WO2003106613A1 - 培養装置 - Google Patents

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WO2003106613A1
WO2003106613A1 PCT/JP2003/006859 JP0306859W WO03106613A1 WO 2003106613 A1 WO2003106613 A1 WO 2003106613A1 JP 0306859 W JP0306859 W JP 0306859W WO 03106613 A1 WO03106613 A1 WO 03106613A1
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culture
unit
cells
medium
culturing
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PCT/JP2003/006859
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日比野　浩樹
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オリンパス光学工業株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control

Definitions

  • the present invention relates to a culture device for culturing cells from a body fluid collected from a patient. Ming background technology
  • HAP Hydroxyapatite
  • TCP tricalcium phosphate
  • a scaffold consisting of: When one TCP is brought into contact with bone cells in a bone defect, osteoclasts eat —TCP, and osteoblasts form new bone, a so-called remodeling process. That is, the bone filling material that has been filled in the bone defect is replaced with autologous bone over time.
  • bone marrow fluid collected from a patient is applied to the bone replacement material to fill the bone defect.
  • a bone marrow fluid containing a large amount of mesenchymal stem cells is collected from a patient, and a bone filling material is immersed in the bone marrow fluid, and then filled into a bone defect.
  • a sufficient amount of mesenchymal stem cells cannot be attached to the bone replacement material simply by immersing the bone replacement material in the bone marrow fluid.
  • Culture of bone marrow fluid includes various steps such as a culture step, a medium exchange step, and an infection test step, and conventionally, all of these steps were performed manually.
  • the present invention has been made in view of the above-described circumstances, and has as its object to provide a culture apparatus capable of reducing the chance of infection with bacteria and the like and providing healthy cultured cells.
  • the present invention provides a storage unit for storing a medium and a living tissue supplement, a cell extraction unit for extracting cells to be cultured from a collected body fluid, the storage unit and the cell extraction.
  • a cell culture unit connected to the cell culture unit for culturing the extracted cells in the culture medium ⁇ and producing a living tissue replacement from the cultured cells and the living tissue replacement material; and
  • a culturing apparatus provided with a sealing portion for sealing in a sterile room.
  • the collected body fluid is sent to the cell extraction unit, and the cells to be cultured are extracted in the cell extraction unit.
  • the extracted cells are sent to a cell culture unit, mixed with a medium stored in a storage unit, and then cultured for a predetermined period to proliferate.
  • a living tissue complement is manufactured.
  • the manufactured biological tissue complement is sent to the sealing section and output in a state sealed in the container. In this case, since all of these steps are performed in a sterile room, the chance of infection by bacteria and the like is reduced throughout the culture period, and a healthy living tissue complement is provided.
  • the present invention provides the culture device, wherein the culture device includes a test unit connected to the cell extraction unit and the cell culture unit, the test unit performing at least an infection test on body fluids and cells, in the sterile room.
  • the culture device includes a test unit connected to the cell extraction unit and the cell culture unit, the test unit performing at least an infection test on body fluids and cells, in the sterile room.
  • infection detection can be performed on body fluids, cells contained in the cell culture section, and the like. Since the infection test is also performed in a sterile room, the chance of infection by bacteria and the like in the inspection process is reduced.
  • the present invention provides the culture device, wherein, in the culture device, an infection test on the cells is performed using a medium discarded from a cell culture unit.
  • the medium discarded from the cell culture section by using the medium discarded from the cell culture section, it becomes possible to perform infection detection on cells without contaminating the cultured cells. You. In the cell culture section, the medium is changed regularly or continuously, and unnecessary medium is discarded each time. It is possible to accurately inspect the cells that have been in contact with the medium for infection.
  • the present invention provides the culture device, wherein in the culture device, the infection test is also performed on a biological tissue complement produced in the cell culture unit.
  • a part of a living tissue complement which is the final product, is collected by cutting or the like, or is used for inspection by using a biological tissue complement produced under the same conditions as the final product.
  • the present invention provides the culture device, further comprising a recording unit connected to the detection unit and recording at least information including a test result in a container in which the living tissue filling body is sealed in the sealing unit.
  • a culture device is provided.
  • the information including the test result of the infection test is recorded in the container in which the biological tissue complement is sealed by the operation of the recording unit, so that the person receiving the manufactured biological tissue complement is
  • the result of the detection of the biological tissue complement can be known from the information recorded in the container. Therefore, the quality of the living tissue filling body enclosed in the container is guaranteed.
  • the present invention provides the culture device, wherein the cell culture unit comprises: a primary culture unit for culturing the extracted cells in a culture medium; and a secondary culture unit for culturing the cultured cells in the culture medium together with a living tissue supplement.
  • the cell culture unit comprises: a primary culture unit for culturing the extracted cells in a culture medium; and a secondary culture unit for culturing the cultured cells in the culture medium together with a living tissue supplement.
  • a culture device including a culture unit is provided.
  • the present invention provides the culture device, wherein in the culture device, the sealing unit seals the cells cultured in the primary culture unit.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing input and output of the culture device according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram showing a schematic configuration of the culture device of FIG.
  • FIG. 3 is a flowchart for explaining each step of the culture apparatus of FIG.
  • FIG. 4A and 4B are views for explaining the operation of the bone replacement material supply means used in the culture device of FIG.
  • FIG. 5 is a flowchart for explaining each step of the culture apparatus according to the second embodiment.
  • FIG. 6 is a schematic diagram showing another example of the culture apparatus of the present invention. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • a culture device according to an embodiment of the present invention will be described below with reference to FIGS. 1 to 4A and 4B.
