WO2003063886A1 - Inhibiteur d'adhesion d'helicobacter pylori - Google Patents

Inhibiteur d'adhesion d'helicobacter pylori Download PDF

Info

Publication number
WO2003063886A1
WO2003063886A1 PCT/JP2003/000724 JP0300724W WO03063886A1 WO 2003063886 A1 WO2003063886 A1 WO 2003063886A1 JP 0300724 W JP0300724 W JP 0300724W WO 03063886 A1 WO03063886 A1 WO 03063886A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
pylori
browning reaction
protein
milk
sugar
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/000724
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Shigeru Hiramoto
Yoshiro Morishita
Nobutake Kimura
Yoshikatsu Kodama
Original Assignee
Nisshin Pharma Inc.
Ghen Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nisshin Pharma Inc., Ghen Corporation filed Critical Nisshin Pharma Inc.
Priority to KR1020047010902A priority Critical patent/KR100702885B1/ko
Priority to CN038044358A priority patent/CN1638787B/zh
Priority to EP03701878A priority patent/EP1498134A1/en
Priority to US10/501,892 priority patent/US20050096262A1/en
Priority to JP2003563575A priority patent/JP4474581B2/ja
Priority to CA002474620A priority patent/CA2474620A1/en
Publication of WO2003063886A1 publication Critical patent/WO2003063886A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23G—COCOA; COCOA PRODUCTS, e.g. CHOCOLATE; SUBSTITUTES FOR COCOA OR COCOA PRODUCTS; CONFECTIONERY; CHEWING GUM; ICE-CREAM; PREPARATION THEREOF
    • A23G1/00—Cocoa; Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/30—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor
    • A23G1/32—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds
    • A23G1/42—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins
    • A23G1/426—Cocoa products, e.g. chocolate; Substitutes therefor characterised by the composition containing organic or inorganic compounds containing microorganisms or enzymes; containing paramedical or dietetical agents, e.g. vitamins containing vitamins, antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A23C9/13—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/152—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations containing additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
    • A23F3/00—Tea; Tea substitutes; Preparations thereof
    • A23F3/16—Tea extraction; Tea extracts; Treating tea extract; Making instant tea
    • A23F3/163—Liquid or semi-liquid tea extract preparations, e.g. gels, liquid extracts in solid capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23F—COFFEE; TEA; THEIR SUBSTITUTES; MANUFACTURE, PREPARATION, OR INFUSION THEREOF
    • A23F5/00—Coffee; Coffee substitutes; Preparations thereof
    • A23F5/24—Extraction of coffee; Coffee extracts; Making instant coffee
    • A23F5/243—Liquid, semi-liquid or non-dried semi-solid coffee extract preparations; Coffee gels; Liquid coffee in solid capsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L23/00—Soups; Sauces; Preparation or treatment thereof
    • A23L23/10—Soup concentrates, e.g. powders or cakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/20—Milk; Whey; Colostrum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/57—Birds; Materials from birds, e.g. eggs, feathers, egg white, egg yolk or endothelium corneum gigeriae galli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/60—Fish, e.g. seahorses; Fish eggs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/48—Fabaceae or Leguminosae (Pea or Legume family); Caesalpiniaceae; Mimosaceae; Papilionaceae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/18—Magnoliophyta (angiosperms)
    • A61K36/88—Liliopsida (monocotyledons)
    • A61K36/899—Poaceae or Gramineae (Grass family), e.g. bamboo, corn or sugar cane
    • A61K36/8998—Hordeum (barley)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/01—Hydrolysed proteins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/02—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by special physical form
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/33—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds containing oxygen
    • A61K8/34—Alcohols
    • A61K8/345—Alcohols containing more than one hydroxy group
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q11/00—Preparations for care of the teeth, of the oral cavity or of dentures; Dentifrices, e.g. toothpastes; Mouth rinses

