WO2015030038A1 - タンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法 - Google Patents

タンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法 Download PDF

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陽子 山西
新井　史人
宏樹 栗木
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Definitions

  • a bubble ejection member used in a protein crystal device A core formed of a conductive material; An outer portion formed of an insulating material, including an extended portion extending from a tip of the core material, and covering at least a part of the core material and covering the core material; and A gap formed between the extending portion and the tip of the core material and having a bubble outlet, A bubble ejection member comprising: (2) The bubble ejection member according to (1), wherein the extending portion of the outer portion is tapered.
  • the combination of the insulating material 2 and the core material 3 includes glass and copper, glass and platinum, glass and aluminum, glass and gold, glass and silver, glass and nickel, epoxy Resin and copper, epoxy resin and platinum, epoxy resin and aluminum, epoxy resin and gold, epoxy resin and silver, epoxy resin and nickel, acrylic resin and copper, acrylic resin and platinum, acrylic resin and aluminum, acrylic resin and gold, acrylic Resin and silver, acrylic resin and nickel, silicon resin and copper, silicon resin and Rachina, silicone resin and aluminum, silicon resin and gold, silicone resin and silver, silicon resin, and nickel, and the like.
  • the core material 3 of the present invention is formed in a solid state in which the conductive material is stretched, and no pipe or the like for supplying air is formed inside the core material 3. .
  • the outer shell 6 is in close contact with the core material 3 in the vicinity of the tip of the bubble ejection member 1.
  • L / D is preferably at least 1 or more.
  • the upper limit of L / D is not particularly limited as long as the bubbles can be continuously ejected, but the tip of the bubble ejection member is very thin and easily damaged.
  • L / D is preferably 1 to 4, more preferably 1 to 3, still more preferably 1 to 2, and particularly preferably 1 to 2.
  • L / D can be adjusted by changing the temperature at which the material is heated and the speed at which the material is pulled in consideration of the relationship between the temperature and the viscosity of the insulating material and the conductive material used for manufacturing.
  • the diameter of the core material 3 after the pulling is 1 ⁇ m to 100 ⁇ m
  • the insulating material 2 is the core material, although it depends on the temperature and the speed at which it is heated. 3 should just be formed so that the circumference
  • the size of the core material 3 and the insulating material 2 used for the production of the bubble ejection member 1 depends on the heating temperature and the pulling speed, but the diameter of the core material 3 is 1 ⁇ m to 1000 ⁇ m.
  • a material having an outer diameter of 2 to 1 mm to 50 mm and an inner diameter of 0.5 mm to 40 mm may be used.
  • the protein solution 13 is injected into a container 12 such as a well plate generally used in the biochemical field, What is necessary is just to immerse at least the bubble ejection port 8 of the bubble ejection member 1 in the protein solution 13 and arrange the counter electrode 11 in contact with the protein solution 13 and output electricity to the core material 3 and the counter electrode 11.
  • the solution for dissolving the protein is not particularly limited as long as it can conduct electricity and the protein is not denatured, and a known protein dissolving solution such as a solution in which sodium acetate is dissolved in water may be used. Moreover, you may add the precipitating agent for accelerating precipitation of the protein which melt
  • a known precipitating agent such as a water-soluble polymer, a crystallization agent, a buffer solution or the like can be used.
  • the water-soluble polymer include PEG and glycerol.
  • the crystallization agent include metal salts such as sodium chloride and ammonium salts such as ammonium sulfate.
  • the outer shell portion 32 may be produced by cutting a glass tube or a plastic tube as described above and directly fitted into the washer 31, or as shown in FIG. A guide 35 made from plastic or the like (for example, Eppendorf tube (ibis (R) pipette tip), IN12403Y) is adhered with an adhesive or the like to produce the outer shell 32, and the guide 35 portion is attached to the washer 31. You may fit. Further, the outer shell portion 32 may be provided so as to be multilayered so that different types of protein solutions can be introduced between the respective layers. Although not shown, the counter electrode 11 may be arranged on the outer surface of the outer shell 6 or the inner surface of the outer shell 32 in FIG. The material forming the outer shell portion 32 may be the same material as that of the outer shell portion 6.
  • the protein adsorption bubbles are ejected into a solution containing a buffer solution or a precipitant. Also good.
  • the concentration of the protein solution 13 introduced into the space 36 is low and the amount of protein adsorbed in the bubbles is small, the protein adsorbing bubbles may be ejected into the protein solution, and the concentration of the protein solution 13 introduced into the space 36 is increased. Accordingly, the solution to be injected into the container 12 may be appropriately adjusted.
  • the protein crystal device of the present invention can be used as a protein crystal cutting device with the same configuration.
  • electricity can be passed and the protein crystals are placed in a solution in which the protein is not denatured, for example, the above-described protein dissolving solution or buffer solution.
  • electricity is output and the core material 3 and the counter electrode 11 are energized, several hundred to several thousand bubbles / second of bubbles can be continuously ejected from the bubble ejection port 8 at a high speed.
  • the protein crystal can be cut by applying it to the protein crystal.
  • the electrical output of the protein crystal cutting device may be the same as the electrical output of the protein crystal device including the bubble ejection member 1.
  • Example 8 Instead of the protein crystal device 10 produced in Example 3, the protein crystal device 10 produced in Example 6 was used, and before outputting electricity, from the opposite side of the protein adsorption bubble ejection port 37 of the protein adsorption bubble ejection member 30.
  • the protein crystals were prepared using the same electrical output and procedure as in Example 7 except that the protein solution 13 was introduced into the space 36 using a peristaltic pump (Aquatech Ring Pump (RP-Q1.5S-P01A)). Growth was observed.
  • FIG. 8 (2) is a photograph of the protein solution 13 after 20 hours. As is apparent from the photograph, it was confirmed that more lysozyme crystals were produced as compared with Example 7.
  • FIG. 9 (1) is a photograph before the bubbles are applied to the lysozyme crystal
  • FIG. 9 (2) is a photograph after the bubbles are applied to the lysozyme crystal. As is clear from FIGS. 9 (1) and (2), it was confirmed that the protein crystal could be cut by applying bubbles to the protein crystal.
  • an 80 mg / ml NADH-GOGAT solution (produced by cloning the gene of cyanobacterium Leptolyngya boreana.
  • the production procedure was as follows: Okuhara, H., Matsumura, T., Fujita, Y. & Hase, T., 99. (See Plant Physiol. 120, 33-42.) 1 ⁇ l and 1 ⁇ l of the protein dissolving solution were mixed to prepare 2 ⁇ l of protein solution 13.
  • the final concentration of PEG6000 in the protein solution was 10 w / v%.
  • the protein solution 13 was placed in a well, and bubbles were ejected into the protein solution 13 using the protein crystal apparatus 10 produced in Example 3 with the same electrical output and procedure as in Example 4.
  • Example 11 The final concentration of PEG6000 in the protein solution is 8 w / v% by setting the concentration of PEG6000 in the protein dissolving solution to 16 w / v% and the concentration of glycerol to 10.5 v / v%, and the concentration of PEG6000 in the reservoir solution is Crystal growth was carried out by the same procedure as in Example 10 except that 8 w / v% and the glycerol concentration was 5.25 v / v%.
  • FIG. 10 (2) is a photograph of the protein solution 13 after two weeks.