  • the culture device 1 comprises a bone marrow fluid 2 collected from a patient, a bone filling material 3 for attaching cells contained in the bone marrow fluid 2, and a culture medium 4.
  • the bone substitute 5 to which the cultured cells are adhered and data indicating the results of the infection test in each step are output.
  • the culture apparatus 1 includes a storage unit 6, a cell extraction unit 7, cell culture units 8a and 8b, a sealing unit 9, and an inspection unit.
  • the upper part 10 is provided in the sterile room 11.
  • the storage section 6 is composed of a plurality of containers for separately storing the bone filling material 3 and the culture medium 4, respectively.
  • Medium 4 is composed of, for example, MEM (Minimal Essential Medium), FBS (Fetal Bovine Serum), and antibiotics as shown in Fig. 3, and these are mixed.
  • the container for storing the culture medium 4 is housed in a refrigerator (not shown), and is kept at, for example, 4 ° C.
  • the antibiotic is, for example, ⁇ a nicillin antibiotic.
  • the bone marrow fluid 2 is supplied to the cell extractor 7.
  • the cell extractor ⁇ is, for example, a centrifuge, and receives the bone marrow fluid 2 from the container containing the bone marrow fluid 2 and rotates the same.
  • bone marrow cells having a high specific gravity can be extracted from the bone marrow fluid 2.
  • the cell culture section for culturing the bone marrow cells is composed of a primary culture section 8a and a secondary culture section 8b. As shown in FIG. 3, the primary culture unit 8a is connected to each of the containers containing the cell extraction unit 7 and the culture medium 4.
  • the primary culture section 8a includes a culture vessel 15 for receiving the bone marrow cells extracted in the cell extraction section 7 and the medium 4 stored in the vessel, and a culture vessel 15 for receiving the bone marrow cells and the culture medium.
  • a constant temperature and humidity chamber 16 for maintaining the cells under a constant culture condition for a predetermined time.
  • a container 17 for storing a protease such as trypsin is connected to the primary culture section 8a.
  • the secondary culture section 8b is connected to the primary culture section 8a and also to a container (not shown) for accommodating the bone filling material 3.
  • the secondary culture unit 8b also includes a culture vessel 19, stirring means (not shown), and a thermo-hygrostat 20.
  • the container for accommodating the bone capturing material 3 is provided with, for example, a bone replacement material supplying means 21 as shown in FIGS. 4A and 4B.
  • the bone replacement material supply means 21 is provided with a shirt 23 provided in a container 22 containing the bone replacement material 3 and a lower portion of the bone replacement material 3a so as to allow only the lowest bone replacement material 3a. It is composed of holding means 24 for holding the bone filling material 3.
  • the holding means 24 is composed of a piston 25 and a holding rod 26. That is, as shown in FIG. 4A, from the state where the shirt 23 is closed and all the bone substitute 3 is placed on the shirt 23, as shown in FIG. By operating the and opening the shirt 23 with the second lowest bone replacement material 3 b being held down by the holding rod 26, only the lowest bone replacement material 3 a can be dropped. You. Therefore, by operating the holding means 24 and opening and closing the shirt 23 according to the required amount of the bone filling material 3 determined according to the amount of bone marrow cells to be cultured, The bone filling material 3 can be put into the culture vessel 19.
  • the primary culture section 8a and the secondary culture section 8b are provided with medium exchange means 27, 28 for periodically exchanging the culture medium in the culture vessels 15, 19, respectively.
  • the medium exchange means 27 and 28 include, for example, vessel rotating means (not shown) for rotating the culture vessels 15 and 19 around a horizontal axis.
  • vessel rotating means not shown
  • the culture medium 15, 19 is rotated around the horizontal axis by operating the container rotating means to incline or invert the culture medium 4, and the internal culture medium 4 is discharged from the culture vessels 15, 19. You can do it.
  • the medium exchange means 27, 28 is provided with a waste medium container 29 for accommodating the discharged medium 4 '.
  • the sealing unit 9 is connected to the secondary culturing unit 8b, and is configured to seal and output the bone substitute produced in the secondary culturing unit 8b in a sealed container 3 °.
  • a specimen extraction section 31 is connected to the secondary culture section 8b, so that a specimen for examination is taken out from a bone substitute as a final product.
  • test unit 10 is connected to the container of the bone marrow fluid 2, the waste medium container 29 of the primary culture unit 8a, the waste medium container 29 of the secondary culture unit 8b, and the sample extraction unit 31.
  • It is an automatic real-time PCR (Polymerase Chain Reaction) device.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • a primer that can detect all fungi, bacteria, endotoxins, viruses, mycoplasmas and the like is used.
  • the storage unit 6, the cell extraction unit 7, the cell culture units 8a and 8b, the sealing unit 9, and the inspection unit 10 are arranged in the sterile room 11.
  • the interior of the aseptic chamber 11 is set to a constant positive pressure, for example, like a clean room, and the number of dust per unit volume is limited by a particle counter or the like.
  • the culture device 1 when the bone marrow fluid 2 collected from a patient is put into the bone marrow fluid storage container, a part of the bone marrow fluid 2 is sent to the testing unit 10 and the infection test is performed. Done. The remainder of the bone marrow fluid 2 is sent to the cell extractor 7 where it is centrifuged to extract the bone marrow cells to be cultured.
  • the extracted bone marrow cells are sent to the primary culture section 8a and cultured, so that the bone marrow cells are proliferated until they reach a predetermined number of cells.
