JP2005304302A

JP2005304302A - 培養処理装置

Info

Publication number: JP2005304302A
Application number: JP2004121459A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Fukuda; 宏福田; Koen Numata; 公延沼田
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2004-04-16
Filing date: 2004-04-16
Publication date: 2005-11-04

Abstract

【課題】培養容器を交換する際に、タンパク質分解酵素に細胞を過剰に接触させることを防止して細胞の健全性を確保するとともに、培養容器から効率的に細胞を剥離させる。
【解決手段】培養された細胞を収容する複数の培養容器に、タンパク質分解酵素を順次供給する酵素供給部と、同一ロット内の最初の培養容器へのタンパク質分解酵素の供給時に時間の計測を開始する計時部６４と、該計時部６４により計測された時間が所定の時間に達したことを報知する報知部６６とを備える培養処理装置３０を提供する。
【選択図】図９

Description

この発明は、培養処理装置に関するものである。

従来、自動培養装置として、複数の培養容器を収納可能な固定式の収納棚と、水平・昇降・回転移動可能な搬送手段とを備えたものが知られている（例えば、特許文献１参照。）。
この自動培養装置は、培養室内に配置された収納棚に、鉛直方向に並ぶ複数の小部屋を備え、各小部屋の中に培養容器を１つずつ収容して培養を行い、培養途中に搬送手段を作動させて、小部屋から１つずつ培養容器を取り出し、培地を交換し、小部屋へ培養容器を戻すよう構成されている。
特開２００２−２６２８５６号公報（図１等）

しかしながら、細胞を必要細胞数まで成長させるには、培養容器内の培地を定期的に交換するのみならず、培養容器を交換するなどして培養容器の底面積を広げる処理、いわゆる継代処理を行う必要がある。継代処理は、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を培養容器内に注入して、底面に付着して成長している細胞を剥離させ、底面積の広い新たな培養容器に移し替えることを行う。

この場合において、タンパク質分解酵素を培養容器内に供給してから、培養容器の底面から細胞が剥離するまでに時間がかかり、またその時間も一定していないことから、一律に時間を設定したのでは、培養容器内の細胞が剥離されずに残ってしまう不都合がある。また、設定時間を長くすることにより、全ての培養容器から細胞を剥離させることができるが、この場合には、細胞がタンパク質分解酵素に長時間接触するために、細胞膜に損傷を受けることが考えられ、好ましくない。

特に、複数の培養容器を１ロットにして処理する場合に、同一ロット内の最初に処理を開始した培養容器と、その後に処理を開始した培養容器とでは、細胞がタンパク質分解酵素に接触している時間が相違するため、最終に処理を開始した培養容器の処理状態を観察中に、最初に処理を開始した培養容器内の細胞の処理時間が過剰になるという不都合が考えられる。

この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、培養容器を交換する際に、タンパク質分解酵素に細胞を過剰に接触させることを防止して、細胞の健全性を確保するとともに、培養容器から効率的に細胞を剥離させることができる培養処理装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、培養された細胞を収容する複数の培養容器に、タンパク質分解酵素を順次供給する酵素供給部と、同一ロット内の最初の培養容器へのタンパク質分解酵素の供給時に時間の計測を開始する計時部と、該計時部により計測された時間が所定の時間に達したことを報知する報知部とを備える培養処理装置を提供する。

この発明によれば、複数の培養容器内に収容した細胞が同一ロットにおいて培養される場合において、これらの培養容器内の細胞に継代処理を施す際に、酵素供給部の作動により、細胞を収容する複数の培養容器内にタンパク質分解酵素が順次供給される。

この場合において、同一ロットの最初の培養容器にタンパク質分解酵素が供給されると、計時部の作動により時間の計測が開始される。そして、予め定められた所定の時間が経過したときには、報知部が作動させられてその旨が報知される。
したがって、作業者は、報知部からの報知により、最初の培養容器のタンパク質分解酵素による処理時間が一定時間を経過したことを知ることができる。

すなわち、報知を受けた作業者は、当該最初の培養容器に対して、その後の処理を進行させることが可能となり、同一ロット内の細胞の内、タンパク質分解酵素に最も長い時間にわたって接触させられている細胞の接触時間が過剰に長くなることにより細胞膜が損傷を受ける等の不都合の発生を防止することができる。

また、上記発明においては、タンパク質分解酵素が供給されたいずれかの培養容器内部の様子を観察可能な観察部を備えることが好ましい。
このようにすることで、タンパク質分解酵素が供給された培養容器内の様子が、観察部の作動により観察されることになる。この場合において、作業者は、タンパク質分解酵素が供給された複数の培養容器の内のいずれの培養容器を観察していても、報知部からの報知により、最初の培養容器のタンパク質分解酵素による処理時間が一定時間を経過したことを知ることができる。

また、上記発明においては、観察部により観察される培養容器を選択する選択スイッチを備える。
このようにすることで、作業者は、選択スイッチを切り替えることにより、培養容器を任意に選択して観察することができ、また、タンパク質分解酵素による処理時間が一定時間を経過したときには、観察を終了して、最初の培養容器の観察を行うことが可能となる。

本発明によれば、複数の培養容器内に細胞を収容して培養する同一ロットの各培養容器にタンパク質分解酵素を供給して継代処理を行う場合に、最も長時間にわたってタンパク質分解酵素に接触させられている細胞が、過剰に処理されることを防止して、細胞の健全性を保持することができる。

