JP2005287466A - 培養処理装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】 最終的に必要細胞数が異なる複数種の検体を、検体ごとに異なる大きさの培養容器を用意することなく、効率的に自動培養する。
【解決手段】 細胞を収容した複数の培養容器3を出し入れ可能に収容する培養室と、培養容器3の蓋を開けて内部の細胞に対し所定の処理を施す培養処理装置とを備え、少なくとも1回、培養容器3を入れ替えて細胞を培養する自動培養装置1であって、提供された細胞を収容する空の培養容器3をトレイ7に載せた状態で供給する複数の培養容器供給部8a〜8dを備え、各培養容器供給部8a〜8dが、それぞれ、同一形状の培養容器3をトレイ7上に複数載せて供給する自動培養装置1を提供する。
【選択図】 図6
【解決手段】 細胞を収容した複数の培養容器3を出し入れ可能に収容する培養室と、培養容器3の蓋を開けて内部の細胞に対し所定の処理を施す培養処理装置とを備え、少なくとも1回、培養容器3を入れ替えて細胞を培養する自動培養装置1であって、提供された細胞を収容する空の培養容器3をトレイ7に載せた状態で供給する複数の培養容器供給部8a〜8dを備え、各培養容器供給部8a〜8dが、それぞれ、同一形状の培養容器3をトレイ7上に複数載せて供給する自動培養装置1を提供する。
【選択図】 図6
Description
この発明は、培養処理装置に関するものである。
従来、自動培養装置として、複数の培養容器を収納可能な固定式の収納棚と、水平・昇降・回転移動可能な搬送手段とを備えたものが知られている(例えば、特許文献1参照。)。
この自動培養装置は、培養室内に配置された収納棚に、鉛直方向に並ぶ複数の小部屋を備え、各小部屋の中に培養容器を1つずつ収容して培養を行い、培養途中に搬送手段を作動させて、小部屋から1つずつ培養容器を取り出し、培地を交換し、小部屋へ培養容器を戻すよう構成されている。
特開2002−262856号公報(図1等)
この自動培養装置は、培養室内に配置された収納棚に、鉛直方向に並ぶ複数の小部屋を備え、各小部屋の中に培養容器を1つずつ収容して培養を行い、培養途中に搬送手段を作動させて、小部屋から1つずつ培養容器を取り出し、培地を交換し、小部屋へ培養容器を戻すよう構成されている。
しかしながら、細胞を必要細胞数まで成長させるには、培養容器内の培地を定期的に交換するのみならず、培養容器を交換するなどして培養容器の底面積を広げる処理、いわゆる継代処理を行う必要がある。継代処理は、例えば、トリプシンのようなタンパク質分解酵素を培養容器内に注入して、底面に付着して成長している細胞を剥離させ、底面積の広い新たな培養容器に移し替えることを行う。
この場合において、培養容器の底面に付着して増殖する幹細胞の増殖速度は、それが置かれている空間的な培養環境に左右される傾向がある。すなわち、幹細胞は培養容器の底面に付着して増殖するため、付着可能な広さの底面積が必要であることは言うまでもないが、あまりに広すぎると逆に増殖速度が低下して、効率的に成長させることができないという不都合がある。
このような不都合を回避するために、幹細胞の増殖度合に応じて、順次容積の大きな培養容器に移し替えることにより、幹細胞の適正な培養環境を維持することが考えられる。
しかしながら、最終的に必要となる細胞数は検体ごとに異なるため、全ての検体に対して最適な広さの培養容器を用意しておくことは無駄が多く現実的ではない。
しかしながら、最終的に必要となる細胞数は検体ごとに異なるため、全ての検体に対して最適な広さの培養容器を用意しておくことは無駄が多く現実的ではない。
この発明は上述した事情に鑑みてなされたものであって、最終的に必要細胞数が異なる複数種の検体を、検体ごとに異なる大きさの培養容器を用意することなく、効率的に自動培養することができる自動培養装置を提供することを目的としている。
上記目的を達成するために、本発明は、以下の手段を提供する。
本発明は、細胞を収容した複数の培養容器を出し入れ可能に収容する培養室と、培養容器の蓋を開けて内部の細胞に対し所定の処理を施す培養処理装置とを備え、少なくとも1回、培養容器を入れ替えて細胞を培養する自動培養装置であって、提供された細胞を収容する空の培養容器をトレイに載せた状態で供給する複数の培養容器供給部を備え、各培養容器供給部が、それぞれ、同一形状の培養容器をトレイ上に複数載せて供給する自動培養装置を提供する。
本発明は、細胞を収容した複数の培養容器を出し入れ可能に収容する培養室と、培養容器の蓋を開けて内部の細胞に対し所定の処理を施す培養処理装置とを備え、少なくとも1回、培養容器を入れ替えて細胞を培養する自動培養装置であって、提供された細胞を収容する空の培養容器をトレイに載せた状態で供給する複数の培養容器供給部を備え、各培養容器供給部が、それぞれ、同一形状の培養容器をトレイ上に複数載せて供給する自動培養装置を提供する。
本発明によれば、各培養容器供給部において、トレイに載せた状態の空の培養容器が供給されるので、各培養容器に細胞および必要な培地を投入して培養室内にトレイごと収容して細胞を培養し、必要に応じてあるいは定期的に、培養処理装置内において、培地の交換や、薬液の供給等の種々の処理が施される。この場合において、本発明によれば、複数の培養容器供給部には、それぞれトレイ上に同一形状の複数の培養容器が搭載されているので、検体ごとの必要細胞数に合わせて、使用する培養容器数を異ならせることが可能となる。
すなわち、培養容器としては単一の種類のものを用意しておき、その使用数を異ならせることで、培養に必要な底面積を変更することができる。その結果、必要細胞数が異なる検体ごとに異なる底面積を有する複数種の培養容器を用意する必要がない。
すなわち、培養容器としては単一の種類のものを用意しておき、その使用数を異ならせることで、培養に必要な底面積を変更することができる。その結果、必要細胞数が異なる検体ごとに異なる底面積を有する複数種の培養容器を用意する必要がない。
