WO2003084983A1 - Procede de production d'un peptide modifie - Google Patents

Procede de production d'un peptide modifie

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WO2003084983A1
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peptide
amino acid
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peptide fragment
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PCT/JP2003/004590
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Yoshiharu Minamitake
Masaru Matsumoto
Tomohiro Makino
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Daiichi Suntory Pharma Co., Ltd.
Kangawa, Kenji
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Definitions

  • the present invention provides a method for producing a modified peptide or protein, and a method for producing the modified peptide or protein.
  • the present invention relates to a method for producing a peptide fragment.
  • GH S -R an endogenous growth hormone secretagogue
  • GH S an endogenous growth hormone secretagogue
  • This peptide is known to have a characteristic structure in which the hydroxyl group of a serine residue is acylated with a fatty acid.
  • vertebrates other than rats for example, humans, mice, pigs, chickens, puppies, pears, pomas, sheep, potatoes, rainbow trouts, or dogs, have fatty acid modifications at the serine or threonine residue at position 3.
  • Ghrelin having a site was isolated or deduced from cDNA (Table 1).
  • human dallelin consists of 28 amino acids, and the serine side chain at position 3 is acylated with a fatty acid (n-octanoic acid).
  • This novel peptide has a strong growth hormone secretion promoting activity, and it has been shown that the fatty acid modification of serine or threonine at position 3 is essential for the expression of the activity (Kojima et al., Nature, vol. 402, p. 656-660, 1999).
  • darellin secreted from the stomach functions as a hormone in blood to regulate growth hormone secretion, and there is interest in the physiological role of ghrelin and its application to pharmaceuticals.
  • Table 1
  • GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR Rat (Rat): GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
  • GSS 11- -oc i anoy 1 FLSPSQKPQGKGKPPRV-, Nitri (Chicken;: GSS (n- -oc i anoy 1) FLSPTYKNI QQQKGTRKPTAR
  • GSS (n- -oc tanoyD FL SPTYKN I QQQKDTRKP TAR
  • GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPTYKNI QQQKDTRKPTARLH ⁇ Toad (Bull frog): GLT (n- -oc t anoy 1) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
  • GLT (n- -oc t anoy 1) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN tilapia (Ti l api a): GSS (n- -oc t anoyD FLSPS QKPQNKVKS SR I -NH 2 Catfish (Cat fi sh): GSS (n- -oc t anoy 1) ) FLSPTQKPQNRGDRKPPRV-,
  • GSS (n-butanoy 1) FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR
  • octanoyl group (C8), butanoyl group (C4), hexanoyl group (C6), decanoyl group (C10), dodecanol group (C12) Modifications exist.
  • some peptides or proteins have a specific amino acid residue in the amino acid sequence that undergoes a modification such as acylation, sulfonation, glycosylation, or phosphorylation, and their physiological role.
  • ghrelin has the effect of promoting growth hormone secretion when a specific amino acid side chain is modified by a long-chain fatty acid, so fatty acid modification is an essential structural element.
  • fatty acids are ester-bonded to the hydroxyl group of a specific amino acid side chain, or whether the fatty acid is extended.
  • darelin is a biologically active peptide that has been shown for the first time to have a structure in which the hydroxyl group of the amino acid side chain has been modified with a fatty acid.
  • the production of peptides having a specific fatty acid modification on the side chain of a hydroxyl-containing amino acid has not been generalized. At present, no advantageous industrial manufacturing method has been established.
  • various peptides or protein preparations such as insulin, growth hormone, calcitonin, atrial natriuretic peptide, LH-RH derivative, and adrenocorticotropic hormone derivative are used as pharmaceuticals.
  • Known methods for producing these peptides or proteins include chemical synthesis, enzymatic methods, and gene recombination. The method to be used is appropriately selected. Generally, when the number of residues is small, a chemical synthesis method is used, and when the number of residues is large, an enzymatic method or a gene recombination method is generally used.
  • the chemical synthesis method is the most reliable method for producing a bioactive peptide or protein having a modification such as darelin.
  • Method for producing modified peptide or protein Many production methods using a chemical synthesis method have already been reported.
  • ghrelin Bednarek J (J. Med. Chem., 43, 4370-4376, 2000)
  • Mat sumo to et al. Biochem. Biophys. Res. Com un., 284, p. 655-659, 2001.
  • International Publication No. TO 01/07475 describes a chemical synthesis method as a method for producing darelin and peptides that are darelin derivatives or salts thereof.
  • the method of enzymatically coupling peptide fragments is excellent in that the protection of amino acid side chains can be minimized.However, in this method, the reverse reaction of hydrolysis is usually performed. Since it is used, it is difficult to set conditions in principle, and it is not practical.
  • octanoic acid Not only (C 8) but also butanoic acid (C 4), decanoic acid (C 10), or those containing these unsaturated fatty acids have been discovered, so that fatty acids with a specific chain length can be introduced.
  • the difficulty of controlling is obvious.
  • the productivity of eukaryotic cells is generally low, the production system of yeast and various egg cells having a modified system is, from the viewpoint of mass production of peptides or proteins modified with ghrelin or the like, There is much room for improvement.
  • a peptide or protein having a modification such as sugar modification, acylation, sulfonation, or phosphorylation can be obtained by applying the conventionally known chemical synthesis method, enzyme method, and gene recombination method alone.
  • a semi-synthetic method that combines a chemical synthesis method and a gene recombination method.
  • An important point of the present production method is to efficiently produce a peptide fragment in a form suitable for condensation.
  • a peptide fragment having a modified amino acid residue (hereinafter, also referred to as a modified component) and a peptide fragment having no modified amino acid residue (hereinafter, also referred to as an unmodified component) are N-terminal or Any of the C-terminal side may be used, and a plurality of modifying components may be used.
  • Build method can be designed. As an example, the case where the modification component exists on the N-terminal side and the other peptide fragment condensed with the peptide fragment (modification component) is an unmodified component will be described in detail.
  • thioester method Specific examples of the thioester method are shown below.
  • a peptide fragment containing a phosphate modification site by solid-phase chemical synthesis (modification component) (13 mer) is produced as a thioester.
  • a peptide fragment having a sequence in which an amino acid residue is added to the N-terminus of the unmodified component is produced in Escherichia coli, and this is treated with dalioxylic acid in the presence of divalent copper or nickel ions, and the N-terminus is After converting the added amino acid residue to a ketoacyl group, the side chain amino group is protected with a Boc group.
  • these fragments are condensed by adding an active esterifying agent such as silver salt or excess HOOBt.
  • a semi-synthetic method combining a chemical synthesis method and a gene recombination method is also described in International Publication No. TO 01/07475 as a method for producing darelin and a peptide which is a darelin derivative or a salt thereof. More specifically, a method for preparing rat ghrelin (1-28) by condensing rat dallelin (6) prepared by a chemical synthesis method with rat dallelin (6-28) prepared by a genetic recombination method is described. I have. However, such a method also has the following problems, so that there is much room for improvement in making the production method advantageous for efficient industrial production.
  • rat darelin (1-5) when the peptide chain is released from the resin by TFA to obtain rat darelin (1-5), the Boc group and tri-Bu group are removed at the same time, so it is necessary to introduce the Boc group into the N-terminal again.
  • Ser side chain since the Ser side chain is unprotected, there is room for improving productivity in that a strong activator cannot be used for the condensation with rat darrellin (6-28).
  • the C-terminal amino acid of the acyl peptide fragment may be racemized, and there is room for improvement to suppress this.
  • Darrelin (mn) means a peptide having an m-th to n-th amino acid sequence from the N-terminal of ghrelin. The same applies to the following.
  • a plasmid that expresses a fusion protein containing protected rat ghrelin (6-28) is a plasmid that highly expresses a fusion protein between an E. coli-galactosidase derivative and human parathyroid hormone (1-34). Since it is constructed based on Rasmid (JP-A-9-296000), when preparing a protected peptide fragment (unmodified component), it may be necessary to select a linker sequence suitable for the amino acid sequence.
  • the protected rat darelin (6-28) has a phenomenon that the protective group is released in an aqueous solution, and the recovery rate in purification is extremely low at 10%, and there is still a problem in the aspect of stable supply of darelin in large quantities. .
  • An object of the present invention is to provide a simple and efficient method for industrial production of modified peptides or proteins. Specifically, the present invention produces a peptide fragment containing a modification site (modified component) by a chemical synthesis method, and a peptide fragment containing no modified site (an unmodified component) by a gene recombination method. It is an object of the present invention to provide a method for efficiently producing a high-quality modified bioactive peptide or protein by condensing both. As described above, each of these peptide fragments (modified component and unmodified component) may be either an N-terminal fragment or a C-terminal fragment, and may have a plurality of modified components.
  • the production method can be appropriately designed according to the desired peptide or protein.
  • the present invention provides a method for producing a protected peptide fragment (modification component) suitable for a condensation reaction under mild conditions that does not affect the structure of the modification site, and a method for producing a protected peptide fragment ( It is an object of the present invention to provide a method for producing a protected peptide fragment (modified component) suitable for condensation with an unmodified component).
  • the present invention provides a highly safe production of a modified bioactive peptide or protein which can be used as a pharmaceutical product. It is intended to provide a method.
  • an object of the present invention is to provide a simple and efficient method for industrial production of darelin and darelin derivatives.
  • the present inventors have improved the method of synthesizing a peptide fragment (modified component) containing an amino acid modified with an acyl group in darelin or a derivative thereof using darelin as a material, and producing the peptide fragment (modified component).
  • a method that can greatly simplify and increase efficiency That is, a peptide main chain sequence of a peptide fragment (modification component) is constructed on a weakly acidic leaving resin such as 2-chlorotrityl resin, and then the residue is selectively modified, and then solidified by treatment with a weak acid such as acetic acid. It has been found that a protective modified peptide can be cut out from a phase resin.
  • a modifying group is introduced on a resin such as a Wang resin which can be cut out from a resin with trifluoroacetic acid or the like, and then the protecting group is removed along with the cutout from the resin.
  • the cleaved peptide fragment (modified component) is continuously subjected to a condensation reaction with the other peptide fragment (unmodified component), so that the protecting group is also removed along with the cleaved resin fragment.
  • the method according to the prior art is not preferable from the viewpoint of simple and efficient production because the protecting group must be introduced again.
  • the present inventors used a weak acid (including a diluted strong acid), which hardly removes the protecting group of the amino acid side chain, to cleave the peptide fragment (modification component) from the resin.
  • a method using quaternary ammonium fluoride is effective as a method for removing specific amino acid side-chain protecting groups on the resin and performing residue-selective modification without leaving the resin.
  • TBAF tetrabutylammonium fluoride
  • the peptide does not leave the resin, and therefore, it is possible to perform residue-selective modification by removing the protecting group of a specific amino acid side chain on the resin, and
  • the peptide fragment (modified component) is cleaved from the resin using a weak acid (including a diluted strong acid) that does not easily remove the protective group of the amino acid side chain, and the condensation reaction with the peptide fragment (unmodified component) in the next step is performed.
  • a step of protecting the peptide fragment (modification component) in advance is not required, and the production process of the modified bioactive peptide or protein can be greatly simplified and made efficient.
  • the present inventors have improved the method of preparing a protected peptide fragment of darelin (unmodified component), and have developed an optimal linker for preparing a large amount of protected darelin (8-28) fragment by a two-step enzyme treatment method.
  • the sequence was found.
  • the present inventors have established a method that can greatly simplify and improve the production process of a protected peptide fragment (unmodified component) by purifying under a PH condition under which a protecting group is not removed.
  • the phenomenon that a protective group is released during the preparation of a protected peptide depends on the pH and temperature of the aqueous solution. By setting the pH of the aqueous solution to 4-8, the release of the protective group can be prevented, and the yield is improved. It has been found that peptides (unmodified components) can be prepared.
  • the method for producing darrellin using a weakly acidic release resin has an advantage that formation of diketopiperazine generated by a side reaction can be suppressed. That is, since the C-terminal amino acid residue is proline at position 7, when the third amino acid (Leu) is condensed with the dipeptide (-Ser-Pro-), the side reaction of winding off diketopiperazine and leaving the resin is Can be minimized.
  • the silyl protecting groups are t-butyldimethylsilyl (TBDMS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), triisopropylsilyl (TIPS), triisobutylsilyl (TIBS), and t-hexyldimethylsilyl (T xDMS) or triphenylsilyl (TPS), and the quaternary ammonium fluoride is tetrabutylammonium fluoride (TBAF), tetraethylammonium fluoride (TEF) or ammonium fluoride.
  • A is serine, threonine, cystine, homocystine, lysine, orditin, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2- ⁇ Minomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine, and R is bonded to the side chain of A via an ester bond, ether bond, thioether bond, disulfide bond, amide bond, O-glycoside bond or N-glycoside bond, etc.
  • A is serine, threonine, cystine, homocystin, lysine, orditin, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine;
  • R is an ester bond; Bonded to the side chain of A by an ether bond, thioether bond, disulfide bond, amide bond, p-glycoside bond or N-glycoside bond.
  • the condensing agent is diisopropyl carbopimide (DIPC), dicyclohexyl carbopimide (DCC) or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminobutyl pill) carbopimide (EDC);
  • DIPC diisopropyl carbopimide
  • DCC dicyclohexyl carbopimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminobutyl pill) carbopimide
  • H0Bt 1-hydroxybenzotriazole
  • HOSu 1-hydroxysuccinimide
  • HOOBt 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzobenzotriazine
  • the present invention relates to a method for subjecting a modified peptide or protein to fragment condensation.
  • the production process (a) when producing a peptide fragment containing a modifying group, the peptide is synthesized using a weakly acidic release resin such as 2-chlorotrityl resin.
  • a weakly acidic release resin such as 2-chlorotrityl resin.
  • a method for producing a modified bioactive peptide or protein, particularly ghrelin or a ghrelin derivative (c) condensation of a modified peptide fragment (a modified component) with a modified peptide fragment (an unmodified component) Darellin or darellin characterized in that racemization of constituent amino acids was suppressed by interposing a proline at the C-terminal residue of the N-terminal fragment to be activated.
  • Process for producing a conductor, to a condensation agent was significantly better for the production of (d) Gureri down or Darerin derivative.
  • a peptide fragment having an acidic substituent protected by a protecting group is prepared on a weakly acidic release resin, and then the protecting group in the peptide fragment is released under a weakly acidic condition.
  • the protecting group of the reactive substituent in the side chain of the amino acid or the non-amino acid A to be modified by the substituent R is a silyl-based protecting group, and quaternary ammonium fluoride is used for deprotection of the protecting group.
  • the method for producing a peptide fragment according to the above (2) or (3) which comprises using (5)
  • the silyl protecting groups are t-butyldimethylsilyl (TBDMS), t-butyldiphenylsilyl (TBDPS), triisopropylsilyl (TIPS), triisobutylsilyl (TIBS), and t-hexyldimethylsilyl (ThxDMS ) Or triphenylsilyl (TPS), wherein the quaternary ammonium fluoride is tetrabutylammonium fluoride (TBAF), tetraethylammonium fluoride (TEF) or ammonium fluoride.
  • TBS t-butyldimethylsilyl
  • TPS t-hexyldimethylsilyl
  • TPS triphenylsilyl
  • the quaternary ammonium fluoride is tetrabutylammonium fluoride (
  • A is serine, threonine, cysteine, homocystine, lysine, orditin, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine or asparagine, and R is ester (1) to (1) to (1) to (1) to (4), which are bonded to a reactive functional group on the side chain of A via a bond, an ether bond, a ether bond, a disulfide bond, an amide bond, a diglycoside bond or an N-glycoside bond.
  • the condensing agent is 2- (1-hydrobenzotriazolyl-1-yl) -1,1,1,3,3-tetramethylperonium hexafluorophosphate (HBTU), 2- (1 -Hydrobenzotriazole-11-yl) 1, 1, 1, 3,
  • TBTU 3-tetramethylperonium tetrafluoroborate
  • DEPC diphenyl phosphorocyanide
  • DIPC disopropylcarpoimide
  • DCC dicyclohexylcarposimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carposimide
  • the condensing agent is diisopropyl carbodiimide (DIPC), dicyclohexyl carbodiimide (DCC) or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl pill) carbopimide (EDC), and a peptide fragment using the condensing agent
  • DIPC diisopropyl carbodiimide
  • DCC dicyclohexyl carbodiimide
  • EDC 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl pill) carbopimide
  • a peptide fragment using the condensing agent
  • the condensation of (a) and (b) is carried out in the presence of 1-hydroxybenzotriazole (H0Bt), 1-hydroxysuccinimide (HOSu) or 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-benzobenzotriazine (HOOBt).
  • H0Bt 1-hydroxybenzotriazole
  • HOSu 1-hydroxysuccinimi
  • a protected peptide fragment containing no modified amino acids or non-amino acids is prepared by the following method;
  • Step (1) a peptide having the amino acid sequence of the peptide fragment (hereinafter referred to as “this item”). Is referred to as a target peptide. Culturing cells transformed by an expression vector having either the nucleotide sequence encoding) or the nucleotide sequence encoding a fusion protein in which a protective peptide is added to the target peptide via a linker sequence as desired. Collecting the target peptide or the fusion protein from the culture.
  • Step (2) When the fusion protein is collected in Step (1), the protected peptide and, if desired, the linker sequence and the target peptide are cleaved and separated from the obtained fusion protein, and the target peptide is further purified if necessary. Performing the step;
  • Step (3) selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a lipoxyl group in the side chain of the target peptide obtained in step (1) or (2).
  • step (2) The cleavage and separation of the protection peptide and, if desired, the linker sequence and the target peptide in step (2) are performed in two steps using OmpT protease or its derivative and KeX2 protease or its derivative.
  • Step (1) A protective peptide is added to a nucleotide sequence encoding a peptide having a desired amino acid sequence (hereinafter referred to as a target peptide in this section) or a target peptide via a linker sequence as desired. Culturing cells transformed by an expression vector having any of the nucleotide sequences encoding the fusion protein, and collecting the target peptide or the fusion protein from the culture;
  • Step (2) When the fusion protein is collected in Step (1), the protective peptide and, if desired, the linker sequence and the target peptide are cleaved and separated from the obtained fusion protein, and further purified if necessary. ;
  • Step (3) selected from the group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a carbonyl group in the side chain of the target peptide obtained in step (1) or (2).
  • Step (4) a step of purifying and storing the protected target peptide obtained in Step (3) in a solution having a pH of 4 to 8;
  • a method for producing a modified amino acid-free or non-amino acid-free protected peptide fragment characterized by being produced by a method comprising:
  • step (2) the cleavage and separation between the protected peptide and, if desired, the linker sequence and the target peptide are carried out by using ⁇ mp T protease or its derivative and Production of a protected peptide fragment containing no amino acid or non-amino acid modified according to the above (20) or (21), which is carried out in two steps using Kex2 protease or a derivative thereof.
  • FIG. 1A shows the total synthetic oligo DNA and amino acid sequence of hGhrelin (8-28).
  • FIG. 1B shows the amino acid sequence of the hGhrelin (8-28) fusion protein expressed by P1178-28oRR.
  • FIG. 2 shows the results of HPLC analysis of purified [Lys 1M9 ′ ′ 24 (Boc)] hGhrelin (8-28).
  • the peak a) shows the peak of [Lys 16 ′ l9 ′ 2 ° ′ 24 (Boc)] hGhrelin (8-28).
  • FIG. 3 shows the condensation reaction of the fragments.
  • Peak one click A is [N a - Boc, Ser 2 - 6 (tBu)] hGhrelin peaks (Bok 7), Peak B [Lys 16 '19' 2 ° '24 (Boc)] hGhrelin (8-28 the peak of), the peak C is Boc, Ser 2 - 6 (tBu ), a peak of Lys ⁇ 9 '2 °' 24 (Boc )] hGhrelin, peak D is a peak of hGhrelin.
  • FIG. 4 shows the results of HPLC measurement of the purified hGhrelin.
  • FIG. 5 shows the amino acid sequences of the fusion proteins having different cleavage recognition sites of Kex2 protease.
  • FIG. 6 shows the results of HPLC analysis of the Kex 2 cleavage efficiency of each fusion protein prepared in FIG. Fig. 6 A. 11-1 ⁇ 11 1111 (8-28) after 13 ⁇ 42 enzyme reaction 3 shows the results of HPLC analysis.
  • FIG. 6B shows the results of HPLC analysis of RR-hGhrelin (8-28) after the Kex2 enzyme reaction.
  • FIG. 6C shows the results of HPLC analysis of KR-hGhrelin (8-28) after the Kex2 enzyme reaction. Peak ⁇ ) shows a peak of containing linker one sequence [Lys 16 'ig' 2Q ' 24 (Boc)] hGhrelin (8- 28). Peak I) has.
  • Peak ⁇ indicating a peak of [Lys 16 '19' 2 ( 4 (Boc)] hGhrelin (8-28)) is, [Lys 16 'ig' M '24 (Boc)] hGlirelin (16 -28).
  • FIG. 7 shows the amino acid sequence of each hGhrelin (8-28) fusion protein created to determine the optimal fusion protein for culture.
  • FIG. 8A shows the difference in culture results due to the difference in the fusion protein
  • FIG. 8B shows the turbidity of the culture solution of each fusion protein before and after cell disruption (depending on the fusion protein). Difference).
  • Figure 9 is that shows the stability evaluation results of [Lys 16 '19' 2 ( 4 (Boc)] hGhrelin (8-28).
  • the first 0 figure shows the stability evaluation results of [Lys 16 '19' 2I 4 (Boc)] hGlireliii (8_28).
  • amino acid is a compound having an amino group and a propyloxyl group in the same molecule.
  • L-amino acid, D-amino acid, a; -amino acid, ⁇ -amino acid, ⁇ -amino acid, natural amino acid Includes all amino acids such as unnatural amino acids and synthetic amino acids.
  • Natural amino acids refer to the 20 amino acids encoded by genes.
  • Unnatural amino acid means that the ⁇ -carbon in an a-amino acid is modified with any substituent that is not present on the natural amino acid or the corresponding D-amino acid Refers to a compound. That is, one amino acid is represented by the following formula;
  • any substituent or hydrogen atom that is not present on the natural amino acid or the corresponding D-amino acid as a substituent represented by R ′′ (where R ′ and R ′′ are both hydrogen atoms) ).
  • Non-amino acid is an analog of an amino acid consisting of one or more atoms selected from the group consisting of (:, H, ⁇ , N and S, and is included in natural amino acids and non-natural amino acids.
  • compounds having a molecular chain length equivalent to that of a peptide or a dipeptide are preferable, for example, N3 ⁇ 4-CH (CH 2 0H) -C3 ⁇ 4, CH CH (R H ) -C00H, C3 ⁇ 4-CH (R a ) -CH 3 (both have a molecular chain length equivalent to a peptide), or N3 ⁇ 4- (CH 2 ) 3 CH (CH 2 OH) -C00H, N- (C3 ⁇ 4) 4 -COOH, N3 ⁇ 4-C ( C3 ⁇ 4) 2 - (CH 2) 3 - COOH, NH CH (CH 3) - (CH 2) r CH (CH 3) one C00H, NH (CH 2) 3 CH (CH 2 0).
  • “Peptide” or “peptide fragment” refers to a compound in which a plurality of amino acids are linked by peptide bonds.
  • the bond between the non-amino acid and an adjacent amino acid may not be a peptide bond,
  • the compounds in this case are also collectively referred to as peptides or peptide fragments.
  • protected peptide fragment refers to a group consisting of a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group, and a lipoxyl group in the amino acid or non-amino acid side chain of the peptide fragment.
  • One or more selected peptide fragments in which a reactive substituent having a possibility of causing an undesired side reaction in the production of peptide fragments or the condensation reaction of peptide fragments is protected by a protecting group.
  • protected peptide fragment it is abbreviated as “protected peptide fragment”.
  • Modified amino acid or non-amino acid is defined by the formula 1; -A (R) -I, where A represents an amino acid or non-amino acid, and R represents a modification attached to the side chain of A. Represents the introduced substituent.
  • the substituent R is bonded to a group formed by removing a hydrogen atom from a hydroxyl group, an amino group, a guanidino group, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group or a hydroxyl group in an amino acid or non-amino acid side chain. In some cases, it is directly bonded to the ⁇ -carbon of amino acids or non-amino acids.
  • the substituent R may be a modified side chain of an amino acid or a non-amino acid.
  • the substituent R is not particularly limited.
  • R formula 2; _ (CH 2 ) n — P— Q (where n is an integer from 1 to: L 0, P is one C ⁇ —, one S0 2 —, one CO — O—, one O— C ⁇ one, one O—, one CO— S—, -S—CO—, _CS— S—, one S—CS—, — S—, one CO—NH—, one NH — C 0_, one CO— NH— CO_, one CS— NH— CS—, one S—S—, — CS one NH— or one NH— CS—, and Q is a hydrogen atom, or Preferably .
  • R is an amino acid or non-amino acid When directly bonded to the ⁇ -carbon of the amino acid, a bond selected from the group consisting of esters, ethers, thioesters, thioethers, amides and carbamides, with or without an alkyl group having 1 or more carbon atoms.
  • alkyl group refers to a cyclic, linear or branched alkyl group, such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a cyclopropyl group, a butyl group, a sec-butyl group, Isobutyl group, tert-butyl group, cyclobutyl group, pentyl group, isopentyl group, tert-pentyl group, neopentyl group, cyclopentyl group, hexyl group, isohexyl group, cyclohexyl group, 3,3-dimethylbutyl group , Heptyl, 1-propylbutyl, octyl, nonyl, decyl, pentadecyl, dodecyl, tridecyl, tetradecyl, pentyldecyl, etc.,
  • aryl group is, for example, phenyl, 1- or 2-naphthyl, biphenyl, 1_, 2- or 9-anthryl, 1_, 2-, 3-, 4-mono or 9-phenanthryl, acenaphthyl, anthracenyl, azulenyl and the like.
  • the number of carbon atoms is 6-20, more preferably 6-15.
  • aralkyl group includes a benzyl group, a p-methoxybenzyl group, a 3,4-dimethoxybenzyl group, an o-nitrobenzyl group, and a p-nitrobenzene And a benzhydryl group and a trityl group.
  • the number of carbon atoms is preferably 7 to 16.
  • alkyl group, aryl group and aralkyl group may have substituents ordinarily used in the technical field at chemically acceptable positions and numbers.
  • Modified amino acid or non-amino acid includes amino acid or non-amino acid A as serine, threonine, cysteine, homocystine, lysine, ordinin, glutamic acid, 2-aminoadipic acid, diaminoacetic acid, or 2-aminomalon.
  • the amino acid A when the amino acid A is serine, threonine, tyrosine or oxyproline, the amino acid has a hydroxyl group in the side chain. Or esterified serine, threonine, tyrosine or oxyproline.
  • amino acid A is a cysteine
  • the amino acid has a mercapto group in the side chain, and thus the ⁇ modified amino acid '' is a cysteine in which the side chain mercapto group is thioetherified, thioesterified, or disulfided.
  • amino acid A is lysine, arginine or 2,3-diaminopropionic acid
  • the amino acid in the side chain has an amino group.
  • Examples include carbamidated, thiocarbamidated or alkylated lysine, arginine or 2,3-diaminopropionic acid.
  • amino acid A is histidine, tributophan, proline or oxyproline, does it have an amino group in the side chain?
  • the "modified amino acids” include histidine, tributofan, proline or oxyproline in which the side chain amino group is amidated, thioamidated, iminoesterified, iminothioetherified, or alkylated.
  • the “modified amino acid or non-amino acid” is preferably serine or threonine in which the hydroxyl group in the side chain is esterified.
  • substituent R when the side chain of the amino acid or the non-amino acid A contains 10 H, 1 SH, —NH— or _NH 2 , a group formed by acylating these is more preferable.
  • the acyl group for this purpose include groups formed by removing hydroxyl groups from organic sulfonic acids, organic sulfonic acids, and organic phosphoric acid compounds. More specifically, examples of the organic carboxylic acid include fatty acids, and the number of carbon atoms is preferably 2 to 35, more preferably 6 to 18, and most preferably 8 to 16.
  • Such fatty acids include, for example, saturated fatty acids such as caprylic acid, capric acid, lauric acid, butyric acid, caproic acid, pendecylic acid, palmitic acid, decanoic acid, nonadecanoic acid, behenic acid, montanic acid, or lacenoic acid.
  • saturated fatty acids such as caprylic acid, capric acid, lauric acid, butyric acid, caproic acid, pendecylic acid, palmitic acid, decanoic acid, nonadecanoic acid, behenic acid, montanic acid, or lacenoic acid.
  • unsaturated fatty acids such as acrylic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, and aatearolic acid can be mentioned.
  • the unsaturated fatty acid may be a monoene or a polyene.
  • preferable examples include octanoic acid (preferably, caprylic acid), decanoic acid (preferably, capric acid), dodecanoic acid (preferably, lauric acid), and the like.
  • the organic sulfonic acid or organic phosphoric acid compound also preferably has 2 to 35 carbon atoms.
  • Modified peptide or protein refers to a peptide or protein that contains one or more amino acids or non-amino acids modified as described above in the peptide or protein.
  • “Darelin” is an endogenous growth hormone secretagogue (GH S), which has the activity of increasing intracellular calcium ion concentration and the activity of inducing the secretion of growth hormone.
  • GH S growth hormone secretagogue
  • human, rat, mouse, pig, two Grelin from chicken, eel, linseed, linseed, hidge, potato, rainbow trout or dog is preferred.
  • Ghrelin has the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 21 and has a hydrogen atom in the side chain hydroxyl group of serine or threonine at the 3-position, and n-octanol Group, butanol group, hexanoyl group, protein substituted with any of decanoyl group or dodecanoyl group, or the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 21.
  • 1 to 10 preferably 1 to several amino acids have an amino acid sequence in which substitution, addition or deletion is performed, and a hydrogen atom in the side chain hydroxyl group of the 3-position serine or threonine Is substituted with any of n-butanol, butanoyl, hexanoyl, decanoyl, and dodecanoyl groups, and has the activity of increasing intracellular calcium ion concentration. Protein having the like.
  • the “darelin derivative” a peptide having an activity of increasing intracellular calcium ion concentration and containing one or more modified amino acids or non-amino acids, or a pharmaceutically acceptable salt thereof is used. Is mentioned. Above all, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the amino acid sequence from the amino terminal to the fourth position, preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the fifth position, preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the sixth position, preferably Is at least the amino acid sequence from the amino terminal to the seventh position, preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the eighth position, preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the ninth position, preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the tenth position.
  • the amino acid sequence from the amino terminal to the fourth position preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the fifth position, preferably the amino acid sequence from the amino terminal to the sixth position
  • an amino acid sequence from the amino terminus to the seventh preferably an amino acid sequence from the amino terminus to the eighth, preferably A portion other than the amino acid sequence from the amino terminus to the ninth amino acid sequence, preferably the amino acid sequence from the amino terminus to the 10th amino acid sequence, at least one amino acid, preferably about 1 to 10 amino acids, and more preferably 1 to 10 amino acids;
  • Peptides containing an amino acid sequence in which amino acids are deleted, substituted and / or added, or a pharmaceutically acceptable salt thereof are preferred.
  • the second or third amino acid from the amino terminal more preferably the third amino acid from the amino terminal is modified. Particularly preferred are amino
  • amino acid sequence of SEQ ID NOs: 1 to 21, or at least one amino acid of the amino acid sequence, preferably about 1 to 10 amino acids, more preferably 1 to several amino acids are deleted, substituted
  • the amino acid sequence from the amino terminal to the fourth amino acid sequence is represented by Formula 6; A-B-C-D- (where A represents an amino acid, a non-amino acid, or no, and B represents Indicates that the amino acid is a non-amino acid or no amino acid, provided that the molecular chain length of A + B is equivalent to that of a dipeptide, C or D may be the same or different, and (a) a modified amino acid, (b) ) An amino acid having a hydrophobic side chain, or (c) an amino acid having a basic side chain.) Or a pharmaceutically acceptable salt thereof, which is substituted by the peptide fragment represented by No.
  • amino acid having a hydrophobic side chain examples include leucine, valine, norguchi isine, homoleucine, homoisoleucine, naphthylalanine, tributofan, fenylalanine, cyclohexylalanine and the like, or a V-methyl amino acid or D_ body and the like.
  • amino acid having a basic side chain examples include lysine, arginine, histidine, and D-forms thereof.
  • C is more preferably an amino acid modified as described above
  • D is more preferably an amino acid having a hydrophobic side chain.
  • B 1 or C 1 is an amino acid at least one of which has been modified or a non-amino acid, if only one of the B 1 or C 1 is an amino acid or non-amino acids undergo modifications, other ⁇ amino acids or non-amino acid not undergo modification, preferably or natural amino acids thereof D- a body.
