WO2004018682A1 - 新規糖転移酵素遺伝子 - Google Patents

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WO2004018682A1
WO2004018682A1 PCT/JP2003/010500 JP0310500W WO2004018682A1 WO 2004018682 A1 WO2004018682 A1 WO 2004018682A1 JP 0310500 W JP0310500 W JP 0310500W WO 2004018682 A1 WO2004018682 A1 WO 2004018682A1
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amino acid
seq
chalcone
acid sequence
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PCT/JP2003/010500
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Noriko Nakamura
Yuko Fukui
Eiichiro Ono
Yoshikazu Tanaka
Hiroaki Okuhara
Original Assignee
Suntory Limited
National Agriculture And Boi-Oriented Research Organization
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)

Definitions

  • the present invention relates to a gene of an enzyme having an activity of transferring sugar to chalcone, and a plant whose flower color has been converted using the glycosyltransferase. More specifically, the present invention relates to a 2′-position of chalcone The present invention relates to an enzyme gene having an activity of synthesizing a saccharide, preferably an enzyme gene having an activity of synthesizing a 2 ′ glycoside of chalcone derived from carnation or cyclamen, and a use thereof.
  • Flower color is an important trait when people appreciate or purchase flowers, and flowers of various colors have been bred since ancient times. It is rather rare that a single species has flowers of all colors, but this is due to the genetic regulation of the biosynthesis of the pigment expressed as the flower color (flower pigment). Because of the limited genetic resources available in hybrid breeding, it is virtually impossible to produce all colored flowers in the target species by crossing. Recently, it has been possible to obtain the gene for an enzyme involved in the synthesis of flower pigments from one plant using genetic recombination technology, and to modify the flower color by expressing the gene in another species. It has become possible (see, for example, Non-Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • anthocyanins Of the flower colors, orange, red, purple, and blue are mainly derived from flavonoids called anthocyanins.
  • the yellow color is often derived from non-flavonoid compounds such as carotenoids and betalains, but the yellow color of some plant species comes from flavonoids.
  • yellow carnations are 4, 2 '
  • THC 6'-tetrahydroxychalcone
  • chalcones glycosides such as THC, butyne, and isoriqitigenin are known.
  • THC is used for carnation, morning glory, botan, aster, and wheat waragic, and 3,4 for quinguiyo soda starch.
  • 2 ', 4', 6 '-Pentahydroxycanolecon, cosmos and Jerusalem artichoke contain butyne
  • dahlia contain butyne and isoliquichigenin as aglycones.
  • limited species such as goldfish have yellow flower pigments called oropens such as aurecidin and black theatine, but the absorption maximum of auron is between 399 nm and 403 nm.
  • both chalcones and aurons are stabilized by transglycosylation in plant cells, and are then transferred to and accumulated in vacuoles.
  • the biosynthetic pathway of anthocyanin has been well studied, and enzymes involved in anthocyanin biosynthesis and genes encoding them are known (for example, see Non-Patent Document 5). Also, enzymes involved in auron biosynthesis and their genes have been reported (for example, see Non-Patent Document 6). Flavonoid biosynthetic pathways are widely present in higher plants and are common among species.
  • THC is biosynthesized from three molecules of malonyl CoA and one molecule of coumayl C0A by the catalysis of chalcone synthase. As shown in Fig. 1, THC has a pale yellow color, but in plants, it is rapidly converted to colorless naringenin by the ribonucleoisomerase. Also, THC is extremely unstable at around pH, and is spontaneously closed to be converted to naringenin. It is said that THC must be transglycosylated to the 2'-position of THC and transported to the vacuole in order for THC to be stable in plant cells, ie, to exhibit a stable yellow color.
  • TH C If it was possible to obtain a gene for an enzyme that transglycosylates at the 2 'position, it would be possible to express this enzyme gene in plants, accumulate THC glycosides, and create yellow flowers (for example, Non-Patent Document 7).
  • Non-Patent Document 8 the activity of chalcone glycosyltransferase is measured by labeling UDP-glucose with a radioisotope, measuring the radioactivity of the organic layer from which the resulting glycoside is extracted with ethyl acetate after the enzymatic reaction.
  • Non-Patent Document 8 the activity of chalcone glycosyltransferase is measured by labeling UDP-glucose with a radioisotope, measuring the radioactivity of the organic layer from which the resulting glycoside is extracted with ethyl acetate after the enzymatic reaction.
  • the problem is that the original THC glycosyltransferase activity cannot be measured accurately. Therefore, since the enzyme that catalyzes this glycosyltransfer reaction could not be purified, the gene encoding the glycosyltransferase could not be cloned.
  • glycosyltransferases Catalyzes the glycosyltransfer reaction of various flower pigment compounds, including flavonoids Enzymes that produce saccharides are called glycosyltransferases. Plants possess glycosyltransferases of various molecular species having specificity for aglycone and the type of sugar to be transferred, and genes encoding them. ing. Since glucose transferase usually uses UDP-glucose as a glucose donor, glucose transferase contains a motif that binds to UDP-glucose in its amino acid sequence (for example, see Non-Patent Document 10). ).
  • Non-patent document 1 Plant Cell Physiol. 39, 1119 (1998)
  • Non-patent document 2 Curr. Opin. Biotechnol. 12, 155 (2001)
  • Non-Patent Document 3 Phytochemistry, 5, 111 (1996)
  • Non-patent document 4 Bioholti 1 49-57 (1990) Seibundo Shinkosha
  • Non-Patent Document 6 Science, 290, 1163 (2000)
  • Non-Patent Document 7 Biotechnology of Ornamental Plants (Edited by Gen eve, Preece and Merkle) p259-294, CAB International Wallingford, UK (1997)
  • Non-Patent Document 8 Phytochemistry, Vol. 17, pp. 53-56, (1978)
  • Non-patent document 9 Plant J. 13, 259 (1998)
  • Non-Patent Document 10 Plant Physiol. 112, 446 (2001)
  • Non-Patent Document 1 J. Biol. Chem. 276, 4338, (2001)
  • Non-Patent Document 1 J. Biol. Chem. 274, 7405, (1999)
  • Non-Patent Document 13 Plant Mol Biol. 48, 401-11 (2002) Disclosure of the Invention
  • the present invention relates to an enzyme that catalyzes a reaction for transferring sugar to a 2′-hydroxyl group of chalcone and a gene thereof, preferably an enzyme that catalyzes a reaction for specifically transferring glucose to a 2′-hydroxyl group of chalcone. And its genes. Further, the present invention provides a plant in which the flower color has been modified, preferably changed to yellow, using the glycosyltransferase gene.
  • the properties of chalcone 2 'glycosyltransferase were not known, and neither the enzyme was purified nor its gene cloned.
  • the present inventors cloned dozens of glycosyltransferase genes having a base sequence corresponding to the conserved region from a carnation petal cDNA library using a probe corresponding to the conserved region of the glycosyltransferase. did.
  • the glycosyltransferase genes were expressed in Escherichia coli, and the activity of transferring glucose to position 2 of chalcone in the extract of Escherichia coli, that is, the activity of chalcone 2 'glycosyltransferase was confirmed. Then, it was confirmed that the cloned gene encodes a 2'-glycosyltransferase, thereby completing the present invention.
  • a protein having the activity of hybridizing under stringent conditions to DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 and having the activity of transferring a sugar to the 2 ′ position of chalcone.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 or an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted, Z or added to the amino acid sequence, and A gene that codes for a protein that has the activity of transferring sugars to position 2,
  • a protein that hybridizes under stringent conditions to DNA consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 18 and has an activity of transferring a sugar to the 2 ′ position of chalcone A gene encoding
  • (10) It consists of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • novel genes and enzymes are provided.
  • the sugar can be specifically transferred to the hydroxyl group at the 'position, and the chalcone can be stabilized.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is suitably used for producing a plant with a modified flower color.
  • FIG. 1 is a diagram showing the synthesis pathway of chalcone 2 ′ glycoside by chalcone 2 and glycosyltransferase.
  • FIG. 2 is a view showing an alignment of amino acid sequences of plant-derived glycosyltransferases.
  • the base sequence corresponding to the amino acid sequence indicated by the arrow was used as a primer.
  • the portion amplified by these was used as the GT storage region in the probe of Example 2.
  • the part enclosed by a square is a part that is homologous to the sequence between GTs.
  • Abbreviations are as follows. MG 3 GGT: Asagao 3 GG T; GGT 7: Gentian 3 GT; HGT 8: Verbena 5 GT; SbUFGT: Koganebana GT.
  • Examples of the gene of the present invention include those encoding the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 2, 15, 7, 9, 21, and 56.
  • proteins having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids have been added, deleted, or substituted with another amino acid are also known to maintain the same enzymatic activity as the original protein. Therefore, the present invention relates to the amino acid sequence of SEQ ID NOs: 2, 15, 17, 17, 19, 21 and 56 as long as the protein retains chalcone 2 'glycosyltransferase activity.
  • a protein having an amino acid sequence in which one or more amino acid sequences are added, deleted and / or substituted with another amino acid, and a gene encoding the protein also belong to the present invention.
  • the term “plurality” means 2 to 30, preferably 2 to 9.
  • the present invention also provides a stringent DNA against a DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 14, 16, 16, 18, 20, 55.
  • the present invention relates to a gene that hybridizes under conditions and encodes a protein having chalcone 2'-glycosyltransferase activity. That is, it hybridizes under stringent conditions to DNA having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NOs: 1, 14, 16, 16, 18, 20, and 55.
  • Hybridization conditions vary depending on the length and base composition of the DNA used for the probe, and are not limited to the specific conditions shown below by numerical values, but are referred to as "stringent conditions" as used herein. Is, for example, preferably 5 ⁇ SSC, 37 ° C., more preferably 5 ⁇ SSC, 50 ° C., and still more preferably 2 ⁇ SSC, 65 ° C.
  • the conditions of 5 XSSC and 37 ° C were, as shown in Example 2, using the conserved region of the glycosyltransferase gene of anthocyanidins as a probe and the chalcone 2′-glycosyltransferase of the present invention as a probe.
  • Such a homolog can be preferably applied as a condition for hybridizing with 5XSSC, 50.
  • the condition C is preferably applied as a condition for hybridizing a chalcone 2 'glycosyltransferase gene (ortholog) of another origin using the chalcone 2' glycosyltransferase gene of the present invention as a probe. it can.
  • the genes selected by the above-mentioned hybridization include those of natural origin, for example, those of plant origin, for example, genes of cyclamen origin, but are not limited to those of plant origin.
  • the chalcone 2 'glycosyltransferase gene of the present invention is not limited to the carnation-derived chalcone 2' glycosyltransferase gene, but includes the orthologs of the gene, such as cyclamen and rhododendron.
  • the gene selected by the hybridization may be cDNA or genomic DNA.
  • Genes having homology to the conserved region of glycosyltransferase were prepared from carnation petals, for example, as shown in the Examples. Obtained by screening a DNA library.
  • a DNA encoding a glycosyltransferase having an amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 has been modified can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and a known site-specific modification. It can be synthesized by a mutagenesis method or a PCR method.
  • DNA encoding a glycosyltransferase having an amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 has been modified can be identified by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14 as a known site. It can be synthesized by mutagenesis or PCR.
  • a DNA encoding a glycosyltransferase having an amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 has been modified can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16 at a known site. It can be synthesized by a specific mutagenesis method or a PCR method.
  • the DNA encoding the glycosyltransferase having the amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 19 has been modified can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 at a known site. It can be synthesized by a specific mutagenesis method or a PCR method.
  • a DNA encoding a glycosyltransferase having an amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is modified can be obtained by using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20 at a known site. It can be synthesized by specific mutagenesis or PCR.
  • a DNA encoding a glycosyltransferase having an amino acid sequence in which the amino acid sequence of SEQ ID NO: 56 has been modified can be identified at a known site using a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55. It can be synthesized by mutagenesis or PCR. For example, a DNA fragment whose amino acid sequence is to be modified is replaced with a cDNA or genomic DNA restriction enzyme. The DNA fragment corresponding to the desired amino acid sequence modification is obtained by performing site-directed mutagenesis or PCR using primers corresponding to the desired amino acid sequence modification, Obtainable. Thereafter, the DNA fragment into which this modification has been introduced may be ligated to a DNA fragment encoding another part of the target enzyme.
  • a DNA encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, a DNA encoding an amino acid sequence longer than the desired amino acid sequence, for example, a DNA encoding a full-length amino acid sequence
  • a DNA encoding an enzyme consisting of a shortened amino acid sequence for example, a DNA encoding an amino acid sequence longer than the desired amino acid sequence, for example, a DNA encoding a full-length amino acid sequence
  • a DNA fragment corresponding to the missing amino acid sequence may be synthesized and ligated.
  • glycosyltransferase gene is expressed using a gene expression system in Escherichia coli or yeast, and the activity of chalcone 2′-glycosyltransferase in the extract of the Escherichia coli or yeast is measured. It can be confirmed that the obtained glycosyltransferase gene encodes a protein exhibiting chalcone 2′-glycosylation activity.
  • the activity of chalcone 2′-glycosyltransferase is determined, for example, by adsorbing chalcone as a substrate for chalcone 2′-glycosyltransferase on a gel filtration resin as described in Example 5, and then purifying the gel filtration resin. It can be measured by reacting with an extract of Escherichia coli or yeast transformed with the glycosyltransferase gene, and analyzing the resulting glycoside 2 ′ glycoside by high performance liquid chromatography.
  • a chalcone 2'-glycosyltransferase protein which is a product of the gene can be obtained.
  • a chalcone 2 'glycosyltransferase gene derived from another organism is obtained by expression cloning using an antibody against a protein or a peptide having all or a part of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2. You can also. SEQ ID NOS: 15, 17, The same applies to the amino acid sequences of 19, 21 and 56.
  • the present invention also relates to a recombinant vector containing the chalcone 2 'glycosyltransferase gene, particularly an expression vector, and a host cell transformed with the vector.
  • a prokaryote or eukaryote can be used as a host.
  • Prokaryotes include bacteria such as bacteria belonging to the genus Escherichia, such as Escherichiacoli, and bacteria belonging to the genus Bacillus (Bacillus), such as Bacillus subtilis.
  • Bacillus Bacillus
  • Known host cells can be used.
  • eukaryotic cells for example, eukaryotic microorganisms, preferably yeast or filamentous fungi can be used.
  • yeast examples include yeast belonging to the genus Saccharomyces such as Saccharomyces cerevisiae, and examples of filamentous fungi include Aspergillus lusoryzae. ), Filamentous fungi belonging to the genus Asperenolesinus (A spergi 1 1 us), such as Niger (A spergi 1 lusniger), and filamentous fungi belonging to the genus Penicillium (Penici 11 i urn).
  • animal cells or plant cells can also be used as host cells, and cell lines such as mouse, hamster, sal, and human are used as animal cells. Insect cells, such as silkworm cells, or silkworm adults themselves, are also used as hosts.
  • the expression vector of the present invention contains a promoter, an expression control region such as a terminator, and an origin of replication depending on the species of the host into which the vector is to be introduced.
  • a promoter for an expression vector for bacteria particularly for Escherichia coli
  • a conventionally known promoter for example, a trc promoter, a tac promoter, a 1ac promoter and the like can be used.
  • a yeast motor for example, a dalyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase promoter, a PHO5 promoter, or the like is used.
  • promoters such as amylase and trpC can be used, but are not limited to these promoters.
  • a viral promoter for example, an SV40 early promoter, an SV40 late promoter and the like are used.
  • the expression vector can be prepared by a conventional method using a restriction enzyme, ligase and the like.
  • transformation of a host cell with an expression vector can also be performed according to a conventionally known method.
  • a plant expression vector for example, use a binary vector such as pBI121 when using Agrobacterium, and use an E. coli vector such as pUC19 when using a particle gun.
  • a plant cell transformed with the expression vector of the plant is selected using a marker gene such as an antibiotic resistance gene, and re-differentiated using conditions such as an appropriate plant hormone. Plants transformed with the chalcone 2 'glycosyltransferase gene can be obtained. By cultivating the transformed plant, it is possible to obtain a plant whose flower color has been modified by flowering.
  • the host cells or transformed plants transformed by the expression vector are cultured or cultivated, and the cultures or plants are subjected to conventional methods, for example, filtration, centrifugation, cell disruption, gel filtration chromatography.
  • the desired chalcone 2 'glycosyltransferase can be recovered and purified by chromatography, ion exchange chromatography, or the like.
  • the present invention is not limited to the chalcone 2'-glycosyltransferase gene of carnation and cyclamen. If the protein encoded by the gene has chalcone 2, glycosyltransferase activity, it can be similarly used for flower color conversion.
  • the present invention also relates to the use of chalcone 2 'glycosyltransferase gene, Plants whose flower color has been modified by introduction and expression in the plant, or their progeny, or the tissues of these plants are also within the technical scope of the present invention. Cut flowers may be used.
  • transformable plants include roses, chrysanthemums, carnations, goldfish, cyclamen, orchids, lisianthus, frigidia, gerberas, gladioli, kasumi, kalanchoe, lilies, pelargonium, Geranium, Petunia, Treasure, Tulip, Rice, Oatmeal, Wheat, Rape, Potato, Tomato, Poplar, Banana, Ukkari, Somaimo, Tides, Ganorefanola, Norepin, Examples include, but are not limited to, corn, cauliflower, and periwinkle.
  • the chalcone 2′-glycosyltransferase gene of the present invention is introduced, and in addition, THC is other than the chalcone 2′-glucoside. Measures can be taken to suppress the metabolism that is converted to the substance.
  • the CHI gene EMBO J 7, 1257 (1988)
  • the petunia flavanone 3-hydroxylase gene F 3 H
  • RNA was obtained by the method, and poIyA + RNA was purified using Origotex dT30 (Nippon Roche). From this poly A + RNA, a cDNA library was constructed using the cDNA synthesis kit (Stratagene) and ZAPIIUni-XR vectorkit (Stratagene). The resulting library is, 1. 6 xl 0 5 plaques' Fomi ring. Unit (piaqueformingunit) force, was Rere Te RaNatsu.
  • Example 2 Acquisition of full-length chalcone 2 'glycosyltransferase gene
  • GT glycosyltransferase
  • the GTs comparing the amino acid sequences were asagao-derived UDP-glucose: anthocyanidin 3-darcoside glycosyltransferase (3GGT) (amino acid sequence described in SEQ ID NO: 13), and gentian-derived UDP-glucose: Anthocyanin 3-Gnorecosinotransferase (3GT) (Plant Cell Physiol. 37, pp. 71 1 (1996)), UD derived from Nokubena p-Gnorecose: Anthocyanin 5-Darcosine transferase (5GT) (J. Biol.
  • GT Scutellaria glycosyltransferase
  • plasmid containing 1 ng of each cDNA as type I and 100 ng of each of the following oligonucleotides as primers were used at 95 ° C for 1 minute, 55 The reaction consisting of 1 minute at 72 ° C and 2 minutes at 72 ° C was defined as one cycle, and 25 cycles were performed. A mixture of equal amounts of these PCR amplification products was used as a hybridization probe to screen the carnation-derived cDNA library described in Example 1.
  • the primers used for amplification of the conserved region are as follows.
  • Distribution system IJ number 6 5 '-CCA CCT TTC ACC CCA ACC CC-3'
  • Rooster system IJ number 8 5'— CTC TCA CTC TCA CAC CCG— 3 '
  • Screening of the library is a non-radio system DNA detection kit. (Roche Diagnostics). Hybridization was performed overnight at 37 ° C in 5XSSC containing 1% SDS, 30% formamide, and filter washes were performed at 55 ° C for 30 minutes using 1XSSC, 1% SDS. Was. About 27,000 plaques were screened, and finally a clone containing about 30 glycosyltransferase genes was obtained. From this clone, one clone was obtained in which the chalcone 2′-glycosyltransferase activity was confirmed by the method described in Example 4 and Example 5, and the clone was named T170, and the clone was named T170.
  • the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence was determined by a primer walking method using a synthetic oligonucleotide primer, and determined using DNA Sequencer model 310 (Applied Biosystems).
  • the nucleotide sequence and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence are shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, respectively.
  • Example 3 Amino Acid Sequence Analysis of Chalcone 2, Glycosyltransferase T170
  • pT170 contained a 170 bp gene T170 encoding a protein consisting of 49 amino acids and having a molecular weight of 54.2 kDa. Comparison of the amino acid sequence encoded by T170 with the previously reported glycosyltransferase revealed that 25% of GT (Plant J.19, 509 (1999)) from Livingstone Daisy and 25% from Perilla and Verbena It showed 21% homology with 5GT.