  • the primary culture unit 8a as shown in Fig. 3, the transmitted bone marrow cells and the culture medium 4 stored in the storage unit 6 composed of MEM, FBS, antibiotics, etc. Mixed within 5. A part of the culture medium 4 is taken out before mixing, and sent to the inspection unit 10 to be inspected for infection.
  • the mixed bone marrow cells and medium 4 are cultured in a thermo-hygrostat 16 under a predetermined culture condition for a predetermined period. Then, it is determined whether it is time to replace the medium, and when a predetermined medium replacement time comes, the medium 4 ′ is discharged to the waste medium container 29. A part of the medium 4 ′ discharged into the waste medium container 29 is sent to the inspection unit 10 to be inspected for infection. On the other hand, for the cells remaining in the culture vessel, it is determined whether or not it is time to finish the primary culture. If it is not the time to finish, the primary culture is continued by mixing the medium 4 again. Then, until the end of the primary culture, the mixing of the medium 4, the culture, and the discharge of the medium 4 'are repeated.
  • a quality test is performed to determine whether the number of cells has reached the specified number. If the number of cells has not increased sufficiently, the primary culture process is performed again. . If it is determined in the quality inspection that the number of cells is sufficiently increased, trypsin is introduced into the culture vessel 15 and the cultured cells growing on the bottom of the culture vessel 15 are peeled off. You. Then, only the cultured cells are extracted by being subjected to the centrifugal separator 18. Thereafter, the number of the cultured cells is adjusted by a hemocytometer, and is sent to the secondary culture unit 8b.
  • the sent cultured cells are put into the culture vessel 19, and the bone replacement material 3 stored in the storage unit 6 is put into the culture vessel 19 As a result, the cultured cells are seeded on the bone replacement material 3.
  • the culture medium 4 is supplied and mixed into the culture vessel 19 from the storage section 6.
  • the supplied medium 4 is different from the medium 4 used for primary culture, in addition to MEM, FBS, and antibiotics, as well as dexamethasone and differentiation-inducing factors such as S-glycemic phosphate and vitamin C. Nutrition is mixed.
  • the secondary culture is started in a state where the bone filling material 3 seeded with the cultured cells is immersed in the medium 4.
  • the medium 4 ' is discharged into the waste medium container 29 at each predetermined medium replacement time, and an infection test is performed.
  • the quality inspection is performed again and the secondary culture ends.
  • the secondary culture 8b After the completion of the secondary culture, the secondary culture 8b has grown sufficiently using the bone substitute 3 as a base material.
  • the bone substitute having the lost cells is output.
  • a part of the bone filling body is taken out as a specimen for examination and sent to the examination section 10 to perform an infection test.
  • the remaining bone filling material is sent to the sealing portion 9 to be sealed in the sealed container 30.
  • the bone filling body enclosed in the sealed container 30 output from the sealing section 9 is one of the final outputs of the culture device 1 according to the present embodiment.
  • the waste medium 4 ′ and the sample sent to the inspection unit 10 are inspected for infection in the inspection unit 10, and the inspection result is also one of the final outputs of the culture device 1 according to the present embodiment. .
  • the sealed bone substitute and the results of the infection test and the like during the culture can be simultaneously obtained only by adding the bone marrow fluid 2 collected from the patient. Can be. Therefore, the chances of infection with bacteria, fungi, etc. can be greatly reduced as compared with those conventionally performed manually. As a result, a healthy bone substitute can be provided, and the labor of the operator can be saved, and a large amount of bone substitute can be easily manufactured.
  • the cells after culturing in the primary culturing unit may be sent to the sealing unit 9 and output in a sealed state (route indicated by a broken line in FIG. 2).
  • the culture device 40 according to the present embodiment is different from the culture device 1 according to the first embodiment in that the culture device 40 includes an entry unit 41 connected to the detection unit 10.
  • the entry unit 41 includes, for example, a database that stores a group of inspection results for each bone replacement and an identification code 42 for identifying the group, and an identification code printer. Then, the identification code 42 corresponding to the bone filling body in the sealed container 30 can be printed on the sealed container 30 in which the bone capturing body is sealed.
  • the culture apparatus 40 configured as described above, a person who receives the sealed container 30 with the identification code 42 reads the identification code 42 printed on the container 30. Alone, it is possible to extract the group of inspection results corresponding to the identification code 42 from the database, and for each bone substitute, the results of infection at each stage of the culturing process are converted to the bone replacement. There is an effect that it can be easily known in a form corresponding to the filling.
  • the information stored in the database in association with the identification code 42 includes not only the results of the infection test of the bone substitute but also the name, gender, age, date of birth, etc. for identifying the patient.
  • the identification data of the culture, culture conditions and culture period indicating the history of culture, and test results other than infection test, for example, quality test results may be stored.
  • the means of transport between the culturing devices 1 and 40 disposed in the aseptic chamber 11 is not specifically shown, but is constituted by a general transport means such as a conveyor or a manifold. It should just be done. Further, as a supply means of the liquid medium 4 or the like, for example, a roller pump or the like can be adopted.
  • substances that contribute to growth such as growth factors, for example, cytokines, concentrated platelets, BMP, FGF, TGF-j3, IGF, PDGF, VEGF, HGF, or a combination thereof can be used. You may mix. Hormonal agents such as estrogen and nutrients such as vitamins may be mixed.
  • the proportion of these growth factors, hormonal agents or nutrients may be determined according to the activity of the bone marrow fluid 2 to be cultured.
  • penicillin antibiotics were used as antibiotics, but any other antibiotics such as cefm, macrolide, tetracycline, fosfomycin, aminoglycoside, and new quinoline may be used instead. Can be.