  • the molecular chain length of Ai + B 1 is a dipeptide equivalent length.
  • D 1 the table in shown.
  • the Amino acid having a Amino acid or basic side chains that have a hydrophobic side chain Peptide fragments obtained may be used.
  • B 2 —C 2 _D 2 (wherein B 2 is a molecular chain of a dipeptide equivalent length) Is a non-amino acid having a long length, C 2 is a modified amino acid or a non-amino acid, and D 2 is an amino acid having a hydrophobic side chain or an amino acid having a basic side chain.)
  • B 2 is a molecular chain of a dipeptide equivalent length
  • C 2 is a modified amino acid or a non-amino acid
  • D 2 is an amino acid having a hydrophobic side chain or an amino acid having a basic side chain.
  • the “dalelin derivative” may be modified at the amino terminus or the olepoxyl terminus of the peptide of the above-described embodiment or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, it is preferable that a basic amino acid is further bound to the lipoxyl terminus of the peptide of the above-described embodiment or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the amino terminal of the peptide or the pharmaceutically acceptable salt thereof according to the above-described embodiment is modified with a saturated or unsaturated alkyl group or an acyl group having 1 or more carbon atoms, and Z or the lipoxyl at the lipoxyl terminus.
  • the group OH is OZ or NR 2 R 3 (Z is a pharmaceutically acceptable cation or a lower branched or unbranched alkyl group; 2 and 13 are a hydrogen atom and a lower (d 6 ) which are the same or different from each other selected from the group consisting of branched or straight chain alkyl groups). Further, these modifications may be combined.
  • the method for producing a modified peptide or protein according to the present invention comprises: (a) producing a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids using a weakly acidic release resin; A protected peptide fragment containing no amino acid or non-amino acid is prepared separately from the protected peptide fragment of (a), and the protected peptide fragment prepared in (a) and (b) is condensed. It is characterized by three steps.
  • the modified peptide or protein obtained by the production method of the present invention, or a fragment thereof is a peptide
  • it can be synthesized by a peptide synthesis method known per se.
  • the modified peptide or protein, or a fragment thereof also includes a compound in which these reactive functional groups are protected by a protecting group.
  • a peptide synthesis method for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, by condensing a partial peptide or amino acid capable of constituting a crudely modified peptide or protein or a fragment thereof with the remaining portion, and removing the protective group when the product has a protective group, the desired peptide is obtained. Can be manufactured.
  • Known methods for condensation and elimination of protecting groups include, for example, the methods described in the following documents 1-3.
  • the step of producing a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids is characterized by using solid phase chemical synthesis to extend a peptide chain on a weakly acidic release resin. More specifically, using a weakly acidic release resin, An amino acid or non-amino acid appropriately protected with a reactive functional group having a possibility of causing an undesired side reaction in the production of the peptide fragment in the amino group and the side chain can be obtained by publicly known per se according to the sequence of the peptide fragment of interest. Condensation on a weakly acidic release resin in accordance with various condensation methods, and separation of the produced protective peptide fragment from the weakly acidic release resin without removing the protective group, to obtain the desired protected peptide fragment Can be.
  • the above weakly acidic release resin is a resin used for peptide synthesis, and is a resin capable of releasing a peptide fragment prepared on the resin from the resin under weakly acidic conditions.
  • the weakly acidic release resin includes one or more of the group consisting of carboxylic acids such as acetic acid, trifluoroacetic acid or formic acid, and fluorinated alcohols such as trifluoroethanol or hexafluoroisopropanol.
  • a resin that can release a peptide fragment prepared on a resin from the resin in a solution containing the compound is preferable.
  • the weakly acidic release resin examples include trityl resins such as 2-chlorotrityl resin, trityl resin, 4-methyltrityl resin, 4-methoxytrityl resin, Rink Amide Bar 1 os resin, and Sieber. Amide resin and the like.
  • the protective group for the amino group and the reactive functional group in the side chain (hereinafter, simply referred to as a side chain functional group) is not particularly limited.
  • «-amino protecting groups include t-butoxycarbonyl (Boc), trichloroethyloxycarbonyl, t-amyloxycarbonyl, 9_fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), It may have a substituent such as an alkoxycarbonyl which may have a substituent such as methylsulfonylethoxycarbonyl, trichloroethoxycarbonyl, 2- (trimethylsilyl) ethoxycarbonyl or pyridine-1-methoxycarbonyl.
  • Cycloalkyloxycarbonyl group benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxybenzyloxycarbonyl (p MZ), p-chlorobenzyloxycarbonyl (Cl-Z), p-bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z), p-nitrobenzyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, 2 —Phenylisopropyloxypropyl, p-methylphenylisopropyloxypropyl, ⁇ -biphenylisopropyloxycarbonyl, 3,5-dimethoxy-, 1,1-dimethylpentyloxycarbonyl
  • aralkyloxycarbonyl group benzyl (Bz1), benzhydryl, trityl and the like, optionally substituted aralkyl group; trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, Benzenesulfonyl,
  • Hydroxyl groups such as serine can be protected by, for example, lower (C ⁇ 6 ) alkanoyl groups such as acetyl group, aroyl groups such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group, and groups derived from carbonic acid such as ethoxyl ponyl group. .
  • the guanidino groups of arginine include, for example, nitro group, Z group, Ts group, p-methoxybenzenesulfonyl group (Mbs), 4-methoxy-2,6-dimethylbenzenesulfonyl group (Mds;), 4-methoxy- 2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl group (Mtr), mesitylene-2-sulfonyl group (Mts), 2,3,4,5,6-pentamethylbenzenesulfonyl group (Pme;), 2,4 1,6-trimethoxybenzenesulfonyl group (M tb), 2,2,5,7,8-pentamethylchroman 1-6-sulfonyl group (Pmc), 2,2,4,6,7-pentamethyl- It can be protected with dihydrobenzofuran-5-sulfonyl group (Pb f).
  • Mbs p-methoxybenzenesulfon
  • the mercapto group of cysteine is, for example, trityl group, acetoamide It can be protected by a methyl (Acm) group, tert-butyl group, benzyl group, p-methylbenzyl group, p-methoxybenzyl group, 3-nitro-2-pyridinesulfenyl group, butylthio group and the like.
  • Examples of the protecting group for the imidazolyl group of histidine include a Boc group, a trityl (Trt) group, a Ts group, a 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulfonyl group, and a 2,4-dinitrophenol (DNP) group.
  • Boc group a Boc group
  • Trt trityl
  • Ts a Ts group
  • DNP 2,4-dinitrophenol
  • Benzyloxymethyl (Bom) group, t-butoxymethyl (Bum) group, Fmoc group and the like are used.
  • the indolyl groups of tributofan include, for example, formyl group, Z group, 2,4-dichlorobenzenebenzyloxycarbonyl group, trichloroethyloxycarbonyl group, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl. Group, 2,4,6-trimethoxybenzenesulfonyl group and the like.
  • Condensation reactions by solid phase synthesis include the sequential extension method in which amino acids are successively condensed one by one into the weakly acidic release resin described above, the fragment condensation method in which peptide fragments composed of two or more amino acids are condensed, and the fragment condensation method in which these are used. Any of a combination of methods may be used.
  • the peptide fragment composed of two or more amino acids can be produced from each amino acid by a conventional liquid phase method, solid phase method, or the like.
  • an amino acid or a non-amino acid (hereinafter, abbreviated as a protected amino acid unless otherwise noted) having an ⁇ -amino group and a side chain functional group appropriately protected as described above is activated to activate a weakly acidic release resin.
  • Condensed protected amino acids the solvent used for activating the protected amino acid or condensing with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the peptide condensation reaction.
  • acid amides such as ⁇ , ⁇ -dimethylformamide, ⁇ , ⁇ -dimethylacetamide, ⁇ -methylpyrrolidone; halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, chloroform, etc .; trifluoroethanol, phenol Alcohols such as dimethyl sulfoxide; pyridine, dioxane, tetra Ethers such as hydrofuran; nitriles such as acetonitrile and propionitrile; esters such as methyl acetate and ethyl acetate; and appropriate mixtures thereof are used.
  • the reaction temperature may be the same as the reaction temperature of the peptide bond formation reaction, and is usually selected appropriately from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated protected amino acid is usually used in a 1- to 4-fold excess.
  • the condensation reaction of each protected amino acid can be performed by a conventional method, for example, a C-terminal activation method, a coupling method using a coupling reagent, or the like.
  • the C-terminal activation method includes an active ester method, a symmetric anhydride method, and the like.
  • the active ester used in the active ester method include alkyl esters such as cyanomethyl ester; thiophenyl ester, p-nitrothiophenyl ester, p-methanesulfonylphenyl ester, and p-ditrophenyl ester.
  • Phenyl esters such as 1,2-dinitrophenyl ester, 2,4,6-trichlorophenyl ester and pentachlorophenyl ester; 1-hydroxysuccinimide (H ⁇ Su), N-hydroxyphthalic imide ester, N— Dicarboxylic acid imide esters such as hydroxy-5-norporene-1,2,3-dicarboxylic acid imide (HO NB); hydroxylamine derivatives such as quinoline ester 8-hydroxy, N-hydroxypiperidine ester and 2-hydroxypyridine ester Is mentioned.
  • Coupling methods using the above coupling reagent include, for example, dicyclohexyl carbodiimide (DCC), water-soluble carbodiimide (WSC) and the like.
  • Carpoimide method used DC C-additive method; carbonyldiimidazole (CD I) method; Woodward reactant (N-ethyl-5-phenylisoxazolidium-3'-sulfonate) )
  • isoxosazolium salts such as N-ethyl-2'-hydroxybenzisoxazolidium trifluoroboroborate, 1-ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroxyquinoline (EEDQ), 1-ethoxycarpo 2-Ru 2-isobutoxy-1,2-dihydroxyquinoline (I IDQ), benzotriazo-l-i-l-uquioxytris (dimethylamino) -phosphonium hexafluorophosphate (BOP), O-benzotriazo
  • the water-soluble carbodiimide is a salt such as a hydrochloride.
  • the DCC-additive method includes, for example, the DCC-HOSu method, the DCC-HOBt (euhydroxybenzotriazole) method, the DCC-H ⁇ NB method, the DCC-2-hydroxyimino 2-cyano method. Ethyl acetate method, WSC-HOSu method, WSC-H ⁇ Bt method, etc. are included.
  • Preferred condensation reactions include the carbodiimide method, the active ester method, and the DCC additive method. More preferred condensation reactions include methods for suppressing racemization, such as the active ester method, the DCC-additive method (eg, DC C—HO Bt method, DCC—HO Su method, WSC—HO Su method, WSC—H ⁇ Bt method) and the like.
  • the desired protected peptide fragment contains one or more modified amino acids or non-amino acids. Methods for inserting a modified amino acid or non-amino acid into a peptide chain include the following two methods.
  • a desired amino acid or non-amino acid side chain is specifically modified in advance, and the amino acid or non-amino acid (hereinafter, referred to as a residue-specific modified amino acid or non-amino acid).
  • a residue-specific modified amino acid or non-amino acid Is introduced at the stage of peptide chain elongation.
  • amino acids or non-amino acids (including compounds in which a protective group is attached to these a-amino groups) modified in a residue-specific manner can be synthesized by a synthesis method known per se. Examples include an esterification reaction, an amidation reaction, an etherification reaction, an acylation reaction, an alkylation reaction, and the like, which can be performed by a method well known to those skilled in the art.
  • this can be introduced into a peptide chain by any of the above-mentioned condensation reactions.
  • the elimination of the protected peptide fragment from the weakly acidic elimination resin is appropriately selected from the conditions described below, but it is preferable that the amino acid or non-amino acid side chain of the target residue is specifically modified. It is preferable to appropriately select from the conditions under which the substituent R is not eliminated.
  • residue-specific modification As a second method, a peptide fragment having a desired sequence consisting of amino acids and / or non-amino acids is prepared by the above method, and then the side chain of the desired amino acid or non-amino acid is specifically modified (hereinafter, referred to as “ This is referred to as residue-specific modification.)
  • the method for the residue-specific modification is not particularly limited, and a known method may be used. Examples include an esterification reaction, an amidation reaction, an etherification reaction, an acylation reaction, an alkylation reaction, and the like, which can be performed by a method well known to those skilled in the art.
  • phosphorylation modification Tet rahedron Letter, 41, p.
  • This method is divided into the following two methods. That is, when the functional group of the side chain of the amino acid or non-amino acid to be subjected to residue-specific modification is protected by a protecting group, the protected peptide fragment is simultaneously released from the resin when the protecting group is deprotected. In the case of the deprotection of such a protecting group, the case where the protected peptide fragment is not released from the resin is roughly classified. In the former case, after protecting the C-terminal lipoxyl group with a protecting group, residue-specific modification is performed by a synthesis method known per se, and then the C-terminal lipoxyl group is appropriately selected from the methods described below. The target peptide fragment can be obtained by deprotection. In the latter case, the residue can be subjected to residue-specific modification on the resin by a method known per se, and then the desired peptide fragment can be appropriately selected from the methods described below and released from the resin. Good.
  • a peptide fragment having a desired sequence consisting of amino acids or amino acids and non-amino acids is prepared by the above-described method, and then, the reactive functional group of the amino acid or non-amino acid side chain to be subjected to residue-specific modification is added.
  • the protecting group is deprotected, residue-specific modification is performed on the resin by a known synthesis method, and then the protected peptide fragment from the weakly acidic release resin described below is used. Most preferred is the method of elimination and, if desired, deprotection of each protecting group.
  • the protecting group of the amino acid or non-amino acid to be subjected to residue-specific modification is not particularly limited as long as the protected peptide fragment does not release from the resin when the protecting group is deprotected.
  • a silyl group such as a t-butyldimethylsilyl group and a t-butyldiphenylsilyl group.
  • the protective group is a silyl group
  • TBAF ammonium fluoride
  • the protecting group is selected as described above, when the N-terminal amino group is deprotected for the condensation of peptide elongation, the protecting group of the side chain functional group of each protected amino acid and the protected peptide fragment from the weakly acidic release resin Are not eliminated, and when the weak acidic elimination resin is eliminated from the obtained peptide-resin conjugate, the protecting group of the side chain functional group of each amino acid residue is not eliminated. Moreover, due to this, the generation of by-products can be suppressed.
  • a peptide fragment in which a side chain functional group is protected by a protecting group can be obtained with high purity and high yield in a simple manner. Since the side chain functional groups of the peptide fragment are protected, it is not necessary to introduce a new protecting group, and in the next step, it is used as a raw material for producing a target modified peptide or protein by a liquid phase method. It can be suitably used. Finally, the produced protective peptide fragment is released from the weakly acidic release resin. At this time, the reaction is carried out under a weak acidic condition in which the protecting group in the protected peptide fragment, that is, the protecting group of the side chain functional group of the amino acid or non-amino acid is not deprotected.
  • Weakly acidic conditions include, for example, carboxylic acids such as acetic acid, trifluoroacetic acid or formic acid, and Z or trifluoroethanol or hexafluoroisopropanol.
  • a weakly acidic release resin is suspended in a solution containing fluorinated alcohols such as toluene.
  • a desired time preferably about 5 minutes to 4 hours, more preferably about 10 minutes to 2 hours.
  • the produced protective peptide fragment is removed from the weakly acidic release resin.
  • the protected peptide fragment is released from the weakly acidic release resin without inserting a modified amino acid or non-amino acid into the peptide chain, and then a desired amino acid residue is subjected to residue-specific modification.
  • a peptide fragment containing a modified amino acid or non-amino acid can be produced.
  • the method of residue-specific modification is the same as described above.
  • the production method described above can be applied without particular limitation as long as it is a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids. Among them, it is preferable to use the above method for producing a protected peptide fragment containing one or more modified amino acids or non-amino acids represented by the following formula 9 or a salt thereof.
  • Equation 9 (R1) n -G 1 yS er (XI) —A (R) one Phe—L e uS er (X2) —Pro — OR2
  • a (R) — is an amino acid or a non-amino compound modified as described above.
  • A is serine, threonine, cystine, homocystin, lysine, ordinine, glutamic acid, Aminoadipic acid, diaminoacetic acid, 2-aminomalonic acid, aspartic acid, tyrosine, and asparagine are preferred, and R is a modifying group such as an acyl group, a sugar, a phosphate group, a sulfate group, an alkyl group, an aralkyl group, or an aryl group.
  • R is bonded to the reactive substituent on the side chain of A via an ester bond, an ether bond, a thioether bond, a disulfide bond, an amide bond, a glycosidic bond, or an N-daricosidic bond. .
  • R 1 is t-butoxycarbonyl (Boc), trichloroethyloxyl Substituents such as ponyl, t-amyloxycarbonyl, 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc), methylsulfonylethoxycarbonyl, trichloromouth ethoxycarbonyl, 2- (trimethylsilyl) ethoxycarbonyl or pyridin-4-methoxycarbonyl
  • An alkoxycarbonyl group which may have a substituent; a cycloalkyloxycarbonyl group which may have a substituent such as cyclobeptoxycarbonyl or cyclohexyloxycarbonyl; benzyloxycarbonyl (Z), p-methoxybenzyloxycarbonyl (pMZ), p-chlorobenzyloxycarbonyl (Cl-Z), p_bromobenzyloxycarbonyl (Br-Z),
  • Aralkyloxycarbonyl group aralkyl group which may have a substituent such as benzyl ( ⁇ 1), benzhydryl, and trityl; trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, benzenesulfonyl, and ⁇ -toluenesulfonyl ( T s), ⁇ -ditrophenylsulfenyl, 2,4-dinitrophenylsulfenyl, 3-nitro-2-pyridylsulfenyl and the like, optionally substituted acyl group; dithiasuccinoyl, 2 —Ditrophenylthio, diphenylphosphinyl, diphenylphosphinochioil, dimethylphosphinochioil Shows,
  • ⁇ 1 or 2
  • X 1 and X 2 each represent a protecting group for a hydroxyl group on the side chain of serine, and include a lower (C ⁇ 6 ) alkanol group such as an acetyl group; an arylo group such as a benzoyl group; A group derived from the group or a group suitable for etherification in which the above-mentioned substituent R is bonded to the side chain via an ether bond, for example, t-butyl group, benzyl group, and tert-butyl group; Represents a silyl group such as a trahydropyranyl group, a trityl group, or a t-butyldimethylsilyl group;
  • R 2 represents a protecting group or no protecting group, and when a protecting group is present, an alkyl ester group (for example, methyl ester, ethyl ester, propyl ester, butyl ester, t-butyl ester, cyclopentyl ester, cyclo Linear, branched or cyclic alkyl ester groups such as hexyl ester, cycloheptyl ester, cyclooctyl ester and 2-adamantyl ester), aralkyl ester group (eg, benzyl ester, Nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl ester group), phenacyl ester group, benzyloxycalponyl hydrazide group, t-butoxycarbonyl hydrazide group, and trityl hydrazide group. )
  • an alkyl ester group for example
  • 1 ⁇ 1 is preferably an 80 group, a Z group, a p MZ group or an F moc group
  • the protecting group represented by X 1 and X 2 is preferably a t-butyl group or a 34-butyl group. And a t-butyl group.
  • R 2 is preferably a hydrogen or a thioester group.
  • the production method described above comprises the production of dallelin, preferably a darrellin of a human, rat, mouse, bush, chick, eel, oak, poma, hidge, potato, rainbow trout or dog, or a darrellin derivative It is suitably used when performing. It is also suitably used for producing a modified amino acid or non-amino acid-containing portion of dallelin or dallelin derivative.
  • Table 1 shows the structure of darelin in each of the organisms.
  • the amino acid sequence according to any one of SEQ ID NOs: 1 to 21 has at least the first to fourth amino acid sequence at the N-terminal, and preferably N-terminal first to fifth amino acid sequence
  • the hydroxyl group of the side chain of the third serine or threonine from the N-terminus is acylated, preferably saturated or (C) hydroxyl, amino, guanidino, imidazolyl, indolyl in the side chain of the amino acid, which is acylated by an unsaturated alkyl group having 2 to 35, preferably 6 to 18 carbon atoms; And at least one reactive functional group selected from the group consisting of a mercapto group and a mercapto group, which has a possibility of causing an undesired side reaction in the preparation of peptide fragments, preferably a hydroxyl group and an amino group.
  • the production method described above is useful for the production of a peptide fragment protected by DNA.
  • a protected peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid is produced separately from the protected peptide fragment containing the modified amino acid or non-amino acid.
  • the peptide or protein-free peptide fragment containing no amino acid or non-amino acid, which has been modified by acylation, glycation, phosphorylation, etc. can be produced by a gene recombination method or an enzymatic method known per se. it can.
  • a gene recombination method or an enzymatic method known per se it can.
  • cells transformed by an expression vector having a nucleotide sequence encoding a peptide having the amino acid sequence of the peptide fragment hereinafter, referred to as a target peptide
  • a target peptide cells transformed by an expression vector having a nucleotide sequence encoding a peptide having the amino acid sequence of the peptide fragment
  • the method includes a step of collecting, and a step of protecting, with a protecting group, a functional group having a possibility of causing an undesired side reaction among the side chain functional groups of the target peptide obtained in the above step.
  • the expression vector can be prepared according to a conventional method in the art. When constructing an expression vector, other elements necessary for high expression of the target peptide, such as a promoter, a motif, a splice site, etc., may be appropriately used, which are already known in the conventional method. it can.
  • the host cell transformed with the expression vector is not particularly limited. P leaked 590
  • base sequences that encode the target peptide from prokaryotic or eukaryotic cells already used in conventional methods for example, microbial cells such as Escherichia coli, yeast or animal cells, etc., are preferred. Those which can be expressed in the cell can be appropriately selected and used.
  • the protection of the side chain functional group of the target peptide may be performed in the same manner as described above.
  • the modified amino acid- or non-amino acid-free peptide fragment is obtained by the following steps: (1); (a) a base encoding a fusion protein in which a protected peptide is added to a target peptide via a linker sequence if desired; Culturing cells transformed by an expression vector having a sequence, and collecting the fusion protein from the culture;
  • Step (2) a step of cleaving and separating a protected peptide and, if desired, a linker sequence and a target peptide from the fusion protein obtained in Step (1), and further purifying, if desired;
  • the protective peptide is used for the purpose of inhibiting the target peptide from being degraded by an enzyme in a host cell, and is not particularly limited as long as the target can be achieved.
  • 3-galactosidase derived from Escherichia coli is used.
  • a fragment having the amino acid sequence according to (1) can be used.
  • the amino acid sequence related to the enzyme is known to those skilled in the art, and the peptide fragment derived from i3-galactosidase is widely used by those skilled in the art as a protective peptide in the fusion protein method.
  • the linker sequence may be used in the case where cleavage and separation of the protected peptide and the target peptide are not successful, for example, when there is no enzyme suitable for cleavage and separation of the protected peptide and the target peptide in step (2).
  • Array inserted between It is. Accordingly, in step (2), the sequence can be appropriately selected so that cleavage and separation of the linker sequence and the target peptide are successful.
  • Cleavage and separation of the protective peptide and, if desired, the linker sequence from the target peptide can be performed by enzymatic or Z- and chemical methods.
  • methionine when methionine is not included in the amino acid sequence of the target peptide, methionine can be introduced into the end of the cleavage site region adjacent to the target peptide, and the cleavage at the cleavage site region can be performed chemically by bromocyan treatment. it can.
  • a cleavage site region that can be specifically recognized as a substrate by the enzyme used for the cleavage treatment may be set, and examples thereof include arginine-arginine, lysine-lysine, and arginine.
  • the peptide bond at the center of the basic amino acid pair of lysine and lysine-arginine, or the peptide bond at the center of the amino acid pair of arginine-methionine, arginine-alanine or arginine-valine is added to E. coli Omp T protease (Sugimura, K and Nishihara, TJ Bacteriol.
  • Lys-C endoprotease Arg-C (Nature, Vol.285, p456-461, 1980), and the C-terminal side of the Lys-Arg, Arg-Arg or Pro-Arg sequence is Saccharomyces C. of Lys in Saccharomyces cerevisiae Kex2 protease and its derivatives (Biochem. Biophys. Res. Counun., Vol. 144, p807-814, 1987, JP-A-1-199578, JP-A-10-229884). Lysl endopeptidase or endopeptidase Lys-C (Japanese Patent Laid-Open No. 61-275222) is used at the terminal side, and the C-terminal side of Asp or Glu is Irokokkasu-Aureusu
  • Vapor Asp-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys sequence SEQ ID NO: 25
  • Lys-Arg, Arg-Arg with lysosomal fin (lysostaphin) at the C-terminal side of poly-Gy with entero-peptidase Biotechnology, Vol. 6, pl204-1210, 1988
  • there is a method of cutting the C-terminal side of Pro-Arg or the like with Kluverromyces lactls Japanese Patent Laid-Open No. 1-124390).
  • the protection of the expression vector, the host cell, and the side chain functional group of the target peptide in the present method is the same as the above method.
  • a peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid is a peptide fragment containing no modified amino acid or non-amino acid of a ghrelin or dalelin derivative (hereinafter, referred to as a darellin fragment (unmodified component)).
  • a darellin fragment unmodified component
  • OmpT protease or a derivative thereof, and KeX2 protea A ghrelin fragment (unmodified component) can also be produced by using a two-step enzymatic method using enzyme or its derivative.
  • the endogenous ⁇ mp T protease of Escherichia coli, which is a host can be used, so that it is not necessary to separately prepare an enzyme.
  • the derivative of OmpT protease or KeX2 protease is not particularly limited as long as it has the same activity as OmpT protease or KeX2 protease.
  • OmpT protease derivatives include enzymes belonging to the immediate tin family, such as OmpP protease of Escherichia coli and pgtE protease of Salmorela, and partial peptides containing the active site of OmpT protease, such as KeX2 protease.
  • the derivative include derivatives described in JP-A-10-229884 and enzymes belonging to one of the Kex2 families represented by Furin and PC 1/3.
  • the pH of the solution used for purification or storage is adjusted to 418 to prevent the removal of the protecting group. Then, by suppressing the elimination of the protecting group, a highly purified modified peptide or protein with a high recovery rate can be prepared.
  • the solution used for the purification or storage is preferably an aqueous solution. Specific examples include water, preferably ultrafiltration water, and sodium acetate solution. As can be seen from Example 15 in which the stability of the protected human darelin (8-28) fragment in aqueous solution was examined, the stability of the peptide fragment protected by the BOC group differs depending on the aqueous solution state.
  • the pH of the solution during the storage of the purified solution was particularly preferably 418 to 188. It is preferable to set in between.
  • the peptide fragment is condensed and, if desired, the protecting group of the amino acid or non-amino acid side chain functional group is deprotected.
  • the condensation reaction is preferably performed by a liquid phase method.
  • each amino acid or non-amino acid side chain functional group of the peptide fragment is usually protected with a protecting group.
  • the protecting group include the protecting groups exemplified above as the protecting group for each functional group.
  • Preferred protective groups include those capable of removing the protective groups of the protective peptide fragments (a) and (b) under similar elimination conditions. In this case, it is not necessary to consider the elimination conditions for the weakly acidic release resin because the weakly acidic release resin has already been released. A protecting group which is eliminated under conditions for eliminating an amino group is more preferred.
  • the reagents and conditions used for the condensation are appropriately selected from those described in the amino acid condensation reaction described above.
  • the method is selected from methods in which impurities such as racemized isomers of peptides or proteins are less likely to be produced as by-products.
  • the reagent (condensing agent) used for the condensation for example, 2- (1-hydrobenzotriazolyl-1-yl) -11,1,3,3-tetramethylperonium hexafluophosphate (HBTU), 21- (1-hydrobenzotriazole-1-yl) -1,1,3,3-tetramethylperonium tetrafluoroborate (TBTU), diphenylphosphoryl azide (DPPA) ), Diphenylphosphorocyanidate (DEPC), diisopropylpropylcarpoimide (DIPC), dicyclohexylcarpoimide (DCC), or 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carpoimide (EDO etc.)
  • the condensing agent include diisopropyl carbodiimide (DIPC), dicyclohexyl carbodiimide (DCC), and 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropy
  • the condensation of the peptide fragment using the condensing agent is performed by using 1-hydroxybenzotriazole (HOBt), 1-hydroxysuccinimide (HOSu), or 3,4-dihydro-3-hydroxy-4_oxo-one. More preferably, the reaction is performed in the presence of benzotriazine (HOOB t).
  • HOOB t benzotriazine
  • the protecting group on the side chain of the amino acid or non-amino acid can be appropriately deprotected.
  • the reagents and conditions for deprotection are preferably selected from methods in which impurities such as racemized isomers of peptides or proteins are less likely to be produced as by-products.
  • the conditions for removing each protecting group may be in accordance with, for example, a known method described in the aforementioned “Basic and Experimental Peptide Synthesis”.
  • Methods for removing protecting groups include strong acids, weak acids, bases, reducing reagents (catalytic reduction, metals, thiols, etc.), oxidizing reagents, nucleophilic reagents, electrophilic reagents, ions, electrons, light, solvents, enzymes, etc. There are methods to use each of them, and the selection of the protecting group can be performed in consideration of the elimination conditions of these elimination methods.
  • a method for removing the protecting group for example, trifluoroacetic acid, acetic acid, hydrogen fluoride, methanesulfonic acid, trifluoromethanesulfonic acid, or a mixed solution thereof (preferably, trifluoroacetic acid, acetic acid, etc.)
  • Treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc .; catalytic reduction in a stream of hydrogen in the presence of a catalyst such as Pd-carbon; treatment with zinc dust in acetic acid (Z n / A c OH); or tetrabutylammonium fluoride (TBAF) treatment is also used.
  • the above-mentioned deprotection reaction is generally carried out at a temperature of about 40 ° C or lower, but preferably at a temperature of about 25 ° C or lower to effectively suppress the by-product of the racemized isomer of the protected peptide fragment. can do.
  • the reaction time of the above deprotection reaction is usually about 0.5 to about 5 hours.
  • acid treatment for example, water, triisopropylsilane (TIPS), phenol, anisol, thioanisole, metacresol, paracresol, dimethylsulfide, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • a cation scavenger such as phenol.
  • the 4-dinitrophenyl group is removed by thiophenol treatment, and the formyl group used as the indole protecting group of tryptophan is treated by acid treatment in the presence of 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanediol and the like. In addition to deprotection, it is also removed by alkaline treatment with dilute sodium hydroxide solution, dilute ammonia and the like.
  • the reaction product obtained by the present invention can be used for, for example, a conventional separation method such as gel filtration, ion exchange chromatography, partition chromatography, high performance liquid chromatography, reversed phase high performance liquid chromatography, and electrophoresis. It can be isolated and purified by a purification means.
  • the product to be purified is not limited to the final modified peptide or protein, but may be a protected peptide fragment containing at least one modified amino acid or non-amino acid, or a modified amino acid or non-amino acid. Needless to say, a protected peptide fragment that does not contain, or a product obtained as an intermediate in these production steps can be appropriately purified by the above-described separation and purification means.
  • a modified peptide or protein can be produced.
  • the production method according to the present invention can be applied without particular limitation as long as it is a modified peptide or protein.
  • preferably used for producing darrellin preferably darrellin of human, rat, mouse, pig, chick, eel, pear, poma, hidge, potato, rainbow trout, or dog, or dallerin derivative
  • darrellin preferably darrellin of human, rat, mouse, pig, chick, eel, pear, poma, hidge, potato, rainbow trout, or dog, or dallerin derivative
  • the structure of darelin in each of the organisms is described in Table 1.
  • the ghrelin or the ghrelin derivative obtained by the present invention has extremely low quality of impurities (especially, the amount of impurities (particularly, the racemized isomer of the darelin or the darelin derivative)) as compared with that obtained by the prior art. It is ghrelin or a ghrelin derivative. As a result, sufficient purification can be performed effectively by a simpler purification method, shortening the working time, and producing darrellin or darrellin in high yield. Body can be manufactured. From this point as well, the production method of the present invention is extremely advantageous as an industrial production method of ghrelin or a ghrelin derivative, as compared with the prior art.
  • the above-mentioned “high-quality darelin or darelin derivative” has, for example, a content of total related substances of about 1% or less (preferably about 0.9% or less, more preferably about 0.8% or less). Or less, more preferably about 0.7% or less).
  • the total analog refers to the sum of all impurities detected by high performance liquid chromatography or the like, and the impurities include racemized isomers of dalelin or ghrelin derivatives, highly polar analogs, and other impurities. Is mentioned.
  • Step 1 (a) in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 21, having at least the first to fourth amino acid sequences at the N-terminal, preferably (B) the amino acid sequence consisting of the first to seventh amino acids at the N-terminus in the amino acid sequence, and (b) the hydroxyl group in the side chain of the third serine or threonine from the N-terminus is (C) a hydroxyl group, an amino group, or a guanidino group in a side chain of an amino acid, preferably a saturated or unsaturated alkyl group having 2 to 35, preferably 6 to 18 carbon atoms.
