は 1. 9 5 n J Zパルスであった。 シャツ夕一の開閉 時間により、 8パルス ( 1 / 1 2 5秒）、 40 0 0パルス （4秒）、 照射 なし （0秒） とし、 パルス数を変化させた。 レーザー照射後は 1 8 °Cに設定した恒温槽内に静置して、 その後の結 晶成長を観察した。 レーザー照射 1日後の写真を図 1 0に示す。 レ一ザ 一を照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが、 照射していないサ ンプルにおいては、 結晶の析出が 1ヶ月以上経っても見られなかった。 本実施例では、 分子量が約 20万の巨大タンパク質であるグルコースィ ソメラーゼを結晶化できた。 このことにより、 レーザー照射を利用する 本発明の方法は、 このような巨大タンパク質の結晶化にも有効だといえ る。
(実施例 6)
本実施例は、 トリパノソ一マ由来プロスタグランジン F 2 ひ合成酵素 (3 1 kb a) の結晶化の実施例である。 タンパク質溶液は、 20mg Zm lの前記合成酵素を、 0. 0 0 5 Mのニコチンアミドアデニンジヌ クレオチドリン酸 （NADP+) と共に、 0. 04Mのトリス塩酸緩衝 液 （pH8. 0) に室温で十分溶解させて、 調製した。 その後、 メンブ ランフィルタにて不純物を除去した。 また、 サーバ一溶液 (外液) とし て、 0. 0 1 Mのへぺス水酸化ナトリウム緩衝液 （HE P E S— N a〇 H)、 2 %のポリエチレンダリコ一ル （P EG) 40 0、 1. 2 Mの硫酸 アンモニゥムの溶液 （pH7. 5) を調製した。 レーザー照射による結晶化は、 図 7に示すレーザー照射装置および結 晶化容器を用い、 ハンギングドロップ蒸気拡散法にて行った。 図示のよ うに、 このレーザー照射装置では、 フェムト秒レーザー照射装置 1 0 1 から照射されたレーザ一が、 ミラー 1 0 2、 波長板 1 03、 偏光子 1 0 4およびシャッター 1 0 5を通過して対物レンズ （ 1 0倍） 1 0 8で集 光され、 結晶化容器 1 1 8の結晶溶液 1 1 7に照射されるようになって いる。 そして、 前記結晶溶液 1 1 7は、 接眼レンズ 1 1 2で肉眼で観察 できるようになつており、 また CCD 1 1 3カメラおよびモニター 1 1 4によっても観察可能となっている。 同図において、 1 1 6は外液であ り、 1 1 5はガラス板であり、 1 1 9はグリースである。 図示のように、 タンパク質溶液 2 1 と外液 2 1を混合した結晶化 溶液の液滴をガラス板 1 1 5上に形成した。 結晶化容器 1 1 8に外液 1 1 6を 500 1入れ、 前記結晶化溶液の液滴 1 1 7を吊り下げるよう にしてガラスで蓋をした。 このとき、 グリース 1 1 9を用いて密封させ た。 外液 1 1 6が落下しないように注意しながら、 結晶化容器 1 1 8を 逆さにし、 結晶化溶液の液滴 1 1 7中にレーザ一を集光照射した。 レー ザ一の照射は、 温度 ·湿度管理したクリーンルーム内 （温度 23°C± 2 °C、 湿度 65 %± 5 %) で行った。 レーザーの波長は 7 80 nm、 時間 幅は 200フェムト秒（ ί s )、 レーザー発振の繰り返し周波数は 1 kH zである。 レーザー光強度は、 波長板と偏光子により調節した。 レーザ 一光の照射回数は、 シャッターの開閉時間を変化させることにより調整 した。 レーザーのパルス強度は 1. 9 5 n J /パルスであった。 シャツ ターの開閉により 6 2パルス ( 1 Z 1 6秒) を照射した。 対象実験とし て、 レーザー照射なしサンプルを育成した。 レ一ザ一照射後は、 20°Cに設定した恒温槽内に静置して、 その後の 結晶成長を観察した。 レーザー照射 7日後の写真を図 1 1に示す。 レ一 ザ一を照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが、 照射していない サンプルにおいては、 結晶の析出が 3ヶ月以上経っても見られなかった 。 本実施例では、 レーザー照射により短期間で結晶が生じた。
(実施例 7)
本実施例は、 アデノシンデァミナ一ゼ（ADA) ネイティブの結晶化の実 施例である。 タンパク質溶液は、 2 OmgZm 1の ADAネイティブ、 を 0 . 00 2 5 Mのへぺス緩衝液 （pH 7. 5) に室温で溶解することによ り調製した。 その後、 メンブランフィル夕にて不純物を除去した。 また 、 サ一バー溶液 （外液） として、 ① 0. 2 Mのクェン酸ナトリウム、 0 . 1 Mの力コジル酸ナトリウムおよび 3 0 %イソプロパノールの溶液 （ p H 6. 5) と② 0. 2Mの酢酸アンモニゥム、 0. 1 Mのクェン酸ナ トリウムおよび 3 0 %のポリエチレングリコール （PEG) 4000の 溶液 （pH 5. 6) を調製した。 レーザー照射による結晶化は、 図 6に示すレーザー照射用および結晶 化プレートを使用し、 シッティングドロップ蒸気拡散法にて行った。 夕 ンパク質溶液 2 H 1を結晶育成容器部 1 0 7に入れ、 サーバ一溶液部 1 06に 1 00 1の外液①と②をそれぞれ分注した。 その後、 サーバー 溶液部 1 06から 2 1をピぺッ卜にて吸い上げ、 結晶育成容器部 1 0 7に注入した。 タンパク質溶液と外液が十分に混ざった後、 室温にてタ ンパク質溶液中にレーザ一を集光照射した。 レーザーのパルス強度は 1 . 95 n J /パルスであった。 シャッターの開閉により、 1 0 00パル ス （1秒） を照射した。 対象実験として、 照射なしサンプルを育成した