Definitions

  • the present invention relates to a Helicopacter pylori that can eliminate Helicobacter pylori involved in the development of peptic ulcer from the stomach, and a method for producing the same, and a Helicopacter pylori containing the same.
  • the present invention relates to pharmaceuticals and foods for the prevention or treatment of digestive diseases related to food. Background art
  • Helicobacter pylori is a spiral-shaped gram-negative rod that has several flagella at one end and inhabits the gastric mucosa of humans. This bacterium was reported in 1983 by Australian Marshal 1, BJ and Warren, JR at a high rate in gastric biopsies from patients with gastritis and gastric ulcers. It has been reported one after another that it is a causative agent of duodenal ulcer and is related to diseases such as gastric cancer. Therefore, eradication of Helicobacter pylori is considered to be indispensable for the fundamental treatment of peptic ulcer, and as explained below, antibiotics and gastric acid secretion inhibitors Combination therapy has been widely advocated.
  • Helicobacter pylori When Helicobacter pylori is colonized in the gastric mucosa, it continues to live in the stomach without being sterilized despite its strong immune response to infection (high antibody titer). Therefore, unless it can be completely sterilized by treatment with antibiotics, it will return to the pre-treatment infection status within about one month after discontinuation. Moreover, since the pH in the stomach is kept very low by hydrochloric acid, many antibiotics are inactivated. For these reasons, proton pump inhibitors that strongly suppress gastric acid secretion and a disinfectant (antibiotic) are used in combination for the eradication of Helicopacter pylori.
  • the first step in infection is to adhere to the host cell and establish it by growing there.
  • Bacterial adherence to host cells requires binding of an adhesion factor to a host cell surface receptor.
  • Japanese Patent Laid-Open No. 10-287585 describes an adhesion factor that has not been clarified as to the adhesion mechanism of Helicopacter pylori is urease produced by this bacterium, and the chicken egg yolk antibody against this urease is transferred to the stomach of Helicopacter pylori. It discloses that the ingrowth is remarkably suppressed.
  • Patent No. 3 2 5 5 1 6 1 also discloses that mucin derived from whey obtained by removing milk fat opin casein from milk inhibits helicopter pylori colonization in the digestive tract. doing.
  • the object of the present invention is to effectively inhibit the adhesion of Helicobacter pylori involved in the development of peptic ulcer to the gastric mucous membrane, and to overcome the disadvantages such as side effects associated with the use of conventional antibiotics. It is to provide a highly safe helicopter pylori adhesion inhibitor that does not have.
  • the present inventors have examined various substances that can prevent urease from adhering to the gastric mucosa. As a result, the present inventors have found that the browning reaction product of sugar and protein can effectively prevent adhesion of urease, which is an adhesion factor, to the gastric mucosa, thereby completing the present invention.
  • the present invention relates to a helicopter .pylori adhesion inhibitor comprising a browning reaction product of koji and protein as an active ingredient.
  • protein is any protein that can be taken orally
  • sugar includes any reducing sugar that can be taken orally.
  • the present invention also relates to a method for producing a Helicopacter pylori adhesion inhibitor comprising a step of browning sugar and protein in an aqueous solution.
  • the present invention relates to a method for producing a Helicopacter pylori adhesion inhibitor comprising a step of causing a browning reaction to occur in a food containing sugar and protein in an aqueous solution.
  • the browning reaction occurs at a wavelength of 40% in a 5% aqueous solution of a mixture of sugar and protein.
  • the food is not particularly limited as long as it contains sugar and protein, but preferably raw milk of milk, milk powder (whole milk powder), skim milk powder, whey and condensed milk (condensed milk).
  • the present invention relates to a helicopter .pylori adhesion inhibitor comprising a browning reaction product of sugar and protein and a gastric acid secretion inhibitor.
  • the present invention also relates to a Helicopacter pylori adhesion inhibitor comprising a browning reaction product of sugar and protein and another substance having a sterilizing action against Helicopacter pylori.
  • the present invention relates to a Helicopacter pylori adhesion inhibitor comprising a browning reaction product of sugar and protein, a gastric acid secretion inhibitor and another substance having a sterilizing action against Helicopacter pylori.
  • the “bactericidal action” means actions such as adhesion inhibition, growth suppression or prevention, and sterilization against Helicobacter pylori in vivo and Z or in vitro.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating a disease associated with Helicobacter pylori comprising the above-mentioned Helicopacter pylori adhesion inhibitor. Furthermore, the present invention relates to a food for preventing or ameliorating diseases associated with Helicobacter pylori comprising the above-mentioned Helicobacter pylori adhesion inhibitor. The present invention is described in detail below.
  • the active ingredients of the Helicopactor .pylori adhesion inhibitor of the present invention are sugar and protein
  • the browning reaction product that is, the product of the amino-carbonyl reaction.
  • the browning reaction can be performed by mixing various sugars and various proteins and heating them in an aqueous solution.
  • the protein in the present invention is any protein that can be taken orally, for example, any vegetable protein derived from wheat, barley, rice, corn, soybean, red beans, etc. or animal protein derived from milk, egg, fish, meat. Good, but not limited to these.
  • casein contained in milk -lactoglopurin, hi-lactalbumin, bovine serum albumin, immune globulin, lactoferrin, glutenin contained in wheat, albumin, etc., zein contained in corn, egg Examples include ovalbumin, age-old botransferrin, ovomucoid, ovomucin, and lysozyme, and myosin and actin contained in fish and meat.
  • proteins those purified by conventional methods may be used, or commercially available ones may be used as they are. These proteins may be used alone or in combination of two or more. Alternatively, food materials containing these proteins, for example, raw milk containing milk-derived protein, milk powder, skim milk powder, whey and condensed milk may be used as they are as a protein mixture.
  • reducing sugars such as D-glucose, D-fructose, D-mannose, D-galactose, D-xylose, L-arabinose, D-ribose and lactose can be used for the production of browning reaction products. Is mentioned. These sugars may be used as refined products, but when using skim milk powder or whey, they contain protein as described above, so browning without mixing milk-derived protein separately. A reaction may be performed. .
  • the mass ratio of sugar to protein may be any ratio, but is usually in the range of 1: 100 to 10: 1, and preferably in the range of 1: 9 to 1: 1.
  • the browning reaction product is a food containing sugar and protein, preferably a food containing sugar and protein in the above-mentioned mass ratio, instead of mixing sugar and protein and causing browning reaction in an aqueous solution.
  • a food containing sugar and protein preferably a food containing sugar and protein in the above-mentioned mass ratio, instead of mixing sugar and protein and causing browning reaction in an aqueous solution.
  • raw milk, cow's milk powder, skim milk powder, whey and condensed milk undergo browning reaction by heat treatment in an aqueous solution. You can also get it.
  • Nonfat dry milk contains various milk proteins, mainly casein, and sugars such as lactose.
  • Non-fat dry milk can be obtained by separating and removing fat from raw milk by conventional methods and pulverizing the resulting non-fat milk.
  • Whey removed casein from non-fat dry milk. It contains sugars such as lactose, and
  • the browning reaction is preferably carried out in a neutral aqueous solution or an alkaline aqueous solution.
  • alkaline aqueous solution various alkaline aqueous solutions such as sodium hydroxide, hydroxy hydroxide, sodium hydrogen carbonate (sodium bicarbonate), sodium carbonate, and disodium hydrogen phosphate can be used.
  • the alkali concentration to be added is not particularly limited.
  • sodium hydroxide of 0.05 to 0.5 N can be used.
  • the amount of the aqueous solution may be an amount that can sufficiently suspend a mixture of sugar and protein or a food containing sugar and protein, for example, 1 to 100 times, preferably 5 to 20 times. To do.
  • the browning reaction is carried out until the absorbance power S O .01, preferably 0.1 or more, in a 5% aqueous solution of a mixture of sugar and protein is 40.5 nm.
  • An absorbance of 4 0 5 11 111 of not less than 0.01 means that the browning reaction is in progress.
  • Absorbance is measured, for example, using a microplate reader with 100% of a 5% aqueous solution.
  • the reaction temperature is preferably 100 ° C or higher, particularly preferably 120 ° C or higher, and the reaction time is usually 20 minutes or longer, preferably 30 ° C. Min to 10 hours.
  • the reaction temperature is preferably from room temperature to 100 ° C., particularly preferably 40 to 90 ° C., and the reaction time is usually 1 to 20 hours, preferably 2 to 8 hours.
  • the resulting browning reaction product may be consumed as it is, but unreacted sugar may be removed and desalted using conventional means such as ultrafiltration and ion exchange resin. Les.
  • the browning reaction product may be precipitated by a conventional means used for selective precipitation of proteins, such as isoelectric precipitation, salting out, and organic solvent precipitation.
  • the browning reaction product is preferably dried by conventional means such as freeze-drying or spray-drying in order to facilitate formulation and addition to foods. When the browning reaction is carried out in a neutral aqueous solution, it may be dried as it is, but it is preferable to remove the unreacted sugar by the above-mentioned means and to dry and powder it after desalting.
  • the reaction solution may be neutralized with an acid (inorganic acid and Z or organic acid). Further, it may be dried as it is after neutralization, but it may be dried and powdered after removing unreacted sugar and desalting by the above-mentioned means.
  • an acid inorganic acid and Z or organic acid
  • the browning reaction product of the present invention can preferentially bind to urease, an adhesion factor of Helicobacter pylori, thereby preventing adhesion of the gastric mucosa to the receptor. For this reason, the browning reaction product of the present invention has an excellent sterilizing action against Helicopacter pylori, and is effective in preventing and improving diseases associated with Helicopacter pylori, such as peptic ulcer. Useful.
  • the sugars and proteins used as raw materials are those that can be taken orally, such as those derived from foods or food materials, and the browning reaction is also a reaction that is always occurring during the cooking process of foods.
  • the reaction product is very safe and has no side effects. Therefore, the Helicopacter pylori adhesion inhibitor containing the browning reaction product of the present invention can be used in the prevention and improvement of diseases related to Helicopacter pylori by blending it with pharmaceuticals and foods.
  • the adhesion inhibitor comprising the browning reaction product of the present invention can be produced by any conventional formulation method with the browning reaction product as it is, or appropriately with a carrier or excipient (such as a bulking agent or a binder). If necessary, other additives and drugs such as antacids (sodium hydrogen carbonate, magnesium carbonate, precipitated calcium carbonate, synthetic hydrotalcite, etc.), gastric mucosal protective agent (synthetic aluminum silicate, sucralf) Art, chlorophyllin sodium, etc.) and digestive enzymes (piodiastase, lipase, etc.) may be added.
  • Administration of the adhesion inhibitor of the present invention is carried out orally, and the dosage is usually from 0.1 to 10.0 g (dry matter amount), preferably 0.5 to 5. 0 g.
  • gastric acid secretion inhibitors examples include, but are not limited to, H 2 blockers such as famotidine, nizatidine, oral xanthidine, lutidine, and cimetidine, and proton pump inhibitors such as omeprazole, lansoprazole, and rabebrazole sodium.
  • the dose of the gastric acid secretion inhibitor varies depending on the drug, but is usually 10 to 50 mg, preferably 20 to 3 O mg per day for an adult.
  • the adhesion inhibitor of the present invention can further improve the sterilizing action of Helicopacter pylori by combining with another substance having a sterilizing action against Helicopacter pylori.
  • Such other substances include, for example, various antibiotics, polyphenols, antibodies against Helicobacter pylori, polysaccharides and glycoproteins that can bind to urease, which is an adhesion factor of Helicobacter pylori.
  • the adhesion inhibitor of the present invention may be combined with a gastric disease therapeutic agent such as a bismuth preparation and an anthelmintic agent such as metronizazole.
  • polyphenols examples include catechin, gallocatechin, gallocatechin gallate, epicatechin, epicatechin gallate, epicarocatechin, epica oral techin gallate, free theaflavin, theaflavin monogallate, theafra vingallate, resveratroline, proanthocyanol , Ke ⁇ / cetin, anthocyanins, sulforafuan, and isoflavones.
  • the adhesion inhibitor of the present invention may be a mixture of these polyphenols, or a food material such as tea, cacao, fruit or the like containing these polyphenols or an extract thereof. May be blended.
  • Examples of antibodies against Helicobacter pylori include antibodies against all bacterial cells and antibodies against bacterial surface molecules, but due to ease of acquisition and improved sterilization action, chicken egg antibodies against bacterial surface molecules, especially Helicopactor pylori A chicken egg antibody against urease and flagella involved in adhesion (JP-A-10-28758) is preferred.