上記発明においては、前記培養容器供給部が、それぞれ異なる数の培養容器を搭載するトレイを供給することが好ましい。このようにすることで、検体によって必要細胞数が多い場合には、多くの培養容器を搭載したトレイを選択し、必要細胞数が少ない場合には少ない培養容器を搭載したトレイを選択することができる。トレイ上に搭載した培養容器は、トレイごと培養室内に収容されるので、使用、不使用にかかわらず、一旦培養室に収容された後には、そのままでは再使用することは困難である。したがって、トレイ上に載せる培養容器数自体を異ならせることで、必要細胞数に合わせた培養容器の数を選択することにより、不使用のまま廃棄される培養容器を減らして、資源の無駄をなくすことができる。
本発明によれば、同一形状の培養容器を使用して、その数を異ならせることで、培養に必要な面積を変更するので、必要細胞数が異なる種々の検体に適用して効率よく細胞を培養することができるという効果がある。また、その場合に、多数種類の培養容器を用意する必要がなく、培養容器の管理が容易であるという効果がある。
この発明の一実施形態に係る自動処理装置について、図1〜図9を参照して説明する。
本実施形態に係る自動培養装置1は、図1に示されるように、外部から観察可能な透明な壁材により密閉され、シャッタ2を介して相互に連絡する第1空間S1と第2空間S2とを備えている。
本実施形態に係る自動培養装置1は、図1に示されるように、外部から観察可能な透明な壁材により密閉され、シャッタ2を介して相互に連絡する第1空間S1と第2空間S2とを備えている。
第1空間S1の両側空間S11,S13には、培養容器3を収容する培養室4が2個ずつ計4個配置され、中央空間S12には、培養容器3を移動するための搬送ロボット(搬送機構)5が備えられている。中央空間S12の上部には、中央空間S12内の空気を浄化するために清浄な下降空気流を送る空気清浄部6が設けられている。
4個の培養室4は、それぞれ中央空間S12に向けて扉4aを配置することにより、横に並んだ2個ずつが相互に扉4aを対向させて、間隔をあけて配置されている。
4個の培養室4は、それぞれ中央空間S12に向けて扉4aを配置することにより、横に並んだ2個ずつが相互に扉4aを対向させて、間隔をあけて配置されている。
前記各培養室4は、図2および図3に示されるように、一側面に開口部4bを有し、該開口部4bを開閉可能な扉4aを備えている。開口部4bに向かって左右の側壁には、対応する高さ位置に複数のレール状のトレイ保持部材4cが設けられており、左右対となる各トレイ保持部材4cに掛け渡すようにして、トレイ7を上下方向に複数段収容できるようになっている。各培養室4内は、所定の培養条件、例えば、温度37±0.5℃、湿度100%およびCO2濃度5%等に維持されている。なお、トレイ保持部材4cはレール状に限定されず、トレイ7を出し入れ可能に支持することができれば任意の形態でよい。
各トレイ7は、複数個、例えば、10個の培養容器3を並べて載置できる大きさを備えている。各トレイ7の上面には、図4に示されるように、載置した培養容器3を嵌合させてトレイ7上で移動しないように保持する凹部7aが設けられている。各培養容器3は、図5に示されるように、容器本体3aと、該容器本体3aの上面に設けられた蓋体3bとからなり、容器本体3aの左右の側面には、後述する第2空間内のハンドにより引っかけられる突起3cが設けられている。
各培養室4の下方には、図2および図6に示されるように、未使用の空の培養容器3をトレイ7に搭載した状態で複数収容するストッカ8a〜8dが配置されている。各ストッカ8a〜8d内には、図示しないリフト機構が設けられており、最上段のトレイ7が取り出された後に、下段のトレイ7を順次持ち上げて、次に取り出すトレイ7を最上段の供給位置に配置しておくことができるようになっている。
ストッカ8a〜8dは、前記培養室4の扉とは反対側の第1空間S1の外部に向かう側面に開閉可能なドア51を有している。該ドア51は、ストッカ8a〜8dの一側面全体を開放する大きさに形成されている。このドア51を介してトレイ7に搭載した培養容器3を外部からストッカ8a〜8d内に挿入することができるようになっている。また、ストッカ8a〜8dには、ストッカ8a〜8d内の最上段のトレイ7に対応する位置に培養室4の扉側に開口する搬入口52が設けられている。搬入口52にはシャッタ53が配置されており、搬送ロボット5は、シャッタ53が開けられた状態の搬入口52から、ストッカ8a〜8d内に収容されている未使用の培養容器3をトレイ7ごと取り出して後述する培養処理装置30へ移動させるようになっている。
この場合において、各培養室4の下方に配されている4個のストッカ8a〜8dは、それぞれ、図6に示されるように、異なる数の培養容器3を搭載したトレイ7を収容している。図6に示す例では、第1のストッカ8aには1個の培養容器3が搭載され、第2のストッカ8bには2個の培養容器3が搭載され、第3のストッカ8cには4個の培養容器3が搭載され、第4のストッカ8dには8個の培養容器3が搭載されている。
これにより、最初に骨髄液提供者から供給された骨髄液から得られた微量の骨髄細胞を培養するには、搬送ロボット5が第1のストッカ8aに収容されているトレイ7を取り出して、該トレイ7上に搭載されている単一の培養容器3に間葉系幹細胞を収容するようになっている。また、その培養容器3において培養することにより細胞が増殖した場合に、培養容器3を入れ替える継代処理を行うには、第2のストッカ8bに収容されているトレイ7を取り出して、該トレイ7上に搭載されている2個の培養容器3に骨髄細胞を播種するようになっている。その後、2回の継代処理を行う際には、第3,第4のストッカ8c,8dに収容されているトレイ7を取り出して、トレイ7上に搭載されている4個、8個の培養容器3にそれぞれ播種するようになっている。
前記搬送ロボット5は、4個の培養室4の間隔位置のほぼ中央に配置されている。該搬送ロボット5は、水平回転可能な第1アーム5aと、該第1アーム5aの先端に鉛直軸回りに回転可能に連結された第2アーム5bと、該第2アーム5bの先端に鉛直軸回りに回転可能に取り付けられ、それ自身は駆動部、伝導機構などの培養室内の環境を劣化させる機構を持たないハンド5cと、これら第1アーム5a、第2アーム5bおよびハンド5cを昇降可能な昇降機構5dとを備えている。これにより、搬送ロボット5は、4個の培養室4内の全てのトレイ7にアクセスするとともに、前記シャッタ2を跨いで第1空間S1と第2空間S2との間に配置されたコンベア9上にトレイ7を引き渡すことができる水平方向の動作範囲を有している。