  • the software sphere used was C 1 usta 1 W included in Mac Vectorver. 6.0 (Oxford Molecule).
  • T170 gene in Escherichia coli was performed using TheQIAExpressionist (QIAGEN).
  • QIAGEN TheQIAExpressionist
  • T170 Ncol (robot self IJ number 11): 5'—AGT TCA ACC ATG GGC AAA GCA C—3 'M13 M4 (SEQ ID NO: 12): 5'-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3 '
  • the PCR reaction solution (25 ⁇ l) was prepared as follows: T17010 ng, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ —Taqbuffer (Takara), 0.2 mM dNTPs, Each of the primers consists of 0.2 pmo ⁇ / ⁇ 1, E x — Taq polymerase 1.25 U.
  • the reaction was performed at 94 ° C for 5 minutes, followed by 25 cycles of 94 ° C, 1 minute, 55 ° C, 1 minute, 72 ° C, 2 minutes, and finally 7 2 Treated at ° C for 7 minutes.
  • the obtained PCR product was subcloned into pCR2.1 TO PO vector (INVITROGEN) by the method recommended by the manufacturer.
  • the plasmid pTOPO-T170 obtained in this manner was determined. The absence of errors due to the PCR reaction was confirmed by determining the nucleotide sequence.
  • pQE60 QI AGEN
  • Ncol and Bg1II an orifice in which the complementary primers pQE61-f and pQE61-r were annealed at the same site.
  • a gonucleotide cassette was introduced to prepare a vector pQE-61 into which MCS was newly introduced.
  • (pQE61-f) 5,-CATGGGAGGTACCACTAGTGATATCA-3 '(SEQ ID NO: 36)
  • Detection was carried out using an absorbance at 36 O nm and an absorption spectrum of 250 to 400 nm using a PDA detector SPD-M6A (Shimadzu Corporation). Under these conditions, 11 ⁇ ⁇ was eluted at a retention time of 27.3 minutes, and the 2 'glycoside was 19.8 The elution at 9 minutes was confirmed using THC and THC 2 'glycoside standard.
  • glycosyltransferase derived from T170 has an activity of transglycosylating glucose to the 2′-hydroxyl group of THC.
  • chalcone 2'-glycosyltransferase gene product derived from T170 in plants encode a protein that has the activity to transfer sugar to the 2'-position of THC.c DNAT 1 CHI-A gene (EMBOJ7, 1257), which expresses 70 and encodes a protein with chalcone isomerase activity derived from petunia using this enzyme and THC as substrates. (1988)), a binary vector (pSPB1342) that suppresses the expression of was constructed. The production of pSPB1342 was performed as follows.
  • Su per Scrit TM First -Strand Synthesis CDNA was synthesized using System for RT-PCR (Invitrogen). From this cDNA, primers, BamH I—CH I—F (SEQ ID NO: 49) and Sa 1—CH I—R (SEQ ID NO: 50), Sa 1 _C HI -F (SEQ ID NO: 51) and Eco RI -CH I— R (SEQ ID NO: 52) was used to cut 0.61 ⁇ 13 and 0.8 kb of the petunia CH I gene by PCR.
  • pE2113 (Mitsuhara et al. Plant Cell Physiol. 37, 45-59 1996) is a rehabilitation mosaic virus 35S (E1235S) promoter and nopaline synthase that repeat the Enhansa sequence. (Nos) It has one terminator.
  • pE2113 was deleted with SnaBI, and BamHI linker (Takara) was inserted to obtain pUE6.
  • pUE6 was digested with SacI, blunt-ended, and Sa1I linker (for example, Takara) was inserted.
  • the fragment having the E1235S promoter was converted into a plant transformation binary vector pBINPLUS (vanEngelen et al. Biol. 15, p373 (1995)) into the Hindlll-EcoRI site.
  • This plasmid PS PB176 was digested with BamHI and Sa1I, and the above two petunia CHI gene fragments were ligated to obtain pSPB1601.
  • This PS PB1601 was digested with Ascl and dephosphorylated.
  • T170 gene inserted into the multicloning site EcoRI—XhoI site of pBluescript II (sk—) (Stratagene) was ligated to BamHI (5 ′ of cDNA). Digestion with Kpnl (3 'end of cd) to obtain a T170 cDNA fragment of about 1.5 kb.
  • p UCAP van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995
  • T170 consisting of the MAC1 promoter (Plant Mol. Biol.
  • the SPB1342 prepared in Example 6 was introduced into Agrobacterium mummefaciens Ag10 strain (Lazo et al., Bio / Technology 9, 963-967, 1991), and the agglobate battery method using leaf disks was used.
  • Plasmids were introduced into Agrobacterium and transformed by known methods (Plant J. 19945 p81).
  • Cultivar PL has flavonoid 3 ', 5'-hydroxylase genes (Holton et al. (1993) Nature 366, p276-279), flavonoid 3' monohydroxylase gene (Brugliera et al.
  • Tl70F and T17OR were used for amplification of T170 mRNA, and primers CHIF1 and CHIR1 were used for amplification of petunia CHI mRNA.
  • the sequence of each primer is as follows. T170F: 5 '-GAGCAAAGCACCGTTCGAGTTG-3' (system IJ number 2 2)
  • T170R 5'-CTCCGTACATGATTGCAGAGAGCA-3 '
  • CHIR1 5 '-ACTTCTCAATGGCACGACCCTC-3' (Rotary number 2 5)
  • T170 mRNA was detected in 38 petunia petals, and a decrease in petunia CH I mRNA was observed in 32 petunias.
  • PSPB265 cloned into pBluescriptll (sk—) of the petunia F3H cDNA gene was used for type I, M13RV primer (SEQ ID NO: 48) and PhF3H—1—Clalprimer (SEQ ID NO: 48).
  • PCR was performed using the combination of SEQ ID NO: 40) to obtain a PhF3H-1 fragment.
  • This P h F 3H fragment was cloned using Zero B TOP T PCR Cloning Kit (Invitrogen), cut out with SacI and C1aI, and a fragment P h of about 0.7 kb was obtained.
  • pSPB265 was digested with BamHI and CIaI, and a fragment of about 0.9 kb was cut out to obtain PhF3H-2 '.
  • pUE6 was blunt-ended at the AscI site of pUCAP (van Engelen et al. Transgenic Research 4, 288-290, 1995), and the plasmid into which the PacI linker was inserted was defined as pUCPP.
  • the DNA fragment containing the E123S promoter was inserted into the HindIII-EcoRI site of pUCPP. This plasmid was named pSPBB540.
  • PCGP1403 (WO 961 36716) containing the petunia DFR gene was digested with BamHI and ScaI, PvuII and SacI to obtain fragments of 0.85 kb and 0.45 kb, respectively.
  • 15, M373 of NP LUS vanEngelen et al. Plant Mol. Biol. 15, p373
  • pSPB1601 containing a cassette consisting of a petunia CHI gene having an EL235S promoter and a double-stranded RNA structure and a NOS terminator described in Example 6 was transformed into HindIII and EcoRI. To obtain a fragment of about 2.5 kb. This was inserted into HindII-EcoRI of the vector pUCPP to give pSFL5. This was cleaved with PacI, and the approximately 2.5 kb fragment obtained from the pUCPP vector was inserted into the PacP cleavage site of pS PB532 in the same direction as the petunia DFR expression suppression cassette, that is, both expression potentials.
  • Both of the sets were inserted such that the LB side of the vector was upstream, and the resulting plasmid was designated as pSFL13.
  • this was digested with AscI and then dephosphorylated.
  • the MAC1 promoter (Comai et al. (1990)) on the plasmid vector pUCAA described in Example 6. Plant Mol. Biol. 15, p373), the expression cassette of the T170 gene and the T170 gene, which consists of the mannopine synthase gene, is cut with AscI, cut out from the pU CAA vector, A 5 kb fragment was obtained.
  • chalcone glycosyltransferase gene may exist in addition to T170 in carnation.
  • the nucleotide sequence and amino acid sequence of cDNA contained in the plasmid designated pT128 are shown in SEQ ID NOs: 14 and 15 in the sequence listing.
  • the cDNA contained in pT128 contained the 14467 bp gene T128 encoding a protein consisting of 489 amino acids and having a molecular weight of 55.2 kDa. .
  • T128 The amino acid sequence encoded by T128 was compared with a previously reported glycosyltransferase as described in Example 3 to find that GT from Livingstone Daisy was 54% and GT from Verbena was 5%. It showed 24% identity. It showed 27% identity with T170.
  • Example 10 Expression and Activity Measurement of T128 Gene in E. coli
  • T128 gene in Escherichia coli was carried out using the same method as described in Example 4 using The QIAE xpressio nist (QIAGEN).
  • QIAE xpressio nist QIAGEN
  • the following primer T128-NcoI and M The same PCR reaction as in Example 4 was performed using 13 M 4.
  • T128-Ncol 5 '-ACAATTTCAGCCATGGGCAC -3' (Distribution 'J number 26)
  • the obtained PCR product was converted into pCR2.1 TO PO vector (I NVITROGEN) by the method recommended by the manufacturer.
  • the plasmid thus obtained was named pTOPO-T128.
  • plasmid pSPB1441 was obtained. PSB1441 was transformed into Competenthigh JM109 (TOYOBO).
  • This E. coli transformant was cultured by the method described in Example 5 to obtain a crude enzyme solution. Using this, glycosyltransferase activity using chalcone as a substrate was measured by the method described in Example 5.
  • THC retention time: 27.3 minutes
  • New substances eluted in minutes were detected. The former was identified as the 2 'glycoside of THC and the latter was identified as the 4' glycoside of THC by comparing the retention time of each standard.
  • T128 is expressed and the same enzyme and substrate are used.
  • the production of pSPB210 was the same as in Example 6. Similarly, the procedure was as follows.
  • pSPB1601 was digested with AscI and then dephosphorylated.
  • the T128 gene inserted into the pBluescriptll (sk—) manole reticulum Jung site was transformed with BamHI (5 'end of cDNA) and Kpnl (3' of cDNA). (End) to obtain a T128C DNA fragment.
  • an expression cassette of the T170 gene comprising the MAC1 promoter, the T128 gene, and the mannopine synthase gene terminator was placed in the pUCAA vector B a.
  • the ⁇ I cleavage site was constructed at the 5 'end and the Kpn I site at the 3' end.
  • the entire T128 expression cassette was excised from the pUCAA vector by AscI cleavage.
  • T170 as a probe, screening was carried out from a carnation petal library 240,000 plaque. Screening provided the plasmid pCGT93.
  • the cDNA contained in pCGT93 contained 144 bp gene CGT93 encoding a protein consisting of 481 amino acids and having a molecular weight of 52.8 kDa.
  • the amino acid sequence encoded by C GT93 was compared with the previously reported glycosyltransferases as described in Example 3 to find that GT from Livingstone Daisy was 26% and GT from Verbena was 5%. It showed 23% identity. In addition, it showed 63% identity with T170 and 25% identity with T128.
  • the expression of the CGT93 gene in Escherichia coli was performed using the same method as that described in Example 4 using The QIAexpresinsiost (QIAGEN).
  • QIAGEN QIAexpresinsiost
  • the primers A93-75BspHI and A93- The same PCR reaction as in Example 4 was performed using 5-BglII.
  • A93-75-Bglll 5'-GGAAGATCTAATATACGTGAGTAC-3 '(Toriki system number 28)
  • the obtained PCR product is converted into pCR—B1untII—TO P ⁇ vector (I NV IT ROG EN) by the manufacturer.
  • the subcloning was performed according to the method recommended by the manufacturer and pSPB1469 was obtained.
  • the absence of errors due to the PCR reaction was confirmed by determining the nucleotide sequence.
  • Approximately 1.8 Kb fragment obtained by digesting this pSPB1469 with BspHI and Bg1II was digested with the NcoI and BglII sites of pQE-61 vector. To obtain plasmid pSPB1470.
  • This pSPB1470 was transformed into Compe tent thigh hJM109.
  • This E. coli transformant was cultured by the method described in Example 5 to obtain a crude enzyme solution. Using this, glycosyltransferase activity using chalcone as a substrate was measured by the method described in Example 5.
  • CGT93 is expressed and a petunia-derived chalcone isomerase that uses the same enzyme as the substrate.
  • a co-expression binary vector (pSPB1494) that suppresses the expression of the CHI-A gene, which encodes an active protein, was constructed.
  • the production of pSPB1494 was performed as follows in the same manner as in Example 6.
  • pSPB1601 was digested with Ascl and then dephosphorylated.
  • the CGT93 gene inserted into the pBluescriptl I (sk—) manore cloning site was digested with XhoI (3 'end of the cDNA), followed by DNA Blunting Kit (Takara), followed by digestion with BamHI (5 'end of cDNA) to obtain a CGT93cDNA fragment.
  • the obtained CGT93c DNA fragment was digested with KpnI on Pplasma vector pUCAA to digest the PSPB184 consisting of the MAC1 promoter and the mannovin synthase gene terminator, followed by DNABlunting Kit. It was blunted and inserted into BamHI digested sites.
  • RNA was obtained from petals and leaves of yellow carnation buds.
  • a cDNA library enriched for the gene expressed in the petals was prepared using CL ONT E CH P C R—Sele c t c DNA Subs t r a c t i on Kit (CL ONT E CH) according to the method recommended by the manufacturer.
  • 16 clones homologous to GT were obtained. Since these GT homolog clones obtained by subtraction were not obtained as full-length clones, screening was performed on the 24: 000 clones from the petal cDNA library again using the GT homologous fragment as a probe. went. Screening was performed according to the method described in Example 2.
  • the nucleotide sequence of cDNA and the amino acid sequence contained in the plasmid designated as clone pS6B11 obtained by the subtraction of Example 15 are shown in SEQ ID NOs: 18 and 19 in the sequence listing. Indicated.
  • the cDNA contained in pS6B11 contained the 144-bp gene S6B11 encoding a protein consisting of 483 amino acids and having a molecular weight of 54.4 kDa. Comparison with the previously reported glycosyltransferase showed 60% identity with the GT from Livingstone Daisy and 26% with 5GT from Verbena. In addition, they showed 27%, 54%, and 27% identity with T170, T128, and CGT93, respectively.
  • pSPB1601 was digested with Ascl and then dephosphorylated.
  • the S6B11 gene inserted into the pBluescriptll (sk—) manole reticulojung site was transformed with BamHI (5, end of cDNA) and Kpnl (3 'of cDNA). (End) to obtain an S6B11c DNA fragment.
  • the cleavage site was prepared at the 5 'end, and the Kpnl cleavage site was prepared at the 3' end.
  • the entire S6B11 expression cassette was excised from the pUCAA vector by AscI digestion.
  • the S6B11 expression cassette excised as described above was inserted into the AscI cleavage site of pSPB161 as described above in the same direction as the petunia CHI expression suppression cassette, that is, in both expression cassettes, the vector was used.
  • the plasmid was inserted so that the LB side was upstream, and the obtained plasmid was designated as pSPBl335.
  • Example 18 Expression of 18 S6B11 in Plants and Changes in Flavonoid Composition As described in Example 7, pSPB133 was introduced into Agrobacterium tumefaciens Ag10 strain. Then, Petunia PL strain was transformed.
  • Example 15 The clone pS12A2-a obtained by the subtraction in Example 5 had a deletion of the 5 'region.
  • the primers are shown below.
  • the cDNA contained in pS12A2—d contains a 148 bp gene S12A2 that encodes a protein with a molecular weight of 486 amino acids 5 Included. Comparison with the previously reported glycosyltransferases as described in Example 3 showed that
  • S12A2 gene in Escherichia coli was performed by the method described in Example 4 using a The QIA expressionist (QIAGEN).
  • PS12A2—d in Example 19 was digested with NcoI and KpnI and ligated to the same site of DQE—61 to construct pSPB14439.
  • pSPB14439 was transformed into Competenthigh JM109 (T OYO BO).
  • This E. coli transformant was cultured by the method described in Example 5 to obtain a crude enzyme solution. Using this, glycosyltransferase activity using chalcone as a substrate was measured by the method described in Example 5.
  • pSPB1478 A co-expression binary vector (pSPB1478) that suppresses the expression of the CHI-A gene, which encodes a protein having the following expression, was constructed.
  • the production of pSPB1478 was performed as follows in the same manner as in Example 6.
  • pSPB1601 was digested with Ascl and then dephosphorylated.
  • the S12A2 gene inserted into the pB1uescript II (sk-) manoretiter roning site was inserted into BamHI (5 'end of cDNA) and Kpnl (cDNA). At the 3 'end) to obtain an S12A2c DNA fragment.
  • the terminator of MAC1 motor, S12A2 gene and mannopine synthase gene was added on the plasmid vector pUCAA.
  • An expression cassette for the S12A2 gene consisting of one vector was constructed with the BamHI cleavage site of the vector at the 5 'end and the Kp ⁇ I cleavage site at the 3' end. The entire S122 ⁇ 2 expression cassette was excised from the pUCAA vector by AscI digestion.
  • the S12A2 expression cassette excised as described above was inserted into the AscI cleavage site of pSPB161 as described above in the same direction as the petunia CHI expression suppression cassette, that is, both expression force sets.
  • the vector was inserted such that the LB side of the vector was upstream, and the resulting plasmid was designated as pSPBl478.
  • a co-expression vector to be suppressed was constructed.
  • verbena a co-expression vector that suppresses CHI derived from Bavena (Tapian (registered trademark)) and a co-expression vector that suppresses both gene expression of CHI and F3H (Hanatemari (registered trademark)) It was constructed.
  • M13RV Primer (sequence) was used for pSPB266, which was obtained by cloning the cDNA of Torenia F 3H into pBluescriptll (SK—). PCR was performed using a combination of No. 48) and ThF3H_SalIlprimer (SEQ ID NO: 41) to obtain a ThF3H-1 fragment. Similarly, PCR was performed using a combination of Reverse primer and ThF3H_SalI2primer (SEQ ID NO: 42) to obtain a ThF3H-2 fragment.
  • Th F 3 H—1 fragment ⁇ Th F 3 H '-2 fragment was TA cloned using TOPO TA cloning kit (Invitrogen), and the former was cut out with S ac I and S a 1 I, and about 0.7 A 5 kb fragment Th F 3H-1 ′ was used. On the other hand, the latter was excised with BamHI and Sa1I to obtain an approximately 0.9 kb fragment ThF3H-2. 1) 1; DNA containing a promoter obtained by digesting £ 6 with 11 ind III and Eco RI was inserted into Hind III and Eco RI sites of pUCAA.
  • This fragment is digested with BamHI and SacI to construct a pSFL308 by ligation of a DNA fragment of about 3.8 kb and ThF3H-1 'and ThF3H-2' fragments. did.
  • this pSFL308 has a structure having dsF3H and one NOS terminator under the EL235S promoter.
  • Approximately 2.7 kb fragment obtained by digesting pSFL308 (ds ThF3H) with Ascl was blunted, and then introduced into the SmaI site of pBI NP LUS to create pSPB2218. did.
  • T170 gene cassette sandwiched between the Mac promoter and the mass terminator is excised from pSPB1342 with AscI and inserted into the AscI site of pSPB22188. Introduced, a binary vector was constructed in which the two genes T170 and dsF3H were oriented in the same direction (pSPB2223).
  • ThF3H-SalIl 5'-ttctctgtcgacgcccattgcc-3 '(SEQ ID NO: 41)
  • ThF3H-SalI2 5'(SEQ ID NO: 42)
  • Verbena petal cDNA library (Plant Cell Physiol. 44 sl22 (2003)) was screened using the petunia F 3 H gene as a probe and the method described in Example 2 was used to screen the verbena F 3 H gene. I got
  • Verbena petal cDNA library (Plant Cell Physiol. 44 sl22 (2003)) was screened using the petunia F 3 H gene as a probe and the method described in Example 2 was used to screen the verbena F 3 H gene. I got
  • Verbena CH I cDNA gene was cloned into pBluescript II (sk—), pS PB2109 was used for type I, Ml 3RV Primer (SEQ ID NO: 48) and Tp CH PCR was performed with the combination of I_XbaI2primer (SEQ ID NO: 45) to obtain a TpCHI-1 fragment.
  • PCR was carried out using a combination of TpCHI—Sa1Iprimer (SEQ ID NO: 43) and TpCHI—Xballrimer (SEQ ID NO: 44) to obtain a TpCHI-2 fragment.