  • glycoproteins that can bind to Helicopacter pylori urease include: Examples include mucins derived from the digestive tract of mammals, mucins derived from milk, mucins derived from chicken egg white, etc., and glycoproteins constituting these mucins. Examples of polysaccharides that can bind to the urease include dextran sulfate (Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, Vol. 44, No. 9, pp. 2492-2497, 2000), fucodyne
  • Antibiotics include penicillins, cefems, macrolides, new quinolones, and tetracyclines, with amoxicillin opiclaris mouthmycin being particularly preferred.
  • the dosage of antibiotics varies depending on the drug, but is usually 100-500 Omg, preferably 500-300 Omg per day for adults.
  • the blending amount of the browning reaction product of the present invention into food is usually about 0.5 to 10% by mass, preferably 1.0 to 3.0% by mass.
  • Such foods include various pharmaceutical forms such as fine granules, tablets, granules, capsules, liquid foods, as well as soups, juices, tea drinks, milk drinks, cocoa drinks, Liquid foods such as jelly-like beverages, semi-solid foods such as pudding and yogurt, breads, confectionery, udon candy, cookies, chocolate, candy, rice crackers, etc., sprinkles, butter, jam spreads, etc. A form is mentioned.
  • a food using a food material rich in polyphenols, polysaccharides or sugar proteins having a sterilizing action against Helicobacter pylori is preferred.
  • Specific examples include fruits containing polyphenol, tea, juices using cacao, tea drinks, cocoa drinks, chocolates, milk drinks containing polysaccharides or glycoproteins, and milk fermented drinks.
  • the form for food for specified health use is not particularly limited, but foods such as confectionery, powdered soaps and beverages that can be ingested continuously are preferred.
  • Food for the sick low sodium diet Products, low-calorie foods, low-protein foods, etc.
  • medical foods such as soups, beverages, and liquid foods.
  • foods contain various food additives such as various nutrients, various vitamins, minerals, dietary fiber, polyunsaturated fatty acids, stabilizers such as dispersants and emulsifiers, sweeteners, flavoring ingredients, and flavors. can do.
  • Liquid food may be prepared from the beginning as liquid food, but it can also be prepared in powder or pasty form and dissolved in a predetermined amount of aqueous liquid.
  • Lactose and casein in the amounts shown in the table below were added to 10 ml of 0.2N NaOH aqueous solution in a 50ral Spitz tube, and shaken with a test tube mixer until a uniform suspension was obtained.
  • the browning reaction was carried out by heating in a 50 ° C water bath for 4 hours.
  • 0.2 N HC1 was added until the pH of the reaction solution reached 7.0.
  • the neutralized reaction solution was lyophilized to obtain a brown powder.
  • Lactose (400 mg) and sodium caseinate (600 mg) were added to distilled water (10 ml) in a 50 ml Spitz tube, and dissolved by shaking with a test tube mixer.
  • the browning reaction was performed at 120 ° C for 20 minutes in a high-pressure sterilizer.
  • the reaction solution was then lyophilized to give a brown powder.
  • Example 3 Browning reaction of J3-lactoglobulin and lactose Lactose 40 mg and _latatoglobulin 60 mg were added to 1.0 ml of 0.2N NaOH aqueous solution in a 15 ml pipe tube and dissolved by shaking with a test tube mixer.
  • the browning reaction was performed by heating for 4 hours in a 50 ° C water bath.
  • 0.2N HC1 was added until the pH of the reaction was 7.0.
  • the neutralized reaction solution was desalted by gel filtration using Sephadex G-25 (Amersham-Pharmacia) and then freeze-dried to obtain
  • Lactose (40 mg) and hydrolactalbumine (60 mg) were added to 1.0 ml of a 0.2N NaOH aqueous solution in a 15 ml pipe tube and dissolved by shaking with a test tube mixer.
  • the browning reaction was performed by heating for 4 hours in a 50 ° C water bath. Neutralization and desalting were carried out in the same manner as in Example 3, followed by freeze-drying to obtain a brown powder.
  • Lactose 400 mg and soy protein powder 600 mg were added to 10.0 ml of 0.2N NaOH aqueous solution in a 50-ml pipe, and the suspension was shaken with a test tube mixer and suspended.
  • the browning reaction was carried out by heating in a 40 ° C water bath for 5 hours. 0. 6N HC1 was added until the pH of the reaction solution reached 7.0.
  • the neutralized reaction solution was lyophilized to obtain a brown powder.
  • Lactose 400 mg and wheat alpmine 600 mg were added to 10.0 ml of 0.2N NaOH aqueous solution in a 50 ml Spitz tube, and dissolved by shaking with a test tube mixer.
  • the browning reaction was performed by heating in a 40 ° C water bath for 5 hours.
  • the reaction solution was neutralized in the same manner as in Example 9, and then freeze-dried to obtain a brown powder.
  • Lactose 400 mg and zein 600 mg were added to 10.0 ml of 0.2N NaOH aqueous solution in a 50 ml Spitz tube, and suspended by shaking with a test tube mixer.
  • the browning reaction was performed by heating in a 40 ° C water bath for 5 hours.
  • the reaction solution was neutralized in the same manner as in Example 9, and then freeze-dried to obtain a brown powder.
  • Example 1 Browning reaction of casein and xylose with disodium hydrogen phosphate 0. lmol / L aqueous solution of ninatrium hydrogen phosphate in an Eppendorf tube 1.0 ml 40 mg of xylose and 60 mg of casein were added, and the mixture was shaken with a test tube mixer and suspended. The browning reaction was performed by heating for 2 hours in a heat block at 85 ° C. Sephadex G-25
  • the progress of the browning reaction was measured by absorbance at 405 nm.
  • the browning reaction product prepared in Examples 1 to 13 was dissolved in 1 ml of distilled water. Centrifugation was performed at 10,000 G for 15 minutes, and the supernatant ⁇ ⁇ was injected into a 96-well plate (NUNC immunoplate, order number 442404). Using a microplate reader (Molecular Device Versa Max), the absorbance at 405 nm was measured using the absorbance at 650 nm as the control wavelength. As shown in Table 3, the browning reaction product of the example showed an absorbance of 0.1 or more, and it was confirmed that the browning reaction was sufficiently advanced in all of the examples.
  • Test Example 2 Measurement of H. pylori adhesion inhibitory activity With respect to the browning reaction products of Examples 1 to 13, the inhibitory effect of urease, which is an adhesion factor of Helicobacter pylori, on the gastric mucosa was examined in the in vitro test system as follows.
  • urease which is an adhesion factor of Helicopacter pylori
  • binds specifically to the gastric mucosa mucin and H. pylori is fixed to the host stomach. Therefore, those that inhibit the adhesion between the Helicopacter pylori urease and gastric mucin at a lower concentration have stronger Helicopacter pylori adhesion inhibitory activity.
  • the urease and puta stomach mucin used in this adhesion inhibition test were prepared as follows.
  • Pullet # 130 strain obtained from Department of Infectious Diseases, Tokai University School of Medicine
  • cultivated bull seraphrose culture solution (3.5X10 8 CFU / ml) at 12, OOOxG for 20 minutes
  • purified pellets with purified water And dissolved in a vortex mixer for 60 seconds. Centrifugation was performed again to obtain an extract supernatant containing urease. Purification was performed by the method shown below. Apply the above extract to a DEAE-Sephacel column equilibrated with buffer (20 mM phosphate, pH 6.8, ImM EDTA, ImM 2-mercaptoethanol and 10% PEG 300) and add 0.5 ml / min.
  • the gel was adsorbed at the flow rate of Elution was performed with a concentration gradient from 0 to 0.5M KC1.
  • the urease activity was monitored for each fraction. Fractions with a peak of urease activity were pooled and concentrated. Next, the concentrated solution was applied to a Cefacryl S-300 column equilibrated with a buffer solution (20 mM phosphate, pH 6.8, 150 mM NaCl) and eluted. The urease activity of each fraction was measured, and the peaks of urease activity were pooled and analyzed by SDS-PAGE, confirming that they consisted of urease A (32 kDa) and urease B (60 kDa) proteins. . The urease was aliquoted and stored at ⁇ 80 ° C until use.
  • the porcine purified gastric mucin was converted to piotin according to a conventional method and used for hot cleaning.
  • Phosphate buffered saline containing Tween 20 (pH 7.0) After washing 3 times with 150 ⁇ 1, phosphate buffered saline containing 0.05% Tween 20 in peroxidase-labeled streptavidin (pH 7.0) 50 ⁇ was added and left at room temperature for 1 hour. 0.05% Tween 20-containing phosphate buffered saline ( ⁇ 7.0) After washing 5 times with 150 ⁇ , substrate solution ( ⁇ 4.5) 50 ⁇ 1 containing ortho-diethylenediamine dihydrochloride 3 ⁇ 40 2 In addition to each tool, a peroxidase reaction was performed. After reacting for 5 minutes at room temperature, 2% sulfuric acid was added to stop the enzyme reaction. The absorbance at 490 nm of each tool was measured.
  • Adhesion-inhibiting activity (%) [1-(absorbance of added sample / absorbance of added sample)] X 1 0 0
  • NS Hr / ICR hairless mice highly sensitive to Helicopacter pylori infection as experimental animals (Institute for Animal Breeding, accession number IAR-thigh 1-9701; ATCC # 72024) (Clin. Diagn. Lab. Immunol 5; 578-582, 1998).
  • NSP 3 3 5 strain (1 X 1 0 9 CFU / mouse) was orally ingested into mice and reared for 1 week, then mixed with the browning reaction product of Example 5 or Example 8 browning reaction product in the feed for mice And fed for 10 weeks. The number of test mice was 6 in each group. After 10 weeks, each group of mice was sacrificed, the stomach was removed, the contents were removed, and a suspension was prepared with a homogenizer. The suspension was used as a sample for detecting Helicopacter pylori.
  • Helicopacter pylori is detected by inoculating the suspension into a medium for Helicopacter pylori detection (Poremedia helicopter separation medium, Eiken Chemical)
  • the browning reaction was calculated by setting the group fed with the feed without added product as the control group and the average colony number of the control group as 100.
  • the results obtained are shown in Table 5 below.
  • Table 5 Lycopacter pylori eradication effect From the above results, administration of the browning reaction product of the present invention significantly reduced the number of Helicopacter pylori bacteria in the mouse stomach.
  • mice in which Helicopacter pylori was not detected were also confirmed. From these results, it was revealed that the browning reaction product of the present invention has an excellent sterilizing action against Helicobacter pylori.
  • Test Example 4 Helicopactor 'Pylori eradication in vivo test
  • the browning reaction product of Example 5 (0.25% diet), famotidine (0.11% diet), helicopter 'chicken egg antibody against Pylori urease (0.25% diet), Mucin derived from whey (0.25% mixed diet), sodium caseinate (0.25% mixed diet), catechin (0.25% mixed diet), fucoidan (0.25% mixed diet), omebrazole (0.11% mixed diet) , Clarithromycin (0.1% diet), amoxicillin (0.1% diet), dextran sulfate (0.25% diet), propolis extract (0.25% diet), or supercritical extract probolis (0.25) % Mixed diet) were fed either alone or in combination with browning reaction products to mice infected with Helicobacter pylori. Ten weeks later, helicopter pylori was detected in the stomach of the mouse. As a result, in any single administration, the sterilization rate was improved as compared with the browning reaction product of the present invention alone. These results are shown in Table 6 below.
  • a dry soup was produced with the following composition as follows.
  • a liquid food for medical use (200 mL / pack) was produced with the following composition.
  • browning reaction product maltodextrin, sodium caseinate, emulsifier, milk protein, and a small amount of water are added. Warm to the extent and stir. After suspension, cool to room temperature, add vegetable oil, vitamins, fragrance, stabilizer, and remaining water to obtain a liquid medical food containing browning reaction products.
  • browning reaction product of the present invention 3.6
  • Tablets were obtained by the usual wet granule compression method.
  • Tea drinks green tea drinks and wooman tea drinks were produced as follows by the following composition. ,
  • a cocoa beverage was produced with the following composition.
  • a coffee drink was produced with the following composition.
  • Browning reaction product 2 of the present invention Extract 6 g of ground coffee beans to 100 mL of water at 95 ° C for 1 minute to make a coffee extract. Add 5 times the amount of coffee extract and sugar to the browning reaction product, then stir and suspend. Add the remaining coffee extract and milk to obtain a coffee drink with browning reaction products. Browning reaction product 2 of the present invention
  • Banana milk shake was manufactured with the following composition.
  • Browning reaction product 2 of the present invention add browning reaction product, milk and banana to home mixer and suspend. Finally, add vitamin C to obtain a banana milk drink with browning reaction products. Browning reaction product 2 of the present invention
  • Vitamin C 0.5
  • a sprinkle was produced with the following composition: Browning reaction product of the present invention 40
  • a Helicopacter pylori adhesion inhibitor that has an excellent sterilizing action against Helicopacter pylori, is highly safe, and has no side effects.
  • the fixing inhibitor of the present invention does not cause the problem of resistant bacteria unlike the conventionally used antibiotics and can specifically sterilize Helicobacter pylori in the stomach. Therefore, the Helicopacter pylori adhesion inhibitor of the present invention, and the medicine and food containing the same are useful for the prevention and improvement of diseases related to Helicopacter pylori, such as peptic ulcer.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Birds (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