前記コンベア9は、搬送ロボット5のハンド5cの幅寸法より大きな間隔をあけて左右に配置された2本の無端ベルト9aを備え、これら無端ベルト9aに掛け渡してトレイ7を載置できるようになっている。また、搬送ロボット5は、培養室4内の全てのトレイ7にアクセスするとともに、前記ストッカ8a〜8dに設けられた搬入口52まで到達する垂直方向の動作範囲を有しており、搬入口52からトレイ7に搭載した未使用の培養容器3を取り出して、培養処理装置30へ移動させることができるようになっている。
なお、ベルト9aは無端ベルトに限られない。
なお、ベルト9aは無端ベルトに限られない。
前記ハンド5cは、トレイ7を載置可能に水平方向に延びる平坦な形状に形成されており、培養室4に収容されているトレイ7間の隙間に挿入可能な厚さ寸法に形成されている。そして、ハンド5cは、トレイ7間の隙間に挿入された状態から上昇させられることにより、2本の腕によってトレイ7を下方から押し上げてトレイ保持部材4cから取り上げるとともに、トレイ7を安定して保持できるようになっている。
前記第2空間S2には、図1に示されるように、培養処理装置30が構成されている。
培養処理装置30は、図1に示されるように、検体抽出部50、給排ロボット10、遠心分離器11、分注ロボット13、チップ供給装置15、チップ回収部31、試薬等供給装置16、顕微鏡17、貯留タンク18、水平移動機構19および載置台21を備えている。
検体抽出部50は、例えば、医療機関等で患者から採取された骨髄液を導入され、供給された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を集める部分であって、提供された骨髄液にPBS(リン酸緩衝化食塩水)等を供給して攪拌する給排ロボット10と、攪拌された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を分離する遠心分離器11とにより構成されている。
培養処理装置30は、図1に示されるように、検体抽出部50、給排ロボット10、遠心分離器11、分注ロボット13、チップ供給装置15、チップ回収部31、試薬等供給装置16、顕微鏡17、貯留タンク18、水平移動機構19および載置台21を備えている。
検体抽出部50は、例えば、医療機関等で患者から採取された骨髄液を導入され、供給された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を集める部分であって、提供された骨髄液にPBS(リン酸緩衝化食塩水)等を供給して攪拌する給排ロボット10と、攪拌された骨髄液から間葉系幹細胞を多く含む検体を分離する遠心分離器11とにより構成されている。
給排ロボット10は、シャッタ2が開かれた状態で第1空間S1からコンベア9によって搬送されてきたトレイ7上の培養容器3に対し、上記検体抽出部50において集められた検体を供給し、あるいは、培地を供給、回収するようになっている。遠心分離機11は、培養容器3内の培地から細胞を分離するように構成されている。
分注ロボット13は、血清や試薬等の種々の液体を分注するための電動ピペット12を備えた水平回転および昇降移動可能なロボットであって、第2空間S2内に4台設置されている。
分注ロボット13は、血清や試薬等の種々の液体を分注するための電動ピペット12を備えた水平回転および昇降移動可能なロボットであって、第2空間S2内に4台設置されている。
前記チップ供給装置15は、これら給排ロボット10および分注ロボット13の電動ピペット12先端に取り付ける使い捨て可能なチップ14を複数収容していて給排ロボット10および分注ロボット13の動作範囲内に提供するようになっている。前記チップ回収部31は、使用済みのチップ14を廃棄回収するようになっている。前記試薬等供給装置16は、血清や試薬等の種々の液体を複数の容器に貯留している。顕微鏡17は培養容器3内における細胞の様子を観察できるようになっている。貯留タンク18は、各試薬および培地交換等により廃棄される廃液をそれぞれ貯留するように複数設けられている。水平移動機構19は、前記コンベア9と各ロボット10,13との間で培養容器3を受け渡し可能とするように培養容器3を移動させるようになっている。前記載置台21は、水平移動機構19のスライダ20に取り付けられ、受け取った培養容器3を載置するように構成されている。
なお、第2空間S2にも、該第2空間S2内の空気を浄化するために清浄な下降気流を形成する空気清浄機32が設けられている。
なお、第2空間S2にも、該第2空間S2内の空気を浄化するために清浄な下降気流を形成する空気清浄機32が設けられている。
前記第2空間S2に構成された培養処理装置30は、その高さ方向の中間位置に配され第2空間S2内を上部空間S21と下部空間S22とに上下に区画する第1の区画壁33と、該第1の区画壁33により形成された下部空間S22内をさらに上下に区画する第2の区隔壁34とにより、上下方向に並ぶ3つの空間S21,S221,S222に区画されている。第1の区画壁33は、前記コンベア9の高さに配置され、その上方の上部空間S21内に、載置台21、給排ロボット10、分注ロボット13のアーム13a、顕微鏡17のXYテーブル17a以上の機構部等を配置している。これらの装置は、培養容器3の移動に必要な装置、および培養容器3の上部開口からアクセスすることが必要な装置だからである。なお、試薬等供給装置16の上面も第1の区画壁33の上面に露出しているが、これはチップ14の挿入口16cを上部空間S21に開口させるためである。
また、第1の区画壁33には、載置台21を上部空間S21において移動させるために、載置台21を下部空間S21内の水平移動機構19に連結するための長孔35、第1の区画壁33の下方の空間S221に配置されたチップ供給装置15からチップ14を取り出すための貫通孔36、使用済みのチップ14を廃棄するための廃棄口37が貫通形成されている。さらに、第1の区画壁33には、その側壁30a,30bに沿って、上下に貫通する通気口38が設けられている(斜線部)。