  • TpCHI-1 After cloning the T p CHI-1 fragment and the ⁇ CH I-2 fragment using Zero Blunt TOPO PCR CI oning Kit (Invitrogen), the former was cut out with BamHI and XbaI, and The 68 kb fragment TpCHI-1 ′ was used. On the other hand, the latter was cut out with Xbal and Sail to obtain a fragment of about 0.5 kb, TpCHI-2.
  • pSPB1486 takes a structure having a dsCHI and a NOS terminator under the EL235S promoter. After digestion of this pSPB1486 with Pacl, the two types of oligo DNAs, PacI—FseIF (SEQ ID NO: 46) and Paccl—FseIR (SEQ ID NO: 47), are annealed. P S with the introduction of a P ac I -F se I adapter and a new F se I site PB 2508 was prepared.
  • TpCHI-XbaI2 5 '-atttctagagcaggtccgacaat-3' (SEQ ID NO: 45)
  • PacI-FseIR 5 -ctggccggcctcagtgcagttaat-3 ( eye C ⁇ 1 J number ⁇ ⁇ 47)
  • a 2.9 kb gene fragment obtained by digesting PSPB2501 with PacI was introduced into the PacI site of pSPB2508 to construct pSPB2504.
  • the pSPB1500 of Example 6 was excised with AscI, and the resulting 3.7 kb T170 gene cassette was introduced into the Ascl site of pSPB1486 to allow T170 A binary vector pSPB1287 carrying the two gene cassettes was constructed.
  • the pSPB1500 of Example 6 was cut out at the blunt-ended site with Ascl, and the resulting 3.7 kb T170 gene set was excised. After end blunting, insert to construct PSPB 2505. For this work It becomes possible to excise the T170 gene cassette using FseI.
  • PSPB2507 was constructed by introducing a 3.7 kb T170 gene cassette obtained by Fspel digestion of PSPB2505 into the Fsel site of PSPB2504.
  • pSPB2507 has a structure in which dsCHI and three gene cassettes of T170 and dsF3H are arranged in the same direction.
  • p SPB 1287 was introduced into Agrobacterium mummefaciens Ag 10 strain (Biotec hnology), and the bar was purified by the method of Tamura et al. (Tamura et al. (2003) Plant Ce 11 Rep. 21, p459-466). Transformation was performed on bena (cultivar Hanatemari Scarlet).
  • Example 7 seven independent transformed verbenas were obtained.
  • the same RT-PCR reaction as in Example 7 was performed using the RNA of the verbena petals.
  • T170 mRNA use the same primers of T170F and T170R as in Example 7, and the expression level of Verbena CHI mRNA was TpCHI_Sa. It was confirmed by amplification of a gene fragment of about 0.5 kb using 1 I pri me r (SEQ ID NO: 43) and TpCH I—Xb allpri me r (SEQ ID NO: 44).
  • T170 mRNA was detected in seven Verbena petals, and a decrease in mRNA expression level of Verbena CHI was observed in three Verbena petals.
  • Example 7 As described in Example 7, pSPB2108 produced in Example 11 was introduced into Agrobacterium mutmefaciens Ag10 strain, and Petunia PL strain was transformed.
  • T128 mRNA was detected in 19 petunia petals, and a decrease in CHI mRNA was observed in 26 petunias.
  • Flavonoids were extracted from petunia petals from which T128 mRNA was detected in the same manner as in Example 7, and analyzed by HP LC in the same manner as in Example 5. Two of the petunias expressing T128 had peaks corresponding to the chalcone 2'-glucoside and had the same absorption spectrum. Further, when the extract of petunia petals expressing T128 and the glycoside at chalcone 2'-position were analyzed by co-chromatography, the peaks of both were completely coincident.
  • T128 results indicate that the expression of T128 resulted in the synthesis of chalcone 2 'glycosides, that is, T128 encodes a chalcone 2' glycosyltransferase that functions in plants.
  • T128 encodes a chalcone 2' glycosyltransferase that functions in plants.
  • the approximately 2.6 kb gene cassette obtained as a result of digestion of p S PB 1498 (ds PhF 3H) with P acl was introduced into the P ac site of a binary vector p SPB 2108 having T 128 and ds CHI.
  • a vector pSPB1499 having a combination of three genes of 128'dsCHI'dsF3H was constructed.
  • T128 gene cassette sandwiched between the Mac promoter and the mass terminator was excised from pS ⁇ 2108 with AscI, and inserted into the Ascl site of PSPB2218 created in Example 23. Introduce two genes, T128 and dsF3H A binary vector carrying the same orientation was constructed (PSPB 2224).
  • PSPB 2224 A binary vector carrying the same orientation was constructed (PSPB 2224).
  • PSPB1499 was introduced into Agrobacterium mutmefaciens Ag 10 strain and transformed into Petunia PL strain.
  • Example 28 Construction of plant expression vector for CGT 93 2
  • PSPB 1498 (ds PhF 3H) was digested with Pac1 and the 2.6 kb gene cassette obtained as a result of digestion with Pac1 was introduced into the Pac site of the binary single vector PSPB1494 having CGT93 and dsCHI.
  • PSPB 1498 (ds PhF 3H) was digested with Pac1 to obtain a 2.6 kb gene cassette and a binary vector containing S6B11 and dsCHI. It was introduced into the Pac site of PS PB1335 to construct a binary vector pSPB2205 having a combination of three genes of S6B11.dsCHI * dsF3H.
  • pSPB2205 was introduced into Agrobacterium mummefaciens Ag10 strain and transformed into Petunia PL strain as described in Example 7.
  • Example 34 Construction of Cyclamen Petal cDNA Library
  • a cDNA library was constructed in the same manner as in Example 1 from 5 g of fresh petals of yellow cyclamen. The resulting library one had summer from 1. 75 X 10 6 plaque-follower timing. Unit (pfu).
  • Example 35 Acquisition of chalcone glycosyltransferase gene YC y3-12
  • YCy 3-12 gene in Escherichia coli was performed using the same He QIA expressionist (QIAGEN) as described in Example 4.
  • the primers YCy3—12P1 (SEQ ID NO: 53) and YCy3_12 The same PCR reaction as in Example 4 was performed using P2 (SEQ ID NO: 54).
  • the resulting PCR product was subcloned into pCR—B1ntII—TOPOvector (INVITROGEN) by the method recommended by the manufacturer.
  • the plasmid pTOPO—YCy3-12 thus obtained was used. The absence of errors due to the PCR reaction was confirmed by determining the nucleotide sequence. Approximately 1.8 Kb fragment obtained by treating pTOPO-YCy3-12 with Ncol and HindiII was ligated to the NcoI and HindiII sites of the pQE-61 vector.
  • the plasmid pQE-YCy3-12 was obtained.
  • pQE—YCy3—12 was transformed into Competen thi gh JM109.
  • This E. coli transformant was cultured by the method described in Example 5 to obtain a crude enzyme solution. Using this, the glycosyltransfer activity using chalcone as a substrate was measured by the method described in Example 5.
  • the present invention is applied to industries such as flower gardening, plant breeding, agriculture, and biotechnology. Sequence Listing Free Text SEQ ID NO: 3; Ipomoea purpurea 3GGT PN3GGTF
  • SEQ ID NO: 9 Scutellaria baicalensis GT SBGTF
  • SEQ ID NO: 13 Amino acid sequence of protein having 3-darcoside glycosyltransferase activity.
  • PacI-FseIR adapter inserted in a vector SEQ ID NO: 48; M13RV PCR Primer SEQ ID NO: 49; BamHI-CHI-F PCR Primer

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Abstract

本発明は、カルコン類の２'位の水酸基に糖を転移する反応を触媒する酵素及びその遺伝子、好ましくはカルコン類の２'位の水酸基に特異的にグルコースを転移する反応を触媒する酵素及びその遺伝子を提供する。さらに、本発明は、当該糖転移酵素遺伝子を用いて花色を改変させた植物体を提供する。カーネーション等の花弁ｃＤＮＡライブラリーから糖転移酵素の保存領域に対応したプローブを用いて、当該保存領域に対応する塩基配列を有する糖転移酵素遺伝子を数十種クローン化した。さらに、当該糖転移酵素遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、その中に、当該大腸菌の抽出液中にカルコンの２'位にグルコースを転移する活性、すなわちカルコン２'位糖転移酵素活性を確認し、クローン化した遺伝子が２'位糖転移酵素をコードすることを確認した。

Description

明 細 書 新規糖転移酵素遺伝子 技術分野
本発明はカルコン類に糖を転移する活性を有する酵素の遺伝子、 およ び当該糖転移酵素を利用して花色が変換された植物に関するものである, 更に詳しくは、 カルコン類の 2 ' 位配糖体を合成する活性を有する酵素 遺伝子、 好ましく はカーネーショ ンまたはシクラメン由来のカルコン類 の 2 ' 位配糖体を合成する活性を有する酵素遺伝子、 及びその利用に関 するものである。 背景技術
花色は人が花卉を鑑賞あるいは購入する際に重要な形質であり、 古く から様々な色の花が育種されてきた。 単一の種ですベての色の花をもつ 場合はむしろ稀であるが、 これは花色と して発現する色素 （花色素） の 生合成が遺伝的に規定されていることによる。 交配育種では利用できる 遺伝子資源が交配可能な近縁種に限定されているため、 交配によって目 的の種においてすベての色の花を作ることは実質的に不可能であった。 最近になって、 遺伝子組換え技術を利用して、 花色素の合成に係る酵素 の遺伝子をある植物から取得し、 当該遺伝子を別の種で発現することに より花の色を改変することが可能となった （例えば、 非特許文献 1、 非 特許文献 2参照） 。
花の色のうち、 橙、 赤、 紫、 青は主にアントシァニンと呼ばれるフラ ボノィ ドに由来する。 黄色は、 カロチノィ ド、 ベタ レインといったフラ ボノィ ド以外の化合物に由来することが多いが、 一部の植物種の黄色は フラボノィ ドに由来する。 たとえば、黄色カーネーショ ンには 4， 2 ' ， 4， ， 6 ' —テ トラヒ ドロキシカルコン （以下、 「THC」 とする。 ） の 2 ' 位配糖体が花弁中に存在することが知られている （例えば、 非特 許文献 3参照） 。 カルコン類と しては、 THC、 ブティン、 イソリ クィ チゲニン等の配糖体が知られており、 カーネーショ ン、 アサガオ、 ボタ ン、 アスター、 ムギワラギクには THCが、 キンギヨ ソゥゃスターチス には 3 , 4， 2 ' ， 4 ' ， 6 ' —ペンタヒ ドロキシカノレコンが、 コスモ ス、 キクイモにはブティンが、 ダリアにはブティンおよびイソリ クイチ ゲニンをァグリ コンとする配糖体が含まれている。 また、 キンギヨ ソゥ などの限られた種にはォーレゥシジン、 ブラックテアチンなどのォー口 ン類と呼ばれる黄色の花色素が存在するが、 オーロンの吸収極大は 3 9 9 n mから 4 0 3 n mであるのに対し、 カルコンの吸収極大は 3 6 5 η mから 3 8 2 n mであるから、 両者の色調は異なる （例えば、 非特許文 献 4参照） 。 一般にカルコン類、 オーロン類とも植物細胞中では糖転移 された配糖体になることにより安定化され液胞中に移行し蓄積される。 アントシァニンの生合成経路はよく研究されており、 アントシァニンの 生合成に関与する酵素やそれらをコードする遺伝子が知られている （例 えば、 非特許文献 5参照） 。 また、 オーロンの生合成に関わる酵素とそ の遺伝子についても報告されている （例えば、 非特許文献 6参照） 。 フラボノィ ドの生合成経路は高等植物には広く存在しており、 また、 種間で共通している。 THCは、 3分子のマロニル C o Aと 1分子のク マロィル C o Aからカルコン合成酵素の触媒作用により生合成される。 図 1に示すように、 T H Cは薄い黄色を呈するが、 植物においては、 力 ノレコンィソメラーゼにより速やかに無色のナリ ンゲニンに変換される。 また、 THCは中 付近の p Hではきわめて不安定であり、 自発的に閉 環してナリ ンゲニンに変換される。 THCが植物細胞中で安定に存在す る、すなわち黄色を安定に呈するためには THCの 2 '位に糖転移され、 液胞に輸送されることが必要であるとされている。 したがって、 TH C の 2 ' 位に糖転移する酵素の遺伝子を得ることができれば、 この酵素遺 伝子を植物において発現し、 THC配糖体を蓄積させ、 黄色の花を作成 できると考えられていた （例えば、 非特許文献 7参照） 。
しかしながら、 THCをはじめ、 カルコン類の 2 ' 位の水酸基に糖、 例えばグルコースを転移する反応を触媒する酵素の活性を測定すること ができなかった。 従来カルコン糖転移酵素の活性測定には、 UD P—グ ルコースを放射性同位元素で標識し、 酵素反応後、 生成した配糖体を酢 酸ェチル抽出した有機層の放射活性を測定するという方法 （例えば、 非 特許文献 8参照） が用いられていた。 しかし、 THCの配糖体はそのほ とんどが水層に移動するため、 放射活性でカウントされていたのは未反 応でわずかに有機層に溶出したフリ一の UD P—グルコースの可能性が 高く、 本来の T H C糖転移酵素活性を正確に測定できないという問題が あった。 従って、 この糖転移反応を触媒する酵素が精製できなかったの で、 当該糖転移酵素をコー ドする遺伝子がクローン化できなかった。
THCの 2， 位の水酸基がメチル化された化合物が蓄積した場合も、 花弁は淡い黄色となることは知られているが、 このメチル化を触媒する 酵素やその遺伝子については知られていない。 ダリア、 コスモスなどの 黄色の品種には 6 ' —デォキシカルコンが含まれる。 マメ科植物におい ては、 6 ' —デォキシカルコンは 5—デォキシフラボノイ ドの前駆体で あり、 カルコンシンターゼ （CH S ) とカルコンリ ダクターゼ （CHR ) の触媒作用により生合成される。 ペチュニアにアルフアルファの C H R遺伝子を導入したところ、 ブティンなどの 6 ' —デォキシカルコン類 が生成したことが報告されているが、 当該 C HR遺伝子を白い花をもつ ペチュニアに導入した場合、 つぼみの段階ではごく薄い黄色が見られた が、 開花時にはほとんど白であり、 産業上有用な黄色の花を作出するに 至らなかった （例えば、 非特許文献 9参照） 。
フラボノィ ドをはじめ多様な花色素化合物の糖転移反応を触媒して配 糖体を生成する酵素は、 糖転移酵素と呼ばれ、 植物はァグリ コン及び転 移する糖の種類に特異性を有する多様な分子種の糖転移酵素およびそれ らをコ一ドする遺伝子を持っている。 グルコース転移酵素は通常 U D P 一グルコースをグルコース供与体と して利用するので、 グルコース転移 酵素はそのアミ ノ酸配列中に U D P -グルコースに結合するモチーフを 含んでいる （例えば、 非特許文献 1 0参照） 。 このモチーフを有する糖 転移酵素の遺伝子は、 すでにゲノムの全構造が明らかになつているァラ ビドプシスには、 9 9種あることが知られている （例えば、 非特許文献 1 1参照） 。 また、 いく つかの糖転移酵素のアミノ酸配列と機能が解明 されている。 フラボノイ ドあるレ、はアントシァニジンの 3位の水酸基に グルコースを転移する反応を触媒する酵素 （U D P—グルコース ： フラ ボノイ ド 3 —ダルコシル トランスフェラーゼ） の遺伝子は、 ト ウモロ コ シ、 リ ンドウ、 ブドウなどから得られている （例えば、 非特許文献 1 1 参照） 。 また、 アン トシァニンの 5.位の水酸基にグルコースを転移する 反応を触媒する酵素 （U D P _グルコース ： アン トシァニン 5 —ダルコ シル トランスフェラーゼ） の遺伝子は、 シソ、 バーべナなどから得られ ている （例えば、 非特許文献 1 2参照） 。