  • Preparation of one or more peptide fragments selected from the group consisting of, an imidazolyl group, an indolyl group, a mercapto group and a carboxyl group, and condensation of the peptide fragments in the following step (4) A step of producing, on a weakly acidic release resin, a peptide fragment having a reactive functional group, preferably a hydroxyl group and an amino group protected by a protecting group, having the possibility of causing an undesired side reaction in the reaction. ,
  • Step (2) removing the protecting group from the peptide fragment under weakly acidic conditions. Step of releasing the peptide fragment from the weakly acidic release resin
  • Step (3) an amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 21; an amino acid sequence other than the amino acid sequence of the peptide fragment prepared in Steps (1) and (2), preferably the amino acid sequence A hydroxyl group in the amino acid sequence from the 6th to 28th amino acid at the N-terminus or the 8th to 28th amino acid sequence at the N-terminus in the amino acid sequence, and in an amino acid or non-amino acid side chain
  • a reactive functional group preferably a hydroxyl group and an amino group, having the possibility of causing Process for manufacturing the Rupepuchido fragment,
  • Step (4) a step of condensing the peptide fragment produced in the step (3) with the peptide fragment produced in the step (2), and then, if necessary, deprotecting the protective group of the reactive functional group
  • the modified peptide or protein obtained by the method according to the present invention can be obtained in the form of a free peptide or a salt thereof depending on the reaction conditions.
  • the free peptide and its salt can be converted into each other by a conventional method.
  • the free peptide is converted into a pharmacologically acceptable salt, it may be reacted with, for example, an inorganic acid or an organic acid exemplified below.
  • an inorganic acid an organic acid exemplified below.
  • an inorganic acid inorganic acid
  • the peptide or protein has an acidic group such as a carboxyl group
  • inorganic bases also referred to as inorganic free bases
  • organic bases also referred to as organic free bases
  • organic free bases eg, triethylamine And organic amines such as arginine, etc.
  • the peptide or protein may form a metal complex compound (eg, a copper complex, a zinc complex, etc.).
  • the modified peptide or protein produced by the method according to the present invention can be used for various uses.
  • the above purified darelin or darelin derivative has low toxicity, and is used in mammals (eg, humans, monkeys, dogs, rats, mice) for treating eating disorders, growth hormone secretagogues, and heart diseases.
  • mammals eg, humans, monkeys, dogs, rats, mice
  • a therapeutic agent for gastric function disorders an intestinal mucosal protective agent or a preventive agent for small intestinal mucosal damage during parenteral nutrition
  • a therapeutic agent for osteoporosis an agent for reducing cachexia due to chronic diseases, a therapeutic agent for pulmonary dysfunction, etc.
  • the above purified darrellin or ghrelin derivative can be orally administered as tablets, capsules, elixirs, sustained-release preparations, etc., coated with sugar as required, or water or other pharmaceutically acceptable.
  • injectables such as sterile solutions or suspensions with liquids, sustained-release preparations, etc .; Nasal preparations such as solutions and suspensions; Pulmonary preparations such as sprays or inhalants; Suppositories It can be administered parenterally.
  • the above preparation can be produced by mixing in the form.
  • DCC dicyclohexylcarbodiimide, HOBt; 1-hydroxybezotriazole, HOOBt; 3-hydroxy-1,3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-ben Zotriazine (3-hydroxy-3,4-dihydro-4-0X0-1,2,3-benzotriazine), TFA; trifluoroacetic acid,
  • Equipment 1 AKTA explorer 1 OS (Chromatography system manufactured by Amersham Pharmacia) Column SP- sepharose big beads (XK26 / 30) (Resin manufactured by Amersham Pharmacia)
  • YMC-0DS 120 s50 HR26 / 15
  • YMC resin 26mm inside diameter x 15mm length
  • Vydac C4 (HR10 / 30) (Vydac)
  • Source 30RPC (HR10 / 30) 23 mL (Amersham-Pharmacia resin) Inner diameter 10 orchids X length 30 mm
  • YMC-0DS AM particle size 20 m, inner diameter 21.5 thigh x 300 mm, manufactured by YMC
  • Example 8 [Lys .6, i9,2o, 24 (Boc )] human-derived Darerin (8-28) in production scale and summary
  • Escherichia coli was transformed with the expression vector shown in Example 1 to express the fusion protein having the amino acid sequence shown in Example 1. Culture was performed by high-density culture using a 2 L culture tank, and the inclusion bodies were collected. Purification was started using half of the recovered inclusion bodies.
  • hGhrel was synthesized by the synthetic method using fully synthesized oligo DNA (Pharmacia Biotech). In (8-28) DNA fragment was obtained.
  • Fig. 1A shows the synthetic oligo DNA and amino acid sequences used for annealing.
  • This DNA fragment was introduced into a plasmid pGP117ompPR (International Publication No. WO00 / 52193) into which a fusion protein gene of Escherichia coli j3-galactosidase derivative and human Glucagonlike peptide-1 was introduced, so that pGP117ompPR was restricted.
  • a DNA fragment which had been treated with the enzymes Sail and SadI and from which the human Glucagonlike peptide-1 gene had been deleted was prepared by agar gel electrophoresis. Further, after the treatment with Al lipophosphatase, the hGhrelin (8-28) derivative gene fragment previously treated with SacII and T4 DNA kinase was ligated with T4 DNA ligase.
  • the ligated plasmid was transformed into Escherichia coli DH5 ⁇ strain to obtain plasmid pl178-28oPR.
  • This plasmid is a fusion protein in which the amino acid sequence of hGhrelin (8-28) and the / 3 galactosidase partial fragment 117 amino acid residues are linked by a linker sequence having an amino acid sequence of EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 26). Is expressed.
  • the plasmid pi178-28oPR was designated as type II, and K0D plus polymerase (Toyobo) was used as an enzyme.
  • the amplified fragment was cut out from the electrophoresis gel by performing PCR using 59. This was further treated with restriction enzymes SalI and BamHI. P1178-28oPR was also treated with restriction enzymes Sall and BamHI and purified, and this fragment was ligated with T4 DNA ligase. The ligated plasmid was transformed into Escherichia coli DH5 strain to obtain plasmid ⁇ 1178-28oRR.
  • the plasmid has an amino acid sequence of hGhrelin (8-28) and a linker sequence having the amino acid sequence EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSP SRHRR (SEQ ID NO: 27) with a partial fragment of 3-galactosidase 117 amino acid residue To express the fused protein.
  • the expressed fusion protein is shown in Figure 1B below.
  • Example 2 Expression of recombinant hGhrelin (8_28) fusion protein in Escherichia coli and recovery of inclusion bodies 2L culture in 3L culture tank using Escherichia coli transformed with plasmid P1178-280RR prepared in Example 1 into Escherichia coli W3110 Was carried out.
  • This expression plasmid is a pBR322-derived plasmid and its expression is induced by the lac promoter. It also carries a tetracycline resistance gene as a drug resistance gene.
  • the preculture was performed by shaking with LB broth at 32 for 14 hours. For the main culture, a medium having the following composition was used.
  • Medium composition is 4g / L yeast extract, 4g / LK 2 HP04, 4g / L KH 2 P0 4, 2.7g / L Na 2 HP0 4, 0.2g / LNH 4 CK 1.2g / L (NH 4) 2 S0 4, 2g / L MgS0 4 ⁇ 7 0 , 40mg / LCaCl 2, 40 mg / L FeS0 4 ⁇ 7H 2 0 10 mg / L MnS0 4 ⁇ n 0, 10 mg / L A1C1 3 ⁇ 6H 2 0, 4 mg / L CoCl 2 ⁇ 63 ⁇ 40, 2 mg / L ZnS0 ⁇ 7 0, 2 mg / L Na 2 Mo0 4 ⁇ 2H 2 0, 1 mg / L CuCl 2 ⁇ 23 ⁇ 40, is 0.5 mg / L 3 ⁇ 4B0 4.
  • glucose was first added to the medium at 1%, and culture was started at 37 ° C. After the glucose was depleted, glycerol was added for culturing. Thereafter, the culture broth was disrupted by a pressurized cell disrupter (Mantongolin), and about 80 g of inclusion bodies were recovered by a centrifuge. Further, the inclusion bodies were resuspended in 2 L of deionized water, and then collected by a centrifuge to wash the inclusion bodies. Finally, 200 mL of an inclusion body suspension having a OD 6M value of 530 was obtained. The following examples were performed using 100 mL, which is half the volume of the inclusion body suspension.
  • Mantongolin pressurized cell disrupter
  • Example 3 hGhrel in (8-28) under the following reaction conditions such that the value of the endogenous OmpT OD 66q inclusion body suspension obtained in Pro Example 2 protease fusion protein is 100.0 After dilution with the additive and deionized water, the OmpT reaction was performed under the following reaction conditions.
  • the supernatant of the T-protease reaction solution immediately obtained in Example 3 was purified by cation chromatography.
  • Sample loading Load sample, equilibrate, and wash with washing solution until UV is reduced (approximately 4 column polymes)
  • the purified [RHHGSGSPSRHRR] -hGhre 1 in (8-28) is subjected to an addition reaction of a Boc group, and the terminal amino group and the amino group on the side chain of the Lys residue contained in the sequence are protected by the Boc group.
  • Process recovery rate 116% (The reason that the process recovery rate is greater than 100% is probably because the addition of the Boc group increased the absorbance at HPLC and increased the apparent recovery rate.)
  • the mass spectrometer used was a Finnigan MAT mass spectrometer (TSQ-700).
  • the measured value by ESI-MS was 4578 (theoretical value; 4577).
  • the peptide solution obtained in Example 6 was prepared under the following conditions, and a Kex2 reaction was performed. That is, the 0DS eluate was diluted to 8 mg / iL with ultrafiltration water, and 1M Tris-HC1 pH 8.3 was added to 50 mM. Added by Uni further comprising a 0.25M CaCl 2 to 5 mM, after 30 ° C lOmin plain-incubated Ichito, Kex2 protease (JP-A-10-229884) solution (lxlO 7 unit / mL) and so as to be 2.5xl0 4 unit In addition to the above, while stirring with a stirrer, the mixture was reacted in a thermostat at 30 ° C. for 120 minutes.
  • Example 9 [Lys 16 ' 19 ' 20 '24 (Boc)] Purification and recovery rate of hGhrelin (8-28) form, purity table [Lys I 9 ' M (Boc) shown in Examples 3 to 8 below Table 2 shows a list of production yields of hGhrelin (8-28).
  • Pre 8-28 * means [Awake GSGSPSRHRR] -hGhrelin (8-28).
  • Boc- Pre8-28 ** is [fT - Boc, Lys 16 ' 19' 2. '24 (Boc)]-[RHHGSGSPSRHRR]-means hGhrel in (8-28).
  • Boc — 8-28 *** means [Lys 16 ' 19 ' 20 '24 (Boc)] hGhrel in (8-28).
  • a prolyl-2-chlorotrityl resin (Nova Biochem, 1.39 g, 1.0 thigh 01) was placed in a reaction vessel equipped with a glass filter, and the introduction of Fmoc-amino acid with HBTU and the removal of Fmoc with piperidine were repeated in sequence, leaving the N-terminal residue.
  • Boc-Gly By introducing Boc-Gly into the group, Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Hie-Leu-Ser (tBu) -Pro-2_mouth trityl resin was constructed.
  • the resulting protected peptide resin was treated with a 0.1 M TBAF / DMF solution (50 mL) for 30 minutes.
  • the peptide resin was collected by filtration, washed several times with DMF (30 mL), and then washed with isopropyl alcohol and then with DCM (30 mL). Next, the obtained de-TBDMS peptide resin was swollen in NMP (5 mL), and in the presence of DMAP (374 mg, 3.1 bandol), octanoic acid (588 mg, 4.1 mmol), EDCHC1 (848 ig, 4.4 mmol) and allowed to react for 16 hours. The resin was collected by filtration, washed successively with NMP, isopropyl alcohol and DCM, and dried under reduced pressure to obtain a protected peptide resin having a 3-position serine side chain octanoylated.
  • a prolyl-2-chlorotrityl resin (Nova Biochem, 1.95 g, l.Ommol) was placed in a reaction vessel with a glass filter, and Fmoc-amino acids were sequentially analyzed by HBTU.
  • Example 11 0.70 g of the white powdery crude peptide obtained in Example 11 was dissolved in 7 mg / mL with 5% acetic acid, and purified under the following conditions.
  • Fig. 4 shows the results of HPLC analysis of the purified hGhrelin.
  • the following Examples 13 to 15 relate to optimization of the conditions shown in Examples 1 to 12 above. Therefore, it goes without saying that the present invention is not limited to the following conditions.
  • Example 13 Difference in Ke x 2 Cleavage Efficiency Due to Differences in Fusion Protein Sequence Kex 2 cleavage efficiency varies greatly depending on the recognition sequence of its substrate. The cleavage efficiency of the Kex2 cleavage sequence KR (10) »RR (5)» TR (1.2)> PR (1.0) [0
  • FIG. 5 shows pi 17s 8-28oPR and pi 178-28 oRR created in Example 1 in FIG.
  • the prepared peptide was treated with Kex2 protease using the method described in Example 7.
  • the HPLC analysis profile 60 minutes after the start of the reaction is shown in FIG.
  • a plasmid expressing the fusion protein shown in FIG. 7 was prepared.
  • ⁇ 8-28oPR was made into type III and was prepared by PCR from different primers.
  • ⁇ 8-28oRR a mutant was constructed for the purpose of lowering the isoelectric point of the protein.
  • the result of the culture was determined based on the final turbidity and the turbidity at the time of cell disruption. It was determined that the higher the ratio of the turbidity of the cells and the turbidity before and after the disruption of the cells, the higher the productivity of the inclusion body. The results are shown in graphs A and B in Fig. 8.
  • Example 15 Stability of 5 [Lys 16 ' 19 ' 2 (4 (Boc)] hGhrelin (8-28)
  • the parameters that affect the decomposition may be the pH during storage and the storage temperature. Therefore, the stability under the following conditions was analyzed by HH and evaluated.
  • Fig. 9 and Fig. 10 show four graphs summarized for each storage temperature. It was found that the degradation products increased with lower pH (below pH 3) and higher temperature. It was also found that if the pH was 4 or more, it was stable even at 42 ° C. Therefore, it became clear that controlling the pH was important for suppressing the generation of the decomposition products.
  • Example 16 Production of hGhrelin (1-28) (Method 2)
  • plasmid pll7-8-28ok was obtained.
  • the difference between plasmid P1178-280PR and plasmid ⁇ -8-28ok created in Example 1 is that the former linker sequence is EPHHffiffGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 26), while the latter linker sequence is RRHHGSGSPSRHPR (SEQ ID NO: 35). ).
  • the hGhrelin (8_28) fusion protein expression plasmid pll7-8-28ok was transformed into Escherichia coli W3110 to obtain a transformant.
  • This strain glucose ⁇ Pi glycerol were cultured in a medium of 20 L of a carbon source, final 0D 66. A culture with a value of 54 was obtained.
  • the inclusion bodies were recovered by centrifugation, resuspended in deionized water, and centrifuged to wash the inclusion bodies.
  • the inclusion body pellet (wet weight: about 170 g) obtained by centrifugation was suspended in a small amount of deionized water to obtain 550 mL of an inclusion body concentrated solution having a 0D 660 value of 826.
  • the above purified eluate (660 mL) was divided into two equal parts, and YMC-0DS AM (particle size: 20 m, manufactured by YMC) equilibrated with 2% acetonitrile and 0.1 FA. Loaded once. After sufficiently washing with the equilibration solution, elution was performed with an eluate [50% acetonitrile, 0.0953 ⁇ 4TFA]. After collecting the eluted peak, acetonitrile contained in the eluate was removed by a single evaporator to obtain 220 mL of a solution containing 720 mg of RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin (8-28). The conditions for high performance liquid chromatography used in (3) and (4) are shown below.
  • Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys 16 ' 19' 2 (4 (Boc)] hGhrelin (8- 28) The following chromatographic system was used to monitor this reaction: Column: YMC-C8, detector: Hitachi High Performance Liquid Chromatography (D7000), flow rate: 1 mL / min, elution: buffer A [1.0% ⁇ Se Tonitoriru, 0.1% TFA] buffer one to 100% B [60.0% Asetonitoriru, 0.095% TFA] linear gradient of 100% 20 min.
  • hG relin (8-28) was purified on a reverse phase column.
  • YMC-ODS AM equilibrated with 2% acetonitrile, 0.1% TFA, 10 mM sodium acetate, PH4.5 (particle size 20 zm, manufactured by T0S0H) 21.5 mmID x 300 column loaded with the above Boc derivative (about 500 mg) did.
  • elution was performed with the eluate [70 acetonitrile, 0.095% TFA, 10 mM sodium acetate, H4.5].
  • Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys 16 ⁇ 19 - 20 ⁇ 2 (Boc)] hGhrelin (8-28) (420 mg) after preparative elution peak containing the minutes to remove Asetonitoriru at E Bapore one coater.
  • a 250 mM calcium chloride solution and 1 M Tris-HCl pH 8. were added to a final concentration of 5 mM and 50 mM, respectively.
  • Kex2 protease Ichize a (JP-10- 229884) solution (lxlO 7 uni t / mL) so as to 3xl0 4 uni t / mL, 30 .
  • the eluted fraction was eluted at a flow rate of 10 mL / min.
  • the target fraction was collected and freeze-dried to obtain 210 mg of the target compound.
  • the product was analyzed by analytical HPLC. As a result, the purity of the target compound on the chart was 83%, and the retention time was the same as that of the chemically synthesized product. Further, when the semi-synthetic product and the whole synthetic product were subjected to coinjection, the peaks on the chromatograph coincided.
