KR101470739B1

KR101470739B1 - 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101470739B1
Application number: KR1020130063607A
Authority: KR
Inventors: 이건봉; 오남수; 이현아; 이지영; 정재연; 하영식; 신용국; 김세헌; 이광원
Original assignee: 서울우유협동조합
Priority date: 2013-06-03
Filing date: 2013-06-03
Publication date: 2014-12-08

Abstract

본 발명은 유단백질 및 유당 시료를 혼합하여 마이얄 반응을 일으키는 단계 및 상기 마이얄 반응 생성물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 제조방법에 관한 것이다. 또한, 이의 방법으로 제조된 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물에 관한 것이다. 이는 높은 항산화 효과가 있음이 확인되었으며, 상기 항산화 효과를 기반으로 소염 및 심장혈관계 치료 및 항산화제 등으로 이용할 수 있는 약학, 건강기능식품 및 화장품 분야 등에 널리 활용될 수 있다.

Description

유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 및 이의 제조방법{Maillard-reacted enzymatic hydrolysate using milk protein and method for manufacturing the same}

본 발명은 유단백질의 마이얄 반응물에 가수분해효소를 처리하여 제조되는 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

우유 단백질은 여러 생물학적 활성 물질을 포함하는 것으로 알려져 있어 식품 가공분야에서 기능성 원료로 폭넓게 사용되어 왔다[Chevalier 등, J Agric Food Chem.(2001), 49(10):5031-5038]. 우유 단백질은 약 80%를 차지하는 카제인(casein)과 약 20%를 차지하는 유청 단백질(whey protein)의 두 개의 주요한 그룹으로 분류될 수 있다[Fox 등, Advanced dairy chemistry.(2003) Vol. 1]. 효소 가수분해는 우유 단백질의 기능성에 영향을 미치고, 그 물리적 및 화학적 특성을 증진시킨다는 사실이 알려져 있다[Bertrand-Harb 등, Nahrung(2002), 46(4):283-289]. 또한, 앤지오텐신 전환 효소-억제 (angiotensin converting enzyme- inhibitory, ACE-inhibitory) [FitzGerald 등, British Journal of Nutrition(2000), 84:33-37], 오피오이드(opioid) [Shah, British Journal of Nutrition(2000), 84(1):3], 항균제[Haque 등, European Food Research and Technology(2008), 227(1):7-15], 항산화제(antioxidant) [Pihlanto, International Dairy Journal(2006), 16(11):1306-1314], 면역조절 펩타이드(immune-modulatory peptides)와 같은 우유 단백질 가수분해물의 여러 생물학적 펩타이드가 연구되어 왔다.

비효소적 갈변 현상으로도 알려져 있는 마이얄 반응(Maillard reaction)은 식품 가공 및 저장 중에 카보닐(carbonyl)기와 아민(amine)기 사이에서 발생하는 복합적인 반응이다. 상기 마이얄 반응에 의해 향, 색상, 맛, 질감 등 식품의 특성을 결정하는 중요한 마이얄 반응 생성물(Maillard reaction products, MRPs)들이 많이 생성되게 된다[Fayle 등, Royal Society of Chemistry(2002), Vol. 5]. 마이얄 반응의 초기 단계에서는 자유 아미노기를 포함하는 단백질들이 당류의 카보닐기와 반응하여 가역적인 시프 염기(Schiff bases)를 형성하며, 이 염기가 전위(rearrangement)를 일으켜 안정적인 ‘아마도리 화합물(Amadori compound)’을 형성한다. 그 후의 반응 단계에서, 상기 아마도리 화합물은 유색의 형광물질을 형성한다[Jing 등, Food and Chemical Toxicology(2002), 40(7):1007-1015]. 마이얄 반응에서 형광 및 갈변의 발달은 일반적으로 반응율 및 MRPs의 형성을 나타내는 지표로 이용된다[Yeboah 등, J Agric Food Chem.(1999), 47(8):3164-3172].