第1の区画壁33と第2の区画壁34との間の空間S221には、図7に示されるように、分注ロボット13の本体部分、チップ供給装置15、試薬等供給装置16、顕微鏡17のXYテーブル17a以下の部分、水平移動機構19および、チップ回収部31の廃棄口37と廃棄容器39とを接続するダクト40が備えられている。前記ダクト40は、図8に示されるように、例えば、その上端にフランジ部40aを備える構造とされ、第1の区画壁33の下部に設けたフック44に引っかけることで、第1の区画壁33と第2の区画壁34との間に着脱可能に設ければよい。第2の区画壁34の側壁30a,30b近傍には、該側壁30a,30bに沿って、上下に貫通する通気口43が設けられている(斜線部)。
さらに、第2の区画壁34の下方の空間S222には、図9に示されるように、遠心分離機11、貯留タンク18、廃棄容器39、および排気ファン41が配置されている。排気ファン41の出口にはHEPAフィルタのようなフィルタ42が設けられ、排気される空気を清浄にするようになっている。
前記給排ロボット10は、水平多関節型ロボットであって、例えば、図1に示す例では、2種類の電動ピペット10a,10bを備えるヘッド10cと、水平旋回可能な2つのアーム10d,10eと、アーム10eの先端に設けられヘッド10cを昇降させる昇降機構10fとを備えている。電動ピペット10aは、貯留タンク18からダクト10gを介して導かれた培地を供給し、あるいはピペッティング動作を行うようになっている。電動ピペット10bは、培養容器3内あるいは遠心容器内の不要な培地を吸引し、ダクト10gを介して他の貯留タンク18へ廃液として排出するようになっている。
電動ピペット10aによるピペッティング動作は、前記検体抽出部50においてPBSを注入された骨髄液に対して行われるとともに、遠心分離機11により分離された細胞に対しても行われるようになっている。ピペッティング動作は、電動ピペット10aの先端にチップ供給装置15から供給されたチップ14を装着して、遠心容器(図示略)内に挿入し、遠心容器内に貯留されている骨髄液とPBSとからなる細胞懸濁液、あるいは細胞と培地とを混合してなる細胞懸濁液に対し、吸引および放出を10回〜20回繰り返す。これにより、細胞懸濁液を均一に攪拌するようになっている。
また、給排ロボット10は、ピペッティング動作の後に、電動ピペット10aによって、遠心分離機11により分離された細胞と培地との細胞懸濁液を吸引し、載置台21上に搭載された培養容器3内に上部開口から供給するようになっている。
一旦使用された使用済みのチップ14は、チップ回収部31において取り外され回収されるようになっている。したがって、給排ロボット10は、載置台21、チップ供給装置15、チップ回収部31および遠心分離機11からの細胞供給装置(図示略)等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。
前記遠心分離機11は、ピペッティングにより混合された細胞懸濁液を貯留した遠心容器を受け取って低速回転させることにより、骨髄液内に含有されている間葉系幹細胞等の白血球をその他の体液から分離して沈下させるようになっている。また、遠心分離機11は、給排ロボット10から供給された細胞入りのトリプシン溶液を低速回転させることによりトリプシン溶液内に浮遊していた比重の重い細胞を培地から分離して沈下させるようになっている。
前記分注ロボット13は、それぞれ、先端にチップ14を着脱可能に取り付ける電動ピペット12を備えた水平回転可能なアーム13aと、該アーム13aを昇降させる昇降機構13bとを備えている。分注ロボット13は、水平移動機構19によって搬送されて来た培養容器3内へ、培地や種々の試薬を供給するようになっている。したがって、分注ロボット13は、水平移動機構19上の載置台21、チップ供給装置15、チップ回収部31および試薬等供給装置16等の種々の装置をその動作範囲内に配置している。
前記チップ供給装置15は、上方に開口した容器15a内に、電動ピペット10a,10b,12への取付口を上向きにして複数のチップ14を配列状態に収容しており、給排ロボット10や分注ロボット13が、新たなチップ14を必要とするときに、電動ピペット10a,10b,12を上方から挿入するだけで、電動ピペット10a,10b,12の先端にチップ14を取り付けるように構成されている。容器15aは、給排ロボット10や分注ロボット13による電動ピペット10a,10b,12の移動方向に対して交差する方向に往復移動させられるように移動機構15bに取り付けられている。また、分注ロボット13にチップ14を供給するチップ供給装置15には、移動機構15bによる移動方向とは直交する方向に容器15aを移動させる他の移動機構15cが備えられている。これにより、容器15a内の全てのチップ14に対して電動ピペット10a,10b,12がアクセスすることができるようになっている。
前記チップ回収部31は、廃棄容器39の入口に、チップ14を把持する把持装置(図示略)を備えていて、給排ロボット10や分注ロボット13において使用されたチップ14が把持装置に挿入されると、これを把持するようになっている。そして、この状態で給排ロボット10や分注ロボット13が電動ピペット10a,10b,12を移動させることにより、電動ピペット10a,10b,12先端から使用済みチップ14が取り外され、廃棄容器39内にダクト40を介して回収されるようになっている。廃棄容器39は、空間S222内に着脱可能に配置されており、必要に応じて交換可能となっている。
前記ダクト40および廃棄容器39の交換時には、培養処理装置30の側壁30a,30bに設けられた図示しないドアを開くことにより、培養処理装置30の外部からアクセスすることとすればよい。
前記ダクト40および廃棄容器39の交換時には、培養処理装置30の側壁30a,30bに設けられた図示しないドアを開くことにより、培養処理装置30の外部からアクセスすることとすればよい。
前記試薬等供給装置16は、例えば、図7に示されるように、円筒状のケーシング内部に、水平回転可能なテーブル16aを収容し、該テーブル16a上に、扇型の底面形状を有する筒状の試薬等容器16bを周方向に複数配列して搭載している。ケーシング内部は一定の温度に保冷されている。各試薬等容器16bには、種々の試薬等が貯留されている。例えば、細胞を培養するために必要な培地を構成するMEM(Minimal Essential
Medium:最小必須培地)、DMEM(Dulbecco's Modified
