WO2003064683A1 - Methode de quantification de proteine glycosylee au moyen d'une reaction d'oxydoreduction, et kit de quantification associe - Google Patents

Methode de quantification de proteine glycosylee au moyen d'une reaction d'oxydoreduction, et kit de quantification associe Download PDF

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WO2003064683A1
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glycated
range
protease
measurement
concentration
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PCT/JP2003/000820
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Satoshi Yonehara
Kaori Ishimaru
Tsuguki Komori
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Arkray, Inc.
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    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for measuring a glycated protein using a redox reaction.
  • glycated hemoglobin glycated Hb
  • glycated Hb glycated hemoglobin
  • Such saccharified Hb is measured as a saccharification rate or saccharification amount by, for example, a high performance liquid chromatography (HPLC) method, a minicolumn method, an immunoassay, a dye method, or the like.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • a minicolumn method an immunoassay
  • a dye method or the like.
  • HPLC method for example, a dedicated machine for measuring glycated Hb is required, and in the case of the immunoassay or the dye method, there are problems such as contamination of the measurement cell and measurement accuracy.
  • glycated proteins such as glycated Hb
  • a measurement method using an oxidation-reduction reaction with an enzyme that does not require a special measuring device and is easy to operate has been applied in, for example, biochemical analysis and clinical tests. I have.
  • the measurement of saccharified Hb using the redox reaction is performed, for example, as follows. First, a sample containing saccharified Hb is treated with fructosyl amino acid oxidase (hereinafter referred to as “FAOD”), and the saccharified portion of the saccharified Hb is reacted to generate hydrogen peroxide. This amount of hydrogen peroxide corresponds to the amount of saccharified Hb. Then, peroxidase (hereinafter referred to as “POD”) and a reducing agent are added to the sample after the FAOD treatment. The redox reaction is performed between the hydrogen peroxide and the reducing agent using the POD as a catalyst.
  • FOD fructosyl amino acid oxidase
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the color development, and as a result, the amount of saccharified Hb in the sample can be known.
  • an object of the present invention is to provide a method for measuring a glycated protein in a sample using a redox reaction, and to provide a method that is excellent in both measurement sensitivity and measurement accuracy. It is another object of the present invention to provide a measurement kit used in the measurement of the glycated protein, which has excellent measurement accuracy, measurement sensitivity, and handleability.
  • the method for measuring a glycated protein of the present invention comprises: performing a redox reaction by applying FAOD to a glycated protein in a sample; measuring the amount of the glycated protein by measuring the redox reaction; A method for removing glycated amino acid present separately from glycated protein in the sample, prior to the oxidation-reduction reaction, by subjecting the glycated amino acid to FAOD and decomposing the glycated amino acid, The redox reaction is carried out in the presence of a compound and sodium azide.
  • FAOD is a general name, and its substrate is saccharified amino acid. It also acts on glycated proteins and glycated peptides, for example.
  • the FAOD for decomposing the glycated amino acid is referred to as “decomposition FAODj”, and the FAOD for measurement to act on the glycated protein is referred to as “measurement FAOD”.
  • the present inventors have conducted intensive research to improve the measurement accuracy, and as a result, have found the following. That is, naturally, free glycated amino acids exist in whole blood in addition to glycated proteins, and the FAOD acts on such glycated amino acids. Therefore, when glycated protein is measured using FAOD as described above, not only redox reaction between glycated protein and FAOD, but also redox reaction between glycated amino acid and FAOD occurs. Above all, the measurement of glycated protein increases. In addition, even when the whole blood sample of the same patient is measured by the above-mentioned measurement method under exactly the same conditions, the problem that the measurement value fluctuates significantly at different blood sampling times depending on the patient may be as follows. I decided.
  • Such a problem is mainly a phenomenon observed in a patient who has received intravenous drip and the like, and the fluctuation of the measured value is caused by, for example, sugars such as glucose and various amino acids as components of the drip or the like.
  • sugars such as glucose and various amino acids as components of the drip or the like.
  • saccharified amino acids are included, saccharified amino acids are generated from these foreign components, and saccharified amino acids are transiently increased.
  • the present inventors have found for the first time that such an increase in measured values due to glycated amino acids is suppressed. As a result, measurement accuracy can be improved, and blood can be collected at any time, regardless of whether or not a drip is received, thereby reducing the burden on the patient. Further, if the redox reaction is performed in the presence of a tetrazolium compound and sodium azide, However, its mechanism is unknown, but the measurement sensitivity is also improved. Therefore, according to such a measurement method having excellent measurement accuracy and measurement sensitivity, the reliability as an index of various glycated proteins is increased, and the method is useful in fields such as clinical medicine.
  • the glycated protein is preferably, for example, glycated Hb. This is because such a method increases the reliability of glycated Hb as an index for diagnosing diabetes, and is useful in fields such as clinical medicine.
  • a FAOD having the same substrate specificity as the first measurement method using FAOD having different substrate specificities for the glycated amino acid and the glycated protein is used. There is a second measurement method.
  • FAOD includes, for example, those that act on the saccharified portion of the ⁇ -amino group, those that act on the saccharified portion of the side chain amino group of amino acid residues such as lysine and arginine, and both of the above. Some of them act on the saccharified moiety, and their substrate specificities vary depending on the type of FAOD.
  • the measurement of glycated Hb can be performed by applying FAOD to any of the glycated portion of the a-amino group, the glycated portion of the side chain amino group, or both glycated portions. It is possible to measure the amount.
  • the degradation FAOD acting on the glycated amino acid and the measurement FAOD acting on the glycated protein have different substrate specificities.
  • the glycated amino acid is degraded by the degradation FAOD, and the glycated protein can be further reacted with a different substrate specificity measurement FAOD on the glycated portion where the degradation FAOD does not act. Therefore, measurement accuracy can be improved without being affected by glycated amino acids.
  • the FAOD for degradation acts on the glycated amino group in a steadily manner
  • the FAOD for measurement specifically acts on the glycated ⁇ -amino group and the glycated side chain amino group.
  • the measurement FAOD acts on both the ⁇ -amino group saccharified moiety and the side chain amino group saccharified moiety
  • the glycated amino acid in which the ⁇ -amino group is saccharified as described above is used.
  • the saccharified amino acid is previously decomposed by the decomposing FAOD that specifically acts on the glycated ⁇ -amino group.
  • the measurement FAOD acts on both the ⁇ -amino group glycated portion and the side chain amino group glycated portion as described above, but the ⁇ -amino group glycated portion of the glycated protein is also degraded by the degrading FAOD in advance. Therefore, the measurement FAOD can act only on the side chain amino group glycated portion of saccharified protein. For this reason, it can be said that this method is particularly useful for measuring glycated Hb, which is characterized by the amount of glycated side chain amino groups.
  • the glycated protein is degraded by protease, and the glycated protein degradation product is acted on by the glycated protein. It is preferable to carry out the oxidation-reduction reaction by causing a measurement FAOD to act.
  • Glycoproteins are degraded by proteases because FAOD acts more easily on glycated amino acids and on shorter glycated peptide fragments than on glycated proteins.
  • the order of protease treatment is not limited before and after the degradation of glycated amino acids, because the measurement FAOD acts on a glycated portion different from the degradation FAOD as described above, and therefore the measurement of glycated protein itself is not performed. Because it is not affected.
  • the glycated protein is preferably decomposed with a protease, and further, the same FAOD as the degrading FAOD is added, and the oxidized-reduction reaction is preferably performed on the protease digest.
  • this is a measurement method when the decomposition FAOD and the measurement FAOD are the same.
  • FAOD has the property of more easily acting on glycated amino acids and shorter glycated peptide fragments than the glycated protein measured as described above. For this reason, even if FAOD for degradation is added, it can be said from the reaction kinetics of the enzyme that the treatment time for decomposing glycated amino acids has little effect on glycated proteins.
  • the degradation product of the glycated protein by the protease that is, glycated amino acid or glycated amino acid
  • the degradation FAOD remaining on the peptide fragment of the protein may act. After that, even if the measurement FAOD is further added, the remaining degradation FAOD has already acted on a part of the glycated protein degradation product, and conversely, the measurement accuracy may be reduced. There is.
  • the glycated protein degradation product due to the protease treatment is not reacted with the degradation FAOD. It can be maintained as it is and can react with the subsequently added measurement FAOD. This improves measurement accuracy.
  • the third measurement method even if the degradation FAOD is not inactivated by the protease treatment as described above, for example, by adjusting the addition amount of the degradation FAOD and the addition amount of the measurement FAQD.
  • high-precision measurement can be realized.
  • the protease at least one protease such as meta-mouth proteinase, bromelain, papain, trypsin, proteinase K, subtilisin and aminopeptidase, and a protease derived from Bacillus sbtilis can be used.
  • the protease is selected from the group consisting of meta-oral proteinase, bromelain, papain, trypsin derived from pig kidney and protease derived from Bacillus sbt i1 is, which selectively degrades glycated Hb.
  • it is at least one selected protease.
  • meta-oral proteinases and proteases derived from Bacillus sbtilis are preferred.
  • the final concentration of the tetrazolium compound in the redox reaction solution is in the range of 0.5 to 2.5 mmo ⁇ / L, and the final concentration of sodium azide in the reaction solution is 0.13 to 1.3 mmo. It is preferably in the range of 1 / L.
  • the sensitivity can be further improved. It is preferable to add a solution containing a trazolyme compound and sodium azide to the sample after aging.
  • the aging treatment temperature is preferably in the range of 20 to 60, and the aging treatment time is preferably in the range of 6 to 120 hours.
  • the measurement of the oxidation-reduction reaction is not particularly limited, and the oxidation-reduction of hydrogen peroxide generated by the action of FAOD on the glycated protein and a substrate (color-forming substrate) that develops color by oxidation is performed.
  • the amount of hydrogen peroxide is determined by reacting with an enzyme and measuring the amount of coloring of the chromogenic substrate to determine the amount of hydrogen peroxide.
  • the chromogenic substrate include N- (carbo'xymethylaminocarbo'enyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamineamine (hereinafter referred to as "DA-64"). ”) Can be used.
  • the DA-64 When using the DA-64, the DA-64 is added to the reaction solution in the presence of a surfactant, and the tetrazolium compound concentration in the reaction solution is in the range of 0.5 to 8 mmol ZL, and the sodium azide concentration is 0.08 to 0.8 mmo 1 ZL and surfactant concentration 0.3 to: L Ommo 1 ZL, and the pH of the reaction solution is 7.0 to 8.5. Is preferred.
  • One of the features of the present invention is to carry out the redox reaction in the presence of a tetrazolium compound and sodium azide in order to improve measurement sensitivity.
  • a tetrazolium compound and sodium azide As described above, when DA-64 is used as a chromogenic substrate, When DA-64 coexists with the tetrazolium compound and sodium azide, DA-64 may cause false color development. Such erroneous coloration causes a problem that, for example, the background becomes high in the measurement of the color development amount, and the DA-64, which should have been added in a sufficient amount, becomes insufficient.
  • DA-64 was added in the presence of a surfactant, and the concentration of each component was set within the above-mentioned concentration range, and the pH of the reaction solution was adjusted. By setting the above range, the rise of the background can be suppressed, and more accurate measurement can be performed.
  • the type of the measurement sample is not particularly limited, and in addition to whole blood, plasma, serum, blood cells, and the like, for example, biological samples such as urine and cerebrospinal fluid, and drinking water such as juice, It can be applied to samples of foods such as soy sauce and sauces, and is particularly useful for whole blood samples and blood cell samples.
  • whole blood may be directly lysed, or erythrocytes separated from whole blood may be lysed, and the lysed sample may be used as a measurement sample.
  • Examples include saccharified Hb and saccharified albumin as described above, and saccharified Hb is preferred.
  • the method for measuring the Hb saccharification rate of the present invention is a measurement method for determining the Hb saccharification rate from the saccharified Hb amount and the Hb amount.
  • This is a method of measuring the amount of glycated Hb, and measuring the amount of Hb in the sample, and obtaining the Hb saccharification rate from the glycated Hb amount and the Hb amount.
  • the “Hb amount” includes both glycated Hb and unglycated Hb.
  • the method of measuring the amount of Hb is not particularly limited, but the Hb in the sample is denatured with a tetrazolium compound, and the absorbance of the sample is measured at an absorption wavelength specific to the obtained denatured Hb. It is preferable to use a method of measuring the absorbance and calculating the amount of Hb in the sample from the absorbance. Since native Hb has various absorption wavelengths depending on its mode, for example, a state of being bound to oxygen and a state of being unbound, it is difficult to accurately determine the amount of Hb even if the absorbance is simply measured. It is.
  • HbAlc can also be measured using the method for measuring a glycated protein of the present invention.
  • a calibration curve prepared from the correlation between the amount of glycated Hb and the amount of Hb A1c by the method for measuring glycated protein of the present invention is prepared, and the method of the present invention is used.
  • the amount of HbA1c in the sample is determined by substituting the amount of glycated Hb in the sample obtained from the method for measuring a glycated protein in the sample into the calibration curve.
  • HbAlc refers to glycated Hb in which the ⁇ -amino group at the N-terminal of the / 3 chain of Hb is glycated.
  • HbAlc is regarded as a particularly important index in diabetes diagnosis and the like.
  • the measurement of HbAlc is a characteristic structural portion of HbA1c in the saccharified moiety.
  • FAOD is specifically expressed in the saccharified moiety of the ⁇ -amino group at the N-terminal of the 3 chain. It was necessary to measure the redox reaction. In this case, for example, it is required that the FAOD to be used has high substrate specificity for the ⁇ -amino group saccharified moiety, and that the FAOD used sufficiently act on the hamino group saccharified moiety. I had to take.
  • the amount of HbAlc can be determined on the basis of the amount of glycated Hb measured with high accuracy, so that accurate and simple measurement of HbA1c becomes possible. Therefore, measurement of HbA1c can be put to practical use in clinical tests and the like.
  • the kit for measuring glycated protein of the present invention is a measurement kit used for measuring glycated protein using a redox reaction, which comprises a reagent for pretreatment of a sample containing FAOD, FAOD, and oxidoreductase. And a coloring reagent containing a coloring substrate.
  • the present inventors have determined the cause of the measurement accuracy problem as described above. And, even if a permanent glycated amino acid or a transient exogenous glycated amino acid is present in a whole blood sample, the FAOD is added to the sample pretreatment reagent as in the present invention.
  • the present inventors have found for the first time that the addition of the pretreatment reagent before the reduction reaction decomposes the glycated amino acid in the sample and suppresses the increase in the measured value due to the glycated amino acid as described above. It was. For this reason, the use of the measurement kit of the present invention enables quick and simple measurement of glycated protein using a redox reaction with excellent accuracy.
  • the measurement using the measurement kit of the present invention has excellent measurement accuracy as described above, the reliability as an index of various glycated proteins is increased, and the measurement kit is useful in the field of clinical medicine and the like.
  • the measurement target is preferably, for example, glycated Hb. This is because such a measurement kit increases the reliability of glycated Hb as an index for diagnosing diabetes and is useful in fields such as clinical medicine.
  • the FAOD contained in the pretreatment reagent decomposes the glycated amino acid
  • the FAOD contained in the coloring reagent is hereinafter referred to as a ⁇ degradation FAOD '' as described above. Since it acts on glycated proteins, it is hereinafter also referred to as “FAOD for measurement”.
  • the measurement kit of the present invention further comprises a proteases containing proteases. It is preferable to include a zeo reagent.
  • the FAOD has a property that it acts more easily on glycated amino acids and shorter glycated peptides than on glycated proteins. Therefore, if the glycated protein in the sample is decomposed by the protease reagent, the FAOD for measurement in the coloring reagent is more likely to act, and the measurement accuracy is also improved.
  • the protease the same protease as in the method for measuring a glycated protein of the present invention can be used.
  • the protease reagent further contains a tetrazolium compound and sodium azide.
  • the measurement sensitivity can be improved, and at the same time, the effect of the tetrazolium compound on the redox reaction of a reducing substance or the like contained in the sample is eliminated. This is because the measurement accuracy can be improved.
  • the protease reagent when a metallobutase is used as a protease, the protease further contains Ca and Na, the metaprotease concentration is 100 to 40,000 KUZL, the & It is preferable that the Na concentration is 1 to 5 Ommo 1 ZL and the Na concentration is 5 to 100 Ommo 1 ZL.
  • the meta-oral protease, Ca and Na coexist in the above-mentioned concentration range, the stability of the meta-oral protease is improved, for example, not only at low temperature but also at room temperature. Meta-Mouth Protea-Prevents the inactivation of zeolites and enables stable storage.
  • the concentration of each substance in the protease reagent is not limited to the concentration range, for example, the It is preferable that the ratio is the same as the above-mentioned concentration range. This is based on the protease test for the reaction solution. This is because the amount of each of the above-mentioned substances required for the reaction can be adjusted by the addition ratio (dilution ratio) of the drug. The same applies to other substances and other reagents.
  • a FAOD for decomposition contained in the pretreatment reagent and a FAOD for measurement contained in the coloring reagent, for example, a first measurement kit using FAOD having different substrate specificities And second and third measurement kits using the same FAOD.
  • the first measurement kit FAODs having different substrate specificities are used for the degradation FAOD contained in the pretreatment reagent and the measurement FAOD contained in the coloring reagent. It is preferred that When such a measurement kit is used, the glycated amino acid is decomposed by the degradation FAOD, and the glycated protein can be caused to act on a different glycated portion where the degradation FAOD does not act. This makes it possible to improve measurement accuracy without being affected by glycated amino acids.
  • the degradation FAOD is a FAOD which acts on a glycated ⁇ _amino group in a diametric manner
  • the measurement FAOD is specific to a glycated amino group and a glycated side chain amino group.
  • it is a FAOD that acts on liposome. Since the measurement FAOD acts on both the ⁇ -amino group glycated portion and the side chain amino group glycated portion, according to the conventional method, the glycated amino acid having the ⁇ -amino group glycated as described above can be obtained by the conventional method. Was working.
  • the glycated amino acid is previously decomposed into a FAOD for decomposition that specifically acts on the glycated ⁇ -amino group by treatment with the pretreatment reagent,
  • the measurement FAOD does not act on this, and the increase in apparent measured values is suppressed, improving accuracy.
  • the measurement FAOD is composed of the ⁇ -amino saccharified moiety and the side. It acts on both saccharified amino-chain glycated moieties.
  • the glycated proteins of the present invention can be treated with the color-forming reagent of the present invention.
  • the measurement FAOD can act only on the side chain amino group saccharified moiety. For this reason, it can be said that this is a useful measurement kit particularly for measuring glycated Hb, which is characterized by the amount of glycated side chain amino groups.
  • Such a measurement kit can be used in the first method for measuring a glycated protein of the present invention.
  • the second measurement kit uses the same FAOD as the decomposition FAOD of the pretreatment reagent and the measurement FAOD of the coloring reagent, decomposes the glycated protein, and decomposes the glycated protein. It is preferable to include a protease reagent containing a protease that inactivates FAOD for digestion.
  • the method of using this second measurement kit is, for example, to add a pretreatment reagent to the sample and allow the glycated amino acid to react with FAOD for degradation, and then add a protease reagent to degrade the glycated protein with protease.
  • the remaining degradation FAOD is also digested and degraded by the protease.
  • the redox reaction may be performed by further adding the color-forming reagent to cause the FAOD for measurement to act on the protease degradation product.
  • FAOD has a property that it acts more easily on glycated amino acids and shorter peptide fragments of glycated proteins than on glycated proteins measured as described above. For this reason, even if a pretreatment reagent containing a degradation FAOD is added, it can be said from the reaction kinetics of the enzyme that the FAOD has little effect on glycated proteins in the treatment time for degrading glycated amino acids. However, if the activity of the degradation FAOD remains during the subsequent treatment with the protease reagent, the glycated protein degradation product (ie, glycated amino acid or glycated protein peptide) by the protease is concurrently performed with the protease treatment.
  • the glycated protein degradation product ie, glycated amino acid or glycated protein peptide
  • the degradation FAOD acts on the Even if a coloring reagent containing measurement FAOD is added to the sample, the degradation FAOD has already acted on some of the degradation products of the saccharified protein. It may decrease. Therefore, if a protease reagent that degrades glycated protein and digests and inactivates the degradation FAOD is included as in the second measurement kit, the degradation product of the glycated protein is not reacted with the degradation FAOD. It can be kept as it is and can react with the measuring FAOD in the coloring reagent to be added subsequently. As a result, measurement accuracy is also improved. In addition, such a measurement kit can be used in the second method for measuring a glycated protein of the present invention.
  • the degradation FAOD remaining with the protease reagent as in the above-described second measurement kit is used.
  • high-accuracy measurement can be realized by adjusting the concentration of the decomposition FAOD of the pretreatment reagent and the concentration of the measurement FAOD of the color-forming reagent without deactivating the reagent.
  • Such a measurement kit can be used in the third method for measuring a glycated protein of the present invention.
  • a substrate that develops color by oxidation for example, a substrate that develops color by reduction, or the like can be used.
  • a substrate that develops color by oxidation is used. It is preferable to use (carbo'xymethylaminocarboyl) -4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine.
  • DA-64 when DA-64 is used as a chromogenic substrate, if the protease reagent contains a tetrazolium compound and sodium azide, these three components are mixed in the reaction system to form DA-64. One of 64 may cause false coloring.
  • the pretreatment reagent, the protease reagent, and the coloring reagent may further include a surfactant.
  • the various reagents are CHES, MOPS, MES, Tris, phosphoric acid, TES, TAPS, HEPES, HEPPSO, boric acid, trietamine, BES, M ⁇ PSO , EPPS, POP SO, ADA, PIPES, ACES, Bis-Tris. This is because each of the various reagents contains an enzyme, and the enzyme can act at an optimum pH, for example, by adding a buffer.
  • the pretreatment reagent further comprises at least one buffer selected from the group consisting of CHES, MOPS, TAPS, EPPS, phosphoric acid, HEPPSO, P ⁇ PSO, and boric acid. And its pH is preferably in the range of 8.0 to 10.0.
  • the protease reagent further comprises Tris, MES, DIPS II, TES, POP SO, HE PES, MOP SO, Bis-T ris, MOP S, ADA, PI PE S, ACE S, phosphorus It contains at least one buffer selected from the group consisting of acids and has a pH of 5.0 to 7. It is preferably in the range of 0.
  • the coloring reagent further contains at least one buffer selected from the group consisting of MES, Tris, phosphoric acid, MOPS, TES, HEPES, HEPPSO, and EPPS, and its pH Is preferably in the range of 6.0 to 9.0.
  • the coloring reagent preferably further contains sodium azide, for example, since erroneous coloring of a coloring substrate such as DA-64 can be prevented.
  • the pretreatment reagent preferably further contains at least one of pericase and pyrilvinoxidase.
  • pericases when pericases are contained, for example, uric acid contained in a measurement sample can be decomposed, and when bilirubinoxidase is contained, pyrirubin can be decomposed. Since uric acid and pyrirubin have a reducing power, if decomposed in this way, the effects of reducing substances can be further removed, and the measurement accuracy can be improved.
  • compositions of each reagent in the measurement kit of the present invention include, for example, the following compositions.
  • the pretreatment reagent is, for example, an enzyme that specifically acts on the saccharified ⁇ -amino group of fructosyl amino acid oxidase, the concentration of which is in the range of 10 to 500 UZL, and the concentration of the buffer is 5 to 200. It is preferably in the range of mmo1ZL, and ⁇ is preferably in the range of 8.0 to 10.0.
  • the protease reagent has, for example, a concentration of meta-mouth protease in the range of 100 to 100,000 KUZL, a tetrazolium compound concentration of 0.1 to: a range of L0 mmo1 ZL, and a sodium azide concentration of 0.1. 08 ⁇ 4mmol ZL range, Ca concentration is 0 .:! ⁇ 50mm o1 / L range, Na concentration is 5 ⁇ 100mm o1 / L range, buffer concentration is 0. : It is preferably in the range of ⁇ 500 mmo 1 ZL, and the pH is preferably in the range of 5.0-7.0.
  • the color-forming reagent is, for example, an enzyme in which fructosyl amino acid oxidase specifically acts on a glycated ⁇ -amino group and a glycated amino acid residue side chain, and has a concentration of 100 to 50,000 UZL.
  • the concentration of peroxidase is in the range of 0.1 to 400 KUZL.
  • the concentration of sodium ⁇ - (carbo'xymethylaminocarbo ')-4,4, -bis (dimethylamino) diphenylamine It is preferable that the buffer concentration is in the range of 0.02 to 2 mMol ZL, the buffer concentration is in the range of 10 to 500 molZL, and the pH is in the range of 6 to 9.
  • the measurement kit of the present invention can be applied to a sample similar to the method for measuring a glycated protein of the present invention.
  • the various reagents in the measurement kit of the present invention may be liquid reagents in which each component is dissolved in an aqueous solvent, or may be dry reagents dissolved in an aqueous solvent before use.
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between the amount of HbAlc by the enzymatic method and the amount of HbAlc by the HPLC method in one example of the measurement method of the present invention.
  • the FAOD used in the measurement method and the measurement kit of the present invention is preferably a FAOD that catalyzes the reaction represented by the following formula (1).
  • the FAOD is specific to a saccharified amine having a glycated amino group.
  • FAOD hereinafter referred to as “FAOD_HI”
  • F AOD hereinafter referred to as “FA ⁇ D-S”
  • a saccharified amamine having a saccharified hyamino group and the side chain amino FAOD (hereinafter, referred to as “FAOD-aS”) which specifically acts on any of the saccharified amines in which the amino group is saccharified.
  • FOD-aS side chain amino FAOD
  • glycated amine J refers to glycated proteins, glycated peptides, glycated amino acids, and the like.
  • R 1 is residue - derived a hydroxyl group or the sugar before glycation (sugar residue )
  • the sugar residue (R 1 ) is an aldose residue when the sugar before the reaction is aldose, and is a ketose residue when the sugar before the reaction is ketoose.
  • the sugar residue (R 1 ) is a glucose residue (aldose residue).
  • n is an integer of 0-6.
  • R 2 is not particularly limited, but when the glycated amamine is a glycated amino acid or a glycated peptide (including a glycated protein), when the ⁇ -amino group is glycated, (Amino group of the amino acid side chain) is different from that in the case of glycation.
  • R 2 is an amino acid residue or a peptide residue represented by the following formula (2).
  • the above-mentioned FAOD- ⁇ and FA ⁇ D-S specifically catalyze the reaction of the formula (1).
  • R 3 represents an amino acid side chain group
  • R 4 represents a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (3), for example.
  • n is an integer of 0 or more
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above, and the amino acid side chain groups may be all the same or different.
  • R 2 when an amino group other than an ⁇ -amino group is saccharified (an amino acid side chain group is saccharified) , R 2 can be represented by the following formula (4).
  • the above-mentioned FAOD-S and FAOD-aS specifically catalyze the reaction of the formula (1).
  • R 5 (: 11 ( ⁇ -R 6 ) -CO-R 7 (4)
  • R 5 represents a portion of the amino acid side chain group other than the glycated amino group.
  • the glycated amino acid is lysine
  • R 5 is
  • R 5 is
  • R 6 is hydrogen, an amino acid residue or a peptide residue, and can be represented by the following formula (5), for example.