これらのグルコース転移酵素のァミノ酸配列の解析から、 グルコース 転移反応を触媒するという同一機能を有するタンパク質は植物種が異な つていてもァミ ノ酸配列は類似していること、 すなわちファミ リーを形 成することが知られている （例えば、 非特許文献 1 1参照） 。 つまり、 すでにアミノ酸配列とグルコース転移反応を触媒することが明らかとな つているグルコース転移酵素と同一機能を有する酵素 （オルソログ） を 他の植物種から得ることについては報告がある。 たとえば、 ペチュニア の U D P—グノレコース ： アン トシァニン 5 —グノレコシノレ トランスフェラ ーゼの遺伝子は、 シソの U D P―グルコース ： アン トシァニン 5 —グル コシル トランスフエラーゼの遺伝子を用いてクローニングされた （例え ば、 非特許文献 1 3参照） 。 しかしながら、 現在の技術水準からしても、 ァミノ酸配列あるいは機能の明らかではない糖転移酵素の遺伝子を取得 することには、 多大の試行錯誤と困難が伴う。 特に、 ァラビドプシスの 花は白であり、 カルコン 2， 位配糖体の蓄積は報告されていない。 した がって、 すでにゲノム構造が決定されているァラビドプシスの糖転移酵 素遺伝子の情報を利用して本遺伝子のクローニングを行う ことはできな レ、。 カーネーショ ンに関しては、 カルコンイソメラーゼとジヒ ドロフラ ボノール還元酵素遺伝子に変異が生じた際に T H C配糖体が蓄積し黄色 を呈することが報告されている。 また、 シクラメンにおいてはカルコン イソメラーゼの変異により THC配糖体が蓄積すると考えられている。 同様にカルコン 2 ' 位配糖体が蓄積する植物と してはペチュニア花粉， シャクャク、 ムギワラギク、 ェゾギク、 シクラメン、 ツキミ ソゥ、 ニチ 二チソゥなどが知られており、 また、 多くの植物、 特に薄い黄色の花を 呈する植物にも THじの 2 ' 位に糖を転移する酵素の遺伝子が発現して いると考えられる。
非特許文献 1 ； Plant Cell Physiol.39, 1119(1998)
非特許文献 2 ； Curr. Opin. Biotechnol.12, 155(2001)
非特許文献 3 ； Phytochemistry, 5， 111 (1996)
非特許文献 4 ； バイオホルティ 1 49-57(1990)誠文堂新光社
非特言午乂'献 5. ； Comprehensive Natural Products Chemistry, vol I ( ed. Sankawa)pp713-748, Elsevier, Amsterdam ( 1999)
非特許文献 6 ； Science, 290, 1163 (2000)
非特許文献 7 ； Biotechnology of Ornamental Plants (Edited by Gen eve, Preece and Merkle) p259~294, CAB International Wallingford, UK (1997)
非特許文献 8 ； Phytochemistry, Vol.17， pp.53-56, (1978)
非特許文献 9 ； Plant J.13, 259(1998) 非特許文献 1 0 Plant Physiol.112, 446(2001)
非特許文献 1 1 J. Biol. Chem.276, 4338, (2001)
非特許文献 1 2 J. Biol. Chem.274, 7405, (1999)
非特許文献 1 3 Plant Mol Biol.48， 401-11 (2002) 発明の開示
本発明は、 カルコン類の 2 ' 位の水酸基に糖を転移する反応を触媒す る酵素及びその遺伝子、 好ましく はカルコン類の 2 ' 位の水酸基に特異 的にグルコースを転移する反応を触媒する酵素及びその遺伝子を提供す る。 さらに本発明は当該糖転移酵素遺伝子を用いて花色を改変、 好まし くは黄色に変化させた植物体を提供する。
前述のように、 カルコン 2 ' 位糖転移酵素の性質は知られておらず、 酵素が精製されたり、その遺伝子がクローニングされたこともなかった。 発明者らは、 カーネーショ ンの花弁 c DNAライブラリ一から糖転移酵 素の保存領域に対応したプローブを用いて、 当該保存領域に対応する塩 基配列を有する糖転移酵素遺伝子を数十種クローン化した。 さらに、 当 該糖転移酵素遺伝子群を各々大腸菌で発現させ、 その中に、 当該大腸菌 の抽出液中にカルコンの 2， 位にグルコースを転移する活性、 すなわち カルコン 2 ' 位糖転移酵素活性を確認し、 クローン化した遺伝子が 2 ' 位糖転移酵素をコードすることを確認して、 本発明を完成した。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に対 して 1若しく は複数個のァミノ酸が欠失、 置換及びノ若しくは付加され たアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性 を有するタンパク質をコー ドする遺伝子、
( 2 ) 配列番号 1に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D NAとス トリ ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
( 3 ) 配列番号 1 5に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に 対して 1若しく は複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及び 若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2， 位に糖を転移する活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
( 4 ) 配列番号 1 4に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス トリ ジヱン 卜な条件下でハイブリダィズし、 かつカルコン類 の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコ一ドする遺伝子、
( 5 ) 配列番号 1 7に記載のアミノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に 対して 1若しく は複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及び Z若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2， 位に糖を転移する活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
( 6 ) 配列番号 1 6に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リ ジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつカルコン類 の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
( 7 ) 配列番号 1 9に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に 対して 1若しく は複数個のアミノ酸が欠失、 置換及び Z若しくは付加さ れたアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2， 位に糖を転移する活 性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子、
( 8 ) 配列番号 1 8に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス トリ ジヱン トな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類 の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、
( 9 ) 配列番号 2 1に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミ ノ酸配列に 対して 1若しく は複数個のァミノ酸が欠失、 置換及び Z若しく は付加さ れたアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活 性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子、
( 1 0 ) 配列番号 2 0に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からな る DNAとス ト リ ジェントな条件下でハイブリ ダイズし、 かつカルコン 類の 2 '位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子、
( 1 1 ) 配列番号 5 6に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列 に対して 1若しく は複数個のァミ ノ酸が欠失、 置換及び Z若しく は付加 されたアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する 活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
( 1 2 ) 配列番号 5 5に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からな る D N Aとス ト リ ジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつカルコン 類の 2 '位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
( 1 3 ) 前記 （ 1 ) から （ 1 2 ) のいずれか一項に記載の遺伝子を含 んでなるベクター。
( 1 4) 前記 （ 1 3 ) に記載のベクターにより形質転換された宿主細 胞。
( 1 5 ) 前記 （ 1 4 ) に記載の宿主細胞を培養又は生育させ、 当該宿 主細胞からカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質 を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法。
( 1 6 ) 前記 （ 1 5 ) に記載の方法で得られた.タンパク質。
( 1 7) 前記 （ 1 ) から （ 1 2 ) のいずれか一項に記載の遺伝子が導 入された植物体若しく は当該植物体の子孫となる植物体、 又はそれら植 物体の組織。
( 1 8 ) 前記 （ 1 7 ) に記載の植物体から採取された切り花。
( 1 9 ) 前記 （ 1 ) から （ 1 2 ) のいずれか一項に記載の遺伝子を植 物体に導入及び発現して花色が改変ざれた植物体、 及び当該植物体の子 孫となる植物体。
( 2 0 ) 改変された花色が黄色であることを特徴とする前記 （ 1 8 ) に記載の植物体。
本発明により新規な遺伝子および酵素等が提供され、 カルコン類の 2 ' 位の水酸基に特異的に糖を転移させることができ、 カルコン類を安定 化させることができる。 本発明は、 花色を改変させた植物体の作製に好 適に用いられる。 図面の簡単な説明
第 1図は、 カルコン 2， 位糖転移酵素によるカルコン 2 ' 位配糖体の 合成経路を示す図である。
第 2図は、 植物由来の糖転移酵素のアミノ酸の配列のァライメントを 示す図である。 矢印で示した部分のァミノ酸配列に相当する塩基配列を プライマーと して用いた。 これらによ り増幅される部分を GT保存領域 と して実施例 2のプローブに用いた。 四角で囲んだ部分は各 GT間の配 列に相同性のある部分である。 略号は、 次の通りである。 MG 3 GGT ： アサガオ 3 GG T ; GGT 7 : リ ンドウ 3 GT ; HGT 8 : バー べナ 5 GT ; S b U F G T ： コガネバナ G T。 発明を実施するための最良の形態
本発明の遺伝子と しては、 例えば配列番号 2、 1 5、 7、 9、 2 1、 5 6のいずれかに記載のァミ ノ酸配列をコードするものが挙げられ る。 しかしながら、 複数個のアミノ酸の付加、 欠失または他のアミ ノ酸 に置換されたアミ ノ酸配列を有するタンパク質も、 もとのタンパク質と 同等の酵素活性を維持することが知られている。 従って本発明は、 カル コン 2 ' 位糖転移酵素活性を保持しているタンパク質である限り、 配列 番号 2、 1 5、 1 7、 1 9、 2 1、 5 6に記載のアミノ酸配列に対して 1個または複数個のァミノ酸配列の付加、 欠失および または他のァミ ノ酸に置換されたァミノ酸配列を有するタンパク質および当該タンパク 質をコー ドする遺伝子も本発明に属する。 なお、 複数個とは、 2〜 3 0 個、 好ましくは 2〜 9個をレ、う。 本発明はまた、 配列番号 1、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 5 5のいずれ かに記載の塩基配列と相補的な塩基配列を有する DN Aに対し、 ス ト リ ンジェン トな条件下でハイブリダィズし、 かつカルコン 2 ' 位糖転移酵 素活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子に関するものである。 す なわち、 配列番号 1、 1 4、 1 6、 1 8、 2 0、 5 5のいずれかに記載 の塩基配列と相補的な塩基配列を有する DN Aに対しス トリンジェン ト な条件でハイブリ ダィズし、 かつカルコン 2， 位糖転移酵素活性を有す るタンパク質をコードする遺伝子も、 本発明の技術的範囲に属する。 ハ イブリダイゼーションの条件はプローブに用いる D N Aの長さ及び塩基 組成によって異なるから、 以下に数値によって示す具体的な条件に限定 されるものではないが、 ここでいう 「ス ト リ ンジェントな条件」 とは、 例えば、 好ましく は 5 X S S C、 3 7 °C、 より好ましく は 5 X S S C、 5 0°C、 さらに好ましくは 2 X S S C、 6 5°Cである。 ここで、 5 X S S C、 3 7 °Cの条件は、 実施例 2に示すよ うに、 アン トシァニジン類の 糖転移酵素遺伝子の保存領域をプローブと して、 本発明のカルコン 2 ' 位糖転移酵素のようなホモログとハイプリダイズさせる条件と して好ま しぐ適用でき、 5 X S S C、 5 0。Cの条件は、 本発明のカーネーショ ン 由来のカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子をプローブと して他起源のカル コン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子 （オルソログ） をハイブリダィズさせる条 件と して好ましく適用できる。
上述のようなハイプリダイゼーショ ンによって選択される遺伝子と し ては、 天然由来のもの、 例えば植物由来のもの、 例えばシクラメン由来 の遺伝子が挙げられるが、 植物由来に限定されるものではない。 すなわ ち、 本発明のカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子は、 カーネーショ ン由来 のカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子に限定されるものではなく、 当該遺 伝子のオルソログであるシクラメン、 シャクャクなどのカルコン類の 2 ' 位配糖体を含む植物に由来するカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子であ つてもよく、 当該遺伝子のいずれでも黄色の花を育種するのに用いるこ とができる。 また、 ハイブリ ダィゼーシヨ ンによって選択される遺伝子 は c D N Aであってもよく、 ゲノム D N Aであってもよレヽ。
糖転移酵素の保存領域の相同性を有する遺伝子は実施例に示すように 例えばカーネーショ ン花弁から作成した。 D N Aライブラリーのスク リ 一二ングによって得られる。 また、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列が 改変されたァミノ酸配列を有する糖転移酵素をコー ドする D N Aは、 配 列番号 1に記載の塩基配列を有する D N Aを用いて、 公知の部位特定変 異誘発法や P C R法によって合成することができる。 また、 配列番号 1 5に記載のァミノ酸配列が改変されたァミノ酸配列を有する糖転移酵素 をコードする D N Aは、 配列番号 1 4に記載の塩基配列を有する D N A を用いて、 公知の部位特定変異誘発法や P C R法によって合成すること ができる。 また、 配列番号 1 7に記載のアミノ酸配列が改変されたアミ ノ酸配列を有する糖転移酵素をコードする D N Aは、 配列番号 1 6に記 載の塩基配列を有する D N Aを用いて、 公知の部位特定変異誘発法や P C R法によって合成することができる。 また、 配列番号 1 9に記載のァ ミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコードする D N Aは、 配列番号 1 8に記載の塩基配列を有する D N Aを用いて、 公 知の部位特定変異誘発法や P C R法によって合成することができる。 ま た、 配列番号 2 1 に記載のアミノ酸配列が改変されたアミノ酸配列を有 する糖転移酵素をコー ドする D N Aは、 配列番号 2 0に記載の塩基配列 を有する D N Aを用いて、 公知の部位特定変異誘発法や P C R法によつ て合成することができる。 また、 配列番号 5 6に記載のアミノ酸配列が 改変されたアミノ酸配列を有する糖転移酵素をコー ドする D N Aは、 配 列番号 5 5に記載の塩基配列を有する D N Aを用いて、 公知の部位特定 変異誘発法や P C R法によって合成することができる。 例えばアミノ酸 配列を改変したい D N A断片を c D N Aまたはゲノム D N Aの制限酵素 処理によって得、 これを铸型にして、 所望のアミノ酸配列の改変に対応 したプライマーを用い、 部位特異的変異誘発または: P C R法を実施し、 所望のァミノ酸配列の改変に対応した D N A断片を得ることができる。 その後、 この改変を導入した D N A断片を目的とする酵素の他の部分を コードする D N A断片と連結すればよい。
あるいはまた、 短縮されたァミノ酸配列からなる酵素をコードする D N Aを得るには、例えば目的とするアミ ノ酸配列より長いアミノ酸配列、 例えば全長ァミノ酸配列をコードする D N Aを所望の制限酵素によ り切 断し、 その結果得られた D N A断片が目的とするァミノ酸配列の全体を コードしていない場合は、 不足部分のアミノ酸配列に対応する D N A断 片を合成し、 連結すればよい。
このようにして得られた糖転移酵素遺伝子を大腸菌又は酵母での遺伝 子発現系を用いて発現させ、 当該大腸菌又は酵母の抽出液中のカルコン 2 ' 位糖転移酵素の活性を測定することにより、 得られた糖転移酵素遺 伝子がカルコン 2 ' 位糖転移活性を示すタンパク質をコードすることを 確認することができる。 カルコン 2 ' 位糖転移酵素の活性は、 例えば実 施例 5に記載したように、 ゲル濾過樹脂にカルコン 2 ' 位糖転移酵素の 基質となるカルコン類を吸着させた後、 当該ゲル濾過樹脂を糖転移酵素 遺伝子で形質転換した大腸菌又は酵母の抽出液と反応させ、 生成した力 ノレコン 2 ' 位配糖体を高速液体クロマ トグラフィーで分析することによ り測定できる。
さらに、 得られたカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子を適切な宿主細胞 で発現させることにより、 当該遺伝子の産物であるカルコン 2 ' 位糖転 移酵素タンパク質を得ることができる。 あるいはまた、 例えば配列番号 2に記載のァミノ酸配列の全部又は一部を有するタンパク質又はべプチ ドに対する抗体を用いて他の生物由来のカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝 子を発現ク ローユングによって得ることもできる。配列番号 1 5 、 1 7 、 1 9、 2 1、 5 6のアミノ酸配列に関しても同様である。
本発明はまた、 カルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子を含む組換えべクタ 一、 特に発現ベクター、 及び当該ベク ターによって形質転換された宿主 細胞に関するものである。 宿主と しては、 原核生物または真核生物を用 いることができる。 原核生物と しては細菌、 例えばェシエリ ヒア （E s c h e r i c h i a ) 属に属する細菌、 例えば大腸菌 （ E s c h e r i c h i a c o l i ) 、 バシルス （ B a c i 1 1 u s ) 属細菌、 例えば バシノレス . スブチリ ス （B a c i l l u s s u b t i l i s ) など従 来公知の宿主細胞を用いることができる。 真核細胞と しては、 例えば真 核微生物、 好ましくは酵母または糸状菌が使用できる。 酵母と しては例 えば、サッカロ ミセス . セ レビシェ ( S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e ) 等のサッカロ ミセス ( S a c c h a r o m y c e s ) 属酵母が挙げられ、 また糸状菌と しては、 例えばァスペルギルス. ォ リゼ （A s p e r g i 1 l u s o r y z a e ) 、 ァスぺノレギノレス . 二 ガー (A s p e r g i 1 l u s n i g e r ) 等のァスぺノレギノレス （A s p e r g i 1 1 u s ) 属糸状菌、 及びぺニシリ ウム （ P e n i c i 1 1 i urn) 属糸状菌等が挙げられる。 さらに動物細胞または植物細胞も 宿主細胞と して使用でき、 動物細胞と しては、 マウス、 ハムスター、 サ ル、 ヒ ト等の細胞系が使用される。 さらに昆虫細胞、例えばカイコ細胞、 またはカイコの成虫それ自体も宿主と して使用される。
本発明の発現ベクターはそれらを導入すべき宿主の生物種に依存した プロモータ一およびターミネーター等の発現制御領域、 及び複製起点等 を含有する。 細菌用、 特に大腸菌における発現ベクターのプロモーター と しては、 従来公知のプロモーター、 例えば t r cプロモーター、 t a cプロモーター、 1 a cプロモーター等が使用できる。 また、 酵母用プ 口モーターと しては、 例えばダリセルアルデヒ ド 3 リ ン酸デヒ ドロゲナ ーゼプロモーター、 P HO 5プロモーター等が使用され、 糸状菌用プロ モーターと しては例えばアミラーゼ、 t r p C等のプロモーターが使用 できるが、 これらのプロモーターに限定されるものではない。 また動物 細胞用プロモーターと してはウィルス性プロモーター、 例えば S V 4 0 アーリープロモーター、 S V 4 0 レー トプロモーター等が使用される。 発現ベクターの作成は制限酵素、 リガーゼ等を用いて常法に従って行う ことができる。 また、 発現ベクターによる宿主細胞の形質転換も従来公 知の方法に従って行うことができる。
植物の発現べクターの構築は、 例えばァグロバタテリ ゥムを用いる場 合には p B I 1 2 1などのバイナリ一べクターを、 パーティクルガンを 用いる場合には p U C 1 9などの大腸菌べクターを用いることができる < さらに、 当該植物の発現ベクターで形質転換された植物細胞を例えば抗 生物質耐性遺伝子などのマーカー遺伝子を用いて選抜し、 適切な植物ホ ルモン等の条件を用いて再分化させ、 カルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子 で形質転換された植物体を得ることができる。 当該形質転換植物を栽培 することにより、 開花させ、 花色が改変された植物体を得ることができ る。
発現べクタ一によつて形質転換された宿主細胞又は形質転換植物体を 培養又は栽培し、 培養物または植物体等から常法に従って、 例えば、 濾 過、 遠心分離、 細胞の破砕、 ゲル濾過クロマ トグラフィー、 イオン交換 クロマ トグラフィー等によ り 目的とするカルコン 2 ' 位糖転移酵素を回 収、 精製することができる。
本発明はカーネーショ ン、 シク ラメ ンのカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺 伝子のみに限定されるものではなく、 カルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子 の起源と しては、 植物でも動物でも微生物であってもよく、 当該遺伝子 がコー ドするタンパク質がカルコン 2， 位糖転移活性を有していれば同 様に花色変換へ利用できる。 本発明はまた、 カルコン 2 ' 位糖転移酵素 遺伝子の利用に関するものであり、 カルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子を 植物体に導入および発現することによ り、 花色が改変された植物体もし く はその子孫の植物体又はこれら植物体の組織も本発明の技術的範囲で あり、 組織の形態と しては切り花であってもよい。