この発明の一実施形態に係る培養処理装置について、図１〜図９を参照して説明する。
本実施形態に係る自動培養装置１は、図１に示されるように、外部から観察可能な透明な壁材により密閉され、シャッタ２を介して相互に連絡する第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２とを備えている。

第１空間Ｓ１の両側空間Ｓ１１，Ｓ１３には、培養容器３を収容する培養室４が２個ずつ計４個配置され、中央空間Ｓ１２には、培養容器３を移動するための搬送ロボット（搬送機構）５が備えられている。中央空間Ｓ１２の上部には、中央空間Ｓ１２内の空気を浄化するために清浄な下降空気流を送る空気清浄部６が設けられている。
４個の培養室４は、それぞれ中央空間Ｓ１２に向けて扉４ａを配置することにより、横に並んだ２個ずつが相互に扉４ａを対向させて、間隔をあけて配置されている。

前記各培養室４は、図２および図３に示されるように、一側面に開口部４ｂを有し、該開口部４ｂを開閉可能な扉４ａを備えている。開口部４ｂに向かって左右の側壁には、対応する高さ位置に複数のレール状のトレイ保持部材４ｃが設けられており、左右対となる各トレイ保持部材４ｃに掛け渡すようにして、トレイ７を上下方向に複数段収容できるようになっている。各培養室４内は、所定の培養条件、例えば、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ_２濃度５％等に維持されている。なお、トレイ保持部材４ｃはレール状に限定されず、トレイ７を出し入れ可能に支持することができれば任意の形態でよい。

各トレイ７には、複数個、例えば、１０個の培養容器３を並べて載置できるようになっている。各培養容器３は、図４に示されるように、容器本体３ａと、該容器本体３ａの上面に設けられた蓋体３ｂとからなり、容器本体３ａの左右の側面には、後述する第２空間内のハンドにより引っかけられる突起３ｃが設けられている。

各培養室４の下方には、図１および図２に示されるように、未使用の培養容器３をトレイ７に搭載した状態で複数収容するストッカ８が配置されている。
各ストッカ８内には、図示しないリフト機構が設けられており、最上段のトレイ７が取り出された後に、下段のトレイ７を順次持ち上げて、次に取り出すトレイ７を最上段の供給位置に配置しておくことができるようになっている。

ストッカ８は、前記培養室４の扉とは反対側の第１空間Ｓ１の外部に向かう側面に開閉可能なドア５１を有している。該ドア５１は、ストッカ８の一側面全体を開放する大きさに形成されている。このドア５１を介してトレイ７に搭載した培養容器３を外部からストッカ８内に挿入することができるようになっている。また、ストッカ８には、ストッカ８内の最上段のトレイ７に対応する位置に培養室４の扉側に開口する搬入口５２が設けられている。搬入口５２にはシャッタが配置されており、搬送ロボット５は、シャッタが開けられた状態の搬入口５２から、ストッカ８内に収容されている未使用の培養容器３をトレイ７ごと取り出して後述する培養処理装置３０へ移動させるようになっている。

前記搬送ロボット５は、４個の培養室４の間隔位置のほぼ中央に配置されている。該搬送ロボット５は、水平回転可能な第１アーム５ａと、該第１アーム５ａの先端に鉛直軸回りに回転可能に連結された第２アーム５ｂと、該第２アーム５ｂの先端に鉛直軸回りに回転可能に取り付けられ、それ自身は駆動部、伝導機構などの培養室内の環境を劣化させる機構を持たないハンド５ｃと、これら第１アーム５ａ、第２アーム５ｂおよびハンド５ｃを昇降可能な昇降機構５ｄとを備えている。これにより、搬送ロボット５は、４個の培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記シャッタ２を跨いで第１空間Ｓ１と第２空間Ｓ２との間に配置されたコンベア９上にトレイ７を引き渡すことができる水平方向の動作範囲を有している。

前記コンベア９は、搬送ロボット５のハンド５ｃの幅寸法より大きな間隔をあけて左右に配置された２本の無端ベルト９ａを備え、これら無端ベルト９ａに掛け渡してトレイ７を載置できるようになっている。また、搬送ロボット５は、培養室４内の全てのトレイ７にアクセスするとともに、前記ストッカ８内の少なくとも最上段のトレイ７にアクセスできる垂直方向の動作範囲を有している。
なお、ベルト９ａは無端ベルトに限られない。

前記ハンド５ｃは、トレイ７を載置可能に水平方向に延びる平坦な形状に形成されており、培養室４に収容されているトレイ７間の隙間に挿入可能な厚さ寸法に形成されている。そして、ハンド５ｃは、トレイ７間の隙間に挿入された状態から上昇させられることにより、２本の腕によってトレイ７を下方から押し上げてトレイ保持部材４ｃから取り上げるとともに、トレイ７を安定して保持できるようになっている。

前記第２空間Ｓ２には、図１に示されるように、培養処理装置３０が構成されている。
培養処理装置３０は、図１に示されるように、給排ロボット１０、遠心分離器１１、分注ロボット１３、チップ供給装置１５、チップ回収部３１、試薬等供給装置１６、顕微鏡１７、貯留タンク１８、水平移動機構１９および載置台２１を備えている。
例えば、医療機関等で患者から採取された骨髄液を導入され、供給された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を集める検体抽出部５０は、提供された骨髄液にＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等を供給して攪拌する給排ロボット１０と、攪拌された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を分離する遠心分離器１１とにより構成されている。