  • ESI-MS 3371 (theoretical value 3370.86), amino acid composition ratio after 6N hydrolyzed hydrolyzate Ala; 1.01 (1), Arg; 2.97 (3), Glx; 5.95 (6), Gly; 1.02 (1), His; 1.00 (1), Leu; 2 (2), Lys; 4.01 (4), Phe; 1.00 (1), Pro; 4.01 (4), Ser; 3.60 (4), Val; 1.00 (1) ( Theoretical value), Camobilization activity 1.3 nM (ref.1.5 nM)
  • Example 16 According to the method of Example 16 (8-1), the optimum conditions for the removal reaction of the 3-position serine TBDMS group and the Octanoylich reaction were examined. Using an automatic peptide synthesizer (433A, manufactured by Applied Biosystems Japan) on the prolyl-2-chlorotrityl resin, the introduction of Fmoc-amino acids by HBTU and the removal of Fmoc by piperidine were sequentially repeated. By introducing Boc-Gly to the terminal residue, Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2-cloth trityl resin was constructed.
  • Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro-2-cloth trityl resin was constructed.
  • the resin was divided into 0.05 parts (about 150 mg), and octanoylation was performed under the conditions shown in Tables 3 and 4. Conditions such as washing of the resin and cutting of the peptide from the resin were performed in the same manner as in Example 16 (8-1).
  • the reaction to remove the TBDMS group is preferably performed using a 0.1 M TBAF solution for 30 minutes to 1 hour, and the octanoylation reaction is performed using 4 equivalents of octanoic acid, 4. It was found that it was preferable to react for 8 to 16 hours.
  • the removal rate of the TBDMS group can be calculated from the octanoyl form of the peptide resin treated with TBAF followed by deprotection, and the desoctanoyl form showing no removal of TBDMS. It was determined by the ratio of The reaction was carried out for 24 hours using 4 equivalents of octanoic acid, 4.4 equivalents of EDC, and 1 equivalent of DMAP.
  • the purity and ratio of the target compound were calculated by analytical HPLC.

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Description

修飾ペプチドの製造方法
技術分野
本発明は、 修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、 及び前記製造方法に好適 明
に用いられる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されて 細
いるべプチド断片の製造方法に関する。
背景技術
ォ一ファンレセプ夕一の一つである成長ホルモン分泌促進因子レセプタ一
( GH S - R) に対する内因性成長ホルモン分泌促進因子 （GH S ) が 1999 年ラット胃から精製単離され、ダレリンと命名された（Koj imaら、 Nature, 402 巻， p. 656-660、 1999年）。 本ペプチドは、 セリン残基の水酸基が脂肪酸でァ シル化された特徴的な構造を有することで知られる。 さらにラット以外の脊 椎動物、 例えばヒト、 マウス、 ブタ、 ニヮトリ、 ゥナギ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッ ジ、 力エル、 ニジマス又はィヌからも 3位のセリン残基又はスレオニン残基 が脂肪酸修飾部位を有するグレリンが単離、 あるいは c D NAから推定され た （第 1表）。 例えばヒトダレリンはアミノ酸 2 8個からなり、 3位のセリン 側鎖が脂肪酸 （n—オクタン酸） でァシル化されている。 この新規ペプチド は強力な成長ホルモン分泌促進活性を有し、 3位セリン又はスレオニンの脂 肪酸修飾はその活性発現に必須であることが分かっている（Koj imaら、 Nature, 402巻， p. 656- 660、 1999年）。 また、 胃から分泌されたダレリンは、 血中ホ ルモンとして成長ホルモン分泌の調節に機能することが解明され、 グレリン の生理的役割と医薬品への適用に関して興味がもたれている。 第 1表
ヒ卜 (Human) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR
GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR ラッ卜 (Rat) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR
GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKAQ KESKKPPAKLQPR マウス (Mouse) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR ブタ (Porc ine; ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKVQQRKESKKPAAKLKPR ゥシ (Bovine) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKLQRKEAKKPSGRLKPR ヒッジ (Ovine) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKLQRKEPKKPSGRLKPR ィヌ (Canine) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR ゥナギ (Eel) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPSQRPQGKDKKPPRV- , ニジマス (Trout) ： GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPSQKPQVRQG GKPPRV- ,
GSS (11- -oc i anoy 1) FLSPSQKPQGKGKPPRV- , 二ヮ卜リ (Chicken; ： GSS (n- -oc t anoy 1 ) FLSPTYKNI QQQKGTRKPTAR
GSS (n- -oc tanoyD FL SPTYKN I QQQKDTRKP TAR
GSS (n- -oc t anoy 1) FLSPTYKNI QQQKDTRKPTARLH ゥシガエル (Bul l frog) : GLT 〔n- -oc t anoy 1) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNM
GLT (n- -decanoyD FLSPADMQKIAERQSQNKLRHG M
GLT (n- -oc t anoy 1) FLSPADMQKIAERQSQNKLRHGNMN テラピア (Ti l api a) ： GSS (n- -oc t anoyD FLSPS QKPQNKVKS SR I -NH2 ナマズ (Cat f i sh) ： GSS (n- -oc t anoy 1 ) FLSPTQKPQNRGDRKPPRV- ,
GSS (n- -oc t anoyl) FLSPTQKPQNRGDRKPPRVG
ゥマ (Equine) ： GSS (n- -bu t anoy 1 ) FLSPEHHKVQHRKESKKPPAKLKPR ォクタノィル基 (C8)以外にも、 ブタノィル基 （C4)、 へキサノィル基 (C6)、 デ カノィル基（C10)、 ドデカノィル基（C12)修飾体が存在する。 また、 不飽和脂 肪酸による修飾体も存在する。 ニンのように、 ペプチド又は蛋白質の中には、 ァ ミノ酸配列中のある特異的なアミノ酸残基がァシル化ゃスルホン化、 糖付加 又はリン酸化等の修飾を受けることにより、 その生理学的役割を発現するも のがある。 これらの修飾は生体内における精緻な酵素系により施されると考 えられており、 修飾を有するペプチド又は蛋白質を、 高品質かつ効率的に大 量に製造する一般的な方法はこれまで報告されていない。 たとえば、 グレリ ンは長鎖脂肪酸により特定のアミノ酸側鎖が修飾を受けることで成長ホルモ ン分泌促進作用を示すことから、 脂肪酸修飾は必須の構造的要素であるが、 生体がどのような酵素系を駆使して、 脂肪酸を特定のアミノ酸側鎖の水酸基 上にエステル結合させるのか、 あるいは脂肪酸が伸長していくのか現時点で は明らかにされていない。 特にダレリンは、 アミノ酸側鎖の水酸基が脂肪酸 で修飾された構造を有することが初めて明らかにされた生理活性べプチドで あるために、 本ペプチドが摂食障害治療薬、 成長ホルモン分泌促進薬等の医 薬品として期待される有用なペプチド性ホルモンであるにもかかわらず、 特 定の水酸基含有アミノ酸側鎖に脂肪酸修飾を有するぺプチドの製造は一般化 されていない、 即ち、 大量に製造するのに有利な工業的製造方法が確立され ていないのが現状である。
現在、 インスリン、 成長ホルモン、 カルシトニン、 心房性ナトリウム利尿 ペプチド、 L H— RH誘導体、 副腎皮質刺激ホルモン誘導体など種々のぺプ チド又は蛋白質製剤が医薬品として使用されている。 これらのペプチド又は 蛋白質の製造方法としては、 化学合成法、 酵素法、 遺伝子組換法による製造 方法が知られている。 いずれの方法を選ぶかは適宜選択されるが、 一般的に 残基数が少ない場合には化学合成法が、 残基数が多い場合は酵素法もしくは 遺伝子組換法が選択される。
例えば、 化学合成法は最も確実にダレリン等の修飾をもつ生理活性べプチ ド又は蛋白質を製造できる方法である。 修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法 として、 化学合成法による製造方法はすでに数多く報告されている。 グレリ ンの例では、 Bednarek ¾ (J. Med. Chem. , 43巻、 . 4370-4376, 2000年）、 Mat sumo to ら (Bi ochem. Bi ophys. Res. Com un. , 284卷、 p. 655 - 659、 2001 年） により報告されている。 また、 国際公開番号： TO 01/07475に、 ダレリン 及びダレリン誘導体であるペプチド又はその塩の製造方法として、 化学合成 法による方法が記載されている。 しかし、 化学合成法による製造方法におい ては、 一定の品質 （純度） を保って合成できるペプチドの鎖長に通常制限が ある。 液相化学合成法は高純度のぺプチドを合成することが可能であるが、 長鎖ペプチドの合成には、 溶解度、 長い製造工程、 反応処理に要する特別の 技術等の点で一般的でない。 即ち、 効率的に大量に製造することは、 液相化 学合成法を用いる製造方法では難しい。 一方、 樹脂上でペプチド鎖を延長す る固相化学合成は、 工程が単純化されており、 大量生産にはより有利である が、 本法も一定品質の目的物を得るにはおのずと構築可能な鎖長に制限があ る。 加えて、 試薬を過剰に用いるために、 特に長鎖ペプチドの製造において 経済性で劣るという問題もある。
また、 酵素法のようにペプチド断片を酵素的に結合させていく方法は、 ァ ミノ酸側鎖の保護を最小に出来る点で優れているが、 本法においては、 通常 加水分解の逆反応を用いるために、 原理的に条件の設定が難しく実用的では ない。
一方、 遺伝子組換法による生理活性ペプチド又は蛋白質の製造は、 大量生 産に適した有用な製造方法である。 しかしながら、 生産性の高い大腸菌等の 原核生物を用いる方法は、 原核生物が翻訳後修飾の系をもたないため、 修飾 部位をもつペプチドの直接的な製造は難しい。 酵母や各種卵細胞のような真 核細胞を用いる遺伝子組換法においては、 糖修飾、 ァシル化、 スルホン化、 リン酸化等の修飾は可能であるが、 例えば脂肪酸に関して、 一定長の脂肪酸 のみを導入することは難しい。 単離されたダレリンのなかには、 オクタン酸 ( C 8 ) だけではなく、 ブタン酸 （C 4 )、 デカン酸 （C 1 0 )、 あるいはこ れらの不飽和脂肪酸を有するものが発見されていることからも、 特定鎖長の 脂肪酸の導入を制御することの困難さは明らかである。 加えて、 真核細胞に よる生産性は一般的に低いことからも、 修飾の系を有する酵母や各種卵細胞 の生産系はグレリン等の修飾を受けたペプチド又は蛋白質の大量生産という 観点からは、 多くの改良の余地がある。
以上述べてきたように、 修飾べプチド又は蛋白質を合成する方法として化 学合成法があり、 すでに種々の報告がなされているが、 大量に製造するため には、 収率、 コストの点において改良の余地がある。 大腸菌等の原核細胞を 用いた遺伝子組換法で直接的に翻訳修飾を受けたぺプチド又は蛋白質を製造 するのは難しい。 また、 酵母等の真核細胞を用いた遺伝子組換法による製造 も、 単一性又は生産性の点で問題があり、 これを克服するために改良の余地 がある。 加水分解反応の逆反応を使う酵素法は、 各々の縮合条件の設定が困 難であり、 大量生産に有利な方法であるとはいえない。
このように、 従来知られている、 化学合成法、 酵素法、 遺伝子組換法を単 独で適用して、 糖修飾、 ァシル化、 スルホン化、 リン酸化等の修飾を有する ペプチド又は蛋白質を、 品質と量的な要素を満足させ、 かつ効率よく製造す ることについては、 更なる改良の余地があった。 そこで、 上記方法の長所を生かし、 欠点を補う方法の一つに、 化学合成法 と遺伝子組換法を組み合わせた半合成法が挙げられる。 本製造方法の重要な 点は、 縮合に適した形態のペプチド断片を効率よく製造することである。 修 飾されたアミノ酸残基を有するペプチド断片 （以下、 修飾成分ともいう。） 及 び修飾されたアミノ酸残基を有さないペプチド断片 （以下、 非修飾成分とも いう。） は、 N末端側又は C末端側の何れであっても良く、 また、 修飾成分が 複数であっても良い。 適宜、 目的とするペプチド又は蛋白質に合わせて、 製 造方法を設計することができる。一例として、修飾成分が N末端側に存在し、 当該ペプチド断片 （修飾成分) と縮合される他方のペプチド断片が非修飾成 分である場合について詳細に言及する。
近年注目されている、 Nat ive chemi cal l igat i on法 (Dawsonら、 Sc i ence, 266巻、 . 776-779、 1994年） は、 Ligat i on部位に Cys残基が残る欠点があつ たが、最近、本方法を改良したチォエステル法が提案された。例えば、 Kawakami らにより、 チォエステルを用いた方法でリン酸化ペプチドの合成が報告され ている (Tet rahedron Let ter, 41巻， p. 2625-2628, 2000年）。
前記チォエステル法の具体例を以下に示す。 リン酸化された p21Max蛋白質 の合成例において（Kawakamiら、 Tetrahedron Let t .， 39巻、 p. 790卜 7904, 1998 年）、 固相化学合成法でリン酸修飾部位を含むペプチド断片 （修飾成分） （13 mer) をチォエステルとして製造する。 一方、 非修飾成分の N末端にーァミノ 酸残基を付加させた配列を有するペプチド断片を大腸菌で製造し、 このもの に 2価銅又はニッケルイオン存在下で、 ダリオキシル酸を作用させ、 N末端 に付加したアミノ酸残基を《ケトァシル基に変換したのち、 側鎖アミノ基を Boc基で保護する。次に、フエ二レンジァミンで αケトァシル基を除去するこ とで、 Ν末端アミノ酸残基のアミノ基のみが遊離したペプチド断片 （非修飾 成分） を調製している。 最後にこれらの両断片を銀塩、 過剰の HOOBt等の活 性エステル化剤を加え縮合している。
上記方法においても、 まだ下記のような課題が残る。 ペプチド断片 （修飾 成分） の製造において、 そのチォエステルの安定性上の課題があり、 収率は 1 1 %と記載されている。 また、 ペプチド断片 （非修飾成分） の製造におい て、 αケトァシル基を用いる本方法は N末端アミノ基を遊離させる化学的方 法として選択性が高いが、 ひケトァシル基が不安定であること、 及び本基の 脱離にフエ二レンジァミン等の変異原性物質を使用する点で、 医薬品用の生 理活性ペプチド又は蛋白質の製造の場合、 安全性の課題が残る。 また、 両断 片の縮合反応において、 銀塩、 過剰の HOOBt等の活性エステル化剤を使用し ており、 ラセミ化、 毒性、 コストの点でも課題がある。
化学合成法と遺伝子組換法を組み合わせた半合成法は、 国際公開番号： TO 01/07475にも、 ダレリン及びダレリン誘導体であるペプチド又はその塩の製 造方法として記載されている。 より具体的には、 化学合成法により調製した ラットダレリン（卜 5)と遺伝子組換法により調製したラットダレリン（6-28) を縮合してラットグレリン（1-28)を調製する方法が記載されている。しかし、 かかる方法においてもまた下記のような課題を有することから、 効率のよい 工業的製造に有利な製造方法とするには、 多くの改良の余地がある。 即ち、 TFA によりペプチド鎖を樹脂から離脱させてラットダレリン（1-5)を得る際 に、 同時に Boc基、 卜 Bu基が除去されるため、 再度 Boc基を N末端に導入す る必要があること、 また、 Ser 側鎖が無保護になるために、 ラットダレリン (6 - 28)との縮合に、 強い活性化剤を使用できない等の点において、 生産性を 向上させる余地がある。 また、 保護ラットダレリン（1-5)及び保護ラットダレ リン（6- 28)を縮合する過程において、 ァシルペプチド断片部の C末端アミノ 酸がラセミ化しうるため、 これを抑制するために改良の余地があった。 なお、 ダレリン （m— n ) は、 グレリンの N末端から m番目〜 n番目のアミノ酸配 列を有するペプチドを意味する。 以下も同様である。
また、 保護ペプチド断片 （非修飾成分） を調製する際にもいくつかの課題 がある。 国際公開番号： W0 01/07475に記載された保護ラットグレリン（6-28) の製法は、 基本的には 2段階酵素処理法 （国際公開番号 TO99/38984) を採用 しており、 そのプロセッシング酵素として組換え V8 プロテアーゼ誘導体 (rV8D5) (特開平 9-47291) と Kex2プロテアーゼ （特開平 10— 229884) の 2 種類の酵素を使用している。 しかしながら保護ラットグレリン（6- 28)を含む 融合たんぱく質を発現するプラスミド （pG97s rGR) は大腸菌 -ガラクトシ ダーゼ誘導体とヒト副甲状腺ホルモン（1-34)との融合蛋白質を高発現するプ ラスミド （特開平 9— 296000)を元に構築したものなので、 保護ペプチド断片 (非修飾成分） を調製する際には、 そのアミノ酸配列に適したリンカ一配列 を選択する必要が生じる場合がある。
さらに、 保護ラットダレリン（6-28)は水溶液中で保護基が離脱するという 現象があり、 精製における回収率は 1 0 %と非常に低くダレリンを大量に安 定供給するという側面においてなお課題を有する。
以上、 化学合成法と遺伝子組換法の組み合わせによっても、 効率がよく、 かつ得られた製品を医薬品として使用できるような安全性の高い、 修飾され た生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法の実現には更なる課題がある。 発明の開示
本発明は、 修飾をうけたべプチド又は蛋白質の簡便で効率のよい工業的製 造方法を提供することを目的とするものである。 具体的には、 本発明は、 修 飾部位を含むペプチド断片 （修飾成分） を化学合成法により製造し、 修飾部 位を含まないペプチド断片 （非修飾成分） を遺伝子組換法により製造し、 両 者を縮合することで効率よく高品質の修飾をうけた生理活性べプチド又は蛋 白質を製造する方法を提供することを目的とするものである。 前述したよう に、 これらの各ペプチド断片 （修飾成分及び非修飾成分） は、 N末端側断片 又は C末端側断片の何れであっても良く、 また、 修飾成分が複数であっても 良い。 適宜、 目的とするペプチド又は蛋白質に合わせて、 製造方法を設計す ることができる。 また、 本発明は、 縮合反応に適した、 保護されているぺプ チド断片 （修飾成分） を修飾部位の構造に影響を与えない温和な条件で製造 する方法、 及び保護されているペプチド断片 （非修飾成分） との縮合に適し た保護されているペプチド断片 （修飾成分） の製造方法を提供することを目 的とするものである。 さらに、 本発明は、 得られた製品を医薬品として使用 できるような安全性の高い、 修飾された生理活性ペプチド又は蛋白質の製造 方法を提供することを目的とするものである。 特に本発明は、 ダレリン及び ダレリン誘導体の簡便で効率のよい工業的製造方法を提供することを目的と するものである。
本発明者らは、 ダレリンを素材に、 ダレリン又はその誘導体の中のァシル 基により修飾されたアミノ酸を含むペプチド断片 （修飾成分） の合成方法の 改良を行い、 ペプチド断片 （修飾成分） の製造工程を大幅に簡略化かつ効率 化しうる方法を確立した。 即ち、 2—クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹 脂上でペプチド断片 （修飾成分） のペプチド主鎖配列を構築し、 引き続き、 残基選択的修飾を施した後、 酢酸等の弱酸処理により固相樹脂上から保護修 飾ペプチドを切り出すことができることを見出した。 従来の技術として、 ト リフルォロ酢酸等で樹脂から切り出せる Wang樹脂等の樹脂上で修飾基を導入 した後、 樹脂からの切り出しとともに保護基も脱離させる方法が知られてい た。 しかし、 本法においては、 切り出したペプチド断片 （修飾成分） は、 引 き続き、もう一方のペプチド断片（非修飾成分） との縮合反応に供するため、 樹脂からの切り出しとともに保護基も脱離されてしまう従来技術による方法 は、 再び保護基を導入しなければならないため、 簡便で効率的な製造という 観点からは好ましくない。 そこで、 本発明者らは、 ペプチド断片 （修飾成分） の樹脂からの切り出しには、アミノ酸側鎖の保護基を脱離させにくい弱酸（希 釈された強酸を含む） を用い、 一方で、 ペプチドが樹脂から離脱せずに、 樹 脂上で特定のアミノ酸側鎖の保護基を脱離させて残基選択的修飾を施す方法 として、 フッ化四級アンモニゥムを用いる方法が有効であることを鋭意検討 の結果、 見出した。 従来、 フッ化四級アンモニゥムのなかでも、 テトラプチ ルアンモニゥムフロオリド （TBAF) は固相樹脂からペプチドを離脱させる試 薬として用いられていた（J. Chem. So ， C em. Commun. , p. 414-415, 1988年、 Tet rahedron Let t ers, 34卷， p. 7599-7602, 1993年) が、 本発明者らは弱酸 性離脱樹脂上に構築したべプチドは TBAF処理によつて樹脂から離脱しないこ とを見出した。 この結果、 T B A Fを用いれば、 ペプチドが樹脂から離脱す ることなく、 そのゆえに、 樹脂上で特定のアミノ酸側鎖の保護基を脱離させ て残基選択的修飾を施すことができ、 ついで、 アミノ酸側鎖の保護基を脱離 させにくい弱酸 （希釈された強酸を含む） を用いペプチド断片 （修飾成分） を樹脂から切り出すことにより、 次工程のペプチド断片 （非修飾成分） との 縮合反応の際に、 事前にペプチド断片 （修飾成分） を保護する工程が必要な くなり、 修飾をうけた生理活性べプチド又は蛋白質の製造工程を大幅に簡略 化かつ効率化することができた。
さらに本発明者らは、 ダレリンの保護ペプチド断片 （非修飾成分） の調製 方法を改良し、 保護ダレリン （8— 2 8 ) 断片を 2段階酵素処理法で大量に 調製するために最適なリンカ一配列を見出した。 さらに本発明者らは、 保護 基が離脱しない PH条件で精製することで保護ペプチド断片（非修飾成分） の 製造工程を大幅に簡略化かつ効率化しうる方法を確立した。 すなわち、 保護 ぺプチドの調製時に保護基が離脱する現象は水溶液の P H及び温度に依存し ており、 水溶液の p Hを 4— 8とすることにより保護基の離脱が阻止でき、 収率よく保護ペプチド （非修飾成分） を調製できることを見出した。
また、 各ペプチド断片の縮合方法を改良し、 アミノ酸の活性化時、 及び縮 合時のラセミ化を抑制し、 ダレリン又はダレリン誘導体をより高品質かつ高 収率で得ることができる製造方法を見出した。 特に、 弱酸性離脱樹脂を用い たダレリンの製造方法は、 副反応により生じるジケトピペラジンの形成を抑 制することができるという利点がある。 即ち、 C末端アミノ酸残基が 7位の プロリンであるので、 ジペプチド（-Ser-Pro- ) に 3個目のアミノ酸 （Leu)を 縮合する時に、 ジケトピペラジンを巻いて樹脂から離脱する副反応を最小限 に抑えることができる。
この知見に基づき、 さらに、 アルキル基はいうまでもなく、 ァシル基、 リ ン酸基又は硫酸基を、 グリコシド結合、 ジスルフイド結合、 エーテル結合、 チォエーテル結合又はアミド結合等を介してアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖 に結合した種々の修飾構造を有する生理活性ペプチド又は蛋白質の製造にも 容易に適用できることを見出し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、
( 1 ) 弱酸性離脱樹脂を用いることを特徴とする、 式 1 ； 一 A (R) 一 (式中、 Aはアミノ酸又は非アミノ を示し、 Rは Aの側鎖に結合している 置換基を示す、）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上 含む保護されているペプチド断片の製造方法、
( 2 ) ( a ) 弱酸性離脱樹脂上に、 側鎖が保護されているアミノ酸又は /及び非アミノ酸の所望の配列を有するペプチド断片を作製し、 （b )前記べ プチド断片を弱酸性離脱樹脂上から脱離させることなく、 置換基 Rにより修 飾をうけるアミノ酸又は非アミノ酸 Aの側鎖の保護基を脱保護し、 （c )前記 脱保護した側鎖を置換基 Rで修飾し、 （d ) 弱酸性離脱樹脂からペプチド断片 を切り出すことを特徴とする前記 （1 ) に記載のペプチド断片の製造方法、 ( 3 ) アミノ酸又は非アミノ酸 Aの側鎖の保護基が、 シリル系保護基で あり、 前記保護基の脱保護にフッ化四級ァンモニゥムを用いることを特徴と する前記 （1 ) 又は （2 ) に記載のペプチド断片の製造方法、
( 4 ) シリル系保護基が、 t一プチルジメチルシリル （TBDMS) 、 t—ブ チルジフエニルシリル (TBDPS) 、 トリイソプロピルシリル (TIPS) 、 トリイ ソブチルシリル (TIBS) 、 t一へキシルジメチルシリル (T xDMS) 又はトリ フエエルシリル (TPS) であり、 フッ化四級アンモニゥムがテトラプチルアン モニゥムフルオリド (TBAF) 、 テトラエチルアンモニゥムフルオリド (TEF) 又はアンモニゥムフルオリドであることを特徴とする前記 （3 ) に記載のぺ プチド断片の製造方法、
( 5 ) Aがセリン、 スレオニン、 システィン、 ホモシスティン、 リジン、 オル二チン、 グルタミン酸、 2—アミノアジピン酸、 ジァミノ酢酸、 2—ァ ミノマロン酸、 ァスパラギン酸、 チロシン又はァスパラギンであり、 Rがェ ステル結合、 エーテル結合、 チォエーテル結合、 ジスルフィド結合、 アミド 結合、 O—グリコシド結合又は N—グリコシド結合等を介して Aの側鎖に結 合していることを特徴とする前記 （1) 〜 （4) に記載のペプチド断片の製 造方法、
(6) Aがセリン又はスレオニンであり、 Rがエステル結合を介して A の側鎖に結合していることを特徴とする前記 （5) に記載のペプチド断片の 製造方法、
(7) ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体、 又は前記グレリ ンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含む部分であることを 特徴とする前記 （6) に記載のペプチド断片の製造方法、
(8) (a) 式 1 ；一 A (R) 一 （式中、 Aはアミノ酸又は非アミノ酸 を示し、 Rは Aの側鎖に結合している置換基を示す、） で表わされる修飾をう けたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されているぺプチド断片を、 弱酸性離脱樹脂を用いて製造し、前記（a)のペプチド断片とは別個に、 （b) 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断 片を製造し、 前記 （a) 及び （b) で製造されたペプチド断片を縮合するこ とを特徴とする修飾べプチド又は蛋白質の製造方法、
(9) 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されてい るペプチド断片を、 前記 （2) 〜 （4) に記載の方法で製造することを特徴 とする前記 （8) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(10) Aがセリン、 スレオニン、 システィン、 ホモシスティン、 リジ ン、 オル二チン、 グルタミン酸、 2—アミノアジピン酸、 ジァミノ酢酸、 2 ーァミノマロン酸、 ァスパラギン酸、 チロシン又はァスパラギンであり、 R がエステル結合、 エーテル結合、 チォエーテル結合、 ジスルフィド結合、 ァ ミド結合、 〇ーグリコシド結合又は N—グリコシド結合により Aの側鎖に結 合していることを特徴とする前記 （8) 又は （9) に記載の修飾ペプチド又 は蛋白質の製造方法、
(1 1) Aがセリン又はスレオニンであり、 Rがエステル結合を介して Aの側鎖に結合していることを特徴とする前記 （10) に記載の修飾べプチ ド又は蛋白質の製造方法、
(12) 修飾ペプチド又は蛋白質が、 ダレリン又はその誘導体であるこ とを特徴とする前記 （11) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(13) ペプチド断片の縮合が、 縮合剤を用いて行われることを特徴と する前記 （8) 〜 （12) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、 (14) 縮合剤が、 2 _(1—ヒドロべンゾトリァゾ一ル— 1—ィル）— 1，1，3,3—テトラメチルゥロニゥム へキサフルォロホスフェート （HBTU)、 2— (1—ヒドロべンゾトリァゾ一ル一 1—ィル） 一1,1,3,3—テトラメチル ゥロニゥム テトラフルォロボレート (TBTU)、 ジフエ二ルホスホリルアジド (DPPA)、 ジフエ二ルホスホロシア二デート (DEPC)、 ジイソプロピルカルボ ジイミド (DIPC)、 ジシクロへキシルカルポジイミド (DCC) 又は 1一ェチル - 3 - (3—ジメチルァミノプロピル) カルポジイミド (EDO であることを 特徴とする前記 （13) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(15) 縮合剤が、 ジイソプロピルカルポジイミド (DIPC)、 ジシクロへ キシルカルポジイミド (DCC) 又は 1—ェチルー 3— (3—ジメチルアミノブ 口ピル） カルポジイミド （EDC) であり、 前記縮合剤を用いるペプチド断片の 縮合が、 1ーヒドロキシベンゾ卜リァゾ一ル (H0Bt)、 1 _ヒドロキシスクシ ンイミド （HOSu) 又は 3, 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4—ォキソ一べ ンゾトリアジン （HOOBt) の存在下、 行われることを特徴とする前記 （13) に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法、
に関する。
より具体的に、 本発明は、 修飾をうけたペプチド又は蛋白質を断片縮合に より製造する過程において、（ a )修飾基を含むぺプチド断片を製造するとき、 2一クロロトリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂を用いて合成することを特徴と する、 修飾をうけた生理活性ペプチド又は蛋白質の製造方法、 （b ) 酸で脱離 しゃすいァシル基、 硫酸基等を含むペプチド断片を合成する際、 2—クロ口 トリチル樹脂等の弱酸性離脱樹脂を用いて製造することを特徴とする、 修飾 を有する生理活性ペプチド又は蛋白質、 特にグレリン又はグレリン誘導体の 製造方法、 （c ) 修飾を含むペプチド断片 （修飾成分） と修飾を含まないぺプ チド断片 （非修飾成分） との縮合を行うとき、 活性化させる N末端側断片の C末端残基にプロリンを介することにより、 構成アミノ酸のラセミ化を抑制 したことを特徴とするダレリン又はダレリン誘導体の製造方法、 （d) グレリ ン又はダレリン誘導体の製造に顕著に良好であった縮合剤に関する。
更に、 本発明は、
( 1 ) アミノ酸又は Z及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、 その うち少なくとも 1のアミノ酸又は非アミノ酸が式 1 ； ー A (R) 一 （式中、 Aはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、 Rは Aの側鎖に結合している修飾のた めに導入された置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非ァ ミノ酸であり、 かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミ ノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基及び力 ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 ペプチド断片作製に際し て望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基によ り保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、 ついで、 弱酸 性条件で前記べプチド断片における保護基を脱離させることなく前記べプチ ド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱することを特徴とする、 修飾をうけたァミ ノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されているぺプチド断片の製造方法、 ( 2 ) ( a )アミノ酸又は Z及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、 かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジ ノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基及び力ルポキシル基か らなる群から選ばれる 1種以上の、 ぺプチド断片作製に際して望ましくない 副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基により保護されてい るペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、 （b )前記ペプチド断片を弱酸 性離脱樹脂上から離脱させることなく、 置換基 Rにより修飾をうけるアミノ 酸又は非アミノ酸 Aの側鎖における反応性官能基に保護基が導入されている 場合は、 当該保護基を脱保護し、 （c ) 前記脱保護した側鎖を置換基 Rで修飾 し、 （d ) 弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることな く前記べプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることを特徴とする前記 ( 1 ) に記載のペプチド断片の製造方法、
( 3 ) , ( a ) 弱酸性離脱樹脂上で、 アミノ酸又は/及び非アミノ酸の所 望の配列を有し、かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の、水酸基、アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基及びカルポキ シル基からなる群から選ばれる 1種以上の反応性置換基が保護基により保護 されているペプチド断片を作製し、 ついで、 （b ) 弱酸性条件で前記ペプチド 断片における保護基を脱離させることなく前記べプチド断片を弱酸性離脱樹 脂から離脱させ、 （c )離脱させたペプチド断片の少なくとも 1のアミノ酸又 は非アミノ酸 Aの側鎖における反応性置換基の保護基を脱保護し、 ( d ) 前記 脱保護した側鎖を置換基 Rで修飾することを特徴とする式 1 ； _ A (R) - (式中、 Aはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、 Rは Aの側鎖に結合している 置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上 含む保護されているぺプチド断片の製造方法、
( 4 ) 置換基 Rにより修飾を受けるアミノ酸又は非アミノ酸 Aの側鎖に おける反応性置換基の保護基が、 シリル系保護基であり、 前記保護基の脱保 護にフッ化四級アンモニゥムを用いることからなる前記 （2 ) 又は （3 ) に 記載のぺプチド断片の製造方法、 (5) シリル系保護基が、 t一プチルジメチルシリル （TBDMS) 、 tーブ チルジフエニルシリル （TBDPS) 、 トリイソプロピルシリル （TIPS) 、 トリイ ソブチルシリル （TIBS) 、 t一へキシルジメチルシリル （ThxDMS) 又はトリ フエニルシリル（TPS) であり、 フッ化四級アンモニゥムがテトラプチルアン モニゥムフルオリド （TBAF) 、 テトラエチルアンモニゥムフルオリド （TEF) 又はアンモニゥムフルオリドである前記 （4) に記載のペプチド断片の製造 方法、