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Abstract

　タンパク質溶液に熱影響を与えることなくタンパク質結晶を生成できるタンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、タンパク質結晶に熱影響を与えることなくタンパク質結晶を切削できるタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法、並びに前記装置に用いることができる気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材を提供する。　導電材料で形成された芯材と、絶縁材料で形成され、前記芯材の先端より延伸した延伸部を含み、且つ前記芯材に少なくとも一部が密着して芯材を覆う外郭部、及び、前記延伸部及び前記芯材の先端との間に形成され且つ気泡噴出口を有する空隙を含むことを特徴とする気泡噴出部材をタンパク質結晶装置に用い、タンパク質溶液に気泡を噴出することで、タンパク質の結晶が得られる。

Description

タンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法
　本発明は、タンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法に関するもので、特に、気泡噴出部材の気泡噴出口から気泡を噴出、又はタンパク質吸着気泡噴出部材のタンパク質吸着気泡噴出口から界面にタンパク質が吸着した気液を噴出することで、タンパク質結晶を容易に生成することができるタンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、前記気泡噴出部材又はタンパク質吸着気泡噴出部材を含むタンパク質結晶装置、及び該タンパク質結晶装置を用いたタンパク質結晶化方法に関するものである。更に、本発明は、タンパク質結晶をＸ線構造解析等に用いるために、角状のタンパク質結晶の角を切削する等、タンパク質結晶を切削して成形するためのタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法に関するものである。
　タンパク質の構造や機能を知るためには、タンパク質の構造解析が不可欠である。タンパク質の構造解析の最も一般的な手法はＸ線構造解析法であるが、このＸ線構造解析法によりタンパク質の三次元結晶構造を解析するためには、タンパク質の良質な単結晶を得る必要がある。
　タンパク質のＸ線構造解析用の結晶を生成する方法としては、従来より蒸気拡散法、沈殿法等が知られている。しかしながら、蒸気拡散法では、タンパク質の結晶化に数週間程度必要であり、時間がかかるという問題がある。また、沈殿法ではタンパク質の結晶化に必要な時間は１週間程度であるが、沈殿剤を用いるため、沈殿剤が不純物となりタンパク質の結晶の純度が低下するという問題がある。
　上記問題を解決するため、非晶質タンパク質を含むタンパク質と前記タンパク質の飽和溶解度に対応する量より少ない量の溶媒とを混在させる溶媒混在工程と、前記タンパク質を静置する静置工程と、静置後の前記タンパク質に撹拌、超音波、電磁波等の刺激を与える刺激付与工程とを含む方法により、沈殿剤を不要とする方法が知られている（特許文献１参照）。しかしながら、下記特許文献１に記載の方法においては、タンパク質を静置する工程が必要であり、依然として結晶化に時間を要するという問題がある。
　タンパク質を溶解した溶液（以下、「タンパク質溶液」と記載することがある。）に刺激を与えることでタンパク質を結晶化する方法としては、タンパク質溶液にピコ秒パルスレーザー又はフェムト秒パルスレーザーを照射する方法も知られている（特許文献２参照）。しかしながら、上記レーザーを照射するための装置は大きく且つ高価で、また、レーザーをタンパク質溶液に照射するためには光学系機器が必要であり、焦点を合わす等、操作が煩雑であるという問題がある。また、下記特許文献２に記載されている方法では、パルスレーザーを集光した時に、焦点で急激な光吸収による爆発現象（レーザーアブレーション）が起き、焦点付近の溶液が瞬間的に蒸発し、溶液の濃縮が起こるため結晶核が生成すると考えられているが、焦点では急激な熱上昇が起こり、タンパク質が変性する恐れがある。
　また、Ｘ線構造解析法によりタンパク質の三次元結晶構造を解析するためには、得られたタンパク質結晶の角を落とす等の加工成形を行うことが好ましく、タンパク質結晶をフェムト秒レーザーで切削することが知られている（非特許文献１参照）。しかしながら、フェムト秒レーザーを用いたタンパク質結晶の切削は、高密度エネルギーが局所的にあたることから、タンパク質結晶の切削面タンパク質が変性する恐れがある。
特開２００４－２７７２５５号公報 国際公開第２００４／０１８７４４号
Ｍａｓａｆｕｍｉ　ＫＡＳＨＩＩ　ｅｔ．ａｌ．，　"Ｆｅｍｔｏｓｅｃｏｎｄ　Ｌａｓｅｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｓ　ｉｎ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｄｒｏｐ"，　Ｊａｐａｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｐｈｙｓｉｃｓ，　Ｖｏｌ．４４，　Ｎｏ．２７，　２００５，　ｐｐ．　Ｌ８７３－Ｌ８７５
　本発明は、上記問題点を解決するためになされた発明であり、鋭意研究を行ったところ、導電材料で形成された芯材と、絶縁材料で形成され、前記芯材の先端より延伸した延伸部を含み、且つ前記芯材に少なくとも一部が密着して芯材を覆う外郭部、及び前記延伸部及び前記芯材の先端との間に形成され且つ気泡噴出口を有する空隙を含む気泡噴出部材の気泡噴出口をタンパク質溶液に浸漬し、気泡噴出部材の芯材及び対向電極に電気を出力して気泡噴出口からタンパク質溶液中に気泡を噴出することで、タンパク質溶液に熱影響を与えることなく、タンパク質結晶を生成できることを新たに見出した。
　また、上記気泡噴出部材１の外周に、前記外郭部の中心軸と同心軸を有し、前記外郭部との間に空間を有するように前記外郭部から離間した位置に形成し且つタンパク質吸着気泡噴出口を有する外側外郭部を配置したタンパク質吸着気泡噴出部材を作製し、前記タンパク質吸着気泡噴出部材の芯材及び対向電極に電気を出力してタンパク質吸着気泡噴出口からタンパク質が吸着した気泡を噴出することで、タンパク質溶液に熱影響を与えることなく、タンパク質結晶を生成できることを新たに見出した。
　また、本発明は、気泡噴出部材からの気泡をタンパク質結晶に連続的に当てることで、タンパク質結晶を切削できることを新たに見出した。本発明は、これら新たに見出された知見に基づいてなされたものである。
　すなわち、本発明の目的は、タンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法を提供することにある。
　本発明は、以下に示す、タンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法に関する。
（１）タンパク質結晶装置に用いられる気泡噴出部材であって、
　導電材料で形成された芯材と、
　絶縁材料で形成され、前記芯材の先端より延伸した延伸部を含み、且つ前記芯材に少なくとも一部が密着して芯材を覆う外郭部、及び、
　前記延伸部及び前記芯材の先端との間に形成され且つ気泡噴出口を有する空隙、
を含むことを特徴とする気泡噴出部材。
（２）前記外郭部の延伸部がテーパー状であることを特徴とする上記（１）に記載の気泡噴出部材。
（３）タンパク質結晶装置に用いられるタンパク質吸着気泡噴出部材であって、
　上記（１）又は（２）に記載の気泡噴出部材の外郭部の外側に、
　前記外郭部の中心軸と同心軸を有し、前記外郭部との間に空間を有するように前記外郭部から離間した位置に形成し、タンパク質吸着気泡噴出口を有する外側外郭部、
を含むことを特徴とするタンパク質吸着気泡噴出部材。
（４）前記延伸部の外側に形成された前記外側外郭部の部分が、テーパー状であることを特徴とする上記（３）に記載のタンパク質吸着気泡噴出部材。
（５）前記外郭部と前記外側外郭部との間の空間及び／又は前記気泡噴出部材の先端と前記外側外郭部で形成される空間に、タンパク質溶液を含むことができることを特徴とする上記（３）又は（４）に記載のタンパク質吸着気泡噴出部材。