レーザー照射後は 2 o°Cに設定した恒温槽内に静置して、 その後の結 晶成長を観察した。 レーザー照射 7日後の写真を図 1 2に示す。 レ一ザ 一を照射した溶液からは結晶の析出が観察できたが、 照射していないサ ンプルにおいては、 結晶の析出が 1ヶ月以上経っても見られなかった。 本タンパク質に関して、 これまでに結晶が得られたことはなく、 本実施 例において、 初めて結晶化が実現できた。
(実施例 8) 本実施例は、 大腸菌主要異物排出卜ランスポーター （AcrB) を結晶化 した例である。 AcrBはポリ トピック型膜タンパク質であり、 1 049ァ ミノ酸残基からなる単量体が、 3個絡み合った 3量体タンパク質である
タンパク質溶液は、 28mg/m 1のヒスチジン標識を付けた AcrBに 、 0. 02 Mの燐酸ナトリウム （pH6. 2)、 1 0 %グリセロールおよ び 0. 2 %ドデシルマルトシドを添加して、 調製した。 サーバー液 （外 液） として、 14. ；!〜 14. 6 %のポリエチレングリコ一ル （PEG ) 4000、 0. 08 Mの燐酸ナトリウム （pH6. 2 ) と、 0. 0 2 Mのクェン酸ナトリウム一塩酸 （pH 5. 6) とを調製した。
レ一ザ一照射による結晶化は、 図 6に示す結晶化容器と装置を使用し ングドロップ蒸気拡散法にて行った。 タンパク質溶液 2 i lを、 結晶育成容器部 1 07に入れ、 サーバー溶 液部 1 0 6に 50 ^ 1の前記外液を分注した。 その後、 サーバー溶液部 1 06から 2 1をピぺットにて吸い上げ、 結晶育成容器部 1 0 7に注 入し、 タンパク質溶液と外液を十分に混合した。 本実施例では、 PEG 40 0 0の濃度を 1 4. 1 %から 14. 6 %までの 0. 1 %刻みで 6条 件の育成溶液を準備し、 それぞれの育成溶液で結晶化を行った。 その後 、 温度 ·湿度管理したクリーンルーム内 （温度 23°C± 2°C、 湿度 6 5 %± 5 %) にて高出力フエムト秒チタンサファイアレーザ一を対物レン ズ （倍率 1 0倍） により集光し、 タンパク質溶液中に照射した。 レーザ
—の波長は 78 0 nm、 時間幅は 20 0フェムト秒 （ f s )、 レーザ一発 振の繰り返し周波数は 1 kH z、 レーザーのパルス強度は 8 00 n J / パルスであった。 シャッターの開閉時間により、 2 50パルス (1Z4 秒） を照射した。 対象実験として、 照射なしサンプルを育成した。 レーザ—照射後は 2 5 に設定した恒温槽内に静置して、 その後の結 晶成長を観察した。 レーザー照射 2日後の写真を図 1 3に示す。 図示の ように、 ポリエチレングリコール （PEG) 4000の濃度を変えて結晶育成溶 液を調製したが、 いずれの育成溶液においてもレーザーを照射した溶液 からは結晶の析出が観察できたが（図 1 3において矢印で示す）、照射し ないサンプルからは、 1週間後においても結晶の析出が確認できなかつ た （図示せず）。
膜タンパク質は、 結晶化が困難であるが、 本実施例では、 膜タンパ ク質の結晶化が実現できた。
(参考例 2 )
この参考例は、 容器を運動させてタンパク質を結晶化した例である。 ニヮトリ卵白リゾチームの結晶育成において、 溶液攪拌を行った。 夕 ンパク質溶液は蒸留水 50ml、 酢酸ナトリウム三水和物 0. 467gの中に酢酸 を加え PH4. 5に調整した後、 塩化ナトリゥム 1. 25gおよびニヮトリ卵白リ ゾチーム 1. 25gを追加したものを用いた。 室温で調整した溶液を、 100ml のテフロン容器に入れ、 恒温水槽にて 40°Cで 24時間保持し、 完全に溶解 させた。 その後、 まで 5時間で冷却し、 穴径 0. 2 / mのメンブランフィ ル夕にて不純物を除去した。 一方、 リザ一バー溶液は蒸留水 50ml、 酢酸 ナトリゥム三水和物 0. 467gの中に酢酸を加え PH4. 5に調整した後、塩化ナ トリゥム 3gを追加したものを用いた。