(6) Aがセリン、 スレオニン、 システィン、 ホモシスティン、 リジン、 オル二チン、 グルタミン酸、 2—アミノアジピン酸、 ジァミノ酢酸、 2—ァ ミノマロン酸、 ァスパラギン酸、 チロシン又はァスパラギンであり、 Rがェ ステル結合、 エーテル結合、 チォェ一テル結合、 ジスルフィド結合、 アミド 結合、 〇ーグリコシド結合又は N—グリコシド結合を介して Aの側鎖の反応 性官能基に結合していることからなる前記 （1) 〜 （5) に記載のペプチド 断片の製造方法、
(7) Aがセリン又はスレオニンであり、 Rがエステル結合を介して A の側鎖の水酸基に結合していることからなる前記 （6) に記載のペプチド断 片の製造方法、
(8) ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体、 又は前記グレリ ンもしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含むペプチド断片であ る前記 （7) に記載のペプチド断片の製造方法、
(9) (a) 前記 （1) 〜 （8) に記載の方法によって修飾をうけたァ ミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されているペプチド断片を製造し、 前記 （a) のペプチド断片とは別個に、 （b) 修飾をうけたアミノ酸又は非ァ ミノ酸を含まず、 かつ、 アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基お よび力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 望ましくない副反 応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護されているペプチド断片を 製造し、 前記 （a) 及び （b) で製造されたペプチド断片を縮合することを 特徴とする修飾べプチド又は蛋白質の製造方法、
(10) ペプチド断片の縮合が、 縮合剤を用いて行われることからなる 前記 （9) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(11) 縮合剤が、 2—（1ーヒドロべンゾトリァゾ一ルー 1一ィル）一 1, 1， 3, 3—テトラメチルゥロニゥム へキサフルォロホスフェート (HBTU)、 2—（1ーヒドロべンゾトリァゾールー 1一ィル） 一 1， 1, 3，
3—テトラメチルゥロニゥム テトラフルォロボレ一ト （TBTU)、 ジフエ二ル ホスホリルアジド ΦΠ>Α)、 ジフエニルホスホロシア二デ一ト （DEPC)、 ジィ ソプロピルカルポジイミド （DIPC)、 ジシクロへキシルカルポジイミド （DCC) 又は 1ーェチルー 3—（3—ジメチルァミノプロピル）カルポジイミド（EDC) である前記 （10) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(12) 縮合剤が、 ジイソプロピルカルポジイミド （DIPC)、 ジシクロへ キシルカルポジィミド （DCC) 又は 1ーェチルー 3— （ 3—ジメチルァミノプ 口ピル）カルポジィミド（EDC)であり、前記縮合剤を用いるぺプチド断片（ a) と （b) の縮合が、 1ーヒドロキシベンゾトリアゾール （H0Bt)、 1ーヒドロ キシスクシンイミド （HOSu) 又は 3， 4—ジヒドロー 3—ヒドロキシー 4— ォキソ一べンゾトリァジン（HOOBt)の存在下で行われることからなる前記（ 1 0) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(13) 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されてい るべプチド断片を、 酵素法又は Z及び遺伝子組換法により製造することから なる前記 （9) 〜 （12) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(14) 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されてい るペプチド断片を、 下記方法；
工程 （1)；前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド （以下、 本項 において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所 望によりリンカ一配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質を コードする塩基配列のいずれかを有する発現べクタ一により形質転換された 細胞を培養して、 当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取す る工程；
工程 （2)；工程 （1) において融合蛋白質を採取した場合、 得られた融合蛋 白質から、 保護ペプチド及び所望によりリンカ一配列と目的ペプチドとを切 断分離し、 所望により目的ペプチドをさらに精製する工程；
工程 （3)；工程 （1) 又は （2) で得られた目的ペプチドの側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカ ブト基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 望ましくな い副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護するェ 程；
を含む方法により製造することからなる前記 （13) に記載の修飾ペプチド 又は蛋白質の製造方法、
(15) 工程 （ 2 ) における保護べプチド及び所望によりリンカ一配列 と目的ペプチドとの切断分離が、 OmpTプロテアーゼ又はその誘導体及び Ke X 2プロテアーゼ又はその誘導体を用いて 2段階で行われることからな る前記 （14) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(16) リンカ一配列が、 配列番号 27に記載の配列である前記 （14) 又は （15) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(17) ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体の中の修飾をう けたアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とす る前記 （13) 〜 （16) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、 (18) 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されてい るペプチド断片を、 p H 4〜 8の溶液中で精製及び保存することを特徴とす る前記 （13) 〜 （17) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、
(19) 保護基が Bo c基である前記 （13) 〜 （18) に記載の修飾 ぺプチド又は蛋白質の製造方法、
(20) 工程 （1)；所望のアミノ酸配列を有するペプチド （以下、 本項 において目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所 望によりリンカ一配列を介して保護べプチドが付加されている融合蛋白質を コードする塩基配列のいずれかを有する発現べクタ一により形質転換された 細胞を培養して、 当該培養物から目的べプチド又は前記融合蛋白質を採取す る工程；
工程 （2)；工程 （1) において融合蛋白質を採取した場合、 得られた融合蛋 白質から、 保護べプチド及び所望によりリンカー配列と目的べプチドとを切 断分離し、 所望によりさらに精製する工程；
工程 （3)；工程 （1) 又は （2) で得られた目的ペプチドの側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカ プト基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 望ましくな い副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護するェ 程；
工程 （4)；工程 （3) で得られた保護されている目的ペプチドを、 pH4〜 8の溶液中で精製及び保存する工程；
を含む方法により製造することを特徴とする修飾をうけたアミノ酸又は非ァ ミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
(21) 保護基が Bo c基である前記 （20) に記載の修飾をうけたァ ミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方 法、
(22) 工程 （2) における保護ペプチド及び所望によりリンカ一配列 と目的べプチドとの切断分離が、 〇mp Tプロテアーゼ又はその誘導体及び Ke x 2プロテアーゼ又はその誘導体を用いて 2段階で行われることからな る前記 （20) または （21) に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非ァミノ 酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法、
(23) リンカー配列が、 配列番号 27に記載の配列である前記 （20) 〜 （22) に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護さ れているペプチド断片を製造する方法、
(24) ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体の中の修飾をう けたアミノ酸又は非アミノ基を含まないぺプチド断片であることを特徴とす る前記 （20) 〜 （23) に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法、 に関する。 図面の簡単な説明
第 1図 Aは、 hGhrelin(8- 28)の全合成オリゴ DNAならびにアミノ酸配列を 表している。 第 1図 Bは、 P1178- 28oRRにより発現される hGhrelin(8-28)融 合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
第 2図は、精製した [Lys1M9' '24(Boc)]hGhrelin(8-28)の HPLC分析結果を示 している。ピーク ァ）は、 [Lys16'l9'2°'24(Boc)]hGhrelin(8- 28)のピークを示す。 第 3図は、 断片の縮合反応を示している。 ピ一ク Aは [Na- Boc， Ser2-6(tBu)] hGhrelin (卜 7)のピークを、ピーク Bは [Lys16'19'2°'24(Boc)]hGhrelin(8-28)のピ ークを、 ピーク Cは Boc, Ser2-6(tBu), Lys〖 9'2°'24(Boc)]hGhrelinのピー クを、 ピーク Dは hGhrelinのピークを示す。
第 4図は、 精製した hGhrel inの HPLC測定結果を示している。
第 5図は、 Kex2プロテアーゼの切断認識部位が異なる融合蛋白質のァミノ 酸配列を示している。
第 6図は、 第 5図で作成した各融合蛋白質の Kex 2切断効率を HPLCで分析し た結果を示している。 第 6図 Aは、 ？11-1^11 1111(8-28)の1¾ 2酵素反応後の HPLC分析結果を示す。 第 6図 Bは、 RR- hGhrelin(8- 28)の Kex2酵素反応後の HPLC分析結果を示す。 第 6図 Cは、 KR- hGhrelin(8- 28)の Kex2酵素反応後の HPLC分析結果を示す。 ピーク ァ） は、 リ ンカ一配列を含む [Lys16'ig'2Q'24(Boc)]hGhrelin(8- 28)のピークを示す。 ピーク ィ） は、 [Lys16'19'2( 4(Boc)]hGhrelin(8-28)のピークを示す。 ピーク ゥ） は、 [Lys16'ig'M'24(Boc)]hGlirelin(16-28)のピークを示す。
第 7図は、 培養に最適な融合蛋白質を決定するために作成した各 hGhrelin(8-28)融合蛋白質のアミノ酸配列を示している。
第 8図 Aは、 融合蛋白質の違いによる培養結果の差を示し、 第 8図 Bは各 融合蛋白質での培養液の菌体破砕前の濁度に対する菌体破砕後の濁度 （融合 蛋白質による相違） を示している。
第 9図は、 [Lys16'19'2( 4(Boc)]hGhrelin(8-28)の安定性評価結果を示してい る。
第 1 0図は、 [Lys16'19'2I 4(Boc)]hGlireliii(8_28)の安定性評価結果を示して いる。 発明を実施するための最良の形態
本発明を説明するに際し、 下記用語を以下のように定義する。
「アミノ酸」 とは、 同一分子内にアミノ基と力ルポキシル基を有する化合 物であり、 例えば、 L一アミノ酸、 D—アミノ酸、 a;—アミノ酸、 β -アミ ノ酸、 ァ一アミノ酸、 天然アミノ酸、 非天然アミノ酸、 合成アミノ酸等あら ゆるアミノ酸を含む。
「天然アミノ酸」 とは、 遺伝子によりコードされる 20種類のアミノ酸を いう。
「非天然アミノ酸」 とは、 a—アミノ酸における α炭素が天然アミノ酸又 はそれに対応する D—アミノ酸に存在しない任意の置換基で修飾されている 化合物をいう。 即ち、 一アミノ酸を下記式； R'
H2N—— C—— C00H
で表したとき、 R'、 R"で示される置換基として、 天然アミノ酸又はそれに 対応する D—アミノ酸に存在しない任意の置換基又は水素原子 （但し、 R' 及び R"がともに水素原子である場合を除く。）を有する化合物が挙げられる。
「非アミノ酸」 とは、 （：、 H、 〇、 N及び Sからなる群から選ばれる 1種 以上の原子からなるアミノ酸の類似体であつて、 天然ァミノ酸及び非天然ァ ミノ酸に含まれない化合物をいう。 なかでも、 分子鎖長がペプチド相当長又 はジペプチド相当長の化合物が好ましい。 例えば、 N¾- CH(CH20H)- C¾、 CH CH(RH)-C00H, C¾-CH(Ra)- CH3 (何れも分子鎖長がペプチド相当長）、 又 は N¾- (CH2)3CH(CH2OH)- C00H、 N -(C¾)4- COOH、 N¾- C (C¾) 2- (CH2) 3- COOH、 NH CH (CH3)― (CH2) rCH (CH3)一 C00H、 NH (CH2) 3CH (CH20H)一 C¾、 NH2- (CH2) 3CH (Ru)一 CH3 (何れも分子鎖長がジペプチド相当長） 等が本発明でいう 「非アミノ酸」 に含まれる。 ここで、 R„は、 天然アミノ酸の側鎖を表す。 ペプチドにおける 「非アミノ酸残基」としては、例えば、 -NH-CH(CH2OH)-CHr, -CH2-CH(Rn)-C0-, -CHrCH(Rn)-CH2- (何れも分子鎖長がペプチ ド相当長）、 又は -NH-(CH2)3CH(CH20H)-C0- 、 - NH- (CH2) 4- CO- 、 - NH- C (C¾) 2- (CH2) 3- CO- 、 -NH-CH (CH3) - (CH2) rCH (CH3) -CO- 、 -NH- (CH2) 3CH (CH20H) -C¾- 、 -NH-(CH2)3CH(RH)-CH2- (何れも分子鎖長がジぺプチド相当長）等が挙げられ、 隣接するアミノ酸との結合はべプチド結合でない場合がありえる。
「ペプチド」 又は 「ペプチド断片」 とは、 複数のアミノ酸がペプチド結合 で連なった化合物のことをいう。 ここで、 非アミノ酸を含む場合は、 当該非 アミノ酸と隣接するアミノ酸との結合はペプチド結合ではない場合があるが、 この場合の化合物もペプチド又はペプチド断片と総称する。
「保護されているペプチド断片」 とは、 ペプチド断片のアミノ酸又は非ァ ミノ酸の側鎖の、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 イン ドリル基、 メルカプト基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以 上の、 ペプチド断片作製に際して又はペプチド断片の縮合反応に際して、 望 ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基が保護基によって 保護されているペプチドの断片をいう。 以下、 本明細書においては、 「保護べ プチド断片」 と略称する。
「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」 は、 式 1 ；ー A (R) 一 （式中、 Aはアミノ酸又は非アミノ酸を示し、 Rは Aの側鎖に結合している修飾のた めに導入された置換基を示す。） で表わされる。
上記置換基 Rは、 アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミ ノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基又は力 ルポキシル基から水素原子を除去して形成される基に結合している場合もあ るし、 アミノ酸又は非アミノ酸の α炭素に直接結合している場合もある。 置 換基 Rは、 ァミノ酸又は非ァミノ酸の修飾された側鎖であつてもよい。
上記置換基 Rとしては、 特に限定されない。 例えば、 Rとしては、 式 2 ； _ (CH2) n— P— Q (式中、 nは 1〜： L 0の整数を示し、 Pは、 一 C〇—、 一 S02—、 一 CO— O—、 一 O— C〇一、 一 O—、 一 CO— S—、 -S -C O—、 _CS— S―、 一 S— CS―、 — S—、 一 CO— NH—、 一 NH— C 0_、 一 CO— NH— CO_、 一 CS— NH— CS—、 一 S— S—、 ― CS 一 NH—又は一 NH— CS—を示し、 Qは、 水素原子、 又は
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好まし くは 。のアルキル基、 C6— 2。のァリール基もしくは C 7— 6のァラルキ ル基を示す。） で表わされる基、 式 3 ； -P-Q (式中、 P及び Qは前記と同 意義。） で表わされる基、 又は式 4 ；― Q (式中、 Qは前記と同意義。） で表 わされる基等が挙げられる。 なかでも、 上記 Rとしては、 アミノ酸又は非ァ ミノ酸の α炭素に直接結合している場合、 炭素数 1以上のアルキル基を介し て又は介さずに、 エステル、 ェ一テル、 チォエステル、 チォエーテル、 アミ ド又はカルバミドからなる群から選ばれる結合により、 一 3 5、 好ましくは
0 ^ 2 0のアルキル基、 C 6 _ 2。のァリール基又は C 7 _ i 6のァラルキル基が結 合している基が好ましい。 置換基 Rがアミノ酸又は非アミノ酸の Q!炭素に直 接結合している場合、 置換基 Rは天然アミノ酸において 炭素に結合してい る置換基を含まない。 置換基 Rがアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における反 応性置換基に結合している場合、 当該置換基 Rは式 4 ；一 Q (式中、 Qは前 記と同意義。） で表わされる基であることが好ましい。
ここで、 上記 「アルキル基」 とは、 環状、 直鎖又は分枝鎖アルキル基を表 し、 例えばメチル基、 ェチル基、 プロピル基、 イソプロピル基、 シクロプロ ピル基、 ブチル基、 s e c一ブチル基、 イソブチル基、 t e r t一ブチル基、 シクロブチル基、 ペンチル基、 イソペンチル基、 t e r t—ペンチル基、 ネ ォペンチル基、 シクロペンチル基、 へキシル基、 イソへキシル基、 シクロへ キシル基、 3， 3—ジメチルブチル基、ヘプチル基、 1—プロピルブチル基、 ォクチル基、 ノニル基、 デシル基、 ゥンデシル基、 ドデシル基、 トリデシル 基、 テトラデシル基又はペン夕デシル基等が挙げられ、 これらは部分的に不 飽和炭素結合を含んでいてもよく、 炭素数は 1乃至 3 5、 より好ましくは 1 乃至 2 0、 さらに好ましくは 1乃至 1 0である。
上記 「ァリ一ル基」 とは、 例として、 フエニル基、 1—もしくは 2—ナフ チル基、 ビフエ二ル基、 1 _， 2—もしくは 9一アン卜リル基、 1 _， 2—, 3 -, 4一もしくは 9—フエナントリル基、 ァセナフチル基、 アントラセニ ル基、 ァズレニル基等が挙げられる。 炭素数は 6乃至 2 0、 より好ましくは 6乃至 1 5である。
上記 「ァラルキル基」 としては、 ベンジル基、 p—メトキシベンジル基、 3， 4ージメトキシベンジル基、 o一二トロべンジル基、 p—二トロべンジ ル基、 ベンズヒドリル基、 トリチル基等が挙げられる。 炭素数は、 好ましく は 7乃至 1 6である。
さらに、 これらアルキル基、 ァリール基及びァラルキル基は、 当技術分野 で通常用いられる置換基を化学的に許容される位置及び個数で有していても よい。
「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」 としては、 アミノ酸又は非アミ ノ酸 Aがセリン、 スレオニン、 システィン、 ホモシスティン、 リジン、 オル 二チン、 グルタミン酸、 2—ァミノアジピン酸、 ジァミノ酢酸、 2—ァミノ マロン酸、 ァスパラギン酸、 チロシン又はァスパラギンであり、 置換基 が 式 5 ;— ( C H 2) n— P i— Q 1 (式中、 nは前記と同意義。 P 1は、 エステ ル結合、ェ一テル結合、チォエーテル結合、 ジスルフィド結合、 アミド結合、 〇ーグリコシド結合又は N—グリコシド結合を表し、 Q 1は、 前記 Qと同意 義。） で示される基である場合が好ましい。
具体的には、 例えば、 アミノ酸 Aがセリン、 スレオニン、 チロシン又はォ キシプロリンである場合、 そのアミノ酸は側鎖に水酸基を有するから、 「修飾 をうけたアミノ酸」 としては、 側鎖の水酸基がエーテル化又はエステル化さ れているセリン、 スレオニン、 チロシン又はォキシプロリンが挙げられる。 アミノ酸 Aがシスティンである場合は、 そのアミノ酸は側鎖にメルカプト基 を有するから、 「修飾をうけたアミノ酸」 としては、 側鎖のメルカプト基がチ ォエーテル化、 チォエステル化又はジスルフィド化されているシスティンが 挙げられる。 アミノ酸 Aがリジン、 アルギニン又は 2 , 3—ジァミノプロピ オン酸である場合は、側鎖にアミノ基を有するから、「修飾をうけたアミノ酸」 としては、 側鎖のァミノ基がアミド化、 チォアミド化、 カルバミド化、 チォ カルバミド化又はアルキル化されているリジン、 アルギニン又は 2， 3—ジ ァミノプロピオン酸が挙げられる。 アミノ酸 Aがヒスチジン、 トリブトファ ン、 プロリン又はォキシプロリンである場合は、 側鎖にアミノ基を有するか ら、 「修飾をうけたアミノ酸」 としては、 側鎖のァミノ基がアミド化、 チオア ミド化、 イミノエ一テル化、 イミノチォエーテル化、 アルキル化されている ヒスチジン、 トリブトファン、 プロリン又はォキシプロリンが挙げられる。 なかでも、 「修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸」 としては、 側鎖の水酸 基がエステル化されているセリン又はスレオニンが好ましい。
さらに、上記置換基 Rとしては、ァミノ酸又は非ァミノ酸 Aの側鎖に一 0H、 一 SH、 — NH—又は _NH2を含む場合、 これらをァシル化して形成される基がよ り好適な例として挙げられる。 そのためのァシル基としては、 例えば有機力 ルボン酸、 有機スルホン酸、 有機リン酸化合物から水酸基を除去して形成さ れる基が挙げられる。 前記有機カルボン酸としてはより具体的には、 脂肪酸 が挙げられ、 その炭素数は好ましくは 2〜 3 5、 より好ましくは 6〜 1 8、 最も好ましくは 8〜1 6である。 そのような脂肪酸としては、 例えばカプリ ル酸、 力プリン酸、 ラウリン酸、 酪酸、 カブロン酸、 ゥンデシル酸、 パルミ チン酸、 デカン酸、 ノナデカン酸、 ベヘン酸、 モンタン酸もしくはラクセン 酸等の飽和脂肪酸、 例えばアクリル酸、 ォレイン酸、 リノール酸、 リノレン 酸もしくはァァテアロール酸等の不飽和脂肪酸が挙げられる。 不飽和脂肪酸 はモノエンであってもよいし、 ポリェンであってもよい。 なかでも、 ォクタ ン酸 （好ましくは、 力プリル酸)、 デカン酸 （好ましくは、 力プリン酸）、 ド デカン酸 （好ましくは、 ラウリル酸） 等が好適な例として挙げられる。 前記 有機スルホン酸又は有機リン酸化合物についても、 その炭素数は 2〜3 5の ものが好ましい。
「修飾ペプチド又は蛋白質」 とは、 ペプチド又は蛋白質中に、 上述の修飾 をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を、 1以上含むぺプチド又は蛋白質をいう。
「ダレリン」 とは、 内因性成長ホルモン分泌促進因子 （GH S ) のことで あり、 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性及ぴ成長ホルモンの 分泌を誘導する活性を有する。 なかでも、 ヒト、 ラット、 マウス、 ブタ、 二 ヮトリ、 ゥナギ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 力エル、 ニジマス又はィヌ由来のグ レリンが好ましい。 より具体的には、 「グレリン」 としては、 配列番号 1〜2 1のいずれかに記載のアミノ酸配列を有し、 3位セリン又はスレオニンの側 鎖水酸基の水素原子が、 n—ォク夕ノィル基、 ブタノィル基、 へキサノィル 基、 デカノィル基又はドデカノィル基のいずれかで置換されている蛋白質、 又は配列番号 1〜2 1のいずれに記載のアミノ酸配列において、 N末端の 1 番目から 4番目までのアミノ酸配列以外の部分で、 1〜1 0個、 好ましくは 1〜数個程度のアミノ酸が置換、付加又は欠失しているアミノ酸配列を有し、 3位セリン又はスレオニンの側鎖水酸基の水素原子が、 n—才クタノィル基、 ブタノィル基、 へキサノィル基、 デカノィル基又はドデカノィル基のいずれ かで置換されており、 かつ細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させる活性 を有する蛋白質が挙げられる。
「ダレリン誘導体」 としては、 細胞内のカルシウムイオン濃度を上昇させ る活性を有し、 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含むことを特 徴とするペプチド又はその薬学的に許容される塩が挙げられる。 なかでも、 配列番号 1に記載のアミノ酸配列においてァミノ末端から 4番目までのアミ ノ酸配列、 好ましくはァミノ末端から 5番目までのアミノ酸配列、 好ましく はァミノ末端から 6番目までのァミノ酸配列、 好ましくはァミノ末端から 7 番目までのアミノ酸配列、 好ましくはァミノ末端から 8番目までのアミノ酸 配列、 好ましくはァミノ末端から 9番目までのアミノ酸配列、 好ましくはァ ミノ末端から 1 0番目までのアミノ酸配列を少なくとも有するペプチド又は その薬学的に許容される塩が好ましい。 さらに、 配列番号 1〜2 1に記載の アミノ酸配列において、 ァミノ末端から 4番目までのアミノ酸配列、 好まし くはァミノ末端から 5番目までのアミノ酸配列、 好ましくはァミノ末端から 6番目までのアミノ酸配列、 好ましくはァミノ末端から 7番目までのァミノ 酸配列、 好ましくはァミノ末端から 8番目までのアミノ酸配列、 好ましくは ァミノ末端から 9番目までのアミノ酸配列、 好ましくはァミノ末端から 1 0 番目までのアミノ酸配列以外の部分で、 少なくともひとつのアミノ酸、 好ま しくは 1〜1 0個程度のアミノ酸、 より好ましくは 1乃至数個のアミノ酸が 欠失、 置換及び/又は付加されたアミノ酸配列を含むぺプチド又はその薬学 的に許容される塩が好ましい。 なかでも、 上記態様の全てのペプチド又はそ の薬学的に許容される塩においては、 ァミノ末端から 2番目又は 3番目のァ ミノ酸、 より好ましくはァミノ末端から 3番目のアミノ酸が、 修飾をうけた アミノ酸又は非アミノ酸であることが特に好ましい。
また、 配列番号 1〜2 1に記載のアミノ酸配列、 又は当該アミノ酸配列の 少なくともひとつのアミノ酸、 好ましくは 1〜1 0個程度のアミノ酸、 より 好ましくは 1乃至数個のアミノ酸が欠失、 置換及び/又は付加されたァミノ 酸配列において、 ァミノ末端から 4番目までのアミノ酸配列が、 式 6 ； A - B - C - D - (式中 Aはアミノ酸、 非アミノ酸、 又はないことを示し、 Bは アミノ酸、 非アミノ酸、 又はないことを示す。 ただし、 A+ Bの分子鎖長が ジペプチド相当長ある。 C又は Dは同一であっても異なっていてもよく、（a ) 修飾されたアミノ酸、 （b) 疎水性側鎖を有するアミノ酸、 又は （c ) 塩基性 側鎖を有するアミノ酸を示す。）で表されるペプチド断片に置き換えられてい るペプチド又はその薬学的に許容される塩も好ましい態様として挙げられる。 前記 「疎水性側鎖を有するアミノ酸」 としては、 ロイシン、 バリン、 ノル口 イシン、 ホモロイシン、 ホモイソロイシン、 ナフチルァラニン類、 トリブト ファン、 フエ二ルァラニン、 シクロへキシルァラニン等、 あるいは、 これら の V—メチルアミノ酸又は D _体などが挙げられる。 前記 「塩基性側鎖を有 するアミノ酸」 としては、 リジン、 アルギニン又はヒスチジン又はこれらの D—体などが挙げられる。 中でも、 前記式 6中、 Cが、 上記修飾をうけたァ ミノ酸であり、 Dが疎水性側鎖を有するァミノ酸であることがより好ましい。 前記式 6； A—B— C— D—で表されるペプチド断片の代わりに、次式 7 ； A1— B1— ^— D1— (式中、 A1はアミノ酸又は非アミノ酸、 好ましくは 天然アミノ酸又はその D—体を示す。 B1又は C1は、 少なくとも一方が修飾 をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、 B1又は C1のうち一方のみが修飾 をうけたアミノ酸又は非アミノ酸である場合、 他方は修飾をうけていないァ ミノ酸又は非アミノ酸、 好ましくは天然アミノ酸又はその D—体である。 ま た、 Ai + B1の分子鎖長がジペプチド相当長ある。 D1は、疎水性側鎖を有す るァミノ酸又は塩基性側鎖を有するァミノ酸を示す。 )で表されるぺプチド断 片を用いてもよい。
また、 前記式 6 ； A— B— C— D—で表されるペプチド断片の代わりに、 次式 8 ; B2— C2_D2— (式中、 B2は、 ジペプチド相当長の分子鎖長を有 する非アミノ酸であり、 C 2は修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸であり、 D 2は、 疎水性側鎖を有するァミノ酸又は塩基性側鎖を有するァミノ酸を示 す。） で表されるペプチド断片を用いてもよい。
さらに、 「ダレリン誘導体」 としては、 上述のような態様のペプチド又はそ の薬学的に許容される塩のアミノ末端や力ルポキシル末端に修飾が施されて いてもよい。 具体的には、 上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許 容される塩の力ルポキシル末端に、 更に塩基性アミノ酸が結合していること が好ましい。 また、 上述のような態様のペプチド又はその薬学的に許容され る塩のアミノ末端が炭素数 1以上の飽和あるいは不飽和アルキル基又はァシ ル基により修飾され及び Z又は力ルポキシル末端の力ルポキシル基の OHが OZ又は NR 2 R 3 (Zは薬学的に許容し得る陽イオン又は低級の分枝鎖又 は非分枝鎖アルキル基、 2及び1 3は、 水素原子及び低級（d 6) の分枝 鎖又は直鎖アルキル基からなる群から選択される互いに同一又は異なる基を 示す） に変換されていることが好ましい。 さらには、 これらの修飾が組み合 わされていてもよい。 本発明にかかる修飾ペプチド又は蛋白質を製造する方法は、 （a )修飾をう けたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護べプチド断片を、 弱酸性離脱 樹脂を用いて製造し、 また （b ) 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含 まない保護ペプチド断片を、 前記 （a ) の保護ペプチド断片とは別個に製造 し、 前記 （a ) 及び （b ) で製造された保護ペプチド断片を縮合するという 3工程からなることを特徴とする。
以下に、 修飾ペプチド又は蛋白質の製造における各工程についてより具体 的に述べる。
本発明の製造方法によって得られる修飾ペプチド又は蛋白質、 又はそれら の断片はペプチド性のものであるので、 自体公知のペプチド合成法によって 合成することができる。 ここで、 修飾ペプチドもしくは蛋白質、 又はそれら の断片とは、 これらの反応性官能基が保護基で保護された化合物も含む。 ぺ プチドの合成方法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによ つても良い。 即ち、 粗修飾ペプチドもしくは蛋白質、 又はそれらの断片を構 成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合させ、 生成物が 保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的のぺプチドを製造す ることができる。 公知の縮合方法や保護基の脱離方法としては、 例えば、 以 下の文献 1〜 3に記載された方法が挙げられる。
1 . 泉屋信夫他 「ペプチド合成の基礎と実験」 丸善株式会社発行 （1985年） 2 . 矢島治明及び榊原俊平「生化学実験講座 1、蛋白質の化学 IV」 日本生化 学会編、 東京化学同人発行 （1977年）
3 . 矢島治明監修 「続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成」 廣川書店発 行
修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護べプチド断片を製 造する工程は、 弱酸性離脱樹脂上でペプチド鎖を延長する固相化学合成を用 いることを特徴とする。 より具体的には、 弱酸性離脱樹脂を用い、 《—アミ ノ基と側鎖における、 ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起 する可能性を有する反応性官能基を適当に保護したアミノ酸又は非アミノ酸 を、目的とするペプチド断片の配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、 弱酸性離脱樹脂上で縮合させ、 作製された保護べプチド断片を保護基を脱離 させることなく弱酸性離脱樹脂から離脱させることにより、 目的とする保護 ぺプチド断片を得ることができる。
上記弱酸性離脱樹脂とは、 ペプチド合成に用いられる樹脂であって、 樹脂 上に作製されたべプチド断片を弱酸性条件で樹脂から離脱させることができ る樹脂をいう。 例えば、 弱酸性離脱樹脂としては、 酢酸、 トリフルォロ酢酸 もしくはギ酸などのカルボン酸類、 およびトリフルォロェタノ一ルもしくは へキサフルォロイソプロパノールなどのフッ素化アルコ一ル類からなる群か らなる 1以上の化合物を含む溶液中で、 樹脂上に作製されたペプチド断片を 樹脂から離脱させることができる樹脂が好ましい。 より具体的には、 弱酸性 離脱樹脂としては、 例えば、 2—クロロトリチル樹脂、 トリチル樹脂、 4— メチルトリチル樹脂、 4ーメトキシトリチル樹脂、 Rink Amide Bar 1 os樹脂等 のトリチル系樹脂や、 Sieber Amide樹脂等を挙げることができる。
ーァミノ基と側鎖における反応性官能基（以下単に、側鎖官能基という。） の保護基としては、 特に限定されない。 例えば、 《—ァミノ基の保護基と しては、 t一ブトキシカルボニル （Boc)、 トリクロ口ェチルォキシ力ルポ二 ル、 tーァミルォキシカルボニル、 9 _フルォレニルメトキシカルポニル (Fmoc)、 メチルスルホニルエトキシカルポニル、 トリクロ口エトキシカルボ ニル、 2— (トリメチルシリル) エトキシカルポニルもしくはピリジン一 4 ーメトキシカルポニル等の置換基を有していてもよいアルコキシカルポニル ニル等の置換基を有していてもよいシクロアルキルォキシカルボニル基；ベ ンジルォキシカルポニル （Z )、 p—メトキシベンジルォキシカルポニル （p MZ)、 p—クロ口べンジルォキシカルポニル （C l—Z)、 p—ブロモベン ジルォキシカルポニル （B r— Z)、 p—二トロベンジルォキシカルポニル、 ァダマンチルォキシカルポニル、 2—フエニルイソプロピルォキシ力ルポ二 ル、 p—メチルフエニルイソプロピルォキシ力ルポニル、 ρ—ビフエ二ルイ ソプロピルォキシカルボニル、 3, 5—ジメトキシー《， ひ一ジメチルペン ジルォキシカルポニル等の置換基を有していてもよいァラルキルォキシカル ポニル基；ベンジル （Bz 1)、 ベンズヒドリル、 トリチル等の置換基を有し ていてもよいァラルキル基；トリフルォロアセチル、フタロイル、ホルミル、 ベンゼンスルホニル、 -トルエンスルホニル (Ts)、 o—ニトロフエニル スルフエニル、 2， 4ージニトロフエニルスルフエニル、 3—二トロ— 2— ピリジルスルフエ二ル等の置換基を有していてもよいァシル基；ジチアスク シノィル、 2一二トロフエ二ルチオ、 ジフエニルホスフィニル、 ジフエニル ホスフイノチオイル、 ジメチルホスフィノチオイル等が挙げられる。
セリン等の水酸基は、例えば、 ァセチル基等の低級（C^ 6) アルカノィル 基、 ベンゾィル基等のァロイル基、 ベンジルォキシカルボニル基、 エトキシ 力ルポニル基等の炭酸から誘導される基等で保護できる。
アルギニンのグァニジノ基は、 例えば、 ニトロ基、 Z基、 Ts基、 p—メ トキシベンゼンスルホニル基 （Mb s)、 4—メトキシ— 2， 6—ジメチルべ ンゼンスルホニル基 （Md s；)、 4ーメトキシー 2， 3， 6—トリメチルベン ゼンスルホニル基（M t r)、 メシチレン— 2—スルホニル基（M t s)、 2, 3， 4, 5, 6—ペンタメチルベンゼンスルホニル基 （Pme；)、 2, 4, 6 一卜リメトキシベンゼンスルホニル基 （M t b)、 2, 2, 5， 7, 8—ペン タメチルクロマン一 6—スルホニル基 （Pmc)、 2, 2, 4, 6, 7—ペン タメチル—ジヒドロべンゾフラン—5—スルホニル基 （Pb f) 等で保護で きる。
また、 システィンのメルカプト基は、 例えば、 トリチル基、 ァセトアミド メチル （A cm) 基、 t e r t—ブチル基、 ベンジル基、 p—メチルベンジ ル基、 p—メトキシベンジル基、 3—二トロー 2—ピリジンスルフエニル基、 プチルチオ基等で保護できる。
ヒスチジンのイミダゾリル基の保護基としては、 例えば、 Boc基、 トリ チル （Tr t) 基、 Ts基、 4ーメトキシー 2, 3， 6—トリメチルベンゼ ンスルホニル基、 2, 4—ジニトロフエノール （DNP) 基、 ベンジルォキ シメチル （Bom) 基、 t—ブトキシメチル （Bum) 基、 Fmoc基等が 用いられる。
また、 トリブトファンのインドリル基は、例えば、 ホルミル基、 Z基、 2， 4ージクロ口べンジルォキシカルポニル基、 トリクロロェチルォキシカルボ ニル基、 4—メトキシ— 2, 3， 6—トリメチルベンゼンスルホニル基、 2, 4, 6—トリメトキシベンゼンスルホニル基等で保護できる。