現在の技術水準をもってすれば、 植物に遺伝子を導入し、 その遺伝子 を構成的あるいは組織特異的に発現させることは可能であるし、 またァ ンチセンス法やコサプレツショ ン法などによって目的の遺伝子の発現を 抑制することも可能である。 形質転換可能な植物の例と しては、 バラ、 キク、 カーネーショ ン、 金魚草、 シクラメン、 ラン、 トルコギキヨ ウ、 フリ一ジァ、 ガーベラ、 グラジオラス、 カスミ ソゥ、 カランコェ、 ユリ、 ペラルゴ二ゥム、 ゼラニゥム、 ペチュニア、 ト レ-ァ、 チューリ ップ、 イネ、 ォォムギ、 小麦、 ナタネ、 ポテ ト、 トマ ト、 ポプラ、 バナナ、 ュ 一カ リ 、 サッマイモ、 タイ ズ、 ァノレファノレファ、 ノレ一ピン、 トウモロ コ シ、 カリ フラワー、 ニチニチソゥなどがあげられるがこれらに限定され るものではない。
また、 花色を改変させる方法の他の実施形態と しては、 上記のよ うに 本発明のカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子を導入すると共に、 併せて T HCがカルコン 2 ' 位配糖体以外の物質に転換される代謝を抑制するよ うな手段を採ることもできる。 例えば、 本発明のカルコン 2 ' 位糖転移 酵素遺伝子を導入すると共に、 CH I遺伝子 （EMBO J 7、1257(1988)) 、 ペチュニアのフラバノ ン 3水酸化酵素遺伝子 （ F 3 H) (Britsh et al. (1993) European J. Biochemistry 217, p745_754) 、 ジヒ ドロフラボノー ル 4還元酵素遺伝子 （D F R) (Beld et al. (1989) Plant Molecular Biology 13,p491_502 ， Huits et al. (1994) Plant J".6, p295 - 310)など の遺伝子群から選ばれる 1種または 2種以上の遺伝子の発現を抑制する 形態を採用してもよい。 実施例 以下実施例に従って、 発明の詳細を述べる。 分子生物学的手法はとく に断らない限り、 W0 9 6 Z 2 5 5 0 0号公報あるいは Molecular Clon ing (Sambrook et. al.し ola spring Harbour Laboratory Press, 1989) iこ 記載されている方法に従った。 実施例 1 カーネーショ ン花弁 c DNAライブラリ一の構築
黄色のカーネーショ ンの新鮮な花弁 5 gから、 R. M c G o o k i n らの Method in Molecular Biology vol.2 (Humana Press Inc.1984)に 羊 細に示されているチォシアン酸グァニジン · 塩化セシウムを用いる方法 で RN Aを取得し、 オリ ゴテックス d T 3 0 (日本ロシュ社） を用いて p o 1 y A + R N Aを精製した。 この p o l y A + R NAから、 c DN A s y n t h e s i s K i t ( S t r a t a g e n e社) およびえ Z A P I I U n i - XR v e c t o r k i t ( S t r a t a g e n e社） を用いて、 c DNAライブラ リーを構築した。 得られたライブラ リーは、 1. 6 x l 05 プラーク ' フォーミ ング . ユニッ ト （ p i a q u e f o r m i n g u n i t ) 力、らなつてレヽた。 実施例 2 完全長カルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子の取得
図 2に示した、 糖転移酵素 （G T) のアミ ノ酸配列を比較し得られた 保存領域 （図 2中、 対合する矢印で示した領域） に相当する塩基配列か らなる DNA断片を増幅し、 これをプローブと して実施例 1で述べた力 —ネーシヨン c DNAライブラリーをスク リーニングした。 ァミノ酸配 列を比較した G Tはアサガオ由来の U D P—グルコース ： アントシァニ ジン 3—ダルコシド糖転移酵素 （ 3 GGT) (配列番号 1 3に記載のァ ミノ酸配列） 、 リ ンドウ由来 UD P—グルコース ： アン トシァニン 3— グノレコシノレトランスフェラーゼ （ 3 GT) (P l a n t C e l l P h y s i o l . 3 7， p p . 7 1 1 ( 1 9 9 6 ) ) 、 ノく一べナ由来 UD p—グノレコース ： アントシァニン 5—ダルコシノレトランスフェラーゼ （ 5 G T) (J. Biol. Chera. , 274, 7405, (1999)) 、 コガネバナ糖転移酵素 （ G T) (Planta 210, 1006-1013 (2000)) 記載のアミ ノ酸配列の 4種であ る。 それぞれ G Tについて、 図 2の逆方向の矢印で示した保存領域を増 幅できるオリ ゴヌク レオチ ドを作製し、 D I G標識システム （ロ シュ ' ダイァグノスティ ックス社） にて製造者が推奨する条件に従い P C Rに よ りラベルした。 この際、 铸型と して 1 n gのそれぞれの c D N Aを含 むプラスミ ド、 プライマーと して各 1 0 0 n gの以下のオリ ゴヌク レオ チドを使用し、 9 5 °C 1分、 5 5 °C 1分、 7 2 °C 2分からなる反応を 1 サイクルと し、 2 5サイクルを行った。 これらの P C R増幅産物を等量 混合したものをハイブリダィゼ一シヨ ンのプローブと して、 実施例 1 に 記載のカーネーショ ン由来の c D NAライブラリーをスク リーニングし た。 保存領域の増幅に使用したプライマーは以下のとおりである。
ォリ ゴヌク レオチド配列
アサガオ 3 G G T
酉己列番号 3 ： 5' -GAA ATG GTC GGA TTG GCT GGG-3'
配歹 IJ番号 4 ： 5' - ACC TCC ACC CCA ACT TTC AGG - 3'
リ ンドウ 3 G T
配歹 IJ番号 5 ： 5' -TGC CTC AAA TGG CTT CAA ACT - 3'
配歹 IJ番号 6 ： 5' -CCA CCT TTC ACC CCA ACC CC-3'
バーべナ 5 G T
配歹 IJ番号 7 ： 5' -TGC CTC GAA TGG TTG AGC ACG-3'
酉己歹 IJ番号 8 ： 5'— CTC TCA CTC TCA CAC CCG— 3'
コガネノくナ G T
酉己歹 IJ番号 9 ： 5' -CAC GAA TGC TTA GCA TGG CTC—3'
配歹 IJ番号 1 0 ： 5' -CTT ATT GCC CAC TGA AAC CCC-3'
ライブラリーのスク リーニングはノンラジオシステム D NA検出キッ ト （ロッシュ . ダイァグノスティ ック社製） を用いて行った。 ハイブリ ダイゼーシヨ ンは、 1 %S D S、 3 0 %ホルムアミ ドを含む 5 X S S C 中で 3 7 °Cで一夜行い、 フィルターの洗浄は 1 X S S C、 1 % S D Sを 用いて 5 5 °Cで 3 0分間行った。約 2 7万プラークをスク リーエングし、 最終的に約 3 0の糖転移酵素遺伝子を含むクローンを得た。 このクロー ンの中から、 実施例 4及び実施例 5に記載した方法でカルコン 2 ' 位糖 転移活性を確認できたク口ーンが 1つ得られ、 該クローンを T 1 7 0 と 名づけ全塩基配列を決定した。 塩基配列の決定は合成オリ ゴヌク レオチ ドプライマ一によるプライマーウォーキング法により行い、 DNA S e q u e n c e r m o d e l 3 1 0 0 ( A p p 1 i e d B i o s y s t e m s社） を用いて決定した。 塩基配列と当該塩基配列がコー ド するアミノ酸配列を配列番号 1及び 2に、 それぞれ示した。 実施例 3 カルコン 2， 位糖転移酵素 T 1 7 0のアミノ酸配列解析
p T 1 7 0は、 4 9 0アミノ酸からなる分子量 5 4. 2 k D aのタン ノ ク質をコードする 1 7 0 9 b pの遺伝子 T 1 7 0を含んでいた。 T 1 7 0がコードするアミノ酸配列を、 すでに報告のある糖転移酵素と比較 したところリ ビングス トーンデージー由来 G T (Plant J.19, 509(1999) ) と 2 5 %、 シソ、 バーべナ由来 5 G Tと 2 1 %の相同性を示した。 使 用したソフ トフェアは Ma c V e c t o r v e r . 6. 0 (O x f o r d M o l e c u l e社） に含まれる C 1 u s t a 1 Wで、 条件は、 M a t r i x B l o s u m : 3 0、 k e t u p l e : l、 G a p p e n a l' t y : 3、 T o p d i a g o n a l s : 5、 W i n d o w S i z e : 5で行った。 B L A S T検索 （検索はデフオル トの条件で実施 し 7こ。 すなわり、 C o m p o s i t i o n— b a s e d s t a t i s t i c s iま、 o n、 C h o o s e I i 1 t e r ttL o w c o m p l e x i t y、 M a t r i x fま B l o s u m 6 2、 G a p c o s t s {ま E x i s t e n c e ： 1 1 E x t e n t i o n : 1 ) では多くの GT に対してホモロジ一を示した。 たとえば、 リ ビングス トーンデージー由 来ベタ二ジン 6 G T (Planta Vol.214, pp.492 (2002) ) に対して 5 5 %、 サリチル酸などで誘導されるタバコ G T (ァクセショ ン番号 A B 0 5 2 5 5 7、 E u r . J . B i o c h e m. V o l . 2 6 8 , p p . 4 0 8 6 ( 2 0 0 1 ) ) に対して 4 5 %、 タバコ NT GT 3 (ァクセション番 号 A B 0 7 2 9 1 8 )に対して 4 4 %のアミノ酸配列の相同性を示した。 同じ機能、 活性を有する酵素はアミノ酸配列が類似しており、 フア ミ リーを形成することが知られているが、 GTにおいても、 図 2に示した アサガオ由来の 3 GGT、 リ ンドウ由来の 3 G T及びバーべナ由来の 5 GT及びコガネバナ G Tはフアミ リ一を形成する。 本発明のカルコン 2 ' 位糖転移酵素のァミ ノ酸配列はこれら 4種の GTのァミノ酸配列とは 低いホモロジ一しか示さず、 このファ ミ リーには属さない。 また、 上記 のリ ビングス トーンデージー由来ベタ二ジン 6 GT、 サリチル酸などで 誘導されるタバコ GT及びタバコ NT GT 3には比較的高いホモロジ一 を示したが、 これらの GTにカルコン糖転移活性は確認されていない。 実施例 4 大腸菌における T 1 7 0遺伝子の発現
T 1 7 0遺伝子の大腸菌での発現は、 T h e Q I A e x p r e s s i o n i s t (Q I AG EN社） を用いて行った。 まず T 1 7 0上の 糖転移酵素遺伝子の開始コ ドンの 5 ' 側に N c o I認識配列を導入する ために、 以下に示す 2種のプライマー T 1 7 0 - c o Iおよび M l 3
M4 を用いて P C R反応を行った。
T170— Ncol (酉己歹 IJ番号 1 1 ) ： 5'— AGT TCA ACC ATG GGC AAA GCA C—3' M13 M4(配列番号 1 2 ) ： 5' - GTT TTC CCA GTC ACG AC - 3'
P C R反応液 （ 2 5 μ 1 ) は、 T 1 7 0 1 0 0 n g , Ι χ Ε χ— T a q b u f f e r (T a k a r a社） ， 0. 2 mM d NT P s , プ ライマー各 0. 2 p m o \ / μ 1 , E x— T a q p o l y m e r a s e 1. 2 5 Uからなる。 反応は、 9 4 °Cで 5分反応させた後、 9 4 °C、 1分、 5 5°C、 1分、 7 2°C、 2分の反応を 2 5サイクル行い、 最後に 7 2 °Cで 7分間処理した。 得られた P C R産物を p C R 2. 1 TO P O v e c t o r ( I N V I T R O G E N社） に製造者が推奨する方法 でサブクローニングした。 このよ うにして得られたプラスミ ド p TO P O— T 1 7 0 と した。 P C R反応によるエラーがないことを塩基配列を 決定することにより確認した。 p Q E 6 0 (Q I AG E N) を N c o l と B g 1 I I で消化した後、 同部位に相補的プライマー p Q E 6 1 - f と p Q E 6 1— r をァニ一リ ングさせたオリ ゴヌク レオチドカセッ トを 揷入して、 新たに MC Sを導入したベクター p Q E— 6 1を作製した。 (pQE61-f) 5， - CATGGGAGGTACCACTAGTGATATCA- 3' (配列番号 3 6 )
(pQE61-r) 5' - GATCTGATATCACTAGTGGTACCTCC-3' (配歹 'J番号 3 7)
p TO P O-T l 7 0を N c o I 、 K p n Iおよび P s t I で制限酵 素処理し得られた約 1. 8 K bのフラグメン トをベクター p Q E— 6 1 の N c o l と K p n l切断部位に連結し、 プラスミ ド p S B 1 4 4 3を 得た。 p S B 1 4 4 3で C o m p e t e n t h i g h J M 1 0 9 ( TOYO B O社） を形質転換した。 実施例 5 T 1 7 0 c D N A組換えタンパク質の糖転移酵素活性の測 定
実施例 4にて得られた大腸菌形質転換株を、 アンピシリ ン 5 0 μ g / m l を含む L B培地 3 m 1 で 3 7 °Cでー晚振と う培養した。 そのうち 2 0 0 μ 1 をアンピシリ ン S O /x g Zm l カザミ ノ酸 0. 5 %を含む M 9培地 1 0 m 1 に加え A 6 0 0 = 0. 6〜： 1. 0に達するまで培養 した後、 I P TG ( I s o p r o p y l - /3 -D- t h i o g a 1 a c t o p y r a n o s i d e ) を終濃度 0. 0 2 mMになるようカ卩え、 さ らに 2 7 °Cで一晩振と う培養し、冷却遠心（ 3 0 0 0 r p m、 1 0分間、 4 °C) によ り集菌した。 菌体を 1 0 m l の緩衝液 （ 3 0 mM
T r i s — HC 1 p H 7. 5、 3 0 mM N a C 1 ) に懸濁し、 超 音波処理により大腸菌を破砕した後、 遠心分離 （ 1 5， 0 0 0 r p m、 1 0分、 4°C) を行い、 得られた上清を粗酵素液と し、 以下の活性測定 に用いた。
THC ( 5 0 0 g Zm 1 エタノール溶液） を蒸溜水で平衡化したゲ ル濾過樹脂、 TOYO P EAR L HW- 4 0 F (TO S OH社） l m 1 に蒸溜水 3 m 1 で希釈しながら負荷した後、 水洗した。 この樹脂 1 0 0 μ 1 に粗酵素液 1 および 5 mM UD P— g l u c o s e
1 0 ^ 1 を加え、 3 0°Cで 2時間反応させた。 遠心上清を除去後、 水洗 し、 0. 1 % T FA (T r i f l u o r o a c e t i c a c i d) を含む 5 0 %ァセ トニ ト リル 3 0 0 μ 1 を加え反応停止させ、 超音波処 理によ り フラボノィ ドを樹脂より遊離した。 1 5， 0 0 0 r p m、 5分、 4 °Cで遠心分離し、 得られた上清をフィルター （ポアサイズ 0. 4 5 μ m、 4 mm M i 1 1 e x— LH、 ミ リポア） を用いて不溶物を除去し て、 液体高速クロマトグラフィーで分析した。 カルコンおよびその配糖 体の分析条件は以下の通りである。
カラムは YMC OD S— A 3 1 2 ( 6 m m X 1 5 0 mm、 株式会 社ヮイエムシ一） を用いて、 移動相には A液と して 2 %酢酸を含む H2 0、 B液と してメ タノールを用い、 B液 1 5 %から B液 4 0 %の直線濃 度勾配 1 5分間の溶出後、 B液 4 0 %で 5分間維持し、 さらに B液 4 0 %から B液 6 2 %の直線濃度勾配 1 0分間の溶出の後、 B液 6 2 %で 2 分間維持した。 流速は 1. O m l /m i n . で行った。 検出は 3 6 O n mにおける吸光度、 及び P DA検出器 S P D— M6 A (島津製作所社） による 2 5 0〜 4 0 0 n mの吸収スぺク トルにより行った。この条件で、 丁1^〇は保持時間 2 7. 3分に溶出され、 その 2 ' 位配糖体は 1 9. 8 9分に溶出されることを THC及び THC 2 ' 位配糖体の標準品を用い て確認した。
T 1 7 0由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応 させたと ところ、 THC (保持時間 2 7. 3分） に加え、 1 9. 8 9分 に溶出される新たな物質が検出された。 これらは p Q E— 6 1ベクター のみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたもの では検出されなかったことから、 T 1 7 0に由来する糖転移酵素によつ て生じた産物と考えられる。
以上の結果から、 T 1 7 0由来の糖転移酵素は T H Cの 2 ' 位の水酸 基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。 実施例 6 T 1 7 0の植物での発現ベクターの構築
T 1 7 0由来のカルコン 2 ' 位糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機 能を明らかにするために、 THCの 2 ' 位に糖を転移する活性を有する タンパク質をコー ドする c D N A T 1 7 0を発現させ、 本酵素と TH Cを基質とするペチュニア由来のカルコンィ ソメラーゼ活性を有するタ ンパク質をコ一ドする C H I遺伝子の 1つである CH I - A遺伝子 （EM BO J 7、 1257 (1988)) の発現を抑制するバイナリーベクター （p S P B 1 3 4 2 ) を構築した。 p S P B 1 3 4 2の作製は以下のように行った。 ペチュニア （品種バカラレッド、 サカタのタネ社） の葉より RN e a s y P I a n t M i n i K i t (Q I AGEN社） を用いて t o t a l RNA を抽 出し、 これより Su p e r S c r i t™ F i r s t -S t r a n d S y n t h e s i s Sy s t em f o r RT— PCR (I nv i t r o g e n社 ) を用いて c DNAを合成した。 この c DNAよりプライマー、 B amH I— CH I— F (配列番号 49) および S a 1— CH I— R (配列番号 50) 、 S a 1 _C H I -F (配列番号 51) および E c o R I—CH I— R (配列番号 52) を用い て PCRによりそれぞれ 0. 61^ 13ぉょび0. 8 k bのペチュニア CH I遺伝子断 片を得た。得られた断片をそれぞれ^ a ΏΗ Iおよび oR I、 Sa i lおよび Ec o lで消化したペチュニア CH I遺伝子断片を作製した。一方 p E 2 1 1 3 (Mitsuhara et al. Plant Cell Physiol. 37， 45-59 1996) はェンハンサ一配列 を繰り返した力リフラワーモザイクウィルス 3 5 S (E 1 23 5 S) プロモーター とノパリンシンターゼ （n o s) ターミネータ一を有する。 p E 2 1 1 3を S n a B Iで消ィ匕し、 B a mH I リンカー （タカラ） を挿入することにより、 pUE 6を 得た。 pUE 6を S a c Iで消化し、 平滑末端化し、 S a 1 I リンカ一（たとえば タカラ社） を挿入した。 このプラスミ ドを H i n d I I I と E c o R Iで消化して 得られる DN A断片のうち E 1 235 Sプロモーターを有する断片を植物形質転 換用バイナリーベクター p B I NP LU S (vanEngelen et al. Plant Mol. Biol. 15， p373 (1995))の H i n d l l l— E c o R Iサイ 卜に挿入した。このプラス ミ ド P S PB 1 76を B a mH Iと S a 1 Iで消化した D N A断片と前述の 2種 のペチュニア CH I遺伝子断片を連結することにより p S PB 1 60 1を得た。こ の P S PB 1 60 1を A s c lで消化後、 脱リン酸ィ匕した。
次に、 p B l u e s c r i p t I I (s k— ) (ストラタジーン社） のマルチク ローニングサイ ト E c o R I—Xh o Iサイ トに揷入されている T 1 70遺伝子 を B amH I (c DNAの 5' 端側） と Kp n l ( c D Ν Αの 3 ' 端側） で消化し 、 約 1. 5 k bの T 1 70 c DNA断片を得た。 p U C A P (van Engelen et al. Transgenic Research 4， 288-290, 1995)の P a c I部位を A s c I リンカーで置 換したプラスミ ドを pUCAA上で、当該 pUCAAの H i n d I I I切断部位を 5 ' 末端、 E c o R I切断部位を 3， 末端として、 MAC 1プロモーター （Plant Mol. Biol. 15, p373(l990)) 、 T 1 70遺伝子及びマンノピン合成酵素遺伝子 （ ma s) ターミネータ一からなる T 1 70遺伝子の発現カセットを構築した （p S PB 1 500) 。
BamHI-CHI-F) 5， -tttggatcctttatattcatgtaatcttagaac -3' (酉己列番号 49) Sal-CHI-R) 5， -tttgtcgacgtttacaacatcaggcccatttg-3' (配列番号 50)
Sal—CHI— F) 5， -tttgtctactttatattcatgtaatcttagaac -3' (酉己歹 IJ番号 5 1 ) EcoRI-CHI-R) 5， -tttgaattctattgattccagcactgcttcag -3' (配列番号 52 ) 上記のようにして構築された T 1 7 0発現カセッ ト全体を A s c I切 断によって回収し、 前述の P S P B 1 6 0 1の A s c I切断部位にペチ ュニァの CH I発現抑制カセッ トと同じ方向、 すなわち両発現カセッ ト ともにバイナリーベクターのレフ トボーダー （L B) 側が上流になるよ うに挿入し、 得られたプラスミ ドを p S P B l 3 4 2 と した。
次に、 p S B P 1 3 4 2を持つァグロバタテリ ゥムを作製し、 リーフ ディスクを用いるァグロバタテリ ゥム法でペチュニア （品種 P L) リー フディスクに形質転換を行った。 形質転換の方法は公知の方法 （Plant J.1994 5 p8l) によつた。 実施例 7 T 1 7 0の植物での発現とフラボノィ ド組成の変化