（６）上記（１）又は（２）に記載の気泡噴出部材、対向電極及び電気出力手段を含むことを特徴とするタンパク質結晶装置。
（７）上記（３）～（５）の何れか一に記載のタンパク質吸着気泡噴出部材、対向電極及び電気出力手段を含むことを特徴とするタンパク質結晶装置。
（８）上記（６）に記載のタンパク質結晶装置の気泡噴出部材の少なくとも気泡噴出口をタンパク質溶液に浸漬し、且つ前記タンパク質溶液に対向電極が接触できるようにする工程、
　前記気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記気泡噴出口からタンパク質溶液中に気泡を噴出させる工程、
を含むことを特徴とするタンパク質結晶化方法。
（９）上記（７）に記載のタンパク質結晶装置のタンパク質吸着気泡噴出部材の外郭部と外側外郭部との間の空間及び／又は気泡噴出部材の先端と前記外側外郭部で形成される空間に、タンパク質溶液を導入する工程、
　タンパク質吸着気泡噴出部材の少なくともタンパク質吸着気泡噴出口をタンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を含む溶液に浸漬し、タンパク質吸着気泡噴出部材の芯材と対向電極とが通電できる状態にする工程、
　前記タンパク質吸着気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記タンパク質吸着気泡噴出口から界面にタンパク質及び／又はタンパク質溶液が吸着した気泡を、前記タンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を含む溶液中に噴出させる工程、
を含むことを特徴とするタンパク質結晶化方法。
（１０）前記タンパク質溶液が、送液ポンプにより前記空間に導入される、又は、タンパク質溶液にタンパク質吸着気泡噴出口を浸漬させ毛細管現象により導入される、ことを特徴とする上記（９）に記載のタンパク質結晶化方法。
（１１）導電材料で形成された芯材と、絶縁材料で形成され、前記芯材の先端より延伸した延伸部を含み、且つ前記芯材に少なくとも一部が密着して芯材を覆う外郭部、及び、前記延伸部及び前記芯材の先端との間に形成され且つ気泡噴出口を有する空隙、を含む気泡噴出部材、
　対向電極、及び
　電気出力手段
を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削装置。
（１２）前記外郭部の延伸部がテーパー状であることを特徴とする上記（１１）に記載のタンパク質結晶切削装置。
（１３）上記（１１）又は（１２）に記載の気泡噴出部材の外郭部の外側に、前記外郭部の中心軸と同心軸を有し、前記外郭部との間に空間を有するように前記外郭部から離間した位置に形成し、界面に溶液が吸着した気泡を噴出する噴出口を有する外側外郭部、を含む界面に溶液が吸着した気泡を噴出する部材、
　対向電極、及び
　電気出力手段
を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削装置。
（１４）前記延伸部の外側に形成された前記外側外郭部の部分が、テーパー状であることを特徴とする上記（１３）に記載のタンパク質結晶切削装置。
（１５）上記（１１）又は（１２）に記載のタンパク質結晶切削装置の気泡噴出部材の少なくとも気泡噴出口を、タンパク質結晶を含む溶液に浸漬し且つ噴出した気泡がタンパク質結晶の切削面に当たる位置に配置するとともに、前記タンパク質結晶を含む溶液に対向電極が接触できるようにする工程、
　前記気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記気泡噴出口から噴出した気泡をタンパク質結晶の切削面に当てる工程、
を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削方法。
（１６）上記（１３）又は（１４）に記載のタンパク質結晶切削装置の界面に溶液が吸着した気泡を噴出する部材の、外郭部と外側外郭部との間の空間及び／又は気泡噴出部材の先端と前記外側外郭部で形成される空間に、電気を通すことができる溶液を導入する工程、
　界面に溶液が吸着した気泡を噴出する噴出口を、タンパク質結晶を含む溶液に浸漬し且つ噴出した界面に溶液が吸着した気泡がタンパク質結晶の切削面に当たる位置に配置するとともに、前記タンパク質結晶を含む溶液に対向電極が接触できるようにする工程、
　前記気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記噴出口から噴出した界面に溶液が吸着した気泡をタンパク質結晶の切削面に当てる工程、
を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削方法。
　本発明では、タンパク質結晶装置の気泡噴出部材の気泡噴出口から気泡を噴出、又はタンパク質吸着気泡噴出部材のタンパク質吸着気泡噴出口からタンパク質が界面に吸着した気泡を噴出することで、タンパク質結晶を生成することができる。したがって、装置を小型化することができ、且つ、簡単な操作でタンパク質結晶を生成することができる。
　また、気泡を用いてタンパク質結晶を生成することから、タンパク質が熱変性する恐れが無い。
　本発明のタンパク質結晶装置は、汎用の医療用電気メスに気泡噴出部材又はタンパク質吸着気泡噴出部材を取り付けることで作製できる。したがって、既存の装置と組み合わせることで、簡単にタンパク質結晶装置を作製することができ、安価に提供できる。
　本発明のタンパク質切削装置及びタンパク質結晶切削方法は、気泡を用いてタンパク質結晶を切削することから、タンパク質を熱変性することなくＸ線構造解析用に成形することができる。
　更に、本発明のタンパク質結晶装置は、タンパク質結晶切削装置としても用いることができるので、単一の装置を用いて、タンパク質結晶生成とＸ線構造解析用にタンパク質を成形することができる。
図１（ａ）は、本発明のタンパク質結晶装置に用いられる気泡噴出部材の製造方法を示す図である。図１（ｂ）は図面代用写真で、実施例１で作製した気泡噴出部材の拡大写真、図１（ｃ）は図面代用写真で、図１（ｂ）を更に拡大した写真である。 図２は、本発明の気泡噴出部材１を含むタンパク質結晶装置１０を用いたタンパク質結晶化方法を説明する図で、図２（１）は容器１２と対向電極１１を別体として設けた例、図２（２）は容器１２に対向電極１１を貼り付けた例を示している。 図３は、タンパク質結晶装置１０の全体構成を示す図である。 図４（ａ）～（ｄ）は、本発明のタンパク質結晶装置に用いられるタンパク質吸着気泡噴出部材の製造方法を示す図である。図４（ｅ）は、図面代用写真で、実施例２で作製したタンパク質吸着気泡噴出部材の拡大写真である。 図５は、図面代用写真で、実施例４において、タンパク質結晶装置１０の気泡噴出部材１の先端部分及び対向電極１１をタンパク質溶液１３に挿入した状態を示す写真である。 図６（１）は、図面代用写真で、実施例４で生成したタンパク質溶液中のリゾチーム結晶を示す写真である。図６（２）は、図面代用写真で、比較例１のタンパク質溶液を示す写真である。 図７（１）は、図面代用写真で、実施例５で生成したタンパク質溶液中のチトクロームＣ結晶を示す写真で、図７（２）は図面代用写真で、図７（１）を更に拡大した写真である。図７（３）は、図面代用写真で、比較例２のタンパク質溶液を示す写真である。 図８（１）は、図面代用写真で、実施例７で生成したタンパク質溶液中のリゾチーム結晶を示す写真である。図８（２）は、図面代用写真で、実施例８で生成したタンパク質溶液中のリゾチーム結晶を示す写真である。図８（３）は、図面代用写真で、比較例３のタンパク質溶液を示す写真である。 図９（１）は、図面代用写真で、実施例９において、溶液中のリゾチーム結晶に気泡を当てる前の写真、図９（２）は、図面代用写真で、リゾチーム結晶に気泡を当てた後の写真である。 図１０（１）は、図面代用写真で、実施例１０で生成したタンパク質溶液中のＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ結晶を示す写真である。図１０（２）は、図面代用写真で、実施例１１で生成したタンパク質溶液中のＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ結晶を示す写真である。図１０（３）は、図面代用写真で、実施例１２で生成したタンパク質溶液中のＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ結晶を示す写真である。