固相合成法による縮合反応は、 上述の弱酸性離脱樹脂にアミノ酸を 1個ず つ順次縮合させる逐次延長法、 2個以上のアミノ酸で構成されたペプチド断 片を縮合させる断片縮合法やこれらの方法を組み合わせた方法の何れの方法 で行ってもよい。 前記 2個以上のアミノ酸で構成されたペプチド断片は、 各 アミノ酸から慣用の液相法、 固相法等により製造することができる。
まず、 上記のような α—アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸 又は非アミノ酸 （以下、 特に断りのない限り、 保護アミノ酸と略称する。） を 活性化し、弱酸性離脱樹脂に活性化された保護アミノ酸を縮合する。その際、 保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒としては、 ペプチド 縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例え ば、 Ν， Ν—ジメチルホルムアミド、 Ν, Ν—ジメチルァセトアミド、 Ν— メチルピロリドン等の酸アミド類；塩化メチレン、 クロ口ホルム等のハロゲ ン化炭化水素類； トリフルォロエタノール、 フエノール等のアルコール類； ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類； ピリジン， ジォキサン， テトラ ヒドロフラン等のエーテル類；ァセトニトリル， プロピオ二トリル等の二卜 リル類；酢酸メチル， 酢酸ェチル等のエステル類又はこれらの適宜の混合物 等が用いられる。 反応温度はペプチド結合形成反応の反応温度と同一であつ てよく、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °C程度の範囲から適宜選択される。 活性化さ れた保護アミノ酸は通常 1〜4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用 いたテストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮 合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行うことができる。 反応を繰り返 しても十分な縮合が得られないときには、 無水酢酸又はァセチルイミダゾ一 ルを用いて未反応保護ァミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に 影響を与えないようにすることができる。
ついで、 弱酸性離脱樹脂に縮合された保護アミノ酸に、 所望の配列どおり に、 保護アミノ酸を縮合させていく。 各保護アミノ酸の縮合反応は、 慣用の 方法、 例えば、 C端活性化法、 カップリング試薬を用いるカップリング法等 により行うことができる。 C端活性化法には、 活性エステル法、 対称酸無水 物法等が含まれる。 前記活性エステル法で用いる活性エステルとしては、 例 えば、シァノメチルエステル等のアルキルエステル；チォフエニルエステル、 p—ニトロチォフエニルエステル、 p—メタンスルホニルフエニルエステル、 p—二トロフエニルエステル、 2， 4—ジニトロフェニルエステル、 2 , 4， 6―トリクロ口フエニルエステル、 ペンタクロロフェニルエステル等のフエ ニルエステル; 1ーヒドロキシスクシンイミド (H〇S u)、 N—ヒドロキシ フタル酸イミドエステル、 N—ヒドロキシ一 5—ノルポルネン一 2 , 3—ジ カルボン酸イミド （HO N B ) 等のジカルボン酸イミドエステル； 8—ヒド 口キノリンエステル、 N—ヒドロキシピペリジンエステル、 2—ヒドロキシ ピリジンエステル等のヒドロキシルァミン誘導体等が挙げられる。
上記カップリング試薬を用いるカップリング法としては、 例えば、 ジシク 口へキシルカルポジイミド (D C C)、 水溶性カルポジイミド (WS C) 等を 用いるカルポジイミド法； DC C—アディティブ法；カルボニルジイミダゾ —ル （CD I) 法；ウッドワード （Woodward) 反応剤 （N—ェチル— 5—フ ェニルイソォキサゾリゥム— 3' —スルホン酸塩） もしくは N—ェチルー 2' ―ヒドロキシベンズィソォキサゾリゥムトリフルォロホウ酸塩等のィソォキ サゾリウム塩、 1一エトキシカルボニル— 2—エトキシー 1， 2—ジヒドロ キシキノリン（EEDQ)、 1—エトキシカルポ二ルー 2—イソブトキシ— 1， 2—ジヒドロキシキノリン（I IDQ)、 ベンゾトリアゾ一ルー 1ーィルーォ キシートリス (ジメチルァミノ) —フォスホニゥムへキサフルオロフォスフ エート （BOP)、 O—べンゾトリァゾ一ルー N, N, N ' , N '—テトラメ チルーゥロニゥム一へキサフルオロフォスフェート （HBTU)、 O—べンゾ トリァゾ一ル— N， N， N '， N '—テトラメチルーゥロニゥムーテトラフ ルォロボレート （TBTU)、 ジフエ二ルホスホリルアジド （DPPA) を用 いる方法等が例示される。
上記カルポジイミド法で用いられる水溶性カルポジイミド（WS C)には、 例えば、 EDC (1—ェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル）カルポジ イミド）、 N—シクロへキシル—N' —モルホリノェチルカルポジイミド、 N ーシクロへキシル—N' - (N, N—ジェチルァミノ） シクロへキシルカル ポジイミド等が含まれる。 水溶性カルポジイミドは、 塩酸塩等の塩であって ちょい。
また、 上記 DC C—アディティブ法には、 例えば、 DCC— HOSu法、 DCC-HOB t (ユーヒドロキシベンゾトリァゾ一ル） 法、 DCC— H〇 NB法、 DCC— 2—ヒドロキシイミノー 2—シァノ酢酸ェチルエステル法、 WSC— HOSu法、 WSC— H〇B t法等が含まれる。
好ましい縮合反応には、 カルポジイミド法、 活性エステル法、 DCC—ァ ディティブ法が含まれる。 さらに好ましい縮合反応には、 ラセミ化を抑制す る方法、 例えば、 活性エステル法、 DC C—アディティブ法 (例えば、 DC C— HO B t法、 D C C—HO S u法、 WS C—HO S u法、 WS C— H〇 B t法等） 等が含まれる。 目的とする保護べプチド断片には、 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸 を 1以上含む。 ペプチド鎖に修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を挿入す る方法としては、 下記 2通りの方法が挙げられる。
第一の方法としては、 所望のアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖を特異的に予 め修飾しておき、 かかるアミノ酸又は非アミノ酸 （以下、 残基特異的に修飾 されたアミノ酸又は非アミノ酸という。） を、 ペプチド鎖の伸長段階で導入す るという方法が挙げられる。 より具体的には、 残基特異的に修飾されたアミ ノ酸又は非アミノ酸 （これらの aァミノ基に保護基を付した化合物を含む） は、 自体公知の合成方法によって合成することができる。 例えば、 エステル 化反応、 アミド化反応、 エーテル化反応、 ァシル化反応、 アルキル化反応な どが挙げられ、 これらは当業者に周知の方法により行われ得る。 さらに、 こ れを前述した縮合反応のいずれかによりペプチド鎖に導入することができる。 この場合、 その弱酸性離脱樹脂からの保護ペプチド断片の脱離は後述する条 件から適宜選択されるが、 好ましくは目的とする残基特異的に修飾されたァ ミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の置換基 Rを脱離させない条件から適宜選択さ れることが好ましい。
第二の方法としては、 アミノ酸又は/及び非アミノ酸からなる所望の配列 を有するペプチド断片を上記方法により作製し、 その後、 所望のアミノ酸又 は非アミノ酸の側鎖を特異的に修飾する （以下、 残基特異的修飾という。） と いう方法が挙げられる。 前記の残基特異的修飾の方法は特に限定されず、 公 知の方法を用いてよい。 例えば、 エステル化反応、 アミド化反応、 エーテル 化反応、 ァシル化反応、 アルキル化反応などが挙げられ、 これらは当業者に 周知の方法により行われ得る。 さらに、 リン酸化修飾する方法としては、 Tet rahedron Let ter, 41巻， p. 4457-4461， 2000年、 Biopolymers, 60巻, . 3-31, 2001 年等が挙げられる。 また、 糖修飾する方法としては Int . J. Pept i de Protein Res. , 42巻， . 165-170, 1993年、 Sc ience, 291巻, . 2344-2350, 2001 年、 Sc i ence, 291巻， . 2357-2364, 2001年等が挙げられる。
かかる方法は、 下記 2通りの塲合に分けられる。 即ち、 残基特異的修飾を 施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の官能基が保護基により保護されている 場合、 かかる保護基の脱保護の際に同時に保護べプチド断片が樹脂から離脱 してしまう場合と、 かかる保護基の脱保護の際には保護べプチド断片は樹脂 から離脱しない場合とに大別される。 前者の場合、 C末端の力ルポキシル基 を保護基により保護した後、 自体公知の合成方法により残基特異的修飾を施 し、 その後、 C末端の力ルポキシル基を後述する方法から適宜選択して脱保 護することにより目的のペプチド断片を得ることができる。 また、 後者の場 合、 樹脂上で自体公知の合成法により残基特異的修飾を施すことができ、 そ の後、 目的のペプチド断片を、 後述する方法から適宜選択して樹脂から離脱 すればよい。
本発明においては、 アミノ酸又はノ及び非アミノ酸からなる所望の配列を 有するペプチド断片を上記方法により作製し、 その後、 残基特異的修飾を施 すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の反応性官能基が保護基により保護されて いる場合は、 その保護基を脱保護し、 樹脂上で自体公知の合成法により残基 特異的修飾を施し、 ついで、 後述する弱酸性離脱樹脂からの保護ペプチド断 片の離脱、 及び所望により各保護基の脱保護を行うという方法が最も好まし い。
上記方法において、 残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の保護 基としては、 かかる保護基を脱保護する際に保護べプチド断片が樹脂から離 脱しないものであれば特に限定されないが、 好ましくは t—プチルジメチル シリル基、 t一プチルジフエニルシリル基等のシリル基等が挙げられる。 こ のような保護基を脱保護する際は、保護べプチド断片が樹脂から離脱されず、 かつ、 残基特異的修飾を施すアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基 を特異的に脱保護することができる試薬を用いる。 かかる試薬は、 弱酸性離 脱樹脂及び前記保護基の種類に応じて適宜選択されるが、 前記保護基がシリ ル基である場合は、 フッ化四級アンモニゥムを用いることが好ましく、 テト ラブチルアンモニゥムフルオリド（T B A F )を用いることがより好ましい。 上記のように保護基を選択すると、 ぺプチド伸長の縮合のため N末端アミ ノ基を脱保護する際に、 各保護アミノ酸の側鎖官能基の保護基及び弱酸性離 脱樹脂から保護ペプチド断片が脱離せず、 また、 得られたペプチド一樹脂結 合体から弱酸性離脱樹脂を脱離する際に、 各アミノ酸残基の側鎖官能基の保 護基が脱離しない。 しかも、 このことに起因して、 副反応物の生成を抑制す ることができる。 そのため、 側鎖官能基が保護基により保護されたペプチド 断片を、 高い純度で収率よくしかも簡易に得ることができる。 このペプチド 断片は、 側鎖官能基が保護されているので、 新たに保護基を導入する必要が なく、 次工程において、 液相法により目的とする修飾ペプチド又は蛋白質を 製造する際の原料として、 好適に使用することができる。 最後に、 作製された保護べプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させる。 このとき、 保護ペプチド断片における保護基、 即ち、 アミノ酸又は非ァミノ 酸の側鎖官能基の保護基が脱保護されない弱酸性条件で行う。 弱酸性条件と は、 例えば、 酢酸、 トリフルォロ酢酸もしくはギ酸などのカルボン酸類、 お よび Zまたはトリフルォロェタノ一ルもしくはへキサフルォロイソプロパノ
—ルなどのフッ素化アルコール類を含む溶液中に、 弱酸性離脱樹脂を懸濁さ せた条件が挙げられる。 具体的には、 上記溶液中で、 所望時間、 好ましくは 5分〜 4時間程度、より好ましくは 1 0分〜 2時間程度攪拌することにより、 作製された保護べプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることができる。 より具体的には、 例えば、 Barlos らの方法 (Tetrahedron Lett, Vol.30, p.3947, 1989) 等に記載されている公知の方法、 例えば、 0.5%トリフルォロ酢 酸/ジクロロメタン、あるいは酢酸/トリフルォロエタノール/ジクロロメタン = 1/2/7、 あるいは酢酸/トリフルォロエタノール/ジクロロメタン =2/2/6等 の溶媒に懸濁させる方法に従えばよい。
本発明においては、 ぺプチド鎖に修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 挿入することなく、 保護ペプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させ、 つい で所望のアミノ酸残基に残基特異的修飾を施すことによつても、 修飾をうけ たアミノ酸又は非アミノ酸を含むぺプチド断片を製造することができる。 残 基特異的修飾の方法は、 上記と同一である。 以上述べてきた製造方法は、 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以 上含む保護ペプチド断片であれば、 特に制限なく適用されうる。 中でも、 下 記式 9で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護 ペプチド断片又はその塩の作製に、 上記方法を用いるのが好ましい。
即ち、 式 9 ; (R1) n-G 1 y-S e r (XI) —A (R) 一 Phe— L e u-S e r (X2) —P r o— OR2
(式中、 一 A (R) —は、 上記修飾を受けたアミノ酸又は非ァミノ化合物で ある。 なかでも、 Aは、 セリン、 スレオニン、 システィン、 ホモシスティン、 リジン、オル二チン、 グルタミン酸、 2—ァミノアジピン酸、 ジァミノ酢酸、 2—ァミノマロン酸、ァスパラギン酸、チロシン、ァスパラギンが好ましく、 Rは、 ァシル基、 糖、 リン酸基、 硫酸基、 アルキル基、 ァラルキル基、 ァロ ィル基等の修飾基が好ましく、 Rが Aの側鎖の反応性置換基にエステル結合、 エーテル結合、 チォエーテル結合、 ジスルフイド結合、 アミド結合、 〇ーグ リコシド結合又は N—ダリコシド結合を介して結合していることが好ましい。
R 1は、 t一ブトキシカルボニル（B o c)、 トリクロ口ェチルォキシカル ポニル、 t—アミルォキシカルポニル、 9一フルォレニルメ卜キシカルポ二 ル （Fm o c )、 メチルスルホニルエトキシカルポニル、 トリクロ口エトキシ 力ルポニル、 2— (トリメチルシリル） エトキシカルポニルもしくはピリジ ンー 4ーメトキシカルボニル等の置換基を有していてもよいアルコキシカル ポニル基；シクロべプチルォキシカルポニル、 シクロへキシルォキシカルボ ニル等の置換基を有していてもよいシクロアルキルォキシ力ルポニル基；ベ ンジルォキシカルポニル （Z )、 p—メトキシベンジルォキシカルポニル （p M Z )、 p—クロ口べンジルォキシカルボニル （C l—Z )、 p _ブロモベン ジルォキシカルポニル （B r— Z )、 p—二ト口ベンジルォキシカルポニル、 7ダマンチルォキシカルポニル、 2 _フエニルイソプロピルォキシ力ルポ二 ル、 p—メチルフエニルイソプロピルォキシ力ルポニル、 p—ビフエ二ルイ ソプロピルォキシ力ルポニル、 3， 5ージメトキシ一 α， α—ジメチルベン ジルォキシカルボニル等の置換基を有していてもよいァラルキルォキシカル ポニル基；ベンジル （Β ζ 1 )、 ベンズヒドリル、 トリチル等の置換基を有し ていてもよいァラルキル基;トリフルォロアセチル、フタロイル、ホルミル、 ベンゼンスルホニル、 ρ—トルエンスルホニル (T s )、 ο -二トロフエニル スルフエニル、 2， 4—ジニトロフエニルスルフエ二ル、 3—二トロー 2— ピリジルスルフエニル等の置換基を有していてもよいァシル基；ジチアスク シノィル、 2—二トロフエ二ルチオ、 ジフエニルホスフィニル、 ジフエ二ル ホスフイノチオイル、 ジメチルホスフィノチオイルを示し、
ηは、 1もしくは 2であり、
X 1及び X 2は、 セリン側鎖の水酸基の保護基を示し、 ァセチル基等の低 級 （C ^ 6 ) アルカノィル基；ベンゾィル基等のァロイル基；ベンジルォキ シカルポニル基もしくはエトキシカルボニル基等の炭酸から誘導される基を 示すか、 又は、 側鎖に上述の置換記 Rをエーテル結合を介して結合させると いうエーテル化に適する基として、 例えば、 t—ブチル基、 ベンジル基、 テ トラヒドロピラニル基、 トリチル基、 t—プチルジメチルシリル基等のシリ リレ基を示し、
R 2は、 保護基又は保護基が無いことを示し、 保護基がある場合は、 アル キルエステル基 (例えば、 メチルェズテル、 ェチルエステル、 プロピルエス テル、 ブチルエステル、 t一ブチルエステル、 シクロペンチルエステル、 シ クロへキシルエステル、シクロへプチルエステル、シクロォクチルエステル、 2—ァダマンチルエステル等の直鎖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステ ル基）、 ァラルキルエステル基 (例えば、 ベンジルエステル、 4 _ニトロベン ジルエステル、 4ーメトキシベンジルエステル、 4 _クロ口べンジルエステ ル、 ベンズヒドリルエステル基）、 フエナシルエステル基、 ベンジルォキシカ ルポニルヒドラジド基、 t—ブトキシカルポニルヒドラジド基、 トリチルヒ ドラジド基を示す。）
で表されるペプチド又はその塩等である。
式 9中、 1^ 1は8 0じ基、 Z基、 p M Z基又は F m o c基が好ましく、 X 1及び X 2で表される保護基としては、 好ましくは t一プチル基又は 3 4ベ ンジル基、 さらに好ましくは t—ブチル基が挙げられる。 R 2は、 水素ある いはチォエステル基が好ましい。
さらに、以上述べてきた製造方法は、 ダレリン、好ましくはヒト、 ラット、 マウス、 ブ夕、 ニヮトリ、 ゥナギ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 力エル、 ニジマス もしくはィヌのダレリン、 又はダレリン誘導体を製造する際に好適に用いら れる。 また、 前記ダレリン又はダレリン誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸 又は非アミノ酸を含む部分を製造する際にも好適に用いられる。 前記各生物 のダレリンの構造は、 第 1表に記載している。
より具体的には、 （ a )配列番号 1〜 2 1のいずれかに記載のァミノ酸配列 において、 少なくとも N末端の 1番目から 4番目のアミノ酸配列を有し、 好 ましくは当該アミノ酸配列において N末端の 1番目から 5番目のアミノ酸配 列からなるか、 又は当該アミノ酸配列において N末端の 1番目から 7番目の アミノ酸配列からなり、 （b ) N末端から 3番目のセリン又はスレオニンの側 鎖の水酸基が、 ァシル化、 好ましくは飽和又は不飽和の炭素数 2〜3 5、 好 ましくは 6〜1 8のアルキル基によりァシル化されており、 （c ) アミノ酸の 側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インド リル基、 メルカプト基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上 の、 ペプチド断片作製に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有す る反応性官能基、 好ましくは水酸基及びアミノ基が保護基により保護されて いるペプチド断片の製造に、 以上述べて た製造方法は有用である。 本発明においては、 修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護 ぺプチド断片を、 前記修飾を受けたアミノ酸又は非アミノ酸を含む保護ぺプ チド断片とは別個に製造する。
本発明におけるペプチド又は蛋白質の、 ァシル化、 糖化、 リン酸化等の修 飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないぺプチド断片は、 自体公 知の遺伝子組換法もしくは酵素法により製造することができる。 例えば、 前 記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド （以下、 目的ペプチドとい う。）をコードする塩基配列を有する発現べクタ一により形質転換された細胞 を培養して、 当該培養物から目的ペプチドを採取する工程、 及び前記工程で 得られた目的べプチドの側鎖官能基のうち、 望ましくない副反応を惹起する 可能性を有する官能基を保護基により保護する工程を含む方法により製造す ることができる。 発現ベクターの作製方法は、 当技術分野における常法に従 つて行うことができる。 発現ベクター作製の際には、 目的ペプチドの高発現 に必要なその他の要素、 例えばプロモーター、 夕一ミネ一ター、 スプライス 部位等についても従来の方法において既に知られているものを適宜用いるこ とができる。 前記発現ベクターにより形質転換される宿主細胞も特に限定さ P 漏裏 590
43 れるものではなく、 従来の方法において既に用いられている原核細胞又は真 核細胞、 例えは大腸菌等の微生物細胞、 酵母又は動物細胞等から、 目的ぺプ チドをコ一ドする塩基配列が好適に発現できるものを適宜選択して用いるこ とができる。 目的ペプチドの側鎖官能基の保護も、 上述と同一の方法で行え ばよい。
修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないぺプチド断片は、 工程 （1 ) ； ( a ) 目的ペプチドに所望によりリンカ一配列を介して保護ぺプ チドが付加されている融合蛋白質をコードする塩基配列を有する発現べクタ 一により形質転換された細胞を培養して、 当該培養物から前記融合蛋白質を 採取する工程；
工程 （2 )；工程 （1 ) において得られた融合蛋白質から、 保護ペプチド及び 所望によりリンカ一配列と目的べプチドと切断分離し、 所望によりさらに精 製する工程；
工程 （3 )； ( 2 ) で得られた目的ペプチドの側鎖官能基のうち、 望ましくな い副反応を惹起する可能性を有する官能基を保護基により保護する工程； を含む方法により製造することもできる。
保護べプチドは、 目的べプチドが宿主細胞内で酵素により分解されるのを 抑制する目的で用いられるものであり、 当該目的を達成できるものであれば 特に限定されないが、 大腸菌由来の 3—ガラクトシダーゼに係るアミノ酸配 列を有するフラグメントを用いることができる。 当該酵素に係るアミノ酸配 列は当業者にとって公知であり、 i3—ガラクトシダーゼ由来のペプチドフラ グメントは広く当業者により融合蛋白法における保護ペプチドとして用いら れている。
リンカ一配列は、 工程 （2 ) において保護ペプチドと目的ペプチドとの切 断分離に適した酵素がない等、 保護べプチドと目的べプチドとの切断分離が うまくいかない場合、 保護べプチドと目的べプチドとの間に挿入される配列 である。 従って、 工程 （2) においてリンカ一配列と目的ペプチドとの切断 分離がうまくいくように、 その配列を適宜選択することができる。
保護べプチド及び所望によりリンカ一配列と目的べプチドと切断分離は、 酵素的又は Z及び化学的な方法で行うことができる。
酵素的及び化学的な切断方法としては Methods in ENZYMOLOGY, 185巻， Gene Expression Technology (David V. Goeddel編集、 出版社 ACADEMIC PRESS, INC) に記載されている方法も用いることができる。
化学的切断方法としては、 メチォニンの C末端側をブロムシアンで切断す る方法（D.V. Goeddel et al, Proc. Natl. Acad.Sci. USA, Vol.76, pl06-110, 1979)、 -Asp-Pro-配列の間を蟻酸で切断する方法 (Biochem. Biophys. Res. Commun. , Vol.40, pll73, 1970)、 -Asn- Gly-配列の間をヒドロキシルァミン で切断する方法及びトリプシンの C末端側を BNPS-スカトール又は N-クロ口 スクシンイミドで切断する方法等が挙げられる。 例えば、 目的ペプチドに係 るアミノ酸配列中にメチォニンが含まれない場合は目的ペプチドに隣接する 切断部位領域の末端にメチォニンを導入し、 ブロムシアン処理により化学的 に切断部位領域での切断を行うことができる。
また、 酵素的切断方法としては、 切断処理に用いる酵素が基質として特異 的に認識することができる切断部位領域を設定すれば良く、 それらの例とし ては、 アルギニン一アルギニン、 リジン—リジン、 アルギニン—リジンおよ びリジン—アルギニンの塩基性アミノ酸対の中央のペプチド結合、 またはァ ルギニン一メチォニン、 アルギニン—ァラニンもしくはアルギニンーバリン のアミノ酸対の中央のぺプチド結合を大腸菌 Omp Tプロテアーゼ (Sugimura, K. and Nishihara, T. J. Bacteriol. 170: 5625-5632, 1988)で、 X-Gly 又は Pro- X- Gly- Pro 配列の -X-Gly-配列の間をコラゲナーゼ (Collagenase) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.81, p4692-4696, 1984) で、 -Asp-Asp_Asp-Lys-配列 （配列番号： 22) の Lysの C末端側をェンテロ P T/JP03/04590
45 キナ一ゼ (Enterokinase) で、 - lie- Glu_Gly- Arg-配列 (配列番号: 23) の Argの C末端側を血液凝固因子 Xa (blood coagulation Factor Xa) (特開昭 61-135591)で、 -Gly- Pro- Arg-配列の Argの C末端側をトロンピン（Thrombin) (特開昭 62-135500)で、 -Arg-の C末端側をトリプシン (Trypsin)又はクロ ストリパイン （Clostripain) で、 Arg又は Lysの C末端側をエンドプロテア —ゼ (endoprotease) Arg-C (Nature, Vol.285, p456-461, 1980)で、 Lys- Arg、 Arg- Arg 又は Pro- Arg 配列の C末端側をサッカロミセス ·セレピシェ (Saccharomyces cerevisiae) Kex2プロテアーゼ及ひその誘導体 (Biochem. Biophys. Res. Counun. , Vol.144, p807-814, 1987、 特開平 1-199578、 特開 平 10-229884) で、 Lys の C末端側をリシル エンドべプチダーゼ （lysl endopeptidase) 又はエンドべプチダ一ゼ (endopeptidase) Lys- C (特開昭 61-275222) で、 Asp又は Gluの C末端側をスタフイロコッカス ·ァウレウス
(S. aureus)V8プロテアーゼ (Proc.Natl. Acad. Sci.USA，Vol.69，p3506 - 3509, 1972) で、 -Phe- Arg-配列の C末端側をカリクレイン (Kallikrein) (特開昭 62-248489) で、 - Pro-Phe- His- Leu- Leu-Va卜 Tyr-配列 （配列番号： 24) の Leu-Leuの間をレニン (renin) で （特開昭 60- 262595)、 - Glu- Gly- Arg-配列 の C末端側をゥロキナーゼ （Urokinase) (特開平 2-100685) で、 Va卜 Asp- Asp- Asp-Asp- Lys配列（配列番号： 25) の C末端側をェンテロぺプ チダーゼ （entero- peptidase) (Biotechnology, Vol.6， pl204-1210, 1988) で、 poly- Giyの C末端側をリソス夕フィン（lysostaphin) (特開平卜 160496) で、 Lys- Arg， Arg-Arg又は Pro- Arg等の C末端側をクリベロミセス 'ラクチ ス (Kluverromyces lactls) (特開平 1-124390) で切断する方法等が挙けられ る。
本方法における発現べクタ一、 宿主細胞及び目的ペプチドの側鎖官能基の 保護については、 上記方法と同様である。
さらに、 遺伝子組換法もしくは酵素法を用いた修飾を受けたァミノ酸もし 細 90
46 くは非アミノ酸を含まないペプチド断片の製造方法は、 国際公開番号： W099/38984に記載されている方法を用いることもできる。 修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含まないペプチド断片が、 グ レリン及びダレリン誘導体の修飾を受けたアミノ酸もしくは非アミノ酸を含 まないペプチド断片 （以下、 ダレリン断片 （非修飾成分） という。） である場 合、 国際公開番号： W001/07475に、 遺伝子組換法及び酵素法による製造方法 が記載されている。
さらに、 国際公開番号： TO 00/52193 に記載されている Glucagon like peptide- 1 の生産で使用している保護たんぱく質及びリンカ一配列を適応さ せて、 OmpTプロテアーゼ又はその誘導体、 ならびに Ke X 2プロテア一 ゼ又はその誘導体による 2段階酵素法を用いてもグレリン断片（非修飾成分） を製造することができる。 この方法では宿主である大腸菌の内在性〇mp T プロテアーゼを活用することが可能なため、酵素を別途調製する必要がない。 前記 OmpTプロテア一ゼまたは Ke X 2プロテアーゼの誘導体としては、 OmpTプロテアーゼまたは Ke X 2プロテアーゼと同一の活性を有するも のであれば特に限定されない。 OmpTプロテア一ゼ誘導体としては大腸菌 の OmpPプロテアーゼ、 サルモレラの p g t Eプロテア一ゼに代表される 0即 tinファミリーに属する酵素や OmpTプロテアーゼの活性部位を含む部 分ペプチドなどが挙げられ、 Ke X 2プロテアーゼ誘導体としては、 特開平 10 - 229884に記載の誘導体および Fu r i n、 P C 1 /3に代表される K e x 2ファミリ一に属する酵素などが挙げられる。
本方法では、 実施例 13に示すように、 国際公開番号： W000/52193に記載 されているリンカー配列 EPHHHHPGGRQMHGYMDVRLYRRHHGSGSPSRHPR (配列番号 26) の代わりに、 当該配列における 35番目プロリン残基をアルギニン残 基に置換した配列 EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHRR (配列番号 27) をリンカ一配列として用いることにより、 Om p Tプロテア一ゼ及び K e X 2プロテア一ゼを使用した 2段階酵素処理法で、グレリン断片（非修飾成分)、 なかでもダレリン （8— 2 8 ) 断片、 特にヒトダレリン （8— 2 8 ) 断片を 効率よく得ることができる。 新たに見出された配列番号 2 7に記載のリンカ 一配列内には Om p Tプロテアーゼの切断認識部位以外にも別箇に切断認識 部位が生じるにもかかわらず、目的の部位でのみ正常に切断が起きている（実 施例 3参照)。
さらに、 保護ペプチド断片 （非修飾成分） を精製，保存する際に、 精製又 は保存に用いる溶液の p Hを 4一 8に調整することにより保護基の離脱を防 ぐことができる。 そして、 保護基の脱離を抑制することにより、 高回収率で 高純度の修飾べプチド又は蛋白質を調製することができる。 前記精製又は保 存に用いる溶液としては、 水溶液が好ましい。 具体的には、 水、 好ましくは 限外ろ過水、 酢酸ナトリウム溶液などが挙げられる。 水溶液中での保護ヒト ダレリン（ 8— 2 8 )断片の安定性を調べた実施例 1 5から明らかなように、 B O C基により保護されたペプチド断片は水溶液状態によってその安定性が 異なり、 特に p H 2以下の水溶液状態においては明らかな本保護基の離脱が 認められたことから、 保護基として B o c基を用いた場合は、 特に精製'保 存時の溶液の p Hを 4一 8の間に設定することが好ましい。 ついで、 本発明においては、 以上のようにして得られた （a ) 修飾をうけ たアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護ペプチド断片と、 （b )修飾をう けたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護ペプチド断片とを、 縮合し、 所 望により、 アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基の保護基を脱保護する。 上記縮合反応は、 液相法により行われることが好ましい。 また、 上記 （a ) 及び （b ) のペプチド断片を液相法により縮合する反応において、 前記ぺプ チド断片の各アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖官能基は、 通常、 保護基で保護 されている。 前記保護基としては、 各官能基の保護基として上記に例示した 保護基が挙げられる。 好ましい保護基としては、 前記 （a) 及び （b) の保 護べプチド断片の保護基を、 同様の脱離条件下で脱離することができる保護 基が挙げられる。 なお、 この場合には、 弱酸性離脱樹脂がすでに脱離してい るため弱酸性離脱樹脂の脱離条件を考慮する必要はなく、 また、 この場合の 側鎖官能基の保護基としては、 N末端アミノ基の脱離条件で脱離する保護基 がより好ましい。
前記 （a) 及び （b) の保護ペプチド断片を液相法により縮合する反応に おいて、 縮合に用いる試薬や条件等は上述のアミノ酸縮合反応において記載 したものから適宜選択される。 好ましくは、 ペプチド又は蛋白質のラセミ化 異性体等の不純物をより副生しにくい方法から選択される。 特に、 縮合に用 いる試薬 （縮合剤） としては、 例えば、 2— (1—ヒドロべンゾトリァゾ一 ルー 1一ィル） 一 1 , 1, 3, 3ーテトラメチルゥロニゥム へキサフルォ 口ホスフェート （HBTU)、 2一 (1—ヒドロべンゾトリァゾール— 1—ィ ル） 一 1, 1， 3， 3—テトラメチルゥロニゥム テトラフルォロボレ一ト (TBTU)、 ジフエニルホスホリルアジド （DPPA)、 ジフエニルホスホ ロシア二デート （DEPC)、 ジィソプロピルカルポジィミド (D I PC)、 ジシクロへキシルカルポジィミド (DCC) 又は 1一ェチル—3— (3—ジ メチルァミノプロピル) カルポジイミド (EDO 等が好適な例として挙げ られる。 中でも、 縮合剤が、 ジイソプロピルカルポジイミド （D I PC)、 ジ シクロへキシルカルポジイミド (DCC) 又は 1—ェチルー 3 - (3—ジメ チルァミノプロピル） カルポジイミド （EDC) であり、 前記縮合剤を用い るペプチド断片の縮合が、 1—ヒドロキシベンゾトリアゾール （HOB t)、 1—ヒドロキシスクシンイミド （HOSu) 又は 3， 4ージヒドロ— 3—ヒ ドロキシー 4_ォキソ一べンゾトリアジン （HOOB t) の存在下、 行われ ることがより好ましい。 縮合した反応生成物において、 アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖の保護基は 適宜脱保護することができる。 この場合における脱保護の試薬や条件等は、 好ましくは、 ペプチド又は蛋白質のラセミ化異性体等の不純物をより副生し にくい方法から選択される。
各保護基の脱離条件は、 例えば、 前記 「ペプチド合成の基礎と実験」 等に 記載されている公知の方法に従えばよい。 保護基の脱離方法には、 強酸、 弱 酸、 塩基、 還元試薬 （接触還元、 金属、 チオール等）、 酸化試薬、 親核試薬、 親電子試薬、 イオン、 電子、 光、 溶媒、 酵素等をそれぞれ利用する方法があ り、 前記保護基の選択には、 これらの脱離方法の脱離条件を考慮して行うこ とができる。
保護基の除去方法 （脱保護反応） としては、 例えば、 トリフルォロ酢酸、 酢酸、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 あるいはこれらの混合液等 （好ましくはトリフルォロ酢酸、 酢酸等） による 酸処理；ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピ ペラジン等による塩基処理； P d—炭素等の触媒の存在下での水素気流中で の接触還元；酢酸中亜鉛末処理 ( Z n /A c OH)；又は、 テトラプチルアン モニゥムフルオリド (T B A F) 処理等も用いられる。 上記の脱保護反応は 一般に約 4 0 °C以下の温度で行なわれるが、 好ましくは約 2 5 °C以下で行う ことにより、 保護べプチド断片のラセミ化異性体の副生を効果的に抑制する ことができる。 上記の脱保護反応の反応時間は通常約 0 . 5〜約 5時間であ る。
上記酸処理においては、例えば、水、 トリイソプロピルシラン（T I P S )、 フエノール、 ァニソール、 チオアニソ一ル、 メタクレゾール、 パラクレゾ一 ル、 ジメチルスルフィド、 1， 4一ブタンジチオール、 1， 2一エタンジチ オール等 （好ましくはフエノール等） のようなカチオン捕捉剤を添加するこ とが好ましい。また、ヒスチジンのイミダゾ一ル保護基として用いられる 2， 4ージニトロフエニル基はチオフエノール処理により除去され、 トリプトフ ァンのィンドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1 , 2—エタ ンジチオール、 1， 4一ブタンジオール等の存在下の酸処理による脱保護以 外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニア等によるアルカリ処理によつ ても除去される。