給排ロボット１０は、シャッタ２が開かれた状態で第１空間Ｓ１からコンベア９によって搬送されてきたトレイ７上の培養容器３に対し、上記検体抽出部５０において集められた検体を供給し、あるいは、培地を供給、回収するようになっている。遠心分離機１１は、培養容器３内の培地から細胞を分離するように構成されている。
分注ロボット１３は、血清や試薬等の種々の液体を分注するための電動ピペット１２を備えた水平回転および昇降移動可能なロボットであって、第２空間Ｓ２内に４台設置されている。

前記チップ供給装置１５は、これら給排ロボット１０および分注ロボット１３の電動ピペット１２先端に取り付ける使い捨て可能なチップ１４を複数収容していて給排ロボット１０および分注ロボット１３の動作範囲内に提供するようになっている。前記チップ回収部３１は、使用済みのチップ１４を廃棄回収するようになっている。前記試薬等供給装置１６は、血清や試薬等の種々の液体を複数の容器に貯留している。顕微鏡１７は培養容器３内における細胞の様子を観察できるようになっている。貯留タンク１８は、各試薬および培地交換等により廃棄される廃液をそれぞれ貯留するように複数設けられている。水平移動機構１９は、前記コンベア９と各ロボット１０，１３との間で培養容器３を受け渡し可能とするように培養容器３を移動させるようになっている。前記載置台２１は、水平移動機構１９のスライダ２０に取り付けられ、受け取った培養容器３を載置するように構成されている。
なお、第２空間Ｓ２にも、該第２空間Ｓ２内の空気を浄化するために清浄な下降気流を形成する空気清浄機３２が設けられている。

前記第２空間Ｓ２に構成された培養処理装置３０は、その高さ方向の中間位置に配され第２空間Ｓ２内を上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに上下に区画する第１の区画壁３３と、該第１の区画壁３３により形成された下部空間Ｓ２２内をさらに上下に区画する第２の区隔壁３４とにより、上下方向に並ぶ３つの空間Ｓ２１，Ｓ２２１，Ｓ２２２に区画されている。第１の区画壁３３は、前記コンベア９の高さに配置され、その上方の上部空間Ｓ２１内に、載置台２１、給排ロボット１０、分注ロボット１３のアーム１３ａ、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以上の機構部等を配置している。これらの装置は、培養容器３の移動に必要な装置、および培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な装置だからである。なお、試薬等供給装置１６の上面も第１の区画壁３３の上面に露出しているが、これはチップ１４の挿入口１６ｃを上部空間Ｓ２１に開口させるためである。

また、第１の区画壁３３には、載置台２１を上部空間Ｓ２１において移動させるために、載置台２１を下部空間Ｓ２１内の水平移動機構１９に連結するための長孔３５、第１の区画壁３３の下方の空間Ｓ２２１に配置されたチップ供給装置１５からチップ１４を取り出すための貫通孔３６、使用済みのチップ１４を廃棄するための廃棄口３７が貫通形成されている。さらに、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口３８が設けられている（斜線部）。

第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間の空間Ｓ２２１には、図５に示されるように、分注ロボット１３の本体部分、チップ供給装置１５、試薬等供給装置１６、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ以下の部分、水平移動機構１９および、チップ回収部３１の廃棄口３７と廃棄容器３９とを接続するダクト４０が備えられている。前記ダクト４０は、図６に示されるように、例えば、その上端にフランジ部４０ａを備える構造とされ、第１の区画壁３３の下部に設けたフック４４に引っかけることで、第１の区画壁３３と第２の区画壁３４との間に着脱可能に設ければよい。第２の区画壁３４の側壁３０ａ，３０ｂ近傍には、該側壁３０ａ，３０ｂに沿って、上下に貫通する通気口４３が設けられている（斜線部）。

さらに、第２の区画壁３４の下方の空間Ｓ２２２には、図７に示されるように、遠心分離機１１、貯留タンク１８、廃棄容器３９、および排気ファン４１が配置されている。排気ファン４１の出口にはＨＥＰＡフィルタのようなフィルタ４２が設けられ、排気される空気を清浄にするようになっている。

前記給排ロボット１０は、水平多関節型ロボットであって、例えば、図１に示す例では、２種類の電動ピペット１０ａ，１０ｂを備えるヘッド１０ｃと、水平旋回可能な２つのアーム１０ｄ，１０ｅと、アーム１０ｅの先端に設けられヘッド１０ｃを昇降させる昇降機構１０ｆとを備えている。電動ピペット１０ａは、貯留タンク１８からダクト１０ｇを介して導かれた培地を供給し、あるいはピペッティング動作を行うようになっている。電動ピペット１０ｂは、培養容器３内あるいは遠心容器内の不要な培地を吸引し、ダクト１０ｇを介して他の貯留タンク１８へ廃液として排出するようになっている。

電動ピペット１０ａによるピペッティング動作は、前記検体抽出部５０においてＰＢＳを注入された骨髄液に対して行われるとともに、遠心分離機１１により分離された細胞に対しても行われるようになっている。ピペッティング動作は、電動ピペット１０ａの先端にチップ供給装置１５から供給されたチップ１４を装着して、遠心容器（図示略）内に挿入し、遠心容器内に貯留されている骨髄液とＰＢＳとからなる細胞懸濁液、あるいは細胞と培地とを混合してなる細胞懸濁液に対し、吸引および放出を１０回〜２０回繰り返す。これにより、細胞懸濁液を均一に攪拌するようになっている。

また、給排ロボット１０は、ピペッティング動作の後に、電動ピペット１０ａによって、遠心分離機１１により分離された細胞と培地との混合液を吸引し、載置台２１上に搭載された培養容器３内に上部開口から供給するようになっている。