明 細 書
ヘリコパクター . ピロリ接着阻害剤
技術分野
本発明は、 消化性潰瘍の発生に関与するヘリコパクター . ピロリ（Helicobacter pylori)を胃内から排除しうるへリコパクター ' ピロリ接着阻害剤、 およびその製 造方法、 並ぴにこれを含有するヘリコパクター · ピロリに関連する消化性疾患の 予防または治療のための医薬および食品に関する。 背景技術
へリコパクター . ピロリは、 一端に数本の鞭毛 （flagella) を持つ、 螺旋型を したグラム陰性桿菌で、 ヒ トの胃粘膜に生息する菌である。 この菌は、 1983年ォ ーストラリアの Marshal 1, B. J.と Warren, J. R.によって胃炎、 胃潰瘍患者の胃生検 材料から高率に検出されることが報告され、 それ以降、 疫学的研究から、 胃炎、 胃潰瘍、 十二指腸潰瘍の起因菌であり， さらに胃癌などの疾患と関連があるとの 報告が相次いでなされている。 従って、 現在、 消化性潰瘍の根本的治療にはへリコパクター · ピロリの除菌が 不可欠であると考えられており、 その除菌療法として以下に説明するように抗生 物質と胃酸分泌抑制剤との併用療法が広く提唱されている。
へリコパクター · ピロリがー且胃粘膜に定着すると、 感染に対する免疫応答が 強い（抗体価が高レ、）にもかかわらず、 除菌されず胃内に生息し続ける。 そのため、 抗生物質による治療によって完全に除菌できない限り、 投薬を中止すると約 1ケ 月以内に治療前の感染状態に戻つてしまう。 しかも胃内は塩酸によって p Hが非 常に低く保たれているので、 多くの抗生物質は不活化される。 このような理由で、 へリコパクター . ピロリ の除菌には、 胃酸分泌を強力に抑制するプロトンポンプ インヒビターと除菌薬 （抗生物質） が併用の形で使用されている。 また、 現状で はヘリコパクター . ピロリ の除菌には、 ァモキシシリン、 クラリスロマイシンお よびランソプラゾール等の三剤併用療法が、 日本における標準的な治療法となつ ている。 しかしながら、 抗生物質の長期間投与は、 その副作用に加え、 耐性菌の 増加という非常に重大な問題が危惧される。
除菌を目的とした抗生物質の投与による副作用および耐性菌の増加などの問題 を解決する手段として、 現在、 経口ワクチンによる免疫療法のアプローチが見ら れるが、 実験の際の複雑な条件が障害となって、 新しい予防、 治療法の確立を目 指した研究はほとんど進展していない。 また、 ワクチンはあくまで予防を主体と するものであり、 一旦へリコパクター ' ピロリが感染した患者に対しては、 効果 は望めない。
一般に細菌の感染が成立するためには細菌が宿主細胞に接着し、 そこで増殖す ることによって定着することが感染の第一歩となる。 細菌の宿主細胞への接着に は、 接着因子（adhesin)の宿主細胞表面の受容体 (receptor)への結合が必要である。 特開平 10-287585 は、 へリコパクター . ピロリの接着機構に関して、 それまで解 明されていなかった接着因子が、 この菌が産生するゥレアーゼであり、 このウレ ァーゼに対する鶏卵黄抗体をヘリコパクター · ピロリの胃内増殖を顕著に抑制す ることを開示している。
また、 特許第 3 2 5 5 1 6 1号は、 牛乳から乳脂肪おょぴカゼインを除去して 得られる乳清由来のムチンがヘリコパクター · ピロリの消化管への定着を阻害し うることを開示している。
しかしながら、 へ Vコパクター · ピロリの接着因子であるゥレアーゼが、 胃粘膜 に接着するのを、 種々の糖とタンパク質との褐変反応生成物によつて阻害されう ることは知られていない。 発明の開示
本発明の課題は、 消化性潰瘍の発生に関与するヘリコパクター · ピロリの胃粘 膜への接着を効果的に阻害でき、 しかも従来の抗生物質の使用に伴う副作用ゃ耐 性菌増加等の欠点を持たない安全性の高いヘリコパクター · ピロリ接着阻害剤を 提供することである。
本発明者等は、 ゥレアーゼの胃粘膜への付着を阻止しうる物質を種々検討した 結果、 糖とタンパク質との褐変反応生成物が、 接着因子であるゥレアーゼの胃粘 膜への接着を効果的に阻止しうることを見出し、 本発明を完成させた。
すなわち、 本発明は、 糠とタンパク質との褐変反応生成物を有効成分とするへ リコパクター . ピロリ接着阻害剤に関する。 ここで、 タンパク質は経口摂取しう る任意のタンパク質であり、 糖は経口摂取しうる任意の還元糖を包含する。
本発明はまた、 水溶液中で糖とタンパク質とを褐変反応させる工程を含む、 へ リコパクター · ピロリ接着阻害剤の製造方法に関する。
さらに、 本発明は、 水溶液中で糖とタンパク質を含む食品に褐変反応を起こさ せる工程を含む、 へリコパクター · ピロリ接着阻害剤の製造方法に関する。 本発 明において、 褐変反応は糖とタンパク質の混合物の 5 %水溶液における波長 4 0
5 n mの吸光度が 0 . 0 1以上になるまで行う。 ここで、 食品とは、 糖とタンパク 質を含むものであれば特に限定されないが、 好ましくは牛生乳、 牛乳粉（全脂粉 乳）、 脱脂粉乳、 乳清および練乳 （コンデンスミルク） などである。
本発明は、 糖とタンパク質との褐変反応生成物と、 胃酸分泌抑制剤からなるへ リコパクター . ピロリ接着阻害剤に関する。 本発明はまた、 糖とタンパク質との 褐変反応生成物とへリコパクター · ピロリに対して除菌作用を有する他の物質か らなるへリコパクター · ピロリ接着阻害剤に関する。 さらに本発明は、 糖とタン パク質との褐変反応生成物、 胃酸分泌抑制剤およびへリコパクター · ピロリに対 して除菌作用を有する他の物質からなるヘリコパクター · ピロリ接着阻害剤に関 する。 なお、 本発明において 「除菌作用」 とは、 インビボおよび Zまたはインビ トロにおいて、 へリコパクター · ピロリに対する接着阻害、 増殖抑制もしくは防 止、 殺菌などの作用を意味する。
本発明はまた、 上述のへリコパクター ' ピロリ接着阻害剤を含む、 へリコパク ター · ピロリが関与する疾患の予防または治療するための医薬組成物に関する。 さらに、 本発明は、 上述のへリコパクター ' ピロリ接着阻害剤を含む、 ヘリコバ クタ一 . ピロリが関与する疾患の予防または改善のための食品に関する。 以下に本発明を詳細に説明する。
本発明のへリコパクター . ピロリ接着阻害剤の有効成分は、 糖とタンパク質の 褐変反応生成物、 す'なわちアミノーカルボニル反応の生成物である。 褐変反応は、 各種糖と、 各種タンパク質とを混合して水溶液中で加熱処理することにより行わ せることができる。
本発明におけるタンパク質は、 経口摂取しうる任意のタンパク質、 例えば小麦、 大麦、 米、 トウモロコシ、 大豆、 小豆等由来の植物性タンパク質または牛乳、 卵、 魚、 肉由来の動物性タンパク質であればいずれでもよいが、 これらに限定されな レ、。 具体的には、 牛乳に含まれるカゼイン、 —ラク トグロプリン、 ひ一ラク ト アルブミン、 牛血清アルブミン、 免疫グロプリン、 ラク トフヱリン等や、 小麦に 含まれるグルテニン、 アルブミン等や、 トウモロコシに含まれるゼィン、 卵に含 まれるオボアルブミン、 才ボトランスフェリン、 オボムコイ ド、 オボムシン、 リ ゾチーム等、 魚肉や肉類に含まれるミォシン、 ァクチン等が挙げられる。 これら の各種タンパク質は、 常法により精製したものを使用してもよいし、 また市販の ものをそのまま用いることもできる。 これらのタンパク質は単独でも、 また 2種 以上を組合わせて使用してもよい。 あるいは、 これらタンパク質を含有する食品 素材、 例えば牛乳由来タンパク質を含む牛生乳、 牛乳粉、 脱脂粉乳、 乳清や練乳 などをタンパク質の混合物をとしてそのまま用いてもよい。
褐変反応生成物の製造に使用する糖としては、 D—グルコース、 D—フラク ト ース、 D—マンノース、 D—ガラクトース、 D—キシロース、 Lーァラビノース、 D—リボース、 乳糖などの種々の還元糖が挙げられる。 これらの糖は精製品を用 いてもよいが、 脱脂粉乳や乳清などを用いる場合には、 上述のように、 タンパク 質を含有しているので、 牛乳由来タンパク質を別途混合することなく、 褐変反応 を行えばよい。 .
糖とタンパク質の質量比は割合は任意の割合でよいが、 通常は 1 ： 1 0 0〜 1 0 ： 1の範囲であり、 好ましくは 1 ： 9〜1 ： 1の範囲である。
本発明において、 褐変反応生成物は、 糖とタンパク質とを混合して水溶液中で 褐変反応させる代わりに、 糖およびタンパク質を含有する食品、 好ましくは糖お よびタンパク質を上記の質量比で含有する食品、 例えば牛生乳、 牛粉乳、 脱脂粉 乳、 乳清および練乳などをそのまま水溶液中で加熱処理などにより褐変反応を起 こさせて得ることもできる。
脱脂粉乳は、 カゼインを主体とする各種牛乳タンパク質、 および乳糖などの糖 を含有している。 脱脂粉乳は、 常法により生乳より遠心分離により脂肪分を分離 除去し、 生じた脱脂乳を粉末化して得ることができるが、 市販の脱脂粉乳を使用 乳清は、 脱脂乳よりカゼインを除去したものであり、 乳糖などの糖、 および |3 - ラク トグロプリン、 （¾ -ラクトアルブミン、 血清アルブミン、 免疫グロブリン、 ラ ク トフエリンなどの乳清タンパク質を含有している。 本発明において使用する乳 清としては、 常法により牛乳汁から調製してもよいし、 市販の乳清 （濃縮液、 粉 末など） をそのまま使用してもよい。
本発明において、 褐変反応は中性水溶液またはアル力リ水溶液中で行うのが好 ましい。 アル力リ水溶液としては、 水酸化ナトリウム、 水酸化力リゥム、 炭酸水 素ナトリウム（重曹）、 炭酸ナトリウム、 リン酸水素ニナトリウムなどの種々のァ ルカリ水溶液が使用できる。 添加するアルカリ濃度は特に限定されないが、 例え ば 0 . 0 5〜0 . 5規定の水酸化ナトリウムを用いることができる。 水溶液の量は、 糖とタンパク質の混合物、 または糖とタンパク質を含む食品を十分に均一に懸濁 できる量であればよく、 例えば 1〜 1 0 0倍量、 好ましくは 5〜 2 0倍量とする。 褐変反応は、 糖とタンパク質の混合物の 5 %水溶液における 4 0 5 n mの吸光 度力 S O . 0 1、 好ましくは 0 . 1以上になるまで行う。 4 0 5 11 111の吸光度が0 . 0 1以上であることは褐変反応が進行していることを意味する。 吸光度は、 例えば 5 %水溶液 1 0 0 μ 1をミクロプレートリーダ一で測定する。
褐変反応の条件としては、 中性水溶液中で行う場合、 反応温度は 1 0 0 °C以上、 特に 1 2 0 °C以上が好ましく、 反応時間は通常 2 0分間以上であり、 好ましくは 3 0分〜 1 0時間である。 また、 アルカリ水溶液中で褐変反応を行う場合は、 反 応温度は室温から 1 0 0 °C、 特に 4 0〜9 0 °Cが好ましく、 反応時間は通常 1〜 2 0時間、 好ましくは 2〜 8時間である。
得られた褐変反応生成物は、 そのまま摂取させても良いが、 慣用の手段、 例え ば限外濾過、 イオン交換樹脂などを用いて未反応の糖の除去、 脱塩を施しても良 レ、。 また、 等電点沈殿、 塩析、 有機溶媒沈殿など、 タンパク質の選択的沈殿に用 いられる通常の手段により褐変反応生成物を沈殿させさせてもよい。 褐変反応生 成物は、 製剤化や食品などへの添カ卩を容易にするため、 慣用の手段、 例えば凍結 乾燥または噴霧乾燥などの手段により乾燥させるのが好ましい。 褐変反応を中性 水溶液中で行った場合には、 そのまま乾燥してもよいが、 上述の手段により未反 応の糖の除去、 脱塩の後に乾燥させ粉末化するのが好ましい。 褐変反応をアル力 リ水溶液中で行った場合には、 反応溶液を酸 （無機酸および Zまたは有機酸） に より中和してもよい。 また、 中和後、 そのまま乾燥してもよいが、 上述の手段に より未反応の糖の除去、 脱塩の後に乾燥させ粉末化してもよい。