  • n is an integer of 0 or more
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above, and all the amino acid side chain groups may be the same or different.
  • R 7 is a hydroxyl group, an amino acid residue or a peptide residue.
  • n is an integer of 0 or more
  • R 3 represents an amino acid side chain group as described above, and the amino acid side chain groups may be all the same or different.
  • FAOD- ⁇ that specifically acts on the saccharified amino group
  • examples of FAOD- ⁇ that specifically acts on the saccharified amino group include commercially available fructosyl-amino acid oxidase (FAOX— ⁇ ). ) (Manufactured by Kikkoman Co., Ltd.) and FAOD derived from Penicillium (Japanese Patent Application Laid-Open No. 833,386 / 86).
  • Examples of FAOD-S that specifically acts on the glycated amino acid side chain include, for example, FAOD derived from the genus Fusarium (Japanese Society of Biotechnical Sciences, 2002, conversion of substrate specificity of amino acid oxidase derived from Fusarium oxysporum; Maki Fujiwara et al.)).
  • Examples of the FAOD-aS that acts on both the saccharified ⁇ -amino group and the saccharified amino acid side chain group include commercially available trade names F ⁇ D (manufactured by Asahi Kasei Corporation) and FAOD derived from the genus Giperella (JP-A-8 — No.
  • tetrazolium compound in the present invention for example, a structure having a ring structure substituent at at least two positions of a tetrazole ring is preferable, and a structure having a ring structure substituent at three positions is more preferable.
  • the tetrazolium compound has a ring structure substituent at at least two positions of the tetrazole ring, it is preferable that the tetrazole compound has the substituent at the 2-position and the 3-position of the tetrazole ring. Further, when the tetrazolium compound has a ring structure substituent at three positions, it is preferable that the tetrazole compound has the substituent at the 2-, 3- and 5-positions of the tetrazole ring.
  • the ring structure of the structural substituent is preferably a benzene ring.
  • the ring structure substituent other than the benzene ring examples include a substituent having a ring structure containing S or O and having a resonance structure, and examples thereof include a phenyl group and a thiazolyl group.
  • the tetrazolium compound has a ring structure substituent at at least three positions of a tetrazole ring, and that the ring structure of at least two of the ring structure substituents is a benzene ring.
  • At least one ring structure substituent has a functional group, and it is more preferable that the number of the functional groups is large.
  • an electron-withdrawing functional group is preferable, and examples thereof include an octane group, an ether group, an ester group, a carboxy group, an acyl group, a nitroso group, a nitro group, a hydroxy group, and a sulfo group.
  • characteristic groups containing oxygen such as a hydroperoxy group, an oxy group, an epoxy group, an epidioxy group, and an oxo group; And a phenylsulfonyl group, a p-toluenesulfonyl group, a P-tolylsulfonyl group, a tosyl group, a sulfamoyl group, and an isothiocynate group.
  • electron-withdrawing functional groups preferred are a nitro group, a sulfo group, a halogen group, a carboxy group, a hydroxy group, a methoxy group, and an ethoxy group.
  • the functional group may be ionized by dissociation.
  • the tetrazolium compound has a benzene ring at the 2-position and 3-position of the tetrazole ring, and at least one of the benzene rings has a halogen group, a carboxy group, a nitro group, a hydroxy group, a sulfo group, a methoxy group, It preferably has at least one functional group selected from the group consisting of ethoxy groups.
  • both the benzene rings may have the functional group.
  • the benzene ring may have the functional group at any position (ortho-, meta-, pra-).
  • the number of functional groups is not particularly limited, and may have the same functional group or different functional groups.
  • the tetrazolium compound may be, for example, a compound having a benzene ring structure substituent at the 2-, 3-, and 5-positions of the tetrazole ring, for example, 2- (4-thiophene) -3- (4--2 5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt (hereinafter also referred to as “WS T_ 3”), 2- (4-iodophenyl) -3- (2,4- Dinitrophenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 2- (2-methoxy-4-diphenyl) -3- (4-diphenyl) -5- (2,4-disulfophenyl) -2H-tetrazolium salt, 2- (4-odophenyl) -3- (4-diphenyl) -5-phenyl-2H-tetrazolium salt, 3, 3 '-( 1,1'
  • the tetrazolium compound is not limited to the above-mentioned compounds, and in addition, a compound having a benzene ring structure substituent at two places of the tetrazole ring and another ring structure substituent at one place.
  • 2,3-diphenyl-5- (2-phenyl) tetrazolium salt 2-benzothiazol-3- (4-carboxy-2-methoxyphenyl) -5- [4- (2-sulfoethyl [2] -Dibenzothiazolyl-5,5'-bis [4-di (2-sulfoethyl) -rubamoylphenyl] -3,3 '-(3,3 '-Dimethoxy-4,4'-biphenylene) ditetrazolium salt and 3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2H-tetrazolium salt.
  • tetrazolium compounds having a benzene ring structure substituent at two positions of the tetrazole ring and a non-ring structure substituent at one position can also be used.
  • 2,3-diphenyl-5-cyanotetrazolium salt 2,3-diphenyl-5-potoxytetrazolium salt, 2,3-diphenyl-5-methyltetrazolium salt, 2,3-diphenyl-5-ethyltetrazolium salt And the like.
  • a compound having three ring structure substituents is preferable, and more preferably a compound having three ring structure benzene rings and having an electron-withdrawing functional group.
  • the palladium compound may be, for example, a salt or may be in an ionized state.
  • one kind of the tetrazolium compound may be used, or two or more kinds may be used in combination.
  • This embodiment uses an example in which FAOD-Q! Is used to decompose the glycated amino acid and FAOD-aS is used to measure glycated Hb, and an oxidation-reduction reaction is performed in the presence of a tetrazolium compound and sodium azide. It is.
  • the whole blood is directly lysed, or a blood cell fraction is separated from the whole blood by a conventional method such as centrifugation and lysed to prepare a hemolyzed sample.
  • the hemolysis method is not particularly limited, and examples thereof include a method using a surfactant, a method using ultrasonic waves, and a method using a difference in osmotic pressure. Among them, the method using the surfactant is preferable because of the simplicity of the operation and the like.
  • the surfactant examples include polyoxyethylene _p_t-octylphenyl ether (Triton-based surfactant and the like), polyethylene sorbitan alkyl ester (Tween-based surfactant and the like), polyoxyethylene alkyl ether ( Nonionic surfactants such as Brij-based surfactants and the like can be used, and specific examples include TritonX-100, Tween-20, and Brij35.
  • the treatment conditions with the surfactant are usually such that when the blood cell concentration in the treatment solution is 1 to 10% by volume, the interface is adjusted so that the concentration in the treatment solution is 0.01 to 5% by weight. Add the activator and stir at room temperature for several seconds (about 5 seconds) to about 10 minutes.
  • the tetrazolium compound when the blood cell concentration in the treatment solution is 0.2 to 2% by volume, the tetrazolium compound is preferably added so as to have a concentration of 0.005 to 400 mmo1 / L, more preferably. Is in the range of 0.02 to 100 mmO 1, particularly preferably in the range of 0.1 to 50 mm O 1 / L. Specifically, when the tetrazolium compound is WST-3, it is preferably added to a concentration of 0.004 to 16 mmo 1 L, more preferably 0.02 to 1 Ommo 1 / L. It is in the range, particularly preferably in the range from 0.1 to 5 mmo 1.
  • the tetrazolium compound may be used alone or in combination of two or more. By adding the tetrazolium compound and sodium azide as described above, the sensitivity is improved in a range of about 1.2 to 3 times as compared with the case without addition.
  • the tetrazolium compound and sodium azide may be directly added to the hemolyzed sample.
  • a tetrazolium compound solution and a sodium azide solution dissolved in a solvent or as a solution containing both a tetrazolium compound and sodium azide (a mixed solution of a tetrazolium compound and sodium azide) It is preferred to use.
  • the concentration of the tetrazolium compound or sodium azide in the various solutions can be appropriately determined according to the dilution factor when added to the hemolyzed sample, and the concentration of the tetrazolium compound is, for example, 0.1 to 10 mm. o 1, preferably 0.6 to 5 mmo 1 ZL, more preferably 0.7 to 2.7 mmo 1 ZL.
  • the concentration of sodium azide is, for example, in the range of 0.1 to 4 mmo 1 ZL, preferably in the range of 0.1 to 5: L in the range of 8 mmo 1 ZL, and more preferably in the range of 0.2 to 1.5 mmo. It is in the range of 1 / L.
  • buffers such as MOP S, MES, MOP SO, DIP SO, TES, POP S ⁇ , HE PES, and phosphoric acid can be used. It is.
  • the pH of the solvent is, for example, in the range of 5.0 to 7.0, and preferably in the range of 5.5 to 6.5.
  • the concentration of the buffer is, for example, in the range of 0.1 lmmol / L to 10 mmo1 / L.
  • the final concentration in the treatment solution when added to the hemolyzed sample is, for example, 0. ⁇ L, Preferably, it is in the range of 0.8 to 4.5 mmo 1 ZL, more preferably in the range of 0.8 to 2.7 mmo 1 / L.
  • the prepared mixture of the tetrazolium compound and sodium azide is aged for a certain period of time before being added to the hemolyzed sample.
  • the sensitivity is improved by, for example, about 1.2 to 3 times as compared with the case where no aging is performed.
  • the treatment temperature is preferably in a range of 40 to 60 t :, more preferably in a range of 50 to 60 :.
  • Processing time is For example, it is in the range of 6 to 72 hours, preferably in the range of 15 to 20 hours.
  • the sample is usually incubated at a treatment temperature of 40 to 60 for 6 to 72 hours to pretreat the sample.
  • a treatment temperature 40 to 60 for 6 to 72 hours.
  • the tetrazolium compound contributes to the improvement of measurement accuracy, but the improvement of measurement sensitivity, which is one of the objects of the present invention, requires the coexistence of not only a tetrazolium compound but also sodium azide. Therefore, the effects specific to the present invention are exhibited.
  • a protease treatment is performed on the pretreated hemolyzed sample to which the tetrazolium compound and sodium azide have been added. This is to make it easier for the FAOD used in the subsequent processing to act on the measurement object.
  • the protease treatment is performed in the presence of the tetrazolium compound as described above, the saccharified Hb can be rapidly decomposed.
  • protease for example, serine protease, thiol protease, meta-oral proteinase and the like can be used.
  • trypsin, proteinase K :, chymotrypsin, papain, bromelain, subtilisin, elastase, amino acid Peptidase and the like can be used, and preferred are bromelain, papain, trypsin derived from butteren, meta-mouth proteinase, and protease derived from Bacillus subtilis, which selectively decompose the glycated Hb.
  • Bacillus subtillis-derived protease examples include trade name protease N (for example, And Protease N "Amano" (manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • meta-mouth proteinase examples include Bacillus-derived meta-mouth proteinase (EC 3.4.24.4) (for example, Toyobo, trade name, manufactured by Toyobo Co., Ltd.) and the like.
  • meta-oral proteinase, bromelain and papain are more preferable, and meta-oral proteinase is particularly preferable.
  • the protease treatment is usually performed in a buffer solution, and the treatment conditions are appropriately determined depending on the type of protease used, the concentration of glycated Hb, and the like.
  • the buffer for example, CHES buffer, CAPSO buffer, CAPS buffer, phosphate buffer, Tris buffer, EPPS buffer, HEPS buffer, and the like can be used.
  • the pH is, for example, in the range of 6 to 13, preferably in the range of 8 to 12, and more preferably in the range of 9 to 11.
  • the final concentration of the buffer in the protease treatment solution is, for example, in the range of 1.0 to: L Ommo 1 ZL.
  • the concentration of the medium-mouth proteinase in the reaction solution is usually 0.1 to 40 MUZL
  • the blood cell concentration is 0.05 to 15% by volume
  • the reaction temperature is 15 to 37
  • the reaction time is 1 minute to 24 hours
  • the pH is 6 to 12.
  • the concentration of the protease in the reaction solution is 10 to 300 KUZL, and the concentration of the blood cell in the reaction solution is 0.0.
  • the range is 5 to 15% by volume, the reaction temperature is 15 to 37, the reaction time is 1 minute to 24 hours, and the pH is 6 to 12.
  • the type of the buffer is not particularly limited, and for example, a Tris-HCl buffer, an EPPS buffer, a PIPES buffer and the like can be used.
  • F AOD- ⁇ F OD for degradation
  • R 1 represents the same sugar residue as described above
  • R 3 is the same as described above. Shows the amino acid side chain.
  • the glycated amino acid in which the ⁇ -amino group is saccharified contained in the hemolyzed sample, and the saccharified portion of the ⁇ -amino group in the glycated Hb degradation product are decomposed.
  • the processing conditions include, for example, a concentration of F AOD_ ⁇ in the reaction solution of 10 to 500 U / L, a blood cell concentration of 0.5 to 20% by volume in the reaction solution, a reaction temperature of 20 to 50, and a reaction time of 1 to 50%. Minutes to 1 hour, ⁇ ranges from 6 to 9.
  • This treatment is usually performed in a buffer solution, and the same buffer solution as used in the protease treatment can be used.
  • the FAOD- ⁇ -treated hemolyzed sample is further treated with FAOD_aS.
  • This FAOD-aS acts on both the glycated ⁇ -amino group and the glycated side chain amino group as described above.
  • the saccharified Hb hydrolyzate has been treated in advance with FAOD- ⁇ for decomposition, the FAOD-S for measurement can act only on the glycated side chain amino group.
  • This F AOD-H-S treatment is preferably performed in a buffer as in the case of the protease treatment.
  • the buffer is not particularly limited, and the same buffer as in the case of the protease treatment can be used. .
  • the processing conditions include, for example, a concentration of F AOD_aS in the reaction solution of 10 to 30,000 UZL, a blood cell concentration of 0.1 to 5% by volume in the reaction solution, and a reaction temperature of 20 to 50, Reaction time 1 minute to 1 hour, ⁇ 6 to 9
  • hydrogen peroxide generated by the F AOD-aS treatment is measured by an oxidation-reduction reaction using an oxidase and a chromogenic substrate.
  • Examples of the coloring substrate include DA-64, orthophenylenediamine (OPD), and a substrate obtained by combining a Trinder reagent with 4-aminoantipyrine.
  • Examples of the Trinder reagent include phenol, phenol derivatives, aniline derivatives, naphthol, naphthol derivatives, naphthylamine, naphthylamine derivatives and the like.
  • an aminoantipyrine derivative, vanillindiaminesulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH) and the like can also be used.
  • DA-64 is particularly preferable as described above.
  • POD oxidase
  • the oxidation-reduction reaction is usually performed in a buffer, and the conditions are appropriately determined depending on the concentration of the generated hydrogen peroxide and the like. Normally, the POD concentration in the reaction solution is from 10 to: LOO, 0,000 IU / L, the concentration of the chromogenic substrate is from 0,05 to 30,0 mmo1, and the reaction temperature is from 15, to 37, and the reaction time is 0.1. ⁇ 30 minutes, p H 5-9.
  • the buffer is not particularly limited.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by measuring the degree of color development (absorbance) of the reaction solution with a spectrophotometer. Then, for example, the amount of saccharified Hb in the sample can be obtained by using a calibration curve indicating a correlation between the amount of hydrogen peroxide and the amount of saccharified Hb prepared in advance and the measured amount of hydrogen peroxide.
  • the hydrogen peroxide generated by the degradation F AOD—first added is eliminated by catalase that is originally present in the blood sample (hemolysis sample). It does not affect the determination of hydrogen peroxide from the source.
  • quenching may be performed by adding a separate enzyme.
  • the addition of FAOD-aS is performed in order to prevent the elimination of even the hydrogen peroxide generated in the subsequent measurement FAOD-aS treatment.
  • it is preferable to add the activity (U) of the POD to, for example, 5- to 100-fold the amount (U) of the enzyme.
  • uric acid contained in the sample can be further decomposed, and by treating with pyrilvinoxidase, pyrilbin can be decomposed. Since uric acid and pyrilvin have a reducing power, such treatment can further remove the influence of reducing substances and improve measurement accuracy.
  • the addition ratio of pericase or pyrilvinoxidase is determined by the reaction solution
  • the concentration of the enzyme in the reaction solution is 0.1 to 5000 UZL
  • the concentration of pyrirubin oxidase is 0.1 to 5,000 UZL.
  • the concentration of pericax is from 1 to 2000
  • the concentration of pyrirubinoxidase is from 0.5 to 1,000 U / L. It is.
  • the processing conditions may be, for example, the same as those for the decomposition FAOD.
  • the protease treatment is not limited to before the decomposition FAD- ⁇ treatment as described above, and may be performed, for example, after the FAOD- ⁇ treatment.
  • the protease treatment is performed to facilitate the action of FAOD.However, since the FAOD- ⁇ treatment is performed for the purpose of decomposing the glycated amino acid, the FAOD- ⁇ This is because the effect of the present invention can be sufficiently obtained even if Hb is not decomposed.
  • the measuring method of the present invention is not limited to the operation order of the present embodiment, and for example, there are steps that may be performed simultaneously.
  • the hemolysis treatment, the tetrazolium compound and sodium azide treatment, and the FAD treatment for degradation may be performed simultaneously, or the protease treatment and the tetrazolium compound and sodium azide treatment are performed simultaneously. Can also. Note that these combinations are not limited.
  • the amount of hydrogen peroxide can be measured by, for example, an electrical method in addition to the enzymatic method using the POD or the like.
  • This embodiment is an example in which the same FAOD is used for decomposing glycated amino acids and measuring glycated Hb.
  • FAOD is not particularly limited.
  • Any of FAOD-, FAOD-S, and FAOD-aS may be used. The measurement is performed in the same manner as in Embodiment A-1 unless otherwise specified.
  • Specific treatment conditions include, for example, a concentration of F AOD for decomposition in the reaction solution of 10 to 500 UZL, a blood cell concentration of 0.5 to 20% by volume in the reaction solution, and a reaction temperature of 20 to 50%. : Reaction time 1 minute to 1 hour, pH 6 to 9 This treatment is usually performed in a buffer, and the same buffer as described above can be used.
  • protease treatment is performed on the F AOD-treated sample for decomposition.
  • the first purpose of this protease treatment is to degrade glycated Hb derived from blood cells and facilitate the action of FAOD for measurement, which is further added in a later step, as described above.
  • the second purpose is to digest and inactivate the degradation FAOD.
  • the protease is not particularly limited, and the same protease as described above can be used.
  • the processing conditions include, for example, the type of protease used.
  • the concentration is appropriately determined according to the concentration of saccharified Hb, the type and amount of the degradation FAOD, and the like.
  • the amount of the protease to be added to the reaction solution for the protease treatment is, for example, in the range of 1 to: L0000, 000 KU / L, and preferably in the range of 10 to 300,000, based on FAOD 100 UZL for decomposition. It is in the range of KUZL, and more preferably in the range of 100 to 100,000 KUZL.
  • the concentration of the protease in the reaction solution is from 1,000 to 30,000 KUZL
  • the concentration of the blood cell in the reaction solution is from 0.2 to 5 volumes. %
  • FAO D concentration in the reaction solution 10 to 100 O.UZL Reaction temperature 20 to 50: Reaction time 10 to 20 hours, pH 6 to 9.
  • the same FAOD as the FAOD for degradation is added again to the saccharified Hb hydrolyzate obtained by the protease treatment, as the FAOD for measurement, and then processed.
  • This FAOD for measurement needs to be added in a sufficient amount because it may be inactivated by the protease.
  • This FAOD treatment for measurement is also preferably performed in a buffer as described above.
  • the buffer is not particularly limited, and the same buffer as used in the protease treatment can be used.
  • the addition amount of the measurement FAOD in the reaction solution of the measurement FAOD treatment is, for example, in the range of 100 to 100,000 UZL per 100,000 KUZL of the protease, and preferably in the range of 100 to 200,000 UZL. , 000 / L, more preferably in the range of 500 to 50,000 U / L.
  • Specific treatment conditions include, for example, a measurement FAOD concentration of 500 to 200,000 U / L in the reaction solution, a protease concentration of 100 to 300,000 KUZL in the reaction solution, Blood cell concentration 0.0 1 to 1% by volume, reaction temperature Degree 15-40: Reaction time 1 minute-1 hour, pH 6-9. (Embodiment A-3)
  • This embodiment is an example in which the same FAOD is used for decomposing glycated amino acids and measuring glycated Hb. Unless otherwise indicated, the measurement is performed in the same manner as in Embodiment A-1.
  • this embodiment is different from the embodiment A-2 in that the FAOD for degradation does not necessarily have to be inactivated by protease. Due to the substrate specificity of the enzyme, it may be difficult to inactivate FAOD with protease, depending on the combination of protease and FAOD. In such a case, the method of the present embodiment is effective. If the FA-D for degradation added at the beginning reacts with the saccharified Hb digest generated by protease, the measurement accuracy cannot be improved.Therefore, the addition ratio of FAOD is adjusted as shown below. It is important to:
  • the degradation FAOD is difficult to inactivate with protease, it must be added during protease treatment within a range that does not affect the generated saccharified Hb degradation product, even if the activity remains. Further, since FAOD has a property of acting on glycated amino acids and being less likely to act on glycated proteins, it is preferable that FAOD is added in such an amount that it acts only on glycated amino acids, and that the reaction time is set.
  • Conditions for the FAOD treatment include, for example, a FAOD concentration of 10 to 5,000 UZL in the reaction solution, a blood cell concentration of 0.2 to 20% by volume in the reaction solution, a reaction temperature of 20 to 50, and a reaction time of 1 minute. ⁇ 1 hour, pH 6-9.
  • This treatment is usually performed in a buffer, and the same buffer as described above can be used.
  • protease treatment is performed on the FAOD-treated sample. As described above, this embodiment is an example in which the protease hardly acts on the FAOD, and thus the amount of the protease to be added is not particularly limited.
  • the protease is not particularly limited, and the same protease as described above can be used.
  • the treatment conditions are appropriately determined in the same manner as described above, depending on the type of protease used, the concentration of glycated Hb, the substrate specificity of the protease used for FAOD, and the like.
  • Examples of the combination of FAOD and protease corresponding to such an embodiment include, for example, a trade name of FOD (manufactured by Asahi Kasei Corporation) and a trade name of Toyoteam (manufactured by Toyobo Co., Ltd.); ).
  • the protease concentration in the reaction solution is 100 to 6000 UZL
  • the blood cell concentration in the reaction solution is 0.2 to 5% by volume
  • the FAOD concentration in the reaction solution is 1 ⁇ : L 00 U ZL, reaction temperature 20 to 50, reaction time 10 minutes to 20 hours, pH 6-9.
  • This FAOD treatment for measurement is also preferably performed in a buffer as described above.
  • the buffer is not particularly limited, and the same buffer as used in the protease treatment can be used.
  • the FAOD for decomposition remains in the reaction solution, but the reaction rate of the remaining FAOD is extremely slow, so that the FAOD is measured in the protease treatment step.
  • the residual FAOD does not act on the generated saccharified Hb hydrolyzate to such an extent as to affect the reaction.
  • the processing conditions include, for example, a concentration of F AOD for measurement in the reaction mixture of 500 to 20,000 U / L, a concentration of protease in the reaction mixture of 100 to 30,000 KU / L, and blood cells in the reaction mixture.
  • the concentration is 0.01-1% by volume
  • the reaction temperature is 15-40T
  • the reaction time is 1 minute-1 hour
  • the pH is in the range of 6-9.
  • This embodiment is an example in which DA-64 is used as a chromogenic substrate to measure hydrogen peroxide generated by the measurement FAOD treatment. Unless otherwise indicated, the same operation is performed as in the embodiment A-1.
  • the final concentration of DA-64, tetrazolium compound, sodium azide and surfactant in the above redox reaction solution should be set to prevent erroneous coloring of DA_64. Is set in the following range.
  • the final concentration of each component is usually DA-64 1 to 100, 000 ⁇ mo1 / L, surfactant 0.01 to 20 Ommo 1 ZL, tetrazolium compound 0.05 to 2 Ommo 1 L , Sodium azide 0.01 to 5 mmol ZL, preferably DA—64 to 1000 / mol / L, surfactant 05 to 30 mmol / L, tetrazolium compound 0.0 1 to 10 mmol / L, sodium azide 0.02 to 2 mmo1 ZL, more preferably DA-643 to 300; mol / L, surfactant 0.1 to 10 mmo 1 L, tetrazolium compound 0.5 to 8 mmol ZL, sodium azide 0.08 to 0.8 mmo 1.
  • the surfactant particularly, Without being limited, for example, those described above and below can be used.
  • the pH of the oxidation-reduction reaction solution is preferably in the range of 6.0 to 10.0, more preferably in the range of 6.5 to 9.0, and particularly preferably in the range of 7.0 to 8.5.
  • the addition of the surfactant may be performed, for example, before or at the same time as the addition of DA-64, or if a surfactant is added to prepare a hemolyzed sample, it may be added during the oxidation-reduction reaction.
  • the surfactant may be added in advance so as to be in the above-mentioned concentration range.
  • the DA-64 develops a color through an oxidation-reduction reaction, if the absorbance (about the color development) of the reaction solution in a detection wavelength range of 600 to 780 nm is measured by a spectrophotometer, hydrogen peroxide can be obtained. Can be measured.
  • the Hb amount can be measured, for example, as described below.
  • a tetrazolium compound as described above is added to the hemolyzed sample to denature Hb.
  • the concentration in the hemolyzed sample is 0.2 to 2% by volume, it is preferably added so that the concentration is in the range of 005 to 40 Ommo 1 ZL, and more preferably 0.
  • the range is from 02 to 100 mmo 1 / L, particularly preferably from 0.1 to 5 Ommo 1 ZL.
  • the tetrazolium compound is WST-3, it is preferable to add the compound so that the concentration is in the range of 0.004 to 16 mmo1 ZL. More preferably, it is in the range of 0.02 to 10 mmol ZL, particularly preferably in the range of 0.1 to 5 mmol ZL.
  • the tetrazolium compound may be used as it is, but is preferably used as a solution of the tetrazolium compound dissolved in a solvent from the viewpoint of easy operation and processing efficiency.
  • concentration of the solution can be appropriately determined depending on the type (eg, molecular weight, etc.) of the tetrazolium compound, and is, for example, in the range of 0.01 to: L 20 mmo 1 ZL, preferably in the range of 0 :! It is in the range of mmol / L, more preferably in the range of 0.2 to 20 mmolZL.
  • the solvent for example, distilled water, physiological saline, buffer, and the like can be used.
  • buffer for example, the above-mentioned buffer and the like can be used.
  • the tetrazolium compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the conditions for the treatment with the tetrazolium compound are not particularly limited.
  • the temperature is in the range of 4 to 50 "
  • the treatment time is in the range of 20 seconds to 60 minutes, and preferably, the temperature is in the range of 15 to 40, and the treatment time is 20 seconds.
  • the temperature is in the range of 25 to 37, and the processing time is preferably in the range of 30 seconds to 6 minutes.
  • the treatment with the tetrazolium compound is preferably performed in the presence of a surfactant. This can further promote the denaturation of Hb. For this reason, a tetrazolium compound may be added in advance at the time of hemolysis of the sample for convenience of operation and the like.
  • polyoxyethylene ether polyoxyethylene phenol ether, polyoxyethylene sorbin alkyl ester, polyoxyethylene alkyl ether and the like can be used.