　以下に、本発明のタンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材、タンパク質結晶装置及びタンパク質結晶化方法、並びにタンパク質結晶切削装置及びタンパク質結晶切削方法について図面を参照しながら詳しく説明する。各図の説明において、同一の符号は同じ物を示す。
　図１（ａ）は本発明の気泡噴出部材１の作製方法の一例を示す図である。図１（ａ）に示す作製方法では、（１）中空の絶縁材料２を準備し、（２）前記中空の絶縁材料２に導電材料で形成された芯材３を挿入し、（３）熱４をかけて引き切ると、（４）気泡噴出部材１を作製することができる。本製造方法では、絶縁材料２と芯材３の粘弾性の差により、図１（ｂ）に示すように、芯材３の先端から絶縁材料２が更に延伸した延伸部５を含む外郭部６が芯材３の外周に密着するように形成され、前記延伸部５と前記芯材３の先端部分とで形成され且つ気泡噴出口８を有した空隙７を含む気泡噴出部材１を作製することができる。上記の方法により気泡噴出部材１を作製すると、芯材３は先鋭形状になる。また、外郭部の延伸部５がテーパー状になり、噴出された気泡が指向性を持つことから好ましい。
　絶縁材料２としては、電気を絶縁するものであれば特に限定はなく、例えば、ガラス、マイカ、石英、窒化ケイ素、酸化ケイ素、セラミック、アルミナ、等の無機系絶縁材料、シリコーンゴム、エチレンプロピレンゴム等ゴム材料、エチレン酢酸ビニル共重合体樹脂、シラン変性オレフィン樹脂、エポキシ樹脂、ポリエステル樹脂、塩化ビニル系樹脂、アクリル樹脂、メラミン樹脂、フェノール樹脂、ポリウレタン樹脂、ポリスチレン系樹脂、弗素系樹脂、シリコン系樹脂、ポリサルファイド系樹脂、ポリアミド樹脂、ポリイミド樹脂、ポリエチレン、ポリプロピレン、セルロース系樹脂、ＵＶ硬化樹脂等の絶縁性樹脂が挙げられる。
　芯材３を形成する導電材料としては、電気を通す電極として使用できるものであれば特に制限はないが、好ましくは金属で、例えば、金、銀、銅、アルミニウム等、これらにスズ、マグネシウム、クロム、ニッケル、ジルコニウム、鉄、ケイ素などを少量加えた合金等が挙げられる。上記のとおり、空隙７は、芯材３の先端及び該先端から絶縁材料２が更に延伸した延伸部５とで形成されることから、絶縁材料２の粘弾性が芯材３の粘弾性より大きくなるように適宜材料を組み合わせればよく、例えば、絶縁材料２及び芯材３の組み合わせとしては、ガラス及び銅、ガラス及びプラチナ、ガラス及びアルミニウム、ガラス及び金、ガラス及び銀、ガラス及びニッケル、エポキシ樹脂及び銅、エポキシ樹脂及びプラチナ、エポキシ樹脂及びアルミニウム、エポキシ樹脂及び金、エポキシ樹脂及び銀、エポキシ樹脂及びニッケル、アクリル樹脂及び銅、アクリル樹脂及びプラチナ、アクリル樹脂及びアルミニウム、アクリル樹脂及び金、アクリル樹脂及び銀、アクリル樹脂及びニッケル、シリコン樹脂及び銅、シリコン樹脂及びプラチナ、シリコン樹脂及びアルミニウム、シリコン樹脂及び金、シリコン樹脂及び銀、シリコン樹脂及びニッケル等が挙げられる。
　なお、気泡噴出部材１を用いて気泡を噴出する際には、電気を出力すると後述するように空隙７で一端形成された気泡が引き千切られるように気泡噴出口８から噴出されるので、気泡噴出部材１に外部から気体を供給する必要は無い。したがって、図１（ｂ）に示すように、本発明の芯材３は導電材料が延伸した中実な状態で形成され、芯材３の内部には空気を供給する管等は形成されていない。また、絶縁材料２と芯材３との粘弾性の差により、気泡噴出部材１の先端付近において、外郭部６の少なくとも一部は芯材３に密着するようになっている。
　図１（ｃ）は、図１（ｂ）を更に拡大した写真である。本発明の気泡噴出部材１と図示しない対向電極１１に電気を出力すると、気泡噴出口８から気泡が連続的に噴出するが、その際、空隙７において、気泡噴出口８の内径（以下、「直径Ｄ」又は「Ｄ」と記載することがある。）に近い大きさの気泡が生成され、気泡噴出口８から前記気泡が引き千切られるように噴出する。したがって、前記空隙７の深さ（芯材３の先端から気泡噴出口８までの長さ。以下、「Ｌ」と記載することがある。）は、少なくとも空隙７内で気泡が生成できる大きさである必要があり、Ｌ／Ｄは少なくとも１以上であることが好ましい。一方、Ｌ／Ｄの上限は、気泡が連続的に噴出できる大きさであれば特に制限はないが、気泡噴出部材の先端は非常に細く破損しやすいため、取扱いの利便性等を考えると、Ｌ／Ｄは、１～４が好ましく、１～３がより好ましく、１～２が更に好ましく、１～２が特に好ましい。Ｌ／Ｄは、製造に用いる絶縁材料及び導電性材料の温度と粘度の関係を考慮し、加熱する際の温度及び引き切るスピードを変化させることで調整することができる。
　噴出する気泡の大きさは、気泡噴出口８の直径Ｄを変えることで調整することができる。気泡噴出口８の直径Ｄは、タンパク質溶液中に気泡を噴出することでタンパク質結晶が得られる大きさであれば特に制限は無く、１μｍ～５０μｍが好ましく、５μｍ～１５μｍがより好ましい。１μｍより小さいとタンパク質の結晶核生成の可能性が減り、５０μｍより大きいとタンパク質溶液に大きな攪乱を与え、単結晶ではなく、針状結晶や多結晶になる恐れがあるので好ましくない。気泡噴出口８の直径Ｄは、加熱する際の温度及び引き切るスピードを変化させることで調整することができる。気泡噴出口８の大きさが上記の範囲となるには、加熱する際の温度及び引き切るスピードにもよるが、引き切った後の芯材３の直径が１μｍ～１００μｍで、絶縁材料２が芯材３の周囲を覆うように形成されていればよい。また、気泡噴出部材１の製造に使用される芯材３及び絶縁材料２の大きさは、加熱する際の温度及び引き切るスピードにもよるが、芯材３の直径が１μｍ～１０００μｍ、絶縁材料２の外径が１ｍｍ～５０ｍｍ、内径が０．５ｍｍ～４０ｍｍの材料を用いればよい。
　気泡噴出部材１の製造方法は、上記の例に限定されず、例えば、芯材３の先端にフォトレジスト、熱硬化性樹脂等の部材を設け、窒化ケイ素、酸化ケイ素等の絶縁材料をスパッタリングにより芯材３の周囲に設けた後、フォトレジスト、光硬化樹脂等を除去することで製造してもよい。また、芯材３の先端にテーパー状のフォトレジスト、熱硬化性樹脂等を設けることで、スパッタリング後の外郭部をテーパー状にすることができる。また、スパッタリングで気泡噴出部材１を製造する場合、上記のＬ／Ｄを調整するには、芯材３の先端に設ける延伸部５の長さを適宜調整すればよい。
　図２は、本発明の気泡噴出部材１を含むタンパク質結晶装置１０を用いたタンパク質結晶化方法を説明する図である。図２（１）はタンパク質結晶装置１０の一例を示す図で、気泡噴出部材１、対向電極１１、気泡噴出部材１の導電性材料で形成された芯材３及び対向電極１１に電気を出力する図示しない電気出力手段を含んでいる。図２（１）に示すタンパク質結晶装置１０を用いてタンパク質溶液からタンパク質結晶を生成する場合は、生化学分野で一般的に使用されているウェルプレート等の容器１２にタンパク質溶液１３を注入し、該タンパク質溶液１３に気泡噴出部材１の少なくとも気泡噴出口８を浸漬し、且つ対向電極１１をタンパク質溶液１３に接触するように配置し、芯材３及び対向電極１１に電気を出力すればよい。
　本発明においては、気泡噴出口８から噴出した気泡の界面は電荷を帯びているため、タンパク質溶液１３中に噴出された気泡界面に電荷を帯びているタンパク質及び／又はタンパク質溶液が吸着し、そして、気泡が収縮すると気泡界面に吸着したタンパク質及び／又はタンパク質溶液（以下、「タンパク質及び／又はタンパク質溶液」を単に「タンパク質」と記載することもある。）が濃縮され、タンパク質が結晶化すると考えられる。なお、タンパク質のアミノ基とカルボキシル基は水素イオン濃度によって変化する。そのため、タンパク質の電荷（プラス又はマイナスチャージ）は、ｐＨを変化させることで調整できるので、タンパク質の種類に応じてタンパク質溶液のｐＨを適宜調整し、気泡に吸着できるように調整すればよい。