本発明の褐変反応生成物は、 へリコパクター · ピロリの接着因子であるウレァ ーゼに優先的に結合することにより、 胃粘膜の受容体への接着を阻止することが できる。 このため、 本発明の褐変反応生成物は、 へリコパクター ' ピロリに対し て優れた除菌作用を有しており、 へリコパクター · ピロリが関与する疾患、 例え ば消化性潰瘍等の予防、 改善に有用である。 また、 原料となる糖およびタンパク 質は、 食品または食品素材に由来するなど経口摂取可能なものであり、 褐変反応 もまた食品の加熱調理の過程で常に起こっている反応であり、 本発明の褐変反応 生成物は非常に安全性が高く、 副作用などの心配がない。 従って、 本発明の褐変 反応生成物を含有するへリコパクター · ピロリ接着阻害剤は、 医薬や食品に配合 して、 ヘリコパクター · ピロリに関与する疾患の予防、 改善のために用いること ができる。
本発明の褐変反応生成物からなる接着阻害剤は、 褐変反応生成物をそのまま、 あるいは適宜担体や賦型剤 （増量剤、 結合剤など） と共に、 通常の任意の製剤化 方法により製造できる。 必要に応じて、 その他の添加剤や薬剤、 例えば制酸剤 (炭 酸水素ナトリウム、 炭酸マグネシウム、 沈降炭酸カルシウム、 合成ヒ ドロタルサ イト等）、 胃粘 S莫保護剤 （合成ケィ酸アルミニウム、 スクラルフアート、 鲖クロロ フィリンナトリウム等） や消化酵素 （ピオジアスターゼ、 リパーゼ等） を加えて もよい。 本発明の接着阻害剤の投与は経口により行い、 投与量は成人 1 日当たり 褐変反応生成物として通常 0 . 0 1〜 1 0 . 0 g (乾物量）、 好ましくは 0 . 5 ~ 5 . 0 gである。
本発明の褐変反応生成物からなる接着阻害剤は、 胃酸分泌抑制剤を併用するこ とにより一層その効果を高めることができる。 使用できる胃酸分泌抑制剤として は、 例えばファモチジン、 ニザチジン、 口キサチジン、 ラュチジン、 シメチジン 等の H 2ブロッカーや、 オメプラゾール、 ランソプラゾール、 ラベブラゾールナト リウム等のプロトンポンプインヒビターがあるが、 これらに限定されない。 胃酸 分泌抑制剤の投与量は、 その薬剤により異なるが、 通常は成人 1 日当たり 1 0〜 5 0 m g、 好ましくは 2 0〜3 O m gである。
また、 本発明の接着阻害剤は、 へリコパクター ' ピロリに対して除菌作用を有 する他の物質と組合わせることで、 へリコパクター ' ピロリの除菌作用をさらに 向上させることができる。 そのような他の物質には、 例えば種々の抗生物質、 ポ リフエノール、 ヘリコパクター · ピロリに対する抗体、 ヘリコパクター · ピロリ の接着因子であるゥレアーゼに結合しうる多糖類および糖タンパク質などが包含 される。 さらに、 本発明の接着阻害剤は、 ビスマス製剤などの胃疾患治療薬、 メ トロ二ザゾールなどの駆虫薬と組合わせてもよい。
そのようなポリフエノールの例には、 カテキン、 ガロカテキン、 ガロカテキン ガレート、 ェピカテキン、 ェピカテキンガレート、 ェピガロカテキン、 ェピガ口 力テキンガレート、 遊離型テアフラビン、 テアフラビンモノガレート、 テアフラ ビンガレート、 レズべラトロール、 プロアントシァニジン、 ケ^/セチン、 アント シァニン、 スルフオラフアン、 イソフラボンなどが挙げられる。 本発明の接着阻 害剤は、 これらのポリフエノールを混合しても良いし、 これらのポリフエノール を含有する茶、 カカオ、 果実などの食品素材またはこれらの抽出物に本発明の接 着阻害剤を配合しても良い。
ヘリコパクター · ピロリに対する抗体としては、 全菌体に対する抗体、 菌表面 分子に対する抗体が挙げられるが、 入手の容易さ ·除菌作用の向上などから菌表 面分子に対する鶏卵抗体、 特にへリコパクター ' ピロリの接着に関与するゥレア ーゼ、 鞭毛に対する鶏卵抗体 （特開平 10- 28758) が好ましい。
ヘリコパクター · ピロリのゥレアーゼに結合しうる糖タンパク質の例としては、 哺乳動物の消化管由来のムチン、 乳精由来のムチン、 鶏卵卵白由来ムチン等のム チン、 これらムチンを構成する糖タンパク質が挙げられる。 該ゥレアーゼに結合 しうる多糖類の例としては、 硫酸デキストラン （Antimicrobiol Agents and Chemotherapy, Vol. 44, No. 9， pp. 2492-2497, 2000)、 フコダイン
(Gastroenteroligy, Vol. 119， pp. 358-367, 2000年） などが挙げられる。 また 該ゥレアーゼの活性を抑制するものとしてプロポリス抽出物があり、 特に超臨界 -抽出法にて抽出したプロポリスが有効であることが報告されている（Medical Nutrition, 2003年 1月 1 日号）。
また、 抗生物質としては、 ペニシリン系、 セフエム系、 マクロライド系、 ニュ 一キノロン系、 テトラサイクリン系の抗生物質を挙げることができ、 特にァモキ シシリンおょぴクラリス口マイシンが好ましレ、。 抗生物質の投与量は、 その薬剤 により異なるが、 通常は成人 1日当たり 1 0 0〜5 0 0 O m g , 好ましくは 5 0 0〜3 0 0 O m gである。
本発明の褐変反応生成物を含む接着阻害剤は食品に含有させることより、 摂取 がさらに容易となる。 本発明の褐変反応生成物の食品への配合量は通常 0 . 5〜1 0質量％程度、 好ましくは 1 . 0〜3 . 0質量％である。 そのような食品、 例えば 健康食品、 機能性食品としては、 細粒、 錠剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 流動食等の 各種医薬形態、 さらにスープ類、 ジュース類、 茶飲料、 乳飲料、 ココア飲料、 ゼ リー状飲料などの液状食品、 プリン、 ヨーグルト等の半固形食品、 パン、 菓子、 うどんなどの麵類、 クッキー、 チョコレート、 キャンディ、 せんべいなどの菓子、 ふりかけ、 バター、 ジャムなどのスプレッド類等の形態が挙げられる。 ヘリコノく クタ一 . ピロリに対して除菌作用を有するポリフエノール、 多糖類または糖タン パク質を多く含む食品素材を用いる食品が好ましい。 具体的にはポリフエノール を含有する果実、 茶、 カカオを用いるジュース類、 茶飲料、 ココア飲料、 チョコ レートなど、 多糖類または糖タンパク質を含有する乳飲料、 乳発酵飲料などが挙 げられる。
また、 特定保健用食品としては、 特に形態は限定されないが、 菓子類、 粉末ス ープ類、 飲料等継続して摂取できるものが好ましい。 病者用食品（低ナトリウム食 品、 低カロリー食品、 低タンパク質食品）等として、 スープ、 飲料、 流動食等の医 療用食品とすることができる。
さらに食品には種々の食品添加物、 例えば各種栄養素、 種々のビタミン、 ミネ ラル、 食物繊維、 多価不飽和脂肪酸、 分散剤および乳化剤等の安定剤、 甘味料、 呈味成分、 フレーバー等を配合することができる。 また、 液状食品は、 最初から 液状食品として調製してもよいが、 粉末またはペース ト状で調製し、 所定量の水 性液体に溶解するものでもよレ、。
発明を実施するための最良の形態
次に、 本発明を下記の実施例により具体的に説明するが、 これにより本発明の 範囲が限定されるものではない。
実施例
実施例 1 カゼインと乳糖のアル力リ水溶液での褐変反応
50ral容スピッツ管中の 0. 2N NaOH水溶液 10ml に、 下記の表の量の乳糖とカゼ ィンを添加し、 試験管ミキサ一で均一な懸濁液となるまで振とうした。 50°Cの水 浴で 4時間加温し、 褐変反応をおこなった。 0. 2N HC1 を反応液の p Hが 7. 0にな るまで添カ卩した。 中和した反応液を凍結乾燥して褐色の粉末を得た。
表 1
実施例 乳糖 _ — カゼイン
1-1 lOOrag 900mg
1-2 300mg 700mg
1-3 400mg 600mg
1-4 500mg 500mg 実施例 2 リウムと乳糖の水溶液での褐変反応
50ml容スピッツ管中の蒸留水 10mlに、 乳糖 400mgとカゼインナトリウム 600mg を添加し、 試験管ミキサーで振とうして溶解した。 高圧滅菌器で、 120°C、 20 分 間褐変反応をおこなった。 次いで、 反応溶液を凍結乾燥して、 褐色の粉末を得た。 実施例 3 J3—ラク トグロブリンと乳糖の褐変反応 15ml容スピッッ管中の 0. 2N NaOH水溶液 1. 0mlに、 乳糖 40mgと _ラタトグ ロブリン 60mgを添カ卩し、 試験管ミキサーで振とうして溶解した。 50°Cの水浴で 4 時間加温し、 褐変反応を行った。 0. 2N HC1 を反応液の p Hが 7. 0になるまで添加 した。 中和した反応液を Sephadex G-25 (Amer sham— Pharmacia) を用いたゲル濾 過により脱塩し、 次いで凍結乾燥して褐色の粉末を得た。
実施例 4 α—ラクトアルブミンと乳糖の褐変反応
15ml容スピッッ管中の 0. 2N NaOH水溶液 1. 0mlに、 乳糖 40mg とひーラクトァ ルブミン 60mgを添カ卩し、 試験管ミキサーで振とうして溶解した。 50°Cの水浴で 4 時間加温し、 褐変反応を行った。 実施例 3と同様に中和して脱塩し、 次いで凍結 乾燥して褐色の粉末を得た。
実施例 5 脱脂粉乳の褐変反応
牛乳粉（キヨゥプロ E - 22、 協同乳業製） 1. 0gを 0. 2N NaOH水溶液 10mlに添加し た。 攪拌して均一な懸濁液とした後、 50°Cの水浴で 4 時間放置し、 褐変反応を行 つた。 反応液を実施例 3と同様に中和し、 次いで凍結乾燥して褐色の粉末を得た。 実施例 6 乳清の褐変反応
乳清（SIMPLESSE 100、 CPKelco社製） l. Ogを 0. 2N NaOH水溶液 10mlに添加した。 攪拌により均一な懸濁液とした後、 50 Cの水浴で 4 時間放置し、 褐変反応を行つ た。 反応液を実施例 3と同様に中和し、 次いで凍結乾燥して褐色の粉末を得た。 実施例 7 カゼインナトリウムとプドゥ糖の褐変反応
蒸留水 100mlに、 ブドウ糖 4gとカゼインナトリウム 6gを添加し、 固形物が溶 解するまで攪拌した。 高圧滅菌器で、 下記の表に示す反応温度および反応時間に て褐変反応を行った。 Sephadex G-25 (Amersham— Pharmacia社製） を用いたゲル 濾過により、 低分子区分を除去した後、 凍結乾燥して褐色の粉末を得た。
表 2
実施例 反応温度 反応時間
7-1 110°C 30分間
7-2 120°C 10分間
7-3 120°C 40分間 実施例 8 カゼインナトリゥムと乳糖の炭酸水素ナトリゥムを用いた褐変反応
1. 5ml 容マイクロチューブ中の蒸留水 1ml にカゼインナトリウム 60mg と乳糖 40mg と炭酸水素ナトリウム 42mg を加え、 攪拌により溶解した。 ヒートブロック にて 90°C、 5 時間褐変反応を行った。 S印 hadex G- 25 (Amersham- Pharmacia) を 用いたゲル濾過により脱塩を行った後、 凍結乾燥を行い褐色の粉末を得た。
実施例 9 大豆蛋白質の褐変反応