  • This polyoxyethylene ether is preferred.
  • the Poriokishe Chiren'eteru [C L H M -0- (CH 2 CH 2 0) N H] is polyoxy
  • the ethylene chain and the hydrocarbon chain are ether-bonded, and examples of the hydrocarbon chain include an alkyl group and an alkylphenyl group.
  • the weight average polymerization degree (N) of the polyoxyethylene chain is preferably in the range of 8 to 23, and the carbon number (L) of the other hydrocarbon chain is preferably in the range of 8 to 18.
  • the weight average degree of polymerization (N) is in the range of 8 to 15, and the number of carbon atoms (L) in the hydrocarbon chain is in the range of 8 to 16.
  • the weight average degree of polymerization is (N) is in the range of 8 to 10
  • the carbon number (L) of the hydrocarbon chain is in the range of 8 to 14.
  • the hydrocarbon chain may be, for example, a straight chain or may have a branched chain.
  • the polyoxyethylene ether include polyoxyethylene-1-pt-octylphenyl ether, polyethylene glycol (10) lauryl ether, polyethylene glycol (9) lauryl ether, and the like.
  • Triton-based surfactant that is polyoxyethylene-pt-octyl phenyl ether
  • Tween-based surfactant that is a polyoxyethylene sorbitan alkyl ester
  • Brij-based surfactants which are ethers
  • polyoxyethylene (10) lauryl ether trade name Nikkol BL-9EX (weight average degree of polymerization of polyoxyethylene N: 9: manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 9) Lauryl ether, trade name T ergito 1 NPX (polyoxyethylene weight average polymerization degree N is about 10.5: manufactured by Nacalai Tesque) and trade name T ergito 1 NP-40 (weight average polymerization of polyoxyethylene) (N: 20: manufactured by Nacalai Tesque, Inc.).
  • these surfactants can also be used as a hemolytic surfactant. Monkey
  • the amount of the surfactant added is not particularly limited.
  • the surfactant is added so that the concentration is in the range of 0.05 to 50 mmo 1 ZL. It is more preferably in the range of 0.2 to 3 Ommo 1 ZL, particularly preferably in the range of 0.3 to: L 0 mmo 1 ZL.
  • the surfactant has a trade name of TritonX-100, it is preferable to add the surfactant in a concentration of 2 to 10 Ommo 1 L, more preferably 1 to 3 Ommo 1 ZL. Preferably it is in the range of 2 to 2 Ommo 1.
  • the concentration is in the range of 0.1 to 50 mmoL, more preferably in the range of 0.5 to 20 mmolZL, and particularly preferably in the range of 1 to L. It is in the range of 10 mmo 1 ZL.
  • the surfactant may be added to the tetrazolium compound in an amount of, for example, 0.1 to 70 mmo 1 with respect to 0.5 to 5 mm 0, and preferably 0.3 to 50 mm 0. l, more preferably in the range of 0.4 to 2 Ommo1.
  • the surfactant is trade name Triton X-100
  • the range is from 0.5 to 10 mmol, particularly preferably from 0.7 to 5 mmol.
  • the tetrazolium compound in an amount of 0.1 to L: 0 mmo 1 per 1 mmo 1, more preferably 0.2 to 1 mmo 1. It is in the range of 8 mmo1, particularly preferably in the range of 0.3 to 4 mmo1.
  • the surfactant may be added in advance in a sufficient amount to promote Hb denaturation at the time of hemolysis of the sample.
  • the measurement wavelength is as described above.
  • the range is preferably from 520 to 670 nm, more preferably from 550 to 660 nm.
  • the sub wavelength is preferably in the range of 730 to 900 nm, more preferably in the range of 800 to 90 O nm, and particularly preferably 800 nm. It is in the range of nm850 nm.
  • the amount of Hb is determined from the measured absorbance of the denatured Hb and the calibration curve prepared in advance, and the Hb saccharification rate can be calculated from the saccharified Hb amount and the Hb amount measured as described above.
  • the calibration curve is created from, for example, a standard sample containing a known amount of Hb measured by the above-described Hb measurement method and a known measurement method, and from these measured values.
  • the known measurement method is not particularly limited as long as it is a method having excellent measurement accuracy.
  • the international standard HiCN method is preferable.
  • the absorbance measurement of denatured Hb for determining the amount of Hb may be performed, for example, by taking a part of a hemolyzed sample prepared for glycated Hb measurement and using it as a sample for Hb measurement. However, it is preferable to perform it in the step of measuring glycated Hb because the operation can be performed easily and quickly.
  • the absorbance of the denatured Hb can be measured.
  • glycated Hb was treated in the same manner as in Embodiment A-1. Measure the amount.
  • a saccharified Hb standard solution having a known Hb A1c amount was prepared, and the saccharified Hb amount was measured in the same manner as described above. Create a calibration curve showing the relationship between) and the amount of HbAlc.
  • the measured value of glycated Hb and the amount of HbA1c are correlated, if the measured value of glycated Hb in the whole blood sample is substituted into this calibration curve, the whole blood The amount of HbA1c in the sample can be determined.
  • the measured value of the glycated Hb amount is not only the saccharified Hb amount finally obtained, but also the absorbance of the reaction solution obtained by the POD treatment in the measurement of the glycated Hb amount. Or the amount of hydrogen peroxide determined from the absorbance may be used.
  • the measurement kit of the present invention will be described with reference to an example in which the measurement target is glycated Hb.
  • This embodiment is an example of the first measurement kit using FAOD-a for FAOD for decomposition of a pretreatment reagent and FAOD-aS for FAOD for measurement of a coloring reagent.
  • This measurement kit is composed of a pretreatment reagent containing FAOD for degradation, a protease reagent containing protease, and a coloring reagent containing FAOD for measurement, oxidoreductase and a chromogenic substrate.
  • pretreatment reagents protease reagents, and coloring reagents can be prepared by dissolving the components to be contained in an aqueous solvent.
  • the pretreatment reagent is diluted, for example, 10- to 200-fold, preferably 20- to 100-fold, in the final color reaction solution.
  • concentration of FAOD and the like contained in the pretreatment reagent can be appropriately determined, for example, according to the dilution factor and the like.
  • the amount of the pretreatment reagent added to the sample can be adjusted. Good 0
  • the concentration of the FAOD for decomposition in the pretreatment reagent is, for example, in the range of 10 to 5000 UZL.
  • the aqueous solvent is not particularly restricted but includes, for example, water and buffers containing various buffers as described above.
  • buffers CHE S, MOP S, TAP S, EPPS, phosphoric acid, HEPP SO, POP SO, and boric acid are preferred, and CHE S, MOP S, TAP S, and phosphate are more preferred. It is.
  • the concentration of the buffer is, for example, in the range of 5 to 200 mol 1 L, and preferably in the range of 20 to 150 mol ZL.
  • the pH of the buffer is, for example, in the range of pH 8 to 10, and preferably in the range of 8.5 to 10.0.
  • this pretreatment reagent may further contain the following components in addition to the separation FAOD.
  • a surfactant for example, various surfactants as described above can be used, and preferred are polyoxyethylene alkyl ether and polyoxyethylene octyl phenyl ether.
  • the surfactant concentration is, for example, in the range of 0.03 to 20 Ommo 1 ZL, preferably in the range of 0 :! to 5 Ommo 1 ZL.
  • lipase When lipase is contained, its concentration is, for example, in the range of 1 to 200 UZL, and when it contains pyrirubin oxidase, its concentration is, for example, in the range of 1 to 200 UZL. . In addition, you may contain these both. (Protease reagent)
  • the protease reagent is diluted, for example, 1.1 to 3 times in the final color reaction solution. Therefore, similarly to the above-mentioned pretreatment reagent, the concentration of each component can be appropriately determined according to the dilution factor and the like, and the amount added to the sample is changed according to the amount of glycated Hb in the sample and the like. By doing so, the amount of protease in the reaction system may be adjusted.
  • the concentration of the protease in the protease reagent is, for example, in the range of 0.5 to 100 MUZL, and preferably in the range of 1 to 40 MUZL when the protease is a meta-oral protease.
  • the aqueous solvent is not particularly restricted but includes, for example, water and buffers containing various buffers as described above.
  • buffers MES and MOPS are preferable, and MES is more preferable.
  • concentration of the buffer is, for example, in the range of 1-2 Ommo 1 ZL, preferably in the range of 1-5 mmo 1 ZL.
  • the pH of the buffer is, for example, in the range of pH 5.0 to 7.0, and preferably in the range of 5.5 to 6.5.
  • the protease reagent may further contain the following components in addition to the protease.
  • the protease reagent has, for example, a tetrazolium compound concentration in the range of 0.1 to 1 Omo 1 ZL, a sodium azide concentration in the range of 0.05 to 4 mmo 1 L, and preferably Lazolium compound concentration is in the range of 0.6 to 5 mmo1 / L, and sodium azide concentration is in the range of 0.15 to 1.8 mol / L.
  • the addition ratio of the tetrazolium compound (C) and sodium azide (D) is (mol
  • a meta-oral protease When a meta-oral protease is used as a protease, it may further contain a Ca compound and an Na compound.
  • the C a compound Contact and N a compound in the aqueous solvent is not particularly limited as long as it I turned into C a 2 + Oyobi N a +, as the C a compound, Example in example, calcium chloride (C a C l 2), C a S0 4, (CH 3 COO) 2 C a and the like can be used, preferably a C a C l 2, C a S_ ⁇ 4.
  • N a compound for example, sodium chloride (N a C l), CH 3 COON a, N a 2 S 0 4, NaN0 3 or the like can be used, preferably N a C and Na 2 S_ ⁇ 4
  • C a compounds and N a compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the meta-oral protease ranges from 0.5 to 100 MUZL, and preferably from 1 to 40 MUZL, as described above.
  • the concentration of the Ca compound is in the range of 0.1 to 50 mmo1 / L so that the dissociated Ca2 + concentration is in the range of 0.1 to 5 mmo1 / L.
  • the concentration of the Na compound is in the range of 5 to: I 00 Ommo 1 ZL, and preferably in the range of 10 to 100, so that the dissociated Na + concentration is in the range of 5 to 1000 mMol ZL.
  • the range is 30 Ommo 1.
  • the color-forming reagent is diluted 2 to 20 times, preferably 3 to 10 times, more preferably 4 to 8 times in the final color reaction solution.
  • concentration of each component can be appropriately determined according to the dilution ratio, etc., as described above, and the amount of addition varies depending on the amount of saccharified Hb and the generated hydrogen peroxide in the sample.
  • Each component in the reaction system May be adjusted.
  • the concentration of the measurement FAOD in the color-forming reagent is, for example, in the range of 1 to 200 KUZL, and preferably in the range of 5 to 100 KUZL.
  • the concentration of the oxidoreductase is, for example, in the range of 1 to 100 KUZL, and preferably in the range of 100 to 200 KU / L.
  • Examples of the oxidoreductase include PD as described above.
  • the concentration of the chromogenic substrate is, for example, in the range of 0.001 to: LO Ommol ZL, preferably in the range of 0.05 to 1 Ommol ZL, more preferably in the range of 0.02 to It is in the range of lmmo1 / L.
  • LO Ommol ZL preferably in the range of 0.05 to 1 Ommol ZL, more preferably in the range of 0.02 to It is in the range of lmmo1 / L.
  • Examples of the chromogenic substrate include those described above.
  • the aqueous solvent is not particularly restricted but includes, for example, water and buffers containing various buffers as described above.
  • buffers Tris and phosphoric acid are preferred.
  • the concentration of the buffer is, for example, in the range of 20 to: L000 mmO1ZL, preferably in the range of 50 to 500 mmO1ZL.
  • the pH of the buffer is, for example, in the range of pH 6 to 9, and preferably in the range of 6.5 to 8.
  • a hemolyzed sample is prepared from whole blood in the same manner as in the embodiment A-1, and the pretreatment reagent is added to the hemolyzed sample to cause the FAOD for degradation to act on glycated amino acids in the sample. To break it down.
  • the glycated amino acid in which the ⁇ -amino group is glycated and the glycated portion of the ⁇ -amino group in the glycated Hb degradation product contained in the hemolyzed sample are degraded.
  • those in which the side chain amino group is glycated may be used. It remains without being decomposed.
  • the amount of the pretreatment reagent to be added is preferably, for example, in the range of 300 to 300 ⁇ L with respect to 30 L of the hemolysis sample having a blood cell concentration of 30 to 60% by volume. Or in the range of 600-2400 L.
  • the pretreatment reaction solution to which the pretreatment reagent has been added preferably has a concentration of the FAOD for degradation in the range of 10 to 500 Umo 1 ZL based on a blood cell concentration of 1% by volume.
  • the pH of the treatment solution is preferably in the range of 8 to 10, more preferably 8.5 to: L0.
  • the pretreatment reagent before incubating, and the conditions are, for example, 10 to 37, 0:! To 20 minutes, preferably 15 to 37 °. C, 0 .:! ⁇ 5 minutes.
  • the pretreatment reagent contains a surfactant, for example, it is not necessary to separately perform a hemolysis treatment as described above to prepare a hemolysis sample. That is, by adding a pretreatment reagent to a whole blood or blood cell sample, both hemolytic treatment with a surfactant and degradation treatment of glycated amino acids with FAOD for degradation can be performed.
  • the pretreatment reaction solution to which the pretreatment reagent has been added preferably has a surfactant concentration in the range of 0.05 to 50 mmol ZL with respect to a blood cell concentration of 1% by volume, more preferably Is in the range of 0.2 to 30 mmol ZL, particularly preferably in the range of 0.3 to 10 mol / L.
  • the pretreatment reagent contains pericamase and pyrirubin oxidase as described above, the pericacase concentration of the treatment reagent is 0.4 to 400 0 with respect to a blood cell concentration of 1% by volume.
  • the oxidase concentration is in the range of 0.4 to 4000 UZL, more preferably, the pericase concentration is in the range of 3 to 1,500 UZL, and the bilirubin oxidase concentration is in the range of 1 to 700 UZL.
  • the concentration of pericax is in the range of 5 to 1000 UZL, and the concentration of pyrirubin oxidase is in the range of 2 to 700 UZL.
  • a protease reagent is added to the pretreatment reaction solution, and the glycated Hb in the sample is decomposed by the action of a decomposition FAOD.
  • the amount of the protease reagent to be added is, for example, in the range of 50 to 300 L, and preferably in the range of 60 to 180, for 10 L of the pretreatment reaction solution having a blood cell concentration of 1% by volume.
  • the protease reaction solution to which the protease reagent has been added preferably has a protease concentration in the range of 100 to 50,000 KUZL, more preferably 300 to 30,000, based on a blood cell concentration of 0.1% by volume. KUZL range.
  • the pH of the protease reaction solution is preferably in the range of 6 to 9, and more preferably in the range of 7 to 8.5.
  • This protease treatment is preferably carried out after adding the protease reagent, and the conditions are, for example, 25 to 37 and 3 to 30 minutes, preferably 25 to 37: 3 to 10 minutes. Minutes, more preferably 30 to 37 ⁇ , and 3 to 5 minutes.
  • the protease reaction solution may have a concentration of the protease in the range of 100 to 10,000 KUZL, for example, Tetrazolium compound 0.1 to 1 Ommo 1 ZL, sodium azide 0.08 to 4.0 mmo 1 ZL, preferably tetrazolium compound 0.6 to 5 mmo 1 ZL, sodium azide Lium The range is from 0.15 to 1.8 mmo1 ZL.
  • the concentration in the protease reaction solution is preferably in the range of 0.2 to 6 mmo 1 ZL, more preferably in the range of 0.6 to 4 mmo 1 / L, and particularly preferably in the range of 0. It is in the range of 7 to 2.7 mm 01 ZL.
  • the protease reaction solution has a meta-oral protease concentration of about 100 to For example, in the range of 100,000 K UZL, for example, in the range of C a compound 0.1 to 50 mm o 1, in the range of Na compound 5 to: 100 mm 0 1 / L Yes, preferably C a compound 0.2 to: L 0 mo1 ZL range, Na compound 10 to 50 Omo 1 / L range, more preferably C a compound 0.2 to 5 mol ZL The range of the Na compound is 30 to 500 mol ZL.
  • the coloring reagent is added to the protease reaction solution, the FAOD for measurement is allowed to act on the saccharified Hb decomposition product, and hydrogen peroxide is generated by the reaction of the formula (1).
  • the chromogenic substrate is reacted with an oxidoreductase, and the chromogenic substrate is colored by oxidation.
  • the measurement FAOD-aS acts on both the glycated amino group and the glycated side chain amino group.
  • F AOD-a S for measurement can act only on the glycated side chain amino group. .
  • the amount of the coloring reagent to be added is, for example, in the range of 5 to 100 L with respect to 100 L of the protease reaction solution, and preferably 8 to 50 L. L, more preferably in the range of 10 to 30 L.
  • the color reaction solution to which the color reagent is added has a measurement FAOD concentration of 0.5 to 200 KUZL, an oxidoreductase concentration of 1 to; a range of L000 KUZL, and a color substrate concentration of 0.000.
  • the concentration is preferably in the range of 1 to 100 mmo 1 ZL, more preferably the FAOD concentration for measurement is in the range of 1 to 100 KUZL, the oxidoreductase concentration is in the range of 5 to 200 KU / L, The concentration is in the range of 0.005 to 1 Ommo 1 ZL, more preferably the FAOD concentration for measurement is in the range of 2 to 10 O KUZL, the oxidoreductase concentration is in the range of 5 to 200 KU / L, and coloring is performed.
  • the substrate concentration is in the range of 0.01 to 1 mmo1 L.
  • the pH of the color reaction solution is preferably in the range of 6 to 9, and more preferably in the range of 6.5 to 8.
  • the color reaction it is preferable to incubate for a certain period of time after the addition of the color-forming reagent.
  • the conditions are, for example, 15 to 37: 1 to 30 minutes, and preferably 25 to 3 minutes. 7, 3 to 10 minutes, more preferably 30 to 37 t: 3 to 5 minutes.
  • the color development of the chromogenic substrate is measured.
  • the degree of color development (absorbance) of the color reaction solution may be measured with a spectrophotometer, and the amount of hydrogen peroxide is determined from the absorbance.
  • the amount of saccharified Hb in the sample can be determined using the calibration curve indicating the correlation between the amount of hydrogen peroxide and the amount of saccharified Hb prepared in advance, and the measured amount of hydrogen peroxide.
  • the pretreatment reagent may further contain catalase. In this manner, when hydrogen peroxide is further eliminated, in order to prevent even the hydrogen peroxide generated by the measurement F AOD-aS treatment in the coloring reagent to be added later from being eliminated by the above-mentioned coloring agent, It is preferable to include excess amounts of POD and chromogenic substrate in the reagent.
  • the concentration of the enzyme in the pretreatment reagent is, for example, in the range of 5 to 300 UZL, preferably in the range of 10 to 100 U / L, and more preferably in the range of 10 to 70 UZL.
  • the concentration of the hydrogenase in the pretreatment reaction solution is, for example, in the range of 1.5 to 50 UZL, preferably in the range of 1.5 to 30 U / L, and more preferably in the range of 1.5 to 15 UZL.
  • the concentration of catalase in the color reaction solution is, for example, in the range of 1 to 50 UZL, preferably in the range of 1 to 30 UZL, and more preferably in the range of 1 to 10 UZL.
  • the POD concentration in the coloring reagent is, for example, in the range of 5 to 1000 KUZL, preferably in the range of 10 to 200 KUZL, and more preferably in the range of 20 to 200 KUZL.
  • the concentration of the POD is, for example, in the range of 3-300 KUZL, preferably in the range of 5-200 KUZL, more preferably in the range of 10-100 KUZL.
  • the concentration of the chromogenic substrate in the coloring reagent is, for example, in the range of 0.01 to 20 Omo 1 ZL, preferably in the range of 0.02 to 20 mol ZL, and more preferably in the range of 0.04 to 5 mol.
  • the concentration of the chromogenic substrate in the reaction solution is, for example, 0.001 to 100 mm. o 1 / L, preferably 0.005 to 1 Ommo 1 ZL, more preferably 0.01 to 1 mmo 1.
  • each reagent is not limited to the above-mentioned order, and some reagents may be added simultaneously. Specifically, for example, after adding a pretreatment reagent to a sample, a protease reagent and a coloring reagent may be simultaneously added, or a pretreatment reagent and a protease reagent may be simultaneously added. Later, a coloring reagent may be added. Further, for example, after adding a protease reagent to a sample, a pretreatment reagent may be added, and then a coloring reagent may be added.
  • the use of the measurement kit of the present invention allows the HbA1c amount to be measured quickly, simply, and accurately. This is because the amount of glycated Hb measured using the measurement kit of the present invention has a high correlation with HbA1c. Specifically, a calibration curve was created from the correlation between the amount of glycated Hb measured by the measurement kit of the present invention and the amount of HbA1c, and the amount of glycated Hb in the sample was measured by the measurement kit. By substituting into the above calibration curve, the amount of HbA1c can be obtained.
  • This embodiment is an example of a second measurement kit using the same FAOD as the FAOD for decomposing the pretreatment reagent and the FAOD for measuring the coloring reagent.
  • the FAOD is not particularly limited, and for example, any one of FAOD-H, FAOD-S, and FAOD-aS may be used.
  • the measurement kit of this embodiment has the same configuration as that of Embodiment B-1 unless otherwise specified, and can be used for measuring glycated Hb in a similar manner.
  • the glycated Hb is degraded by the protease reagent protease, and the degraded FAOD remaining in the pretreatment reaction solution is deactivated, thereby decomposing the glycated Hb with the glycated Hb degradation product. It is necessary to prevent the reaction. For this purpose, it is necessary to promptly inactivate the degradation FAOD of the pretreatment reagent and to include in the protease reagent enough protease to degrade glycated Hb.
  • the type and content of the protease are not particularly limited, for example, depending on the type and amount of the FAOD used, the substrate specificity of the protease with respect to FAOD, the amount of saccharified Hb, and the dilution ratio due to the addition to the reaction solution, It is preferable to determine it appropriately.
  • examples of such a combination of FAOD and proteinase include, for example, trade name FOD (manufactured by Asahi Kasei Corporation) and trade name Toyoteam (manufactured by Toyobo Co., Ltd.); Protease).
  • the protease reagent is added so that the concentration of the protease in the protease reaction solution is in the range of, for example, 1 to: L 00,000 KUZL with respect to the F AOD 100 UZL for decomposition.
  • the protease concentration is more preferably in the range of 100 to 300,000 KU / L, and particularly preferably in the range of 100 to 100,000 KUZL.
  • the trypsin concentration in the protease reaction solution is 100 to 30,000 KU / L
  • the blood cell concentration is 0.2 to 5% by volume
  • the FAOD concentration for degradation is 1
  • the reaction conditions are, for example, a temperature of 20 to 50, a time of 10 minutes to 20 hours, and a pH of 6 to 9.
  • the FAOD for measurement in the coloring reagent may be inactivated by the protease, so that a sufficient amount of the FAOD for measurement needs to be added.
  • the concentration of the measurement F AOD in the reaction solution of the measurement F AOD treatment is, for example, in the range of 100 to 100,000 UZL with respect to 100,000 KUZL of the protease.
  • the coloring reagent more preferably, the FAOD concentration for measurement is in the range of 100 to 200,000 UZL, and particularly preferably, the FAOD concentration for measurement is 500 to 500,000 UZL. It is preferable to add the color-forming reagent so as to fall within the range described above.
  • Specific treatment conditions include, for example, the concentration of FAOD for measurement in the reaction solution of 500 to 200,000 UZL, the concentration of protease in the reaction solution of 100 to 300,000 KUZL, Blood cell concentration 0.0! It is preferable to add the above-mentioned coloring reagent so as to be in volume%.
  • the reaction conditions are, for example, a temperature of 15 to 40, a time of 1 minute to 1 hour, and a pH of 6 to 9.
  • This embodiment is an example of a third measurement kit using the same FA 0D as FAOD for decomposition of a pretreatment reagent and FAOD-H for measuring FAOD for a coloring reagent.
  • it is not always necessary to inactivate the FAOD for decomposition of the pretreatment reagent by protease. Enzymes have substrate specificity, so protea Depending on the combination of the protease and the FAOD, it may be difficult to inactivate the FAOD with a protease.
  • the measurement kit of the present embodiment is effective. If the degradation FAOD in the pretreatment reagent reacts with the saccharified Hb degradation product, the measurement accuracy cannot be improved.Therefore, as shown below, the addition ratio of FAOD in the pretreatment reagent and the Coordination is important.
  • the FAOD is not particularly limited, and for example, any of FAOD-H, FAOD-S, and FAOD_aS may be used.
  • the measurement kit of this embodiment has the same configuration as that of Embodiment B-1 unless otherwise specified, and can be used for measurement of glycated Hb in the same manner.
  • Examples of the combination of FA ⁇ D and protease corresponding to such an embodiment include, for example, trade name FOD (manufactured by Asahi Kasei Corporation) and Giperella-derived FAOD (manufactured by ARKRAY, JP-A-154672); Trade name trypsin (manufactured by Sigma) and trade name Proteinase K (manufactured by Wako Pure Chemical Industries).
  • the degradation FAOD needs to be added to the extent that it does not act on glycated Hb degradation products during protease treatment, even if its activity remains, and it easily acts on glycated amino acids and acts on glycated proteins. It is desirable that the amount of addition is such that it acts only on saccharified amino acids in order to take advantage of the property of being difficult to perform.
  • the concentration of the FAOD for decomposition in the pretreatment reagent is, for example, in the range of 10 to 20,000 UZL, and preferably in the range of 20 to: I, 000 U / L. It is more preferably in the range of 100 to 5000 UZL.
  • the FAOD concentration for measurement in the coloring reagent is in the range of 0.5 to 200 KUZL, preferably in the range of 1 to 100 KUZL, and more preferably in the range of 2 to: L00 KUZL.
  • the pretreatment reagent is used in a pretreatment reaction solution, for example, for decomposition
  • the FAOD concentration becomes 10 to 5000 UZL and the blood cell concentration becomes 0.2 to 20% by volume.
  • the reaction time is such that it only affects the reaction time.
  • the reaction temperature is preferably 20 to 37, and the reaction time is preferably 1 to 60 minutes, more preferably 25 to 37, and the reaction time is 2 to 30 hours, particularly preferably. Is a reaction temperature of 30 to 37, and a reaction time of 3 minutes to 10 hours.
  • the pretreatment reagent and the coloring reagent are preferably added so as to be in the range of 00, more preferably G: H is in the range of 1: 5 to 1:50, and particularly preferably G: H. Is in the range of 1:10 to 1:40.
  • the degradation FAOD remains in the protease reaction solution, but the reaction rate of the remaining FAOD is very slow, so that the measurement may be affected in the protease treatment step. This is because the residual FAOD does not act on the generated saccharified Hb hydrolyzate to the extent that the product is given.
  • This embodiment is an example in which DA-64 is used as a coloring substrate of a coloring reagent.
  • the measurement kit of the present embodiment has the same configuration as that of the above-described embodiment B-1 unless otherwise specified, and can be used for measuring glycated Hb in the same manner.