  • the bone marrow fluid 2 has been described as an example of the body fluid to be cultured.
  • peripheral blood or umbilical cord blood may be used.
  • a fluid containing somatic cells such as ES cells, somatic stem cells, mesenchymal stem cells, bone cells, and chondrocytes is also referred to as a body fluid for convenience.
  • the cells may be autologous cells or allogeneic cells.
  • bone is taken as an example of the living tissue, but a supplement of another living tissue may be manufactured.
  • any material having affinity for living tissue can be used as the living tissue filling material, and a bioabsorbable material is more preferable.
  • a porous body may be used.
  • the porous body is biocompatible porous ceramics, collagen, polylactic acid, porous metal, or the like, and is not limited to these as long as it has a large number of pores.
  • porous materials include calcium phosphate ceramics such as apatite and J3-TCP, collagen, and polymilk. Acids and the like can be used.
  • a combination of calcium phosphate ceramics and collagen, or a combination of calcium phosphate ceramics and polylactic acid may be used.
  • Collagen and polylactic acid have the characteristic of being biodegradable and absorbed by the living body, whereas apatite has the characteristic of being excellent in strength. It goes without saying that a person skilled in the art can appropriately select and use an appropriate type of porous body according to the site to be transplanted.
  • each component device such as the bone replacement material supply means 21 in each of the above embodiments is an example of the means constituting the present invention, and the present invention is not limited to these.
  • Industrial applicability is an example of the means constituting the present invention, and the present invention is not limited to these.
  • a living tissue complement can be produced in a sterile room without human intervention only by injecting a bodily fluid, thereby reducing the chance of infection.
  • a healthy body tissue complement can be provided.
  • the detection result can be known together with the biological tissue complement, the reliability of the quality of the provided biological tissue complement can be enhanced, and the user can use the specimen with more assurance. There is also an effect.

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Abstract

本発明は、細菌等の感染の機会を低減し、健全な細胞を培養することができる培養装置に関する。前記培養装置1は、培地と生体組織補填材をそれぞれ貯蔵する貯蔵部6と、採取された体液2から培養すべき細胞を抽出する細胞抽出部7と、貯蔵部6および細胞抽出部7に接続され、抽出された細胞を培地内において培養し、培養された細胞と生体組織補填材とから生体組織補填体を製造する細胞培養部8a,8bと、製造された生体組織補填体を容器内に密封する密封部9とを無菌室11内に備えるものである。

Description

技術分野
この発明は、 患者から採取した体液から細胞を培養する培養装置に関するものであ る。 明背景技術