50ml容スピッッ管中の 0. 2N NaOH水溶液 10. 0ml に、 乳糖 400mg と大豆蛋白粉 末 600mg (和光純薬製）を添加し、 試験管ミキサーで振盪し、 懸濁した。 40°Cの水 浴で 5時間加温し、 褐変反応を行った。 0. 6N HC1 を反応液の p Hが 7. 0になるま で添加した。 中和した反応液を凍結乾燥して、 褐色の粉末を得た。
実施例 1 0 小麦アルブミンの褐変反応
50ml容スピッツ管中の 0. 2N NaOH水溶液 10. 0ml に、 乳糖 400mg と小麦アルプ ミン 600mg (日清フアルマ製）を添カ卩し、 試験管ミキサーで振とうし、 溶解した。 40°Cの水浴で 5 時間加温し、 褐変反応を行った。 反応液を実施例 9と同様に中和 し、 次いで凍結乾燥して褐色の粉末を得た。
実施例 1 1 卵アルブミンの褐変反応
50ml容スピッツ管中の 0. 2N NaOH水溶液 10. 0ml に、 乳糠 400mg と卵由来アル ブミン 600mg (和光純薬製）を添加し、 試験管ミキサーで振とうして溶解した。 40°Cの水浴で 5 時間加温し、 褐変反応を行った。 反応液を実施例 9と同様に中和 し、 次いで凍結乾燥して褐色の粉末を得た。
実施例 1 2 ゼインと乳糖の褐変反応
50ml 容スピッツ管中の 0. 2N NaOH水溶液 10. 0ml に、 乳糖 400mg とゼイン 600mg (和光純薬製）を添加し、 試験管ミキサーで振盪して懸濁した。 40°Cの水浴で 5 時間加温し、 褐変反応を行った。 反応液を実施例 9と同様に中和し、 次いで凍 結乾燥して褐色の粉末を得た。
実施例 1 3 カゼインとキシロースのリン酸水素ニナトリウムを用いた褐変反応 エツペンドルフチューブ中の 0. lmol/Lリン酸水素ニナトリゥム水溶液 1. 0mlに、 キシロース 40mg とカゼイン 60mgを添加し、 試験管ミキサーで振盪し、 懸濁した。 85°Cのヒートブロックで 2 時間加温し、 褐変反応を行った。 Sephadex G - 25
(Amer sham— Pharmacia社製） を用いたゲル濾過により、 低分子区分を除去した 後、 凍結乾燥を行い、 褐色の粉末を得た。
試験例 1 褐変反応の進展の測定
褐変反応の進展を 405nmにおける吸光度で測定した。
実施例 1〜1 3で調製した褐変反応生成物 50mg を蒸留水 1ml に溶解した。 10, 000G で 15 分間遠心分離し、 上清 ΙΟΟ μ Ι を 96 穴プレー ト （NUNC immunoplate, 注文番号 442404 ) に注入した。 ミクロプレー ト リーダー (Molecular Device 社 Versa Max) で 650nm の吸光度を対照波長とした際の 405nm の吸光度を測定した。 表 3に示すように、 実施例の褐変反応生成物が 0. 1 以上の吸光度を示しており、 実施例の全てにおいて褐変反応が十分に進展してい たことが確認された。
表 3
Figure imgf000014_0001
試験例 2 リ 3ノ クタ、 ピロリ接着阻害活性の測定 実施例 1〜1 3の褐変反応生成物について、 ヘリコパクター · ピロリの接着因 子であるゥレアーゼの胃粘膜への接着阻害効果を以下のようにしてインビト口実 験系において調べた。 なお、 へリコパクター ' ピロリの接着因子であるゥレアー ゼが、 胃粘膜ムチンと特異的な結合することによって、 ピロリ菌が宿主の胃に定 着する。 従って、 このへリコパクター ' ピロリのゥレアーゼと胃ムチンとの接着 を、 より低濃度で阻害するものが、 より強いへリコパクター · ピロリ接着阻害活 性を持つものである。
(実験材料および方法）
本接着阻害試験に用いるゥレアーゼおよびプタ胃ムチンの調製は、 以下のよう に行った。
( 1 ) ゥレアーゼの調製
へリコパクター . ピロリ #130株 (東海大学医学部感染症学教室より入手）のブル セラブローズ培養菌液（3. 5X108 CFU/ml) を 12, OOOxGで 20分間遠心した後、 ペレ ットを精製水に溶解し、 ボルテックスミキサ一で 60秒間処理した。 再び遠心し、 ゥレアーゼを含む抽出上清液を得た。 精製は以下に示した方法によって行った。 緩衝液（20mM リン酸塩、 pH6. 8， ImM EDTA, ImM 2-メルカプトェタノールぉよび 10%PEG 300)で平衡化した DEAE—セファセルカラムに上記抽出液をアプライし、 0. 5ml/分の流速でゲルに吸着させた。 溶出は 0〜0. 5M KC1 の濃度勾配によって実 施した。 各分画液についてゥレアーゼ活性をモニターした。 ゥレアーゼ活性のピ ークが認められた分画をプールし、 濃縮した。 次に、 緩衝液（20mM リン酸塩、 pH6. 8, 150mM NaCl)で平衡ィヒしたセフアクリル S - 300 カラムに、 上記濃縮液をァ プライし、 溶出した。 各分画液のゥレアーゼ活性を測定し、 ゥレアーゼ活性のピ ークを各々プールし、 SDS- PAGE で分析したところ、 ゥレアーゼ A (32kDa) とウレ ァーゼ B (60kDa) のタンパクからなることを確認した。 ゥレアーゼは、 使用する まで、 小分けし， - 8 0 °Cで保存した。
( 2 ) ブタ胃ムチンの調製
約 2ヶ月齢の健康な豚を屠殺し、 胃部を摘出し、 内部に 0. 1M リン酸塩 + 0. 15MNaCl + 5raM N-ェチルマレイミ ド（NEM) + lmM フエニルメチノレスルホニルフノレ オライド（PMSF) + lmM EDTA含有 PBS (pH7. 4)を加えて洗浄した。 胃を切開し、 粘膜 を削り取り、 上記の緩衝液に浮遊させた。 この粘膜浮遊液を氷冷しながらポリ ト ロンホモゲナイザーを用いて均一にした。 これを 15, 000XGで遠心し上清を得た。 この上清を 25, 000XGで再び遠心し、 上清を回収し、 蒸留水で透析した後、 凍結乾 燥して粗精製胃ムチンを得た。 次いで、 この乾燥粗精製胃ムチンを PBS (pH6. 8) (6M塩酸グァニジンおよびプロティアーゼインヒビター（5mM NEM, 1 mM PMSF, ImM EDTA を含む） に溶解し、 これを塩化セシウム密度勾配（1. 5g/ml) に重層し、 · 34, OOOx gで 48 時間遠心した。 シアル酸含有分画の検出はニトロセルローズ膜ブ 口ッティングと過ヨウ素酸シフ試薬による染色によって行った。 発色した分画を プールし、 再ぴ塩化セシウム密度勾配に重層して遠心した。 染色陽性分画をブー ルし、 凍結乾燥した。 次いで、 0. 1Mリン酸緩衝液 (0. 1M NaCl含有、 PH6. 8)で平衡 ィ匕したセファロース CL-4B カラムを通してゲル濾過を行い、 分画した。 PAS染色 陽性で、 タンパク濃度の高い分画をプールし、 PBS (pH6. 8)で透析し、 精製豚胃ム チンを得た。 これを使用時まで一80°Cに保存した （精製豚胃ムチン） 。 なお、 精 製豚胃ムチンは SDS- PAGEの結果、 66kDの糖タンパク質であることを認めた。
なお、 ブタ精製胃ムチンは、 常法に従い、 ピオチン化し、 アツセィに使用した。 ( 3 ) へリコパクター 'ピロリウレアーゼ接着阻害試験
96 ウェルマイク口プレートの各々のゥエルに、 あらかじめ、 S ^u g/ml の濃度に 調製したヘリコパクター 'ピロリウレアーゼの 0. 05M炭酸ナトリゥム緩衝溶液を 50 ^ 1 ずつ加え、 4°Cでー晚静置し、 ゥエルにゥレアーゼを吸着させた。 各ゥヱノレ を 0. 05%ツイーン 2 0含有リン酸緩衝生理食塩水 （pH7. 0) 150 μ 1で 3回洗浄後、 3%牛血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水 （ρΗ7. 0) 150 ^ 1 を加えた。 37°C、 1 時間静置することにより、 ブロッキングをおこなった。 溶液を除去後、 0. 05%ッ ィーン 2 0含有リン酸緩衝生理食塩水 （pH7. 0) 150 μ ΐ で 3 回洗浄をおこなった。
2. 5 ,u g/mlのピオチン化ブタ胃ムチンと試験サンプルの一定濃度を含む 0. 05%ッ ィーン 2 0含有リン酸緩衝生理食塩水 （pH4. 0) 50 μ 1 をそれぞれのゥエルに加え、 37°Cで 1 時間静置し、 ゥレアーゼにピオチン化ブタ胃ムチンを接着させた。 ゥェ ルから溶液を除去し、 0. 05%ツイーン 2 0含有リン酸緩衝生理食塩水 （pH4. 0) 150 で、 3回洗浄後、 65°Cで、 10分間静置し、 タンパクを固定した。 0.05° /。ツイ一 ン 20含有リン酸緩衝生理食塩水 （pH7.0) 150^ 1 で 3 回洗浄後、 ペルォキシダ ーゼ標識ス トレプトァビジンの 0.05%ツイーン 2 0含有リ ン酸緩衝生理食塩水 (pH7.0) 50 μ ΐを加え、 室温で 1時間静置した。 0.05%ツイーン 20含有リン酸緩 衝生理食塩水 （ρΗ7.0) 150 ΐ で 5 回洗浄後、 オルト一フエ二レンジァミン 2塩 酸おょぴ ¾02を含む基質溶液 （ρΗ4.5) 50μ 1 を各ゥヱルに加え、 ペルォキシダー ゼ反応をおこなった。 室温で 5分間反応後、 2Ν硫酸 を添加し、 酵素反応 を停止した。 各ゥヱルの 490nmの吸光度を測定した。
接着阻害活性は、 以下の計算式により算出した。 · 接着阻害活性 (%) = [ 1 - (サンプル添加ゥ ルの吸光度/サンプル無添 加ゥエルの吸光度）] X 1 0 0
(4) 結果
実施例 1〜1 3の褐変反応生成物の lOO^g/ml の濃度における接着阻害活性を 測定した結果、 全ての生成物がピロリ菌へリコパクター ' ピロリのゥレアーゼと プタ胃ムチンの結合を強く阻害することが明らかになった。 これらの結果を表 4 に示す。
表 4. 褐変反応生成物の結合阻害活性
実施例 結合阻害活性 (%)
1-1 70
1-2 78
1-3 84
1-4 81
2 60
3 72
4 66
5 82
6 69
7-1 50
7-2 52
7-3 43
8 66
9 63
10 38
11 62 13 48 試験例 3 へリコパクター ' ピロリ除菌ィンビボ実験
(方法)
実験動物としてヘリコパクター · ピロリ感染に対して高感受性の NS :Hr/ICR 系 ヘアレスマウス （財団法人動物繁殖研究所， 受託番号 IAR-腿 1-9701 ； ATCC#72024) (Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5； 578-582, 1998) を用いた。 N S P 3 3 5株 （1 X 1 0 9 C F U/マウス） をマウスに経口摂取して 1週間飼育した後、 マウス用飼料に実施例 5の褐変反応生成物または実施例 8褐変反応生成物を混餌 し、 1 0週間給餌した。 供試マウス数は各群とも 6匹とした。 1 0週間後に各群 のマウスを屠殺し、 胃を摘出し、 内容物を除去した後、 ホモジナイザーで懸濁液 を作成した。 懸濁液をへリコパクター · ピロリ検出用試料とした。
へリコパクター · ピロリの検出は、 懸濁液をヘリコパクター · ピロリ検出用培 地 （ポアメディアへリコパクター分離培地， 栄研化学) に接種し, ガスパック法 で 3 7 ° (：、 3日間培養し、 コロニー数を計測することによって行った。 褐変反応 生成物を添加しない飼料を給餌した群をコントロール群とし、 コントロール群の 平均コロニー数を 1 0 0として算出した。 得られた結果を下記の表 5に示す。 表 5 リコパクター · ピロリの除菌効果
Figure imgf000018_0001