実施例 6で作製した S P B 1 3 4 2をァグロバタテリ ゥムッメファ シエンス A g 1 0株 (Lazo et al. , Bio /Technology 9， 963 - 967， 199 1) に導入し、 リーフデ スクを用いるァグロバタテリ ゥム法でペチュニ ァ （品種 P L) リーフディスクに形質転換を行った。 ァグロバタテリ ゥムへのプラスミ ドの導入、 形質転換の方法は公知の方法 （Plant J. 1 994 5 p81 ) によった。 品種 P Lはフラボノイ ド 3 ' , 5 ' —水酸化酵 素遺伝子 （Holton et al. (1993) Nature 366, p276 - 279) 、 フラボノィ ド 3 ' 一水酸化酵素遺伝子 （Brugliera et al. (1999) Plant J 19,p441- 4 51) を欠損しているため花色は白ないし薄いピンクである。 なお、 本実 験の目的には使用するペチュニア品種は P Lに限定されるものではない < 上記のようにして 6 1系統の独立した形質転換ペチュニアを得た。 ぺ チュニァ花弁から RN e a s y P l a n t M i n i K i t (Q I AG E N) を用いて t o t a l RNAを得た。 この t o t a l R N A l ju g力 ら S U P E R S C R I P T F i r s t - S t r a n d S y n t h e s i s S y s t e m f o r R T - P C R ( I NV I TR OG E N) を用いて逆転写反応を行い、 さらに E x T a q ( T a k a r a ) を用いて製造者の推奨する方法により R T _ P C R反応を実 施した。 T 1 7 0の mR NAの増幅にはプライマ一 T l 7 0 Fと T 1 7 O Rを、 ペチュニア CH I mR NAの増幅にはプライマー CH I F 1 と CH I R 1を用いた。 各プライマーの配列は以下のとおりである。 T170F :5' - GAGCAAAGCACCGTTCGAGTTG- 3' (配歹 IJ番号 2 2 )
T170R： 5' -CTCCGTACATGATTGCAGAGAGCA-3' (酉己歹【J番号 2 3 )
CHIF1： 5' -GCAAAAATGTCTCCTCCAGTGTCC-3' (配列番号 2 4 )
CHIR1： 5' -ACTTCTCAATGGCACGACCCTC-3' (酉己歹リ番号 2 5 )
その結果、 3 8系統のペチュニア花弁で T 1 7 0の mR N Aが検出さ れ、 3 2系統のペチュニアでペチュニア CH I mRNAの減少が観察 された。
T 1 7 0の mRNAが検出されたペチュニア花弁 0. 5 gを 2. 5 m 1 の 0. 1 % ト リ フルォロ酢酸を含む 5 0 %ァセ トニ ト リルに浸潤し、 フラボノイ ドを抽出後、 高速液体クロマ トグラフィー （H P L C) によ り分析した。 H P L Cの条件は、 OD S—A— 3 1 2 ( 1 5 0 X 6. 0 mm) を用いた実施例 5 と同じ条件を用いた。 本条件ではカルコン 2 ' 位配糖体、 カルコン 4， 位配糖体はそれぞれリテンショ ンタイム 1 9. 8 9分、 2 1. 6 9分に溶出される。 T 1 7 0を発現しているペチュニ ァのうち 3系統でカルコン 2 ' 位配糖体に対応するピークをもち、 また 同じ吸収スぺク トルを有していた。 さらに T 1 7 0を発現しているペチ ュニァ花弁の抽出物とカルコン 2， 位配糖体をコクロマ トグラフィーに より解析したところ、両者のピークは完全に一致した。以上の結果より、 T 1 7 0の発現によりカルコン 2 ' 位配糖体が合成された、 すなわち T 1 7 0は植物の中で機能するカルコン 2 ' 位糖転移酵素をコードしてい ることを示すことができた。 なお、 形質転換ペチュニアにおいては、 ぺ チュニァ CH I の mRNA量は減少していたものの低レべノレの転写が認、 められた。 実施例 8 T 1 7 0の植物での発現べクタ一の構築 2
T 1 7 0の発現とペチュニア C H I遺伝子の抑制だけでは十分量の力 ルコン 2， 位配糖体の蓄積が十分ではなかったため、 ペチュニアのフラ バノ ン 3水酸化酵素遺伝子 （ F 3 H) (Britsh et al. (1993) European J. Biochemistry 217, p745—754)あるレヽはジヒ ドロフラボノーノレ 4還元酵 素遺伝子 （D F R) (Beld et al. (1989) Plant Molecular Biology 13, p491-502 ， Huits et al. (1994) Plant J.6, p295-310) の抑制を行うこ とにした。
(8- 1)ペチュニア F 3 H c DNA 二本鎖コンストラク ト構築
ペチュニア F 3Hの c DNA遺伝子を p B l u e s c r i p t l l (s k—） にク ローニングした p S P B 265を铸型に用レヽ、 M13RV p r i me r (配列番 号 48) と PhF 3H— 1— C l a l p r i me r (配列番号 40) の組み合わ せで PC Rを行い、 P h F 3H— 1断片を得た。 この P h F 3H断片を Z e r o B l un t TOPO PCR C l o n i n g K i t (I n v i t r o g e n ) を用いてクローユングした後、 S a c I と C 1 a Iで切り出し、 約 0. 7 k bの 断片 P h F 3H- 1 ' とした。 一方、 p SPB 265を B amH I と C I a Iで消 ィ匕して約 0. 9 k bの断片を切り出し PhF 3H—2' とした。 pUE 6を pUC AP (van Engelen et al. Transgenic Research 4， 288—290， 1995) の A s c I 部位を平滑末端化し、 P a c I リンカ一を挿入したプラスミ ドを pUCPPとした 。 pUE 6をE c oR IとH i n d I I Iで消化して得られる断片のうち E 1 23 5 Sプロモーターを含む DN A断片を、 p UC P P の H i n d I I I— E c o R I部位に挿入した。 このプラスミ ドを p S PB 540とした。 p SPB 540を B a mH Iと S a c Iで消化して得られる約 3. 7 k bの D N A断片と、 P h F 3 H _ 1， と P h F 3H— 2， 断片をライゲーシヨンによって p S PB 1498を構築 した。結果、 この p SPB 1498は EL 235 Sプロモーターと NO Sタ一ミネ 一ター制御下に d s F 3 Hを転写できる構造をとる。
次に、 p S PB 1498 (d s PhF 3H) を P a c lにより消化した結果得ら れた約 2. 6 k bの遺伝子カセットを T 170と d s CH Iをもつバイナリ一ベタ ター p SPB 1342の P a c I部位に導入し T 1 70 - d s CH I - d s F 3H の 3種の遺伝子が同方向に並んだバイナリーベクター p S PB 2201を構築し た。
M13RV) 5 ' -caggaaacagctatgac-3 ' (配列番号 48)
PhF3H-ClaI) 5 ' -tggttcctggatcagtgtgtcttttc-3 ' (配列番号 40)
(8-2) ペチュニア DFRcDNA 二本鎖コンストラクト構築
ペチュニア DFR遺伝子を含む p CGP 1403 (WO 961 36716) を B a mH Iおよび S c a I、 P v u I Iおよび S a c Iにより消化し、 それぞれ 0. 85 k bおよび 0. 45 k bの断片を得た。 2本鎖 RNA構造を形成するこれら両 断片と EL 2 35 Sプロモーター（Mitsuhara et al. Plant Cell Physiol. 37， P49) ならびに ma sターミネータ一から構成されるカセットを、植物形質転換用 バイナリーベクター p B I NP LUS (vanEngelen et al. Plant Mol. Biol. 15, p373) の MC S内 H i n d l I I— E c oR I間に挿入し、 これを p S PB 53 2とした。 これを P a c Iで消化後、 脱リン酸化した。
次に実施例 6に記述した、 EL 2 35 Sプロモーターと 2本鎖 RNA構造をも つペチュニア CH I遺伝子ならびに NOSターミネータ一から構成されるカセッ トを含む p S P B 1601を H i n d I I Iおよび E c o R Iで消化し、約 2· 5 k bの断片を得た。これをべクター pUC P Pの H i n d l I I— E c oR I間に 挿入し、 p SFL 5とした。 これを P a c Iで切断し、 pUCPP ベクターから 切り出し得られた約 2. 5 k bの断片を前述の p S PB 532の P a c l切断部位 にペチュニアの DFR発現抑制カセットと同じ方向、すなわち両発現力セットとも にベクターの LB側が上流になるように挿入し、得られたプラスミ ドを p SFL l 3とした。 次にこれを A s c Iで消化後、 脱リン酸ィヒした。 実施例 6に記述したプ ラスミ ドベクター pUCAA上で、 MAC 1プロモーター （Comai et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15, p373) 、 T 170遺伝子及ぴマンノピン合成酵素遺伝子タ —ミネ一ターからなる T 1 70遺伝子の発現カセットを、 A s c Iで切断し、 pU CAAベクターから切り出し、 約 3. 5 k bの断片を得た。 これを前述の p SFL 13の As c I切断部位にペチュニアの DFRおよび CH I発現抑制カセットと 同じ方向になるように挿入し、 得られたプラスミ ドを p S FL 14とした。 実施例 9 カルコン糖転移酵素遺伝子 T 1 2 8の取得
カーネーショ ンには T 1 7 0以外にもカルコン糖転移酵素遺伝子が存 在する可能性があるため探索を継続した。 実施例 2で得た糖転移酵素の うち p T 1 2 8 と したプラスミ ドに含まれる c D N Aの塩基配列とアミ ノ酸配列を配列表の配列番号 1 4、 1 5に示した。 p T 1 2 8に含まれ る c DNAは、 4 8 9アミノ酸からなる分子量 5 5. 2 k D aのタン パク質をコー ドする 1 4 6 7 b pの遺伝子 T 1 2 8を含んでいた。 T 1 2 8がコー ドするアミノ酸配列を、 すでに報告のある糖転移酵素と実 施例 3に記載したように比較したところリ ビングス トーンデージー由来 GTと 5 4 %、 バーべナ由来 5 G Tと 2 4 %の同一性を示した。 また T 1 7 0 とは 2 7 %の同一性を示した。 実施例 1 0 大腸菌における T 1 2 8遺伝子の発現と活性測定
T 1 2 8遺伝子の大腸菌での発現は、 実施例 4に記載された方法と同 じ T h e Q I A e x p r e s s i o n i s t (Q I AG E N) を用 いて行った。 まず T 1 2 8上の糖転移酵素遺伝子の開始コ ドンの 5 ' 側 に N c o l 認識配列を導入するために、 以下に示すプライマー T 1 2 8— N c o I と実施例 4で示した M 1 3 M 4 を用いて実施例 4 と同 様の P C R反応を行った。
T128- Ncol ： 5' - ACAATTTCAGCCATGGGCAC -3' (配歹 'J番号 2 6 )
得られた P C R産物を p C R 2. 1 TO P O v e c t o r ( I N V I T R O G E N)に製造者が推奨する方法でサブクローニングした。 このよ うにして得られたプラスミ ドを p TO P O— T 1 2 8 と した。 Ρ C R反応によるエラーがないことを塩基配列を決定することによ り確認 した。 p TO P O— T 1 2 8を N c o I 、 K p n l で制限酵素処理し得 られた約 1. 8 k bのフラグメ ン トを p Q E— 6 1 v e c t o r ( Q I AGE N) の同サイ トに連結し、 プラスミ ド p S P B 1 4 4 1を得 た。 P S B 1 4 4 1を C o m p e t e n t h i g h J M 1 0 9 ( T O Y O B O) に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、 実施例 5に記載されている方法で培養し、 粗酵素液を得た。 これを用いて実施例 5に記載されている方法でカルコ ンを基質と した糖転移活性を測定した。 T 1 2 8由来の糖転移酵素遺伝 子を発現させた大腸菌の抽出液を反応させたところ、 THC (保持時間 2 7. 3分） に加え、 1 9. 8 9分と 2 1. 6 9分に溶出される新たな 物質が検出された。 前者は THCの 2 ' 位配糖体で、 後者は THCの 4 ' 位配糖体であることを、 それぞれの標準品の保持時間と比較すること で同定した。 これらは p Q E— 6 1ベクターのみを発現させた大腸菌か ら同様に調製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったこと から T 1 2 8に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる。 以上の結果から、 T 1 2 8由来の糖転移酵素は TH Cの 2， 位と 4 ' 位 の水酸基にダルコ一スを糖転移する活性を有することが確認された。 実施例 1 1 T 1 2 8の植物での発現ベクターの構築
T 1 2 8由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を明 らかにするために、 T 1 2 8を発現させ、 本酵素と基質を同じにするぺ チュニァ由来のカルコンイソメ ラーゼ活性を有するタンパク質をコー ド する C H I — A遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリ一べクター （ P S P B 2 1 0 8) を構築した。 p S P B 2 1 0 8の作製は実施例 6 と 同様に以下のよ うに行った。
まず、 p S P B 1 6 0 1を A s c I で消化後、 脱リ ン酸化した。
次に、 p B l u e s c r i p t l l ( s k—） のマノレチクロ一ユング サイ トに挿入されている T 1 2 8遺伝子を、 B a mH I ( c DNAの 5 ' 端側） と K p n l ( c DNAの 3 ' 端側） で消化し、 T 1 2 8 c D N A断片を得た。 次にプラスミ ドベクター p UCAA上で、 MAC 1プロ モ一ター、 T 1 2 8遺伝子及びマンノ ピン合成酵素遺伝子ターミネータ 一からなる T 1 7 0遺伝子の発現カセッ トを、 p U CAAベクターの B a ιηΗ I切断部位を 5， 端、 K p n I サイ トを 3 ' 端と して構築した。 この T 1 2 8発現カセッ ト全体を A s c I切断によって p UCAAべク ターから切り出した。
p UCAAベクターから A s c I で切り出した発現カセッ トを、 前述 の P S P B 1 6 0 1の A s c l切断部位に、 ペチュニアの CH I発現抑 制カセッ トと同じ方向、 すなわち両発現力セッ トともにベクターの L B 側が上流になるように挿入し、 得られたプラスミ ドを p S P B 2 1 0 8 と した。 実施例 1 2 カルコン糖転移酵素遺伝子 C G T 9 3の取得
T 1 7 0をプローブと して、 カーネーショ ン花弁ライブラ リー 2 4 0 0 0プラークよ りスク リーニングを行った。 スク リーニングによ りプラ スミ ド p C G T 9 3を得た。 p C G T 9 3に含まれる c D N Aは、 4 8 1アミノ酸からなる分子量 5 2. 8 k D aのタンパク質をコードする 1 4 4 3 b pの遺伝子 C GT 9 3を含んでいた。 C GT 9 3がコー ドする ァミノ酸配列を、 すでに報告のある糖転移酵素と実施例 3に記載したよ うに比較したところリ ビングス トーンデージー由来 G Tと 2 6 %、 バー べナ由来 5 G Tと 2 3 %の同一性を示した。 また T 1 7 0 とは 6 3 %、 T 1 2 8 とは 2 5 %の同一性を示した。 p C G T 9 3中に含まれる遺伝 子を含む塩基配列および当該塩基配列にコードされているアミノ酸配列 を配列番号 1 6、 1 7にそれぞれ示す。 実施例 1 3 大腸菌における C GT 9 3遺伝子の発現と活性測定
C G T 9 3遺伝子の大腸菌での発現は、 実施例 4に記載された方法と 同じ T h e Q I A e x p r e s s i o n i s t (Q I AG E N) を 用いて行った。 まず C GT 9 3上の糖転移酵素遺伝子の開始コ ドンの 5 ' 側に N c o I 認識配列を導入するために、 以下に示すプライマー A 9 3— 7 5 B s p H I と A 9 3— 7 5— B g l I I を用いて実施例 4 と 同様の P C R反応を行った。
A93-75BspHI ： 5' - ACAGGATCATGACTTCAGGG- 3' (配歹 U番号 2 7 )
A93 - 75- Bglll ： 5' - GGAAGATCTAATATACGTGAGTAC- 3' (酉己歹リ番号 2 8 ) 得られた P C R産物を p C R— B 1 u n t I I — TO P〇 v e c t o r ( I NV I T ROG E N) に製造者が推奨する方法でサブクロー ユングし、 p S P B 1 4 6 9 とした。 P C R反応によるエラーがないこ とを塩基配列を決定することにより確認した。 この p S P B 1 4 6 9を B s p H I 、 B g 1 I I で制限酵素処理し得られた約 1. 8 K bのフラ グメントを p Q E— 6 1 v e c t o rの N c o I 、 B g l I I切断 部位に連結し、 プラスミ ド p S P B 1 4 7 0を得た。 この p S P B 1 4 7 0を C o m p e t e n t h i g h J M 1 0 9 に形質転換した。 この大腸菌形質転換株を、 実施例 5に記載されている方法で培養し、 粗酵素液を得た。 これを用いて実施例 5に記載されている方法でカルコ ンを基質と した糖転移活性を測定した。
C GT 9 3由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を 反応させたところ、 THC (保持時間 2 7. 3分） に加え、 1 9. 8 9 分に溶出される新たな物質が検出された。 これは THCの 2 ' 位配糖体 の保持時間と一致し、 p Q E— 6 1ベクターのみを発現させた大腸菌か ら同様に，製した粗抽出液を反応させたものでは検出されなかったこと から C GT 9 3に由来する糖転移酵素によって生じた産物と考えられる ( 以上の結果から、 C G T 9 3由来の糖転移酵素は T H Cの 2， 位の水酸 基にグルコースを糖転移する活性を有することが確認された。 実施例 1 4 C G T 9 3を含む植物発現ベクターの構築
C GT 9 3由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を 明らかにするために、 C GT 9 3を発現させ、 本酵素と基質を同じにす るペチュニア由来のカルコンイソメラ一ゼ活性を有するタンパク質をコ ードする CH I — A遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーべクタ 一 (p S P B 1 4 9 4) を構築した。 p S P B 1 4 9 4の作製は実施例 6 と同様に以下のように行った。
まず、 p S P B 1 6 0 1 を A s c l で消化後、 脱リ ン酸化した。
次に、 p B l u e s c r i p t l I ( s k— ) のマノレチクロ一二ング サイ トに挿入されている C GT 9 3遺伝子を X h o I ( c DNAの 3 ' 端側） で消化後、 DNA B l u n t i n g K i t (T a k a r a ) にて平滑化し、 次に B a mH I ( c DNAの 5 ' 端側） で消化して C GT 9 3 c DN A断片を得た。得られた C GT 9 3 c DNA断片を、 プラスミ ドベクター p UC AA上で、 MAC 1プロモーター、 マンノビ ン合成酵素遺伝子ターミネーターからなる P S P B 1 8 4を K p n I で 消化後 D N A B l u n t i n g K i t にて平滑化して更に B a m H I にて消化したサイ 卜へ挿入した。 ベクターの B a m H I切断部位を 5， 端、 K p n l サイ トを 3 ' 端と して MAC 1プロモーター、 C GT 9 3遺伝子及びマンノ ピン合成酵素遺伝子ターミネータ一からなる遺伝 子の発現カセッ ト p S Ρ Β 1 4 9 3を構築した。
このように構築した S P B 1 4 9 3を A s c I切断によって C GT 9 3発現カセッ ト全体を p UC AA ベクターから切り出し、 前述の p S P B 1 6 0 1の A s c l切断部位にペチュニアの C H I発現抑制カセ ッ トと同じ方向、 すなわち両発現力セッ トともにベクターの L B側が上 流になるように挿入し、得られたプラスミ ドを p S P B 1 4 9 4 と した。 実施例 1 5 サブトラクシヨ ンライブラリーの作製
実施例 1に述べた方法で黄色カーネーションのつぼみの花弁と葉から p o 1 y A + R N Aを得た。 C L ONT E CH P C R— S e l e c t c DNA S u b s t r a c t i o n K i t (C L ONT E C H ) を用い製造者の推奨する方法により花弁で発現する遺伝子を濃縮した c DNAライブラリーを作製した。 ランダムシークェンスの結果、 GT と相同性のあるクローンを 1 6種類得た。 サブトラクショ ンで得られた これら GTホモログクローンは完全長と して得られなかったので、 再度 GTホモ口グ断片をプローブと して花弁 c DNAライブラリーより 2 4 : 0 0 0クローンについてスク リーニングを行った。 スク リーニングは実 施例 2に記載の方法に従った。 実施例 1 6 カルコン糖転移酵素遺伝子 S 6 B 1 1の取得
実施例 1 5のサブトラクシヨンによって得られたクローン p S 6 B 1 1 と したプラスミ ドに含まれる c DN Aの塩基配列とァミ ノ酸配列を配 列表の配列番号 1 8、 1 9に示した。 p S 6 B 1 1 に含まれる c D N A は、 4 8 3アミノ酸からなる分子量 5 4. 4 k D aのタンパク質をコー ドする 1 4 4 9 b pの遺伝子 S 6 B 1 1 を含んでいた。 すでに報告のあ る糖転移酵素と実施例 3に記載したように比較したところリ ビングス ト ーンデージー由来 GTと 6 0 %、 バーべナ由来 5 G Tと 2 6 %の同一性 を示した。 また T 1 7 0、 T 1 2 8、 C GT 9 3 とはそれぞれ 2 7 %、 5 4 %、 2 7 %の同一性を示した。 実施例 1 7 S 6 B 1 1の植物での発現ベクターの構築
S 6 B 1 1 由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を 明らかにするために、 S 6 B 1 1 を発現させ、 本酵素と基質を同じにす るペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコ ードする C H I — A遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリーべクタ 一 ( p S P B 1 3 3 5 ) を構築した。 p S P B 1 3 3 5の作製は実施例 6 と同様に以下のよ うに行った。
まず、 p S P B 1 6 0 1を A s c l で消化後、 脱リ ン酸化した。