近年、 骨腫瘍摘出や外傷等により生じた骨欠損部等の生体組織欠損部に、 骨補填材 等の生体組織補填材を補填することにより、 骨書等の生体組織を再生させて生体組織欠 損部を修復することが可能になってきている。 骨補填材としては、 ハイ ドロキシァパ タイ ト （H A P ) やリン酸三カルシウム （T C P ) が知られているが、 体内に異物を 残さないとする考え方から、 例えば、 一 T C Pのようなリン酸カルシウム多孔体か らなる足場材が使用される。 一 T C Pを骨欠損部の骨細胞に接触させておくと、 破 骨細胞が —T C Pを食べ、 骨芽細胞が新しい骨を形成する、 いわゆるリモデリング が行われる。 すなわち、 骨欠損部に補填された骨補填材は、 経時的に自家骨に置換さ れていくことになる。
一方、 術後の骨欠損部の修復速度を高めるために、 骨補填材をそのまま用いるので はなく、 患者から採取した骨髄液を骨補填材に付与して骨欠損部に補填することが行 われている。 この場合に、 間葉系幹細胞を多く含む骨髄液を患者から採取し、 骨補填 材をこの骨髄液に浸した後に、 骨欠損部に補填する。 しかしながら、 単に骨補填材を 骨髄液に浸すだけでは、 充分な量の間葉系幹細胞を骨補填材に付着させることができ ないという問題がある。 このため、 充分な量の間葉系幹細胞を骨補填材に付着させる ベく、 抽出した骨髄液を培養することにより、 増殖した間葉系幹細胞を骨補填材に付 着させることが考えられている。
骨髄液の培養には、 培養工程、 培地交換工程、 感染検査工程等の諸種の工程が含ま れ、 従来は、 これらの全ての工程を人手により行っていた。
しかしながら、 各工程および工程間の移行時に人手が介在すると、 細菌や真菌等の 混入の可能性が高まるという問題があつた。 発明の開示
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、 細菌等の感染の機会を低 減し、 健全な培養細胞を提供することができる培養装置を提供することを目的として レヽる。
前記目的を達成するために、 本発明は、 培地と生体組織補填材をそれぞれ貯蔵する 貯蔵部と、 採取された体液から培養すべき細胞を抽出する細胞抽出部と、 前記貯蔵部 および前記細胞抽出部に接続され、 抽出された細胞を培地內において培養し、 培養さ れた細胞と生体組織補填材とから生体組織補填体を製造する細胞培養部と、 製造され た生体組織補填体を容器内に密封する密封部とを無菌室内に備える培養装置を提供す る。
このような培養装置によれば、 採取された体液が細胞抽出部に送られ、 該細胞抽出 部において培養すべき細胞が抽出される。 抽出された細胞は細胞培養部に送られ、 貯 蔵部に貯蔵されている培地と混合された後、 所定期間にわたって培養されることによ り増殖させられる。 また、 貯蔵部に貯蔵されている生体組織捕填材に増殖させた細胞 を付着させることにより、 生体組織補填体が製造される。 製造された生体組織補填体 は、 密封部に送られることにより容器内に密封された状態で出力される。 この場合に おいて、 これらの全ての工程が無菌室内において行われるので、 培養期間全体を通じ て細菌等が感染する機会が低減され、 健全な状態の生体組織補填体が提供されること になる。
また、 本発明は、 前記培養装置において、 前記細胞抽出部および前記細胞培養部に 接続され、 少なくとも体液および細胞における感染検査を行う検査部を前記無菌室内 に備える培養装置を提供する。 - このような培養装置によれば、 体液や細胞培養部に収容されている細胞等に対して 感染検查を行うことができる。 感染検査も無菌室内において行われるので、 検査工程 における細菌等の感染の機会も低減されることになる。
また、 本発明は、 前記培養装置において、 前記細胞における感染検査が、 細胞培養 部から廃棄される培地により行われる培養装置を提供する。
このような培養装置によれば、細胞培養部から廃棄される培地を用いることにより、 培養されている細胞を汚染することなく細胞における感染検查を行うことが可能とな る。 細胞培養部においては、 培地は定期的にあるいは継続的に交換され、 その都度不 要となる培地が廃棄されるので、 この廃棄される培地を用いて感染検査を行うことに より、 それまでその培地に接触していた細胞における感染を的確に検査することが可 能となる。
また、 本発明は、 前記培養装置において、 前記感染検査が前記細胞培養部において 製造された生体組織補填体に対しても行われる培養装置を提供する。
このような培養装置によれば、 最終製品である生体組織補填体の一部を切り取る等 して採取し、 あるいは、 検查用に最終製品と同一条件下で製造した生体組織補填体を 用いて感染検査を行うことにより、 より確実に健全な生体組織補填体を提供すること が可能となる。
また、 本発明は、 前記培養装置において、 前記検查部に接続され、 前記密封部にお いて生体組織補填体を密封した容器に、 少なくとも検査結果を含む情報を記録する記 録部をさらに備える培養装置を提供する。
このような培養装置によれば、 記録部の作動により、 感染検査の検査結果を含む情 報が生体組織補填体を密封した容器に記録されるので、 製造された生体組織補填体を 受け取る者は、 当該生体組織補填体の検查結果を容器に記録されている情報から知る ことができる。 したがって、 容器に封入されている生体組織補填体の品質が保証され ることになる。
また、 本発明は、 前記培養装置において、 前記細胞培養部が、 抽出された細胞を 培地内において培養する一次培養部と、 培養された細胞を培地内において生体組織補 填材とともに培養する二次培養部とを備える培養装置を提供する。
このような培養装置によれば、 一次培養部において、 増殖した培養細胞を得ること ができ、 二次培養部において、 生体組織補填材を基材として培養細胞を成長させた生 体組織補填体を得ることができる。 したがって、 製品として培養細胞または生体組織 補填体を得ることが可能となる。 また、 一次培養部および二次培養部の両方において 感染検查を行うことが可能となり、 より確実に健全性を確認することができる。 また、 本発明は、 前記培養装置において、 前記密封部が、 前記一次培養部で培養さ れた細胞を密封する培養装置を提供する。
このような培養装置によれば、 生体組織補填体とともに、 一次培養部で培養された 細胞をも、 細菌等の感染を回避した健全な状態で提供することが可能となる。 図面の簡単な説明