Eagle Medium)、FBS(Fetal Bovine Serum:ウシ胎児血清)やヒト血清のような血清、培養容器3内の細胞を剥離させるトリプシンのようなタンパク質分解酵素や、培養に際して細胞を成長させるサイトカインのような成長因子、細胞を分化させるデキサメタゾンのような分化誘導因子、ペニシリン系抗生物質のような抗生剤、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤が貯留されている。
Medium:最小必須培地)、DMEM(Dulbecco's Modified
Eagle Medium)、FBS(Fetal Bovine Serum:ウシ胎児血清)やヒト血清のような血清、培養容器3内の細胞を剥離させるトリプシンのようなタンパク質分解酵素や、培養に際して細胞を成長させるサイトカインのような成長因子、細胞を分化させるデキサメタゾンのような分化誘導因子、ペニシリン系抗生物質のような抗生剤、エストロゲン等のホルモン剤や、ビタミン等の栄養剤が貯留されている。
試薬等供給装置16のケーシングの上面には、分注ロボット13が電動ピペット12先端のチップ14を挿入する挿入口16cが設けられている。この挿入口16cは、前記分注ロボット13の動作範囲内に配置されている。また、各試薬等容器16bは、その上面に、前記挿入口16cに一致する位置に配置される開口部(図示略)を備えている。これにより、テーブル16aを回転させて試薬等容器16bの開口部をケーシングの挿入口16cの鉛直下方に配置することで、分注ロボット13が、電動ピペット12先端のチップ14を上方から試薬等容器16b内へ挿入して、内部に貯留されている試薬等を吸引することができるようになっている。試薬等供給装置16を2台設けているのは、検体に共通のトリプシンのような薬液と、検体に固有の血清のような液体とを分離して取り扱うようにしているためである。
前記顕微鏡17は、培養工程の途中、あるいは、培地交換の際に、培養容器3内の細胞の様子や増殖の程度を観察したり、細胞数を計数したりする場合等に使用されるようになっている。顕微鏡17のXYステージ17aや作動距離調整、倍率の変更等は全て遠隔操作により行うことができるように構成されている。第2空間S2の外方に向けて接眼レンズを配置しておくことにより、自動培養装置1の外部から培養容器3内の細胞の状態を観察できるようにしてもよい。
前記貯留タンク18は、例えば、全ての検体に共通して使用できるMEMやPBS(リン酸緩衝化食塩水)等を貯留しておき、必要に応じて試薬等供給装置16内の試薬等容器16b内に供給するようになっている。また、貯留タンク18には、廃液タンクとして、培地交換の際に排出される廃培地等を貯留するものもある。
前記水平移動機構19は、直線移動機構により水平方向に移動可能なスライダ20を備えている。スライダ20上には前記載置台21が搭載されており、載置台21に搭載された培養容器3を、コンベア9から分注ロボット13の動作範囲まで移動させることができるようになっている。
前記載置台21は、コンベア9上のトレイ7内から移載された培養容器3を搭載して保持する保持機構(図示略)を備えている。また、該培養容器3に振動を付与する加振装置(図示略)を備えていてもよい。加振装置は、例えば、培養容器3を所定の角度範囲で往復揺動させる装置の他、超音波振動を加える装置や、水平方向の振動を加える装置を採用してもよい。
本実施形態に係る自動培養装置1の各種装置には、図示しない制御装置が接続されている。制御装置は、各工程の順序や動作タイミング等を制御するとともに、動作履歴等を記録保存するようになっている。
本実施形態に係る自動培養装置1の各種装置には、図示しない制御装置が接続されている。制御装置は、各工程の順序や動作タイミング等を制御するとともに、動作履歴等を記録保存するようになっている。
このように構成された本実施形態に係る培養処理装置30および自動培養装置1の作用について、以下に説明する。
本実施形態に係る自動培養装置1を用いて、間葉系幹細胞を培養するには、まず、患者から採取された骨髄液を遠心容器に入れて培養処理装置30内に導入し、検体抽出部50に供給する。この工程は作業者が行ってもよく、図示しないロボットにより行ってもよい。
本実施形態に係る自動培養装置1を用いて、間葉系幹細胞を培養するには、まず、患者から採取された骨髄液を遠心容器に入れて培養処理装置30内に導入し、検体抽出部50に供給する。この工程は作業者が行ってもよく、図示しないロボットにより行ってもよい。
検体抽出部50においては、骨髄液内にPBSが供給され、給排ロボットによりピペッティング動作が行われる。このようにして構成された細胞懸濁液は、遠心分離機11に投入される。そして、遠心分離機11が、例えば、800〜1300Gで3〜5min間作動させられることにより、骨髄液内の比重の重い間葉系幹細胞を含む細胞が沈降した状態に集められる。
この状態で、遠心分離機11外に取り出され、給排ロボット10およびチップ供給装置15の作動により、電動ピペット10b先端に未使用のチップ14が取り付けられる。
すなわち、チップ供給装置15は移動機構15bを作動させることにより、未使用のチップ14を給排ロボット10の動作範囲内に配する。すると、給排ロボット10は、昇降機構10fを作動させることにより、ヘッド10cを下降させて、第1の区画壁33下方のチップ供給装置15から未使用のチップ14を受け取り、電動ピペット10bの先端に取り付ける。
すなわち、チップ供給装置15は移動機構15bを作動させることにより、未使用のチップ14を給排ロボット10の動作範囲内に配する。すると、給排ロボット10は、昇降機構10fを作動させることにより、ヘッド10cを下降させて、第1の区画壁33下方のチップ供給装置15から未使用のチップ14を受け取り、電動ピペット10bの先端に取り付ける。
この状態で、給排ロボット10を作動させて電動ピペット10bのチップ14の先端を遠心容器内に挿入して吸引する。これにより、遠心容器内の上澄み液が除去され、間葉系幹細胞を多く含む細胞が遠心容器内に残される。