　図２（２）はタンパク質結晶装置１０の他の例を示す図で、気泡噴出部材１、対向電極１１を貼り付けたウェルプレート等の容器１２、芯材３及び対向電極１１に電気を出力する図示しない電気出力手段を含んでいる。なお、容器１２には、対向電極１１と電気出力手段とを接続する電気回路を設けてもよいし、使用時に対向電極１１と電気出力手段を電線等で接続してもよい。図２（２）に示すタンパク質結晶装置１０を用いてタンパク質溶液からタンパク質結晶を生成する場合は、タンパク質溶液１３を容器１２に注入し、該タンパク質溶液１３に気泡噴出部材１の少なくとも気泡噴出口８を浸漬し、芯材３及び対向電極１１に電気を出力すればよい。
　対向電極１１は、電気が通るものであれば特に制限は無く、芯材３と同様の導電材料で作製すればよい。また、図２（２）に示す例の場合は、作製した対向電極１１を接着剤・溶接等により容器１２に設けてもよいし、スパッタ等で容器に蒸着してもよい。また、電気回路を設ける場合は、電気回路を容器に貼り付けてもよいし、スパッタ等で対向電極１１と同時に容器１２面に蒸着してもよい。図２（１）及び図２（２）に示す何れのタンパク質結晶装置であっても、タンパク質溶液１３を入れた際に、対向電極１１がタンパク質溶液に接触するようにすればよい。また、図２に示す容器１２のウェルは一つであるが、一つの容器１２に複数のウェルを設けてもよい。
　図３は、タンパク質結晶装置１０の全体構成を示す図である。電気出力手段は、一般商用交流電源装置２０、並びに気泡噴出部材１の芯材３（アクティブ電極）と対向電極１１とで回路を形成するための電線２１、を少なくとも含み、必要に応じて、無誘導抵抗２２、電圧増幅回路２３、図示しないＤＩＯ（Ｄｉｇｉｔａｌ　Ｉｎｐｕｔ　Ｏｕｔｐｕｔ）ポート等を設けてもよい。電気出力手段は、従来の電気メス用電気回路に無誘導抵抗２２やＤＩＯポート等を組み込み、微小対象用の出力構成にセッティングすることで簡単に作成することができる。
　芯材３及び対向電極１１に出力する電気の電流、電圧及び周波数は、タンパク質結晶が生成でき且つ気泡噴出部材１を損傷しない範囲であれば特に制限は無いが、例えば、電流は、１０ｍＡ～８０ｍＡが好ましく、２５ｍＡ～７５ｍＡがより好ましい。電流が１０ｍＡより小さいと気泡をうまく生成できないことがあり、８０ｍＡより大きいと電極摩耗を生じることとなり好ましくない。電圧は、１００Ｖ～８００Ｖが好ましく、２００Ｖ～６００Ｖがより好ましい。電圧が１００Ｖより小さいと気泡生成が困難となり、８００Ｖより大きいと芯材３の摩耗や気泡噴出部材１が破損する恐れがあり好ましくない。周波数は、１ｋＨｚ～１ＧＨｚが好ましく、５ｋＨｚ～１ＭＨｚがより好ましく、１０ｋＨｚ～６０ｋＨｚが特に好ましい。周波数が１ｋＨｚより小さいと、タンパク質溶液に与える衝撃が大きく、また、気泡噴出部材１が破損する恐れがあり、１ＧＨｚより大きいと気泡が生成できなくなる恐れがあり好ましくない。
　タンパク質を溶解する溶液としては、電気を通すことができ、タンパク質が変性しなければ特に制限はなく、水に酢酸ナトリウムを溶解した溶液等、公知のタンパク質溶解用の溶液を用いればよい。また、結晶生成に影響を与えない範囲で、必要に応じて、溶液中に溶解しているタンパク質の析出を促進するための沈殿剤を加えてもよい。沈殿剤としては、水溶性高分子、結晶化剤、緩衝液等、公知の沈殿剤を用いることができる。水溶性高分子としては、ＰＥＧ、グリセロール等が挙げられる。結晶化剤としては、塩化ナトリウム等の金属塩、硫酸アンモニウム等のアンモニウム塩が挙げられる。緩衝液としては、酢酸、リン酸、トリス等が挙げられる。これらの沈殿剤は、単独で用いても組み合わせて用いてもよい。タンパク質の溶解濃度は、過飽和状態であっても、不飽和状態であってもよく、必要に応じて適宜調整すればよい。上記のとおり、本発明では、気泡の界面にタンパク質が吸着し、気泡が収縮する時に気泡界面に吸着したタンパク質が濃縮されてタンパク質が結晶化すると考えられるので、電荷を調整することで気泡界面に多くのタンパク質が吸着すればタンパク質の結晶が生成されやすくなる。したがって、タンパク質溶液は過飽和状態にすることが好ましいものの必須の条件ではなく、タンパク質溶液は不飽和状態であってもよい。
　本発明のタンパク質結晶装置１０を用いて、タンパク質溶液１３中に気泡を噴出することでタンパク質結晶を生成できるが、生成した結晶を成長させるために、タンパク質溶液より濃度の濃いリザーバー溶液を入れたタンパク質結晶成長装置に、生成した結晶を含む容器１２を入れて結晶成長させてもよい。リザーバー溶液を入れたタンパク質結晶成長装置は、ハンギングドロップ用装置、シッティングドロップ用装置等、公知のタンパク質結晶成長装置を用いればよい。
　図４（ａ）～（ｄ）は、本発明のタンパク質結晶装置用のタンパク質吸着気泡噴出部材３０の作製手順の概略を示す図である。なお、本発明において、「タンパク質吸着気泡」とは、界面にタンパク質及び／又はタンパク質溶液が吸着した気泡を意味する。本発明のタンパク質吸着気泡噴出部材３０は、図１（ａ）の（１）～（４）と同様の手順で気泡噴出部材１を製造した後（図４の（ａ）～（ｂ）に相当）、ポリマーフィルムやゴムワッシャ、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）を使用したソフトリソグラフィー・３次元光造形法等の方法により作製した同心軸位置決めワッシャ３１を気泡噴出部材１に嵌め、ガラス管、プラスチック管等を熱により引き切って作製し、且つ前記外郭部６の中心軸と同心軸を有し前記外郭部６より大きな直径を有する外側外郭部３２をワッシャ３１に外挿することで、図４（ｄ）外郭部６と外側外郭部３２の間に、タンパク質溶液１３を挿入することができる空間３６を有するタンパク質吸着気泡噴出部材３０を作製することができる。また、図示しないポンプにより、タンパク質溶液１３を送液できるようにするため、前記ワッシャ３１は孔３３を含むことが望ましい。また、外側外郭部３２は、前記のようにガラス管やプラスチック管を引き切って作製したものを直接ワッシャ３１に嵌めてもよいし、図４（ｃ）に示すように、引き切ったガラス３４等の周りにプラスチック等（例えば、エッペンドルフチューブ（アイビス（Ｒ）ピペットチップ）、ＩＮ１２４０３Ｙ）から作製したガイド３５を接着剤等で接着して外側外郭部３２を作製し、ガイド３５部分をワッシャ３１に嵌合してもよい。また、外側外郭部３２は、多層となるように設けて、各層間に異なる種類のタンパク質溶液を導入できるようにしてもよい。また、図示はしていないが、上記図４（ｃ）において、対向電極１１を外郭部６の外面又は外側外郭部３２の内面に配置してもよい。外側外郭部３２を形成する材料は、外郭部６と同じ材料であればよい。
　噴出するタンパク質吸着気泡の大きさは、気泡噴出口８の直径Ｄとタンパク質吸着気泡噴出口３７の内径を変えることで調整することができる。気泡噴出口８の直径Ｄは、空間３６に導入されるタンパク質溶液中に気泡を噴出することで気泡界面にタンパク質を吸着することができれば特に制限は無く、上記と同様に１μｍ～５０μｍが好ましく、５μｍ～１５μｍがより好ましい。一方、タンパク質吸着気泡噴出口３７の内径は、１μｍ～８００μｍが好ましく、３０μｍ～２００μｍがより好まく、５０μｍ～１５０μｍが特に好ましい。タンパク質吸着気泡噴出口３７の内径が１μｍより小さいと送液が困難になる。一方、タンパク質サンプルは微量であることから、容器１２にタンパク質溶液を入れる場合は数μｌ程度の量になる。そのため、タンパク質吸着気泡噴出口３７の内径が８００μｍより大きい場合、タンパク質吸着気泡噴出口３７の一部がウェルに入れたタンパク質溶液１３から出やすくなり、操作が煩雑になるので好ましくない。タンパク質吸着気泡噴出口３７の内径は、加熱する際の温度及び引き切るスピードを変化させることで調整することができる。
　タンパク質吸着気泡噴出部材３０を用いたタンパク質結晶装置の場合、図２に示すように対向電極１１をタンパク質吸着気泡噴出部材３０とは別体として設けることもできるが、対向電極１１をタンパク質吸着気泡噴出部材３０に設けることもできる。対向電極１１をタンパク質吸着気泡噴出部材３０に設ける場合、対向電極１１は芯材３と回路が形成できればよいので、図４（ｅ）に示すように、外郭部６と外側外郭部３２で形成される空間３６又は気泡噴出部材１の先端と外側外郭部３２で形成される空間３６に導入されるタンパク質溶液１３と接触する場所であれば特に制限は無い。