夕ンパク質溶液 3 ^ 1および 10 1 1に対して、 リザ一バー溶液を 300 1 とし、 溶液攪拌の有無による違いを調べた。 結晶化手法は、 シッティン グドロップ蒸気拡散法を用いた。 また、 フロリナート （前記タンパク質 溶液も比重が重い液） を用いた 2液界面での結晶育成であるフローティン グドロップ蒸気拡散法についても同時に実験を行った。 フロリナート溶 液量は 10 z 1である。 結晶育成は 20°C—定温度で行った。
攪拌機構はロータリ一振盪器 （タイテック製 BR-15) を用いた。 回転速 度は、 溶液が緩やかに攪拌される 50 rpmに設定した。 この攪拌装置の模 式図を図 14に示す。 図示のように、 振盪器 20 2に、 ゥエルプレート 20 1を載せて回転運動させて攪拌した。 また、 ゥエルプレート 20 1 の各ゥエルは、 2つの小ゥエルと 1つの大ゥエルとから構成されている。 Floating-drop法を適用する小ゥエルには、前記タンパク質溶液およびフ 口リナート 2 14が入れてあり、 Sitting- drop法を適用する小ゥエルで は、 前記タンパク質溶液 2 1 2が入れられている。 また、 大ゥエルでに は、 リゾチウム以外の成分が高濃度で溶解しているリザーバー溶液 2 1 3が入れられている。 この方法では一度にたくさんの溶液を簡便に攪拌 することができる。
結晶の育成結果を図 1 5に示す。 溶液攪拌の有無で結晶析出数と結晶 サイズに明らかな違いが生じた。 図 1 5A、 Bに示すように、 溶液を攪 拌しない従来法においては、 非常に小さい結晶 （微結晶） が数多く析出 した。 一方、 図 1 5 C, Dに示すように、 溶液攪拌した育成では、 結晶 の析出数が少なく大きな結晶が得られた。 また、 溶液攪拌シッティング ドロップ法 （図 1 5 C参照） に比べて、 溶液攪拌フローティングドロッ プ法 （図 1 5 D) の方が結晶の析出がより少なく、 結晶サイズも大きか つ /こ。 つぎに、 本発明の容器の実施例について、 図に基づき説明する。 (実施例 9 )
図 1 6の断面図に、本発明の第 1の容器の一例を示す。図示のように、 この容器 3 0 1は、 第 1の部屋 3 1 1と第 2の部屋 3 1 3を有し、 前記 両部屋は、 通路で連通している。 この容器 3 0 1の上部は、 蓋体 3 1 6 で覆われて密閉状態となっており、 また前記容器 3 0 1の底部 3 1 5は、 レーザー光 3 1 7が透過できるように、 前記第 1の部屋に該当する部分 が透明若しくは半透明になっている。 この底の部分の材質は、 レーザ一 光を通せば、 特に制限されず、 例えば、 アクリル樹脂等の透明榭脂、 石 英ガラス、 ガラス等の透明部材が使用できる。 また、 その他の部分の部 材は、 特に制限されず、 一般の樹脂やガラス等が使用できる。 この容器 全体の大きさは、 特に制限されず、 例えば、 縦 2 0〜1 8 0 mm X横 1 0〜： L 2 0 X高さ 3〜5 0 mm、 好ましくは、 縦 4 0〜 1 5 0 mm X横 2 0〜1 0 0 X高さ 5〜3 0 mm、 より好ましくは縦 5 0〜 1 3 0 mm X横 3 0〜 8 0 X高さ 1 0〜 2 0 mmである。 第 1の部屋 3 1 1には、 タンパク質溶液等の溶液 3 1 2が入れられ、 第 2の部屋 3 1 3には、 リ ザ一バー溶液 3 1 4が入れられるため、 第 1の部屋 3 1 1は、 第 2の部 屋 3 1 3の部屋より小さいほうがよい。 この容器 3 0 1は、 例えば、 つ ぎのようにして使用される。 まず、 蓋体 3 1 6を外して、 第 1の部屋 3 1 1にタンパク質溶液等の 高分子溶液 3 1 2を入れ、 第 2の部屋 3 1 3にリザ一バー溶液 3 1 4を 入れ、 蓋体 3 1 6で蓋をして密閉する。 すると、 同図において矢印で示 すように、 高分子溶液 3 1 2から発生した水蒸気が通路を通って第 2の 部屋 3 1 3に移行し、 これによつて高分子溶液 3 1 2の溶媒の蒸発が促 進される。 そして、 高分子溶液 3 1 2が過飽和状態になったら、 結晶核 を強制的に生成させるため、 容器 3 0 1の底部から、 例えば、 パルスレ —ザ一光 3 1 7を高分子溶液 3 1 2に照射する。 結晶核が生成すれば、 そのまま、 結晶を成長させればよいし、 結晶核が生成しなければ、 その 2003/010681
条件は、 結晶化に不適と判断して、 別の条件で結晶化を試みればよい。 このように、 パルスレーザ一を照射して結晶核の生成を観察し、 結晶 核が生成すれば、 その溶液等の条件は、 結晶化に適していると判断でき るし、 そのまま育成すれば結晶が得られる。 また、 パルスレーザ一を照 射して溶質の状態を観察し、 溶質が変化していれば、 その溶液等の条件 は結晶化に適していると判断できる。 前記溶質の変化は、 タンパク質の 場合、 例えば、 立体構造の変化 （変性） である。 本発明の容器において、 レーザーの種類、 照射条件等は、 本発明の製 造方法等で記載したとおりであり、 これらのレーザーの条件などは、 本 発明の他の容器若しくはプレートでも共通である。 (実施例 1 0 )