次に、 p B l u e s c r i p t l l ( s k— ) のマノレチクロ一ユング サイ トに挿入されている S 6 B 1 1遺伝子を B a mH I ( c DNAの 5 ， 端側） と K p n l ( c DNAの 3 ' 端側） で消化し、 S 6 B 1 1 c D N A断片を得た。 次にプラスミ ドベクター p UCAA上で、 MAC 1プ 口モーター、 S 6 B 1 1遺伝子及びマンノ ピン合成酵素遺伝子ターミネ 一ターからなる S 6 B 1 1遺伝子の発現カセッ トを、 ベクターの B a m H I切断部位を 5 ' 端、 K p n l切断部位を 3 ' 端と して作製した。 こ の S 6 B 1 1発現カセッ ト全体を A s c I切断によって p UCAAべク ターから切り出した。
上記のよ うに切り出した S 6 B 1 1発現カセッ トを、 前述の p S P B 1 6 0 1の A s c I切断部位にペチュニアの C H I発現抑制カセッ トと 同じ方向、 すなわち両発現カセッ トともにベクターの L B側が上流にな るように挿入し、 得られたプラスミ ドを p S P B l 3 3 5 と した。 実施例 1 8 S 6 B 1 1の植物での発現とフラボノィ ド組成の変化 実施例 7に記述したように、 p S P B 1 3 3 5をァグロバクテリ ゥム ツユメファシエンス A g 1 0株に導入し、 ペチュニア P L株を形質転換 した。
上記のよ うにして 2 7系統の独立した形質転換ペチュニア P L株を得 た。 ペチュニア花弁の R N Aを用いて実施例 7 と同様の RT— P C R反 応を実施した。 S 6 B 1 1の mRNAの増幅にはプライマー S 6 B 1 1 — RT— Fと S 6 B 1 1 — RT— Rを、 CH I mRNAの増幅には実 施例 7 と同じ C H I F 1 と C H I R 1を用いた。 各プライマ一の配列は 以下のとおりである。
S6B11— RT_F:5'— GTAATCCGCTCATCAATGTGGAG— 3' (酉己歹リ番号 2 9)
S6B11- RT - R:5' - AGCAAATGGTTCGTCGTCAGAC-3' (配列番号 3 0)
その結果、 2 4系統のペチュニア花弁で S 6 B 1 1の mRNAが検出 され、 1 1系統のペチュニアで C H I mR N Aの減少が観察された。 S 6 B 1 1の mR N Aが検出されたペチュニア花弁から実施例 7 と同様に フラボノイ ドを抽出し、 OD S— A— 3 1 2を用いたメタノール溶媒系 の高速液体クロマ トグラフィ一にて分析を行った。 S 6 B 1 1 を発現し ているペチュニアのうち 4系統でカルコン 2 ' 位配糖体に対応するピー クをもち、 また同じ吸収スペク トルを有していた。 さらに S 6 B 1 1 を 発現しているペチュニア花弁の抽出物とカルコン 2， 位配糖体をコクロ マ トグラフィ一によ り解析したところ、両者のピークは完全に一致した。 以上は、 S 6 B 1 1の発現によりカルコン 2 ' 位配糖体が合成された、 すなわち S 6 B 1 1 は植物の中で機能するカルコン 2 ' 位糖転移酵素を コードしていることを示すことができた。 なお、 形質転換ペチュニアに おいては、 C H I の mR N A量は減少していたものの低レベルの転写が 認められた。 実施例 1 9 カルコン糖転移酵素 S 1 2 A 2の取得
実施例 1 5のサブ トラクシヨ ンによって得られたク ローン p S 1 2 A 2— aは 5 ' 領域が欠失していた。 S 1 2 A 2— RT， S 1 2 A 2 - S 1 , S 1 2 A 2 -A 1 , S 1 2 A 2 - S 2 , S 1 2 A 2 -A 2 の 4種のプライマーと 5 ' — F u l l RAC E C o r e S e t ( T a k a r a ) を用いた 5 ' — RAC Eによ り約 0. 4 k b程度の断片 を TA c 1 o n i n g した （p S 1 2 A 2— b ) 。 プライマーについ ては以下に示す。
S12A2 - Ncol ： 5' - ACCAGACCATGGGTGCTG - 3， （配歹 IJ番号 3 1 )
S12A2-S1 ： 5' - GAGATTGCAATGCGCATCC- 3' (配列番号 3 2 )
S12A2-S2 ： 5'— GTGGCCGACATGTTTTACCC— 3' (酉己歹 IJ番号 3 3 )
S12A2-A1 ： 5' - GCATTCTCACAACCCTCAGG - 3' (配歹 'J番号 3 4 )
S12A2-A2 ： 5， - TCTGTTACCCGTGTCAACTGC- 3' (酉己歹 'J番号 3 5)
p S 1 2 A 2— bを铸型に更に S 1 2 A 2—N c o I と S I 2 A 2 - A 2で P C Rして増幅した断片を再び T A クロ一ニングした （ p S l 2 A 2— c ) 。 p S 1 2 A 2を N d e l ， K p n I消ィヒした挿入断片 側を、 p S 1 2 A 2— cの同サイ トに導入したベタターを構築し、 全長 を含むクローンが得られた （p S 1 2 A 2— d ) 。 プラスミ ドに含まれ る c D N Aの塩基配列とァミノ酸配列を配列表の配列番号 2 0、 2 1 に 示した。 p S 1 2 A 2— dに含まれる c D N Aは、 4 8 6アミノ酸から なる分子量 5 5. O k D aのタンパク質をコー ドする 1 4 5 8 b pの遺 伝子 S 1 2 A 2を含んでいた。 すでに報告のある糖転移酵素と実施例 3 に記載したように比較したところリ ビングス トーンデージー由来 GTと
5 7 %、バーべナ由来 5 G Tと 2 5 %の同一性を示した。また T 1 7 0、 T 1 2 8、 C GT 9 3、 S 6 B 1 1 とそれぞれ 2 7 %、 5 2 %、 2 7 %、
6 7 %の同一性を示した。 実施例 2 0 大腸菌における S 1 2 A 2遺伝子の発現と活性測定
S 1 2 A 2遺伝子の大腸菌での発現は、 実施例 4に記載された方法で T h e Q I A e x p r e s s i o n i s t (Q I AGE N) を用レヽ て行った。 実施例 1 9における p S 1 2 A 2— dを N c o I と K p n I で消化し、 D Q E— 6 1の同サイ トに連結し p S P B 1 4 3 9を構築し た。 p S P B 1 4 3 9を C o m p e t e n t h i g h J M 1 0 9 (T OYO B O) に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、 実施例 5に記載されている方法で培養し、 粗酵素液を得た。 これを用いて実施例 5に記載されている方法でカルコ ンを基質とした糖転移活性を測定した。
S 1 2 A 2由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反 応させたところ、 THC (保持時間 2 7. 3分） に加え、 1 9. 8 9分 に溶出される新たな物質が検出された。 これらは p Q E— 6 1ベクター のみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させたもの では検出されなかったことから S 1 2 A 2に由来する糖転移酵素によつ て生じた産物と考えられる。 以上の結果から、 S 1 2 A 2由来の糖転移 酵素は THCの 2 ' 位の水酸基にグルコースを糖転移する活性を有する ことが確認された。 実施例 2 1 S 1 2 A 2の植物での発現ベクターの構築
S 1 2 A 2由来のカルコン糖転移酵素遺伝子産物の植物体での機能を 明らかにするために、 S 1 2 A 2を発現させ、 本酵素と基質を同じにす るペチュニア由来のカルコンイソメラーゼ活性を有するタンパク質をコ 一ドする CH I一 A遺伝子の発現を抑制させる共発現バイナリ一べクタ — （p S P B 1 4 7 8 ) を構築した。 p S P B 1 4 7 8の作製は実施例 6 と同様に以下のように行った。
まず、 p S P B 1 6 0 1 を A s c l で消化後、 脱リ ン酸化した。
次に、 p B 1 u e s c r i p t I I ( s k -) のマノレチタローニング サイ トに挿入されている S 1 2 A 2遺伝子を B a mH I ( c DNAの 5 ' 端側） と K p n l ( c DNAの 3 ' 端側） で消化し、 S 1 2 A 2 c D N A断片を得た。 次にプラスミ ドベクター p UCAA上で、 MAC 1プ 口モーター、 S 1 2 A 2遺伝子及びマンノ ピン合成酵素遺伝子ターミネ 一ターからなる S 1 2 A 2遺伝子の発現カセッ トを、 ベクターの B a m H I切断部位を 5， 端、 K p η I切断部位を 3 ， 端と して構築した。 こ の S 1 2 Α 2発現カセッ ト全体を A s c I切断によって p U C AAベタ ターから切り出した。
上記のよ うにして切り出した S 1 2 A 2発現カセッ トを、 前述の p S P B 1 6 0 1 の A s c I切断部位にペチュニアの C H I発現抑制カセッ トと同じ方向、 すなわち両発現力セッ トと ともにべクターの L B側が上 流になるよ うに挿入し、得られたプラスミ ドを p S P B l 4 7 8 と した。 実施例 2 2 T 1 7 0の植物での発現 2
p S F L 1 4を実施例 7に記述したように、ァグロパクテリゥムッメファシェン ス Ag 1 0株に導入し、ペチュニア P L株とバカラレツ ド株に形質転換した。 同様 に P S P B 2 2 0 1も P L株とバカラレツ ド株に形質転換した。 実施例 2 3 T 1 7 0の植物での発現ベクターの構築 3
ペチュニア以外の植物、 トレユア 'バーべナで T 1 7 0を発現させてカルコン配 糖体を蓄積ささせるため、 トレ-ァについては、 トレユア由来のフラバノン 3水酸 化酵素 （F 3 H) を抑制させる共発現ベクターを構築した。 バーべナについてはバ 一べナ （タピアン （登録商標） ） 由来の CH Iを抑える共発現ベクターと、 CH I と F 3H (花手毬 （登録商標） ） の両遺伝子発現を抑える共発現ベクターを構築し た。
(23-1) トレニァ F 3 H c DNA二本鎖コンストラク ト （ d s F 3 H) 構築 トレニァの花弁 c DN Aライブラリー （Molecular Breeding, 6, p239, 2000) を ペチュニアの F 3 H遺伝子をプローブにして実施例 2に記載の方法でスクリー二 ングしトレエアの F 3H遺伝子を取得した。
トレニァ F 3Hの c DNA遺伝子を p B l u e s c r i p t l l (SK—） に クローニングした p S P B 2 6 6を铸型に用い、 M1 3 RV P r i me r (配列 番号 48) と Th F 3H_S a l I l p r i me r (配列番号 4 1 ) の組み合わ せで PC Rを行い、 Th F 3H— 1断片を得た。 また同様に、 R e v e r s e p r i me rと ThF 3H_S a l I 2 p r i me r (配列番号 42 ) の組み合わ せで PC Rを行い、 Th F 3H— 2断片を得た。 Th F 3 H— 1断片 · Th F 3 H' - 2断片を TOP O TA c l o n i n g k i t ( I n v i t r o g e n) を 用いて TAクローエングした後、 前者は S a c I と S a 1 Iで切り出し、約 0. 7 5 k bの断片 Th F 3H- 1 ' とした。 一方、 後者は B a mH Iと S a 1 Iで切り 出し、 約 0. 9 k bの断片 ThF 3H— 2， とした。 1)1；£ 6を11 i n d I I I と E c o R Iで消化して得られるプロモーターを含む DNAを pUCAAの H i n d I I I と E c o R I部位に挿入した。これを B a mH Iと S a c Iで消化して得 られる約 3. 8 k bの DNA断片と Th F 3H- 1 ' と Th F 3 H— 2' 断片をラ ィゲーシヨンによって p S FL 308を構築した。結果、 この p S F L 308は E L 2 3 5 Sプロモーター下に d s F 3 Hと NO Sターミネータ一をもつ構造をと る。 p S F L 308 (d s ThF 3H) を A s c lにより消化した結果得られた約 2. 7 k bの断片を平滑化した後、 p B I NP LUSの Sma I部位に導入して p S P B 22 1 8を作製した。 Ma cプロモーターと ma sターミネータ一に挟まれ た T 1 70遺伝子カセット約 3. 7 k bを p S PB 1 34 2から A s c Iで切り出 し、 p S PB 22 1 8の A s c I部位に導入し、 T 1 70と d s F 3 Hの 2つの遺 伝子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した （p S PB 22 23) 。
ThF3H-SalIl) 5' -ttctctgtcgacgcccattgcc-3' (配列番号 4 1)
ThF3H-SalI2) 5， -cgccgtgtcgactcgcttgaag-3 ' (配列番号 42)
(23-2) バーべナ （花手毬 （登録商標） ） d s F 3Hの構築
バーべナの花弁 c DNAライブラリー （Plant Cell Physiol. 44 sl22 (2003) )をペチュニアの F 3 H遺伝子をプローブにして実施例 2に記載の方法でスクリー ニングしバーべナの F 3 H遺伝子を取得した。
バーべナ F 3^^の。 DNA遺伝子を p B l u e s c r i p t l l (s k— ) にク ローニングした P S PB 9を B s t X Iで消化後平滑化し、 その後、 B amHで部 分消化し、 約 1. 1 k bの遺伝子断片を回収して Ha F 3H— 1とした。 また、 p S PB 9を S a c l と Ha e l lで消化し、約 0. 7 k bの遺伝子断片を回収して Ha F 3H—2とした。 p S PB 540を B a mH Iと S a c Iで消化して得られ る約 3. 8 k bの DNA断片と Ha F 3H— 1と Ha F 3 H_ 2断片をライゲーシ ョンによって p S P B 250 1を構築した。この p S PB 2 50 1は E L 23 5 S プロモータ一下に d s F 3 Hと NO Sターミネータ一をもつ構造をとる。
(23-3) バーべナ （タピアン （登録商標） ） d s CH Iの構築
バーべナの花弁 c DNAライブラリー （Plant Cell Physiol. 44 sl22 (2003) )をペチュニアの F 3 H遺伝子をプローブにして実施例 2に記載の方法でスクリー ニングしバーべナの F 3 H遺伝子を取得した。
バーべナ CH Iの c DNA遺伝子を p B l u e s c r i p t I I ( s k—) にク ローニングした p S PB 2 1 0 9を铸型に用レヽ、 Ml 3RV P r i me r (配列 番号 48) と Tp CH I _Xb a I 2 p r i me r (配列番号 45) の組み合わ せで PC Rを行い、 Tp CH I— 1断片を得た。 また同様に Tp CH I — S a 1 I p r i me r (配列番号 43) と Tp CH I— Xb a l l r i me r (配列 番号 44 ) の組み合わせで P C Rを行い、 T p C H I— 2断片を得た。 T p C H I 一 1断片 ·Τρ CH I— 2断片を Z e r o B l u n t TOPO PCR C I o n i n g K i t ( I n v i t r o g e n) を用いてクローニングした後、 前者 は B a mH Iと X b a Iで切り出し、 約 0. 68 k bの断片 T p CH I - 1 ' とし た。 一方、 後者は X b a l と S a i lで切り出し、 約 0. 5 k bの断片 T p CH I — 2， とした。 p S PB l 76の GUS遺伝子領域を B a mH I と S a 1 Iで切り 出して除いた DNA断片と、 T p CH I— 1 ' と Tp CH I— 2' 断片をライゲー シヨンによって P S PB 1 48 6を構築した。 その結果、 p S PB 1 486は EL 23 5 Sプロモーター下に d s CH Iと NO Sターミネータ一をもつ構造をとる。 この p S PB 1 48 6を P a c lで消化後、 P a c I— F s e I F (配列番号 46 ) と P a c l— F s e I R (配列番号 4 7) の 2種類のオリゴ DN Aをァニールさ せた P a c I -F s e Iアダプターを導入し、新たに F s e I部位を導入した p S P B 2508を作製した。
TpCHI-Sall) 5， -acgcagaaaaaagtcgactg-3 ' (酉己列番号 43)
TpCHI-Xball) 5， -gaggtgattgggtctagag-3 ' (酉己列番号 44)
TpCHI-XbaI2) 5' -atttctagagcaggtccgacaat-3' (配列番号 45)
PacI-FselF) 5 -taactgcactgaggccggccagat-3 (目 ΰ歹 号 46ノ
PacI-FseIR) 5 -ctggccggcctcagtgcagttaat-3 (目 C歹1 J番^ · 47 )
(23-4) バ一^け (花手毬 （登録商標） ） d s F 3H +バーべナ （タピアン （登録 商標） ） d s C H Iの構築
P SPB 2501を P a c lで消化して得られる、 2. 9 k bの遺伝子断片を p SPB 2508の P a c l部位に導入し、 p SPB 2504を構築した。
(23-5)バーべナでの T 1 70遺伝子発現ベクターの構築 （T 1 70 + d s CH I
)
実施例 6の p SPB 1500を As c Iによって切り出し、生じる 3. 7 k bの T 1 70遺伝子カセットを、 p S PB 1486の A s c l部位に導入することによ り、 T 1 70と d s CH Iの 2種類の遺伝子カセットを載せたバイナリーベクター p S PB 1287を構築した。
(23-6)バ一ペナでの T 1 70遺伝子発現ベクターの構築 2 (T 1 70 + d s CH I + d s F 3 H
p UC 19の E c o R I部位に!！ c o F s e 1 (配列番号 57) と E c o F s e R (配列番号 58) のオリゴ DNAをァニールさせたアダプター E c o F s e 1 R を導入後、 H i n d I I I部位に I- I i n F s e R (配列番号 59) と H i n F s e 3 (配列番号 60) のオリゴ DNAをァニールさせたアダプター H i n F s e 3 R を導入して、 pUC 1 9のマルチクロ一ニングサイトの両端側に 2ケ所の F s e I 部位を導入したベクターを構築した （p SPB 1838) 。 p S PB 1838を H i n d l l l と E c oR Iで消化した後、末端平滑化した部位に、実施例 6の p S PB 1500を As c lによって切り出し、生じる 3. 7 k bの T 170遺伝子力 セットを末端平滑化後、挿入することにより P SPB 2505を構築。 この作業に より T 1 70の遺伝子カセットが F s e Iを用いて切り出すことが可能となる。
P SPB 2505を F s e l消化して得られる 3. 7 k bの T 170遺伝子カセ ットを P SPB 2504の F s e l部位に導入して p SPB 2507を構築した。 以上の結果、 p SPB 2507には d s CH Iと T1 70、 d s F 3 Hの 3遺伝子 カセットが同方向に並んだ構造をとる。 実施例 24 バーべナでの T 1 70の発現
p S P B 1287をァグロバクテリゥムッメファシエンス Ag 10株（B i o t e c hn o l o g y) に導入し、 田村らの方法 （Tamura et al. (2003) Plant Ce 11 Rep. 21, p459- 466) によりバーべナ （品種 花手毬スカーレット） に形質転換 を行った。
上記のようにして 7系統の独立した形質転換バーべナを得た。バーべナ花弁の R NAを用いて実施例 7と同様の RT— PC R反応を実施した。 T 1 70の mRNA の増幅には実施例 7と同様のプライマー T 1 70 Fとプライマー T 170 Rのプ ライマーを用レヽ、バーべナ CH Iの mRNAの発現量は T p CH I _ S a 1 I p r i me r (配列番号 43) と TpCH I— Xb a l l p r i me r (配列番号 44) を用いて約 0. 5 k bの遺伝子断片の増幅で確認した。 その結果、 7系統の バーべナ花弁で T1 70の mRNAが検出され、 3系統のバーべナ花弁でバーべナ CH Iの mRNA発現量の減少が観察された。 また、 T 170の発現が確認できた 7系統のうち 1系統（S a T170 # 7) の花弁花色がコント口ールの赤色に比べ 薄く、 若干の黄色を帯びていることを確認できた。 実施例 25 T 128の植物での発現とフラボノィド組成の変化
実施例 1 1で作製した p SPB 2108を実施例 7に記述したように、ァグロバ クテリゥムッメファシエンス Ag 10株に導入し、ペチュニア P L株を形質転換し た。
上記のようにして 37系統の独立した形質転換ペチュニア P L株を得た。ペチュ ニァ花弁の RN Aを用いて実施例 7と同様の RT— PC R反応を実施した。 T 1 2 8の mRN Aの増幅にはプライマー T 128— F (配列番号 38) と T 128— R (配列番号 39) を、 CH Iの mRNAの増幅には実施例 8と同じ CH I Fと CH I Rを用いた。 各プライマーの配列は以下のとおりである。
T128-F) 5 ' -acgagttagaacccgagtatgctg-3 ' (配列番号 38 )
T128-R) 5' -cagtgtgtcacgaatcctcctacg-3 ' (配列番号 39)
その結果、 1 9系統のペチュニア花弁で T 128の mRNAが検出され、 26系 統のペチュニアで CH Iの mRNAの減少が観察された。 T 128の mRNAが検 出されたペチュニア花弁中から実施例 7と同様の方法でフラボノィドを抽出し、実 施例 5と同様の方法で HP LCにより分析を行った。 T 1 28を発現しているペチ ュニァのうち 2系統でカルコン 2'位配糖体に対応するピークをもち、 また、 同じ 吸収スぺク トルを有していた。さらに T 1 28を発現しているペチュニア花弁の抽 出物とカルコン 2'位配糖体をコクロマトグラフィーにより解析したところ、 両者 のピークは完全に一致した。 以上は、 T 1 28の発現によりカルコン 2' 位配糖体 が合成された、すなわち T 1 28は植物の中で機能するカルコン 2'位糖転移酵素 をコードしていることを示すことができた。 実施例 26 T 128の植物での発現ベクターの構築 2
(26-1) T 1 28 +ペチュニア d s CH I + d s F 3 H
p S PB 1498 (d s PhF 3H) を P a c lにより消化した結果得られた約 2. 6 k bの遺伝子カセットを T 1 28と d s CH Iをもつバイナリーベクター p SPB 2108の P a c部位に導入し T 128 ' d s CH I ' d s F 3Hの 3種の 遺伝子を合わせもつベクター p SPB 1499を構築した。
(26-2) T 1 28 +トレニァ d s F 3 H
Ma cプロモーターと ma sターミネータ一に挟まれた T 128遺伝子カセッ ト約 3. 7 k bを p S Ρ Β 2108から A s c Iで切り出し、実施例 23で作製し た P SPB 2218の As c l部位に導入し、 T 128と d s F 3Hの 2遺伝子が 同方向に載ったバイナリーベクターを構築した （P SPB 2224) 。 実施例 27 T 1 28の植物での発現 2 .