次に、遠心容器内に残った検体は、給排ロボット10により、培養容器3に投入される。投入に先立って、第1空間S1内の搬送ロボット5が、ハンド5cを前記ストッカ8aの搬入口52までアクセスし、搬入口52から未使用の培養容器3を1個搭載したトレイ7を取り出して、ベルト9上に移載している。そして、コンベア9の作動により、トレイ7に載せた1個の空の培養容器3が、第1空間S1から第2空間S2に差し出されている。その後、トレイ7上の培養容器3は、図示しない移載装置の作動により、載置台21上に載置される。そして、図示しない蓋体開閉装置の作動により、載置台21上の培養容器3の蓋体3bが開けられる。
この状態で、給排ロボット10を作動させて、電動ピペット10aから遠心容器内に、貯留タンク18に貯留されているDMEMやPBS(リン酸緩衝化食塩水)等の培地構成液を、所定量供給する。電動ピペット10a先端のチップ14を遠心容器内に挿入した状態に保持したまま、電動ピペット10aを作動させることにより、ピペッティングを行う。これにより、間葉系幹細胞を多く含む細胞と培地構成液とが均一に混合された細胞懸濁液が構成されることになる。
このようにして製造された細胞懸濁液は、電動ピペット10aを作動させることにより、チップ14内に吸引される。吸引された細胞懸濁液は、チップ14内に保持された状態で、給排ロボット10を作動させることにより、載置台21上の培養容器3内に上部開口から投入される。
細胞懸濁液を培養容器3内に投入し終わると、給排ロボット10は、第1の区画壁33に形成された廃棄口37にチップ14を挿入して取り外し、チップ回収部31に回収させる。廃棄口37において取り外されたチップ14は、ダクト40を介して、最下位の空間S222に配置されている廃棄容器内に投入される。
次に、細胞懸濁液が投入された培養容器3は、水平移動機構19を作動させることにより、載置台21ごと水平移動させられ、各分注ロボット13の動作範囲内に配置される。分注ロボット13は、チップ供給装置15から受け取った未使用のチップ14を先端に取り付けた電動ピペット12を作動させることにより、試薬等供給装置16の試薬等容器16b内からDMEMや血清、あるいは各種試薬を適量吸引した後に、培養容器3の上方まで搬送して培養容器3内に注入する。血清や各試薬の吸引は、各試薬等の吸引ごとにチップ供給装置15から未使用のチップ14に交換して行われる。これにより、培養容器3内においては、適正な培地内に間葉系幹細胞が混合された状態で存在することになる。なお、培地内において間葉系幹細胞を均一に分布させるために、載置台21を作動させて、培養容器3ごと加振することにしてもよい。
そして、全ての処理を終えた培養容器3は水平移動機構19の作動により、コンベア9の近傍まで移動させられ、そこで、再度、蓋体開閉装置および移載装置の作動により、蓋体3bにより上部開口を閉じられた状態で、トレイ7に戻される。
トレイ7上の全ての培養容器3に対して所定の処理が行われた後に、コンベア9を作動させることにより、トレイ7に載せられた培養容器3が第2空間S2から第1空間S1の中央空間S12内に挿入される。
トレイ7上の全ての培養容器3に対して所定の処理が行われた後に、コンベア9を作動させることにより、トレイ7に載せられた培養容器3が第2空間S2から第1空間S1の中央空間S12内に挿入される。
この状態で、搬送ロボット5を作動させることにより、ハンド5cによってトレイ7を持ち上げる。そして、トレイ7を収容する培養室4の前まで搬送したところで、当該培養室4の扉4aを開き、搬送ロボット5によって、空いているトレイ保持部材4c上にトレイ7を挿入する。そして、再度、扉4aを閉じることにより、培養室4内の培養条件を一定に保持して細胞の培養が行われることになる。なお、細胞懸濁液の投入や、DMEM、血清、各種試薬の投入や吸引の順序は適宜変更してもよいのは言うまでもない。
また、培地交換や容器交換の際にも、上記と同様にして、培養室4外に配置されている搬送ロボット5の作動により、培養室4内の培養容器3がトレイ7ごと取り出され、第1空間S1から第2空間S2へ受け渡される。
培地交換の際には、給排ロボット10の作動により、培養容器3内部の培地が吸引されて廃棄され、分注ロボット13の作動により、新たな培地や薬液が供給される。
培地交換の際には、給排ロボット10の作動により、培養容器3内部の培地が吸引されて廃棄され、分注ロボット13の作動により、新たな培地や薬液が供給される。
一方、容器交換の際、すなわち、継代処理においては、培養容器3内部の培地が吸引されて廃棄された後に、分注ロボット13の作動によりトリプシンが培養容器3内に供給される。トリプシンが供給された培養容器3は水平移動機構19および移載機構の作動により顕微鏡17に移載され、トリプシン処理の様子が顕微鏡17により外部から観察される。
そして、所定時間が経過した後に自動的に、あるいは顕微鏡17により観察をしている作業者が手動で、移載機構を作動させることによりトリプシン処理を行った培養容器3が載置台21に載置され、給排ロボット10の作動により、トリプシン内に剥離された間葉系幹細胞が浮遊した細胞懸濁液が電動ピペット10aによりチップ14内に吸引される。チップ14内に吸引された細胞懸濁液は、遠心容器に移し替えられて、遠心分離機11に投入され、遠心分離によりトリプシンと間葉系幹細胞とに分離される。
一方、内部の細胞懸濁液を吸引されて空になった使用済みの培養容器3は、トレイ7に戻されてコンベア9により第1空間S1に戻され、搬送ロボット5の作動により、図示しない排出口から第1空間S1外部に廃棄される。その代わりに、搬送ロボット5は、第2のストッカ8bから2個の培養容器3を搭載したトレイ7を取り出し、コンベア9に引き渡す。
コンベア9は、トレイ7に搭載した2個の培養容器3をシャッタ2が開かれた状態で第1空間S1から第2空間S2に搬入される。
遠心分離機11により細胞から分離されたトリプシンは、上澄み液として給排ロボット10により吸引廃棄され、沈降した間葉系幹細胞は、所定の培地を供給されて細胞懸濁液として、給排ロボット10により2個の培養容器3に分注される。これにより、間葉系幹細胞は、2倍の底面積の培養容器3に播種されることになり、薬液供給等の所定の処理を施された後に培養室4に収容されて培養されることになる。
遠心分離機11により細胞から分離されたトリプシンは、上澄み液として給排ロボット10により吸引廃棄され、沈降した間葉系幹細胞は、所定の培地を供給されて細胞懸濁液として、給排ロボット10により2個の培養容器3に分注される。これにより、間葉系幹細胞は、2倍の底面積の培養容器3に播種されることになり、薬液供給等の所定の処理を施された後に培養室4に収容されて培養されることになる。