一旦使用された使用済みのチップ１４は、チップ回収部３１において取り外され回収されるようになっている。したがって、給排ロボット１０は、載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および遠心分離機１１からの細胞供給装置（図示略）等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。

前記遠心分離機１１は、ピペッティングにより混合された細胞懸濁液を貯留した遠心容器を受け取って低速回転させることにより、骨髄液内に含有されている間葉系幹細胞等の白血球をその他の体液から分離して沈下させるようになっている。また、遠心分離機１１は、給排ロボット１０から供給された細胞入りのトリプシン溶液を低速回転させることによりトリプシン溶液内に浮遊していた比重の重い細胞を培地から分離して沈下させるようになっている。

前記分注ロボット（酵素供給部）１３は、それぞれ、先端にチップ１４を着脱可能に取り付ける電動ピペット１２を備えた水平回転可能なアーム１３ａと、該アーム１３ａを昇降させる昇降機構１３ｂとを備えている。分注ロボット１３は、水平移動機構１９によって搬送されて来た培養容器３内へ、培地や種々の試薬を供給するようになっている。したがって、分注ロボット１３は、水平移動機構１９上の載置台２１、チップ供給装置１５、チップ回収部３１および試薬等供給装置１６等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。

前記チップ供給装置１５は、上方に開口した容器１５ａ内に、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２への取付口を上向きにして複数のチップ１４を配列状態に収容しており、給排ロボット１０や分注ロボット１３が、新たなチップ１４を必要とするときに、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を上方から挿入するだけで、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の先端にチップ１４を取り付けるように構成されている。容器１５ａは、給排ロボット１０や分注ロボット１３による電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２の移動方向に対して交差する方向に往復移動させられるように移動機構１５ｂに取り付けられている。また、分注ロボット１３にチップ１４を供給するチップ供給装置１５には、移動機構１５ｂによる移動方向とは直交する方向に容器１５ａを移動させる他の移動機構１５ｃが備えられている。これにより、容器１５ａ内の全てのチップ１４に対して電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２がアクセスすることができるようになっている。

また、チップ供給装置１５には、図８に示されるように、チップ１４の残量を検出する残量検出センサ５９が設けられている。残量検出センサ５９は、例えば、縦横に配列されたチップ１４の各列の両端に設けられた発光部５９ａと受光部５９ｂとからなり、当該列の全てのチップ１４が取り出されたときに発光部５９ａからの光を受光部５９ｂにおいて受光し、その列が空になったことを検出するようになっている。給排ロボット１０および分注ロボット１３は、一列ごとに順次チップ１４を取り出していくことにより、チップ１４の残量を列単位で把握することができるようになっている。

前記チップ回収部３１は、廃棄容器３９の入口に、チップ１４を把持する把持装置（図示略）を備えていて、給排ロボット１０や分注ロボット１３において使用されたチップ１４が把持装置に挿入されると、これを把持するようになっている。そして、この状態で給排ロボット１０や分注ロボット１３が電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２を移動させることにより、電動ピペット１０ａ，１０ｂ，１２先端から使用済みチップ１４が取り外され、廃棄容器３９内にダクト４０を介して回収されるようになっている。廃棄容器３９は、空間Ｓ２２２内に着脱可能に配置されており、必要に応じて交換可能となっている。
前記ダクト４０および廃棄容器３９の交換時には、培養処理装置３０の側壁３０ａ，３０ｂに設けられた図示しないドアを開くことにより、培養処理装置３０の外部からアクセスすることとすればよい。

前記試薬等供給装置１６は、例えば、図５に示されるように、円筒状のケーシング内部に、水平回転可能なテーブル１６ａを収容し、該テーブル１６ａ上に、扇型の底面形状を有する筒状の試薬等容器１６ｂを周方向に複数配列して搭載している。ケーシング内部は一定の温度に保冷されている。各試薬等容器１６ｂには、種々の試薬等が貯留されている。例えば、細胞を培養するために必要な培地を構成するＭＥＭ(Minimal Essential
Medium：最小必須培地)、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified
Eagle Medium）、ＦＢＳ（Fetal Bovine Serum：ウシ胎児血清）やヒト血清のような血清、培養容器３内の細胞を剥離させるトリプシンのような蛋白質分解酵素や、培養に際して細胞を成長させるサイトカインのような成長因子、細胞を分化させるデキサメタゾンのような分化誘導因子、ペニシリン系抗生物質のような抗生剤、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤が貯留されている。

試薬等供給装置１６のケーシングの上面には、分注ロボット１３が電動ピペット１２先端のチップ１４を挿入する挿入口１６ｃが設けられている。この挿入口１６ｃは、前記分注ロボット１３の動作範囲内に配置されている。また、各試薬等容器１６ｂは、その上面に、前記挿入口１６ｃに一致する位置に配置される開口部（図示略）を備えている。これにより、テーブル１６ａを回転させて試薬等容器１６ｂの開口部をケーシングの挿入口１６ｃの鉛直下方に配置することで、分注ロボット１３が、電動ピペット１２先端のチップ１４を上方から試薬等容器１６ｂ内へ挿入して、内部に貯留されている試薬等を吸引することができるようになっている。試薬等供給装置１６を２台設けているのは、検体に共通のトリプシンのような薬液と、検体に固有の血清のような液体とを分離して取り扱うようにしているためである。