以上の結果より、 本発明の褐変反応生成物を投与することにより、 マウス胃内 のへリコパクター . ピロリの菌数が大幅に減少した。 また、 実施例 5および 8の 褐変反応生成物投与群において、 へリコパクター ' ピロリが検出されなかったマ ウスも確認した。 これらの結果から、 本発明の褐変反応生成物はへリコバクタ 一. ピロリに対して優れた除菌作用を有することが明らかとなった。 試験例 4 へリコパクター ' ピロリ除菌ィンビボ実験
以下に、 本発明の褐変反応生成物と胃酸分泌抑制剤、 へリコパクター · ピロリ に対して除菌作用を有する種々の物質との組合わせの効果を試験した。
試験例 3と同様に、 実施例 5の褐変反応生成物 （0. 25%混餌）、 ファモチジン (0. 01%混餌）、 へリコパクター ' ピロリのゥレアーゼに対する鶏卵抗体 （0. 25%混 餌）、 牛乳清由来のムチン （0. 25%混餌）、 カゼインナトリウム（0. 25%混餌）、 カテ キン （0. 25%混餌）、 フコィダン（0. 25%混餌）、 オメブラゾール (0. 01%混餌）、 クラ リスロマイシン (0. 1%混餌）、 ァモキシシリン (0. 1%混餌）、 デキストラン硫酸 (0. 25%混餌）、 プロポリス抽出物（0· 25%混餌）、 もしくは超臨界抽出プロボリス (0. 25%混餌)単独、 または褐変反応生成物とこれらのいずれかを組合わせてヘリコ パクター . ピロリ感染マウスに給餌した。 1 0週間後、 マウス胃内のへリコパク ター . ピロリの検出した。 その結果、 単独投与いずれにおいても、 本発明の褐変 反応生成物のみと比較して除菌率が向上した。 これらの結果を下記の表 6に示す。
表 6
Figure imgf000020_0001
以下に、 本発明の褐変反応生成物を含有する医薬の製剤例および食品の配合例 を示す。
実施例 1 4 乾燥スープ
下記の配合にて、 次のように乾燥スープを製造した。
肉エキス、 ォユオンエキス、 キヤロッ トペースト、 昆布エキス、 食塩、 調味料 を加え攪拌機にて攪拌後、 乳化剤を加え、 再度、 攪拌を行う。 次に褐変反応生成 物、 よく溶いた鶏卵を加え混合する。 最後に香辛料を加え攪拌混合し、 凍結乾燥 を行い、 乾燥スープを得る。 本発明の褐変反応生成物 23
鶏卵 26
肉エキス 5
才ニ才ンエキス 17
キヤロットペースト 21
昆布エキス 1
乳化剤 1
2
香辛料（レツドペッパー） 2
調味料 (アミノ酸等） 2
100 (質量％) 実施例 1 5 細粒剤
下記の配合にて、 湿式造粒法にて造粒を行い 細粒を得た。
本発明の褐変反応生成物 45
乳糖 （賦型剤） 35
トゥモロコシデンプン 15
ポリビュルピロリ ドン PVP (K-30) 5
全量 100 (質量％) 実施例 1 6 医療用食品流動食
下記の配合にて、 医療用食品流動食 (200mL/パック）を製造した。
少量の水にミネラル類、 リン酸ナトリウム、 リン酸カリウムを加え攪拌した後 に、 褐変反応生成物、 マルトデキストリン、 カゼィンナトリウム、 乳化剤、 乳タ ンパク質、 少量の水を加え、 50°C程度まで加温し攪拌する。 懸濁後、 室温まで冷 却し、 植物油、 ビタミン類、 香料、 安定剤、 残りの水を加え、 褐変反応生成物入 り医療用流動食を得る。 本発明の褐変反応生成物 3. 6
マルトデキストリン 38. 0
カゼィンナトリウム 13. 0
植物油 12. 0
ビタミン類 1. 0
ミネラル類 1. 5
乳化剤 0. 2
?1 " 10. 3
リン酸ナトリウム 1. 8
リン酸カリゥム 1. 2 香料 0. 5
安定剤（カラギーナン） 1. 5
水 残量
100 (質量％) 実施例 1 7 錠剤
通常の湿式顆粒圧縮法にて錠剤を得た。
本発明の褐変反応生成物 40. 0
D-マンニトール 20. 0
乳糖 20. 0
結晶セルロース 10. 0
ヒ ドロキシプ口ピノレセノレロース 5. 0
クェン酸 5. 0
100 (質量％) 実施例 1 8 茶飲料
以下の配合により、 次のようにして茶飲料 (緑茶飲料およびウー口ン茶飲料) を製造した。 ，
水 lOOmLに対し、 緑茶 3gを 85°Cで 5分間抽出した緑茶抽出液を調製する。 あ るいは、 水 lOOmLに対し、 ウーロン茶 4gを 95°Cで 5分間抽出したウーロン茶抽 出液を調製する。 褐変反応生成物とその 5倍量の緑茶抽出液またはウーロン茶抽 出液を加え攪拌する。 褐変反応生成物を懸濁した後、 残りの茶抽出液を加え、 褐 変反応生成物入り茶飲料を得る。 本発明の褐変反応生成物
緑茶抽出液 99
100 (質量％) 実施例 1 9 ココァ飲料
下記の配合にてココァ飲料を製造した。
褐変反応生成物にココア（森永乳業製）を加え攪拌する。 褐変反応生成物の 5倍 量のお湯 (80°C程度）を加え、 攪拌 '懸濁する。 懸濁後、 残りのお湯と牛乳を加え、 ココア飲料を得る。 本発明の褐変反応生成物 5
ココア 5
牛乳 . 20
水 70
100 (質量％) 実施例 2 0 コーヒー飲料
下記の配合にてコーヒ一飲料を製造した。
水 100mLに対し挽いたコーヒー豆 6gを 95°C、 1分間抽出し、 コーヒー抽出液 とする。 褐変反応生成物に対し、 5倍量のコーヒー抽出液、 砂糖を加えた後、 攪 拌し懸濁する。 残りのコーヒー抽出液と牛乳を加ぇ褐変反応生成物入りコーヒー 飲料を得る。 本発明の褐変反応生成物 2
砂糖 1
牛乳 30
コーヒー抽出液 67
100 (質量％) 実施例 2 1 バナナミルクシェーク
下記の配合にてバナナミルクシェークを製造した。
褐変反応生成物と牛乳とバナナを家庭用ミキサーに加え懸濁する。 最後にビタ ミン Cを加え褐変反応生成物入りバナナミルク飲料を得る。 本発明の褐変反応生成物 2
ビタミン C 0. 5
牛乳 40
バナナ 57. 5
100 (質量。/。） 実施例 2 2 ふりかけ
下記の配合にてふりかけを製造した 本発明の褐変反応生成物 40
味付けかつお節 25
味付け白ゴマ 20
味付け海苔 10 ビタミン E 5
全量 100 (質量。/。） 実施例 2 3 発酵乳飲料
本発明の褐変反応生成物 5gに乳酸菌入り発酵乳（ャクルト社製) 25gを加え懸濁 する。 懸濁後、 乳酸菌入り発酵乳 70g を加え、 褐変反応生成物入り発酵乳飲料を 得る。
実施例 2 4 乳飲料
本発明の褐変反応生成物に 5gに牛乳 25 gを加え、 懸濁する。 懸濁後、 牛乳 70g を加え、 褐変反応生成物入り乳飲料を得る。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 へリコパクター · ピロリに対して優れた除菌作用を有し、 且 つ安全性が高く、 副作用などの心配がないへリコパクター · ピロリ接着阻害剤が 提供される。 本発明の定着阻害剤は、 従来用いられてきた抗生物質のように耐性 菌の問題も生じず、 胃内のヘリコパクター · ピロリを特異的に除菌することがで きる。 このため、 本発明のへリコパクター ' ピロリ接着阻害剤、 これを含有する 医薬および食品は、 へリコパクター · ピロリに関連する疾患、 例えば消化性潰瘍 等の予防、 改善に有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 糖とタンパク質との褐変反応生成物を有効成分とするへリコパクター · ピ 口リ接着阻害剤。
2 . タンパク質が小麦、 大麦、 米、 トウモロコシ、 大豆、 小豆由来の植物性タ ンパク質および牛乳、 卵、 魚、 肉由来の動物性タンパクからなる群から選択され る 1種以上である、 請求項 1記載のへリコパクター ' ピロリ接着阻害剤。
3 . 糖が、 D—グルコース、 D—フラク トース、 D—マンノース、 D—ガラク トース、 D—キシロース、 Lーァラビノース、 D—リボースおよび乳糖からなる 群から選択される 1種以上である、 請求項 1または 2記載のへリコパクター - ピ ロリ接着阻害剤。
4 . 水溶液中で、 糠とタンパク質とを褐変反応させる工程を含む、 へリコパク ター · ピロリ接着阻害剤の製造方法。
5 . 水溶液中で、 糖とタンパク質とを含む食品に褐変反応を起こさせる工程を 含む、 ヘリコパクター · ピロリ接着阻害剤の製造方法。
6 . タンパク質が小麦、 大麦、 米、 トウモロコシ、 大豆、 小豆由来の植物性タ ンパク質および牛乳、 卵、 魚、 肉由来の動物性タンパク質からなる群から選択さ れる 1種以上である、 請求項 4または 5記載の方法。
7 . 糖が、 D—グルコース、 D—フラク トース、 D—マンノース、 D—ガラク トース、 D—キシロース、 Lーァラビノース、 D—リボースおよび乳糖からなる 群から選択される 1種以上である、 請求項 4または 5記載の方法。
8 . 前記食品が牛生乳、 牛乳粉、 脱脂粉乳、 乳清または練乳である、 請求項 5 の記載の方法。
9 . 褐変反応を、 5%水溶液で測定して 405nmの吸光度が 0. 01以上になるまで行う、 請求項 4〜 8のいずれかの項記載の方法。
1 0 . 糖とタンパク質との褐変反応生成物と胃酸分泌抑制剤からなるへリコパク ター ' ピロリ接着阻害剤。
1 1 . 糖とタンパク質との褐変反応生成物とヘリコパクター · ピロリに対して除 菌作用を有する他の物質からなるヘリコパクター · ピロリ接着阻害剤。
1 2 . 前記物質が、 ポリフエノール、 抗生物質、 へリコパクター · ピロリに対す る抗体、 ヘリコパクター · ピロリの接着因子であるゥレアーゼに結合しうる多糖 類および糖タンパク質からなる群から選択される 1種以上である請求項 1 1記載の
1 3 . 請求項 1〜 3および請求項 1 0〜1 2のいずれかに記載のへリコパクター • ピロリ接着阻害剤を含む、 へリコパクター · ピロリに関連する疾患の予防また は治療のための医薬組成物。
1 4 . 請求項 1 ~ 3および請求項 1 0〜1 2のいずれかに記載のヘリコパクター • ピロリ接着阻害剤を含む、 へリコパクター · ピロリに関連する疾患の予防また は改善のための食品。
PCT/JP2003/000724 2002-01-28 2003-01-27 Inhibiteur d'adhesion d'helicobacter pylori WO2003063886A1 (fr)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020047010902A KR100702885B1 (ko) 2002-01-28 2003-01-27 헬리코박터 파이로리 접착 저해제
CN038044358A CN1638787B (zh) 2002-01-28 2003-01-27 幽门螺旋杆菌粘附抑制剂
EP03701878A EP1498134A1 (en) 2002-01-28 2003-01-27 Helicobacter pylori adhesion inhibitor
US10/501,892 US20050096262A1 (en) 2002-01-28 2003-01-27 Helicobacter pylori adhesion inhibitor
JP2003563575A JP4474581B2 (ja) 2002-01-28 2003-01-27 ヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤
CA002474620A CA2474620A1 (en) 2002-01-28 2003-01-27 Helicobacter pylori adhesion inhibitor