　図４（ｅ）に示すタンパク質吸着気泡噴出部材３０を用いたタンパク質結晶装置を用いてタンパク質結晶を生成する場合は、タンパク質吸着気泡噴出部材３０の先端をタンパク質溶液１３に浸漬して毛管現象により空間３６にタンパク質溶液を導入、又はタンパク質吸着気泡噴出部材３０の先端と反対側からポンプ等によりタンパク質溶液１３を空間３６に予め導入しておく。次いで、タンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を溶解した溶液にタンパク質吸着気泡噴出部材３０の少なくともタンパク質吸着気泡噴出口３７を浸漬し、対向電極１１が別体の場合は図２に示すようにタンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を含む溶液に接触させ、そして、タンパク質吸着気泡噴出部材３０の芯材３及び対向電極１１に電気を出力することで、先ず、気泡噴出口８から気泡が噴出し、次いで、噴出された気泡の界面にタンパク質が吸着し、タンパク質吸着気泡噴出口３７からタンパク質吸着気泡を噴出することができる。なお、タンパク質吸着気泡噴出部材３０を用いた場合、容器１２に入れる溶液は、タンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を含む溶液の何れであってもよい。空間３６に導入されるタンパク質溶液１３の濃度が高く、気泡に吸着するタンパク質量が結晶を生成するのに十分な量の場合は、タンパク質吸着気泡を緩衝液又は沈殿剤を含む溶液に噴出してもよい。一方、空間３６に導入されるタンパク質溶液１３の濃度が低く気泡に吸着するタンパク質量が少ない場合は、タンパク質吸着気泡をタンパク質溶液中に噴出すればよく、空間３６に導入するタンパク質溶液１３の濃度に応じて、容器１２に注入する溶液は適宜調整すればよい。
　容器１２に入れるタンパク質溶液１３には、上記のとおり沈殿剤を含むことがあるが、沈殿剤の濃度を高くするとタンパク質溶液１３の粘度が高くなる。そのため、気泡噴出部材１を用いた場合は、噴出した気泡がタンパク質溶液１３中で移動しにくくなり、その結果、タンパク質結晶の生成が難しくなる場合がある。一方、タンパク質吸着気泡噴出部材３０を用いた場合は、空間３６に導入するタンパク質溶液１３に含む沈殿剤の濃度を低くしておき、気泡界面にタンパク質を十分吸着したタンパク質吸着気泡をタンパク質溶液中に噴出することで、容器１２に注入するタンパク質量や沈殿剤の濃度を低くすることができる。したがって、結晶生成のために比較的多くの沈殿剤を要する種類のタンパク質の結晶を生成する場合には、タンパク質吸着気泡噴出部材３０を用いたタンパク質結晶装置を用いることが好ましい。
　本発明のタンパク質結晶装置は、そのままの構成でタンパク質結晶切削装置としても使用することができる。タンパク質切削装置を用いてタンパク質結晶を切削する際には、電気を通すことができ、タンパク質が変性しない溶液、例えば、上記のタンパク質溶解用の溶液又は緩衝液等の中にタンパク質結晶を入れる。そして、電気を出力して芯材３及び対向電極１１が通電すると、気泡噴出口８から数百～数千個／秒の気泡を高速で連続的に噴出することができ、噴出した気泡を直接タンパク質結晶に当てることでタンパク質結晶を切削することができる。タンパク質結晶切削装置の電気出力は、気泡噴出部材１を含むタンパク質結晶装置の電気出力と同じでよい。本方法により、従来は困難であったタンパク質結晶の角を落とす等の加工をすることができる。
　また、タンパク質吸着気泡噴出部材を用いたタンパク質結晶装置をタンパク質結晶切削装置として使用することもできる。その場合は、タンパク質吸着気泡噴出部材の空間に、タンパク質溶液に換えて緩衝液等の電気を通すことができる溶液を導入しておき、タンパク質吸着気泡噴出部材を、界面に溶液が吸着した気泡を噴出する部材として用い、噴出された界面に溶液が吸着した気泡をタンパク質結晶に当てて、タンパク質結晶を切削すればよい。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
＜実施例１＞
〔タンパク質結晶装置用又はタンパク質結晶切削装置用の気泡噴出部材の作製〕
　ガラス中空管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製、外径１．３７ｍｍ、内径０．９３ｍｍ）に直径３０μｍの銅線を挿入し、ガラスプラー（サッター社製、Ｐ－１０００ＩＶＦ）によって、加熱しながら引き切って気泡噴出部材１を作製した。図１（ｂ）は実施例１で作製した気泡噴出部材１の先端部分の写真、図１（ｃ）は図１（ｂ）を更に拡大した写真で、気泡噴出口８の直径Ｄは約１０μｍであった。
＜実施例２＞
〔タンパク質結晶装置用のタンパク質吸着気泡噴出部材の作製〕
　ガラスプラー（サッター社製、Ｐ－１０００ＩＶＦ）によって、気泡噴出部材１の作製に用いたガラス中空管より一回り大きいガラス中空管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ社製、外径３３ｍｍ、内径１．６３ｍｍ）を加熱しながら引き切って外側外郭部３２を作製した。次いで、実施例１と同様の手順で作製した気泡噴出部材１にポリマーフィルムを積層して作製したワッシャを嵌め、作製した外側外郭部３２をワッシャの外側に挿入してタンパク質吸着気泡噴出部材３０を作製した。図４（ｅ）は実施例２で作製したタンパク質吸着気泡噴出部材３０の先端部分の写真で、タンパク質吸着気泡噴出口３７の内径は約１００μｍであった。
＜実施例３＞
〔タンパク質結晶装置の作製〕
　医療用電気メス（ＣｏｎＭｅｄ社製、Ｈｙｆｒｅｃａｔｏｒ３００）のメスに換え実施例１で作製した気泡噴出部材１を組み込み、更に、無誘導抵抗及びＤＩＯポートを電気出力手段に組み込んでタンパク質結晶装置１０を作製した。
〔タンパク質（リゾチーム）の結晶化〕
＜実施例４＞
　５ＭのＮａＣｌ溶液を３０μｌ、８０％のグリセロール溶液（和光純薬社製）を４６．８μｌ、純水を６５．７μｌ、及び１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を７．５５μｌ、を混合してタンパク質溶解用溶液を作製した。７０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液（和光純薬社製）を１μｌ及び上記タンパク質溶解用溶液１μｌを混合して、２μｌのタンパク質溶液１３を作製した。
　次いで、ウェルに上記タンパク質溶液１３を入れ、実施例３で作製したタンパク質結晶装置１０の気泡噴出部材１の先端部分及びタングステン製の対向電極１１を、図５に示すように、タンパク質溶液１３中に挿入した。電圧２７．７ｍＡ、電流３０９Ｖ、アウトプット周波数は３２．５ｋＨｚ、インピーダンスマッチングのためのサンプリング周波数は４５０ｋＨｚ、３．５ｋＨｚでフィードバックを行い、芯材３と対向電極１１に電気を出力した。電気の出力回数は１０回で、タンパク質溶液１３中に気泡を噴出した。電気の出力後は、ウェルの上面をフィルムで覆い、タンパク質結晶の生成を観察した。図６（１）は、２２時間５０分経過後のタンパク質溶液１３の写真である。写真から明らかなように、タンパク質溶液１３中にリゾチームの結晶が生成したことを確認できた。
＜比較例１＞
　電気を出力しなかった以外は、実施例４と同様の手順でタンパク質結晶の生成を観察した。図６（２）は、２２時間５０分経過後のタンパク質溶液１３の写真である。写真から明らかなように、比較例１では、リゾチーム結晶の生成は確認されなかった。
〔タンパク質（チトクロームＣ）結晶の生成〕
＜実施例５＞
　４．０Ｍの硫酸アンモニウム溶液を６μｌ及び２．５Ｍの硝酸ナトリウム溶液を４μｌ、を混合してタンパク質溶解用溶液（ｐＨ５．７）を作製した。ウシ心筋由来の１ｗｔ％のチトクロームＣ溶液（シグマアルドリッチ社製）を１μｌ及び上記タンパク質溶解用溶液を１μｌ、を混合して２μｌのタンパク質溶液１３を作製した。
　次いで、ウェルに上記タンパク質溶液１３を入れ、実施例４と同様の手順でタンパク質結晶の生成を観察した。図７（１）は、１２時間経過後のタンパク質溶液１３の写真で、図７（２）は、図７（１）の○で囲った部分を拡大した写真である。写真から明らかなように、タンパク質溶液１３中にチトクロームＣの結晶が生成したことが確認できた。
＜比較例２＞
　電気を出力しなかった以外は、実施例５と同様の手順でタンパク質結晶の生成を観察した。図７（３）は、１２時間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。写真から明らかなように、比較例２では、チトクロームＣの結晶の生成は確認されなかった。