つぎに、 一つのプレート内に前記第 1の容器を複数形成した例を、 図 1 7の斜視図に示す。 図示のように、 このプレート 3 0 2は、 6個の第 1の容器 3 2 1が形 成されており、 これは、 第 1の部屋 3 2 1 aと第 2の部屋 3 2 1 bを有 し、 前記両部屋は通路で連通している。 また、 このプレート 3 0 2は、 前記第 1の容器 3 2 1が形成されたプレート本体 3 2 2、 底部 3 2 3お よび蓋体 3 2 4とから構成されている。 底部 3 2 3は、 レーザー光 3 2 5が照射可能なように透明若しくは半透明部材から形成されている。 こ のプレート 3 0 2の形成材料および容器 3 2 1の大きさ等については、 前述の第 1の容器と同様である。また、このプレート 3 0 2の大きさは、 特に制限されず、 例えば、 縦 2 0〜 1 8 O mm X横 1 0〜 1 2 0 X高さ 3〜 5 0 mm、 好ましくは、 縦 4 0〜； L 5 0 mm X横 2 0〜； L 0 0 X高 さ 5〜4 0 mm、 より好ましくは縦 5 0 - 1 3 O mm X横 3 0〜8 0 X 高さ 1 0〜 3 O mmである。 このプレート 3 0 2において、 容器 3 2 1 の個数は 6個であるが、 本発明はこれに限定されず、 プレートあたり、 容器数 1〜 1 5 3 6個、 好ましくは 2〜3 8 4個、 より好ましくは 4〜 9 6.個である。 このプレート 3 0 2は、 例えば、 つぎのようにして使用 される。 すなわち、 まず、 容器 3 2 1部分の第 1の部屋 3 2 1 aに高分子溶液 を入れ、 第 2の部屋 3 2 1 bにリザーバ一溶液を入れると、 蒸気拡散に より、 高分子溶液の溶媒の蒸発が促進される。 そして、 高分子溶液が過 飽和状態となったら、前述のように、パルスレーザー 3 2 5を照射して、 結晶核を強制的に生成させる。 結晶核が生成したら、 これを育成して目 的とする高分子結晶を得ることができる。 また、 結晶核が生成しない場 合は、 結晶化条件が不適当と判断して、 次の条件で結晶化を試みる。 こ のプレートでは、 複数の容器が形成されているから、 高分子溶液の濃度 を変えるなど容器毎に異なる結晶化条件を設定でき、 また、 容器毎に異 なる条件でレーザ一を照射できる。 (実施例 1 1 )
つぎに、 本発明の第 2の容器の一例を図 1 8に示す。 同図において、 ( A) は、 平面図であり、 （B ) は断面図である。 図示のように、 この容器 3 0 3は、 円盤の底に円柱が結合した形状で ある。 前記円盤の周辺部には、 円中心から放射状に 8個の第 1の部屋 3 3 1が形成され、 前記円柱の中には、 1つの第 2の部屋 3 3 2が形成さ れており、 前記第 1の部屋 3 3 1のそれぞれから通路 3 3 3が延びて、 第 2の部屋 3 3 2と連通している。 前記 8個の通路 3 3 3において、 各 通路 3 33は、 それぞれ通路径が異なっている。 この容器 30 3全体の 大きさは、 特に制限されず、 第 1の部屋の大きさと個数や、 第 2の部屋 の大きさ等により適宜決定される。前記第 1の部屋の大きさは、例えば、 内径 0. 5〜： L 0mm、 深さ l〜 50mm、 好ましくは、 内径 1〜 5 m m、 深さ 3〜40mm、 より好ましくは内径 1〜 3 mm、 深さ 3〜3 0 mm、 であり、 第 1の部屋の個数は、 例えば、 1〜 1 5 3 6個、 好まし くは 2〜 3 84個、 より好ましくは 4〜 9 6個である。 前記第 2の部屋 の大きさは、 例えば、 内径；！〜 3 0mm、 深さ l〜 5 0mm、 好ましく は、 内径 2〜2 0mm、 深さ 2〜40mm、 より好ましくは内径 3〜 1 5mm、 深さ 3〜3 0mmである。 前記通路の長さも制限されず、 例え ば、 0. 5〜5 0mm、 好ましくは l〜3 0mm、 より好ましくは；！〜 2 Ommである。 また、 この通路は、 その通路径がそれぞれ異なるが、 例えば、 0. 3〜 1 0 mm、 好ましくは 0. 5〜5mm、 より好ましく は 0. 5〜 3mmである。 この容器 30 3の材質も特に制限されず、 例 えば、 樹脂やガラスなどで構成されるが、 第 1の部屋にレーザーを照射 する場合は、 その部分をレーザーが透過するように、 前述の透明若しく は半透明部材で構成すればよい。 この容器 30 3は、 例えば、 つぎのよ うにして使用する。 すなわち、まず、複数の第 1の部屋 33 1に高分子溶液 334を入れ、 第 2の部屋 3 3 2にリザ一バー溶液 3 3 5を入れると、 図中の矢印で示 すように、 高分子溶液 3 34から発生した水蒸気が通路 33 3を通り、 第 2の部屋 3 3 2に移動するという蒸気拡散により、 高分子溶液 3 34 の溶媒の蒸発が促進される。 この蒸気拡散において、 通路 33 3の通路 PC蘭賺誦 1