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002018606 2002-01-28
JP2002/18606 2002-01-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2003063886A1 true WO2003063886A1 (fr) 2003-08-07

Family

ID=27653892

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/000724 WO2003063886A1 (fr) 2002-01-28 2003-01-27 Inhibiteur d'adhesion d'helicobacter pylori

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20050096262A1 (ja)
EP (1) EP1498134A1 (ja)
JP (1) JP4474581B2 (ja)
KR (1) KR100702885B1 (ja)
CN (1) CN1638787B (ja)
CA (1) CA2474620A1 (ja)
TW (1) TW200302733A (ja)
WO (1) WO2003063886A1 (ja)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006325447A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Nisshin Pharma Inc 抗ヘリコバクター・ピロリ飲食品
JP2008024662A (ja) * 2006-07-22 2008-02-07 Oita Univ ヘリコバクター・ピロリの除菌方法及びその投与剤
WO2008136397A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Nisshin Pharma Inc. 消化性潰瘍を予防および／または治療するための組成物

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101470739B1 (ko) * 2013-06-03 2014-12-08 서울우유협동조합 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 및 이의 제조방법
CN109846051B (zh) * 2019-02-19 2022-06-07 齐齐哈尔大学 卵黏蛋白水解物在抑制幽门螺旋杆菌粘附中的应用
CN109820088B (zh) * 2019-02-19 2022-12-30 齐齐哈尔大学 一种小麦胚芽蛋白水解物及其制备方法和应用
CN115247197B (zh) * 2021-11-29 2023-05-12 齐齐哈尔大学 一种具有拮抗幽门螺旋杆菌粘附活性的玉米蛋白水解物及其制备方法和应用
CN115960167B (zh) * 2022-08-18 2023-11-07 齐齐哈尔大学 一种玉米抗粘附肽及其制备方法和应用
CN116041426B (zh) * 2022-08-18 2023-11-03 齐齐哈尔大学 玉米蛋白源抗粘附肽及其制备方法和应用

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05238947A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Yakult Honsha Co Ltd 細菌毒素中和剤
JPH10182451A (ja) * 1996-12-24 1998-07-07 Toshio Sato ウレア−ゼ阻害活性を有する抗潰瘍剤
JPH10245344A (ja) * 1997-03-04 1998-09-14 Ota Isan:Kk ウレアーゼ活性阻害剤の製造方法
WO1998042323A1 (en) * 1997-03-25 1998-10-01 Takeda Chemical Industries, Ltd. Stabilized urease inhibitor
JPH1112172A (ja) * 1997-06-18 1999-01-19 Yakult Honsha Co Ltd ヘリコバクター・ピロリ菌抑制剤
JP2002159566A (ja) * 2000-08-28 2002-06-04 Maruzen Pharmaceut Co Ltd 消臭剤及び抗菌剤

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4013800A (en) * 1967-03-15 1977-03-22 Ajinomoto Co., Inc. 4-hydroxy-5-methyl-2,3-dihydrofuran-3-one and methods of making and using the same
JPH01112172A (ja) * 1987-10-24 1989-04-28 Sharp Corp 映像中間周波回路の周波数選択特性測定方法
EP0769245A1 (en) * 1995-10-19 1997-04-23 Societe Des Produits Nestle S.A. Browning composition
JP3430853B2 (ja) * 1997-04-11 2003-07-28 株式会社ゲン・コーポレーション 胃炎、胃潰瘍および十二指腸潰瘍の予防剤並びに治療剤
US6524625B2 (en) * 1998-06-30 2003-02-25 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyuto Physiologically active extract obtained from indigo plant polygonum tinctorium
KR100460173B1 (ko) * 1998-12-11 2004-12-04 겐 코오포레이션 헬리코박터 파일로리 정착 억제제
KR100324441B1 (ko) * 1999-02-08 2002-02-27 이은선 위염, 위궤양, 십이지장궤양 예방을 위한 식품
JP2001294600A (ja) * 2000-04-14 2001-10-23 Gen Corp:Kk ヘリコバクター・ピロリ定着阻害作用を有する糖タンパク質

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH05238947A (ja) * 1992-02-28 1993-09-17 Yakult Honsha Co Ltd 細菌毒素中和剤
JPH10182451A (ja) * 1996-12-24 1998-07-07 Toshio Sato ウレア−ゼ阻害活性を有する抗潰瘍剤
JPH10245344A (ja) * 1997-03-04 1998-09-14 Ota Isan:Kk ウレアーゼ活性阻害剤の製造方法
WO1998042323A1 (en) * 1997-03-25 1998-10-01 Takeda Chemical Industries, Ltd. Stabilized urease inhibitor
JPH1112172A (ja) * 1997-06-18 1999-01-19 Yakult Honsha Co Ltd ヘリコバクター・ピロリ菌抑制剤
JP2002159566A (ja) * 2000-08-28 2002-06-04 Maruzen Pharmaceut Co Ltd 消臭剤及び抗菌剤

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006325447A (ja) * 2005-05-24 2006-12-07 Nisshin Pharma Inc 抗ヘリコバクター・ピロリ飲食品
JP2008024662A (ja) * 2006-07-22 2008-02-07 Oita Univ ヘリコバクター・ピロリの除菌方法及びその投与剤
WO2008136397A1 (ja) 2007-04-27 2008-11-13 Nisshin Pharma Inc. 消化性潰瘍を予防および／または治療するための組成物
JP5198438B2 (ja) * 2007-04-27 2013-05-15 日清ファルマ株式会社 消化性潰瘍を予防および／または治療するための組成物

Also Published As

Publication number Publication date
TWI343813B (ja) 2011-06-21
CN1638787A (zh) 2005-07-13
JPWO2003063886A1 (ja) 2005-05-26
EP1498134A1 (en) 2005-01-19
US20050096262A1 (en) 2005-05-05
TW200302733A (en) 2003-08-16
CA2474620A1 (en) 2003-08-07
KR20040096525A (ko) 2004-11-16
JP4474581B2 (ja) 2010-06-09
CN1638787B (zh) 2012-10-03
KR100702885B1 (ko) 2007-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Uruakpa et al. Colostrum and its benefits: a review
KR101233648B1 (ko) 유청 단백, 젖 유래의 항체 또는 항체를 포함하는 기능성조성물 또는 식품
JP2003533438A (ja) 免疫応答増強用の炭水化物処方物（プレバイオチック補助剤）
JP2006149371A (ja) 乳清タンパク食品
JP5465834B2 (ja) 肝機能保護剤
CA2292012C (en) Inhibitor of helicobacter pylori colonization
RU2762096C2 (ru) Бифидобактерии для снижения потребления пищи, энергии и/или жиров
JP4474581B2 (ja) ヘリコバクター・ピロリ接着阻害剤
EP1145644B1 (en) Glycoprotein having inhibitory activity against helicobacter pylori colonization
JP2006325447A (ja) 抗ヘリコバクター・ピロリ飲食品
JP3255161B2 (ja) ヘリコバクター・ピロリ定着阻害剤
AU5185301A (en) Method of producing fractions containing a high concentration of milk basic cystatin and decomposition products thereof
JP2008024662A (ja) ヘリコバクター・ピロリの除菌方法及びその投与剤
JP6797966B2 (ja) 胃内酸性プロテアーゼ酵素活性阻害剤、ラクトフェリン組成物の製造方法、及びラクトフェリン組成物
AU781236B2 (en) Glycoprotein having inhibitory activity against helicobacter pylori colonization
JP2021029208A (ja) アルコール代謝促進用組成物
Sharma Dairy Beverages

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NO NZ OM PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003563575

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 1020047010902

Country of ref document: KR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10501892

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2474620

Country of ref document: CA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003701878

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038044358

Country of ref document: CN

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003701878

Country of ref document: EP