  • the protease reagent contains a tetrazolium compound and sodium azide for improving the measurement sensitivity
  • the color-forming reagent contains DA-64 as a color-developing substrate
  • the protease is used in the color-developing reaction solution.
  • the coexistence of the compound, sodium azide and DA-64 causes the false coloration of DA-64 as described above. Therefore, in order to prevent such erroneous coloring, the following composition is preferable.
  • At least one of the pretreatment reagent, the protease reagent and the color-forming reagent contains a surfactant.
  • the surfactant for example, the surfactants described above can be used.
  • the concentration is in the range of 0.03 to 200 mmo1 ZL, preferably in the range of 0.1 to 50 mmo1 ZL.
  • a protease reagent When it is contained in a protease reagent, its concentration is in the range of 0.01 to 50 mm 01 ZL, preferably in the range of 0.05 to 20 mm O 1 / L.
  • a coloring reagent When it is contained in a coloring reagent, its concentration is in the range of 0.03 to 30 mO1 / L, preferably in the range of 0.1 SOmolZL.
  • each reagent of the measurement kit may be added so that each component in the color reaction solution has the following concentration range.
  • DA-64 0.001 to: L0 Ommo 1 ZL, surfactant 0.002 to 50 mmo 1 ZL, tetrazolid compound 0.1 to: L 0 mmol ZL, sodium azide It is preferably in the range of 0.08 to 4 mmo 1 ZL, and more preferably, DA-64 0.005 to 10 mmo 1 _L, surfactant 005 to 2 Ommo 1 ZL, and tetrazolium compound 0.6 to 5 mmoL / L, sodium azide 0.15 to 1.8 mmo1 ZL, particularly preferably DA-64 0.01 to 1 mmo1 / L, surfactant 02 to 1 Ommo1 ZL, tetrazolymization Compound 0.7 to 2.7 mmo 1 L, sodium azide 0.2 to: L. 5 mmol / L
  • the pH of the color reaction solution is preferably in the range of 6.0 to 9.0, more preferably in the range of 6.5 to 8.5, and particularly preferably in the range of 7.0 to 8.0. .
  • FAOD (trade name: FA0X, manufactured by Kikkoman Corporation) 1KU / L
  • 20 L of the obtained hemolyzed sample and 76 L of the following protease reagent were mixed and incubated at 37 for 5 minutes.
  • the following coloring reagent 19 was further added, and the mixture was incubated at 37 for 3 minutes, and the absorbance at this time was measured at a wavelength of 751 nm and a wavelength of 571 nm.
  • Absorption An automatic analyzer (trade name: JCA-BM8, manufactured by JEOL Ltd.) was used for measuring the degree.
  • Tetradium compound (trade name: WST-3, Dojin Kagaku) 2mmol / L
  • HbA1c concentration and Hb concentration were determined, and HbA1c% was calculated from the following equation.
  • the Hb concentration can be determined from the absorbance at a wavelength of 751 nm, and the HbA 1c concentration can be determined from the absorbance at a wavelength of 571 nm.
  • HbA lc (%) (HbA 1c concentration / Hb concentration) XI 00
  • the calibration curve was created by the following method. First, Hb concentration The HbA1c concentration and the Hb concentration of standard solutions of various concentrations of known degrees were measured by an HPLC method using a HbAlc measuring device (trade name: HA-8160: manufactured by Arkley). On the other hand, for each of the standard solutions, the absorbance corresponding to the Hb concentration and the HbA1c concentration was measured by the same measurement method as in the above example. Then, a linear regression equation was created from the values measured by the automatic measuring device and the absorbance, and this was used as a calibration curve.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between HbA1c (%) of Example 1 measured by the enzyme method and HbA1c () of the control example by the HPLC method.
  • the method and the kit for measuring a glycated protein of the present invention are excellent in measurement accuracy because the influence of coexisting glycated amino acids is eliminated. Therefore, if the present invention is applied to, for example, measurement of glycated Hb and HbAlc in erythrocytes, a measurement value with higher reliability than before can be obtained. Will become even more important as indicator substances.

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Description

明 細 書 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット 技術分野
本発明は、 本発明は、 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方 法および測定キットに関する。 背景技術
糖化タンパク質の中でも、 例えば、 血液中の糖化ヘモグロビン （糖化 H b) は、 生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、 糖尿病の診 断や治療等における重要な指標とされている。
このような糖化 Hbは、 例えば、 高速液体クロマトグラフィー （HP L C) 法、 ミニカラム法、 免疫法、 色素法等により、 糖化率や糖化量と して測定されている。 しかし、 前記 H P L C法の場合は、 例えば、 糖化 Hbを測定するための専用機が必要であり、 また、 免疫法や色素法では 、 例えば、 測定用のセルの汚れや測定精度等に問題があった。
そこで、 糖化 Hb等の糖化タンパク質について、 特殊な測定機器が不 要であり、 操作も簡便である酵素による酸化還元反応を用いた測定方法 が、 例えば、 生化学分析や臨床検査等において適用されている。
前記酸化還元反応を用いた糖化 Hbの測定は、 例えば、 以下に示すよ うにして行われる。 まず、 糖化 Hbを含む試料をフルクトシルアミノ酸 ォキシダ一ゼ （以下、 「FAOD」 という） で処理し、 糖化 Hbの糖化 部分に作用させて過酸化水素を発生させる。 この過酸化水素量は、 前記 糖化 H b量に対応する。 そして、 この F AOD処理後の前記試料に、 ぺ ルォキシダーゼ （以下、 「POD」 という） および還元剤を添加し、 前 記 P O Dを触媒として前記過酸化水素と前記還元剤との間で酸化還元反 応させる。 この時、 前記還元剤として、 酸化されることにより発色する 還元剤を用いれば、 その発色の測定により前記過酸化水素量を測定でき 、 この結果、 試料中の糖化 H b量を知ることができる。 発明の開示
しかし、 このような従来の測定方法は、 測定感度が十分ではない。 ま た、 測定精度に関しては、 例えば、 実際に試料中に含まれる糖化 H に 対応する以上の過酸化水素が発生したり、 患者によっては一時的に糖化 H bの測定値が急激に増加するという現象が見られることがあるため、 さらなる精度の向上が求められている。
そこで、 本発明の目的は、 試料中の糖化タンパク質を、 酸化還元反応 を用いて測定する方法の提供であって、 測定感度および測定精度の両方 に優れる方法の提供である。 また、 前記糖化タンパク質の測定に使用す る、 測定精度、 測定感度、 取り扱い性に優れる測定キットの提供である
前記目的を達成するために、 本発明の糖化タンパク質の測定方法は、 試料中の糖化タンパク質に F A O Dを作用させて酸化還元反応を行い、 その酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質の量を測定する 方法であって、 前記試料中に糖化タンパク質とは別に存在する糖化アミ ノ酸を除去することを目的として、 前記酸化還元反応に先立ち、 前記糖 化アミノ酸に F A O Dを作用させて分解し、 テトラゾリゥム化合物およ びアジ化ナトリゥムの存在下で、 前記酸化還元反応を行うことを特徴と する。
なお、 前記 F A O Dは、 一般名称であり、 その基質としては糖化アミ ノ酸には限られず、 例えば、 糖化タンパク質や糖化ペプチドにも作用す る。 以下、 本発明において、 前記糖化アミノ酸を分解するための F AO Dを 「分解用 FAODj といい、 前記糖化タンパク質に作用させる測定 のための F AO Dを 「測定用 FAOD」 という。
本発明者らは、 測定精度の向上を図るべく鋭意研究を行った結果、 以 下の事を突き止めた。 つまり、 全血中には、 本来、 糖化タンパク質の他 に遊離の糖化アミノ酸が存在しており、 前記 FAODは、 このような糖 化アミノ酸に対しても作用する。 このため、 前述のような FAODを用 いた糖化夕ンパク質の測定を行った場合、 糖化タンパク質と FAODと の酸化還元反応だけでなく、 糖化アミノ酸と FAODとの酸化還元反応 も生じてしまい、 見かけ上、 糖化タンパク質の測定値が増加してしまう のである。 さらに、 同じ患者の全血試料について、 全く同じ条件で前記 測定方法により測定を行った場合でも、 患者によっては採血時が異なる と測定値が著しく変動するという問題に関しては、 以下のような事をつ きとめた。 すなわち、 このような問題は、 主に、 点滴等を受けた患者に 見られる現象であり、 このように測定値が変動するのは、 点滴等の成分 として、 例えば、 グルコース等の糖類や各種アミノ酸が含まれた場合に 、 これらの外来成分から糖化アミノ酸が生成され、 一過的に糖化アミノ 酸が増加するためであることを解明したのである。 そこで、 全血試料中 に恒常的な糖化アミノ酸や一過性の外来糖化アミノ酸が存在しても、 本 発明のように、 予め糖化アミノ酸に分解用 FAODを作用させて分解す れば、 前述のような糖化アミノ酸による測定値の上昇が抑制されること を、 本発明者らが初めて見出したのである。 これによつて、 測定精度が 向上でき、 さらに、 点滴を受けたか否かに関わらず、 いつでも採血を行 うことができるため、 患者の負担も低減できる。 さらに、 テトラゾリゥ ム化合物およびアジ化ナトリゥムの存在下で前記酸化還元反応を行えば 、 その作用機作は不明であるが、 測定感度も向上する。 したがって、 こ のように測定精度および測定感度に優れる測定方法によれば、 各種糖化 タンパク質の指標としての信頼性も増し、 臨床医療等の分野において有 用な方法となる。
本発明において、 前記糖化タンパク質としては、 例えば、 糖化 Hbが 好ましい。 このような方法によれば、 糖化 Hbの糖尿病診断の指標とし ての信頼性が増し、 臨床医療等の分野において有用となるからである。 ' 本発明の測定方法としては、 例えば、 前記糖化アミノ酸と前記糖化夕 ンパク質とに、 異なる基質特異性の F AO Dを使用する第 1の測定方法 と、 同じ基質特異性の FAODを使用する第 2の測定方法とがあげられ る。
なお、 FAODには、 後述するように、 例えば、 α—ァミノ基の糖化 部分に作用するもの、 リジンやアルギニン等のアミノ酸残基の側鎖アミ ノ基の糖化部分に作用するもの、 および前記両方の糖化部分に作用する もの等があり、 その基質特異性は FAODの種類により様々である。 例 えば、 糖化タンパク質が糖化 Hbの場合、 糖化 Hbの測定は、 前記 a— ァミノ基の糖化部分、 前記側鎖アミノ基の糖化部分または両方の糖化部 分のいずれに FAODを作用させても、 その量を測定することが可能で ある。
本発明の第 1の測定方法としては、 前記糖化アミノ酸に作用させる分 解用 FAODと、 糖化タンパク質に作用させる測定用 FAODとが、 異 なる基質特異性を有することが好ましい。 これによれば、 分解用 FAO Dによって前記糖化アミノ酸が分解され、 糖化タンパク質については、 前記分解用 FAODが作用していない糖化部分に、 さらに異なる基質特 異性の測定用 FAODを作用させることができるため、 糖化アミノ酸の 影響を受けず、 測定精度を向上できるからである。 具体的には、 例えば、 前記分解用 FAODが、 糖化ひ —アミノ基に待 異的に作用し、 前記測定用 FAODが、 糖化 α—アミノ基および糖化側 鎖ァミノ基に特異的に作用することが好ましい。 前記測定用 FAODは 、 α—ァミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の両方に作用する ため、 従来の方法であれば、 前述のように α—ァミノ基が糖化された糖 化アミノ酸にも作用していた。 しかし、 本発明においては、 前記糖化ァ ミノ酸は、 予め、 前記糖化 α—ァミノ基に特異的に作用する分解用 FA ODによって分解されているため、 これに測定用 FAODが作用するこ とはなく、 見かけ上の測定値の増加が抑制されて精度が向上する。 また 、 前記測定用 FAODは、 前述のように α—アミノ基糖化部分および側 鎖ァミノ基糖化部分の両方に作用するが、 予め、 糖化タンパク質の α— アミノ基糖化部分も分解用 FAODによって分解されているため、 糖化 夕ンパク質の側鎖アミノ基糖化部分のみに測定用 FAODを作用させる ことができる。 このため、 特に側鎖アミノ基の糖化量に特徴がある糖化 Hbの測定に、 有用な方法といえる。
このように異なる FAODを用いる場合、 前記糖化アミノ酸に F AO Dを作用させる前または作用させた後に、 糖化タンパク質をプロテア一 ゼで分解し、 この糖化タンパク質の分解物に、 前記糖化タンパク質に作 用させる測定用 FAODを作用させて前記酸化還元反応を行うことが好 ましい。 糖化タンパク質をプロテアーゼで分解するのは、 FAODは、 糖化夕ンパク質よりも、 糖化アミノ酸やより短い糖化べプチド断片に作 用し易いからである。 また、 プロテア一ゼ処理の順序が、 糖化アミノ酸 の分解処理の前後で制限されないのは、 測定用 FAODは、 前述のよう に分解用 FAODとは異なる糖化部分に作用するため、 糖化タンパク質 の測定自体には影響を受けないからである。
つぎに、 本発明の第 2の測定方法としては、 糖化アミノ酸に分解用 F AODを作用させた後、 糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、 さら に前記分解用 F AODと同じ F AODを添加して、 前記プロテアーゼ分 解物に作用させて前記酸化還元反応を行うことが好ましい。 すなわち、 分解用 FAODと測定用 F AO Dとが同じ場合の測定方法である。
具体的には、 前記プロテアーゼにより、 前記分解用 F AODを失活さ せることが好ましい。 FAODは、 前述のように測定する糖化タンパク 質よりも、 糖化アミノ酸やより短い糖化べプチド断片に対して作用し易 いという性質を有している。 このため、 分解用 FAODを添加しても、 酵素の反応速度論から、 糖化アミノ酸を分解する処理時間においては、 糖化タンパク質にはあまり作用しないといえる。 しかし、 続く糖化タン パク質のプロテアーゼ処理の間も前記分解用 FAOD活性が残存してい ると、 前記プロテア一ゼ処理と併行して、 プロテアーゼによる糖化タン パク質分解物 （すなわち糖化アミノ酸や糖化夕ンパク質のぺプチド断片 ) に残存する前記分解用 FAODが作用するおそれがある。 そして、 そ の後、 さらに測定用 FAODを添加しても、 すでに前記糖化タンパク質 分解物の一部には前記残存する分解用 FAODが作用してしまった状態 となり、 反対に測定精度が低下するおそれがある。 したがって、 前述の ように糖化タンパク質を分解するためのプロテアーゼ処理によって、 同 時に残存する前記分解用 FAODを失活させれば、 プロテアーゼ処理に よる糖化タンパク質分解物は、 前記分解用 FAODとは未反応のままで 維持され、 続いて添加する測定用 FAODと反応することができる。 こ のため測定精度も向上するのである。
一方、 第 3の測定方法として、 前述のようにプロテアーゼ処理で分解 用 FAODを失活させなくとも、 例えば、 前記分解用 FAODの添加量 と、 測定用 FAQDの添加量とを調整することによつても、 高精度な測 定を実現できる。 この場合、 例えば、 前記分解用 FAOD (A) と測定 用 F AOD (B) の添加割合 （活性比 A ： B) を、 A : B= 1 : 1 0〜 1 : 1 0 00の範囲に設定することが好ましい。 このような添加割合で あれぱ、 プロテアーゼ処理を行う際に、 前記分解用 F AODが残存して も、 酵素の反応速度論の点から、 糖化タンパク質分解物には作用し難い からである。
本発明の測定方法において、 前記プロテアーゼとしては、 メタ口プロ ティナーゼ、 ブロメライン、 パパイン、 トリプシン、 プロティナーゼ K 、 ズブチリシンおよびアミノぺプチダーゼ、 Bacillus sbtilis由来の プロテアーゼ等の少なくとも一つのプロテアーゼが使用できる。
糖化タンパク質が糖化 Hbの場合、 前記プロテアーゼは、 糖化 Hbを 選択的に分解する、 メタ口プロティナ一ゼ、 ブロメライン、 パパイン、 ブタ塍臓由来トリプシンおよび Baci llus sbt i 1 is由来のプロテアーゼ からなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが 好ましい。 この中でも好ましくはメタ口プロティナーゼ、 Bacillus sbtilis由来のプロテア一ゼであり、 より好ましくはメタ口プロティナ ーゼである。 測定対象物が糖化 H bの場合に、 このようなプロテアーゼ を作用させれば、 糖化 Hb以外の糖化タンパク質や糖化べプチドは分解 され難いため、 前記他の糖化タンパク質等には FAODも作用し難く、 糖化 H bのみの測定が可能になる。
本発明の測定方法において、 テトラゾリゥム化合物 （C) とアジ化ナ トリウム （D) との添加割合 （モル比 C ： D) は、 C : D= 20 : 3〜 20 : 1 2の範囲であることが好ましい。 また、 前記酸化還元反応溶液 におけるテトラゾリゥム化合物の終濃度が、 0. 5〜2. 5 mmo \ / Lの範囲であり、 前記反応溶液におけるアジ化ナトリウムの終濃度が 0 . 1 3〜 1. 3mmo 1 /Lの範囲であることが好ましい。
本発明の測定方法において、 より一層感度を向上できることから、 テ トラゾリゥム化合物とアジ化ナトリゥムとを含む溶液をエージングした 後に、 前記試料に添加することが好ましい。 この場合、 エージングの処 理温度は、 2 0〜60での範囲であることが好ましく、 エージングの処 理時間は、 6〜 1 2 0時間の範囲であることが好ましい。
本発明において、 前記酸化還元反応の測定としては、 特に制限されな いが、 糖化タンパク質に FAODを作用させて発生した過酸化水素と、 酸化することより発色する基質 （発色基質） とを酸化還元酵素により反 応させ、 前記発色基質の発色量を測定することによって、 過酸化水素量 を決定する過酸化水素量の測定等があげられる。 前記発色基質としては 、 例えば、 N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'ニル） -4， 4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリ ゥム （以下、 「DA— 64」 ともいう） が使用できる。
前記 D A— 64を使用する場合、 前記 D A— 64を界面活性剤存在下 で反応溶液に添加し、 前記反応溶液におけるテトラゾリゥム化合物濃度 を 0. 5〜 8 mmo 1 ZLの範囲、 アジ化ナトリウム濃度を 0. 0 8〜 0. 8mmo 1 ZLの範囲および界面活性剤濃度を 0. 3〜： L Ommo 1 ZLの範囲とし、 かつ前記反応溶液の p Hを 7. 0〜8. 5とするこ とが好ましい。
本発明は測定感度の向上のため、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化 ナトリゥムの存在下で前記酸化還元反応を行うことを特徴の一つとして いるが、 前述のように、 発色基質として D A— 64を使用すると、 この DA— 64と、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムとが共存 することによって、 DA— 64が誤発色を起こす場合がある。 このよう に誤発色が生じると、 例えば、 発色量の測定においてバックグラウンド が高くなり、 また、 十分量添加したはずの DA— 64が不足するという 問題が生じる。 しかし、 このように界面活性剤の存在下で D A— 64を 添加し、 かつ各成分濃度を前記濃度範囲に設定し、 反応溶液の pHを前 記範囲に設定すれば、 前記バックグラウンドの上昇も抑制でき、 より一 層高精度な測定が可能になる。
本発明の測定方法において、 前記測定試料の種類は、 特に制限されず 、 全血、 血漿、 血清、 血球等の他に、 例えば、 尿、 髄液等の生体試料や 、 ジュース等の飲料水、 醤油、 ソース等の食品類等の試料に対しても適 用でき、 この中でも特に全血試料、 血球試料に有用である。 例えば、 赤 血球内の糖化 H bを測定する場合には、 全血をそのまま溶血したり、 全 血から分離した赤血球を溶血し、 この溶血試料を測定試料とすればよい 測定対象物の糖化タンパク質としては、 例えば、 前述のような糖化 H b、 糖化アルブミン等があげられるが、 好ましくは糖化 H bである。 つぎに、 本発明の H b糖化率の測定方法は、 糖化 H b量と H b量とか ら H b糖化率を求める測定方法であって、 前記本発明の糖化タンパク質 の測定方法により試料中の糖化 H b量を測定し、 他方、 前記試料中の H b量を測定し、 前記糖化 H b量と前記 H b量とから H b糖化率を求める 方法である。 本発明によれば、 高精度で糖化 H b量を測定できるため、 信頼性の高い H b糖化率を得ることができる。 なお、 「H b量」 とは、 糖化されている H bおよび未糖化の H bの両方を含む。
本発明において、 前記 H b量を測定する方法は、 特に制限されないが 、 試料中の H bをテトラゾリゥム化合物で変性させ、 得られた変性 H b に特異的な吸収波長で、 前記試料の吸光度を測定し、 この吸光度から前 記試料中の H b量を算出する方法であることが好ましい。 未変性 H bは 、 例えば、 酸素と結合した状態や未結合の状態等、 その態様によって様 々な吸収波長を有するため、 単純に吸光度を測定しても H b量を正確に 求めることは困難である。 これに対して、 テトラゾリゥム化合物により 変性させた変性 H bは安定であり、 吸収極大を示す波長が一定範囲にな るため、 容易かつ高精度で Hb量を求めることができる。 このため、 前 述のような信頼性の高い糖化 Hb量と Hb量とから、 より一層、 信頼性 の高い H b糖化率を求めることができる。 また、 本発明の糖化タンパク質の測定方法を用いて、 HbA l cを測 定することもできる。 例えば、 この Hb A 1 cの測定方法は、 前記本発 明の糖化タンパク質の測定方法による糖化 Hb量と Hb A 1 c量との相 関関係から作成された検量線を準備し、 前記本発明の糖化タンパク質の 測定方法から得られた試料中の糖化 Hb量を前記検量線に代入すること により前記試料中における Hb A 1 c量を求める方法である。