径がそれぞれ異なるため、 第 1の部屋 3 3 3のそれぞれの蒸気拡散条件 が異なることになる。 したがって、 複数の第 1の部屋において、 結晶核 が生成したものは、 そのまま育成を続けて目的とする高分子結晶を得る ことができる。 また、 結晶核が生じない第 1の部屋は、 結晶化条件が不 適と判断することができる。 さらに、 高分子溶液 3 3 4が過飽和状態と なったら、 前述のように、 パルスレ一ザ一を照射して、 結晶核を強制的 に生成させてもよい。 結晶核が生成したら、 これを育成して目的とする 高分子結晶を得ることができる。 また、 結晶核が生成しない場合は、 結 晶化条件が不適当と判断して、 次の条件で結晶化を試みる。
(実施例 1 2 )
つぎに、 本発明の第 2の容器のその他の例を図 1 9に示す。 同図にお いて、 （A) は、 平面図であり、 （B ) は断面図である。 図示のように、 この容器 3 0 4は、 円盤の底に円柱が結合した形状で ある。 前記円盤の周辺部には、 円中心から放射状に 8個の第 1の部屋 3 4 1が形成され、 前記円柱の中には、 1つの第 2の部屋 3 4 2が形成さ れており、 前記第 1の部屋 3 4 1のそれぞれから通路 3 4 3が延びて、 第 2の部屋 3 4 2と連通している。 前記 8個の通路 3 4 3において、 各 通路 3 3 3は、 それぞれ通路長が異なっている。 この容器 3 0 4全体の 大きさは、 特に制限されず、 第 1の部屋の大きさと個数や、 第 2の部屋 の大きさ等.により適宜決定される。前記第 1の部屋の大きさは、例えば、 内径 0 . 5〜： L 0 mm、 深さ l〜 5 0 mm、 好ましくは、 内径 l〜 5 m m、 深さ 3〜4 0 mm、 より好ましくは内径 1〜 3 mm、 深さ 3〜 3 0 mm、 であり、 第 1の部屋の個数は、 例えば、 1〜 1 5 3 6個、 好まし くは 2〜 3 8 4個、 より好ましくは 4〜 9 6個である。 前記第 2の部屋 PC蘭賺誦 1
の大きさは、 例えば、 内径 l〜30mm、 深さ l〜5 0mm、 好ましく は、 内径 2〜20mm、 深さ 2〜40mm、 より好ましくは内径 3〜 1 5 mm, 深さ 3〜 3 0mmである。 前記通路の長さも制限されず、 例え ば、 0. 5〜 5 0mm、 好ましくは l〜 3 0mm、 より好ましくは 1〜 20mmである。 また、 この通路は、 その通路径がそれぞれ異なるが、 例えば、 0. 3〜： L 0mm、 好ましくは 0. 5〜 5mm、 より好ましく は 0. 5〜 3mmである。 この容器 4の材質も特に制限されず、例えば、 樹脂やガラスなどで構成されるが、 第 1の部屋にレーザーを照射する場 合は、 その部分をレーザーが透過するように、 前述の透明若しくは半透 明部材で構成すればよい。 この容器 3 04は、 例えば、 つぎのようにし て使用する。 すなわち、まず、複数の第 1の部屋 34 1に高分子溶液 344を入れ、 第 2の部屋 342にリザ一バー溶液 34 5を入れると、 図中の矢印で示 すように、 高分子溶液 344から発生した水蒸気が通路 343を通り、 第 2の部屋 342に移動するという蒸気拡散により、 高分子溶液 344 の溶媒の蒸発が促進される。 この蒸気拡散において、 通路 343の通路 長がそれぞれ異なるため、 第 1の部屋 343のそれぞれの蒸気拡散条件 が異なることになる。 したがって、 複数の第 1の部屋において、 結晶核 が生成したものは、 そのまま育成を続けて目的とする高分子結晶を得る ことができる。 また、 結晶核が生じない第 1の部屋は、 結晶化条件が不 適と判断することができる。 さらに、 高分子溶液 344が過飽和状態と なったら、 前述のように、 パルスレーザーを照射して、 結晶核を強制的 に生成させてもよい。 結晶核が生成したら、 これを育成して目的とする 高分子結晶を得ることができる。 また、 結晶核が生成しない場合は、 結 晶化条件が不適当と判断して、 次の条件で結晶化を試みる。 なお、 実施例 1 1では、 通路径を変化させ、 実施例 1 2では、 通路長 を変化させたが、 これらを組み合わせてもよい。 また、 実施例 1 1の容 器、 実施例 1 2の容器およびこれらの組み合わせの容器の少なくとも一 つを、 1つのプレート内に複数形成してもよい。 このプレートの大きさ 等の条件は、 例えば、 実施例 1 0のプレートと同様である。
(実施例 1 3)