종래 우유 단백질 및 당류의 마이얄 반응 효과에 대한 연구가 수행되었다. MRPs는 화학적 모델 및 식품 시스템 모두에서 항산화 활성을 나타냈다. 가열된 카제인-포도당 혼합물은 유화 리놀레산(emulsified linoleic acid) 모델에서 지질 과산화 비율을 감소시켰다. 또한, 카제인-당-유래 마이얄 반응 생성물은 팬톤(Fenton)에 의해 유발된 하이드로실 자유 라디칼에 대해서는 항산화 활성을 보였으나, 소수성 라디칼에 대해서는 활성을 나타내지 않았다[Gu 등, Food Chemistry(2009), 117(1):48-54]. 또한, 마이얄-반응한 카제인과 포도당 또는 유당의 생성물은 순수 카제인에 비해 항산화 활성이 더 좋다고 개시되어 있다[McGookin 등, Journal of Dairy Research(1991), 58(03):313-320]. 또한, 마이얄 반응은 유청 단백질(whey)의 열 안정성, 유화 특성(emulsifying properties) 및 항산화 활성을 증진시킨다[Chevalier 등, J Agric Food Chem.(2001), 49(10):5031-5038]. 이러한 결과는 우유 단백질의 생리적 및 생물학적 기능이 마이얄 반응에 의해 개선될 수 있다는 점을 시사한다.

한편, 유청 단백질의 특성과 관련하여, 대한민국 특허공개공보 제2009-0095902호는 유청 단백질의 프로테아제 가수분해물의 항산화 효과를 개시하고 있으나, 마이얄 반응에 관한 내용은 기재되어 있지 않다.

이에 본 발명자들은 일반적인 가수분해 생성물보다 우수한 활성을 갖는 유단백질 가공물을 개발하고자 실험을 거듭한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 일반적인 유단백질 가수분해물 보다 활성이 높은 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 유단백질 및 유당 시료를 혼합하여 마이얄 반응을 일으키는 단계; 및 상기 마이얄 반응 생성물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유단백질은 유청 단백질(whey protein) 또는 카제인 나트륨(sodium caseinate)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유단백질 및 유당 시료는 완충액(buffer)에 용해되어 액체 상태로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유단백질과 유당 시료는 1:5의 중량비로 혼합될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 마이얄 반응은 유단백질 및 유당 시료를 인산나트륨 완충액에 넣고 50 - 60℃로 가열하는 조건에서 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가열은 6 - 8일간 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해효소는 프로타멕스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 알칼라제(Alcalase) 및 플라보자임(Flavourzyme)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해효소는 알칼라제(Alcalase)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해효소는 유단백질과 1:100 (wt/vol)의 비율이 되는 양만큼 첨가될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해효소 처리는 1 내지 3 시간 동안 이루어질 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 가수분해효소 처리는 뉴트라제(Neutrase), 알칼라제 (Alcalase) 또는 플라보자임(Flavourzyme)의 경우 50℃에서, 프로타멕스(Protamex)의 경우 40℃에서 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 항산화 효과를 나타내는 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성을 갖는 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물을 유효성분으로 포함하는, 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 따라 생산된 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물은 높은 항산화 효과가 있음이 확인되었다. 따라서, 항산화 효과를 갖는 기능성 식품 뿐만 아니라, 항산화 작용에 의해 발생하는 질병에 대한 치료용 약학조성물, 항산화 활성을 갖는 화장품 등으로 활용될 수 있다.