本発明者らは鋭意研究の結果、 前記本発明の糖化タンパク質の測定方 法により得られる全血中の糖化 H b量が、 同じ試料における H b A 1 c 量と高い相関関係にあることを見出した。 HbA l cは、 Hbの /3鎖 N 末端の α—ァミノ基が糖化された糖化 H bをいい、 糖化 Hbの中でも、 糖尿病診断等における特に重要な指標とされている。 従来の方法による と、 HbA l cの測定は、 糖化部分の中での Hb A 1 cの特徴的構造部 分である） 3鎖 N末端の α-ァミノ基の糖化部分に F A ODを特異的に作 用させ、 その酸化還元反応を測定する必要があった。 この場合、 例えば 、 使用する FAODが前記 α—アミノ基糖化部分に対して基質特異性が 高いことや、 前記ひーァミノ基糖化部分に十分に作用すること等が要求 されているため、 特別な方法をとらざるを得なかった。 しかし、 本発明 によれば、 高精度で測定される糖化 Hb量を基に、 HbA l c量を決定 できるため、 正確かつ簡便な Hb A 1 cの測定が可能になる。 したがつ て、 Hb A 1 cの測定を臨床検査等で実用化することができる。 つぎに、 本発明の糖化タンパク質の測定キットは、 酸化還元反応を用 いた糖化タンパク質の測定に使用する測定キッ卜であって、 FAODを 含有する試料の前処理用試薬と、 FAOD、 酸化還元酵素および発色基 質を含有する発色用試薬とを含むことを特徴とする。
本発明者らは、 前述のように測定精度の問題の原因を突き止めた。 そ して、 全血試料中に恒常的な糖化アミノ酸や一過性の外来糖化アミノ酸 が存在しても、 本発明のように、 試料の前処理用試薬に FAODを含有 させれば、 前記酸化還元反応に先立ち、 前記前処理試薬を添加すること によって、 試料中の糖化アミノ酸が分解され、 前述のような糖化アミノ 酸による測定値の上昇が抑制されることを、 本発明者らが初めて見出し たのである。 このため、 本発明の測定キットを使用すれば、 迅速かつ簡 便に酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定を優れた精度で行うこ とができ、 さらに、 点滴を受けた患者の血液試料であっても、 同様の条 件で測定できる。 また、 本発明の測定キットを用いた測定は、 前述のよ うに測定精度に優れるため、 各種糖化タンパク質の指標としての信頼性 も増し、 臨床医療等の分野において有用な測定キッ卜となる。
本発明の測定キットは、 測定対象物が、 例えば、 糖化 Hbであること が好ましい。 このような測定キットによれば、 糖化 Hbの糖尿病診断の 指標としての信頼性が増し、 臨床医療等の分野において有用となるから である。
なお、 本発明において、 前処理試薬に含有させる FAODは、 前記糖 化アミノ酸を分解するものであるため、 前述のように、 以下、 「分解用 FAOD」 ともいい、 発色用試薬に含有させる FAODは、 糖化タンパ ク質に作用させるものであることから、 以下、 「測定用 FAOD」 とも いう。
本発明の測定キットは、 さらに、 プロテア一ゼを含有するプロテア一 ゼ試薬を含むことが好ましい。 前記 FAODは、 糖化タンパク質よりも 、 糖化アミノ酸やより短い糖化べプチドに作用し易いという性質を有し ている。 したがって、 前記プロテアーゼ試薬により、 試料中の糖化タン パク質を分解すれば、 さらに発色用試薬における測定用 F AO Dが作用 し易くなり、 測定精度も向上するからである。 なお、 前記プロテア一ゼ としては、 前記本発明の糖化タンパク質測定方法と同様のものが使用で さる。
本発明の測定キットにおいて、 前記プロテア一ゼ試薬が、 さらにテト ラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを含有することが好ましい。 このようにプロテアーゼ試薬にテトラゾリゥム化合物およびアジ化ナト リウムを含有させれば、 測定感度を向上できると同時に、 テトラゾリゥ ム化合物によって、 前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に 与える影響を除去でき、 測定精度をも向上できるからである。
また、 前記プロテアーゼ試薬において、 プロテア一ゼとしてメタロブ 口テアーゼを使用する場合は、 さらに C aおよび N aを含有し、 メタ口 プロテア一ゼ濃度が 1 00〜40 , 000 KUZL、 〇 &濃度が0. 1 〜 5 Ommo 1 ZL、 N a濃度が 5〜 1 00 Ommo 1 ZLであること が好ましい。 このように、 前記濃度範囲になるように、 メタ口プロテア —ゼ、 C aおよび N aを共存させれば、 メタ口プロテアーゼの安定性が 向上し、 例えば、 低温だけでなく常温条件下においてもメタ口プロテア —ゼの失活を防止して安定に保存することができる。 なお、 C aおよび N aは、 使用時に、 それぞれ C a 2 +および N a+にイオン化すればよい なお、 前記プロテアーゼ試薬における各物質の濃度は、 前記濃度範囲 には限定されず、 例えば、 その割合が、 前記濃度範囲と同様の含有割合 であることが好ましい。 これは、 反応溶液に対する前記プロテアーゼ試 薬の添加割合 （希釈率） によって、 反応に必要な前記各物質の添加量は 調整可能だからである。 なお、 他の物質や他の試薬についても同様であ る。
本発明の測定キットとしては、 前記前処理用試薬に含有させる分解用 FAODと、 前記発色用試薬に含有させる測定用 FAODとに、 例えば 、 異なる基質特異性の FAODを使用する第 1の測定キットと、 同じ F AODを使用する第 2および第 3の測定キットとがあげられる。
本発明において、 第 1の測定キットとしては、 前述のように、 前処理 用試薬に含有させる分解用 FAODと、 発色用試薬に含有させる測定用 FAODとに、 異なる基質特異性の FAODを使用することが好ましい 。 このような測定キットを用いれば、 前記糖化アミノ酸は分解用 F AO Dによって分解され、 糖化タンパク質については、 前記分解用 FAOD が作用していない異なる糖化部分に、 前記測定用 FAODを作用させる ことができるため、 糖化アミノ酸の影響を受けず、 測定精度を向上でき るからである。
具体的には、 例えば、 前記分解用 FAODが、 糖化 α_アミノ基に待 異的に作用する FAODであり、 前記測定用 FAODが、 糖化ひ —アミ ノ基および糖化側鎖アミノ基に特異的に作用する FAODであることが 好ましい。 前記測定用 FAODは、 α—アミノ基糖化部分および側鎖ァ ミノ基糖化部分の両方に作用するため、 従来の方法であれば、 前述のよ うに α—ァミノ基が糖化された糖化アミノ酸にも作用していた。 しかし 、 本発明の測定キットを使用すれば、 前処理用試薬での処理によって、 前記糖化アミノ酸は、 予め、 前記糖化 α—アミノ基に特異的に作用する 分解用 FAODに分解されているため、 これに測定用 FAODが作用す ることはなく、 見かけ上の測定値の増加が抑制されて精度が向上する。 また、 測定用 FAODは、 前述のように α—ァミノ基糖化部分および側 鎖ァミノ基糖化部分の両方に作用するが、 予め、 糖化タンパク質のひ — アミノ基糖化部分も分解用 FAODによって分解されているため、 本発 明における前記発色用試薬で処理すれば、 糖化タンパク質の側鎖アミノ 基糖化部分のみに測定用 FAODを作用させることができる。 このため 、 特に側鎖アミノ基の糖化量に特徴がある糖化 Hbの測定に、 有用な測 定キットであるといえる。 なお、 このような測定キットは、 前記本発明 の第 1の糖化タンパク質の測定方法に利用できる。
つぎに、 前記第 2の測定キットは、 前処理用試薬の前記分解用 F AO Dおよび発色用試薬の前記測定用 FAODとして、 同じ F AODを使用 し、 糖化タンパク質を分解し、 かつ、 前記分解用 FAODを消化失活さ せるプロテアーゼを含有するプロテアーゼ試薬を含むことが好ましい。
この第 2の測定キットの使用方法は、 例えば、 まず、 前処理用試薬を 試料に添加して糖化アミノ酸に分解用 FAODを作用させた後、 プロテ ァーゼ試薬を添加して糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、 あわせ て残存する分解用 FAODもプロテアーゼにより消化分解する。 そして 、 さらに前記発色用試薬を添加して測定用 FAODを前記プロテアーゼ 分解物に作用させ、 前記酸化還元反応を行えばよい。
FAODは、 前述のように測定する糖化タンパク質よりも、 糖化アミ ノ酸やより短い糖化タンパク質のぺプチド断片に対して作用し易いとい う性質を有している。 このため、 分解用 FAODを含有する前処理用試 薬を添加しても、 酵素の反応速度論から、 糖化アミノ酸を分解する処理 時間においては、 前記 FAODは糖化タンパク質にはあまり作用しない といえる。 しかし、 続くプロテアーゼ試薬による処理の間も前記分解用 FAODの活性が残存していると、 プロテア一ゼ処理と併行して、 プロ テアーゼによる糖化タンパク質分解物 （すなわち糖化アミノ酸や糖化夕 ンパク質のペプチド断片） に前記分解用 FAODが作用してしまい、 後 に測定用 F AO Dを含む発色用試薬を添加しても、 すでに前記糖化タン パク質の分解物の一部には分解用 FAODが作用してしまった状態とな り、 反対に測定精度が低下するおそれがある。 したがって、 前記第 2の 測定キッ トのように、 糖化タンパク質を分解し、 かつ分解用 FAODを 消化失活させるプロテアーゼ試薬を含めば、 糖化タンパク質の分解物は 、 前記分解用 FAODとは未反応のままで維持され、 続いて添加する発 色用試薬中の測定用 FAODと反応することができる。 このため測定精 度も向上するのである。 なお、 このような測定キッ トは、 前記本発明の 第 2の糖化タンパク質の測定方法に利用できる。
一方、 第 3の測定キットは、 分解用 FAODと測定用 FAQDとに同 じ FAODを用いて場合であっても、 前述の第 2の測定キッ トのように 、 プロテアーゼ試薬で残存する分解用 FAODを失活させなくとも、 例 えば、 前処理用試薬の前記分解用 FAOD濃度と、 発色用試薬の前記測 定用 FAOD濃度とを調整することによって、 高精度な測定を実現でき る。 この場合、 例えば、 最終的な発色反応溶液における前記分解用 F A OD (A) と測定用 FAOD (B) の添加割合 （活性比 A： B) が、 A ： B= l : 1 0〜 l : 10 00の範囲になるように、 前処理用試薬と発 色用試薬の FAOD濃度を設定することが好ましい。 このような添加割 合であれば、 プロテアーゼ試薬で処理する際に、 前記分解用 FAODが 残存しても、 酵素の反応速度論の点から糖化タンパク質には作用し難い からである。 なお、 このような測定キッ トは、 前記本発明の第 3の糖化 タンパク質の測定方法に利用できる。
本発明の測定キッ トにおいて、 前記発色基質は、 例えば、 酸化により 発色する基質や還元により発色する基質等が使用できるが、 好ましくは 、 酸化により発色する基質であり、 具体的には、 N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'二 ル） -4, 4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウムであることが好ましい。 このように、 発色基質として DA— 64を使用する場合に、 前記プロ テア一ゼ試薬がテトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを含有す ると、 これらの 3つの成分が反応系において混合することにより、 DA 一 64が誤発色を起こす場合がある。 このように誤発色が生じると、 例 えば、 発色量の測定においてバックグラウンドが高くなり、 また、 十分 量添加した DA— 64が不足するという問題が生じる。 しかし、 前述の ように、 各試薬が前記濃度範囲で各成分を含有すれば、 反応系における DA_ 64の誤発色も防止される。 このため、 前記バックグラウンドの 上昇も抑制でき、 より一層高精度な測定が可能になる。
本発明の測定キットにおいて、 前記前処理用試薬、 プロテアーゼ試薬 、 発色用試薬が、 さらに界面活性剤を含んでもよい。
また、 前記各種試薬が、 CHE S， MOP S, ME S、 T r i s、 リ ン酸、 TE S、 TAP S, HE P E S、 HE P P SO、 ホウ酸、 トリエ 夕ノールァミン、 BE S、 M〇P SO、 EP P S、 POP SO、 ADA ， P I PE S、 ACE S, B i s -T r i sからなる群から選択された 少なくとも一つの緩衝剤を含有することが好ましい。 前記各種試薬はそ れぞれ酵素を含有するため、 緩衝剤を添加することにより、 例えば、 至 適 p Hにおいて前記酵素を作用できるからである。
具体的には、 前記前処理用試薬が、 さらに CHE S、 MOP S, T A P S、 EP P S、 リン酸、 HE P P SO、 P〇P SO、 ホウ酸からなる 群から選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、 その pHが、 8. 0〜 1 0. 0の範囲であることが好ましい。
また、 前記プロテア一ゼ試薬が、 さらに T r i s、 ME S、 D I P S 〇、 TE S、 POP S O、 HE P E S、 MOP SO、 B i s—T r i s 、 MOP S, ADA, P I PE S, ACE S、 リン酸からなる群から選 択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、 その pHが、 5. 0〜 7. 0の範囲であることが好ましい。
また、 前記発色用試薬が、 さらに ME S、 T r i s、 リン酸、 MOP S、 TE S、 HEP E S、 HEP P SO、 E P P Sからなる群から選択 された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、 その pHが、 6. 0〜9. 0 の範囲であることが好ましい。
前記発色用試薬は、 例えば、 D A— 64等の発色基質の誤発色を防止 できることから、 さらにアジ化ナトリゥムを含むことが好ましい。
前記前処理用試薬は、 さらにゥリカーゼおよびピリルビンォキシダー ゼの少なくとも一方を含むことが好ましい。 このようにゥリカ一ゼを含 有すれば、 例えば、 測定試料に含まれる尿酸を分解でき、 また、 ビリル ビンォキシダ一ゼを含有すれば、 ピリルビンを分解できる。 この尿酸や ピリルビンは還元力を有するため、 このように分解すれば、 さらに還元 物質による影響が除去でき、 測定精度を向上できるからである。
本発明の測定キットにおける各試薬の具体的な組成としては、 例えば 、 以下の組成があげられる。
前記前処理用試薬は、 例えば、 フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼが 糖化された α—ァミノ基に特異的に作用する酵素であり、 その濃度が 1 0〜50 00 UZLの範囲、 緩衝剤濃度が 5〜 200 mm o 1 ZLの範 囲であり、 ρΗが 8. 0〜 1 0. 0の範囲であることが好ましい。
前記プロテアーゼ試薬は、 例えば、 メタ口プロテアーゼの濃度が、 1 00〜 1 0， 00 0 KUZLの範囲、 テトラゾリゥム化合物濃度が 0. 1〜： L 0 mmo 1 ZLの範囲、 アジ化ナトリゥム濃度が 0. 08〜 4m mo l ZLの範囲、 C a濃度が 0. ：!〜 50 mm o 1 / Lの範囲、 N a 濃度が 5〜 1 0 0 0mm o 1 /Lの範囲、 緩衝剤濃度が 0. ：!〜 50 0 mmo 1 ZLの範囲であり、 pHが 5. 0〜7. 0の範囲であることが 好ましい。 前記発色用試薬は、 例えば、 フルク トシルアミノ酸ォキシダーゼが、 糖化された α—アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に 作用する酵素であり、 その濃度が 1 00〜50, 000 UZLの範囲、 ペルォキシダ一ゼ濃度が 0. 1〜40 0 KUZLの範囲、 Ν- (カルホ'キシメチル アミノカルホ'二ル）— 4， 4， -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウム濃度が 0. 02〜2m mo 1 ZLの範囲、 緩衝剤濃度が 1 0〜 50 0mo l ZLの範囲であり 、 p Hが 6〜 9の範囲であることが好ましい。
本発明の測定キットは、 前記本発明の糖化タンパク質の測定方法と同 様の試料に適用できる。 また、 その測定対象物も同様であり、 好ましく は糖化 Hbである。
なお、 本発明の測定キットにおける各種試薬は、 各成分を水性溶媒に 溶解した液系の試薬でもよいし、 使用前に水性溶媒に溶解して使用する ドライ系の試薬であってもよい。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の測定方法の一実施例において、 酵素法による Hb A l c量と、 HP L C法による HbA l c量との相関関係を示すグラフで ある。 発明を実施するための最良の形態
本発明の測定方法および測定キッ 卜において使用する F AODは、 下 記式 （ 1) に示す反応を触媒する FAODであることが好ましく、 例え ば、 ひ —アミノ基が糖化された糖化ァミンに特異的に作用する F A OD (以下、 「FAOD_ひ」という） 、 アミノ酸残基の側鎖アミノ基が糖化 された糖化ァミンに特異的に作用する F AOD (以下、 「FA〇D— S 」 という） 、 ひーァミノ基が糖化された糖化ァミンおよび前記側鎖アミ ノ基が糖化された糖化ァミンのいずれにも特異的に作用する FAOD ( 以下、 「F AOD— a S」という） 等があげられる。 なお、 「糖化ァミン J とは、 糖化タンパク質、 糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸等をいう。
Ri— CO— CHr NH— R2 十 H2〇 + 02
→R1-CO-CHO + NH2 - R 2 + H2〇2 … （ 1) 前記式 （ 1 ) において、 R1は、 水酸基もしくは糖化反応前の糖に由 来する残基 （糖残基） を意味する。 前記糖残基 （R1) は、 反応前の糖 がアルド一スの場合はアルドース残基であり、 反応前の糖がケト一スの 場合、 ケトース残基である。 例えば、 反応前の糖がグルコースの場合は 、 アマドリ転位により、 反応後の構造はフルク ト一ス構造をとるが、 こ の場合、 糖残基 （R 1) は、 グルコース残基 （アルドース残基） となる 。 この糖残基 （R 1) は、 例えば、
一 [CH (OH) ]n- CH2OH
で示すことができ、 nは、 0〜6の整数である。
前記式 （ 1 ) において、 R2は、 特に制限されないが、 糖化ァミンが 糖化アミノ酸または糖化ペプチド （糖化タンパク質を含む） の場合、 α —ァミノ基が糖化されている場合と、 それ以外のアミノ基 （アミノ酸側 鎖のアミノ基） が糖化されている場合とで異なる。
前記式 （ 1 ) において、 α—ァミノ基が糖化されている場合、 R2は 、 下記式 （2) で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。 この場 合に前記式 （ 1 ) の反応を特異的に触媒するのが前記 FAOD— αおよ び F A〇D— Sである。
- CHR3- CO- R4 - (2) 前記式 （2) において、 R3はアミノ酸側鎖基を示し、 R4は水酸基、 アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、 例えば、 下記式 （3) で示す ことができる。 下記式 （3) において、 nは、 0以上の整数であり、 R 3は、 前述と同様に、 アミノ酸側鎖基を示し、 アミノ酸側鎖基は全て同 一でも、 異なっていても良い。
- (NH_CR3H— CO) n— OH … （3) また、 前記式 （ 1) において、 α—アミノ基以外のァミノ基が糖化さ れている （アミノ酸側鎖基が糖化されている） 場合、 R2は下記式 （4 ) で示すことができる。 この場合に前記式 （ 1 ) の反応を特異的に触媒 するのが前記 F AOD— Sおよび F AOD— a Sである。
R 5 (： 11 (ΝΗ- R6) -CO-R7 (4) 前記式 （4) において、 R5は、 アミノ酸側鎖基のうち、 糖化された アミノ基以外の部分を示す。 例えば、 糖化されたアミノ酸がリジンの場 合、 R5は
-CH2-CH2-CH2-CH2- であり、
例えば、 糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、 R5は、
-CH2-CH2-CH2-NH-CH (NH2) - である。
また、 前記式 （4) において、 R6は、 水素、 アミノ酸残基またはべ プチド残基であり、 例えば、 下記式 （5) で示すことができる。 なお、 下記式 （5) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同様 にアミノ酸側鎖基を示し、 アミノ酸側鎖基は全て同一でも、 異なってい ても良い。 - (CO-CR3H-NH) n-H … （5) また、 前記式 （4) において、 R7は、 水酸基、 アミノ酸残基または ペプチド残基であり、 例えば、 下記式 （6) で示すことができる。 なお 、 下記式 （6) において、 nは 0以上の整数であり、 R3は、 前述と同 様にアミノ酸側鎖基を示し、 アミノ酸側鎖基は全て同一でも、 異なって いても良い。
- (NH— CHR3— C〇） n-OH … (6) 前記糖化ひーァミノ基に特異的に作用する FAOD— αとしては、 例 えば、 市販の商品名フルクトシルーアミノ酸ォキシダーゼ （FAOX— Ε) (キッコーマン社製） 、 ぺニシリウム属由来の FAOD (特開平 8 一 33 638 6号公報） 等があげられる。 前記糖化されたアミノ酸側鎖 に特異的に作用する FAOD— Sとしては、 例えば、 フサリウム属由来 F A O D (日本生物工学会大会 平成 1 2 年度 Γ Fusarium oxysporum由来アミノ酸ォキシダ一ゼの基質特異性の変換 ； 藤原真紀 他」 ） 等があげられる。 また、 前記糖化 α—ァミノ基および糖化アミノ 酸側鎖基の両方に作用する FAOD— a Sとしては、 例えば、 市販の商 品名 F〇D (旭化成社製） 、 ギペレラ属由来 FAOD (特開平 8— 1 5 467 2号公報） 、 フサリウム属由来 FAOD (特開平 7— 2 8 9 2 5 3号公報） 、 ァスペルギルス属由来 FAOD (WO 9 9/2 0 0 3 9) 等があげられる。 本発明におけるテトラゾリゥム化合物としては、 例えば、 テトラゾー ル環の少なくとも 2箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ま しく、 より好ましくは、 3箇所に環構造置換基を有する構造である。 前記テトラゾリゥム化合物が、 前述のように、 前記テトラゾール環の 少なくとも 2箇所に環構造置換基を有する場合、 前記置換基を、 前記テ トラゾ一ル環の 2位および 3位に有することが好ましい。 また、 テトラ ゾリゥム化合物が 3箇所に環構造置換基を有する場合は、 前記置換基を 、 前記テトラゾール環の 2位、 3位および 5位に有することが好ましい また、 テトラゾリゥム化合物は、 少なくとも 2つの環構造置換基の環 構造がベンゼン環であることが好ましい。 前記ベンゼン環以外の環構造 置換基としては、 例えば、 環骨格に Sまたは Oを含み、 かつ共鳴構造で ある置換基があげられ、 例えば、 チェニル基、 チアゾィル基等である。 また、 前記テトラゾリゥム化合物は、 テトラゾール環の少なくとも 3 箇所に環構造置換基を有し、 前記環構造置換基のうち少なくとも 2つの 環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。
また、 少なくとも 1つの環構造置換基が官能基を有することが好まし く、 前記官能基の数が多いことがより好ましい。
前記官能基としては、 電子吸引性の官能基が好ましく、 例えば、 八口 ゲン基、 エーテル基、 エステル基、 カルポキシ基、 ァシル基、 ニトロソ 基、 ニトロ基、 ヒドロキシ基、 スルホ基等があげられる。 この他にも、 例えば、 ヒドロペルォキシ基、 ォキシ基、 エポキシ基、 ェピジォキシ基 、 ォキソ基等の酸素を含む特性基や、 メルカプト基、 アルキルチオ基、 メチルチオメチル基、 チォキソ基、 スルフィノ基、 ベンゼンスルホニル 基、 フエニルスルホニル基、 p -トルエンスルホニル基、 P-トリルスルホ ニル基、 トシル基、 スルファモイル基、 イソチオシァネート基等の硫黄 を含む特性基等があげられる。 これらの電子吸引性官能基の中でも、 好 ましくは、 ニトロ基、 スルホ基、 ハロゲン基、 カルボキシ基、 ヒドロキ シ基、 メトキシ基、 エトキシ基である。 また、 前記電子吸引性の官能基 の他に、 例えば、 フエニル基 （C 6H 5―) 、 スチリル基 （C 6H5 CH =CH—） 等の不飽和炭化水素基等もあげられる。 なお、 前記官能基は 、 解離によりイオン化していてもよい。
前記テトラゾリゥム化合物は、 テトラゾール環の 2位および 3位にベ ンゼン環を有し、 前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、 ハロゲン基 、 カルポキシ基、 ニトロ基、 ヒドロキシ基、 スルホ基、 メトキシ基およ びエトキシ基からなる群から選択された少なくとも 1つの官能基を有す ることが好ましい。 なお、 前記両方のベンゼン環が、 前記官能基を有し てもよい。 前記ベンゼン環において、 いずれの箇所 （ortho-、 meta -、 pra-) に前記官能基を有してもよい。 また、 官能基の数も特に制限され ず、 同じ官能基を有しても、 異なる官能基を有してもよい。
前記テトラゾリゥム化合物は、 例えば、 前記テトラゾール環の 2位、 3位および 5位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、 例えば 、 2- (4-ョ一ドフエ二ル）- 3- (4-二ト口フエ二ル）- 5- (2, 4-ジスルホフエ 二ル）- 2H-テトラゾリゥム塩 （以下、 「WS T_ 3」 ともいう） 、 2- (4- ョードフエニル） -3-(2,4-ジニトロフエニル） -5- (2，4-ジスルホフエニル )-2H-テトラゾリゥム塩、 2-(2-メトキシ -4-二ト口フエ二ル）- 3-(4-二ト 口フエ二ル）- 5- (2,4-ジスルホフエ二ル）- 2H-テトラゾリゥム塩、 2- (4 - ョードフエニル） -3- (4-二ト口フエニル） -5-フエニル- 2H-テトラゾリゥ ム塩、 3, 3' - (1， 1' -ビフエニル- 4,4' -ジル）-ビス（2, 5-ジフエニル） - 2H -テトラゾリゥム塩、 3，3' - [3, 3' -ジメトキシ-（1, 1' -ビフエニル） - 4, 4' -ジル] -ビス [2-(4-二ト口フエ二ル）- 5-フエニル- 2H-テトラゾリゥ ム塩]、 2, 3-ジフエニル- 5- (4-クロ口フエニル）テトラゾリゥム塩、 2，5- ジフエニル- 3-(p-ジフエニル）テトラゾリゥム塩、 2,3-ジフエ二ル -5- (P-ジフエニル）テトラゾリゥム塩、 2， 5-ジフエニル -3- (4-スチリルフエ ニル）テトラゾリゥム塩、 2， 5-ジフエニル -3- (in-トリル）テトラゾリゥム 塩および 2， 5-ジフエ二ル -3- (P-トリル）テトラゾリゥム塩等があげられ る。
また、 前記テトラゾリゥム化合物は、 前述のような化合物には制限さ れず、 この他に、 前記テトラゾ一ル環の 2箇所にベンゼン環構造置換基 および 1箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、 例え ば、 2，3-ジフエニル -5-(2-チェニル）テトラゾリゥム塩、 2-ベンゾチア ゾィル -3- (4-カルボキシ- 2-メトキシフエニル） -5- [4- (2-スルホェチル 力ルバモイル）フエニル] -2H-テトラゾリゥム塩、 2,2' -ジベンゾチアゾ ィル -5， 5' -ビス [4-ジ（2-スルホェチル）力ルバモイルフエ二ル]- 3,3' - (3,3' -ジメトキシ -4，4' -ビフエ二レン）ジテトラゾリゥム塩および 3- (4, 5-ジメチル -2-チアゾィル）- 2,5-ジフエニル -2H-テトラゾリゥム塩等 があげられる。
また、 前記テトラゾ一ル環の 2箇所にベンゼン環構造置換基および 1 箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリゥム化合物も使用でき、 例えば、 2，3-ジフエニル -5-シァノテトラゾリゥム塩、 2,3-ジフエ二ル- 5-力ルポキシテトラゾリゥム塩、 2,3-ジフエニル -5-メチルテトラゾリ ゥム塩、 2,3-ジフエニル -5-ェチルテトラゾリゥム塩等があげられる。 前述のテトラゾリゥム化合物の中でも、 前述のように、 環構造置換基 を 3つ有する化合物が好ましく、 より好ましくは、 環構造がベンゼン環 である置換基を 3つ有し、 かつ電子吸引性官能基を多く有するものであ り、 特に好ましくは、 WS T— 3である。 なお、 このようなテトラゾリ ゥム化合物は、 例えば、 塩でもよいし、 イオン化された状態等であって もよい。 また、 このテトラゾリゥム化合物は、 一種類でもよいし、 二種 類以上を併用してもよい。 つぎに、 本発明の糖化タンパク質の測定方法について、 血球中の糖化 Hbを測定する例を、 下記実施形態 A- 1〜A- 5において説明する。