つぎに、本発明の第 3の容器の一例を、図 20に示す。図示のように、 この容器 3 0 5は、 大容器 3 5 1の中に、 小容器 3 5 2が配置された構 成となっている。 大容器 3 5 1は、 円柱状であり、 その上部は、 蓋体で 蓋がされている。 前記小容器 3 5 2は、 逆円錐台形状本体部 （大容積部） と、 この本体部分の上部と連結する円筒部 （小容積部） とからなり、 前 記円筒部の先端は開口している。 大容器 3 5 1の内壁と小容器 3 5 2の 外壁との間の空間が、 リザーバー溶液 3 54を入れる第 2の部屋である。 また、 小容器 5 1の内部若しくはその円筒部先端口付近が、 高分子溶液 3 5 5を入れる若しくは保持する第 1の部屋となる。 この容器 3 0 5の 大きさは、 特に制限されない。 前記大容器 3 5 1の大きさは、 例えば、 内径 3〜3 0mmで深さ 5〜1 0 0mmであり、 好ましくは、 内径 5〜 2 5 mmで深さ 1 0〜 5 0mmであり、 より好ましくは、 内径 1 0〜 2 0 mmで深さ 1 0〜30 mmである。小容器 3 5 2の大きさは、例えば、 逆円錐台形状本体部 （大容積部） において、 最大内径 3〜3 0mm、 最 小内径 0. 3〜5mm、 高さ 4〜90mm、 前記円筒部 （小容積部） に おいて、 内径 0. 3〜5mm、 高さ 0. 1〜 5 mmであり、 好ましくは、 逆円錐台形状本体部 （大容積部） において、 最大内径 5〜2 5mm、 最 小内径 0. 5〜3mm、 高さ 9〜45mm、 円筒部 （小容積部） におい て、 内径 0 . 5〜3 mm、 高さ 0 . 1〜 3 mmであり、 より好ましくは、 逆円錐台形状本体部 （大容積部） において、 最大内径 1 0〜2 0 mm、 最小内径 1〜 2 mm、 高さ 9〜 2 5 mm、 円筒部（小容積部） において、 内径 l〜2 mm、 高さ 0 . l〜 2 mmである。 また、 容器 3 0 5の材質 は、 特に制限されず、 例えば、 樹脂、 ガラス等が使用できる。 この容器 において、 レーザー光を照射する場合は、 レーザー光が通過する部分は 透明若しくは半透明の部材で構成され、 そのような部材としては、 前述 のものがあげられる。 この容器 3 0 5は、 例えば、 つぎのようにして使 用する。 すなわち、 まず、 大容器 3 5 1 (第の部屋 3 5 3 ) にリザーバー溶液 3 5 4を入れ、 小容器 3 5 2は、 非混合性高比重液 3 5 6で満たす。 ま た、 小容器 3 5 2の底部には、 マグネット攪拌子 3 0 7を配置する。 そ して、 小容器 3 5 2の円筒部先端に、 高分子溶液 3 5 5の液滴を配置す る。この状態で、容器 3 0 5をマグネットスターラー 3 0 6の上に置き、 前記攪拌子 3 0 7を回転させる。 このようにすれば、 リザーバ一溶液 3 5 4の作用により、高分子溶液 3 5 5からは水蒸気の発生が促進される。 また、攪拌子 3 0 7の回転により、非混合性高比重液 3 5 6が攪拌され、 その振動が高分子溶液 3 5 5にも伝わり、 間接的に高分子溶液 3 5 5も 攪拌され、 その結果、 結晶核の生成が促進される。 そして、 高分子溶液 の結晶核が生成したら、 そのまま育成を続け、 目的とする結晶を得ても よいし、 結晶核が生成しない場合は、 その条件は、 結晶化条件に不適と 判断し、 次の条件で結晶化を試みればよい。 さらに、 過飽和状態になつ たら、 高分子溶液 3 5 5に、 レーザー光を照射してもよい。 また、 この 実施例の容器を、 1つのプレート内に複数形成してもよい。その条件は、 例えば、 実施例 1 0のプレー卜と同様である。 P T/JP2003/010681
産業上の利用可能性
以上のように、 本発明の方法は、 タンパク質等の有機物の結晶の製造 若しくはスクリーニングに有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、 ピコ秒パルスレー ザ一およびフエムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレーザ —を照射することにより結晶核を生成させる結晶核の製造方法。
2. パルスレーザ一をレンズで溶液中に集光し、 その集光位置で単発 若しくは複数発の局所的な爆発現象を生じさせ、 これによつて結晶核を 生成する請求項 1記載の製造方法。
3. レ一ザ一照射が一回の場合、 パルスレーザーの光密度が、 5 X 1 05 (watt) 以上である請求項 1または 2記載の製造方法。
4. レーザー照射が一回の場合、 パルスレーザーのレーザー強度が、 60 n J /p u 1 s e以上である請求項 1から 3のいずれかに記載の製 造方法。
5. レーザー照射が 1秒間に 1 00 0 pulse以上場合、パルスレーザ一 の光密度が、 1 X 1 04 (watt) 以上である請求項 1または 2記載の製 造方法。
6. レーザー照射が 1秒間に 1 000 pulse以上、パルスレーザ一のレ 一ザ一強度が、 1. 9 5 n J /p u 1 s e以上である請求項 1、 2また は 5に記載の製造方法。
7. パルスレーザーが、 フェムト秒パルスレ一ザ一である請求項 1か ら 6のいずれかに記載の製造方法。
8 . パルスレーザ一の照射回数が、 単発から 1 0 0 0万発である請求 項 1から 7のいずれかに記載の製造方法。
9 . 前記溶液が、 過飽和溶液である請求項 1から 8のいずれかに記載 の製造方法。