本発明により得られた反応生成物は、 例えば、 ゲル濾過法、 イオン交換ク 口マトグラフィ一、分配クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、 逆相高速液体ク口マトグラフィー、 電気泳動法等の慣用の分離精製手段によ り、 単離精製できる。 また、 精製する生成物は、 最終目的とする修飾された ペプチド又は蛋白質に限らず、 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 1以 上含む保護べプチド断片、 もしくは修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を 含まない保護ペプチド断片、 又はこれらの製造工程における中間体として得 られた生成物を、 上述の分離精製手段により適宜精製することができること は言うまでも無い。 以上のようにして、 修飾ペプチド又は蛋白質を製造することができる。 本 発明にかかる上記製造方法は、 修飾ペプチド又は蛋白質であれば、 特に制限 なく適用されうる。 中でも、 ダレリン、 好ましくはヒト、 ラット、 マウス、 ブタ、 ニヮトリ、 ゥナギ、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジ、 力エル、 ニジマス、 もしく はィヌのダレリン、 又はダレリン誘導体を製造する際に好適に用いられる。 なお、 前記各生物のダレリンの構造は、 第 1表に記載している。 本発明によ り得られるグレリン又はグレリン誘導体は、 従来の技術により得られるダレ リン又はダレリン誘導体に比べ、 不純物 （特にダレリン又はダレリン誘導体 のラセミ化異性体） の量が大幅に少ない極めて高品質のグレリン又はグレリ ン誘導体である。 その結果、 より簡便な精製方法により十分な精製を効果的 に行うことができ、 作業時間を短縮し、 高収率でダレリン又はダレリン誘導 体を製造することができる。 この点からも従来技術に比べ、 本発明の製造方 法はグレリン又はグレリン誘導体の工業的製造方法として極めて有利な方法 である。
上記 「高品質のダレリン又はダレリン誘導体」 としてより具体的には、 例 えば、 総類縁物質の含量が約 1 %以下 （好ましくは約 0 . 9 %以下、 より好 ましくは約 0 . 8 %以下、 更に好ましくは約 0 . 7 %以下） である精製ダレ リン又はダレリン誘導体又はその塩等が挙げられる。 ここで、 総類縁物質と は、 高速液体クロマトグラフィー等により検出される、 全ての不純物の合計 を意味し、不純物としては、ダレリン又はグレリン誘導体のラセミ化異性体、 高極性類縁物質、 その他の不純物が挙げられる。
本発明にかかる修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法の特に好ましい態様は、 以下の通りである。 すなわち、
工程 1； ( a )配列番号 1〜2 1のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 少なくとも N末端の 1番目から 4番目のアミノ酸配列を有し、 好ましくは当 該アミノ酸配列において N末端の 1番目から 5番目のアミノ酸配列からなる か、 又は当該アミノ酸配列において N末端の 1番目から 7番目のアミノ酸配 列からなり、 （b ) N末端から 3番目のセリン又はスレオニンの側鎖の水酸基 が、 ァシル化、 好ましくは飽和又は不飽和の炭素数 2〜 3 5、 好ましくは 6 〜1 8のアルキル基によりァシル化されており、 （c ) アミノ酸の側鎖におけ る、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メ ルカプ卜基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 ぺプチ ド断片作製及び下記工程 （4 ) におけるペプチド断片の縮合反応に際して望 ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、 好ましくは水酸 基及びアミノ基が保護基により保護されているぺプチド断片を、 弱酸性離脱 樹脂上で製造する工程、
工程（2 )；弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させるこ となく前記べプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させる工程、
工程 （3 )；配列番号 1〜2 1のいずれかに記載のアミノ酸配列において、 工程 （1 ) 及び （2 ) で作製されたペプチド断片が有するアミノ酸配列以外 のアミノ酸配列、 好ましくは当該アミノ酸配列において N末端の 6番目から 2 8番目のアミノ酸配列からなるか、 又は当該アミノ酸配列において N末端 の 8番目から 2 8番目のアミノ酸配列からなり、 かつ、 アミノ酸又は非アミ ノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基及びカルボキシル基からなる群から選ばれる 1 種以上の、 ペプチド断片作製及び下記工程 （4 ) におけるペプチド断片の縮 合反応に際して望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基、 好ましくは水酸基及びァミノ基が保護基により保護されているぺプチド断片 を製造する工程、
工程 （4 )；前記工程 （2 ) で製造されたペプチド断片と工程 （3 ) で製造 されたペプチド断片を縮合し、 ついで、 所望により反応性官能基の保護基を 脱保護する工程
を含む修飾べプチド又は蛋白質の製造方法である。
本発明にかかる方法により得られる修飾ペプチド又は蛋白質は、 反応条件 により、 遊離のペプチド又はその塩の形態で得られる。 遊離のペプチドとそ の塩は、 慣用の方法により相互に変換可能である。 遊離のペプチドを、 薬理 的に許容できる塩とする場合には、 例えば、 次記例示の無機酸、 有機酸等と 反応させればよい。 上記のペプチド又は蛋白質の塩としては、 薬理学的に許 容される塩が好ましく、 このような塩としては、 該ペプチド又は蛋白質がァ ミノ基等の塩基性基を有する場合、 無機酸 （無機の遊離酸とも称する） （例、 炭酸、 重炭酸、 塩酸、 硫酸、 硝酸、 ホウ酸等)、 有機酸 （有機の遊離酸とも称 する） （例、 コハク酸、 酢酸、 プロピオン酸、 トリフルォロ酢酸等） 等との塩 があげられる。 該ペプチド又は蛋白質がカルボキシル基等の酸性基を有する 場合、 無機塩基 （無機の遊離塩基とも称する） （例、 ナトリウム、 カリウム等 のアルカリ金属、 カルシウム、 マグネシウム等のアルカリ土類金属等） や有 機塩基 （有機の遊離塩基とも称する） （例、 トリェチルァミン等の有機アミン 類、 アルギニン等の塩基性アミノ酸類等） 等との塩があげられる。 また、 該 ペプチド又は蛋白質は金属錯体化合物 （例、 銅錯体、 亜鉛錯体等） を形成し ていてもよい。
本発明にかかる方法で製造される修飾ペプチド又は蛋白質は、 種々の用途 に利用することができる。 例えば、 上記の精製ダレリン又はダレリン誘導体 は、 低毒性であり、 哺乳動物 （例、 ヒト、 サル、 ィヌ、 ラット、 マウス） に 対して、 摂食障害治療薬、 成長ホルモン分泌促進薬、 心疾患治療薬、 胃機能 性疾患治療剤、腸管粘膜保護剤もしくは経静脈栄養時の小腸粘膜障害予防剤、 骨粗鬆症治療剤、 慢性疾患による悪液質の減少剤、 肺機能不全治療剤等の医 薬品として、 投与することができる。 また、 上記の精製ダレリン又はグレリ ン誘導体は、 必要に応じて糖衣を施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 徐放性製剤等として経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容 し得る液との無菌性溶液、 又は懸濁液剤、 徐放性製剤等の注射剤；溶液、 懸 濁液剤等の経鼻投与製剤；噴霧剤もしくは吸入剤等の経肺投与製剤；座剤の 形で非経口的に投与できる。 上記の精製グレリン又はグレリン誘導体を生理 学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、安定剤、 結合剤等とともに一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混 和することによって上記製剤を製造することができる。 実施例
本発明を以下の実施例で更に詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定さ れるものではない。 本実施例において用いた試験法と機器は、 特に記載しな い限り以下に記載のものを使用した。 〔主な略号〕
HBTU； 2 - (1H—ベンゾトリアゾ一ル— 1一ィル） 一 1， 1, 3, 3, - テ ト ラ メ チルゥ ロ ニゥム へキサフルォロホス フ ェイ ト ( 2-(lH-benzotriazole-l-yl)-l, 1, 3， 3,-tetramet yluronium hexaf luorophosphate) ，
DCC；ジシクロへキシルカルポジィミド （dicyclohexylcarbodiimide) , HOBt； 1ーヒドロキシベンゾトリアゾ一ル (1— hydroxybezotriazole) , HOOBt； 3—ヒドロキシ一 3, 4—ジヒドロー 4 _ォキソ一 1, 2, 3—ベン ゾトリアジン （3 - hydroxy - 3， 4 - dihydro - 4 - 0X0-1， 2， 3 - benzotriazine) ， TFA； トリフルォロ酢酸 (trifluoroacetic acid) ，
TIPS； 卜' Jイソプロピルシラン (triisopropylsilane) ，
DIPEA；ジイソプロピルェチルァミン (diisopropylethylamine) ，
TBAF;テトラプチルアンモニゥムフルオリ H (tetrabutylammonium fluoride),
TFE； トリフルォロエタノール (trifluoroethanol) ,
Fmoc；フルォレニルメトキシカルポニル (f luorenylmethoxycarbonyl) ， Boc； 一ブチルォキシカルポニル (/-butyloxycarbonyl) ,
tBu； t一ブチル （ -butyl) ,
TBDMS； —ブチル ジメチルシリル (/-butyl dimethylsilyl) ，
Trt； トリチル (trityl) ,
Pac；フエナシリレ （phenacyl) ,
DMF； N, N—ジメチルホルムアミド （N，N- dimethyl formamide) ，
DCM;ジクロロメタン (dichloromethane) ，
NMP； N—メチルピロリドン (N-methylpyrrolidone) ,
Et20；ジェチルエーテル （diethylether) ,
DMAP； 4—ジメチルァミノピリジン （4- dimethylaminopyridine) ，
EDC ; 1—ェチル— 3 ( 3ージメチルァミノプロピル) カルポジイミド ( l-ehtyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodi imide)
〔合成に使用した保護ァミノ酸と樹脂〕
Boc-Gly, Fmoc-Ser (TBDMS) , Fmoc-Ser (tBu) , Fraoc-Phe, Fmoc-Leu, Fmoc-Ser, Fmoc-Pro (以上、渡辺化学工業社製又はアプライドバイオシステム社製）， プ 口リル- 2-クロロトリチル樹脂 （ノババイオケム社製)。
〔使用機器〕
( a ) ペプチド自動合成機
アプライドバイオシステム社製： 4 3 3 A合成機
( b ) 分析用 H P L Cシステム
機器：島津 LC- 10Aシステム
カラム： YMC-Pack PROTEIN - RP 又は YMC-Pack ODS AP-302 又は YMC- Pack PROTEIN- C8 (全て 4. 6 ηιηιφ X 150 mm)
カラム温度： 40 °C
溶出液： 0. 1%トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル濃度を最高 100%まで直線 的に変化させた。
流速： 1 mL/分
検出： UV (210 nm又は 214nm)
注入量： 10〜50 L
( c ) 分取用クロマトシステム
機器 1 ： AKTA explorer 1 OS (アマシャムフアルマシア社製クロマトシステム） カラム SP- sepharose big beads (XK26/30) (アマシャムフアルマシア社製樹 脂）
内径 26mm x長さ 300腿
YMC-0DS 120 s50 (HR26/15) (YMC社製樹脂） 内径 26mm x長さ 15mm
Vydac C4 (HR10/30) (Vydac社）
内径 10mm x長さ 300匪
Source 30RPC (HR10/30) 23 mL (アマシャムフアルマシア社製樹脂） 内径 10蘭 X長さ 30mm
流速、 溶出液等の条件は別途実施例に記載した。
機器 2 ： Applied Biosysteni BioCAD perfusion Chromatography workstation カラム SP- Toyopearl 550- c (内径 16mm x 280匪 TOSOH社製）
YMC-0DS AM (粒径 20 m、 内径 21.5腿 x 300mm, YMC社製）
逆相クロマトカラム 0DS- 80Ts
(内径 21.5mm x 300匪カラム（108 mL) 粒径 20mn， T0S0H社製) 流速、 溶出液等の条件は別途実施例に示した。
(d) 分取用 HP LCシステム
機器： Waters 600 Multisolvent Delivery System
カラム： YMC- Pack ODS-A (5 I, 20腿 x 250匪）又は YMC- Pack PROTEIN- RP (5 m, C4, 20 mm x 250mm)
溶出液： 0.1%トリフルォロ酢酸中、 適宜ァセトニトリル濃度を最高 100%まで 直線的に変化させた。
流速： 10 mL/分
検出： 210 nm及び 260 nm
注入： 10〜2000 L、 2000 L以上はポンプにより注入
(e) 質量分析機
機器 1 ：フィニガン MAT TSQ700
イオン源： ESI
検出イオンモ一ド： positive
スプレー電圧： 4.5kV キヤビラリ一温度： 250°C
移動相： 0.2%酢酸 ·メタノール混液 （1 : 1)
流速： 0.2 mL/分
スキャン範囲： m/z 300〜1,500
機器 2 ： API3000(宝酒造）
検出イオンモード： positive mode
スキャンタイプ： Qlscan
流速： 0.3 mL/分
1 count/0.1msec during 5min chase
Molecular range 500~3000 Mass
(f) アミノ酸配列分析
機器：パーキンエルマ一社製 アプライドバイオシステム 477A型シークェ ンサ一
(g) アミノ酸組成分析
機器： 日立製作所製 L - 8500型アミノ酸分析機計
試料：封管中、 0.1 フエノールを含む 6M塩酸で 110°C、 2 時間加水分解した。
〔 Lys.6,i9,2o,24(Boc) ] ヒト由来ダレリン（8-28)の製造スケールと概要〕 以下、 実施例 2から実施例 8は最終精製品として 0.6 g 程度の [Lys1M9'20'24(Boc)]hGhrelin(8-28) (hGhrelinはヒト由来ダレリンを示す。 以 下も同様である。） とを得ることを目的とした培養及び精製結果である。大腸 菌に実施例 1に示す発現べクタ一を形質転換し、 同実施例に示すアミノ酸配 列を持つ融合蛋白質を発現させた。 培養は 2 L培養槽を用いた高密度培養で 行い、 封入体を回収した。 回収した封入体の半量を用いて精製を開始した。 OmpT反応 [0.9 Lスケール]、 陽イオン交換 SP- sepharose big beads [160 mL スケール]、 Boc化反応 [0.5Lスケール]、 逆相カラム YMC ODS-120 s50 [80 mLスケール]、 Kex2反応 [0. 3 Lスケール]はそれぞれ一回ずつ行い、 最終精 製の逆相カラム Vydac C4 [ 25 mLスケール]は 2回実施した。 最終精製工程の み直線濃度勾配による溶出で分画分析を実施した。 また、 脱溶媒にはエバポ レーターを、 濾過にはガラス繊維濾紙 （ワットマン社） を用いた減圧濾過を 実施した。 実施例 1 hGhrel in (8- 28)誘導体発現ベクター ρΙ Π 8_28oRRの構築
hGhrel inの cDNA遺伝子配列（Koj imaら、 Nature, 402巻， p. 656-660、 1999 年） に基づき、 全合成オリゴ DNA (フアルマシアバイオテック社）を用いてァ 二一リング法により hGhrel in (8-28)の DNA断片を得た。 アニーリングに用い た全合成ォリゴ DNAならびにァミノ酸配列を第 1図 Aに示す。
この DNA断片を大腸菌 j3 -ガラクトシダ一ゼ誘導体とヒト Glucagon l ike pept ide- 1 との融合蛋白質遺伝子を導入したプラスミド pGP117ompPR (国際公 開番号： W0 00/ 52193)に揷入するため、 pGP117ompPRを制限酵素 Sai l及び Sad Iで処理し、 ヒト Glucagon l ike pept ide- 1遺伝子を欠失させた DNA断片 を寒天ゲル電気泳動により調製した。さらにアル力リホスファタ一ゼ処理後、 先に Sac I I処理、 T4 DNAキナーゼ処理を施した hGhrel in (8- 28)誘導体遺伝子 断片と T4 DNAリガ一ゼにより連結させた。 連結したプラスミドを大腸菌 DH5 α株に形質転換し、 プラスミド pl l7 8-28oPR を得た。 当該プラスミドは hGhre l in (8-28) のアミノ酸配列と /3ガラクトシダ一ゼの部分断片 117アミ ノ酸残基を EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (配列番号 2 6 ) という アミノ酸配列を有するリンカ一配列で繋いだ融合蛋白質を発現する。
さらに、 このプラスミド pi 17 8-28oPRを铸型とし、 酵素として K0D plus ポリメラ一ゼ （東洋紡）、 プライマ一には以下の 2種のプライマ一
0RI-RR: GGTTCCGGATCCCCTTCTCGACATCGCCGGGAACAC (配列番号 2 8 )
SAL*R ： ATAAGTCGACTTATCGTGGCTGCAG (配列番号 2 9 ) 画細 90
59 を用い PCRを行い増幅断片を電気泳動ゲルから切り出した。 さらに、 これを 制限酵素 SalI、BamHIで処理した。先に P1178- 28oPRを同じく制限酵素 Sall、 BamHI処理し精製したものとこの断片とを T4 DNAリガーゼで連結させ、 連結 したプラスミドを大腸菌 DH5 株に形質転換し、 プラスミド ρ117 8- 28oRRを 得た。 当該プラスミドは hGhrelin (8-28) のアミノ酸配列と ]3—ガラクトシ ダ ー ゼ の 部 分 断 片 117 ア ミ ノ 酸 残 基 を EPHHHHPGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSP SRHRR (配列番号 2 7) というァミノ酸配 列を有するリンカー配列で繋いだ融合蛋白質を発現する。 発現する融合蛋白 質を以下第 1図 Bに示す。 実施例 2 大腸菌での組換え hGhrelin(8_28)融合蛋白質の発現と封入体回収 実施例 1で作成したプラスミド P1178-280RRを大腸菌 W3110株に形質転換 した大腸菌を用いて 3L培養槽にて 2Lの培養を実施した。 なおこの発現ブラ スミドは pBR322由来のプラスミドで lac promoterで発現誘導される。 また 薬剤耐性遺伝子としてテトラサイクリン耐性遺伝子を保持する。 前培養は LB brothにて 32 で 14時間振とう培養した。本培養には以下の組成の培地を使 用した。培地組成は 4g/L酵母エキス、 4g/L K2HP04、 4g/L KH2P04、 2.7g/L Na2HP04、 0.2g/LNH4CK 1.2g/L (NH4) 2S04、 2g/L MgS04 · 7 0、 40mg/LCaCl2、 40 mg/L FeS04 · 7H20 10 mg/L MnS04 · n 0、 10 mg/L A1C13 · 6H20、 4 mg/L CoCl2 · 6¾0、 2 mg/L ZnS0 · 7 0、 2 mg/L Na2Mo04 · 2H20、 1 mg/L CuCl2 · 2¾0、 0.5 mg/L ¾B04である。 炭素源としてはグルコースを最初培地中に 1 %添加して、 37°C で培養を開始した。 グルコースが枯渴した後、 グリセロールを添加して培養 を行った。 その後培養液を加圧式菌体破碎機 （マントンゴ一リン） にて菌体 を破砕し、 さらに遠心機にて約 80 gの封入体を回収した。 さらに、 この封入 体を脱イオン水 2 Lで再懸濁したのち、 遠心分離機で回収することで封入体 を洗浄した。 最終的に 0D6M値が 530である封入体懸濁液 200 mLを得た。 以下の実施例はこの封入体懸濁液の半分の量である 100 mLを用いて行った。 実施例 3 hGhrel in (8-28)融合蛋白質の内在性 OmpTプロテアーゼによるプロ 実施例 2で得られた封入体懸濁液を OD66Qの値が 100. 0になるように下記の 反応条件に示す添加物と脱イオン水で希釈し、以下の反応条件で OmpT反応を 実施した。
反応条件：
4M尿素、 20mM Tris-HCl Η 7. 4、 50mM NaCK 反応容量： 800 mL、 反応温度 32°C、 反応時間 40分
封入体を 1000D66D/ mLになるように 8M尿素 400 mLで溶解希釈し、 Tris- HC1、 NaClを上記の濃度になるように添加し、 脱イオン水で 800 mLになるようにメ スアップする。さらに pHを 7. 4に調整して反応を開始させた。反応開始 0分、 20分、 40分でサンプリングし HPLCにて分析を行い切断率が 80%を超えた 40 分で反応を停止させた。 反応停止は 5N NaOHにより pHl lまで上昇させて行つ た。 反応停止後、 低速遠心により残渣を除去し、 上清を得た。
[RHHGSGSPSRHRRl -hGhrel in (8-28)濃度： 2. 23 mg/ mL
溶液量： 800 mL
ペプチド含量： 1. 7 g
HPLC測定結果、 及び質量分析の結果、 正常にプロセシングが起きており、 [RHHGSGSPSRHRR] - hGhrel in (8- 28)が遊離していることが示された。 フィニガ ン MAT社の質量分析計 (TSQ- 700)で行つた ESI-MSでの測定値は 4078 (理論値； 4077)であった。 実施例 4 [RHHGSGSPSRHRR] - hGhreI in (8_28)の精製 （陽イオン交換による精 90
61
実施例 3で得られた 0即 Tプロテアーゼ反応液上清を陽イオンクロマトダラ フィ一により精製を行った。
方法：
使用カラム： SP-sepharose big beads (XK26/30) (160 mL)
(アマシャムフアルマシア社製樹脂） 内径 26腿 X長さ 300匪 平衡化、 洗浄液： 1. 5 M尿素， 50 mM NaHC03 pHl l
溶出液： 1. 5 M尿素，0. 5 M NaCl , 50 mM NaHC03 pHl l
初期化、 再生液： 0. 4M NaOH
流速： 10 raL/inin (2. 5cm/min)
操作：
初期化、 平衡化： 0. 4M NaOH2カラムポリュ一ム →脱イオン水 2カラムポ リューム ―平衡化液： 100% 3カラムポリュ一ム
サンプル負荷： サンプルを負荷し、 平衡化、 洗浄液で UVが下がってくるま で洗浄する （約 4カラムポリユーム程度）
溶出： 溶出液 100%のステップワイズで実施した。
結果：溶出液で得られたペプチドの純度は 9 0 %で、 工程回収率は 91. 6% であった。
CRHHGSGSPSRHRR] -hGhre 1 in (8-28)濃度： 4. 75 mg/inL
溶液量： 300 mL
ペプチド含量： 1. 43 g 実施例 5 [RHHGSGSPSRHRR] -hGhre 1 in (8-28)の Boc化
精製した [RHHGSGSPSRHRR] - hGhre 1 in (8-28)に Boc 基の付加反応を行い、 末端のひアミノ基及び配列中に含まれる Lys残基の側鎖のアミノ基を Boc基 により保護する。
方法：陽イオンクロマト溶出液 300 mL全量をガラスピーカーに移し、 50% ァ セトニトリルになるように等量 （300 mL) のァセトニトリルを加えた。 さら に攪拌しながら、 1Mの（Boc) 20 を [RHHGSGSPSRHRR] - hGhrel in (8- 28)内に存在 するひァミノ基とリジン残基側鎖の εァミノ基数 （計 5箇所） の 5倍モル量 にあたる 8. 8 mL (終濃度 20mM, 25当量） 加えた。 さらに pHが 9を下らないよ うに 5N NaOHで調整し、スターラーで攪拌しながら室温で 60分間反応させた。 反応効率の測定は HPLC分析及び分子量の測定によりモニタ一した。
反応終了後ただちにエバポレー夕一により脱溶媒を実施した。 脱溶媒後、 酢 酸にて pHを 5. 5にあわせて沈殿をガラス繊維濾紙（ヮットマン社）にて減圧濾 過を行った。. この工程により [N Boc， Lysl6'【9'20'24 (Boc) ] - [腿 GSGSPSRHRR] - hGhrel in (8- 28)を 1740 mg含む溶液、 580 mLを得た。
工程回収率： 116% (工程回収率が 100%より大きいのは、 Boc基付加によ り HPLCでの吸光度が上昇し、見かけの回収率が増加したためであると考えら れる。 ）
質量分析はフィニガン MAT社の質量分析計 （TSQ-700) を使用した。行った ESI-MSでの測定値は 4578 (理論値； 4577)であった。
Boc化前（測定分子量 =4077、理論上分子量 =4077) に比べ反応後では分子 量が 500多くなつたもの （測定分子量 =4578、 理論上分子量 =4577) が主に 見られた。 このピークは hGhrel in (8- 28)配列内のリジン残基側鎖に存在する 個所の εアミノ基、 及び Ν末端のひァミノ基が Boc 化された [Na-Boc, Lys16- 19' 20· 24 (Boc) ] - [RHHGSGSPSRHRR] -hGhrel in (8-28)であると推定された。 実施例 6 [Na-Boc, Lys (Boc) 16- 19' 20- 24] - [RHHGSGSPSRHRR] -hGhr e 1 in (8-28)の 逆相カラムによる精製
実施例 5にて得られた [Na- Boc, Lys ι6· 19' 20· (Boc) 3 - [RHHGSGSPSRHRR] - hGhr el in (8- 28)を逆相カラムにて精製した。
方法： 90
63
使用カラム： YMC- 0DS 120 s50 (HR26/15) 80 mL (YMC社製樹脂） 内径 26删 X長さ 15腿
平衡化、 洗浄液： 10% ァセトニトリル， 30 mM酢酸ナトリウム pH 5.5 溶出液： 50% ァセトニトリル， 30 mM酢酸ナトリゥム pH 5.5
再生液： 80% ァセトニトリル
流速： 7 mL/分 (2cm/分)
平衡化液で 3カラムボリューム平衡化の後、 サンプルを負荷し、 平衡化液 にて 3カラムボリューム （UVが下がるまで） カラムを洗浄する。 溶出は溶出 液 100%のステップワイズ溶出で行った。 溶出後再生液でカラムを洗浄した。 溶出液は 1770 mgの [Na - Boc, Ly s 16' 19' 20' 24 (Boc) ] - [RHHGSGSPSRHRR] - hGhrelin(8- 28)を含む 150 mLの溶液で得られた。 これに限外濾過水を 75 mL 添加することで 1.5倍希釈し、 エバポレーターにて溶液中に含まれるァセト 二トリルを留去した。
工程回収率： 98% 実施例 7 Kex2 プロテアーゼによる [Lys16'19'M'M(Boc)] - hGhrelin(8-28)の製 造
実施例 6で得られたペプチド溶液を以下に示す条件に調製して Kex2反応を 実施した。すなわち、 0DS溶出液を限外濾過水で 8 mg/ iLに希釈後、 1M Tr i s-HC 1 pH8.3を 50 mMになるように添加した。 さらに 0.25M CaCl2を 5 mMになるよ うに添加し、 30°C lOmin プレインキュベ一ト後、 Kex2プロテアーゼ（特開平 10-229884) 溶液（lxlO7 unit/mL)を 2.5xl04unit となるように加え て、 スターラーで攪拌しながら、 30°Cの恒温槽で 120分間反応させた。 反応 後、 酢酸を用いて PH 5.5に調整し反応を停止させた。 HPLC、 質量分析及 びア ミ ノ 酸分析か ら 、 切断前後で原料で あ る [N a -Boc, Lysi6, .9, 20, 24 (Boc) ] _ [RHHGSGSPSRHRR] -hGhre 1 in (8-28) は 消 失 し 、 [Lys16'19'2M4(Boc)]hGhrelin(8- 28)が出現増加していることがわかり、 正常に プロセシングされていることが分かつた。 実施例 8 [Lys16'19'20'24(Boc)〕 hGhrel in(8- 28)体の精製
実施例 7で得られた [Lys 16' 19' 0- 24 (Boc) ]hGhrel in (8-28) を含む反応後溶液 を逆相力ラムにて以下の条件で精製した。
方法：
使用逆相カラム Vydac C4 (HR10/30) 23 mLカラム （Vydac社） 内径 10匪 x 長さ 300mm
条件：
平衡化、 .洗浄液 10%ァセトニトリル， 0.1% TFA H 3
溶出液： 50% ァセトニトリル， 0.1% TFA pH 3
流速： 2 mL/分 （線流速 3cm/分）
3カラムボリューム平衡化液を流した後、 Kex2反応後溶液を 2回に分けて 負荷（20 mg/mL樹脂）し、 溶出液 10%で 2カラムボリューム洗浄した後、 溶出 液 10%〜80%の直線濃度勾配を 8カラムポリュ一ムで終了するプログラムで 溶出させ、続いて溶出液 100% で 2カラムポリュ一ム洗浄し、 この間の溶出液 を 6 mLずつフラクション分取した。フラクションは HPLC分析し、リンカ一 [N a—Boc] - [RHHGSGSPSRHRR]及び、 未切断体 [Na-Boc， Lys16'19'2。'24(Boc)]—
[RHHGSGSPSRHRR]- hGhrelin(8- 28)を含まないフラクションをプールした。 収率： 84.4% 純度 97.5%
[LysiM9,2o,24(Boc) ] hGhrelin(8- 28)濃度： 5.62 mg/ mL
溶液量： 120 mL
ペプチド含量： 600 mg 溶出した溶液をエバポレー夕一にて脱溶媒を行った後、凍結乾燥を実施し、
OmpTプロテア一ゼ誘導体によるプロセッシングで得られた 1700 mgの前駆体 (実施例 3)より、 [Lys16'19'20'24 (80じ）]1^ 61111(8_28)を6001^得た(第2図）。 実施例 9 [Lys16'19'20'24 (Boc)] hGhrelin(8- 28)体の精製回収率、 純度表 以下に実施例 3から実施例 8で示した [LysI 9'M (Boc)]hGhrelin(8-28)の 製造収率一覧表を第 2表に示す。
第 2表
表 2 実施例 3から実施例 8で示した [Lys16'19'2fl'24(Boc)]iiGtireIin(8-28)の製造収率一覧表
Figure imgf000067_0001
Pre 8- 28*は [醒 GSGSPSRHRR]-hGhrelin(8- 28) を意味する。
Boc- Pre8-28**は [fT - Boc, Lys16' 19'2。'24 (Boc) ] - [RHHGSGSPSRHRR] - hGhrel in (8 - 28) を意味する。
Boc— 8-28***は [Lys16'19'20' 24 (Boc)] hGhrel in (8-28)を意味する。
4590
67
実施例 10
(10— 1)N末端側断片（ T-Boc, Ser2'6(tBu)]hGhrelin (卜 7))の合成 (方 法 1)
プロリル - 2-クロロトリチル樹脂 （ノババイオケム社製、 1.39g、 1.0腿01) をガラスフィルター付き反応容器に入れ、 順次 HBTUによる Fmoc-ァミノ酸の 導入とピぺリジンによる脱 Fmocを繰り返し、 N末端残基に Boc- Glyを導入し て、 Boc - Gly- Ser(tBu)- Ser(TBDMS)- Hie- Leu - Ser(tBu) - Pro- 2_クロ口トリチ ル樹脂を構築した。得られた保護べプチド樹脂を 0.1 M TBAF/DMF溶液（50 mL) で 30分間処理した。ぺプチド樹脂を濾取し、 DMF (30 mL)で数回洗浄した後、 イソプロピルアルコール、 次いで DCM(30 mL)で洗浄した。 次に、 得られた脱 TBDMSペプチド樹脂を NMP (5 mL)に膨潤させ、 DMAP (374 mg, 3.1 匪 ol) 存 在下、 オクタン酸 （588 mg， 4.1 mmol)、 EDC · HC1 (848 ig, 4.4 mmol) を加 え 16 時間反応させた。 樹脂を濾取し、 NMP、 イソプロピルアルコ一ル、 DCM で順次洗浄し、 減圧下乾燥して、 3位セリン側鎖がォクタノィル化された保 護ペプチド樹脂を得た。 このものに、 0.5% TFA/DCM溶液 30 mLを加え、 室温 で 30分間攪拌し、 保護ペプチドを樹脂から離脱させた。 樹脂を濾去し、 濾液 を濃縮後、 残査に水を加え沈殿とした。 沈殿を濾取した後、 さらにへキサン 中で攪拌して洗浄し、 再度濾取した。 これを終夜、 減圧して乾燥し、 目的物 742 mg (収率 72%) を得た。 HPLCによりこのものの純度を調べたところ、 94% であった。
(10-2) N末端側断片 ( - Boc, Ser2- 6(tBu)]hGhrelin(l-7) ) の合成 (方法 2)
プロリル- 2-クロロトリチル樹脂 （ノババイオケム社製、 1.95g、 l.Ommol) をガラスフィル夕一付き反応容器に入れ、 順次 HBTUによる Fmoc-アミノ酸の
：よる脱 Fmocを繰り返し、 Phe-Leu- Ser(tBu) - Pro- 2-クロ ロトリチル樹脂を構築した。 次に HOOBt/DCCにより Fmoc- Ser- 0Hを導入し、 次いで脱 Fmocと HOOBt/DCCによる縮合を繰り返し、 N末端残基に Boc- Glyを 導入して、 Boc- Gly- Ser (tBu) _Ser- Phe-Leu-Ser (tBu) - Pro- 2 -クロロトリチル 樹脂を構築した。 得られたペプチド樹脂を NMP (5 mL)に膨潤させ、 DMAP (374 mg, 3. 1 顏 ol) 存在下、 オクタン酸 （579 mg， 4. 0 mmol)、 EDC - HC1 (847 mg, 4. 4 腿 ol) を加え 16時間反応させた。 樹脂を濾取し、 NMP、 イソプロピルァ ルコール、 DCMで順次洗浄し、減圧下乾燥して、 3位セリン側鎖がォクタノィ ル化された保護ペプチド樹脂を得た。 このものに、 0. 5% TFA/DCM溶液 30 mL を加え、 室温で 30分間攪拌し、 保護ペプチドを樹脂から離脱させた。 樹脂を 濾去し、 濾液を濃縮後、 残查に水を加え沈殿とした。 沈殿を濾取した後、 さ らにへキサン中で攪拌して洗浄し、 再度濾取した。 これを終夜、 減圧して乾 燥し、 目的物 715 mg (収率 69%) を得た。 HPLCによりこのものの純度を調べ たところ、 74%であった。 実施例 1 1 断片縮合と脱保護
それぞれ実施例 1 0 — 1 と実施例 8 で得られた α -Boc, Ser (tBu) 2'6] hGhrel in (1 - 7)及び [Lys16' 19'20'24 (Boc) ] hGhrel in (8 - 28)を、 あらか じめアミノ酸分析計を用い定量したのち、 縮合反応に供した。 a- Boc， Ser (tBu) 2'6] hGhrel in (1-7)、 HBTU、 DIPEAそれぞれ 0. 19 删 olを DMF 1 mLに 溶解し、 30分間室温で撹拌した。 その後、 [Lys16'19'M'24(Boc) ] hGhrel in (8- 28) を 0. 16 匪 ol及び DIPEA 0. 48 讓 olを DMF 1. 5 mLに溶解し、 撹拌下、 前述の 活性化 N末端側断片溶液を滴下した。 1時間後、反応溶媒を減圧留去し、残査 に Et20を加え析出させ、 洗浄後、 乾燥した。 得られた粉末に TFA 6 mLを加 え、 30分間室温でゆるやかに撹拌した。 TFAを減圧留去し、 残査に Et20を加 え析出させ、 洗浄、 乾燥を経て、 白色粉末状の粗ペプチド 0. 70 gを得た。 こ のものを分析用 HPLCで分析した結果、チャート上の目的物純度は 80%であり、 また全化学合成品と保持時間が一致した。 さらに半合成品及び全化学合成品 をコインジェクションしたところクロマト上ピークが一致した。 縮合前後の HPLCチヤ一トを第 3図に示す。 実施例 1 2 hGhrel inの精製
実施例 1 1で得られた白色粉末状の粗べプチド 0. 70 gを 5%酢酸で 7 mg/mL に溶解し、 以下の条件で精製を実施した。
方法、 条件；
使用カラム： Source 30RPC (HR10/30) 23 iL カラム
(アマシャムフアルマシア社製樹脂） 内径 10腿 X長さ 30腿
平衡化、 洗浄液： 10% ァセトニトリル， 50mM酢酸
溶出液： 60% ァセトニトリル， 50mM酢酸
再生液 ： 80% ァセトニトリル
流速： 2. 5 1111 分（ 111/分)
平衡化液で 3カラムボリューム平衡化の後、 hGhrel in溶解液を 2分し、 半 量ずつを負荷し、 平衡化液にて 3カラムポリューム （UVが下がるまで） カラ ムを洗浄する。 溶出は溶出液 0 %から 1 0 0 %までの直線濃度勾配を 6カラ ムポリュームで終了するプログラムで溶出させた。 溶出液は 5 mLずつフラク ション分画し、適時 HPLCで分析し、 hGhrel inを含むフラクションをプールし た。 プールはエバポレーターで脱溶媒した後、 凍結乾燥を実施した。 結果、 純度 98%の hGhrel inを 512 mg (回収率 73%) 得た。 精製 hGhrel inの HPLC での分析結果を第 4図に示す。 以下の実施例 1 3から 1 5までは、 上記の実施例 1から 1 2までに示した 条件の最適化に関するものである。 したがって、 本発明が下記条件に限定さ れないことは言うまでもない。 実施例 13 融合蛋白質の配列の違いによる Ke x 2の切断効率の違い Kex2の切断効率はその基質の認識配列により大きく異なる。 その切断効率 は in vivoで Kex2切断配列 KR(10)»RR(5)»TR(1.2) >PR(1.0) [ 0 内は
PRを 1とした際の切断効率]の順で切れにくくなる（Proc. Nail. Acad. Sci 95 P10384-10389 1998) ことが報告されている。
以下第 5図に実施例 1で作成した pi 17s 8- 28oPR 、 pi 178-28 oRRとさらに、
Pll78-280PRを铸型にして PCRで作成したプラスミド pll78- 28oKRが発現す る蛋白質を示す。
これら 3種類の蛋白質を発現するプラスミドを保持する大腸菌 W3110を用 いてそれぞれ培養を実施し、実施例 2から 6に示した方法の約 10分の 1のス ケ一ルで精製を行い、それぞれ [Na_Boc， Lys 16- 19- 20- 2 (Boc) ] - [RHHGSGSPSRHPR] - hGhrelin(8- 28) (以下 PR-hGhrelin(8-28))、 [ - Boc, Lys16- 19- 20- 24 (Boc)] - [匪 GSGSPSRHRR]- hGhrelin(8- 28) (以下 RR- hGhrelin(8-28)) 、 [N a -Boc, Lys16- 19' 20- 24 (Boc) ] - [RHHGSGSPSRHKR] -hGhrel in (8-28) ( 以 下 KR-hGhrel in (8-28)) の 3種類のペプチドを調製した。
調製したペプチドについて、実施例 7で示した方法を用いて Kex2プロテア ーゼ処理を実施した。 反応開始 60分の HPLCの分析プロファイルを第 6図に 示す。