(実施形態 A-1)
この実施形態は、 前記糖化アミノ酸の分解に FAOD— Q!を、 糖化 H bの測定に FAOD— a Sをそれぞれ使用し、 テトラゾリゥム化合物お よびアジ化ナトリウムの存在下で酸化還元反応を行った例である。
まず、 全血をそのまま溶血し、 または全血から遠心分離等の常法によ り血球画分を分離してこれを溶血し、 溶血試料を調製する。 この溶血方 法は、 特に制限されず、 例えば、 界面活性剤を用いる方法、 超音波によ る方法、 浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。 この中でも、 操作 の簡便性等の理由から、 前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、 例えば、 ポリオキシエチレン _p_t—ォク チルフエニルエーテル （T r i t o n系界面活性剤等） 、 ポリエチレン ソルビタンアルキルエステル （Twe e n系界面活性剤等） 、 ポリオキ シエチレンアルキルエーテル （B r i j系界面活性剤等） 等の非イオン 性界面活性剤が使用でき、 具体的には、 例えば、 T r i t o nX— 1 0 0、 Twe e n— 2 0、 B r i j 3 5等があげられる。 前記界面活性剤 による処理条件は、 通常、 処理溶液中の血球濃度が、 1〜 1 0体積％の 場合、 前記処理溶液中の濃度が 0. 0 1〜 5重量％になるように前記界 面活性剤を添加し、 室温で、 数秒 （約 5秒） 〜 1 0分程度攪拌すればよ い。
つぎに、 前記溶血試料に対し、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナ トリゥムを添加する。
前記テトラゾリゥム化合物は、 例えば、 処理溶液中の血球濃度が、 0 . 2〜 2体積％の場合、 濃度 0. 00 5〜400 mmo 1 /Lの範囲に なるように添加することが好ましく、 より好ましくは 0. 0 2〜 1 0 0 mm o 1 の範囲、 特に好ましくは 0. 1〜 5 0 mm o 1 / Lの範囲 である。 具体的に、 前記テトラゾリゥム化合物が WST— 3の場合は、 濃度 0. 004〜 1 6 mmo 1 Lの範囲になるように添加することが 好ましく、 より好ましくは 0. 02〜 1 Ommo 1 /Lの範囲、 特に好 ましくは 0. 1〜 5 mmo 1 の範囲である。 なお、 前記テトラゾリ ゥム化合物は、 一種類でもよいし、 二種類以上を併用してもよい。 この ようにテトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加することに より、 無添加の場合に比べて、 その感度が、 約 1. 2〜 3倍の範囲で向 上する。
また、 前記テトラゾリゥム化合物 （C) とアジ化ナトリウム （D) の 添加割合 （モル比 C ： D) は、 例えば、 C : D= 20 : 3〜2 0 : 1 2 の範囲であり、 好ましくは 2 0 : 5〜2 0 : 1 1の範囲、 より好ましく は 20 ： 6〜20 ： 1 0の範囲である。
前記テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムは、 そのまま前記 溶血試料に添加してもよい。 しかし、 操作の簡便性等の点から、 溶媒に 溶解したテトラゾリゥム化合物溶液およびアジ化ナトリゥム溶液として 、 または、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有 する溶液 （テトラゾリゥム化合物 · アジ化ナトリウム混合液） として使 用することが好ましい。
前記各種溶液におけるテトラゾリゥム化合物またはアジ化ナトリゥム の濃度は、 前記溶血試料に添加する場合の希釈倍率等に応じて適宜決定 できるが、 テトラゾリゥム化合物の濃度は、 例えば、 0. l〜 1 0mm o 1 の範囲であり、 好ましくは、 0. 6〜 5 mmo 1 ZLの範囲で あり、 より好ましくは 0. 7〜2. 7 mmo 1 ZLの範囲である。 アジ 化ナトリウムの濃度は、 例えば、 0. 1〜4mmo 1 ZLの範囲であり 、 好ましくは、 0. 1 5〜： L . 8 mmo 1 ZLの範囲、 より好ましくは 0. 2〜 1. 5 mmo 1 /Lの範囲である。 また、 前記混合液の場合、 テトラゾリゥム化合物 （C) とアジ化ナトリウム （D) との配合割合 （ モル比 C ： D) は、 C : D= 20 : 3〜2 0 : 1 2の範囲であり、 好ま しくは 20 : 5〜 20 : 1 1の範囲、 より好ましくは 2 0 ： 6〜20 ： 1 0の範囲である。
前記溶液の溶媒としては、 例えば、 MOP S、 ME S, MOP S O, D I P SO, TE S, POP S〇， HE P E S, リン酸等の緩衝液が使 用でき、 好ましくは、 MOP S、 ME Sである。 前記溶媒の pHは、 例 えば、 5. 0〜7. 0の範囲であり、 好ましくは、 5. 5〜6. 5の範 囲である。 また、 前記緩衝液の濃度は、 例えば、 0. lmmo l /L〜 1 0 mmo 1 /Lの範囲、 好ましくは、 ：！〜 5 mmo 1 ZLの範囲、 よ り好ましくは l〜 3mmo 1 ZLの範囲であり、 前記溶血試料に添加し た場合の処理溶液における最終濃度は、 例えば、 0. Υ θπιιηο Ι Ζ Lの範囲、 好ましくは、 0. 8~4. 5 mmo 1 ZLの範囲、 より好ま しくは 0. 8〜2. 7mmo 1 /Lの範囲である。
また、 より一層の感度向上が可能であることから、 調製した前記テト ラゾリゥム化合物 ·アジ化ナトリゥム混合液を、 前記溶血試料に添加す る前に、 一定時間放置することによってエージングすることが好ましい 。 このエージング処理によって、 感度が、 エージングしない場合よりも 、 例えば、 約 1. 2〜 3倍に向上する。
前記エージングにおいて、 例えば、 処理温度は、 40〜60t:の範囲 が好ましく、 より好ましくは 50〜6 O :の範囲である。 処理時間は、 例えば、 6〜 7 2時間の範囲であり、 好ましくは 1 5〜 20時間の範囲 である。
前記溶血試料に対して、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥ ムを直接または前記溶液として添加した後、 通常、 処理温度 40〜 60 の範囲で、 6〜 72時間インキュベートし、 前記試料の前処理を行う 。 このように試料をテトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムで前 処理することによって、 前述のように感度の向上が達成できると同時に 、 テトラゾリゥム化合物によって、 前記試料中に含まれる還元物質等が 酸化還元反応に与える影響を除去でき、 測定精度をも向上できるからで ある。 このようにテトラゾリゥム化合物は、 測定精度の向上にも寄与す るが、 本発明の目的の一つである測定感度の向上には、 テトラゾリゥム 化合物だけでなくアジ化ナトリゥムの共存が必要であり、 それによつて 本発明に特有の効果が奏される。
続いて、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加した前 処理済み溶血試料について、 プロテアーゼ処理を行う。 これは、 後の処 理に使用する F AO Dを測定対象物に作用し易くするためである。 また 、 前述のようにテトラゾリゥム化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行 うため、 糖化 Hbの分解を迅速に行うこともできる。
前記プロテア一ゼとしては、 例えば、 セリンプロテアーゼ、 チオール プロテアーゼ、 メタ口プロティナ一ゼ等が使用でき、 具体的には、 トリ プシン、 プロテナ一ゼ K：、 キモトリブシン、 パパイン、 ブロメライン、 ズブチリシン、 エラスターゼ、 アミノぺプチダーゼ等が使用でき、 好ま しくは、 前記糖化 Hbを選択的に分解する、 ブロメライン、 パパイン、 ブタ滕臓由来 ト リ プシン、 メタ 口プロティ ナ一ゼ、 Bacillus subtil lis由来のプロテアーゼ等が好ましい。 前記 Bacillus subtillis 由来プロテアーゼとしては、 商品名プロテアーゼ N (例えば、 フル力社 製） 、 商品名プロテアーゼ N「ァマノ」 （天野製薬社製） 等があげられる 。 前記メタ口プロティナーゼとしては、 Bacillus属由来メタ口プロティ ナ一ゼ （EC 3. 4. 24. 4) (例えば、 東洋紡社製：商品名トヨチ ーム） 等があげられる。 これらの中でもより好ましくはメタ口プロティ ナ一ゼ、 ブロメライン、 パパインであり、 特に好ましくはメタ口プロテ イナーゼである。 このように、 選択的に分解するプロテアーゼを使用す れば、 糖化 Hb分解物を選択的に調製できる。 前記プロテアーゼ処理は 、 通常、 緩衝液中で行われ、 その処理条件は、 使用するプロテア一ゼの 種類、 糖化 Hbの濃度等により適宜決定される。
前記緩衝液としては、 例えば、 CHE S緩衝液、 CAP SO緩衝液、 CAP S緩衝液、 リン酸緩衝液、 T r i s緩衝液、 EP P S緩衝液、 H E P E S緩衝液等が使用できる。 その pHは、 例えば、 6〜 1 3の範囲 であり、 好ましくは 8〜 1 2の範囲、 より好ましくは 9〜 1 1の範囲で ある。 また、 プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、 例えば、 1. 0〜： L Ommo 1 ZLの範囲である。
具体的には、 例えば、 前記プロテア一ゼとしてメタ口プロティナーゼ を用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、 通常、 反応液中のメ 夕口プロティナ一ゼ濃度 0. 1〜40MUZL、 反応液中の血球濃度 0 . 05〜 1 5体積％、 反応温度 1 5〜37 ：、 反応時間 1分〜 24時間 、 pH 6〜 1 2の範囲である。
また、 例えば、 前記プロテアーゼとしてプロティナ一ゼ Kを用いて前 記前処理済み溶血試料を処理する場合、 通常、 反応液中のプロテアーゼ 濃度 1 0〜3 00 KUZL、 反応液中の血球濃度 0. 0 5〜 1 5体積％ 、 反応温度 1 5〜 3 7 、 反応時間 1分〜 24時間、 pH 6〜 1 2の範 囲である。 また、 前記緩衝液の種類も特に制限されず、 例えば、 トリス 塩酸緩衝液、 EP P S緩衝液、 P I P E S緩衝液等が使用できる。 つぎに、 前記プロテアーゼ処理した溶血試料を、 前記式 （ 1) の反応 、 具体的には下記式 （7) の反応を触媒する F AOD— α (分解用 F A OD) で処理する。
R1? CO-CH,? NH-CHR3-C00H + Η,Ο
R'-CO-CHO + ΝΗ,-CHR3- C00H + Η, 2ΟW2 (7) 前記式 （7) において、 R1は前述と同様の糖残基を示し、 R3は前述 と同様にアミノ酸側鎖を示す。
この処理によって、 前記溶血試料に含まれる α—ァミノ基が糖化され た糖化アミノ酸、 および前記糖化 Hb分解物のうち α—ァミノ基の糖化 部分が分解される。
なお、 前記 FAOD_ α処理によっては、 糖化アミノ酸の中でも側鎖 ァミノ基が糖化されたものは分解されずに残存する。 しかし、 この側鎖 が糖化されたアミノ酸の糖化アミノ酸全体に対する割合、 および糖化 Η bにおける糖化された側鎖アミノ基を有するアミノ酸残基に対する割合 から考えても、 残存する糖化アミノ酸の影響は小さく、 測定精度は十分 に向上するといえる。
処理条件としては、 例えば、 反応液中の F AOD_ α濃度 1 0〜50 0 0 U/L, 反応液中の血球濃度 0. 5〜2 0体積％、 反応温度 20〜 50で、 反応時間 1分〜 1時間、 ρΗ 6〜9の範囲である。 この処理は 、 通常、 緩衝液中で行われ、 前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使 用できる。
つぎに、 前記 F AO D— α処理した前記溶血試料を、 さらに FAOD _ a Sで処理する。 この FAOD— a Sは、 前述のように、 糖化された α—アミノ基および糖化された側鎖アミノ基の両方に作用する。 しかし 、 糖化 Hb分解物は、 予め、 分解用 FAOD— αによって処理されてい るため、 糖化側鎖アミノ基のみに測定用 F AO D— Sを作用させるこ とができる。
この F AOD— ひ S処理は、 前記プロテア一ゼ処理と同様に緩衝液中 で行うことが好ましく、 前記緩衝液としては、 特に制限されず、 前記プ 口テアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
処理条件としては、 例えば、 反応液中の F AOD_ a S濃度 1 0〜 3 0， 0 0 0 UZL、 反応液中の血球濃度 0. 1〜 5体積％、 反応温度 2 0〜 5 0で、 反応時間 1分〜 1時間、 ρΗ 6〜9の範囲である。
つぎに、 前記 F AOD— a S処理で生成した過酸化水素を、 酸化酵素 および発色基質を用いて、 さらに酸化還元反応によって測定する。
前記発色基質としては、 例えば、 DA— 64、 オルトフエ二レンジァ ミン （OPD) 、 トリンダー試薬と 4—ァミノアンチピリンとを組み合 せた基質等があげられる。 前記トリンダー試薬としては、 例えば、 フエ ノール、 フエノール誘導体、 ァニリン誘導体、 ナフトール、 ナフトール 誘導体、 ナフチルァミン、 ナフチルァミン誘導体等があげられる。 また 、 前記ァミノアンチピリンの他に、 ァミノアンチピリン誘導体、 バニリ ンジァミンスルホン酸、 メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン （MBT H) 、 スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン （SMBTH) 等も使用できる。 このような発色性基質の中でも、 特に好ましくは、 前 述のように、 DA— 64である。
前記酸化酵素としては、 例えば、 PODが好ましい。
前記酸化還元反応は、 通常、 緩衝液中で行われ、 その条件は、 前記生 成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。 通常、 反応液中の P OD濃度 1 0〜： L O O, 0 0 0 I U/L、 発色基質濃度 0. 0 0 5〜 3 0 mmo 1 /し 反応温度 1 5〜 3 7 、 反応時間 0. 1〜 3 0分、 p H 5〜9である。 また、 前記緩衝液は、 特に制限されず、 例えば、 前記 プロテアーゼ処理および F AO D処理等と同様の緩衝液等が使用できる 前記酸化還元反応において、 例えば、 前記発色基質を用いた場合、 前 記反応液の発色程度 （吸光度） を分光光度計で測定することにより、 過 酸化水素の量を測定できる。 そして、 例えば、 予め準備した過酸化水素 量と糖化 Hb量との相関関係を表わす検量線と、 測定した過酸化水素量 とを用いて、 試料中の糖化 Hb量を求めることができる。
なお、 はじめに添加した分解用 F AOD—ひによって生成した過酸化 水素は、 血液試料 （溶血試料） 中にはじめから存在するカタラーゼによ つて消失するため、 F AOD—ひ Sにより生成した測定対象物由来の過 酸化水素の測定には影響を及ぼすことはない。 また、 別途力夕ラーゼを 添加して消去させてもよい。 このように前記カタラーゼにより過酸化水 素を消去する場合、 後に行う測定用 F AOD— a S処理で生成する過酸 化水素までもが消去されることを防ぐために、 FAOD— a Sの添加と 共に、 過剰量の PODおよび発色性基質を添加することが好ましい。 こ の場合、 PODは、 前記力夕ラーゼの添加量 （U) に対し、 例えば、 5 〜 1 00倍の活性 （U) 量を添加することが好ましい。
また、 分解用 FAODで溶血試料を処理する際に、 例えば、 さらにゥ リカ一ゼ、 ピリルビンォキシダーゼ等を添加して同様に処理してもよい 。 このようにゥリカーゼで処理すれば、 さらに前記試料中に含まれる尿 酸を分解でき、 また、 ピリルビンォキシダーゼで処理すれば、 ピリルビ ンを分解できる。 この尿酸やピリルビンは還元力を有するため、 このよ うに処理することによって、 さらに還元物質による影響が除去でき、 測 定精度を向上できる。
前記ゥリカーゼまたはピリルビンォキシダーゼの添加割合は、 反応液 中の血球濃度が 0. 2〜2体積％の場合、 例えば、 前記反応液中のゥリ 力一ゼ濃度 0. 1〜 500 0 UZL、 ピリルビンォキシダーゼ濃度 0. 1〜 5 000 UZLであり、 好ましくは、 ゥリカ一ゼ濃度 1〜 20 0 0 ピリルビンォキシダーゼ濃度 0. 5〜 1 000 U/Lであり、 より好ましくはゥリカ一ゼ濃度 5〜 1 000U/L、 ピリルビンォキシ ダーゼ濃度 2〜 1 000 UZLである。 また、 その処理条件としては、 例えば、 前記分解用 FAODと同様に行うことができる。
この測定において、 前記プロテア一ゼ処理は、 前述のように前記分解 用 F A〇D— α処理の前には限られず、 例えば、 前記 FAOD— α処理 の後に行ってもよい。 前記プロテアーゼ処理は、 前述のように、 FAO Dを作用し易くするために行うが、 前記 F A O D— α処理は糖化アミノ 酸の分解を目的として行うため、 F AOD—ひ処理前にプロテアーゼに よって糖化 Hbが分解されていなくても、 本発明の効果は十分に得るこ とができるからである。
また、 本発明の測定方法は、 本実施形態の操作順序には限定されず、 例えば、 同時に行ってもよい工程もある。 例えば、 溶血処理と、 テトラ ゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウム処理と、 分解用 F AO D処理と を同時に行ってもよく、 また、 プロテアーゼ処理と、 テトラゾリゥム化 合物およびアジ化ナトリゥム処理とを同時に行うこともできる。 なお、 これらの組み合わせには制限されない。
なお、 前記過酸化水素量は、 前記 POD等を用いた酵素的手法の他に 、 例えば、 電気的手法により測定することもできる。
(実施形態 A-2)
この実施形態は、 糖化アミノ酸の分解と糖化 Hbの測定に、 同じ FA ODを用いた例である。 FAODとしては、 特に制限されず、 例えば、 F AOD- , FAOD— S、 F A O D— a Sのいずれを用いてもよい 。 なお、 特に示さない限りは、 前記実施形態 A-1と同様にして測定を 行う。
テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加した前処理済み 溶血試料に分解用 F AO Dを添加する。
具体的な処理条件としては、 例えば、 反応液中の分解用 F AOD濃度 1 0〜 5 0 0 0 UZL、 反応液中の血球濃度 0. 5〜2 0体積％、 反応 温度 2 0〜 5 0 ：、 反応時間 1分〜 1時間、 pH 6〜9の範囲である。 この処理は、 通常、 緩衝液中で行われ、 前述と同様の緩衝液が使用でき る。
つぎに、 分解用 F AO D処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う 。 このプロテアーゼ処理の第 1の目的は、 前述と同様に、 血球由来の糖 化 Hbを分解し、 後の工程でさらに添加する測定用 F AO Dを作用し易 くするためである。 そして、 第 2の目的は、 前記分解用 FAODを消化 して失活させるためである。
FAODは、 糖化タンパク質よりも糖化アミノ酸に作用し易いため、 前記分解用 FAOD処理では、 糖化アミノ酸が分解される。 しかし、 こ の分解用 FAODが残っている状態で、 前記糖化 Hbをプロテア一ゼ処 理すると、 残存する分解用 F AODと糖化 H b分解物の糖化部分とが反 応してしまい、 正確な測定ができないという問題がある。 したがって、 この残存する分解用 FAODをプロテアーゼで失活させ、 前記糖化 Hb 分解物との反応を防止する。 このために、 はじめに添加した分解用 F A ODを速やかに失活させ、 かつ、 糖化 H bを分解できるだけのプロテア ーゼを添加する必要がある。
前記プロテアーゼとしては、 特に制限されず前述と同様のものが使用 できる。 また、 その処理条件は、 例えば、 使用するプロテアーゼの種類 、 糖化 Hbの濃度、 分解用 FAODの種類やその量等に応じて適宜決定 される。
プロテアーゼ処理の反応溶液におけるプロテアーゼの添加量は、 分解 用 FAOD 1 0 0 UZLに対して、 例えば、 1〜： L 00 0, 00 0 KU /Lの範囲であり、 好ましくは 1 0〜300， 000 KUZLの範囲で あり、 より好ましくは 1 00〜： 1 00， 000 KUZLの範囲である。 具体的に、 プロテア一ゼとしてトリプシンを用いて、 前記試料を処理 する場合、 例えば、 反応液中のプロテアーゼ濃度 1 000〜 30， 0 0 0 KUZL、 反応液中の血球濃度 0. 2〜5体積％、 反応液中の FAO D濃度 1 0〜： 1 00 O.UZL 反応温度 2 0〜 50 ：、 反応時間 1 0分 〜20時間、 pH 6〜9の範囲である。
つぎに、 前記プロテアーゼ処理により得られた糖化 Hb分解物に、 分 解用 FAODと同じ FAODを、 再度測定用 F A O Dとして添加して処 理する。 この測定用 FAODは、 前記プロテアーゼによって失活するお それがあるため、 十分量添加する必要がある。
この測定用 FAOD処理も、 前述と同様に緩衝液中で行うことが好ま しく、 前記緩衝液としては、 特に制限されず、 前記プロテア一ゼ処理と 同様の緩衝液が使用できる。
測定用 FAOD処理の反応溶液における測定用 FAODの添加量は、 プロテア一ゼ 1 0， 000 KUZLに対して、 例えば、 1 0〜 1 00 0 , 000 UZLの範囲であり、 好ましくは 1 00〜 200 , 000 / Lの範囲であり、 より好ましくは 500〜 5 0， 000 U/Lの範囲で ある。
具体的な処理条件としては、 例えば、 反応液中の測定用 FAOD濃度 500〜 2 0, 0 00 U/L、 反応液中のプロテアーゼ濃度 1 0 0〜 3 0, 00 0 KUZL、 反応液中の血球濃度 0. 0 1〜 1体積％、 反応温 度 1 5〜40 ：、 反応時間 1分〜 1時間、 pH 6〜9の範囲である。 (実施形態 A- 3)
この実施形態は、 糖化アミノ酸の分解と糖化 Hbの測定に、 同じ FA ODを用いた例である。 特に示さない限りは、 前記実施形態 A- 1と同 様にして測定を行う。
但し、 この実施形態は、 前記実施形態 A- 2とは異なり、 分解用 FA ODを、 プロテア一ゼによって必ずしも失活させる必要がない実施形態 である。 酵素には基質特異性があるため、 プロテアーゼと F AODとの 組み合わせによっては、 FAODをプロテア一ゼで失活させ難い場合が ある。 このような場合に本実施形態の方法が有効になる。 なお、 はじめ に添加した分解用 F A〇Dが、 プロテア一ゼにより生成した糖化 H b分 解物と反応すると、 測定精度を向上できないため、 以下に示すように、 F AO Dの添加割合を調整することが重要となる。
テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加した前処理済み 溶血試料に、 分解用 F AODを添加する。
分解用 FAODは、 プロテア一ゼで失活させ難い場合、 その活性が残 存しても、 プロテアーゼ処理の間に、 生成した糖化 Hb分解物に作用し ない範囲で添加する必要がある。 また、 FAODは糖化アミノ酸に作用 しゃすく、 糖化タンパク質に作用し難いという性質を利用するため、 糖 化アミノ酸のみに作用する程度の添加量であり、 かつ反応時間とするこ とが好ましい。
FAOD処理の条件としては、 例えば、 反応液中の FAOD濃度 1 0 〜 500 0 UZL、 反応液中の血球濃度 0. 2〜2 0体積％、 反応温度 2 0〜 5 0 ：、 反応時間 1分〜 1時間、 pH 6〜9の範囲である。 この 処理は、 通常、 緩衝液中で行われ、 前述と同様の緩衝液が使用できる。 つぎに、 前記 FAOD処理した試料に対しプロテアーゼ処理を行う。 この実施形態は、 前述のように、 プロテアーゼが前記 FAODに作用し 難い場合の例であるため、 特にプロテアーゼの添加量は特に制限されな い。
前記プロテアーゼとしては、 特に制限されず、 前述と同様のものが使 用できる。 その処理条件は、 前述と同様に、 使用するプロテア一ゼの種 類、 糖化 Hbの濃度、 使用するプロテアーゼの FAODに対する基質特 異性等により適宜決定される。
このような実施形態に該当する FAODとプロテアーゼの組み合わせ としては、 例えば、 商品名 FOD (旭化成社製） と商品名トヨチーム （ 東洋紡社製） 、 前記ギペレラ属由来 FAODと商品名プロテナーゼ K ( ロシュ社製） のプロテアーゼ等があげられる。
プロテアーゼとしてトリプシンを用いて、 前記試料を処理する場合、 例えば、 反応液中のプロテアーゼ濃度 1 00〜6000 UZL、 反応液 中の血球濃度 0. 2〜 5体積％、 反応液中の F AOD濃度 1〜： L 00 U ZL、 反応温度 20〜5 0 、 反応時間 1 0分〜 2 0時間、 pH 6〜9 の範囲である。
続いて、 前記プロテアーゼ処理により得られた分解物に、 再度同じ F AODを測定用 FAODとして添加する。
この測定用 FAOD処理も、 前述と同様に緩衝液中で行うことが好ま しく、 前記緩衝液としては、 特に制限されず、 前記プロテアーゼ処理と 同様の緩衝液が使用できる。
このように、 本実施形態においては、 分解用 FAOD (A) と測定用 FAOD (B) の添加割合 （活性比 A： B) を、 例えば、 前述のように A： B = 1 ： 5 0, 00 0〜 1 ： 1 0の範囲、 好ましくは 1 ： 50 00 〜 1 ： 2 5の範囲、 より好ましくは 1 ： 500〜1 ： 5 0の範囲にする 。 このように設定すれば、 前記実施形態 A- 2と異なり前記分解用 FA ODは反応液中に残存するが、 この残存した F AO Dの反応速度は非常 に遅いため、 プロテアーゼ処理工程において、 測定に影響を与える程度 に、 生成した糖化 Hb分解物に残存 F AO Dが作用することはない。 処理条件としては、 例えば、 反応液中の測定用 F AOD濃度 5 00〜 20, 0 00 U/L、 反応液中のプロテアーゼ濃度 1 00〜 30， 0 0 0 KU/L, 反応液中の血球濃度 0. 0 1〜 1体積％、 反応温度 1 5〜 40T：、 反応時間 1分〜 1時間、 pH 6〜9の範囲である。 (実施形態 A-4)
この実施形態は、 発色基質として DA— 64を用いて、 前記測定用 F AOD処理によって生成した過酸化水素を測定する例である。 なお、 特 に示さない限りは、 前記実施形態 A-1と同様に行う。
発色基質として DA— 64を使用する場合は、 D A_ 64の誤発色を 防止するために、 DA— 64、 テトラゾリゥム化合物、 アジ化ナトリウ ムおよび界面活性剤のそれぞれの前記酸化還元反応溶液における終濃度 を以下の範囲に設定する。 各成分の終濃度は、 通常、 DA— 64 1〜 1 0, 0 00 ^mo 1 /L, 界面活性剤 0. 0 1〜 2 0 Ommo 1 ZL 、 テトラゾリゥム化合物 0. 0 5〜 2 Ommo 1 L、 アジ化ナトリウ ム 0. 0 1〜 5mmo l ZLの範囲であり、 好ましくは、 DA— 64 〜 10 00 / mo l /L、 界面活性剤 0 5〜3 0mmo l /L、 テトラゾリゥム化合物 0. 0 1〜 1 0mmo l /L、 アジ化ナトリウム 0. 0 2〜 2 mm o 1 ZLの範囲であり、 より好ましくは DA— 6 4 3〜30 0 ; mo l /L、 界面活性剤 0. 1〜 1 0 mm o 1 L、 テト ラゾリゥム化合物 0. 5〜8mmo l ZL、 アジ化ナトリウム 0. 0 8 〜0. 8mmo 1 の範囲である。 前記界面活性剤としては、 特に制 限されず、 例えば、 前述や後述のものが使用できる。