1 0 . 請求項 1から 9のいずれかに記載の方法により溶液中に結晶核 を生成させ、 これを基に結晶を成長させる結晶の製造方法。
1 1 . 結晶化対象の溶質が、 有機物である請求項 1 0記載の製造方法
1 2 . 結晶化対象の溶質が、 タンパク質である請求項 1 0記載の製造 方法。
1 3 . 請求項 1から 9のいずれかに記載の方法を実施するための結晶 核製造装置であって、 パルスレーザー照射手段を有する装置。
1 4 . 結晶化対象の溶質が溶解している溶液に対し、 ピコ秒パルスレ —ザ一およびフエムト秒パルスレーザーの少なくとも一方のパルスレー ザ一を照射する工程と、 前記レーザー照射により結晶核が生成するか否 かを判定する工程および前記レーザー照射により溶質が変化しているか 否かを判定する工程の少なくとも一方とを含む結晶化条件のスクリー二 ング方法。
1 5. パルスレーザーをレンズで溶液中に集光し、 その集光位置で単 発若しくは複数発の局所的な爆発現象を生じさせ、 これによつて結晶核 を生成若しくは溶質の変性を誘起する請求項 14記載のスクリーニング 方法。
1 6. レーザ一照射が一回の場合、 パルスレーザーの光密度が、 5 X 1 05 (watt) 以上である請求項 14または 1 5記載のスクリーニング 方法。
1 7. レーザー照射が一回の場合、 パルスレーザーのレーザー強度が 、 60 n J/p u l s e以上である請求項 14から 1 6のいずれかに記 載のスクリーニング方法。
1 8. レーザ一照射が 1秒間に 1 0 0 0 pulse以上場合、パルスレーザ —の光密度が、 1 X 1 04 (watt) 以上である請求項 14または 1 5記 載のスクリーニング方法。
1 9. レーザ一照射が 1秒間に 1 0 0 0 pulse以上、パルスレ一ザ一の レーザー強度が、 1. 9 5 n J Zp u 1 s e以上である請求項 14、 1 5または 1 8に記載のスクリーニング方法。
20. パルスレーザーが、 フェムト秒パルスレーザーである請求項 1 4から 1 9のいずれかに記載のスクリーニング方法。
2 1. パルスレーザーの照射回数が、 単発から 1 00 0万発である請 求項 1 4から 2 0のいずれかに記載のスクリーニング方法。
2 2 . 前記溶液が、 過飽和溶液である請求項 1 4から 2 1のいずれか に記載のスクリーニング方法。
2 3 . 結晶化対象の溶質が、 有機物である請求項 1 4から 2 2のいず れかに記載のスクリーニング方法。
2 4 . 結晶化対象の溶質が、 タンパク質である請求項 1 4から 2 2の いずれかに記載のスクリーニング方法。
2 5 . 請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方法を 実施するためのスクリーニング装置であって、 パルスレーザ一照射手段 を有する装置。
2 6 . 前記溶液を入れた容器を運動させることにより前記溶液を攪拌 しながら結晶を生成させ、 育成する請求項 1 0記載の製造方法。
2 7 . 前記運動が、 回転、 振動および揺動のいずれかの運動若しくは これらを 2種類以上組み合わせた運動である請求項 2 6記載の製造方法
2 8 . 前記容器が、 複数のゥエルを有するゥエルプレートであり、 前 記各ゥエルに前記溶液が入っている請求項 2 6または 2 7記載の製造方 法。
2 9 . 前記溶液中の溶媒を蒸発させる、 または温度変化させることな どにより過飽和状態にする請求項 2 6から 2 8のいずれかに記載の製造 方法。
3 0 . 前記容器に、 前記溶液よりも比重が重い液を入れ、 前記比重が 重い液と前記溶液との界面で結晶を成長させる請求項 2 6から 2 9のい ずれかに記載の製造方法。
3 1 . 前記溶液の溶質以外の成分が前記溶液より高濃度で溶解したリ ザ一バー溶液を入れた別の容器を準備し、 この容器と前記溶質を入れた 容器とにおいて、 水蒸気が移動可能な状態で、 前記溶質の結晶を発生 · 成長させる請求項 2 6から 3 0のいずれかに記載の製造方法。
3 2 . 前記溶液の溶質が、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および核酸 からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 2 6から 3 1の いずれかに記載の製造方法。
3 3 . 請求項 1から 1 2のいずれかに記載の製造方法に使用する容器 若しくは請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方法に 使用する容器であって、 結晶化対象物質の溶液を入れる第 1の部屋と、 前記結晶化対象物質の溶液における前記結晶化対象物質以外の成分のみ が前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザ一バー溶液 を入れる第 2の部屋と、前記第 1の部屋および前記第 2の部屋と連通し、 気体が通過可能な通路とを有し、前記第 1の部屋の一部若しくは全部が、 前記結晶化対象物質の溶液にレーザ一光線を照射可能なように透明若し くは半透明である容器。