P SPB 1499を実施例 7に記述したように、ァグロバタテリゥムッメファシ エンス Ag 10株に導入し、 ペチュニア PL株に形質転換した。 実施例 28 CGT 93の植物での発現ベクターの構築 2
(28-1) CGT 93 +ペチュニア d s CH I + d s F 3 H
P SPB 1498 (d s PhF 3H) を P a c lにより消化した結果得られた約 2. 6 k bの遺伝子カセットを CGT 93と d s CH Iをもつバイナリ一ベクター P SPB 1494の P a c部位に導入し CGT 93 ' d s CH I ' d s F 3Hの 3 種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクター P SPB 2202を構築した。
(28-2) CGT 93 +トレニァ d s F 3 H
Ma cプロモーターと m a sターミネータ一に挟まれた C G T 93遺伝子カセ ット約 3. 7 k bを p S PB 1494から A s c Iで切り出し、実施例 23で作製 した P SPB 22 18の A s c I部位に導入し、 CGT93と d s F 3 Hの 2遺伝 子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した （P SPB 2225) 。 実施例 29 CGT 93の植物での発現
p S PB 1494を実施例 7に記述したように、ァグロバタテリゥムッメファシ エンス Ag 10株に導入し、 ペチュニア P L株を形質転換した。 また、 p SPB 2 202をペチュニア P L株とバカラレツド株に形質転換した。 実施例 30 S 6 B 1 1の植物での発現ベクターの構築 2 '
(30-1) S 6 B 1 1 +ペチュニア d s CH I + d s F 3 H
P SPB 1498 (d s PhF 3H) を P a c lにより消化した結果得られた約 2. 6 k bの遺伝子カセットを S 6B 1 1と d s CH Iをもつバイナリーベクター P S PB 1 3 3 5の P a c部位に導入し S 6 B 1 1 · d s CH I * d s F 3Hの 3 種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクター p S PB 2 20 5を構築した。
(30-2) S 6 B 1 1 +トレニァ d s F 3 H
Ma cプロモーターと ma sターミネ一ターに挟まれた S 6 B 1 1遺伝子カセ ット約 3. 7 k bを p S P B 1 3 35から A s c Iで切り出し、実施例 23で作製 した P S PB 22 1 8の A s c I部位に導入し、 S 6 B 1 1と d s F 3 Hの 2遺伝 子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した （P S PB 2 226) 。 実施例 3 1 S 6 B 1 1の植物での発現 2
p S PB 2205を実施例 7に記述したように、ァグロパクテリゥムッメファシ エンス Ag 1 0株に導入し、 ペチュニア P L株に形質転換した。 実施例 32 S 1 2 A 2の植物での発現ベクターの構築 2
(32-1) S 1 2 A2+ペチュニア d s CH I + d s F 3H
p S PB 1 498 (d s Ph F 3 H) を P a c Iにより消化した結果得られた約' 2. 6 k bの遺伝子カセットを S 1 2 A2と d s CH Iをもつバイナリーベクター P S PB 1 4 78の P a c部位に導入し S 1 2A2 - d s CH I - d s F 3Hの 3 種の遺伝子を合わせもつバイナリーベクター p S PB 2 206を構築した。
(32-2) S 1 2 A 2 +トレニァ d s F 3 H
Ma cプロモーターと ma sターミネータ一に挟まれた S 1 2 A2遺伝子カセ ット約 3. 7 k bを p S P B 2 206から A s c Iで切り出し、実施例 23で作製 した p S P B 22 1 8の A s c I部位に導入し、 S 1 2A2と d s F 3 Hの 2遺伝 子が同方向に載ったバイナリーベクターを構築した （P S PB 222 7) 。 実施例 33 S 1 2 A 2の植物での発現
実施例 2 1で作製した p S PB 14 78を実施例 7に記述したように、ァグ口バ クテリゥムッメファシエンス Ag 1 0株に導入し、ペチュニア P L株を形質転換し た。 また、 p SPB 2206も PL株に形質転換した。 実施例 34 シクラメン花弁 c DNAライブラリーの構築
黄色のシクラメンの新鮮な花弁 5 gから実施例 1と同様の方法で cDN Aライ ブラリーを構築した。 得られたライブラリ一は 1. 75 X 106プラーク ·フォ ミング .ユニット （p f u) からなつていた。 実施例 35 カルコン糖転移酵素遺伝子 Y C y 3— 1 2の取得
T 1 70をプローブとして、 シクラメン花弁ライブラリー 24， 000プラーク よりスクリーニングを行った。スクリーニングによりプラスミ ド p YCy 3— 12 を得た。 p YCy 3_ 12に含まれる c DNAは、 482アミノ酸からなる分子量 54. 3 kD aのタンパク質をコードする 1446 b pの遺伝子 YCy 3— 1 2を 含んでいた。 YCy 3— 12がコードするアミノ酸配列を、すでに報告のある糖転 移酵素と実施例 3に記載したように比較したところリビングスト一ンデージー由 来 GTと 28%、バーべナ由来 5 GTと 24%の同一性を示した。 また T 1 70と は 46 %、 T 128とは 28 %、 C G T 93とは 46 %、 S 6 B 1 1とは 28 %、 S 1 2A2とは 27%の同一性を示した。 PYCy 3— 12中に含まれる遺伝子を 含む塩基配列および当該塩基配列にコードされているァミノ酸配列を配列番号 5 5、 56にそれぞれ示す。 実施例 36 大腸菌における YCy 3- 1 2遺伝子の発現と活性測定
YCy 3-12遺伝子の大腸菌での発現は、実施例 4に記載された方法と同じ T h e Q I A e x p r e s s i o n i s t (Q I AGEN) を用いて亍つた。 まず YC y 3-12上の糖転移酵素遺伝子の開始コドンの 5 '側に N c o I認識配 列を導入するために、 以下に示すプライマー YCy 3— 12 P 1 (配列番号 53 ) と YCy 3_12 P 2 (配列番号 54 ) を用いて実施例 4と同様の P C R反応を行 つた。 YCy3-12Pl) 5' -ccccatggagagggcagagctagccttca-3' (酉己歹 IJ番号 53)
YCy3-12P2) 5' -aaagcttcacgaagagcgattgagtacttc-3' (酉己歹 IJ番号 54 )
得られた PCR産物を p CR— B 1 u n t I I—TOPO v e c t o r (I NV I TROGEN) に製造者が推奨する方法でサブクロ一ニングした。 このよう にして得られたプラスミ ド pTOPO— YCy 3— 1 2とした。 PCR反応による エラーがないことを塩基配列を決定することにより確認した。 pTOPO— YCy 3— 12を N c o l、 H i n d i I Iで制限酵素処理し得られた約 1. 8 K bのフ ラグメントを pQE— 6 1 v e c t o rの Nc o I、 H i n d i I I部位に連 結し、 プラスミ ド pQE— YCy 3— 12を得た。 pQE— YCy 3— 1 2を Co mp e t e n t h i g h JM109 に形質転換した。
この大腸菌形質転換株を、実施例 5に記載されている方法で培養し、粗酵素液を 得た。これを用いて実施例 5に記載されている方法でカルコンを基質とした糖転移 活性を測定した。
YCy 3-12由来の糖転移酵素遺伝子を発現させた大腸菌の抽出液を反応さ せたところ、 THC (保持時間 27. 3分） に加え、 1 9. 89分に溶出される新 たな物質が検出された。 これは THCの 2' 位配糖体の保持時間と一致し、 pQE 61 ベクターのみを発現させた大腸菌から同様に調製した粗抽出液を反応させ たものでは検出されなかったことから YC y 3-12に由来する糖転移酵素によ つて生じた産物と考えられる。以上の結果から、 YCy 3— 1 2由来の糖転移酵素 は T H Cの 2 '位の水酸基にダルコースを糖転移する活性を有することが確認され た。 産業上の利用の可能性
本発明は、 花卉園芸、 植物育種、 農業、 バイオテク ノ ロジー関連など の産業に適用される。 配列表フリ一テキス ト 配列番号 3 ； Ipomoea purpurea 3GGT PN3GGTF
配列番号 4 ； Ipomoea purpurea 3GGT PN3GGTR
酉己列番号 5 ； Gentiana scabra 3GT GT3GTF
配列番号 6 ； Gentiana scabra 3GT GT3GTR
配列番号 7 ； Verbena hybrids 5GT H5GTF
配列番号 8 ； Verbena hybrida 5GT H5GTR
配列番号 9 ； Scutellaria baicalensis GT SBGTF
配列番号 1 0 ； Scutellaria baicalensis GT SBGTR 配列番号 1 1 ； T170 - Ncol PCR primer
配列番号 1 2 ； M13M4 PCR primer
配列番号 1 3 ； 3—ダルコシド糖転移活性を有するタンパク質のァミノ酸配列。
An amino acid sequence of a protein having an activity to t ransfer glucose to sugar at position 3 of f lavonoids
配列番号 2 2 ； T170F PCR primer
配列番号 2 3 ； T170R PCR primer
配列番号 2 4 ； CHIF1 PCR primer 配列番号 2 5 ； CHIR1 PCR primer
配列番号 2 6 ； T128- Ncol PCR primer
配列番号 2 7 ； A93-75 BspHI PCR primer 配列番号 2 8 ； A93- 75- Bglll PCR primer
配列番号 2 9 ； S6B11-RT-F PCR primer 配列番号 3 0 ； S6B11-RT-R PCR primer
配列番号 3 1 ； S12A2 - Ncol PCR primer
配列番号 3 2 ； S12A2-S1 PCR primer
配列番号 3 3 ； S12A2-S2 PCR primer
配列番号 3 4 ； S12A2-A1 PCR primer 配列番号 3 5 ； S12A2-A2 PCR primer 配列番号 3 6 ； pQE61-f primer
配列番号 3 7 ； pQE61-r primer
配列番号 3 8 ； T128-F PCR Primer
配列番号 3 9 ； T128-R PCR Primer
配列番号 4 0 ； PhF3H-ClaI PCR Primer
配列番号 4 1 ； ThF3H-SalIl PCR Primer
配列番号 4 2 ； ThF3H-SalI2 PCR Primer
配列番号 4 3 ； TpCHI-Sall PCR Primer 配列番号 4 4 ； TpCHI-Xball PCR Primer
配列番号 4 5 ； TpCHI-XbaI2 PCR Primer
配列番号 4 6 ；ベクターに挿入される Pacl- FselF アダプター
Pacl— FselF adapter inserted in a vector 配列番号 4 7 ；ベクターに挿入される PacI-FseIRアダプター
PacI-FseIR adapter inserted in a vector 配列番号 4 8 ； M13RV PCR Primer 配列番号 4 9 ； BamHI-CHI-F PCR Primer
配列番号 5 0 ； Sal- CHI- R PCR Primer
配列番号 5 1 ； Sal- CHI- F PCR Primer
配列番号 5 2 ； EcoRI-CHI-R PCR Primer
配列番号 5 3 ； YCy3-12Pl PCR Primer
配列番号 5 4 ； YCy3-12P2 PCR Primer
配列番号 5 7 ； EcoFsel Primer
配列番号 5 8 ； EcoFseR Primer
配列番号 5 9 ； HinFseR Primer
配列番号 6 0 ； HinFse3 Primer

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 配列番号 2に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に対し て 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換及び/若しく は付加された アミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を 有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
2 . 配列番号 1に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リ ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
3 . 配列番号 1 5に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミ ノ酸配列に対 して 1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、 置換及び/若しくは付加され たアミ ノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性 を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
4 . 配列番号 1 4に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リ ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
5 . 配列番号 1 7に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミ ノ酸配列に対 して 1若しくは複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及び/若しくは付加され たアミ ノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性 を有するタンパク質をコードする遺伝子。
6 . 配列番号 1 6に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リジェン トな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
7 . 配列番号 1 9に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に対 して 1若しく は複数個のァミ ノ酸が欠失、 置換及び Z若しくは付加され たアミ ノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性 を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
8 . 配列番号 1 8に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リ ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
9 . 配列番号 2 1に記載のアミ ノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に対 して 1若しく は複数個のァミ ノ酸が欠失、 置換及び _ 若しくは付加され たアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性 を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
1 0 . 配列番号 2 0に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リ ジェントな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類 の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコー ドする遺伝子。
1 1 . 配列番号 5 6に記載のアミノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列に 対して 1若しく は複数個のアミ ノ酸が欠失、 置換及び/若しく は付加さ れたアミノ酸配列からなり、 かつカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活 性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
1 2 . 配列番号 5 5に記載する塩基配列と相補的な塩基配列からなる D N Aとス ト リ ジヱントな条件下でハイブリダイズし、 かつカルコン類 の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
1 3 . 請求の範囲第 1項から第 1 2項のいずれか一項に記載の遺伝子 を含んでなるベクター。
1 4 . 請求の範囲第 1 3項に記載のべクターにより形質転換された宿 主細胞。
1 5 . 請求の範囲第 1 4項に記載の宿主細胞を培養又は生育させ、 当 該宿主細胞からカルコン類の 2 ' 位に糖を転移する活性を有するタンパ ク質を採取することを特徴とする当該タンパク質の製造方法。
1 6 . 請求の範囲第 1 5項に記載の方法で得られたタンパク質。
1 7 . 請求の範囲第 1項から第 1 2項のいずれか一項に記載の遺伝子 が導入された植物体若しくは当該植物体の子孫となる植物体、 又はそれ ら植物体の組織。
1 8 . 請求の範囲第 1 7項に記載の植物体から採取された切り花。
1 9 . 請求の範囲第 1項から第 1 2項のいずれか一項に記載の遺伝子 を植物体に導入及び発現して花色が改変された植物体、 及び当該植物体 の子孫となる植物体。
2 0 . 改変された花色が黄色であることを特徴とする請求の範囲第 1 8項に記載の植物体。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005059141A1 (ja) * 2003-12-17 2005-06-30 Suntory Limited フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法
WO2006049315A1 (ja) * 2004-11-02 2006-05-11 Suntory Limited リグナン配糖化酵素およびその利用
WO2006085699A1 (ja) * 2005-02-14 2006-08-17 Suntory Limited 環境負荷化学物質を検出し得るトランスジェニック植物
WO2011001777A1 (ja) * 2009-06-30 2011-01-06 サントリーホールディングス株式会社 花の色を薄く又は濃くする方法
CN110982830A (zh) * 2019-12-06 2020-04-10 中国药科大学 糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用
CN114807075A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 东北林业大学 糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用
JP7491517B2 (ja) 2020-03-20 2024-05-28 ポステック・アカデミー‐インダストリー・ファウンデーション 植物から目的タンパク質を大量生産する方法

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008073578A2 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Iowa State University Research Foundation, Inc. Plant genes involved in nitrate uptake and metabolism
JP5698663B2 (ja) * 2009-05-19 2015-04-08 サントリーホールディングス株式会社 フロフラン型リグナン４位グルコース転移酵素、及びそれをコードするポリヌクレオチド
MY180803A (en) 2010-06-02 2020-12-09 Evolva Inc Recombinant production of steviol glycosides
WO2013022989A2 (en) 2011-08-08 2013-02-14 Evolva Sa Recombinant production of steviol glycosides
JP6147195B2 (ja) 2012-01-17 2017-06-14 サントリーホールディングス株式会社 新規糖転移酵素遺伝子及びその使用
JP6165875B2 (ja) * 2012-12-06 2017-07-19 上海 インスティテューツ フォー バイオロジカル サイエンシーズ、チャイニーズ アカデミー オブ サイエンシーズＳｈａｎｇｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ Ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 一連の糖転移酵素およびその応用
AU2014214004B2 (en) 2013-02-06 2018-05-24 Evolva Sa Methods for improved production of Rebaudioside D and Rebaudioside M
MY184253A (en) 2013-02-11 2021-03-29 Evolva Sa Efficient production of steviol glycosides in recombinant hosts
SG10201901007PA (en) 2014-08-11 2019-03-28 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
AU2015314251A1 (en) 2014-09-09 2017-03-16 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
US10364450B2 (en) 2015-01-30 2019-07-30 Evolva Sa Production of steviol glycoside in recombinant hosts
US10604743B2 (en) 2015-03-16 2020-03-31 Dsm Ip Assets B.V. UDP-glycosyltransferases
EP3332018B1 (en) 2015-08-07 2022-07-27 Evolva SA Production of steviol glycosides in recombinant hosts
MY198001A (en) 2016-04-13 2023-07-25 Evolva Sa Production of steviol glycoside in recombinant hosts
WO2017198682A1 (en) 2016-05-16 2017-11-23 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
WO2018083338A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Evolva Sa Production of steviol glycosides in recombinant hosts
CN111373045A (zh) 2017-03-24 2020-07-03 特征生物科学公司 水溶性大麻素在植物系统中高水平体内生物合成和分离
AU2018301674B2 (en) 2017-07-11 2024-03-28 Trait Biosciences, Inc. Generation of water-soluble cannabinoid compounds in yeast and plant cell suspension cultures and compositions of matter
US11905543B2 (en) 2017-07-11 2024-02-20 Trait Biosceinces, Inc. In vivo generation of water-soluble acetylated cannabinoid glycoside compounds in plant cell suspension cultures
US11946059B2 (en) 2017-07-11 2024-04-02 Trait Biosciences, Inc. In vivo generation of water-soluble cannabinoids in plant cell suspension cultures
CN116286894A (zh) * 2023-02-22 2023-06-23 首都医科大学 一种催化稀有人参皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1072684A1 (en) * 1999-02-16 2001-01-31 Suntory Limited Genes encoding proteins having activity of transferring sugar onto aurone
WO2001092509A1 (fr) * 2000-06-02 2001-12-06 International Flower Developments Proprietary Limited Nouveaux genes de glycosyltransferase

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1072684A1 (en) * 1999-02-16 2001-01-31 Suntory Limited Genes encoding proteins having activity of transferring sugar onto aurone
WO2001092509A1 (fr) * 2000-06-02 2001-12-06 International Flower Developments Proprietary Limited Nouveaux genes de glycosyltransferase

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ISHIDA M. ET AL.: "Isolation of a cDNA for the chalcone 2'-glucosyltransferase gene and its expression profile in carnation flowers", PLANT CELL PHYSIOL., vol. 44, no. SUPPL., 2003, pages S158, XP002973931 *
LI Y. ET AL.: "Phylogenetic analysis of the UDP-glucosyltransferase multigene family of arabidopsis thaliana", J. BIOL. CHEM., vol. 276, no. 6, 9 February 2001 (2001-02-09), pages 4338 - 4343, XP002172234 *
VOGT T.: "Substrate specificity and sequence analysis define a polyphyletic origin of betanidin 5-and 6-O-glucosyltransferase from dorotheanthus bellidiformis", PLANTA, vol. 214, no. 3, January 2002 (2002-01-01), pages 492 - 495, XP002973933 *
YAMAZAKI M. ET AL.: "Molecular cloning and biochemical characterization of a novel anthocyanin 5-O-glucosyltransferase by mRNA differential display for plant forms regarding anthocyanin", J. BIOL. CHEM., vol. 274, no. 11, 12 March 1999 (1999-03-12), pages 7405 - 7411, XP002973932 *

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8350125B2 (en) 2003-12-17 2013-01-08 Suntory Holdings Limited Method for producing yellow flower by controlling flavonoid synthetic pathway
US7750209B2 (en) 2003-12-17 2010-07-06 International Flower Developments Proprietary Limited Method for producing yellow flower by controlling flavonoid synthetic pathway
WO2005059141A1 (ja) * 2003-12-17 2005-06-30 Suntory Limited フラボノイド合成系の制御による黄色の花の作製方法
US7935802B2 (en) 2004-11-02 2011-05-03 Suntory Holdings Limited Lignan glycosidase and utilization of the same
WO2006049315A1 (ja) * 2004-11-02 2006-05-11 Suntory Limited リグナン配糖化酵素およびその利用
JP4912292B2 (ja) * 2005-02-14 2012-04-11 サントリーホールディングス株式会社 環境負荷化学物質を検出し得るトランスジェニック植物
WO2006085699A1 (ja) * 2005-02-14 2006-08-17 Suntory Limited 環境負荷化学物質を検出し得るトランスジェニック植物
WO2011001777A1 (ja) * 2009-06-30 2011-01-06 サントリーホールディングス株式会社 花の色を薄く又は濃くする方法
CN110982830A (zh) * 2019-12-06 2020-04-10 中国药科大学 糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用
CN110982830B (zh) * 2019-12-06 2022-07-12 中国药科大学 糖基转移酶基因RyUGT3A及其编码蛋白与应用
JP7491517B2 (ja) 2020-03-20 2024-05-28 ポステック・アカデミー‐インダストリー・ファウンデーション 植物から目的タンパク質を大量生産する方法
CN114807075A (zh) * 2021-01-27 2022-07-29 东北林业大学 糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用
CN114807075B (zh) * 2021-01-27 2023-11-21 东北林业大学 糖基转移酶PpUGT73E5及其在重楼皂苷合成中的应用

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