第 6 図に示すよう に切断率の順番では RR- hGhrel in (8- 28) > PR_hGhre 1 in (8-28) >KR- hGhrel in (8-28)で RR-hGhre 1 in (8-28)が一番切断率 が高かった。 また KR-hGhrel in(8-28)については Boc基が KRのリジン残基を 保護してしまい、 リジンの電荷を消失させることになるため、 切断がまった く起きなかった。また PR- hGhrd in (8-28)は切断効率が低く、 hGhrel in (8-28) 内で切断が生じた。この hGhre 1 in (8-28)内での分解は hGhrel inのァミノ酸番 号 1 5のアルギニンと 16のリジンの間で切断が生じていた。 細 90
71 実施例 14 大腸菌の培養に適した融合蛋白質の構築
培養に適した融合蛋白質を得るため、 実施例 13第 5図で示した融合蛋白 質以外にも以下第 7図に示すような融合蛋白質を発現するプラスミドを作成 した。 第 7図に示すいずれの融合蛋白質とも ρΙΠ 8-28oPRを铸型にしてそれ ぞれ異なるプライマーから PCRで作成した。 ρΙΠ 8- 28oRRに対して、 蛋白質 の等電点の低下を目的として変異体を構築した。
作成した融合蛋白質プラスミドをそれぞれ大腸菌 W3110株に形質転換した 大腸菌を用いて 3 L培養槽にて 2Lの培養を実施した。前培養は LB brot にて 32°Cで 14時間振とう培養した。本培養の培地組成は実施例 2で示したものと 同一である。炭素源としてはグルコースを最初培地中に 1%添加して、 32°Cで 培養を開始した。 グルコースの枯渴後、 グリセロールを添加して培養を行つ た。 またグルコースの枯渴時に培養温度を 37°Cに上昇させ、 培養後は加圧式 菌体破碎機 （マントンゴ一リン） にて菌体を破砕した。 培養の成果について は最終濁度と菌体破碎時の濁度で判断した。 菌体の濁度及び、 菌体破砕前後 の濁度の比が高いものほど封入体の生産性が高い菌と判断した。 結果を第 8 図のグラフ A， Bに示す。
グラフ A， Bから分かるように最終濁度、 菌体破砕後の濁度比率から、 構 築した融合蛋白質の中で 117 8-280RR融合蛋白質がもっとも高い生産性を示 した。 実施例 1 3、 14の結果から実施例 2では当該蛋白質を発現するブラ スミド pll7 8_28oRRが培養にも適していると考えられた。 実施例 1 5 [Lys16'19'2( 4(Boc)]hGhrelin(8-28)の安定性
実施例 6、 7、 8において、 [Na-Boc, Lys16'19'20'24 (Boc)] -[匪 GSGSPSRHRR] -
1^11 1111(8-28)及び[1^16 9'2。'24(30(；)]1^11 1111(8_28)にぉぃて 1〜10%程度 Boc 基が脱離するという現象が認め られた。 [Lys16'19'21 4(Boc)] hGhrelin(8- 28)は付加した Boc基が一箇所でも脱離すると、 その後の縮合ェ PC翻細 90
72 程で大幅な縮合率低下につながるため、 Boc 基の脱離を防ぐ目的で [Lys16'l9'2°'24(Boc)]hGhrelin(8- 28)の安定性を調べた。
分解に影響を及すパラメ一夕としては保存中の PHと保存温度力考えられた。 そこで以下のような条件での安定性を HH により分析し、 評価した。
方法：新たに精製した [Lys16'19'2°'24(Boc)]hGhrelin(8- 28)を 30mM酢酸ナト リウム溶液に溶解し、 pH2， 3, 4は TFAをもちいて、 pH6， 7, 8は 5N NaOHを用いて pHを調整し、 さらに、 4°C、 20。C、 37。C、 42°Cの恒温槽で 1週 間放置した。放置開始後、 0時間、 2時間、 6時間、 9時間、 24時間、 48時間、 96時間、 168時間でサンプリングを行い、 HPLCにて分析を実施した。 解析方 法 と しては HPLC での分析結果の総 ピー ク 面積に対する [Lys16'19'2°'M(Boc)]hGhrelin(8- 28)のピーク面積の割合 (%) を経時的に評価 することで行った。
結果：以下第 9図及び第 10図に保存温度毎にまとめたグラフを 4種類示 す。 pHが低いほど （pH3以下）、 温度が高いほど、 分解物が増加することがわ かった。 また pH4以上であれば、 42°Cでも安定であることがわかった。 よつ て pHをコントロールすることが、 この分解物生成の抑制に重要であることが 判明した。 実施例 16 hGhrelin (1- 28)の製造 （方法 2)
(1) hGhrelin (8-28)誘導体発現ベクター pll7-8-28okの構築
実施例 1と同一の方法で、 プラスミド pll7- 8- 28okを得た。 実施例 1で作 成したプラスミド P1178-280PRとプラスミド ρΙΠ- 8- 28okの相違は、 前者の リンカ一配列が EPHHffiffGGRQMHGYDADVRLYRRHHGSGSPSRHPR (配列番号 26) で あるのに対し、 後者のリンカー配列は RRHHGSGSPSRHPR (配列番号 35 ) であ る点のみである。 ( ) 大腸菌での組換え hGhrel in (8-28)融合蛋白質の発現 hGhrelin(8_28)融合蛋白質発現プラスミド pll7- 8-28okを大腸菌 W3110株 に形質転換し、 形質転換株を得た。 この株をグルコース及ぴグリセロールを 炭素源とする 20 Lの培地で培養を行い、 最終 0D66。値が 54の培養液を得た。
(3) hGhrelin(8-28)融合蛋白質の内在性 0即 Tプロテアーゼによるプロセ ッシング
前記（2)で得られた培養液より菌体（約 680 g) を TE (10mM Tris-HCl, lmM EDTA pH8.0) バッファー 20 Lに懸濁後、 高圧ホモジナイザ一を用いて菌体の 破砕処理を 2回行った。 その後、 遠心分離で封入体を回収し、 脱イオン水で 再度懸濁し、 遠心分離することで封入体を洗浄した。 次に遠心分離により得 られた封入体ペレット （湿重量約 170 g) を少量の脱イオン水で懸濁し、 0D660 値が 826の封入体濃縮液 550 mLを得た。 550 mLの封入体濃縮液より 50 mL を採取後、 OD660 の値が 50.0 になるように脱イオン水で希釈し、 Tris- HC1 (pH8.2) 、 EDTA(pH8.0)をそれぞれ終濃度 50mM、 lmMになるように加え、 尿素 (終濃度 4.0M) により封入体を溶解させた。 尿素により封入体を溶解するこ とで、 内在性の 0即 T プロテア一ゼにより融合蛋白質のリンカ一配列 RRHHGSGSPSRHPR (配列番号 35) の Arg-Arg間を切断させた。 即ち、 反応溶 液を 30°Cで 5分保温後、 30°Cで 15分 (kpTプロテアーゼ処理を行つた。 その 後 3%Ac0H を添加して反応を停止させた。 本処理によ り 、 RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8-28)を 1.3 g得た。 ESI-MS 4019 (理論値； 018) hGhrelin(8-28)融合蛋白質の内在性 0即 Tプロテアーゼによるプロセッシン グ工程の高速液体ク ロマ ト グラフィ 一による解析の結果、 RfflGSGSPSRHPR- Gh relin(8-28)が遊離していることが示された。
(4) RHHGSGSPSRHPR-hGhrelin(8- 28)の精製 （陽イオン交換による精製） 細 90
74 前記（3 )で得られた 0即 Tプロテアーゼ反応液 (900 mL)を、平衡化液（1. 5M Urea, 20mM NaCl, lOmM Tris-HCl pH8. 3) にて平衡化させた陽イオン交換カラ Λ SP-Toyopearl 550 - c (bed volume 55 mL、 16腿 ID x 280mm T0S0H社製）に 4 回に分けて負荷した。 各回、 平衡化液で十分カラムを洗浄後、 平衡化液 75%、 溶出液 (1. 5M Urea, 1. 5M NaCl , ΙΟηιΜ Tris-HCl pH8. 3) 25%から溶出液 100% の濃度勾配を 1. 5カラムボリュームで完了するプログラムで溶出を行った。 5 mL毎にサンプリングを行い、各分画を高速液体クロマトグラフィ一で分析し、 大腸菌 J3 -ガラクトシダ一ゼ誘導体の含まないピークを分取した。 4回分の合 計収量は約 950 mgであった。
上記精製溶出液 （660 mL) を 2等分し、 2%ァセトニトリル、 0. 1 FAで平衡 化した YMC- 0DS AM (粒径 20 m、 YMC社製） 21. 5腿 ID x 300mmカラムに 2回負 荷した。平衡化液で十分洗った後、溶出液 [ 50%ァセトニトリル、 0. 095¾TFA ] で溶出を行った。 溶出ピークを分取後、 溶出液中に含まれるァセトニトリル は口一タリ一エバポレーターにて除去し、 RHHGSGSPSRHPR- hGhrel in(8- 28)を 720 mg含む溶液 220 mLを得た。 （3 )、 （4 ) で用いた高速液体クロマトダラ フィ一の条件を以下に示す。
カラム； YMC 0DS AP- 302、 検出器； Hi tachi高速液体クロマトグラフィ一シス テム （D7000)、 流速； 1 mL/min、 溶出；バッファー A [ 1. 0%ァセトニトリル、 0. 1¾TFA] 100%からバッファ一 B [ 50. 0¾ ァセトニトリル、 0. 1% TFA ] 100% の 20分間直線濃度勾配。
( 5 ) RHHGSGSPSRHPR - hGhrel in(8-28)の t -ブトキシカルポニル （Boc) ィ匕 前記（4 )で得られた試料 220 mL (RHHGSGSPSRHPR-hGhrel in (8-28)を 720 mg 含む） をガラス三角フラスコに移し、 等量のァセトニトリル（220 mL)を加え た。 これに 1Mの二炭酸ジ- 1-ブチルを RHHGSGSPSRHPR- hGhrel in (8- 28)内に存 在するひアミノ基と L y s εァミノ基数 （計 5箇所） の 5倍モル量にあたる 0
75
4. mL (終濃度 lOmM, 25当量） 加えた。 さらにトリェチルァミンにて pH9に 調整し、 スターラーで攪拌しながら室温で 60分反応させた。 反応の停止は酢 酸を終濃度 0.5%になるように添加し、 pHを中性付近にした後、 速やかに口一 タ リ ーエバポ レー夕一によ り ァセ トニ ト リ ルを除去し、 Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys 16> 19' 20- 24 (Boc) ] hGhrelin(8 - 28)を 530 mg含む溶液、 300 mLを得た。 ESI-MS; 4519 (理論値； 4518)。
Boc化前後の RHHGSGSPSRiffR-hGhrelin(8- 28)の溶出プロファイル、 及びマ . ススぺクトロメトリ一測定結から、 Boc-RHHGSGSPSRHPR-[Lys16'19'2( 4(Boc)] hGhrelin(8- 28)の生成を確認した。 本反応のモニターには以下のクロマトシ ステムを使用した。 カラム； YMC- C8、検出器； Hitachi高速液体クロマトダラ フィーシステム （D7000)、 流速； 1 mL/min、 溶出；バッファー A [ 1.0%ァセ トニトリル、 0.1%TFA] 100%からバッファ一 B [60.0% ァセトニトリル、 0.095% TFA ] 100%の 20分間の直線濃度勾配。 (6) Kex2プロテアーゼによる [Lys16'19'2°'24(Boc)]hGhrelin(8-28)の製造 前記 (5) で得られた Boc-匪 GSGSPSRHPR- [Lys16'19'2°'24(Boc)]
hG relin(8-28)を逆相カラムにて精製した。 2%ァセトニトリル、 0.1%TFA、 10mM 酢酸ナトリウム、 PH4.5 で平衡化した YMC- ODS AM (粒径 20 zm、 T0S0H社 製） 21.5mmID x 300廳カラムに上記 Boc誘導体 （約 500 mg) を負荷した。 平 衡化液で十分洗った後、 溶出液 [70 ァセトニトリル、 0.095%TFA、 10mM酢酸 ナトリウム、 H4.5 ]で溶出した。 Boc-RHHGSGSPSRHPR- [Lys 16· 19- 20· 2 (Boc) ] hGhrelin(8-28) (420 mg) を含む溶出ピークを分取後、 ァセトニトリルをェ バポレ一ターにて除去した。本溶液に 250mM塩化カルシウム溶液、 lMTris-HCl pH8. をそれぞれ終濃度 5mM、 50mMになるように添加した。 30°C、 5分間保温 後、 Kex2プロテア一ゼ （特開平 10— 229884) 溶液（lxlO7 uni t/mL)を 3xl04 uni t/mLになるように添加し、 30。C、 45分間反応した。 本工程の高速液体クロマトグラフィーによる解析の結果、 linker 配列 1皿6863?31^1 と[1^16'19'2°'24(80 ] hGhrel in(8-28)とが切断されていること が示された。 (7) [Lys16'19'2°'24(Boc)] hGhrel in(8_28)体の精製
前記 (6) で得られた [Lyslf 9'2°'24(Boc)] hGhrel in (8-28) (320 mg)を含む 反応後溶液 (300 mL)を酢酸で H3.5に調整後、 10%ァセトニトリル、 0.095%TFA で平衡ィ匕した逆相クロマトカラム 0DS-80TS (21.5匪 ID x 300mmカラム（108 mL) 粒径 20um, T0S0H社製）に負荷した。 平衡化液で 2カラムポリユーム洗浄後、 バッファ一 A [10%ァセトニトリル、 0.095%TFA] 70%, バッファ一 B [65%ァセ トニトリル、 0.1%TFA] 30%からバッファー B 100 の濃度勾配を 5カラムポリュ ームにて完了するプログラムを行い、 [Lys16'19-20'24(Boc)] hGhrelin(8- 28)体を 溶出させた。 フラクション（5 mLずつ）を分取し、 高速液体クロマトグラフィ 一 （条件は （6) と同様である） にて分析を行った。 [Lys16'19'2°'24(Boc)] hGhrelin(8 - 28)の溶出画分を集め。 濃縮後、 凍結乾燥し、 136 mg の [Lysi6,i9;2o,24(Boc)] hGhrelin(8- 28)体を得た。 0即 T プロテアーゼ誘導体によ るプロセッシングで得られた 1300 mgの前駆体 （前記 （3)) より 136 mgの [LysiM9,2o,24(Boc)] hGhrel in(8- 28)体最終標品を得た。 . (8- 1) N末側断片（ T_Boc， Ser2-6(tBu)] Ghrel in(l- 7)の合成 (方法 1 ) プロリル- 2-クロロトリチル樹脂（ノババイオケム社製、 548 mg、 0.25匪 ol) 上に、 ペプチド自動合成機を用いて、 順次 HBTUによる Fmoc-アミノ酸の導入 とピペリジンによる脱 Fmocを繰り返し、 N末端残基に Boc- Glyを導入して、 Boc-Gly-Ser (tBu) - Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro- 2 -クロ口トリチル樹 脂を構築した。 得られた保護べプチド樹脂 （757 mg )を 0.1 M TBAF/DMF溶液 (5 mL) で 1時間処理した。 ペプチド樹脂をろ取し、 DMF (10 mL) で数回洗 90
77 浄した後、ィソプロピルアルコ一ル、ついで塩化メチレン（10 mL)で洗浄した。 次に、得られた脱 TBDMSぺプチド樹脂を DMF (10 mL)に膨潤させ、 DMAP (31 mg, 0.25 mmol) 存在下、 オクタン酸 (144.2 mg, 1.0腿 ol)、 EDC · HC 1 (211 mg, 1.1 腿 ol) を加え 16時間反応させた。 樹脂をろ取し、 DMF、 イソプロピルァ ルコール、 塩ィヒメチレンで順次洗浄し、 減圧下乾燥して、 3位セリン側鎖が ォク夕ノィル化された保護ペプチド樹脂を得た。 このものに、酢酸 mL/TFE 2 mL I塩化メチレン 6 mLの混合溶液を加え、 室温で 1時間攪拌し、 保護べ プチドを樹脂から離脱させた。 樹脂をろ去し、 ろ液を濃縮後、 残查にエーテ ルを加え沈殿とした。 沈殿をろ取、 乾燥し、 粗ペプチド 248 mg (収率 96%) を得た。 本品を酢酸水及びァセトニトリルの混液約 2 mLに溶解し、 YMC- Pack 0DS-A (20醒 X 250mmに添加し、 0.1% トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 40%から 80%までの 60分間直線グラジェント（流速： 10 mL/min)で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥し、 210 mgの目的物を得た。 (8-2) N末側断片 ([r-Boc, Ser2'6(tBu)] Ghrel in(l- 7)の合成 (方法 2) プロリル - 2-クロロトリチル樹脂 （ノバビオケム社製、 466 mg、 0.25腿 ol) 上に、 ペプチド自動合成機を用いて、 順次 HBTUによる Fmoc-アミノ酸の導入 とピペリジンによる脱 Fmocを繰り返し、 N末端残基に Boc- Glyを導入して、 Boc-Gly-Ser (tBu) - Ser (Trt)-Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro- 2 -クロ口トリチル樹脂 を構築した。 この樹脂を^ TFA, 5% TIPS / ジクロロメタンで 30 min処理す ることにより、 Trt基の除去及び樹脂からの切断を同時に行った。樹脂をろ去 した後、 ジクロロメタンを減圧留去して濃縮し、 これに Et20を加えて析出さ せ 乾 燥 し た と こ ろ 、 白 色 沈 殿 と し て Boc_Gly- Ser(tBu)- Ser- Phe- Leu- Ser(tBu)- Pro-OHを 165mg得た。次に、 臭化 フエナシル（Phenacyl Bromide, 40 mg, 1.1当量）、 トリェチルァミン（20mg、 1.1当量） を加え、 DMF約 3 mL中で 2 hr反応させた。 反応後、 反応溶液を約 PC翻細 90
78
5倍量の酢酸ェチル中に入れ、水及び飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムを 加え乾燥させ、 これをろ去した後濃縮し、 Et20で析出させ乾燥したところ、 白色沈殿として Boc- Gly- Ser(tBu)- Ser-Phe_Leu- Ser(tBu)- Pro- OPacを得た。 次に、 オクタン酸 （18.2 mg、 1.1 当量）、 EDC - HC1 (26.4 mg, 1.2当量)、 DMAP (1.4mg、 0.1当量） を加え、 DMF約 2 mL中で終夜反応させた。、 反応溶 液を約 5倍量の酢酸ェチル中に入れ、 水及び飽和食塩水で洗浄し、 硫酸ナト リウムを加え乾燥させ、 これをろ去した後濃縮、 Et20で析出させ乾燥し、 白 色沈殿として Boc_Gly- Ser (tBu)-Ser (Octanoyl)-P e-Leu-Ser (tBu)-Pro-OPac を 144 rag得た。 次に、 酢酸 1.5mL、 亜鉛末 （Zinc Powder、 163 mg 20当量） を加え 1 hr反応させた後、 ろ過し、 冷水を加え析出させ、 Et20で洗浄し乾燥 した。 白色沈殿として Boc-Gly- Ser (tBu) -Ser (0c t anoyl)-Phe-Leu-Ser (tBu) - Pro- OHを 65 rag得た。 本品を酢酸水及びァセトニトリルの混液約 2 mLに溶解 し、 YMC- Pack 0DS-A (20 mm x 250薩に添加し、 0.1% トリフルォロ酢酸中、 ァセトニトリル 40%から 80%までの 60分間直線グラジェント（流速： 10 mL/min) で溶出させた。 目的画分を分取後、 凍結乾燥して目的物 50 mgを得た。
(9) 断片縮合と脱保護
それぞれ前記 （8— 1) と前記 （7) で得られた [ - Boc, Ser (tBu)2' 6]- Ghrelind- 7)及び [Lysl6， 19' 2。' 24(Boc)] hGhrel in(8- 28)を、 あらかじめァミノ 酸分析計を用い定量したのち、 縮合反応に供した。 [ - Boc， Ser (tBu)2' 6]- Ghrelina- 7)を 19.3 ^moK HBTU 20.3 ^mol及び DIPEA 20.3 ； molを DMF 500 L に溶解し、 1 時間室温で撹拌した。 その後、 [Lys16' 19' 2D' M(Boc)] hGhrel in (8-28) ¾ 18.4 mol及び DIPEA 55.2 1を DMF 1 mLに溶解し、 撹拌下、前述の活性化 N末側断片溶液を滴下した。 3時間後、反応溶媒を減圧 留去し、残査に Et20を加え析出させ、洗浄後、乾燥した。えられた粉末に TFA 3 mLを加え、 30 min室温でゆるやかに撹拌した。 TFAを減圧留去し、 残査に Et20を加え析出させ、 洗浄、 乾燥を経て、 白色粉末状の粗ペプチド 77 mgを 得た。このものを分析用 HPLCで分析した結果、チヤ一卜上の目的物純度は 83% であり、 また化学合成品と保持時間が一致した。 さらに半合成品及び全合成 品をコインジェクションしたところクロマト上ピークが一致した。
(10) hGhrelina- 28)体の精製
前記 （9) で得られた白色粉末状の粗 hGhrelin 67 mgを 1%酢酸で 1 mg/mLに 溶解し、 0.1 M酢酸で平衡化した逆相クロマトカラム TSK-ODS- 80Ts 108 mL (ID21.5腿 X 300 mm) に負荷した。 平衡化液で 2カラムボリューム洗浄後、 バッファー A [0.1M酢酸] 100%からバッファ一 B [40%ァセトニトリル、 0.1M酢 酸] 100%の濃度勾配を 5カラムボリュームにて完了するプログラムを行い、 hGhrelin (卜 28)体を溶出させた。 高純度の画分を集め、 凍結乾燥して hGhrelin (1-28) 34.4 mgを得た。
ESI-MS 3371 (理論値 3370.86)、 6N塩酸化水分解後のアミノ酸組成比 Ala； 1.01 (1) , Arg； 2.97 (3) , Glx ； 5.95 (6) , Gly； 1.02 (1) , His ； 1.00 (1) , Leu ； 2 (2) ， Lys ； 4.01 (4) ， Phe ； 1.00 (1) , Pro ； 4.01 (4)， Ser； 3.60 (4)， Val； 1.00 (1) (括弧内は理論値）、 Camobili zation活性 1.3 nM (ref.1.5 nM)
実施例 1 7 Boc- Gly-Ser(tBu)-Ser(TBDMS)- Phe-Leu- Ser(tBu)-Pro- OHの脱
TBDMS条件とォクタノィル化条件の最適ィ匕
実施例 16 (8- 1) の方法に従つて、 3位セリン TBDMS基の除去反応及び ォクタノィルイヒ反応の最適条件について検討した。プロリル- 2-クロロトリチ ル樹脂上に、 ペプチド自動合成機 （アプライドバイオシステムジャパン (株） 製、 433A) を用いて、 順次 HBTUによる Fmoc-アミノ酸の導入とピぺリジンに よる脱 Fmoc を繰り返し、 N末端残基は Boc- Gly を導入することにより、 Boc-Gly-Ser (tBu) -Ser (TBDMS) -Phe-Leu-Ser (tBu) -Pro- 2クロ口トリチル樹 脂を構築した。 次に、 樹脂を 0. 05 讓 ol (約 150 mg) ずつに分け、 第 3表及 び第 4表に示す条件でォクタノィル化を行った。 樹脂の洗浄、 樹脂からのぺ プチド切断等の条件は、 実施例 1 6 ( 8 - 1 ) と同様に行った。
その結果、 TBDMS基の除去反応は 0. 1 M TBAF溶液を用いて 30分間から 1 時間反応させることが好ましく、 またォクタノィル化反応はオクタン酸 4当 量、 EDC 4. 当量、 DMAP 1当量を用いて 8〜16時間反応させることが好まし いことが明らかになった。
第 3表
TBDMS基の除去反応 a
比率'
TBAF 反応時間 収率 b 目的物純度'
才ク夕ノィル： (M) (時間） (%) (%)
デスォク夕ノィル
I 0.01 0.25 89 94 98.3 ： 1.7
II 0.01 3 100 97 100 ： N.D. d
III 0.1 0.25 94 97 100 ： N.D.
IV 0.1 0.5 100 96 100 ： N.D.
V 0.1 1 98 96 100 ： N.D.
VI 0.1 3 100 96 100 ： N.D. a ； TBDMS基の除去率は、 TBAF処理したペプチド樹脂をォクタノィル化した のち、脱保護して得られるォク夕ノィル体と TBDMS未除去を示すデスォクタノ ィル体との比で求めた。ォク夕ノィル化は、 オクタン酸 4当量、 EDC4.4当量、 DMAP 1当量を用い、 24時間反応。
プロリル- 2-クロロトリチル樹脂の置換率を基準に算出。
目的物純度及び比率は、 分析用 HPLCにより算出。
N.D.検出されず。
第 4表
3位セリンのォクタノィル化反応 £ ォ々ノ々ノ ン、ノ ノ入 し、 S的物 比率 e
EDC DMAP 収率 b
酸 時間 紬度 c ォクタノィル： (当量) (当量) (¾)
(当量） (時間） (%) デスォクタノィル
VII 4 4.4 0.1 24 83 94 97.2 ： .8
VIII 2 2.2 24 93 96 99.5 ： 0.5
IX 4 4.4 1 85 78 80.5 ： 19.5
X 4 4.4 4 98 97 99.7 ： 0.3
XI 4 4.4 8 98 96 100 ： N.D. d
XII 4 4.4 16 97 98 100 ： .D. a ； 全てのサンプルは 0.1 M TBAFで 1時間処理して、 TBDMS基を除去した b ； プロリル一 2—クロ口トリチル樹脂の置換率を基準に算出。
c ； 目的物純度及び比率は、 分析用 HPLCにより算出。
d ； N.D. 検出されず。 実施例 18 断片縮合条件の検討
[Na-Boc， Ser(tBu)2'6]hGhrelin(l-7)と [Lys16'19'2。'24(Boc)]hGhrelin(8-28) を用い、 種々の縮合試薬の反応効率を検討したところ、 HBTUがもっとも良い 結果を与えたが、 EDC/H0Bt、 EDC/HOSu, DPP Aでも反応が進行することが明ら かになつた。 - 第 5表
[ -Boc, Ser(tBu)2- 6] -Ghrel in (1-7) +hGhrel in (8-28)
Figure imgf000084_0001
産業上の利用可能性 本発明の製造方法により、 非常に高品質の修飾ペプチド又は蛋白質を高収 量で得ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . アミノ酸又は Z及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、 そのう ち少なくとも 1のアミノ酸又は非アミノ酸が式 1 ；—A (R) — （式中、 A はアミノ酸又は非アミノ酸を示し、 Rは Aの側鎖に結合している修飾のため に導入された置換基を示す。）で表わされる修飾をうけたアミノ酸又は非アミ ノ酸であり、 かつ、 アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミ ノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基及び力 ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 ペプチド断片作製に際し て望ましくない副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護基によ り保護されているペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、 ついで、 弱酸 性条件で前記べプチド断片における保護基を脱離させることなく前記べプチ ド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱することを特徴とする、 修飾をうけたアミ ノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されているぺプチド断片の製造方法。
2 . ( a ) アミノ酸又は Z及び非アミノ酸からなる所望の配列を有し、 かつアミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジ ノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト基及び力ルポキシル基か らなる群から選ばれる 1種以上の、 'ぺプチド断片作製に際して望ましくない 副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護基により保護されてい るペプチド断片を弱酸性離脱樹脂上で作製し、 （b )前記ペプチド断片を弱酸 性離脱樹脂上から離脱させることなく、 置換基 Rにより修飾をうけるアミノ 酸又は非アミノ酸 Aの側鎖における反応性官能基に保護基が導入されている 場合は、 当該保護基を脱保護し、 （c ) 前記脱保護した側鎖を置換基 Rで修飾 し、 （d ) 弱酸性条件で前記ペプチド断片における保護基を脱離させることな く前記べプチド断片を弱酸性離脱樹脂から離脱させることを特徴とする請求 の範囲第 1項に記載のぺプチド断片の製造方法。
3 . 置換基 Rにより修飾を受けるアミノ酸又は非アミノ酸 Aの側鎖にお ける反応性官能基の保護基が、 シリル系保護基であり、 前記保護基の脱保護 にフッ化四級アンモニゥムを用いることからなる請求の範囲第 2項に記載の ペプチド断片の製造方法。
4. シリル系保護基が、 t一プチルジメチルシリル （TBDMS；) 、 t一プチ ルジフエニルシリル (TBDPS) 、 トリイソプロビルシリル (TIPS) 、 トリイソ ブチルシリル （TIBS) 、 t一へキシルジメチルシリル （ThxDMS) 又はトリフ ェニルシリル （TPS) であり、 フッ化四級アンモニゥムがテトラブチルアンモ ニゥムフルオリド (TBAF) 、 テトラエチルアンモニゥムフルオリド (TEF) 又 はアンモニゥムフルオリドである請求の範囲第 3項に記載のペプチド断片の 製造方法。
5 . Aがセリン、 スレオニン、 システィン、 ホモシスティン、 リジン、 オル二チン、 グルタミン酸、 2—アミノアジピン酸、 ジァミノ酢酸、 2—ァ ミノマロン酸、 ァスパラギン酸、 チロシン又はァスパラギンであり、 Rがェ ステル結合、 エーテル結合、 チォエーテル結合、 ジスルフィド結合、 アミド 結合、 〇ーグリコシド結合又は N—グリコシド結合を介して Aの側鎖の反応 性置換基に結合していることからなる請求の範囲第 1項〜第 4項に記載のぺ プチド断片の製造方法。
6 . Aがセリン又はスレオニンであり、 Rがエステル結合を介して Aの 側鎖の水酸基に結合していることからなる請求の範囲第 5項に記載のぺプチ ド断片の製造方法。
7 . ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体、 又は前記ダレリン もしくはその誘導体の中の修飾をうけたアミノ酸を含むぺプチド断片である 請求の範囲第 6項に記載のぺプチド断片の製造方法。 8 . ( a ) 請求の範囲第 1項〜第 7項に記載の方法によって修飾をうけ たアミノ酸又は非アミノ酸を 1以上含む保護されているペプチド断片を製造 し、 前記 （a ) のペプチド断片とは別個に、 （b ) 修飾をうけたアミノ酸又は 非アミノ酸を含まず、 かつ、 アミノ酸又は非アミノ酸の側鎖における、 水酸 基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカプト 基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 望ましくない副 反応を惹起する可能性を有する反応性官能基が保護されているペプチド断片 を製造し、 前記 （a ) 及び （b ) で製造されたペプチド断片を縮合すること を特徴とする修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。 9 . 'ペプチド断片の縮合が、 縮合剤を用いて行われることからなる請求 の範囲第 8項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
1 0 . 縮合剤が、 2— ( 1—ヒドロべンゾトリァゾ一ル— 1一ィル）—1 , 1 , 3， 3—テトラメチルゥロニゥム へキサフルォロホスフェート（HBTU)、 2—（1—ヒドロべンゾトリアゾール _ 1—ィル） - 1 , 1， 3 , 3—テトラ メチルゥロニゥム テトラフルォロポレート (TBTU)、 ジフエニルホスホリル アジド (DPPA)、 ジフエニルホスホロシア二デート (DEPC)、 ジイソプロピル カルポジイミド (DIPC)、 ジシクロへキシルカルポジイミド (DCC) 又は 1一 ェチルー 3 - ( 3—ジメチルァミノプロピル) カルポジイミド (EDO である 請求の範囲第 9項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
1 1 . 縮合剤が、 ジイソプロピルカルポジイミド （DIPC)、 ジシクロへキ シルカルポジイミド （DCC) 又は 1—ェチル—3— （3—ジメチルァミノプロ ピル） カルポジイミド （EDC)であり、 前記縮合剤を用いるペプチド断片（a ) と （b ) の縮合が、 1ーヒドロキシベンゾトリアゾ一ル （HOBt；)、 1—ヒドロ キシスクシンイミド （HOSu) 又は 3， 4ージヒドロ一 3—ヒドロキシー 4一 ォキソ一べンゾトリアジン（HOOBt) の存在下で行われることからなる請求の 範囲第 9項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
1 2 . 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されている ペプチド断片を、 酵素法又は Z及び遺伝子組換法により製造することからな る請求の範囲第 8項〜第 1 1項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
1 3 . 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されている ペプチド断片を、 下記方法；
工程 （1 )；前記ペプチド断片のアミノ酸配列を有するペプチド （以下、 本項 において目的ペプチドという。） をコードする塩基配列、 又は目的ペプチドに 所望によりリンカー配列を介して保護べプチドが付加されている融合蛋白質 をコードする塩基配列のいずれかを有する発現べクタ一により形質転換され た細胞を培養して、 当該培養物から目的べプチド又は前記融合蛋白質を採取 する工程；
工程 （2 )；工程 （1 ) において融合蛋白質を採取した場合、 得られた融合蛋 白質から、 保護べプチド及び所望によりリンカー配列と目的べプチドとを切 断分離し、 所望により目的べプチドをさらに精製する工程；
工程 （3 )；工程 （1 ) 又は （2 ) で得られた目的ペプチドの側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカ ブト基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 望ましくな い副反応を惹起する可能性を有する反応性官能基を保護基により保護するェ 程；
を含む方法により製造することからなる請求の範囲第 1 2項に記載の修飾べ プチド又は蛋白質の製造方法。
1 4. 工程 （2 ) における保護ペプチド及び所望によりリンカ一配列と 目的ペプチドとの切断分離が、 Om p Tプロテアーゼ又はその誘導体及び K e X 2プロテア一ゼ又はその誘導体を用いて 2段階で行われることからなる 請求の範囲第 1 3項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
1 5 . リンカー配列が、 配列番号 2 7に記載の配列である請求の範囲第 1 3項又は第 1 4項に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
1 6 . ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけ たアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする 請求の範囲第 1 2項〜第 1 5項に記載の修飾ペプチド又は蛋白質の製造方法。
1 7 . 修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されている ぺプチド断片を、 p H 4〜 8の溶液中で精製及び保存することを特徵とする 請求の範囲第 1 2項〜第 1 6項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
1 8 . 保護基が B o c基である請求の範囲第 1 2項〜第 1 7項に記載の 修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。 1 9 . 工程 （1 )；所望のアミノ酸配列を有するペプチド （以下、 本項に おいて目的ペプチドという。）をコードする塩基配列又は目的ペプチドに所望 によりリンカー配列を介して保護ペプチドが付加されている融合蛋白質をコ ードする塩基配列のいずれかを有する発現べクタ一により形質転換された細 胞を培養して、 当該培養物から目的ペプチド又は前記融合蛋白質を採取する 工程；
工程 （2 )；工程 （1 ) において融合蛋白質を採取した場合、 得られた融合蛋 白質から、 保護べプチド及び所望によりリンカー配列と目的べプチドとを切 断分離し、 所望によりさらに精製する工程；
工程 （3 )；工程 （1 ) 又は （2 ) で得られた目的ペプチドの側鎖における、 水酸基、 アミノ基、 グァニジノ基、 イミダゾリル基、 インドリル基、 メルカ ブト基及び力ルポキシル基からなる群から選ばれる 1種以上の、 望ましくな い副反応を惹起する可能性を有する反応性置換基を保護基により保護するェ 程；
工程 （4 )；工程 （3 ) で得られた保護されている目的ペプチドを、 p H 4〜 8の溶液中で精製及び保存する工程；
を含む方法により製造することを特徴とする修飾をうけたアミノ酸又は非ァ ミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法。
2 0 . 保護基が B o c基である請求の範囲第 1 9項に記載の修飾をうけ たアミノ酸又は非アミノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造す る方法。
2 1 . 工程 （2 ) における保護ペプチド及び所望によりリンカ一配列と 目的べプチドとの切断分離が、 Om p Tプロテアーゼ又はその誘導体及び K e X 2プロテアーゼ又はその誘導体を用いて 2段階で行われることからなる 請求の範囲第 1 9項又は第 2 0項に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミ ノ酸を含まない保護されているペプチド断片を製造する方法。
2 2 . リンカー配列が、 配列番号 2 7に記載の配列である請求の範囲第 1 9項〜第 2 1項に記載の修飾をうけたアミノ酸又は非アミノ酸を含まない 保護されているぺプチド断片を製造する方法。
2 3 . ペプチド断片が、 ダレリンもしくはその誘導体の中の修飾をうけ たアミノ酸又は非アミノ基を含まないペプチド断片であることを特徴とする 請求の範囲第 1 9項〜第 2 2項に記載の修飾べプチド又は蛋白質の製造方法。
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