3 4 . 前記結晶化対象物質が、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および 核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 3 3記載の 容器。
3 5 . 請求項 1から 1 2のいずれかに記載の製造方法に使用するプレ ート若しくは請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方 法に使用するプレー卜であって、 請求項 3 3記載の容器が、 複数形成さ れたプレート。
3 6 . 前記結晶化対象物質が、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および 核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 3 5記載の プレ一卜。
3 7 . 請求項 1から 1 2のいずれかに記載の製造方法に使用する容器 若しくは請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方法に 使用する容器であって、 結晶化対象物質の溶液を入れる第 1の部屋と、 前記結晶化対象物質の溶液における前記結晶化対象物質以外の成分のみ が前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解しているリザーバー溶液 を入れる第 2の部屋と、前記第 1の部屋および前記第 2の部屋と連通し、 気体が通過可能な通路とを有し、 前記第 1の部屋が複数あり、 これが複 数の前記通路により一つ以上の前記第 2の部屋と連通しており、 前記複 数の通路において、 それぞれ、 通路径若しくは通路長の少なくとも一つ が異なり、 前記第 1の部屋の一部若しくは全部が、 前記結晶化対象物質 の溶液にレーザー光線を照射可能なように透明若しくは半透明である容
3 8 . 結晶化対象物質が、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および核酸 からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 3 7記載の容器。
3 9 . 請求項 1から 1 2のいずれかに記載の製造方法に使用するプレ 一ト若しくは請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリ一ニング方 法に使用するプレートであって、 請求項 3 7記載の容器が、 複数形成さ れたプレー卜。
4 0 . 請求項 1から 1 2のいずれかに記載の製造方法に使用する容器 若しくは請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方法に 使用する容器であって、 結晶化対象物質の溶液およびこの溶液より比重 が重たくかつ前記結晶化対象物質の溶液と混合しない非混合性高比重液 を入れる第 1の部屋と、 前記結晶化対象物質の溶液における結晶化対象 物質以外の成分のみが前記結晶化対象物質の溶液より高濃度で溶解して いるリザーバー溶液を入れる第 2の部屋とを有し、 前記第 2の部屋の中 に前記第 1の部屋が形成され、 前記第 1の部屋において、 下部の大容積 部と、 これより容積が小さい上部の小容積部とを有し、 この上部先端は 開口して前記両部屋の間は気体が通過可能であり、 少なくとも前記第 1 の部屋の上部もしくは先端開口部に結晶化対象物質の溶液を保持し、 か つ前記結晶化対象物質の溶液にレーザー照射が可能なように、 容器の一 部若しくは全部が透明若しくは半透明である容器。 1 . 前記第 1の部屋において、 前記下部の大容積部の形状が逆円錐 台若しくは逆角錐状台であり、 前記上部の小容積部の形状が円筒若しく は角筒であり、 前記両者が連結している請求項 4 0記載の容器。
4 2 . 前記第 1の部屋において、 前記上部の小容積部の先端開口の上 に結晶化対象物質の溶液の液滴を形成し、 この状態で、 前記結晶化対象 物質の溶液の溶媒を蒸発させる請求項 4 1記載の容器。
4 3 . 前記結晶化対象物質が、 樹脂、 タンパク質、 糖類、 脂質および 核酸からなる群から選択される少なくとも一つである請求項 4 0から 4 2のいずれかに記載の容器。
4 4 . 請求項 1から 1 2のいずれかに記載の製造方法に使用するプレ 一ト若しくは請求項 1 4から 2 4のいずれかに記載のスクリーニング方 法に使用するプレートであって、 請求項 4 0記載の容器が、 複数形成さ れたプレート。
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