前記顕微鏡１７は、培養工程の途中、あるいは、培地交換の際に、培養容器３内の細胞の様子や増殖の程度を観察したり、細胞数を計数したりする場合等に使用されるようになっている。顕微鏡１７のＸＹステージ１７ａや作動距離調整、倍率の変更等は全て遠隔操作により行うことができるように構成されている。第２空間Ｓ２の外方に向けて接眼レンズを配置しておくことにより、自動培養装置１の外部から培養容器３内の細胞の状態を観察できるようにしてもよい。

前記貯留タンク１８は、例えば、全ての検体に共通して使用できるＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等を貯留しておき、必要に応じて試薬等供給装置１６内の試薬等容器１６ｂ内に供給するようになっている。また、貯留タンク１８には、廃液タンクとして、培地交換の際に排出される廃培地等を貯留するものもある。

前記水平移動機構１９は、直線移動機構により水平方向に移動可能なスライダ２０を備えている。スライダ２０上には前記載置台２１が搭載されており、載置台２１に搭載された培養容器３を、コンベア９から分注ロボット１３の動作範囲まで移動させることができるようになっている。

前記載置台２１は、コンベア９上のトレイ７内から移載された培養容器３を搭載して保持する保持機構（図示略）を備えている。また、該培養容器３に振動を付与する加振装置（図示略）を備えていてもよい。加振装置は、例えば、培養容器３を所定の角度範囲で往復揺動させる装置の他、超音波振動を加える装置や、水平方向の振動を加える装置を採用してもよい。

本実施形態に係る培養処理装置３０の各種装置には、図９に示されるように、制御装置６０とスケジューラ６１とが接続されている。
スケジューラ６１は、骨髄液提供者の年齢や、最終的な必要細胞数等の最初に得られる情報に基づいて培養スケジュールをたて、培地交換の時期や継代処理の時期を大まかに設定している。また、スケジューラ６１は、培養途中の状況、例えば、継代処理の進みや遅れ等に応じて培地交換の時期やその後の継代処理の時期あるいは出荷予定日等についてスケジュールを更新するように機能する。スケジューラ６１は、設定したスケジュールを制御装置６０に送り出し、制御装置６０はスケジューラ６１から送られてきたスケジュールに基づいて培養処理を進行させるように、各工程の順序や動作タイミング等を制御するとともに、各種装置を制御する制御部６２を備えている。

また、制御装置６０は、自動培養装置１において生じた各種のエラーの履歴をデータベース化して残す履歴作成手段６３に接続されている。エラーの履歴は、エラーの発生日時、エラー発生箇所、エラーの内容を含み、例えば、細胞の癌化や成長不良等のエラーの場合に、顕微鏡１７において撮影した画像がある場合には、画像とともに記録するように構成されている。

本実施形態においては、制御装置６０とスケジューラ６１とが別々に設けられている。これにより、仮に、スケジューラ６１がダウンした場合においても、制御装置６０は最新の培養スケジュールにしたがって培養処理を実施することができるようになっている。したがって、スケジューラ６１のダウンにより培養処理が停止して、培養された細胞が無駄になってしまうことを防止できるようになっている。

また、制御部６２には、各トレイ７上の複数の培養容器３に対する継代処理を行う際に、最初の培養容器３に対して分注ロボット１３がトリプシンを供給した時点で時間の計測を開始するタイマー（計時部）６４と、タイマー６４により計測された時間が所定時間を超えたか否かを判断する時間判定部６５と、該時間判定部６５により所定時間を超えたと判断されたときに、外部に対してその旨を報知するスピーカ、モニタ６８あるいは赤色灯のような報知部６６とが接続されている。

また、制御装置６０には、顕微鏡１７により培養容器３内の様子を観察する作業者が、任意に選択できる手動指令スイッチ６７が設けられている。この手動指令スイッチ６７には、例えば、「ＯＫ」スイッチ６７ａと「ＮＥＸＴ」スイッチ６７ｂと「廃棄」スイッチ６７ｃとが設けられている。顕微鏡１７により培養容器３内の細胞の様子を観察する作業者が「ＯＫ」スイッチ６７ａを押下すると、制御部６２がその培養容器３に対する次の処理を進行させるようになっている。また、「ＮＥＸＴ」スイッチ６７ｂを押下すると、観察している培養容器３が、同じトレイ７上に搭載されている他の培養容器３に入れ替えられるようになっている。さらに、「廃棄」スイッチ６７ｃを押下すると、観察している培養容器３内の細胞に対するそれ以上の処理が中止され、同一トレイ７上の全ての培養容器３の観察後に廃棄すべく、種々の機器が作動させられるようになっている。

このように構成された本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る自動培養装置１を用いて、間葉系幹細胞を培養するには、まず、患者から採取された骨髄液を遠心容器に入れて培養処理装置３０内に導入し、検体抽出部５０に供給する。この工程は作業者が行ってもよく、図示しないロボットにより行ってもよい。

検体抽出部５０においては、骨髄液内にＰＢＳが供給され、給排ロボット１０によりピペッティング動作が行われる。このようにして構成された細胞懸濁液は、遠心分離機１１に投入される。そして、遠心分離機１１が、例えば、８００〜１３００Ｇで３〜５ｍｉｎ間作動させられることにより、骨髄液内の比重の重い間葉系幹細胞を含む細胞が沈降した状態に集められる。

この状態で、遠心分離機１１外に取り出され、給排ロボット１０およびチップ供給装置１５の作動により、電動ピペット１０ｂ先端に未使用のチップ１４が取り付けられる。
すなわち、チップ供給装置１５は移動機構１５ｂを作動させることにより、未使用のチップ１４を給排ロボット１０の動作範囲内に配する。すると、給排ロボット１０は、昇降機構１０ｆを作動させることにより、ヘッド１０ｃを下降させて、第１の区画壁３３下方のチップ供給装置１５から未使用のチップ１４を受け取り、電動ピペット１０ｂの先端に取り付ける。