同様にして、2回目の継代処理では4個の培養容器3を搭載したトレイ7が選択されて第3のストッカ8cから取り出され、3回目の継代処理では8個の培養容器3を搭載したトレイ7が第4のストッカ8dから取り出され、培養に必要な底面積が順次広げられていくことになる。
この場合において、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、トレイ7に載せる培養容器3の数を異ならせることにより、培養に必要とされる底面積を変えることができる。したがって、培養容器3としては同一の種類のものを多数用意しておけば済み、検体ごとに底面積の異なる複数種類の培養容器を用意しておく必要がない。したがって、培養容器3の管理が簡単であり、コストの低減を図ることができる。
この場合において、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、トレイ7に載せる培養容器3の数を異ならせることにより、培養に必要とされる底面積を変えることができる。したがって、培養容器3としては同一の種類のものを多数用意しておけば済み、検体ごとに底面積の異なる複数種類の培養容器を用意しておく必要がない。したがって、培養容器3の管理が簡単であり、コストの低減を図ることができる。
また、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、異なるストッカ8a〜8dにそれぞれ異なる数の培養容器3を搭載したトレイ7が収容されているので、作業者は、常に同じストッカ8a〜8dには同じ数の培養容器3を載せたトレイ7を各ドア51から挿入すれば済む。すなわち、異なる数の培養容器3を搭載したトレイ7を同じストッカ8a〜8dに収容しておく場合と比較すると、これを準備する作業者の人為的なミスの発生を未然に防止することができる。
そして、複数回の培地交換や容器交換を介した所定期間にわたる培養工程を行うことにより、間葉系幹細胞が十分な細胞数まで増殖させられることになる。十分な細胞数に達したか否かは、給排ロボット10の作動により、間葉系幹細胞が底面に付着した培養容器3を顕微鏡17まで搬送することにより、観察あるいは測定され、細胞の増殖の程度が判断される。なお、培養室4内に収容される複数のトレイ7上には、同一検体の培養容器3が載置されていてもよいし、異なる検体の培養容器3が載置されていてもよい。
このようにして、本実施形態に係る自動培養装置1により、患者から採取した骨髄液から十分な細胞数の間葉系幹細胞を自動的に培養することが可能となる。なお、十分な間葉系幹細胞が得られた後には、培養容器3内にリン酸カルシウムのような生体組織補填材およびデキサメタゾンのような分化誘導因子を投入して、再度培養工程を継続することにより、生体の欠損部に補填可能な、生体組織補填体を製造することにしてもよい。
また、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、培養室4内に、培養容器3を取り出すための機構部が存在しない。すなわち、培養室4内には、トレイ7を載置した状態に支持するトレイ保持部材4cが設けられているのみであり、培養容器3を取り出すための機構部は全て培養室4外に配置された搬送ロボット5に集約されている。そして、搬送ロボット5は、トレイ7の出し入れ作業が行われた後には、培養室4の扉4aの外側に完全に退避することができるようになっている。
したがって、扉4aが閉じられた状態では、培養室4内に機構部が存在せず、機構部の作動によって発生するような塵埃の発生は全く存在しない。また、培養室4内は、温度37±0.5℃、湿度100%およびCO2濃度5%等に維持されるが、機構部が存在しないために、このような環境下においても、腐食等の問題が生ずることがない。また、扉4aが開かれた状態においても、培養室4内に挿入されるのは搬送ロボット5のハンド5c先端のみであり、実質的に回転機構や摺動機構が培養室4内に入ることはない。その結果、培養室4内への塵埃の侵入が抑制され、培養室4内部の清浄度を高めることができる。
なお、培養室4は、CO2インキュベータ、マルチガスインキュベータ、インキュベータ、または保冷庫等のように、培養に利用されるものあるいはその組合せで構成されていてもよい。
なお、培養室4は、CO2インキュベータ、マルチガスインキュベータ、インキュベータ、または保冷庫等のように、培養に利用されるものあるいはその組合せで構成されていてもよい。
また、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、医療機関等において患者から採取された状態の骨髄液を培養処理装置30に導入するだけで、早期に間葉系幹細胞を必要細胞数まで増殖させることができる。したがって、医療機関や作業者に特別な設備や作業を発生させることがないという利点がある。
さらに、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、培養処理装置30の第2空間S2内が、第1の区画壁33により上部空間S21と下部空間S22とに区画されている。さらに、上部空間S21には清浄な下降気流を発生させる空気清浄機32が設けられている。そして、第1の区画壁33には、その側壁30a,30b近傍に通気口38が設けられている。第1の区画壁33には、通気口38の他に種々の装置を貫通させるための貫通孔36,37等が形成されているが、通気口38の流通断面積を他の貫通孔36,37等の流通断面積より十分に大きく確保しておくことにより、気流を通気口38に通過させることが可能となる。
したがって、上部空間S21内を下降してきた清浄な気流は、第1の区画壁33の近くで側壁30a,30bの方向に向かい、通気口38を介して下部空間S22へと流通させられる。その結果、上部空間S21内に浮遊していた塵埃を下方に向かって押し流してきた気流が、上部空間S21の側壁30a,30b近傍の角部に滞留することがなく、スムーズに下部空間S22へ流通させられることになる。