図 1は、 この発明の第 1の実施形態に係る培養装置の入出力を示す模式図である。 図 2は、 図 1の培養装置の概要構成を示すプロック図である。
図 3は、 図 2の培養装置の各工程を説明するためのフローチヤ一トである。
図 4 Aと 4 Bは、 図 1の培養装置に使用される骨補填材供給手段の動作を説明する 図である。
図 5は、 第 2の実施形態に係る培養装置の各工程を説明するためのフローチヤ一ト である。
図 6は、 この発明の他の培養装置の例を示す模式図である。 発明を実施するための最良の形態
この発明の一実施形態に係る培養装置について、 図 1から図 4 Aおよび 4 Bを参照 して以下に説明する。
本実施形態に係る培養装置 1は、 図 1に示されるように、 患者から採取した骨髄液 2と、 該骨髄液 2に含有されている細胞を付着させる骨補填材 3と、 培地 4とを供給 することにより、 培養細胞を付着させた骨補填体 5と、 各工程における感染検査の結 果を示すデータとを出力するものである。
さらに具体的には、 本実施形態に係る培養装置 1は、 図 2に示すように、 貯蔵部 6 と、 細胞抽出部 7と、 細胞培養部 8 a , 8 bと、 密封部 9と、 検查部 1 0とを無菌室 1 1内に備えている。
前記貯蔵部 6は、 骨補填材 3、 培地 4をそれぞれ別々に収容する複数の容器からな る。 培地 4は、 例えば、 図 3に示すように、 M E M(Minimal Essential Medium：最 小必須培地)、 F B S (Fetal Bovine Serum： ゥシ胎児血清） および抗生物質から構 成されており、 これらが混合された状態で、 あるいは別々の容器 1 2 , 1 3 , 1 4に 分離された状態で収容されている。 また、 培地 4を貯蔵する容器は、 図示しない冷蔵 装置内に収容されており、 例えば、 4 °Cに保持されている。 抗生物質は、 例えば、 ぺ ニシリン系抗生物質である。
骨髄液 2は細胞抽出部 7に供給される。 前記細胞抽出部 Ίは、 例えば、 遠心分離機 であり、 骨髄液 2を収容している容器から骨髄液 2を受け取って、 旋回させることに より、 骨髄液 2の中から比重の重い骨髄細胞を抽出することができるようになってい る。
前記骨髄細胞を培養するための細胞培養部は、 一次培養部 8 aと二次培養部 8 bと から構成されている。 一次培養部 8 aは、 図 3に示すように、 前記細胞抽出部 7およ び培地 4を収容している容器のそれぞれに接続されている。 この一次培養部 8 aは、 細胞抽出部 7において抽出された骨髄細胞と、 容器に貯蔵されている培地 4とを受け 入れる培養容器 1 5と、 培養用容器 1 5内においてこれら骨髄細胞および培地を攪拌 する攪拌手段 （図示略） と、 攪拌されて混合された骨髄液 2および培地 4を所定の温 度 （例えば、 3 7 ± 0 . 5 °C) および C 0 2濃度 （例えば 5体積％) 等の培養条件に 維持する恒温恒湿器 1 6とを備え、 所定時間にわたって一定培養条件下で細胞を培養 することができるようになつている。 また、 一次培養部 8 aには、 トリプシンなどの 蛋白質分解酵素を貯蔵する容器 1 7が接続されている。 これにより、 一次培養部 8 a における培養工程において、 培養容器 1 5内にトリプシンを供給することで、 培養容 器 1 5の底面に付着した細胞を培養容器 1 5から剥離させることができるようになつ ている。 さらに、 一次培養部 8 aには、 遠心分離機 1 8が接続されており、 これによ つてトリプシン内に混合している細胞を抽出することができるようになっている。 二次培養部 8 bは、 一次培養部 8 aに接続されているとともに、 骨補填材 3を 収容する容器 （図示略） にも接続されている。 この二次培養部 8 bも前記一次培 養部 8 aと同様に、 培養容器 1 9および図示しない攪拌手段、 恒温恒湿器 2 0を備え ている。 骨捕填材 3を収容する容器には、 例えば、 図 4 Aおよび 4 Bに示すような、 骨補填材供給手段 2 1が設けられている。 この骨補填材供給手段 2 1は、 骨補填材 3 を収容する容器 2 2に設けられたシャツタ 2 3と、 最下位の骨補填材 3 aのみの落下 を許容するように、 それより上の骨補填材 3を押さえる保持手段 2 4により構成され ている。 保持手段 2 4は、 ピストン 2 5と保持ロッド 2 6とから構成されている。 すなわち、 図 4 Aに示されるように、 シャツタ 2 3を閉じて該シャツタ 2 3上に全 ての骨補填材 3を載置した状態から、 図 4 Bに示されるように、 保持手段 2 4を作動 させて、 保持ロッド 2 6により最下位から 2番目の骨補填材 3 bを押さえた状態で、 シャツタ 2 3を開くことにより、 最下位の骨補填材 3 aのみを落下させることができ る。 したがって、 培養される骨髄細胞の量に応じて决定される骨補填材 3の要求量に 従って、 保持手段 2 4を作動させて、 シャツタ 2 3を開閉することにより、 所望量の 骨補填材 3を培養容器 1 9内に投入することができるようになつている。
また、 これら一次培養部 8 aおよび二次培養部 8 bには、 培養容器 1 5 , 1 9内の 培地を定期的に交換する培地交換手段 2 7 , 2 8が備えられている。 培地交換手段 2 7 , 2 8は、例えば、培養容器 1 5 , 1 9を水平軸回りに回転させる容器回転手段 （図 示略） を備えている。 すなわち、 容器回転手段を作動させて培養容器 1 5， 1 9を水 平軸回りに回転させることにより傾斜させ、 あるいは、 反転させて内部の培地 4を培 養容器 1 5， 1 9から排出することができるようになつている。
また、 培地交換手段 2 7， 2 8には、 排出された培地 4 ' を収容する廃培地容器 2 9が備えられている。
密封部 9は、 二次培養部 8 bに接続され、 該二次培養部 8 bにおいて製造された骨 補填体を密封容器 3◦内に密封して出力するように構成されている。
さらに、 二次培養部 8 bには、 検体抽出部 3 1が接続され、 最終製品である骨補填 体から検査用の検体が取り出されるように構成されている。