도 1은 유당을 처리한 유청 단백질(Whey protein concentrates, WPC) 및 카제인 나트륨(sodium caseinate, SC)을 55℃로 7일간 열처리하여 마이얄 반응을 시키는 동안 나타나는 형광 변화를 나타낸 그래프이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 2는 각각 다른 효소를 처리한 (A)WPC, (B) 마이얄 반응한 WPC, (C) SC 및 (D)마이얄 반응한 SC의 가수분해 정도를 나타낸 그래프이다. P; Protamex, N; Neutrase, A; Alcalase, F; Flavourzyme이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다. *P＜0.05는 대조군과 비교한 것이다.
도 3은 각각 3시간 동안 효소처리한 (A)WPC, (B) 마이얄 반응한 WPC, (C) SC 및 (D)마이얄 반응한 SC 가수분해물의 SDS-PAGE 패턴을 나타낸 것이다. P; Protamex, N; Neutrase, A; Alcalase, F; Flavourzyme이다.
도 4는 WPC 및 마이얄 반응한 WPC 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 5는 SC 및 마이얄 반응한 SC 가수분해물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 6은 WPC 및 마이얄 반응한 WPC 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 7은 SC 및 마이얄 반응한 SC 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 활성을 나타낸 것이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 8은 WPC 및 마이얄 반응한 WPC 가수분해물의 FRAP를 나타낸 것이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.
도 9는 SC 및 마이얄 반응한 SC 가수분해물의 FRAP을 나타낸 것이다. 값은 평균 ± 표준편차(n=3)로 나타내었다.

본 발명은 유단백질의 마이얄 반응 생성물을 효소로 가수분해시킨 가수분해물에 관한 것이다. 본 발명자들은 유단백질인 유청 단백질(Whey protein concentrates , WPC) 및 카제인 나트륨(sodium caseinate , SC)으로부터 유래한 마이얄 반응 생성물의 가수분해물의 특성 및 항산화 효과를 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 항산화 활성이 뛰어난 유단백질 가수분해물 및 이의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 유단백질 및 유당 시료를 혼합하여 마이얄 반응을 일으키는 단계; 및 상기 마이얄 반응 생성물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 가수분해물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 본 발명의 가수분해물에 의해 항산화 효과를 나타내므로 체내 산화작용으로 인하여 발생하는 질병에 적용될 수 있다.

본 발명으로 제조된 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물을 포함하는 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여가 가능하다. 본발명의 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골순, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 설하 또는 국소 투여가 가능하다. 이와 같은 임상 투여를 위해 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 기술을 이용하여 경구투여, 비경구 투여용, 주사용 등의 적합한 제형으로 제제화할 수 있다. 예를 들어, 경구 투여시에는 불활성 희석제 또는 식용 담체와 혼합하거나, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 밀봉되거나 또는 정제로 압형하여 투여할 수 있다. 경구 투여용의 경우, 활성 화합물은 제제화에 필요한 통상의 성분들과 혼합되어 섭취형 정제, 협측 정제, 트로키제(troches), 로진지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 엘릭시르(elixirs), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이때, 정제, 캡슐 등의 제형으로 제제화하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유 등을 혼합할 수도 있다. 캡슐 제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 혼합할 수도 있다. 또한, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사, 흉부내 주사 주입방식과 점막, 또는 국소에 적용되는데, 분산제, 좌제, 분제, 에어로졸(비강 스프레이 또는 흡입제), 겔, 현탁액제(수성, 또는 비수성 액상 현탁액, 수중유 에멀젼 또는 유중수 에멀젼), 용액제 등 비경구 투여에 적합한 액상 투여 형태 등에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 조성물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화할 수 있다. 상기와 같은 본 발명의 약학적 조성물의 유효투입량은 환자의 연령, 신체적 조건, 몸무게 등의 상태를 고려하여 임상의 판단에 따라 필요한 범위로 조절될 수 있으며 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1일 수회, 바람직하게는 하루 2회 내지 5회 분할 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 가수분해물 또는 이의 식품학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강기능식품은 상기 가수분해물에 의해 체내 항산화 효과를 나타낸다.