この酸化還元反応溶液の PHは、 6. 0〜 1 0. 0の範囲が好ましく 、 より好ましくは 6. 5〜9. 0の範囲、 特に好ましくは 7. 0〜8. 5の範囲である。
前記界面活性剤の添加は、 例えば、 D A— 64を添加する前または同 時に行ってもよいし、 溶血試料を調製するために界面活性剤を添加する 塲合であれば、 酸化還元反応の際に界面活性剤が前記濃度範囲になるよ うに、 予め添加しておいてもよい。
前記 DA— 64は、 酸化還元反応により発色するため、 この反応液に ついて、 例えば、 検出波長 6 00〜 7 80 nmの範囲における吸光度 （ 発色程度） を分光光度計で測定すれば、 過酸化水素の量を測定できる。
(実施形態 A-5)
つぎに、 本発明の Hb糖化率の測定方法について、 全血を試料とした 場合の例をあげて説明する。
まず、 前記実施形態 A-1と同様にして、 全血を溶血し、 溶血試料中 の糖化 Hb量を測定し、 一方、 前記溶血試料における Hb量を測定する
Hb量は、 例えば、 以下に示すようにして測定できる。 まず、 前記溶 血試料に、 前述のようなテトラゾリゥム化合物を添加し、 Hbを変性さ せる。 その添加割合は、 例えば、 前記溶血試料中の血球濃度が、 0. 2 〜 2体積％の場合、 濃度 00 5〜40 Ommo 1 ZLの範囲になる ように添加することが好ましく、 より好ましくは 0. 02〜 1 00mm o 1 /Lの範囲、 特に好ましくは 0. 1〜 5 Ommo 1 ZLの範囲であ る。 具体的に、 前記テトラゾリゥム化合物が WS T— 3の場合、 濃度 0 . 004〜 1 6 mm o 1 ZLの範囲になるように添加することが好まし く、 より好ましくは 0. 02〜10mmo lZLの範囲、 特に好ましく は 0. 1〜 5mmo 1 ZLの範囲である。
前記テトラゾリゥム化合物は、 そのまま使用してもよいが、 操作の簡 便性や処理効率等の点から、 溶媒に溶解したテトラゾリゥム化合物溶液 として使用することが好ましい。 前記溶液の濃度は、 テトラゾリゥム化 合物の種類 （例えば、 分子量等） 等により適宜決定でき、 例えば、 0. 01〜： L 20 mm o 1 ZLの範囲であり、 好ましくは 0. ：!〜 50 mm o l /Lの範囲、 より好ましくは 0. 2〜 20 mm o 1 ZLの範囲であ る。 前記溶媒としては、 例えば、 蒸留水、 生理食塩水、 緩衝液等が使用 でき、 前記緩衝液としては、 例えば、 前述の緩衝液等が使用できる。 な お、 前記テトラゾリゥム化合物は、 一種類でもよいし、 二種類以上を併 用してもよい。
前記テトラゾリゥム化合物による処理条件は、 特に制限されないが、 例えば、 温度 4〜50" の範囲、 処理時間 20秒〜 60分の範囲であり 、 好ましくは、 温度 15〜40での範囲、 処理時間 20秒〜 20分の範 囲であり、 より好ましくは、 温度 25〜37 の範囲、 処理時間 30秒 〜 6分の範囲である。
また、 このテトラゾリゥム化合物処理は、 界面活性剤存在下において 行うことが好ましい。 これによつて、 さらに Hbの変性を促進できるか らである。 このため、 操作の簡便性等から前記試料の溶血時に予めテト ラゾリゥム化合物を添加しておいてもよい。
前記界面活性剤としては、 例えば、 ポリオキシエチレンエーテル、 ポ リォキシエチレンフエノールエーテル、 ポリォキシエチレンソルビ夕ン アルキルエステル、 ポリオキシエチレンアルキルエーテル等が使用でき る。 このポリオキシエチレンエーテル等が好ましい。 このポリオキシェ チレンエーテル [CLHM—0— (CH2CH20) NH] は、 ポリオキシ エチレン鎖と炭化水素鎖とがエーテル結合しており、 前記炭化水素鎖と しては、 例えば、 アルキル基、 アルキルフエニル基等があげられる。 前 記ポリオキシエチレン鎖の重量平均重合度 （N) は 8〜23の範囲であ り、 他方の炭化水素鎖の炭素数 （L) は 8〜 1 8の範囲であることが好 ましく、 より好ましくは前記重量平均重合度 （N) が 8〜 1 5の範囲で あり、 炭化水素鎖の炭素数 （L) が 8〜 1 6の範囲であり、 特に好まし くは前記重量平均重合度 （N) が 8〜 1 0の範囲であり、 炭化水素鎖の 炭素数 （L) が 8〜 14の範囲である。 また、 前記炭化水素鎖は、 例え ば、 直鎖でもよく、 分岐鎖を有していてもよい。 前記ポリオキシェチレ ンエーテルの具体例としては、 例えば、 ポリオキシエチレン一 p— t— ォクチルフエ二ルエーテル、 ポリエチレングリコール （ 1 0) ラウリル エーテル、 ポリエチレングリコール （9) ラウリルエーテル等があげら れる。
より具体的には、 例えば、 ポリオキシエチレン- p-t-ォクチルフエ二 ルエーテルである市販の T r i t o n系界面活性剤等、 ポリオキシェチ レンソルビタンアルキルエステルである市販の Twe e n系界面活性剤 等、 ポリオキシエチレンアルキルエーテルである市販の B r i j系界面 活性剤等が使用できる。 この他に、 例えば、 ポリオキシエチレン （ 1 0 ) ラウリルエーテル、 商品名 N i k k o l B L - 9 EX (ポリオキシ エチレンの重量平均重合度 Nが 9 ：和光純薬工業社製） 等のようなポリ ォキシエチレン （9) ラウリルエーテル、 商品名 T e r g i t o 1 N P X (ポリォキシエチレンの重量平均重合度 Nが約 1 0. 5 ： ナカライ テスク社製） および商品名 T e r g i t o 1 NP— 40 (ポリオキシ エチレンの重量平均重合度 Nが 2 0 ： ナカライテスク社製） 等のような ポリオキシエチレンォクチルフエ二ルエーテル等も使用できる。 なお、 これらの界面活性剤は、 溶血用の界面活性剤としても使用することがで さる。
界面活性剤の添加量は、 特に制限されないが、 例えば、 前記溶血試料 中の血球濃度が、 0. 2〜 1体積％の場合、 濃度 0. 05〜50mmo 1 ZLの範囲になるように添加することが好ましく、 より好ましくは 0 . 2〜3 Ommo 1 ZLの範囲、 特に好ましくは 0. 3〜： L 0 mm o 1 ZLの範囲である。 具体的に、 前記界面活性剤が商品名 T r i t o nX 一 100の場合、 濃度 2〜 10 Ommo 1 Lの範囲になるように 添加することが好ましく、 より好ましくは 1〜3 Ommo 1ZLの範囲 、 特に好ましくは 2〜 2 Ommo 1 の範囲である。 また、 商品名 B r i j 35の場合、 濃度 0. 1〜 50 mm o 1ノ Lの範囲になるように 添加することが好ましく、 より好ましくは 0. 5〜20mmo lZLの 範囲、 特に好ましくは 1〜 10 mmo 1 ZLの範囲である。
また、 前記界面活性剤は、 前記テトラゾリゥム化合物 0. 5〜5mm o 1に対して、 例えば、 0. 1〜 70 mmo 1の範囲になるように添加 してもよく、 好ましくは 0. 3〜50mmo lの範囲、 より好ましくは 0. 4〜 2 Ommo 1の範囲である。 具体的に、 前記界面活性剤が商品 名 T r i t onX— 100の場合、 テトラゾリゥム化合物 1 mmo 1に 対して、 0. 2〜 15mmo 1の範囲になるように添加することが好ま しく、 より好ましくは 0. 5〜 10mmo lの範囲、 特に好ましくは 0 . 7〜 5mmo 1の範囲である。 また、 また、 商品名 B r i j 35の場 合、 テトラゾリゥム化合物 1 mmo 1に対して、 0. 1〜： L 0 mmo 1 の範囲になるように添加することが好ましく、 より好ましくは 0. 2〜 8 mmo 1の範囲、 特に好ましくは 0. 3〜4mmo 1の範囲である。 なお、 界面活性剤は、 試料の溶血時に、 予め Hb変性を促進できる十分 量を添加しておいてもよい。
つぎに、 前記変性 Hbの吸光度測定を行う。 測定波長は、 前述のよう に、 520〜 6 70 nmの範囲が好ましく、 より好ましくは 5 5 0〜6 60 nmの範囲である。 また、 前記波長を主波長として二波長測定を行 う場合、 副波長は、 7 30〜900 nmの範囲が好ましく、 より好まし くは 800〜9 0 O nmの範囲であり、 特に好ましくは 800〜8 50 nmの範囲である。
そして、 測定した変性 Hbの吸光度と、 予め作成した検量線から Hb 量を求め、 前述の測定した糖化 Hb量と Hb量とから、 Hb糖化率を算 出できる。
前記検量線は、 例えば、 既知量の Hbを含む標準試料を、 前述の Hb 測定方法および公知の測定方法によって測定し、 これらの測定値から作 成する。 前記公知の測定方法としては、 測定精度に優れる方法であれば 特に制限されないが、 例えば、 国際標準である H i CN法が好ましい。 なお、 Hb量を求めるための変性 Hbの吸光度測定は、 例えば、 糖化 H b測定のために調製した溶血試料の一部を分取して、 これを H b測定 用試料として行ってもよい。 しかし、 操作を簡便かつ迅速に行えること から、 糖化 Hbの測定工程において行うことが好ましい。 具体的には、 例えば、 前記実施形態 A-1に示す前記糖化 Hbの測定において、 前記 溶血試料にテトラゾリゥム化合物を添加した後、 前記溶血試料にテトラ ゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加した後、 プロテアーゼ処 理を行った後、 または測定用 FAOD処理を行った後等に、 変性 Hbの 吸光度を測定できる。
(実施形態 A- 6)
つぎに、 本発明の H b A 1 cの測定方法について、 全血を試料とした 場合の例をあげて説明する。
まず、 全血試料について、 前記実施形態 A-1と同様にして糖化 Hb 量の測定を行う。 他方、 糖化 Hbのうち Hb A 1 c量が既知である糖化 Hb標準液を準備し、 これについて、 前述と同様にして糖化 Hb量の測 定を行い、 この標準液の測定値 （糖化 Hb量） と HbA l c量との関係 を示す検量線を作成する。 前述のように、 前記糖化 Hbの測定値と Hb A 1 c量とは相関関係にあるため、 この検量線に、 前記全血試料におけ る糖化 Hbの測定値を代入すれば、 前記全血試料中の Hb A 1 c量を求 めることができる。
なお、 検量線の作成において、 前記糖化 Hb量の測定値としては、 最 終的に求めた糖化 Hb量だけでなく、 前記糖化 Hb量の測定において P OD処理よつて得られた反応液の吸光度の値でもよいし、 前記吸光度か ら求めた過酸化水素量を使用してもよい。 つぎに、 本発明の測定キットについて、 測定対象物が糖化 Hbである 例をあげて説明する。
(実施形態 B- 1 )
この実施形態は、 前処理用試薬の分解用 F AODに F AOD— aを、 発色用試薬の測定用 FAODに FAOD— a Sをそれぞれ使用した前記 第 1の測定キットの一例である。
この測定キットは、 分解用 FAODを含有する前処理用試薬、 プロテ ァーゼを含有するプロテア一ゼ試薬、 および測定用 FAOD、 酸化還元 酵素および発色基質を含有する発色用試薬から構成される。
これらの前処理用試薬、 プロテアーゼ試薬、 発色用試薬は、 それぞれ 含有させる成分を水性溶媒に溶解することによって調製できる。
(前処理用試薬）
前処理用試薬は、 最終的な発色反応溶液において、 例えば、 1 0〜 2 0 0倍に希釈され、 好ましくは 2 0〜 1 0 0倍に希釈される。 したがつ て、 前処理用試薬に含まれる FAOD等の濃度は、 例えば、 この希釈倍 率等に応じて適宜決定できる。 また、 測定試料中の測定対象物または分 解する糖化アミノ酸の量に応じて、 前処理用試薬の試料への添加量を変 化することによって、 反応系における FAOD等の量を調整してもよい 0
具体的には、 前処理用試薬における分解用 FAOD濃度は、 例えば、 1 0〜 5000UZLの範囲である。
前記水性溶剤としては、 特に制限されないが、 例えば、 水、 前述のよ うな各種緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。 前記緩衝剤の中でも、 好 ましくは CHE S、 MOP S, TAP S, E P P S、 リン酸、 HE P P SO, POP SO、 ホウ酸であり、 より好ましくは CHE S、 MOP S 、 TAP S, リン酸である。 前記緩衝液の濃度は、 例えば、 5〜2 00 mo 1ノ Lの範囲であり、 好ましくは 2 0〜： 1 50mo l ZLの範囲で ある。 また、 前記緩衝液の pHは、 例えば、 pH8〜 1 0の範囲であり 、 好ましくは 8. 5〜： 1 0. 0の範囲である。
また、 この前処理用試薬は、 分離用 FAODの他に、 さらに以下の成 分を含有してもよい。
界面活性剤を含有する場合、 例えば、 前述のような各種界面活性剤が 使用できるが、 好ましくはポリオキシエチレンアルキルエーテル、 ポリ ォキシエチレンォクチルフエニルエーテルである。 また、 界面活性剤濃 度は、 例えば、 0. 0 3〜20 Ommo 1 ZLの範囲であり、 好ましく は 0. ：!〜 5 Ommo 1 ZLの範囲である。
ゥリカーゼを含有する場合、 その濃度は、 例えば、 1〜 20 0 0 UZ Lの範囲であり、 また、 ピリルビンォキシダーゼを含有する場合、 その 濃度は、 例えば、 1〜 2 00 0 UZLの範囲である。 なお、 これら両者 を含有してもよい。 (プロテア一ゼ試薬）
つぎに、 プロテアーゼ試薬は、 最終的な発色反応溶液において、 例え ば、 1. 1〜 3倍に希釈される。 したがって、 前述の前処理用試薬と同 様に、 各成分の濃度は、 この希釈倍率等に応じて適宜決定でき、 また、 試料中の糖化 Hb量等に応じて、 試料への添加量を変化することにより 、 反応系におけるプロテア一ゼ量を調整してもよい。
プロテア一ゼとしては、 例えば、 前述のものが使用できる。 プロテア ーゼ試薬におけるプロテァーゼ濃度は、 プロテァ一ゼがメタ口プロテア ーゼの場合、 例えば、 0. 5〜 1 0 0 MUZLの範囲であり、 好ましく は 1〜40MUZLの範囲である。
前記水性溶剤としては、 特に制限されないが、 例えば、 水、 前述のよ うな各種緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。 前記緩衝剤の中でも、 好 ましくは ME S、 MOP Sであり、 より好ましくは ME Sである。 前記 緩衝液の濃度は、 例えば、 1〜2 Ommo 1 ZLの範囲であり、 好まし くは l〜5mmo 1 ZLの範囲である。 また、 前記緩衝液の pHは、 例 えば、 pH 5. 0〜7. 0の範囲であり、 好ましくは 5. 5~6. 5の 範囲である。
また、 このプロテア一ゼ試薬は、 前記プロテアーゼの他に、 さらに以 下の成分を含有してもよい。
他の成分としては、 例えば、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナト リウムがあげられる。 この場合、 前記プロテア一ゼ試薬は、 例えば、 テ トラゾリゥム化合物濃度が 0. 1〜 1 Omo 1 ZLの範囲、 アジ化ナト リウム濃度が 0. 0 5〜4mmo 1 Lの範囲であり、 好ましくはテト ラゾリウム化合物濃度が 0. 6〜 5mmo 1 /Lの範囲、 アジ化ナトリ ゥム濃度が 0. 1 5〜 1. 8mo 1ノ Lの範囲である。 また、 テトラゾ リウム化合物 （C) とアジ化ナトリウム （D) との添加割合は、 （モル 比 C : D) は、 C : D= 20 : 3〜2 0 : 1 2の範囲であることが好ま しく、 より好ましくは C : D= 2 0 ： 5〜2 0 ： 1 1の範囲であり、 特 に好ましくは C : D= 20 ： 6〜20 ： 1 0の範囲である。
また、 プロテアーゼとしてメタ口プロテアーゼを使用する場合は、 さ らに C a化合物および N a化合物を含有してもよい。 前記 C a化合物お よび N a化合物としては、 前記水性溶媒中で、 C a 2 +ぉょびN a+にィ オン化するものであれば特に制限されず、 前記 C a化合物としては、 例 えば、 塩化カルシウム （C a C l 2) 、 C a S04、 （CH3COO) 2 C a等が使用でき、 好ましくは C a C l 2、 C a S〇4である。 また、 前 記 N a化合物としては、 例えば、 塩化ナトリウム （N a C l ) 、 CH3 COON a, N a 2 S 04、 NaN03等が使用でき、 好ましくは N a C し Na 2S〇4である。 これらの C a化合物および N a化合物は、 それ ぞれ一種類でもよいし、 二種類以上を併用してもよい。
メタ口プロテアーゼの濃度は、 前述のように、 0. 5〜 1 00MUZ Lの範囲であり、 好ましくは 1〜 40 MUZLの範囲である。
一方、 前記 C a化合物の濃度は、 解離した C a 2 +濃度が 0. l〜5m mo 1 /Lの範囲となるように、 0. 1〜 5 0 mm o 1 /Lの範囲であ る。 また、 N a化合物の濃度は、 解離した N a+濃度が 5〜 1 0 00 m mo 1 ZLの範囲となるように、 5〜： I 00 Ommo 1 ZLの範囲であ り、 好ましくは 1 0〜30 Ommo 1 の範囲である。
(発色用試薬）
つぎに発色用試薬は、 最終的な発色反応溶液において、 例えば、 2〜 20倍に希釈され、 好ましくは 3〜 1 0倍、 より好ましくは 4〜8倍に 希釈される。 この場合も前述と同様に、 各成分の濃度は、 この希釈倍率 等に応じて適宜決定でき、 また、 試料中の糖化 Hbや発生する過酸化水 素の量に応じて、 添加量を変化することにより、 反応系における各成分 の量を調整してもよい。
発色用試薬における測定用 FAODの濃度は、 例えば、 1〜 2 0 0 K UZLの範囲であり、 好ましくは 5〜 1 0 0 KUZLの範囲である。 酸化還元酵素の濃度は、 例えば、 1〜 1 0 0 0 KUZLの範囲であり 、 好ましくは 1 0〜 2 0 0 KU/Lの範囲である。 前記酸化還元酵素と しては、 前述のように P〇Dがあげられる。
前記発色基質の濃度は、 例えば、 0. 0 0 1〜 ： L O Ommo l ZLの 範囲であり、 好ましくは 0. 0 0 5〜 1 Ommo 1 ZLの範囲であり、 より好ましくは 0. 0 2〜 lmmo 1 /Lの範囲である。 前記発色基質 としては、 前述のようなものがあげられる。
前記水性溶剤としては、 特に制限されないが、 例えば、 水、 前述のよ うな各種緩衝剤を含む緩衝液等があげられる。 前記緩衝剤の中でも、 好 ましくは T r i s、 リン酸である。 前記緩衝液の濃度は、 例えば、 2 0 〜 ： L 0 0 0 mm o 1 ZLの範囲であり、 好ましくは 5 0〜 5 0 0 mm o 1 ZLの範囲である。 また、 前記緩衝液の pHは、 例えば、 pH 6〜 9 の範囲であり、 好ましくは 6. 5〜8の範囲である。
(使用方法）
つぎに、 このような測定キットを使用して、 血球中の糖化 Hbを測定 する方法を説明する。
まず、 前記実施形態 A-1と同様にして、 全血から溶血試料を調製し、 この溶血試料に前記前処理用試薬を添加して、 分解用 F AO Dを試料中 の糖化アミノ酸に作用させてこれを分解する。
この分解用 F AOD_ Sの作用によって、 前記溶血試料に含まれる α—アミノ基が糖化された糖化アミノ酸、 および前記糖化 H b分解物の うち α—アミノ基の糖化部分が分解される。 なお、 前記 FAOD— ひ処 理によっては、 糖化アミノ酸の中でも側鎖アミノ基が糖化されたものは 分解されずに残存する。 しかし、 この側鎖が糖化されたアミノ酸の糖化 アミノ酸全体に対する割合および糖化 Hbにおける糖化された側鎖アミ ノ基に対する割合から考えても、 残存する糖化アミノ酸の影響は小さく 、 測定精度は十分に向上するといえる。
前記前処理用試薬の添加量は、 血球濃度が 3 0〜6 0体積％の溶血試 料 3 0 Lに対して、 例えば、 3 0 0〜 3 0 0 0 ^ Lの範囲であり、 好 ましくは 600〜2400 Lの範囲である。 前記前処理用試薬を添加 した前処理反応液は、 血球濃度 1体積％に対して、 前記分解用 FAOD 濃度が 1 0〜 50 00 Umo 1 ZLの範囲となることが好ましい。 また 、 前記処理溶液の pHは、 8〜 1 0の範囲が好ましく、 より好ましくは 8. 5〜： L 0の範囲である。
この前処理は、 前記前処理用試薬を添加してからィンキュペートする ことが好ましく、 その条件は、 例えば、 1 0〜 37 、 0. ：!〜 20分 間であり、 好ましくは 1 5〜37°C、 0. ：!〜 5分間である。
なお、 この前処理用試薬が界面活性剤を含有する場合、 例えば、 前述 のような溶血処理を別途行って溶血試料を調製する必要はない。 つまり 、 前処理用試薬を全血または血球試料に添加することによって、 界面活 性剤による溶血処理と、 分解用 FAODによる糖化アミノ酸の分解処理 の両方を行うことができるのである。
この場合、 前記前処理用試薬を添加した前処理反応液は、 血球濃度 1 体積％に対して、 前記界面活性剤濃度が 0. 0 5〜50mmo l ZLの 範囲となることが好ましく、 より好ましくは 0. 2〜 30mmo l ZL の範囲であり、 特に好ましくは 0. 3〜 1 0mo l /Lの範囲である。 また、 前記前処理用試薬が、 前述のようにゥリカ一ゼ、 ピリルビンォ キシダーゼを含有する場合、 前記処理用試薬は、 血球濃度 1体積％に対 して、 前記ゥリカーゼ濃度が 0. 4〜400 0 U/Lの範囲、 ピリルビ ンォキシダ一ゼ濃度が 0. 4〜4000 UZLの範囲となることが好ま しく、 より好ましくはゥリカーゼ濃度が 3〜 1 500 UZLの範囲、 ビ リルビンォキシダ一ゼ濃度が 1〜 700 UZLの範囲であり、 特に好ま しくはゥリカ一ゼ濃度が 5〜 1000 UZLの範囲、 ピリルビンォキシ ダーゼ濃度が 2〜 700 UZLの範囲である。
次に、 前記前処理反応液に、 プロテアーゼ試薬を添加し、 試料中の糖 化 Hbに分解用 F AO Dを作用させて分解する。
プロテアーゼ試薬の添加量は、 例えば、 血球濃度が 1体積％の前記前 処理反応液 10 Lに対して、 例えば、 50〜 300 Lの範囲であり 、 好ましくは 60〜180 の範囲である。 前記プロテア一ゼ試薬を 添加したプロテアーゼ反応液は、 血球濃度 0. 1体積％に対して、 前記 プロテアーゼ濃度が 100〜 50， 000 KUZLの範囲となることが 好ましく、 より好ましくは 300〜 30 , 000 KUZLの範囲である 。 また、 前記プロテアーゼ反応液の p Hは、 6〜9の範囲が好ましく、 より好ましくは 7〜8. 5の範囲である。
このプロテアーゼ処理は、 前記プロテアーゼ試薬を添加してからイン キュべ一卜することが好ましく、 その条件は、 例えば、 25〜37 、 3〜30分間であり、 好ましくは 25〜37 ：、 3〜 10分間であり、 より好ましくは 30〜 37^、 3〜5分間である。
また、 このプロテアーゼ試薬が前述のようにテトラゾリゥム化合物お よびアジ化ナトリウムを含む場合、 前記プロテアーゼ反応液は、 前記プ 口テアーゼ濃度が 100〜 10, 000 KUZLの範囲であるのに対し て、 例えば、 テトラゾリゥム化合物 0. 1〜 1 Ommo 1 ZLの範囲、 アジ化ナトリウム 0. 08~4. 0 mmo 1 ZLの範囲であり、 好まし くはテトラゾリゥム化合物 0. 6〜 5mmo 1 ZLの範囲、 アジ化ナト リウム 0. 1 5〜1. 8 mmo 1 ZLの範囲である。 具体的に、 テトラ ゾリゥム化合物が WS T— 3の場合、 プロテアーゼ反応液における濃度 が 0. 2〜 6mmo 1 ZLの範囲であることが好ましく、 より好ましく は 0. 6〜4mmo 1 /Lの範囲、 特に好ましくは 0. 7〜 2. 7 mm 0 1 ZLの範囲である。 このようにテトラゾリゥム化合物およびアジ化 ナトリウムを添加することにより、 無添加の場合に比べて、 その感度が 、 約 1. 2〜 3倍の範囲で向上する。
また、 このプロテア一ゼ試薬が、 前述のようにメタ口プロテアーゼを 含有し、 さらに C a化合物および N a化合物を含む場合、 前記プロテア —ゼ反応液は、 前記メタ口プロテアーゼ濃度が ί 0 0〜 1 0, 0 0 0 K UZLの範囲であるのに対して、 例えば、 C a化合物 0. l〜 5 0mm o 1 の範囲、 N a化合物 5〜： 1 0 0 0 mmo 1 /Lの範囲であり、 好ましくは C a化合物 0. 2〜： L 0 mo 1 ZLの範囲、 N a化合物 1 0 〜 5 0 Omo 1 /Lの範囲であり、 より好ましくは C a化合物 0. 2〜 5mo l ZLの範囲、 N a化合物 3 0〜 5 0 0mo l ZLの範囲である 。
次に、 前記プロテア一ゼ反応液に前記発色用試薬を添加し、 測定用 F AODを糖化 Hb分解物に作用させて、 前記式 （ 1 ) の反応により過酸 化水素を生成させ、 これと発色基質とを酸化還元酵素により反応させ、 前記発色基質を酸化により発色させる。
測定用の F AOD— a Sは、 前述のように、 糖化されたひ—アミノ基 および糖化された側鎖アミノ基の両方に作用する。 しかし、 予め、 前処 理用試薬中の分解用 F AO D— αによって処理されているため、 糖化さ れた側鎖アミノ基のみに測定用 F AO D— a Sを作用させることができ る。
発色用試薬の添加量は、 例えば、 前記プロテア一ゼ反応液 1 0 0 L に対して、 例えば、 5〜 1 0 0 Lの範囲であり、 好ましくは 8~ 5 0 Lの範囲であり、 より好ましくは 1 0〜 30 Lの範囲である。 前記 発色用試薬を添加した発色反応溶液は、 測定用 FAOD濃度が 0. 5〜 2 00 KUZLの範囲、 酸化還元酵素濃度が 1〜； L 000 KUZLの範 囲、 発色基質の濃度が 0. 00 1〜 1 00 mmo 1 ZLの範囲であるこ とが好ましく、 より好ましくは測定用 FAOD濃度が 1〜 1 0 0KUZ Lの範囲、 酸化還元酵素濃度が 5〜2 00 KU/Lの範囲、 発色基質の 濃度が 0. 00 5〜 1 Ommo 1 ZLの範囲であり、 より好ましくは測 定用 FAOD濃度が 2〜 1 0 O KUZLの範囲、 酸化還元酵素濃度が 5 〜 20 0 KU/Lの範囲、 発色基質の濃度が 0. 0 1〜 1 mmo 1ノ L の範囲である。 また、 前記発色反応溶液の p Hは、 6〜 9の範囲が好ま しく、 より好ましくは 6. 5〜8の範囲である。
この発色反応は、 前記発色用試薬を添加してから一定時間ィンキュベ ートすることが好ましく、 その条件は、 例えば、 1 5〜 37 ：、 1〜 3 0分間であり、 好ましくは 2 5〜 3 7 、 3〜 1 0分間であり、 より好 ましくは 3 0〜37t：、 3〜5分間である。
つぎに、 発色基質の発色を測定する。 これは、 例えば、 発色反応溶液 の発色程度 （吸光度） を分光光度計で測定すればよく、 この吸光度から 、 過酸化水素の量を決定する。 そして、 例えば、 予め準備した過酸化水 素量と糖化 Hb量との相関関係を表わす検量線と、 測定した過酸化水素 量とを用いて、 試料中の糖化 H b量を求めることができる。
なお、 前記本発明の糖化タンパク質はじめに添加した分解用 FAOD — αによって生成した過酸化水素は、 血液試料 （溶血試料） 中にはじめ から存在するカタラーゼによって消失するため、 FAOD— a Sにより 生成した測定対象物由来の過酸化水素の測定には影響を及ぼすことはな い。 しかし、 十分に前記過酸化水素を消去するために、 前処理用試薬に 、 さらにカタラーゼを含有させてもよい。 このように前記力夕ラーゼに より過酸化水素を消去する場合、 後に添加する発色用試薬中の測定用 F AOD- a S処理によって生成する過酸化水素までもが前記力タラ一ゼ により消去されることを防ぐために、 発色用試薬中の PODおよび発色 基質を過剰量含有させることが好ましい。
この場合、 前処理用試薬における力タラ一ゼの濃度は、 例えば、 5〜 300 UZLの範囲であり、 好ましくは 10〜100U/Lの範囲であ り、 より好ましくは 10〜70UZLの範囲である。 また、 前記前処理 反応液における力夕ラーゼ濃度は、 例えば、 1. 5〜50UZLの範囲 であり、 好ましくは 1. 5〜30U/Lの範囲であり、 より好ましくは 1. 5〜15UZLの範囲であり、 前記発色反応溶液におけるカタラー ゼ濃度は、 例えば、 1〜 50 UZLの範囲であり、 好ましくは 1〜30 UZLの範囲であり、 より好ましくは 1〜10UZLの範囲である。 また、 発色用試薬における P OD濃度は、 例えば、 5〜 1000 KU ZLの範囲であり、 好ましくは 10〜200 KUZLの範囲であり、 よ り好ましくは 20〜200 KUZLの範囲であり、 発色反応溶液におけ る PODの濃度は、 例えば、 3〜300 KUZLの範囲であり、 好まし くは 5〜200 KUZLの範囲であり、 より好ましくは 10〜100K UZLの範囲である。