また、 検査部 1 0は、 前記骨髄液 2の容器、 一次培養部 8 aの廃培地容器 2 9、 二 次培養部 8 bの廃培地容器 2 9および検体抽出部 3 1に接続された全自動リアルタイ ム P C R (Polymerase Chain Reaction) 装置である。 この全自動リアルタイム P C R装置においては、 真菌、 細菌、 エンドトキシン、 ウィルス、 マイコプラズマ等を全 て検出できるようなプライマが使用される。
本実施形態に係る培養装置 1では、 これら貯蔵部 6、 細胞抽出部 7、 細胞培養部 8 a , 8 b、 密封部 9および検査部 1 0が、 無菌室 1 1内に配置されている。 無菌室 1 1は、 例えばクリーンルームと同様に、 内部を一定の陽圧に設定され、 パーティクル カウンタ等によって単位容積当たりの塵埃の数を制限されている。
このように構成された本実施形態に係る培養装置 1の作用について、 以下に説明す る。
本実施形態に係る培養装置 1によれば、 患者から採取された骨髄液 2が骨髄液収容 容器に投入されると、該骨髄液 2の一部が検査部 1 0に送られて感染検査が行われる。 骨髄液 2の残りは、 細胞抽出部 7に送られ、 該細胞抽出部 7において遠心分離され、 培養すべき骨髄細胞が抽出される。
抽出された骨髄細胞は一次培養部 8 aに送られて培養されることにより、 所定の細 胞数となるまで増殖させられる。 一次培養部 8 aでは、 図 3に示されるように、 送られてきた骨髄細胞と貯蔵部 6に 貯蔵されていた M E M、 F B S、 および抗生物質等から構成された培地 4とが培養容 器 1 5内において混合される。 培地 4は、 混合前にその一部が取り出され、 検査部 1 0に送られることにより感染検査される。
混合された骨髄細胞と培地 4とは、 恒温恒湿器 1 6内において所定の培養条件に維 持された状態で、 所定期間にわたって培養される。 そして、 培地交換の時期か否かが 判断され、 予め定められた培地交換時期になると、 培地 4 ' が廃培地容器 2 9に排出 される。 廃培地容器 2 9に排出された培地 4 ' の一部は検査部 1 0に送られることに より感染検査される。 一方、 培養容器に残った細胞に対しては、 一次培養終了時期か 否かが判断され、 終了時期ではない場合には、 再度培地 4を混合して一次培養が継続 される。 そして、 一次培養終了時期となるまで、 培地 4の混合、 培養、 培地 4 ' の排 出が繰り返される。
一次培養終了時期となった場合には、 細胞数が所定数まで達しているか否かの品質 検査が行われ、 細胞数が充分に増加していない場合には、 再度一次培養工程が行われ る。 品質検査において、 細胞数が充分に増加していると判断された場合には、 培養容 器 1 5内にトリプシンが投入されて、 培養容器 1 5の底面に増殖していた培養細胞が 剥離される。 そして、 遠心分離機 1 8にかけられることにより、 培養細胞のみが抽出 される。 この後、 培養細胞はへモサイ トメータにかけられることにより細胞数が調整 され、 二次培養部 8 bへ送られる。
二次培養部 8 bでは、 送られてきた培養細胞が、 培養容器 1 9内に投入されるとと もに、 貯蔵部 6に収容されていた骨補填材 3が培養容器 1 9内に投入されることによ り、 骨補填材 3に培養細胞が播種される。 そして、 一次培養の場合と同様に貯蔵部 6 から培地 4が培養容器 1 9内に供給 ·混合される。 供給される培地 4は、 一次培養に 使用される培地 4とは異なり、 MEM、 F B S、 および抗生物質の他に、 デキサメサ ゾンや； Sグリセ口フォスフエ一ト等の分化誘導因子ゃビタミン C等の栄養剤が混合さ れる。 そして、 このようにして培養細胞を播種した骨補填材 3が培地 4内に浸漬され た状態で二次培養が開始される。 この二次培養工程においても、 所定の培地交換時期 ごとに培地 4 ' が廃培地容器 2 9に排出され、 感染検査が行われる。 そして、 二次培 養終了時期になると、 再度品質検査を経て二次培養が終了する。
二次培養が終了すると二次培養部 8 bからは骨補填材 3を基材として充分に成長し た細胞を有する骨補填体が出力される。 そして、 出力された骨補填体が検体抽出部 3 1を通過させられると、 骨補填体の一部が検査用の検体として取り出され、 検査部 1 0に送られて感染検査が行われる。 また、 残りの骨補填体は、 密封部 9に送られるこ とにより、 密封容器 3 0内に密封される。 そして、 密封部 9から出力される密封容器 3 0内に封入された骨補填体が、 本実施形態に係る培養装置 1の最終出力の 1つとな る。 また、 各工程において検査部 1 0に送られた廃培地 4 ' や検体は検査部 1 0にお いて感染検査され、 その検査結果も本実施形態に係る培養装置 1の最終出力の 1つと なる。
このように、 本実施形態に係る培養装置 1によれば、 患者から採取した骨髄液 2を 投入するだけで、 密封された骨補填体と培養途中における感染検査等の結果とを同時 に得ることができる。 したがって、 従来、 手作業で行われていたことと比較すると、 細菌や真菌等の感染の機会を大幅に低減することができる。 その結果、 健全な骨補填 体を提供することができるとともに、 作業者の手間を省き、 大量の骨補填体を簡易に 製造することができる。
なお、 一次培養部における培養後の細胞を密封部 9に送り、 密封した状態で出力し てもよい （図 2に破線で示すルート）。
次に、 本発明の第 2の実施形態に係る培養装置 4 0について、 図 5を参照して説明 する。
なお、 本実施形態の説明においては、 上述した第 1の実施形態に係る培養装置 1と 構成を共通とする箇所に同一符号を付して説明を簡略化する。
本実施形態に係る培養装置 4 0は、 検查部 1 0に接続された記入部 4 1を備えてい る点で、 第 1の実施形態に係る培養装置 1と相違している。 記入部 4 1は、 例えば、 骨補填体ごとの検查結果群と、 これを識別するための識別コード 4 2とを関連づけて 記憶するデータベースと、 識別コードプリンタとを備えている。 そして、 骨捕填体を 封入した密封容器 3 0に、 該密封容器 3 0内の骨補填体に対応する識別コード 4 2を 印刷することができるようになっている。