この状態で、給排ロボット１０を作動させて電動ピペット１０ｂのチップ１４の先端を遠心容器内に挿入して吸引する。これにより、遠心容器内の上澄み液が除去され、間葉系幹細胞を多く含む細胞が遠心容器内に残される。

次に、遠心容器内に残った検体は、給排ロボット１０により、培養容器３に投入される。投入に先立って、第１空間Ｓ１内の搬送ロボット５が、ハンド５ｃを前記ストッカ８の搬入口５２までアクセスし、搬入口５２から未使用の培養容器３を搭載したトレイ７を取り出して、ベルト９上に移載している。そして、コンベア９の作動により、トレイ７に載せた空の培養容器３が、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２に差し出されている。その後、トレイ７上の培養容器３は、図示しない移載装置の作動により、載置台２１上に載置される。そして、図示しない蓋体開閉装置の作動により、載置台２１上の培養容器３の蓋体３ｂが開けられる。

この状態で、給排ロボット１０を作動させて、電動ピペット１０ａから遠心容器内に、貯留タンク１８に貯留されているＤＭＥＭやＰＢＳ（リン酸緩衝化食塩水）等の培地構成液を、所定量供給する。電動ピペット１０ａ先端のチップ１４を遠心容器内に挿入した状態に保持したまま、電動ピペット１０ａを作動させることにより、ピペッティングを行う。これにより、間葉系幹細胞を多く含む細胞と培地構成液とが均一に混合された細胞懸濁液６１が構成されることになる。

このようにして製造された細胞懸濁液は、電動ピペット１０ａを作動させることにより、チップ１４内に吸引される。吸引された細胞懸濁液は、チップ１４内に保持された状態で、給排ロボット１０を作動させることにより、載置台２１上の培養容器３内に上部開口から投入される。

細胞懸濁液を培養容器３内に投入し終わると、給排ロボット１０は、第１の区画壁３３に形成された廃棄口３７にチップ１４を挿入して取り外し、チップ回収部３１に回収させる。廃棄口３７において取り外されたチップ１４は、ダクト４０を介して、最下位の空間Ｓ２２２に配置されている廃棄容器内に投入される。

次に、細胞懸濁液が投入された培養容器３は、水平移動機構１９を作動させることにより、載置台２１ごと水平移動させられ、各分注ロボット１３の動作範囲内に配置される。分注ロボット１３は、チップ供給装置１５から受け取った未使用のチップ１４を先端に取り付けた電動ピペット１２を作動させることにより、試薬等供給装置１６の試薬等容器１６ｂ内からＤＭＥＭや血清、あるいは各種試薬を適量吸引した後に、培養容器３の上方まで搬送して培養容器３内に注入する。血清や各試薬の吸引は、各試薬等の吸引ごとにチップ供給装置１５から未使用のチップ１４に交換して行われる。これにより、培養容器３内においては、適正な培地内に間葉系幹細胞が混合された状態で存在することになる。なお、培地内において間葉系幹細胞を均一に分布させるために、載置台２１を作動させて、培養容器３ごと加振することにしてもよい。

そして、全ての処理を終えた培養容器３は水平移動機構１９の作動により、コンベア９の近傍まで移動させられ、そこで、再度、蓋体開閉装置および移載装置の作動により、蓋体３ｂにより上部開口を閉じられた状態で、トレイ７に戻される。
トレイ７上の全ての培養容器３に対して所定の処理が行われた後に、コンベア９を作動させることにより、トレイ７に載せられた培養容器３が第２空間Ｓ２から第１空間Ｓ１の中央空間Ｓ１２内に挿入される。

この状態で、搬送ロボット５を作動させることにより、ハンド５ｃによってトレイ７を持ち上げる。そして、トレイ７を収容する培養室４の前まで搬送したところで、当該培養室４の扉４ａを開き、搬送ロボット５によって、空いているトレイ保持部材４ｃ上にトレイ７を挿入する。そして、再度、扉４ａを閉じることにより、培養室４内の培養条件を一定に保持して細胞の培養が行われることになる。なお、細胞懸濁液の投入や、ＤＭＥＭ、血清、各種試薬の投入や吸引の順序は適宜変更してもよいのは言うまでもない。

また、培地交換や容器交換の際にも、上記と同様にして、培養室４外に配置されている搬送ロボット５の作動により、培養室４内の培養容器３がトレイ７ごと取り出され、第１空間Ｓ１から第２空間Ｓ２へ受け渡される。
培地交換の際には、給排ロボット１０の作動により、培養容器３内部の培地が吸引されて廃棄され、分注ロボット１３の作動により、新たな培地や薬液が供給される。

一方、容器交換の際、すなわち、継代処理においては、培養容器３内部の培地が吸引されて廃棄された後に、分注ロボット１３の作動によりトリプシンのようなタンパク質分解酵素が培養容器３内に供給される。タンパク質分解酵素が供給された培養容器３は水平移動機構１９および移載機構の作動により顕微鏡１７に移載され、トリプシン処理の様子が顕微鏡１７により外部から観察される。

この場合において、本実施形態に係る培養処理装置３０によれば、分注ロボット１３による、トレイ７上の最初の培養容器３へのトリプシンの供給時に、制御装置６０内のタイマー６４が作動させられる。具体的には、制御装置６０内の制御部６２から分注ロボット１３に対して、トレイ７上の最初の培養容器３へのトリプシン供給の指示が出されると同時に、タイマー６４に対して計時開始の指示が出力される。