さらに、本実施形態に係る培養処理装置30および自動培養装置1によれば、蓋体3bを開かれた状態の培養容器3が移動させられる上部空間S21には、培養容器3の移動に必要な載置台21、顕微鏡17のXYテーブル17a、培養容器3の上部開口からアクセスすることが必要な給排ロボット10、分注ロボット13の電動ピペット12、顕微鏡17の光源部分等のみが配置され、その他の機構部は下部空間S22に配置されている。したがって、上部空間S21における塵埃の発生が最小限に抑えられ、培養容器3内への塵埃の混入の可能性が低減されることになる。
また、特に、塵埃を発生する可能性の高い装置、例えば、遠心分離機11、廃棄容器39、排気ファン41等は、下部空間S22の内、さらに第2の区画壁34によって区画された最下位の空間S222内に配置されているので、そこで発生した塵埃が上部空間S21に流入することはない。さらに、空間S222内の空気は排気ファン41によって吸引され、HEPAフィルタ42によって塵埃を除去された後に培養処理装置30の外部に放出される。したがって、上部空間S21の清浄度は、極めて高い清浄度に維持されることになる。
また、第2の区画壁34にも、側壁30a,30bに沿って通気口43が設けられているので、上部空間S21から流入した塵埃を含む気流が、空間S221内に広がることなく、スムーズに空間S222に向けて流通させられることになる。
さらに、培地や細胞が付着した使用済みのチップ14を収容した廃棄容器39は、着脱可能であり、必要によりまたは定期的に交換することで、下部空間S22の清浄度をも高い状態に回復することができる。さらに、廃棄容器39への廃棄の際に使用済みのチップ14を通過させるダクト40も、必要によりまたは定期的に取り外して、交換あるいは清掃することで、清浄度の向上に寄与することができる。
さらに、本実施形態に係る自動培養装置1は、搬送ロボット5の設置されている中央空間S12の上部に、空気清浄部6を備えているので、搬送ロボット5の存在する中央空間S12内も常に清浄度が維持されている。したがって、培養室4の扉4aが開かれたときにも、培養室4内に塵埃が流入することを最小限に抑えることが可能となる。
したがって、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、培養中の細胞が塵埃等によって汚染される可能性を低減し、健全な細胞を培養することができるという効果がある。
したがって、本実施形態に係る自動培養装置1によれば、培養中の細胞が塵埃等によって汚染される可能性を低減し、健全な細胞を培養することができるという効果がある。
なお、この発明は、上記実施形態に示した構成に限定されるものではない。すなわち、培養室4の形状や数、搬送ロボット5、給排ロボット10および分注ロボット13の形態や数、各種装置の形態や数等は、何ら限定されることなく、適用条件に合わせて任意に設定することができる。
また、スタッカ8a〜8dを4カ所に設けたが、4カ所に限定されるものではない。また、各スタッカ8a〜8dの各トレイ7に搭載する培養容器3の数を1,2,4,8個としたが、これに代えて、他の数の培養容器3を搭載することにしてもよい。また、3回の継代処理により、最初の1個の培養容器3を2,4,8個と順次増加させることとしたが、これに代えて、増殖の早い細胞の場合には、最初の1個から4個、8個、10個の培養容器3に播種していくことにしてもよい。また、初期に得られる骨髄液が多い場合には、2個以上の培養容器3から開始してもよい。
また、4カ所のスタッカ8a〜8dに収容するトレイ7上に搭載する培養容器3の数を異ならせることとしたが、これに代えて、全てのトレイ上の培養容器3の数を10個とし、必要な培養容器3のみを使用することにしてもよい。
また、成長因子としては、サイトカインの他に、例えば、濃縮血小板、BMP、EGF、FGF、TGF−β、IGF、PDGF、VEGF、HGFやこれらを複合させたもの等の成長に寄与する物質を採用することにしてもよい。また、抗生剤としては、ペニシリン系抗生物質の他、セフェム系、マクロライド系、テトラサイクリン系、ホスホマイシン系、アミノグリコシド系、ニューキノロン系等任意の抗生物質を採用することができる。
なお、本発明に係る自動培養装置は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された細胞や、樹立された細胞ラインを培養してもよい。
なお、本発明に係る自動培養装置は、骨髄の間葉系幹細胞の培養に限定されるものではない。生体の種々の組織から採取された細胞や、樹立された細胞ラインを培養してもよい。
また、生体組織補填材としては、リン酸カルシウムに代えて、生体組織に親和性のある材料であれば任意のものでよく、生体吸収性の材料であればさらに好ましい。特に、生体適合性を有する多孔性のセラミックスや、コラーゲン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒアルロン酸、またはこれらの組合せを用いてもよい。また、チタンの様な金属であってもよい。また、生体組織補填材は、顆粒状でもブロック状でもよい。
1 自動培養装置
3 培養容器
3b 蓋
4 培養室
7 トレイ
8a〜8d ストッカ(培養容器供給部)
30 培養処理装置
3 培養容器
3b 蓋
4 培養室
7 トレイ
8a〜8d ストッカ(培養容器供給部)
30 培養処理装置
Claims (2)
- 細胞を収容した複数の培養容器を出し入れ可能に収容する培養室と、
培養容器の蓋を開けて内部の細胞に対し所定の処理を施す培養処理装置とを備え、
少なくとも1回、培養容器を入れ替えて細胞を培養する自動培養装置であって、
提供された細胞を収容する空の培養容器をトレイに載せた状態で供給する複数の培養容器供給部を備え、
各培養容器供給部が、それぞれ、同一形状の培養容器をトレイ上に複数載せて供給する自動培養装置。 - 前記培養容器供給部が、それぞれ異なる数の培養容器を搭載するトレイを供給する請求項1に記載の自動培養装置。
Priority Applications (1)
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- 2004-04-06 JP JP2004111736A patent/JP2005287466A/ja not_active Withdrawn
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