このように構成された本実施形態に係る培養装置 4 0によれば、 識別コード 4 2付 の密封容器 3 0を受け取った者は、 容器 3 0に印刷されている識別コード 4 2を読み とるだけで、 該識別コード 4 2に対応する検查結果群をデータベースから引き出すこ とが可能となり、 骨補填体ごとに、 培養工程の各段階における感染結果を、 当該骨補 填体に対応づけた形で容易に知ることができるという効果がある。
なお、 識別コード 4 2に対応づけてデータベースに記憶しておく情報としては、 当 該骨補填体の感染検査の結果のみならず、 患者を識別するための氏名、 性別、 年齢、 生年月日等の識別データや、 培養の履歴を示す培養条件や培養期間、 さらに、 感染検 查以外の検査結果、 例えば、 品質検査の結果等をも格納しておくことにしてもよい。 また、 無菌室 1 1内に配される培養装置 1 , 4 0各部の間における搬送手段等につ いては、 特に示さなかったが、 一般的な搬送手段、 例えば、 コンベアやマニピユレ一 タにより構成されていればよい。 また、 液体状の培地 4等の供給手段としては、 例え ば、 ローラポンプ等を採用することができる。
また、培地 4に加える成分として、成長因子、例えば、 サイ トカイン、濃縮血小板、 B M P , F G F、 T G F— j3、 I G F、 P D G F、 V E G F , H G Fやこれらを複合 させたもの等の成長に寄与する物質を混合することにしてもよい。 また、 エス トロゲ ン等のホルモン剤や、 ビタミン等の栄養剤を混合することにしてもよい。
この場合に、 培養すべき骨髄液 2の活性度に応じて、 これらの成長因子やホルモン 剤もしくは栄養剤の配合割合を決定することにしてもよい。 また、 抗生物質として、 ペニシリン系抗生物質を採用したが、 これに代えて、 セフエム系、 マクロライ ド系、 テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノ口ン系等、 任意の抗生物質を採用することができる。
また、 前記実施形態においては、 培養すべき体液として骨髄液 2を例示して説明し たが、 これに代えて、末梢血や臍帯血を用いてもよい。 また、 この明細書においては、 E S細胞、 体性幹細胞、 間葉系幹細胞、 骨細胞や軟骨細胞等の体細胞が含まれる液も 便宜上体液と呼ぶことにする。 さらに、 細胞としては、 自家細胞の他、 他家細胞でも よい。
また、 前記実施形態においては、 生体組織として骨を例に挙げたが、 他の生体組織 の補填体を製造することにしてもよレ、。この場合において、生体組織補填材としては、 生体組織に親和性のある任意の材料を使用することができ、 生体吸収性の材料であれ ばさらに好ましい。 また、 多孔体でもよい。 多孔体とは、 生体適合性を有する多孔性 のセラミックスやコラーゲン、 ポリ乳酸あるいは多孔性の金属等であり、 多数の気孔 を有するものであればこれらに限定されるものではない。 多孔体としては、 一般にァ パタイ トや J3— T C Pなどのリン酸カルシウム系セラミックス、 コラーゲン、 ポリ乳 酸等を使用することができる。 また、 リン酸カルシウム系セラミックスとコラーゲン とを組み合わせたり、 リン酸カルシウム系セラミックスとポリ乳酸とを組み合わせた り してもよい。 コラーゲン、 ポリ乳酸は生分解性で生体に吸収される特 徴を有する一方、 アパタイ トはその強度に優れるという特徴を有する。 当業者であれ ば、 移植する部位等に応じて、 適正な種類の多孔体を適宜選択して使用することがで きることは言うまでもない。
また、 前記各実施形態においては、 培養工程の途中における人手の介在を完全にな くすこととしたが、 これに代えて、 例えば、 図 6に示されるように、 培養装置 1から は、 骨補填体 5と、 検査用細胞 4 3および検査用培地 4 4を出力し、 培養装置 1の外 部に配される検査装置 4 5において真菌や細菌等の微生物による感染検査を行うこと にしてもよレ、。
また、 前記各実施形態における骨補填材供給手段 2 1等の各構成装置の具体的構造 については、本発明を構成する手段の一例であり、これらに限定されるものではない。 産業上の利用の可能性
以上説明したように、 この発明に係る培養装置によれば、 体液を投入するだけで、 無菌室内において人手を介在させることなく生体組織補填体を製造することができる ので、 感染の機会を低減して健全な生体組織補填体を提供することができるという効 果を奏する。
また、 生体組織補填体とともに検查結果を知ることができるので、 提供される生体 組織捕填体の品質に対する信頼性を高めることができ、 使用者が、 より安心してこれ を使用することができるという効果もある。

Claims

請求の範囲
1 . 培地と生体組織補填材をそれぞれ貯蔵する貯蔵部と、
採取された体液から培養すべき細胞を抽出する細胞抽出部と、
前記貯蔵部および前記細胞抽出部に接続され、 抽出された細胞を培地内において培 養し、 培養された細胞と生体組織補填材とから生体組織補填体を製造する細胞培養部 と、
製造された生体組織補填体を容器内に密封する密封部とを無菌室内に備える培養装
2 . 前記細胞抽出部および前記細胞培養部に接続され、 少なくとも体液および細胞に おける感染検查を行う検査部を前記無菌室内に備える請求項 1に記載の培養装置。
3 . 前記細胞における感染検査が、細胞培養部から廃棄される培地により行われる請 求項 2に記載の培養装置。
4 . 前記感染検査が前記細胞培養部において製造された生体組織補填体に対しても行 われる請求項 2に記載の培養装置。
5 . 前記検査部に接続され、 前記密封部において生体組織補填体を密封した容器に、 少なくとも検査結果を含む情報を記録する記録部をさらに備える請求項 2に記載の培
6 . 前記細胞培養部が、 抽出された細胞を培地内において培養する一次培養部と、 培 養された細胞を培地内において生体組織補填材とともに培養する二次培養部とを備え る請求項 1に記載の培養装置。
7 . 前記密封部が、 前記一次培養部で培養された細胞を密封する請求項 6に記載の培
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