そして、トリプシンが供給された培養容器３が顕微鏡１７に送られると、作業者は、トリプシン処理の状況を顕微鏡１７の画像により確認することができる。観察している培養容器３内のトリプシン処理が十分に行われたと判断された場合には、作業者は「ＯＫ」スイッチ６７ａを押下することにより、その培養容器３内の細胞懸濁液を給排ロボット１０によって吸引して遠心分離機１１にかける処理に移行させることができる。

トリプシン処理の状況が十分ではない場合に、他の培養容器３のトリプシン処理の状況を見たい場合には、作業者は「ＮＥＸＴ」スイッチ６７ｂを押下する。これにより、同じトレイ７に載置されている同一ロットの他の培養容器３が顕微鏡１７に移送され、顕微鏡１７による観察が可能となる。

この場合において、１つの培養容器３内のトリプシン処理の状況を観察しているときに、同じトレイ７に搭載されていた培養容器３のうち、最初にトリプシン処理を開始した培養容器３においては、処理時間が過剰になる可能性がある。本実施形態によれば、タイマー６４の作動により計測された時間が判定部６５において所定の時間と比較され、所定時間を超えた場合には報知部６６により外部にその旨が報知される。したがって、他の培養容器３のトリプシン処理の状況を観察していた作業者は、最初の培養容器３のトリプシン処理の状況を再度観察することにより、処理が十分に行われている場合には「ＯＫ」スイッチ６７ａを押下して、その後の処理を進行させることができる。また、所定時間の経過によってもトリプシン処理が十分に行われていない場合には、それ以上のトリプシン処理は細胞膜を損傷させてしまうことになり、その後に回収された細胞の健全性が十分ではないことから、「廃棄」スイッチ６７ｃを押して、廃棄処理を行わせることができる。

すなわち、本実施形態に係る培養処理装置３０によれば、個々の培養容器３において処理状況が異なり、一律に処理時間を設定できないトリプシン処理を、作業者により個別に観察させて確実に処理の終了を見極めることができ、しかも、過剰なトリプシン処理によって細胞の健全性が害されることをより確実に防止することができるという効果がある。

そして、複数回の培地交換や容器交換を介した所定期間にわたる培養工程を行うことにより、間葉系幹細胞が十分な細胞数まで増殖させられることになる。十分な細胞数に達したか否かは、給排ロボット１０の作動により、間葉系幹細胞が底面に付着した培養容器３を顕微鏡１７まで搬送することにより、観察あるいは測定され、細胞の増殖の程度が判断される。なお、トレイ７上には、同一検体の培養容器３が載置されていてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。また、載置台２１上には同一検体の培養容器３が載置されてもよいし、異なる検体の培養容器３が混在していてもよい。

このようにして、本実施形態に係る自動培養装置１により、患者から採取した骨髄液５０から十分な細胞数の間葉系幹細胞を自動的に培養することが可能となる。なお、十分な間葉系幹細胞が得られた後には、培養容器３内にリン酸カルシウムのような生体組織補填材およびデキサメタゾンのような分化誘導因子を投入して、再度培養工程を継続することにより、生体の欠損部に補填可能な、生体組織補填体を製造することにしてもよい。

この場合において、本実施形態に係る自動培養装置１によれば、培養室４内に、培養容器３を取り出すための機構部が存在しない。すなわち、培養室４内には、トレイ７を載置した状態に支持するトレイ保持部材４ｃが設けられているのみであり、培養容器３を取り出すための機構部は全て培養室４外に配置された搬送ロボット５に集約されている。そして、搬送ロボット５は、トレイ７の出し入れ作業が行われた後には、培養室４の扉４ａの外側に完全に退避することができるようになっている。

したがって、扉４ａが閉じられた状態では、培養室４内に機構部が存在せず、機構部の作動によって発生するような塵埃の発生は全く存在しない。また、培養室４内は、温度３７±０．５℃、湿度１００％およびＣＯ_２濃度５％等に維持されるが、機構部が存在しないために、このような環境下においても、腐食等の問題が生ずることがない。また、扉４ａが開かれた状態においても、培養室４内に挿入されるのは搬送ロボット５のハンド５ｃ先端のみであり、実質的に回転機構や摺動機構が培養室４内に入ることはない。その結果、培養室４内への塵埃の侵入が抑制され、培養室４内部の清浄度を高めることができる。
なお、培養室４は、ＣＯ_２インキュベータ、マルチガスインキュベータ、インキュベータ、または保冷庫等のように、培養に利用されるものあるいはその組合せで構成されていてもよい。

また、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、医療機関等において患者から採取された状態の骨髄液を導入するだけで、早期に間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させることができる。したがって、医療機関や作業者に特別な設備や作業を発生させることがないという利点がある。

さらに、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、培養処理装置３０の第２空間Ｓ２内が、第１の区画壁３３により上部空間Ｓ２１と下部空間Ｓ２２とに区画されている。さらに、上部空間Ｓ２１には清浄な下降気流を発生させる空気清浄機３２が設けられている。そして、第１の区画壁３３には、その側壁３０ａ，３０ｂ近傍に通気口３８が設けられている。第１の区画壁３３には、通気口３８の他に種々の装置を貫通させるための貫通孔３６，３７等が形成されているが、通気口３８の流通断面積を他の貫通孔３６，３７等の流通断面積より十分に大きく確保しておくことにより、気流を通気口３８に通過させることが可能となる。