＜実施例６＞
〔タンパク質結晶装置の作製〕
　実施例３のタンパク質結晶装置の気泡噴出部材１に換え、実施例２で作製したタンパク質吸着気泡噴出部材３０を組み込んだ以外は、実施例３と同様の構成でタンパク質結晶装置１０を作製した。
〔実施例３及び６で作製したタンパク質結晶装置１０を用いたタンパク質（リゾチーム）結晶の生成〕
＜実施例７＞
　５ＭのＮａＣｌ溶液を１００μｌ、８０％のグリセロール溶液（和光純薬社製）を１５６．２μｌ、純水を２１８．８μｌ、及び１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）を２５μｌ、を混合してタンパク質溶解用溶液を作製した。次いで、８０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液（和光純薬社製）を１μｌ及び上記タンパク質溶解用溶液を１μｌ、を混合して２μｌのタンパク質溶液１３を作製した。
　次いで、ウェルに上記タンパク質溶液１３を入れ、実施例３で作製したタンパク質結晶装置１０を用い、実施例４と同様の電気出力及び手順で、タンパク質溶液１３中に気泡を噴出した。電気出力後は、上記タンパク質溶解用溶液をリザーバー溶液としたハンギングドロップ法用の装置にウェルを載置し、結晶成長させた。図８（１）は、２０時間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。写真から明らかなように、タンパク質溶液中にリゾチームの結晶が生成したことを確認できた。
＜実施例８＞
　実施例３で作製したタンパク質結晶装置１０に換え、実施例６で作製したタンパク質結晶装置１０を用い、電気を出力する前に、タンパク質吸着気泡噴出部材３０のタンパク質吸着気泡噴出口３７の反対側から、ぜん動型ポンプ（アクアテック社製リングポンプ（ＲＰ－Ｑ１．５Ｓ－Ｐ０１Ａ））を用いて空間３６にタンパク質溶液１３を導入した以外は、実施例７と同様の電気出力及び手順でタンパク質結晶の成長を観察した。図８（２）は２０時間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。写真から明らかなように、実施例７と比較して、より多くのリゾチームの結晶が生成したことを確認できた。
＜比較例３＞
　電気を出力しなかった以外は、実施例７と同様の手順でタンパク質結晶の生成を観察した。図８（３）は、２０時間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。写真から明らかなように、比較例３では、リゾチームの結晶の生成は確認されなかった。
〔タンパク質結晶の切削〕
＜実施例９＞
　実施例３で作製したタンパク質結晶装置をタンパク質結晶切削装置とし、タンパク質結晶の切削実験を行った。
　先ず、５ＭのＮａＣｌ溶液を３０μｌ、８０％のグリセロール溶液（和光純薬社製）を４６．８μｌ、純水を６５．７μｌ、及び１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を７．５μｌ、を混合してタンパク質溶解用溶液を作製した。１００ｍｇ／ｍｌのリゾチーム溶液（和光純薬社製）を１μｌ及び上記タンパク質溶解用溶液を１μｌ、を混合して２μｌのタンパク質溶液１３を作製した。次いで、実施例４と同様の電気出力及び手順でタンパク質溶液１３中に気泡を噴出し、１８時間放置することで、リゾチーム結晶を含むタンパク質溶液を準備した。
　次に、タンパク質切削装置の気泡噴出部材１の気泡噴出口８を、噴出した気泡がリゾチーム結晶の切削面に当たる位置に配置し、電流２７．７ｍＡ、電圧３０９Ｖ、アウトプット周波数は３２．５ｋＨｚ、インピーダンスマッチングのためのサンプリング周波数は４５０ｋＨｚ、３．５ｋＨｚでフィードバックを行い、リゾチーム結晶に気泡を当てた。図９（１）はリゾチーム結晶に気泡を当てる前の写真で、図９（２）はリゾチーム結晶に気泡を当てた後の写真である。図９（１）及び（２）から明らかなように、タンパク質結晶に気泡を当てることでタンパク質結晶を切削できることが確認できた。
〔実施例３で作製したタンパク質結晶装置１０を用いたタンパク質（ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ）結晶の生成〕
＜実施例１０＞
　次に、結晶化し難いタンパク質であるＮＡＤＨ依存性グルタミン酸シンターゼ（ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ）の結晶化を行った。なお、ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴの結晶を得るためには、通常、沈殿剤であるＰＥＧ６０００を約２５％程度加える必要があり、沈殿剤が不純物となり、構造解析に不適当な針状結晶しかられない。
　純水に、ＮａＣｌ濃度が１００ｍＭ、２－オキソグルタル酸（２－ＯＧ、和光純薬工業社製）濃度が４ｍＭ、アザセリン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）濃度が４ｍＭ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度が１００ｍＭ（ｐＨ７．５）、グリセロール（和光純薬社製）濃度が１２ｖ／ｖ％、ＰＥＧ６０００（Ｈａｍｐｔｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）濃度が２０ｗ／ｖ％となるように混合してタンパク質溶解用溶液を作製した。次いで、８０ｍｇ／ｍｌのＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴ溶液（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｌｅｐｔｏｌｙｎｇｂｙａ　ｂｏｒｙａｎａの遺伝子をクローニングして作成したもの。作成手順は、Ｏｋｕｈａｒａ，Ｈ．，　Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｔ．，　Ｆｕｊｉｔａ，Ｙ．　＆　Ｈａｓｅ，Ｔ．，１９９９，　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　１２０，３３－４２　参照。）を１μｌ及び上記タンパク質溶解用溶液を１μｌ、を混合して２μｌのタンパク質溶液１３を作製した。タンパク質溶液中のＰＥＧ６０００の最終濃度は、１０ｗ／ｖ％であった。
　次いで、ウェルに上記タンパク質溶液１３を入れ、実施例３で作製したタンパク質結晶装置１０を用い、実施例４と同様の電気出力及び手順で、タンパク質溶液１３中に気泡を噴出した。電気出力後は、リザーバー溶液としたハンギングドロップ法用の装置にウェルを載置し、結晶成長させた。リザーバー溶液には、純水に、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ濃度が８５ｍＭ（ｐＨ８．５）、酢酸ナトリウム三水和（Ｈａｍｐｔｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）濃度が０．１７ｍＭ、ＰＥＧ６０００（Ｈａｍｐｔｏｎ　ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）濃度が１４ｗ／ｖ％、グリセロール（和光純薬社製）濃度が１０．５ｖ／ｖ％となるように混合した液を用いた。図１０（１）は、２週間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。
＜実施例１１＞
　タンパク質溶解用溶液のＰＥＧ６０００の濃度を１６ｗ／ｖ％、グリセロールの濃度を１０．５ｖ／ｖ％とすることでタンパク質溶液中のＰＥＧ６０００の最終濃度を８ｗ／ｖ％とし、リザーバー溶液のＰＥＧ６０００の濃度を８ｗ／ｖ％、グリセロール濃度を５．２５ｖ／ｖ％とした以外は、実施例１０と同様の手順で結晶成長させた。図１０（２）は、２週間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。
＜実施例１２＞
　タンパク質溶解用溶液のＰＥＧ６０００の濃度を１２ｗ／ｖ％、グリセロールの濃度を９．０ｖ／ｖ％とすることでタンパク質溶液中のＰＥＧ６０００の最終濃度を６ｗ／ｖ％とし、リザーバー溶液のＰＥＧ６０００の濃度を６ｗ／ｖ％、グリセロール濃度を４．５ｖ／ｖ％とした以外は、実施例１０と同様の手順で結晶成長させた。図１０（３）は、２週間経過後のタンパク質溶液１３の写真である。