また発色反応溶液におけるカタラーゼ （E) と POD (F) の割合 （ 活性比 E ： F) は、 例えば、 E : F= 1 : 2〜1 : 40の範囲であり、 好ましくは 1 ： 3〜1 ： 20の範囲であり、 より好ましくは 1 ： 4〜1 ： 10の範囲である。
また、 発色用試薬における発色基質濃度は、 例えば、 0. 0 1〜20 Omo 1 ZLの範囲であり、 好ましくは 0. 02〜20mo l ZLの範 囲であり、 より好ましくは 0. 04〜5mo 1 ZLの範囲であり、 発色 反応溶液における発色基質の濃度は、 例えば、 0. 001〜100mm o 1 /Lの範囲であり、 好ましくは 0. 005〜1 Ommo 1 ZLの範 囲であり、 より好ましくは 0. 01〜 1 mmo 1 の範囲である。
この測定キットを用いた測定において、 各試薬の添加は、 前記順序に は限定されず、 また、 同時に添加してよい試薬もある。 具体的には、 試 料に、 例えば、 前処理用試薬を添加した後、 プロテアーゼ試薬と発色用 試薬とを同時に添加してもよいし、 前処理用試薬とプロテア一ゼ試薬と を同時に添加した後に、 発色用試薬を添加してもよい。 また、 試料に、 例えば、 プロテア一ゼ試薬を添加した後、 前処理用試薬を添加し、 それ から発色用試薬を添加してもよい。
なお、 本発明の測定キットを用いれば、 HbA 1 c量を迅速かつ簡便 に、 精度よく測定することもできる。 これは本発明の測定キットを用い て測定した糖化 Hb量は、 HbA 1 cと高い相関関係にあるからである 。 具体的には、 本発明の測定キットにより測定した糖化 Hb量と HbA 1 c量との相関関係から検量線を作成し、 前記測定キットにより試料中 の糖化 Hb量を測定して、 この測定値を前記検量線に代入すれば H b A 1 c量を求めることができる。
(実施形態 B- 2)
この実施形態は、 前処理用試薬の分解用 F AODと、 発色用試薬の測 定用 F AO Dとに、 同じ F AO Dを用いた第 2の測定キットの一例であ る。 FAODとしては、 特に制限されず、 例えば、 FAOD— ひ、 F A OD— S、 F AOD— a Sのいずれを用いてもよい。 なお、 本実施形態 の測定キットは、 特に示さない限り前記実施形態 B-1と同様の構成で あり、 また、 同様にして糖化 Hbの測定に使用できる。
FAODは、 前述のように糖化タンパク質よりも糖化アミノ酸に作用 し易いため、 前記分解用 FAODによって、 糖化アミノ酸が分解される 。 しかし、 前記実施形態 B-lと異なり、 分解用 F AODと測定用 F A ODとに、 同じ F AODを使用すると、 以下のような問題が生じる。 つ まり、 前処理反応液に、 分解用 FAODが残存している状態でプロテア ーゼ試薬を加え、 前記糖化 Hbを分解すると、 残存する FAODと糖化 Hb分解物の糖化部分とが反応してしまい、 正確な測定ができないとい う問題が起こるのである。 したがって、 同じ FAOD使用する場合は、 プロテアーゼ試薬のプロテア一ゼによって、 糖化 Hbを分解し、 かつ、 前記前処理反応液に残存する分解用 FAODを失活させて、 前記糖化 H b分解物との反応を防止する必要がある。 このために、 前処理用試薬の 分解用 FAODを速やかに失活させ、 かつ、 糖化 Hbを分解できるだけ のプロテアーゼをプロテアーゼ試薬に含有させる必要がある。
前記プロテアーゼの種類や含有量は、 特に制限されないが、 例えば、 使用する FAODの種類や量、 プロテアーゼの FAODに対する基質特 異性、 糖化 Hb量等や、 反応溶液への添加による希釈割合によつて、 適 宜決定することが好ましい。 このような FAODとプロテア一ゼの組み 合わせとしては、 例えば、 商品名 FOD (旭化成社製） と商品名トヨチ ーム （東洋紡社製） 、 前記ギペレラ属由来 FAODと商品名プロテナー ゼ K (ロシュ社製） のプロテアーゼ等があげられる。
具体的には、 プロテアーゼ反応液におけるプロテアーゼ濃度が、 前記 分解用 F AOD 1 00 UZLに対して、 例えば、 1〜： L 00 0, 0 00 KUZLの範囲になるように前記プロテアーゼ試薬を添加することが好 ましく、 より好ましくはプロテアーゼ濃度 1 0〜300, 0 0 0 KU/ Lの範囲であり、 特に好ましくは 1 0 0〜 1 00, 000 KUZLの範 囲である。 具体的に、 プロテアーゼとしてトリプシンを使用する場合は 、 例えば、 前記プロテアーゼ反応液中のトリプシン濃度 1 0 00〜 30 , 00 0 KU/L、 血球濃度 0. 2〜 5体積％、 分解用 FAOD濃度 1 0〜 1 0 O UZLとなるように、 前記プロテア一ゼ試薬を添加すること が好ましい。 また、 反応条件としては、 例えば、 温度 2 0〜 50 、 時 間 1 0分〜 20時間、 pH6〜9である。
また、 本実施形態においては、 発色用試薬中の測定用 FAODまでも が、 前記プロテア一ゼによって失活するおそれがあるため、 前記測定用 F AO Dを十分量添加する必要がある。
具体的には、 測定用 F AOD処理の反応溶液における測定用 F AOD 濃度が、 プロテア一ゼ 1 0， 0 00 KUZLに対して、 例えば、 1 0〜 1 00 0, 00 0 UZLの範囲になるように、 前記発色用試薬を添加す ることが好ましく、 より好ましくは測定用 FAOD濃度 1 00〜20 0 ， 00 0 UZLの範囲、 特に好ましくは測定用 FAOD濃度 500〜 5 0, 0 0 0 UZLの範囲となるように前記発色用試薬を添加することが 好ましい。
具体的な処理条件としては、 例えば、 反応液中の測定用 FAOD濃度 50 0〜2 0， 00 0 UZL、 反応液中のプロテア一ゼ濃度 1 00〜 3 0, 0 0 0 KUZL、 反応液中の血球濃度 0. 0 1〜：！体積％となるよ うに、 前記発色用試薬を添加することが好ましい。 また、 反応条件とし ては、 例えば、 温度 1 5〜40 、 時間 1分〜 1時間、 pH 6〜9の範 囲である。
(実施形態 B- 3)
この実施形態は、 前処理用試薬の分解用 FAODと、 発色用試薬の測 定用 FAODに FAOD—ひ Sとに、 同じ F A 0 Dを用いた第 3の測定 キットの一例である。 但し、 この実施形態は、 前記実施形態 B-2とは 異なり、 前処理用試薬の分解用 FAODを、 プロテア一ゼによって必ず しも失活させる必要がない。 酵素には基質特異性があるため、 プロテア ーゼと F AO Dとの組み合わせによっては、 F AO Dをプロテアーゼで 失活させ難い場合がある。 このような場合に本実施形態の測定キッ卜が 有効になる。 なお、 前処理用試薬中の分解用 F AODが糖化 Hb分解物 と反応すると、 測定精度を向上できないため、 以下に示すように、 前処 理用試薬と発色用試薬とにおける FAODの添加割合を調整することが 重要となる。
前記 FAODとしては、 特に制限されず、 例えば、 FAOD—ひ、 F AOD— S、 F AOD _ a Sのいずれを用いてもよい。 また、 本実施形 態の測定キットは、 特に示さない限り前記実施形態 B-1と同様の構成 であり、 また、 同様にして糖化 Hbの測定に使用できる。
このような実施形態に該当する FA〇Dとプロテアーゼの組み合わせ としては、 例えば、 商品名 FOD (旭化成社製） およびギペレラ属由来 FAOD (アークレイ社製、 特開平— 1 546 7 2号公報） と、 商品名 トリプシン （シグマ社製） および商品名プロティナーゼ K (和光純薬ェ 業社製） 等があげられる。
前記分解用 FAODは、 その活性が残存しても、 プロテア一ゼ処理の 間に糖化 Hb分解物に作用しない範囲で添加する必要があり、 かつ、 糖 化アミノ酸に作用しやすく、 糖化タンパク質に作用し難いという性質を 利用するため、 糖化アミノ酸のみに作用する程度の添加量であることが 望ましい。
具体的には、 前処理用試薬における分解用 FAOD濃度は、 例えば、 1 0〜20， 00 0 UZLの範囲であり、 好ましくは 2 0〜： I 0, 0 0 0 U/Lの範囲であり、 より好ましくは 1 0 0〜 5000 UZLの範囲 である。 発色用試薬における測定用 FAOD濃度は 0. 5〜 200 KU ZLの範囲であり、 好ましくは 1〜 1 00 KUZLの範囲であり、 より 好ましくは 2〜： L 00 KUZLの範囲である。 そして、 前記前処理試薬は、 前処理反応液において、 例えば、 分解用
FAOD濃度 1 0〜5000 UZL、 血球濃度 0. 2〜20体積％とな るように添加することが好ましい。
この測定キットを使用する場合、 分解用 FAODを含有する前処理用 試薬による処理は、 FAODが糖化アミノ酸に作用しやすく糖化タンパ ク質に作用し難いという性質を利用するため、 例えば、 糖化アミノ酸の みに作用する程度の反応時間であることが好ましい。 具体的には、 反応 温度 20〜3 7で、 反応時間 1分〜 60分であることが好ましく、 より 好ましくは反応温度 2 5〜3 7 、 反応時間 2分〜 30時間であり、 特 に好ましくは反応温度 30〜 3 7 、 反応時間 3分〜 1 0時間である。 本実施形態においては、 発色反応溶液における分解用 FA〇D (G) と測定用 FAOD (H) との割合 （活性比 G ： H) が、 例えば、 G ： H = 1 ： 3〜 1 ： 1 00の範囲となるように、 前記前処理用試薬および発 色用試薬を添加することが好ましく、 より好ましくは G ： Hが 1 ： 5〜 1 : 50の範囲であり、 特に好ましくは G ： Hが 1 ： 1 0〜 1 ： 40の 範囲である。 このように設定すれば、 前記実施形態 2と異なり前記分解 用 FAODはプロテアーゼ反応溶液中に残存するが、 この残存した F A ODの反応速度は非常に遅いため、 プロテアーゼ処理工程において、 測 定に影響を与える程度に、 生成した糖化 Hb分解物に残存 FAODが作 用することはないからである。
(実施形態 B-4)
この実施形態は、 発色用試薬の発色基質として DA— 64を用いた例 である。 なお、 本実施形態の測定キットは、 特に示さない限りは、 前記 実施形態 B-1と同様の構成であり、 また、 同様にして糖化 Hbの測定 に使用できる。 プロテアーゼ試薬が、 前述のように測定感度の向上のためにテトラゾ リゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを含有し、 発色用試薬が発色基質 として DA— 64を含有する場合、 発色反応溶液中で、 前記テトラゾリ ゥム化合物、 アジ化ナトリウムおよび D A— 64が共存することによつ て、 前述のような D A— 64の誤発色が生じてしまう。 したがって、 こ の誤発色を防止するためには、 以下の組成とすることが好ましい。
前処理用試薬、 プロテアーゼ試薬および発色用試薬のうち少なくとも いずれかが、 界面活性剤を含有することが好ましい。 前記界面活性剤と しては、 例えば、 前述のような界面活性剤が使用できる。
前処理用試薬に含有させる場合、 その濃度は、 0. 03〜 200 mm o 1 ZLの範囲であり、 好ましくは 0. 1〜50 mmo 1 ZLの範囲で ある。 プロテアーゼ試薬に含有させる場合、 その濃度は、 0. 01〜5 0 mm 0 1 ZLの範囲であり、 好ましくは 0. 05〜20 mm o 1 /L の範囲である。 発色用試薬に含有させる場合、 その濃度は、 0. 06〜 30 m o 1 /Lの範囲であり、 好ましくは 0. l S Omo lZLの範 囲である。
そして、 発色反応溶液における各成分が以下の濃度範囲となるように 、 測定キットの各試薬を添加すればよい。 前記発色反応溶液において、 例えば、 D A— 64 0. 001〜： L 0 Ommo 1 ZL、 界面活性剤 0 . 002〜 50 mmo 1 ZL、 テトラゾリゥム化合物 0. 1〜： L 0 mm o lZL、 アジ化ナトリウム 0. 08〜4mmo 1 ZLの範囲でありこ とが好ましく、 より好ましくは、 DA— 64 0. 005〜10mmo 1 _ L、 界面活性剤 005〜2 Ommo 1 ZL、 テトラゾリゥム化 合物 0. 6〜5mmo l/L、 アジ化ナトリウム 0. 1 5〜1. 8 mm o 1 ZLの範囲であり、 特に好ましくは DA— 64 0. 01〜 1 mm o 1 / L、 界面活性剤 02〜 1 Ommo 1 ZL、 テトラゾリゥム化 合物 0. 7〜2. 7 mmo 1 L, アジ化ナトリウム 0. 2〜： L . 5m mo 1 /Lの範囲である。
また、 この発色反応溶液の p Hは、 6. 0〜9. 0の範囲が好ましく 、 より好ましくは 6. 5〜8. 5の範囲、 特に好ましくは 7. 0〜8. 0の範囲である。
前記0八— 64は、 酸化還元反応により発色するため、 この反応液に ついて、 例えば、 検出波長 650〜 7 50 nmの範囲における吸光度 （ 発色程度） を分光光度計で測定すれば、 過酸化水素の量を測定できる。 実施例
(実施例 1)
患者から全血試料を採取し （患者数 1 63名） 、 赤血球を自然沈降さ せて回収した。 そして、 この沈降した赤血球画分 1 0 Lに、 下記前処 理用試薬 60 0 Lを添加して溶血試料を調整した （n= 1 63 ) 。 な お、 この試料は、 赤血球を自然沈降させた画分を使用するため、 血漿も 含有している。
(前処理用試薬： pH 9. 4)
CHAP S 50mmol/L 界面活性剤 （商品名 NIKK0L-BL9EX、 ニツコ -ケミカル社製） 9g/L
FAOD (商品名 FA0X、 キッコ -マン社製） 1KU/L 次に、 得られた溶血試料 20 Lと下記プロテアーゼ試薬 76 Lを 混合して、 3 7でで 5分間インキュベートした。 続いて、 さらに下記発 色試薬 1 9 を添加して 37でで 3分間インキュベートし、 この際の 波長 7 5 1 nmおよび波長 5 7 1 n mにおける吸光度を測定した。 吸光 度の測定には、 自動分析装置 （商品名 J CA— BM8、 日本電子社製） を使用した。
(プロテアーゼ試薬： pH 5. 5)
テトラ リゥム化合物 （商品名 WST- 3、 同仁化学社製） 2mmol/L
N a N3 0.6mmol/L
N a C 1 lOOmmol/L
C a C 1 2 2mmol/L
中性プロテアーゼ （Γクレイ社製） 4MU/L
M E S lmmol/L
(発色試薬： pH 7. 0)
商品名 DA- 64 (和光純薬工業社製） 80 mol/L
F AOD (アークレイ株式会社社製） 36KU/L
Tris-HCl 380匪 ol/L
N a N, 0.5mmol/L そして、 予め作成した Hb濃度 （gZL) または HbA l c濃度 （g /L) と、 吸光度との関係を示す各検量線に、 測定したそれぞれの吸光 度を代入して H b A 1 c濃度および Hb濃度を求め、 下記式から HbA 1 c %を算出した。 なお、 Hb濃度は波長 7 5 1 nmの吸光度から、 H b A 1 c濃度は波長 57 1 nmの吸光度から求めることができる。
HbA l c (%) = (HbA 1 c濃度/ Hb濃度） X I 00 なお、 前記検量線は、 以下に示す方法により作成した。 まず、 Hb濃 度が既知である種々濃度の標準液について、 HbA l c測定装置 （商品 名 HA— 8 1 60 : アークレイ社製） を用いた H P L C法により H b A 1 c濃度と Hb濃度とを測定した。 一方、 前記各標準液について、 前記 実施例と同様の測定方法により、 Hb濃度および HbA 1 c濃度に相当 する吸光度の測定を行った。 そして、 前記自動測定器による測定値と前 記吸光度から一次回帰式を作成し、 これを検量線とした。
また、 対照例としては、 前記実施例 1において調製した溶血試料 （n = 1 6 3) を試料とし、 前記 HPL C法によって測定した値を使用した 以上の結果を図 1に示す。 同図は、 酵素法により測定した実施例 1の HbA l c (%) と、 H P L C法による対照例の H b A 1 c ( ) との 関係を示すグラフである。 同図において、 実施例の相関式は、 「y= l . 03 1 X - 0. 0 9」 、 相関係数は 「0. 98 1」 であった。
このように、 本発明の実施例によれば、 対照例の値と非常に近い値が 得られ、 その相関係数 （0. 9 8 1) も非常に高いことから、 優れた精 度で糖化 H を測定できることがわかった。 産業上の利用の可能性
以上のように、 本発明の糖化タンパク質の測定方法および測定キット は、 共存する糖化アミノ酸の影響を排除するため、 測定精度に優れる。 このため、 本発明を、 例えば、 赤血球中の糖化 Hb、 HbA l cの測定 に適用すれば、 従来よりも信頼性の高い測定値が得られるため、 糖化 H bや Hb A 1 cの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上 する。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 試料中の糖化タンパク質に、 フルク トシルアミノ酸ォキシダ一ゼ を作用させて、 その酸化還元反応を測定することにより糖化タンパク質 の量を測定する方法であって、 前記試料中に糖化タンパク質とは別に存 在する糖化アミノ酸を除去することを目的として、 前記酸化還元反応に 先立ち、 前記糖化アミノ酸にフルク トシルアミノ酸ォキシダーゼを作用 させて分解し、 テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムの存在下 で、 前記酸化還元反応を行う糖化タンパク質の測定方法。
2 . 糖化タンパク質が、 糖化ヘモグロビンである請求の範囲 1記載の 測定方法。
3 . 糖化アミノ酸にフルク トシルアミノ酸ォキシダ一ゼを作用させる 前または作用させた後に、 糖化タンパク質をプロテアーゼで分解し、 こ の分解物に、 前記糖化タンパク質に作用させるフルクトシルアミノ酸ォ キシダーゼを作用させて前記酸化還元反応を行う請求の範囲 1記載の測 定方法。
4 . 前記酸化還元反応の測定が、 糖化タンパク質にフルク トシルアミ ノ酸ォキシダ一ゼを作用させて発生した過酸化水素と、 発色基質である N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'二ル）- 4, 4， -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウムとを酸化 還元酵素により反応させ、 前記発色基質の発色量を測定することによつ て、 過酸化水素量を決定する過酸化水素量の測定であり、 前記発色基質 を界面活性剤存在下で反応溶液に添加し、 前記反応溶液におけるテトラ ゾリゥム化合物の濃度を 0 . 5〜8 mm o 1 Z Lの範囲、 アジ化ナトリ ゥムの濃度を 0 . 0 8〜 0 . 8 mm o 1 Z Lの範囲および界面活性剤濃 度を 0 . 3〜 1 O mm o 1 Z Lの範囲とし、 かつ前記反応溶液の p Hを 7 . 0〜 8 . 5とする請求の範囲 1記載の測定方法。
5 . 糖化アミノ酸に作用させるフルク トシルアミノ酸ォキシダーゼが 、 糖化されたひ—ァミノ基に特異的に作用し、 糖化タンパク質に作用さ せるフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼが、 糖化された α—ァミノ基お よびアミノ酸残基の糖化された側鎖アミノ基に特異的に作用する請求の 範囲 1記載の測定方法。
6 . テドラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムとを含む溶液をェ 一ジングした後に、 試料に添加する請求の範囲 1記載の測定方法。
7 . テトラゾリゥム化合物が、 2- (4-ョ-ドフエニル） -3- (2，4-シ'ニトロフエニル） -5- (2， 4-シ'スルフイト'フ Iニル） -2Η-テトラ'ノ'リウム塩である請求の範囲 1記載の測定方法
8 . 糖化へモグロビン量とヘモグロビン量とからヘモグロビン糖化率 を求める測定方法であって、 請求の範囲 1記載の糖化タンパク質の測定 方法により試料中の糖化ヘモグロビン量を測定し、 他方、 前記試料中の ヘモグロビン量を測定し、 前記糖化ヘモグロビン量と前記ヘモグロビン 量とからヘモグロビン糖化率を求めるヘモグロビン糖化率の測定方法。
9 . 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定に使用する測定キッ 卜であって、 フルク トシルアミノ酸ォキシダーゼを含有する試料の前処 理用試薬と、 フルク トシルアミノ酸ォキシダーゼ、 酸化還元酵素および 発色基質を含有する発色用試薬とを含む糖化タンパク質の測定キット。
1 0. 糖化タンパク質が、 糖化ヘモグロビンである請求の範囲 9記載 の測定キッ卜。
1 1. 前処理用試薬のフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼが、 糖化さ れた α—ァミノ基に特異的に作用する酵素であり、 発色用試薬のフルク トシルアミノ酸ォキシダーゼが、 糖化された α—アミノ基およびアミノ 酸残基側鎖の糖化されたァミノ基に特異的に作用する酵素である請求の 範囲 9記載の測定キット。
1 2. さらに、 プロテアーゼを含有するプロテア一ゼ試薬を含む請求 の範囲 9記載の測定キット。
1 3. プロテアーゼが、 メタ口プロテアーゼ、 ブロメライン、 パパイ ン、 トリプシン、 プロティナ一ゼ Κ：、 ズブチリシンおよびアミノぺプチ ダーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテァーゼである 請求の範囲 1 2記載の測定キット。
1 4. プロテア一ゼが、 糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテ ァーゼであって、 メタ口プロテアーゼ、 ブロメライン、 パパイン、 ブタ 滕臓由来トリプシンおよび Bacillus subt i 11 i s由来のプロテアーゼか らなる群から選択された少なくとも一つのプロテア一ゼである請求の範 囲 1 2記載の測定キット。
1 5. プロテアーゼ試薬が、 さらにテトラゾリゥム化合物およびアジ 化ナトリウムを含有する請求の範囲 1 2記載の測定キッ ト。
1 6. プロテアーゼ試薬におけるテトラゾリゥム化合物 （A) とアジ 化ナトリウム （B) との含有割合 （モル比 A ： B) が、 A： B = 2 0 ： 3〜 20 ： 1 2の範囲である請求の範囲 1 5記載の測定キッ ト。
1 7. プロテア一ゼ試薬において、 プロテアーゼがメタ口プロテア一 ゼであって、 さらに C aおよび N aを含有し、 メタ口プロテアーゼ濃度 が 1 00〜40, 000 U/L, 〇 &濃度が0. l〜5 0mmo l /L 、 N a濃度が 5〜： L 00 Ommo 1 ZLである請求の範囲 1 2記載の測 定キッ 卜。
1 8. 発色基質が N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'二ル）- 4， 4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエ ニルァミンナトリウムである請求の範囲 9記載の測定キッ ト。
1 9. 前処理用試薬および発色用試薬の少なくとも一方が、 さらに界 面活性剤を含む請求の範囲 9記載の測定キッ 卜。
2 0. プロテア一ゼ試薬が、 さらに界面活性剤を含む請求の範囲 1 2記 載の測定キッ ト。
2 1. 界面活性剤が、 ポリオキシエチレンエーテル、 ポリオキシェチ レンフエノールエーテル、 ポリォキシエチレンソルビ夕ンアルキルエス テルおよびポリォキシエチレンアルキルエーテルからなる群から選択さ れた少なくとも一つの界面活性剤である請求の範囲 1 9または 2 0記載 の測定キッ ト。
22. 前処理用試薬が、 さらに CHE S、 MOP S, TAP S, E P P S、 リン酸、 HE P P SO、 POP SOおよびホウ酸からなる群から 選択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、 その pHが、 8. 0〜 1 0. 0の範囲である請求の範囲 9記載の測定キット。
2 3. 発色用試薬が、 さらに ME S、 T r i s、 リン酸、 MO P S、 TE S、 HEP E S、 HE P P S Oおよび E P P Sからなる群から選択 された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、 その pHが、 6. 0〜9. 0 の範囲である請求の範囲 9記載の測定キッ ト。
24. プロテアーゼ試薬が、 さらに T r i s、 ME S、 D I P S〇、 TE S、 P〇P SO、 HE P E S、 M〇P S O、 B i s— T r i s、 M OP S, ADA, P I P E S、 A C E Sおよびリン酸からなる群から選 択された少なくとも一つの緩衝剤を含有し、 その p Hが、 5. 0〜7. 0の範囲である請求の範囲 1 2記載の測定キッ ト。
2 5 テトラゾリゥム化合物が、 2- (4-ョ-ト 'フ I二ル）- 3- (2，4-シ'ニトロフ Iニル） - 5-(2,4-シ'スルフイト'フ Iニル） -2H-テトラ' リウム塩である請求の範囲 1 5記載の測定 キット。
26. 前処理用試薬が、 さらにゥリカ一ゼおよびピリルビンォキシダ —ゼの少なくとも一方を含む請求の範囲 9記載の測定キット。
2 7. 発色用試薬が、 さらにアジ化ナトリウムを含む請求の範囲 9記 載の測定キッ卜。
2 8. 前処理用試薬において、 フルク トシルアミノ酸ォキシダ一ゼが 糖化された α—ァミノ基に特異的に作用する酵素であり、 その濃度が 1 0〜 5 0 00 UZLの範囲、 緩衝剤濃度が 5〜 2 0 Omo 1 /Lの範囲 であり、 pHが 8. 0〜 1 0. 0の範囲である請求の範囲 22記載の測 定キッ 卜。
2 9. プロテアーゼ試薬が、 さらに C a、 N aおよび緩衝剤を含有し 、 プロテア一ゼがメタ口プロテア一ゼであって、 前記プロテア一ゼ試薬 におけるメタ口プロテア一ゼの濃度が、 1 00〜 ： 1 0, 000 KUZL の範囲、 テトラゾリゥム化合物濃度が 0. 1〜 1 Ommo 1 ZLの範囲 、 アジ化ナトリウム濃度が 0. 0 8〜4mmo 1 ZLの範囲、 C a濃度 が 0. ：！〜 5 0 mmo 1 ZLの範囲、 N a濃度が 5〜： 1 00 0 mm o 1 ZLの範囲、 緩衝剤濃度が 0. 1〜50 Omo 1 ZLの範囲であり、 p Hが 5. 0〜7. 0の範囲である請求の範囲 1 5記載の測定キッ ト。
30. 発色用試薬において、 フルク トシルアミノ酸ォキシダ一ゼが、 糖化された α—アミノ基および糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に 作用する酵素であり、 酸化還元酵素がペルォキシダーゼ、 発色基質が Ν - (カルホ'キシメチルァミノカルホ'ニル） -4, 4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウムであり、 前 記発色試薬における、 フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼの濃度が 1 0 0〜5 0, 0 00 UZLの範囲、 ペルォキシダーゼ濃度が 0. 1〜40 0 KUZLの範囲、 Ν- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'ニル） -4, 4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フエ ニルァミンナトリウム濃度が 0. 02〜2mmo 1 /Lの範囲、 緩衝剤濃度が 1 0 〜 500 mo 1 /Lの範囲であり、 ρ Hが 6〜 9の範囲である請求の範 囲 2 3記載の測定キッ ト。
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