したがって、上部空間Ｓ２１内を下降してきた清浄な気流は、第１の区画壁３３の近くで側壁３０ａ，３０ｂの方向に向かい、通気口３８を介して下部空間Ｓ２２へと流通させられる。その結果、上部空間Ｓ２１内に浮遊していた塵埃を下方に向かって押し流してきた気流が、上部空間Ｓ２１の側壁３０ａ，３０ｂ近傍の角部に滞留することがなく、スムーズに下部空間Ｓ２２へ流通させられることになる。

さらに、本実施形態に係る培養処理装置３０および自動培養装置１によれば、蓋体３ｂを開かれた状態の培養容器３が移動させられる上部空間Ｓ２１には、培養容器３の移動に必要な載置台２１、顕微鏡１７のＸＹテーブル１７ａ、培養容器３の上部開口からアクセスすることが必要な給排ロボット１０、分注ロボット１３の電動ピペット１２、顕微鏡１７の光源部分等のみが配置され、その他の機構部は下部空間Ｓ２２に配置されている。したがって、上部空間Ｓ２１における塵埃の発生が最小限に抑えられ、培養容器３内への塵埃の混入の可能性が低減されることになる。

また、特に、塵埃を発生する可能性の高い装置、例えば、遠心分離機１１、廃棄容器３９、排気ファン４１等は、下部空間Ｓ２２の内、さらに第２の区画壁３４によって区画された最下位の空間Ｓ２２２内に配置されているので、そこで発生した塵埃が上部空間Ｓ２１に流入することはない。さらに、空間Ｓ２２２内の空気は排気ファン４１によって吸引され、ＨＥＰＡフィルタ４２によって塵埃を除去された後に培養処理装置３０の外部に放出される。したがって、上部空間Ｓ２１の清浄度は、極めて高い清浄度に維持されることになる。

また、第２の区画壁３４にも、側壁３０ａ，３０ｂに沿って通気口４３が設けられているので、上部空間Ｓ２１から流入した塵埃を含む気流が、空間Ｓ２２１内に広がることなく、スムーズに空間Ｓ２２２に向けて流通させられることになる。

さらに、培地や細胞が付着した使用済みのチップ１４を収容した廃棄容器３９は、着脱可能であり、必要によりまたは定期的に交換することで、下部空間Ｓ２２の清浄度をも高い状態に回復することができる。さらに、廃棄容器３９への廃棄の際に使用済みのチップ１４を通過させるダクト４０も、必要によりまたは定期的に取り外して、交換あるいは清掃することで、清浄度の向上に寄与することができる。

さらに、本実施形態に係る自動培養装置１は、搬送ロボット５の設置されている中央空間Ｓ１２の上部に、空気清浄部６を備えているので、搬送ロボット５の存在する中央空間Ｓ１２内も常に清浄度が維持されている。したがって、培養室４の扉４ａが開かれたときにも、培養室４内に塵埃が流入することを最小限に抑えることが可能となる。
したがって、本実施形態に係る自動培養装置１によれば、培養中の細胞が塵埃等によって汚染される可能性を低減し、健全な細胞を培養することができるという効果がある。

なお、この発明は、上記実施形態に示した構成に限定されるものではない。すなわち、培養室４の形状や数、搬送ロボット５、給排ロボット１０および分注ロボット１３の形態や数、各種装置の形態や数等は、何ら限定されることなく、適用条件に合わせて任意に設定することができる。

また、本実施形態に係る培養処理装置３０においては、遠心分離機１１により分離された骨髄細胞、間葉系幹細胞を、サンプルチューブ（図示略）内に少量採取して保管することにしてもよい。これにより、出荷された細胞や生体組織補填体に何らかの不具合が生じた場合に、原因を追跡するため等に役立てることができる。

また、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、ＢＭＰ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦ−β、ＩＧＦ、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
なお、本発明に係る自動培養装置は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された細胞や、樹立された細胞ラインを培養してもよい。

また、生体組織補填材としては、リン酸カルシウムに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、生体組織補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。

この発明の一実施形態に係る自動培養装置を示す斜視図である。図１の自動培養装置の第１空間を概略的に示す縦断面図である。図１の自動培養装置の第１空間を概略的に示す平面図である。図１の自動培養装置において用いられる培養容器の一例を示す斜視図である。図１の自動培養装置の培養処理装置の第１の区画壁を除去して第２の区画壁上の装置を示す斜視図である。図１の自動培養装置の培養処理装置の第１および第２の区画壁を除去して最下位の空間内に設置された装置を示す斜視図である。図１の自動培養装置の培養処理装置の廃棄容器に接続するダクトの取付構造例を示す縦断面図である。図１の自動培養装置のチップ供給装置の容器を示す平面図である。図１の自動培養装置に備えられた制御装置を示すブロック図である。

符号の説明

３培養容器
１３分注ロボット（酵素供給部）
１７顕微鏡（観察部）
３０培養処理装置
６４タイマー（計時部）
６６報知部
６７手動指令スイッチ（選択スイッチ）

Claims

培養された細胞を収容する複数の培養容器に、タンパク質分解酵素を順次供給する酵素供給部と、
同一ロット内の最初の培養容器へのタンパク質分解酵素の供給時に時間の計測を開始する計時部と、
該計時部により計測された時間が所定の時間に達したことを報知する報知部とを備える培養処理装置。
タンパク質分解酵素が供給されたいずれかの培養容器内部の様子を観察可能な観察部を備える請求項１に記載の培養処理装置。
観察部により観察される培養容器を選択する選択スイッチを備える請求項２に記載の培養処理装置。