　図１０（１）～（３）の写真から明らかなように、タンパク質溶液中の沈殿剤であるＰＥＧ６０００の濃度を１０ｗ／ｖ％以下にしても、タンパク質溶液中に気泡を噴出することでタンパク質結晶を得ることができた。また、図１０（３）に示すように、タンパク質溶液中のＰＥＧ濃度を６ｗ／ｖ％と低くした場合はＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴの単結晶が得られた。本発明のタンパク質結晶装置を用いることで、沈殿剤であるＰＥＧ６０００の濃度を低くしても結晶が得られるのみでなく、ＰＥＧ６０００の濃度を調整することで、針状結晶又は単結晶を区別して作製することができる。更に、単結晶を作製できることから、ＮＡＤＨ－ＧＯＧＡＴの構造解析が期待できる。
　本発明に係るタンパク質結晶装置用の気泡噴出部材及びタンパク質吸着気泡噴出部材を、従来より用いられている医療用電気メス等に組み込むことで、タンパク質結晶装置を簡単に作製することができる。また、本発明のタンパク質結晶装置は、気泡を用いてタンパク質結晶を生成することから、タンパク質が熱変性する恐れがない。更に、本発明のタンパク質結晶装置は、タンパク質切削装置としても用いることができることから、単一の装置を用いて、タンパク質の結晶を生成するとともにＸ線構造解析用にタンパク質を成形することができる。したがって、医療機関、大学、企業などの研究機関等において、タンパク質結晶構造の解析に利用が可能である。
１…気泡噴出部材、２…絶縁材料、３…芯材（導電材料）、５…延伸部、６…外郭部、７…空隙、８…気泡噴出口、１０…タンパク質結晶装置、１１…対向電極、１２…容器、１３…タンパク質溶液、２０…一般商用交流電源装置、２１…電線、２２…無誘導抵抗、２３…電圧増幅回路、３０…タンパク質吸着気泡噴出部材、３１…同心軸位置決めワッシャ、３２…外側外郭部、３３…孔、３４…ガラス、３５…ガイド、３６…空間、３７…タンパク質吸着気泡噴出口

Claims (16)

  1. 　タンパク質結晶装置に用いられる気泡噴出部材であって、
    　導電材料で形成された芯材と、
    　絶縁材料で形成され、前記芯材の先端より延伸した延伸部を含み、且つ前記芯材に少なくとも一部が密着して芯材を覆う外郭部、及び、
    　前記延伸部及び前記芯材の先端との間に形成され且つ気泡噴出口を有する空隙、
    を含むことを特徴とする気泡噴出部材。
  2. 　前記外郭部の延伸部がテーパー状であることを特徴とする請求項１に記載の気泡噴出部材。
  3. 　タンパク質結晶装置に用いられるタンパク質吸着気泡噴出部材であって、
    　請求項１又は２に記載の気泡噴出部材の外郭部の外側に、
    　前記外郭部の中心軸と同心軸を有し、前記外郭部との間に空間を有するように前記外郭部から離間した位置に形成し、タンパク質吸着気泡噴出口を有する外側外郭部、
    を含むことを特徴とするタンパク質吸着気泡噴出部材。
  4. 　前記延伸部の外側に形成された前記外側外郭部の部分が、テーパー状であることを特徴とする請求項３に記載のタンパク質吸着気泡噴出部材。
  5. 　前記外郭部と前記外側外郭部との間の空間及び／又は前記気泡噴出部材の先端と前記外側外郭部で形成される空間に、タンパク質溶液を含むことができることを特徴とする請求項３又は４に記載のタンパク質吸着気泡噴出部材。
  6. 　請求項１又は２に記載の気泡噴出部材、対向電極及び電気出力手段を含むことを特徴とするタンパク質結晶装置。
  7. 　請求項３～５の何れか一項に記載のタンパク質吸着気泡噴出部材、対向電極及び電気出力手段を含むことを特徴とするタンパク質結晶装置。
  8. 　請求項６に記載のタンパク質結晶装置の気泡噴出部材の少なくとも気泡噴出口をタンパク質溶液に浸漬し、且つ前記タンパク質溶液に対向電極が接触できるようにする工程、
    　前記気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記気泡噴出口からタンパク質溶液中に気泡を噴出させる工程、
    を含むことを特徴とするタンパク質結晶化方法。
  9. 　請求項７に記載のタンパク質結晶装置のタンパク質吸着気泡噴出部材の外郭部と外側外郭部との間の空間及び／又は気泡噴出部材の先端と前記外側外郭部で形成される空間に、タンパク質溶液を導入する工程、
    　タンパク質吸着気泡噴出部材の少なくともタンパク質吸着気泡噴出口をタンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を含む溶液に浸漬し、タンパク質吸着気泡噴出部材の芯材と対向電極とが通電できる状態にする工程、
    　前記タンパク質吸着気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記タンパク質吸着気泡噴出口から界面にタンパク質及び／又はタンパク質溶液が吸着した気泡を、前記タンパク質溶液、緩衝液又は沈殿剤を含む溶液中に噴出させる工程、
    を含むことを特徴とするタンパク質結晶化方法。
  10. 　前記タンパク質溶液が、送液ポンプにより前記空間に導入される、又は、タンパク質溶液にタンパク質吸着気泡噴出口を浸漬させ毛細管現象により導入される、ことを特徴とする請求項９に記載のタンパク質結晶化方法。
  11. 　導電材料で形成された芯材と、絶縁材料で形成され、前記芯材の先端より延伸した延伸部を含み、且つ前記芯材に少なくとも一部が密着して芯材を覆う外郭部、及び、前記延伸部及び前記芯材の先端との間に形成され且つ気泡噴出口を有する空隙、を含む気泡噴出部材、
    　対向電極、及び
    　電気出力手段
    を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削装置。
  12. 　前記外郭部の延伸部がテーパー状であることを特徴とする請求項１１に記載のタンパク質結晶切削装置。
  13. 　請求項１１又は１２に記載の気泡噴出部材の外郭部の外側に、前記外郭部の中心軸と同心軸を有し、前記外郭部との間に空間を有するように前記外郭部から離間した位置に形成し、界面に溶液が吸着した気泡を噴出する噴出口を有する外側外郭部、を含む界面に溶液が吸着した気泡を噴出する部材、
    　対向電極、及び
    　電気出力手段
    を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削装置。
  14. 　前記延伸部の外側に形成された前記外側外郭部の部分が、テーパー状であることを特徴とする請求項１３に記載のタンパク質結晶切削装置。
  15. 　請求項１１又は１２に記載のタンパク質結晶切削装置の気泡噴出部材の少なくとも気泡噴出口を、タンパク質結晶を含む溶液に浸漬し且つ噴出した気泡がタンパク質結晶の切削面に当たる位置に配置するとともに、前記タンパク質結晶を含む溶液に対向電極が接触できるようにする工程、
    　前記気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記気泡噴出口から噴出した気泡をタンパク質結晶の切削面に当てる工程、
    を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削方法。
  16. 　請求項１３又は１４に記載のタンパク質結晶切削装置の界面に溶液が吸着した気泡を噴出する部材の、外郭部と外側外郭部との間の空間及び／又は気泡噴出部材の先端と前記外側外郭部で形成される空間に、電気を通すことができる溶液を導入する工程、
    　界面に溶液が吸着した気泡を噴出する噴出口を、タンパク質結晶を含む溶液に浸漬し且つ噴出した界面に溶液が吸着した気泡がタンパク質結晶の切削面に当たる位置に配置するとともに、前記タンパク質結晶を含む溶液に対向電極が接触できるようにする工程、
    　前記気泡噴出部材の芯材と前記対向電極とで構成される一対の電極に電気を出力し、前記噴出口から噴出した界面に溶液が吸着した気泡をタンパク質結晶の切削面に当てる工程、
    を含むことを特徴とするタンパク質結晶切削方法。
     
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