본 발명의 건강기능식품은 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물을 유효성분으로 포함하므로 인체에 안전하여 식품에 첨가하여 사용하기에 적합하다. 상기 건강기능식품으로는 그 종류가 한정되는 것은 아니나, 예를 들어 통상적인 기호성 식품 즉, 라면, 생면 등의 면류, 두부, 시리얼, 빵류, 츄잉 껌, 사탕, 과자류 등에 첨가하여 통상적으로 알려진 방법에 의하여 각종 식품으로 제조할 수 있고, 식용가능한 색소로서 적용할 수도 있다. 또한, 정제, 과립제, 환제, 경질캅셀제, 연질 캅셀제 또는 액제 제형 등 일반적인 제형으로 제형화될 수 있으며, 생즙, 파우치, 음료, 또는 다류 등으로 제조될 수도 있다. 상기한 성분 이외에 다른 성분은 제형에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 배합할 수 있음은 물론이다. 또한, 본 발명의 건강기능식품에 포함되는 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물은 항산화 활성이 우수하여 산화에 의해서 일어나는 식품의 냄새나 풍미의 변화, 유지의 산패, 그리고 식품의 변색을 효과적으로 방지할 수도 있다. 따라서, 본 발명의 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물은 통상의 각종 식품류에 배합함으로써 이들 식품류를 보존하거나 식품의 신선도 및 품질을 장기간에 걸쳐 유지하기 위해 사용할 수도 있다. 상기 식품류로는 전형적인 식품뿐만 아니라, 음료(알코올성 음료도 포함함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일 통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게이트, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용 식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스등) 등을 포함함은 물론이다.

또한, 본 발명은 상기 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 항산화 기능성 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물을 그대로 사용하거나 또는 필요에 따라 희석하여 사용할 수 있다. 상기 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제를 사용하여 액체 또는 고체 형태로 제조될 수 있다. 액체 또는 고체 형태의 화장품으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 화장수, 크림제, 로션제, 입욕제 등의 형태를 포함할 수 있다. 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 기제, 보조제 및 첨가제는 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 물, 알코올, 프로필렌글리콜, 스테아르산, 글리세롤, 세틸 알코올, 유동 파라핀 등이 있다. 상기와 같은 본 발명의 화장료 조성물은 피부의 산화에 의한 손상, 예를 들면 반점(갈색반), 주근깨, 피부균열, 자외선 손상(햇볕에 탐) 등을 예방하는데 매우 유용하며, 화장품 자체의 산화를 방지함으로써 화장품의 품질을 유지하는데도 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 실험재료 및 통계처리

<1-1> 화합물

o-phthaldialdehyde (OPA), 2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt (ABTS), 과황산칼륨(potassium persulfate), 2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), 아스코르브산(L-ascorbic acid), 염화제2철(6수화물)(iron (III) chloride hexahydrate)은 시그마 케미컬(USA)에서 구입하여 사용하였다. 농축 유청 단백질(Whey protein concentrates , WPC) 및 카제인 나트륨(sodium caseinate , SC)은 다비스코 푸드(USA) 및 케리골드(Ireland)에서 각각 구입하였고, 프로타멕스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 알칼라제 (Alcalase) 및 플라보자임(Flavourzyme)은 노보자임(Denmark)에서 얻었다. 유당 일수화물(Lactose monohydrate)은 준세이 케미칼(Japan)에서, 트립톤(tryptone)은 옥소이드(UK)에서, 황산 철(II)(iron (II) sulfate heptahydrate)은 쇼와 케미칼(Japan)에서 구입하였으며, 모든 화합물은 분석용 등급인 것을 사용하였다.

<1-2> 통계분석

모든 데이터는 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 그룹 사이의 차이를 위한 통계분석은 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple range tests)을 이용하여 평가하였다. SAS 소프트웨어버전 9.2 (SAS Institute, NC, USA)는 모든 통계 테스트를 형성하여 사용하였다. P < 0.05 값은 특이적인 차이가 보여지는 것으로 여겨진다.

< 실시예 2> 본 발명의 마이얄 반응 생성물의 제조 및 특성 분석

<2-1> 마이얄 반응 생성물의 제조

마이얄 반응을 용이하게 하기 위하여 10 mg 의 WPC 또는 SC와 50 mg의 유당을 1:5의 중량비로 0.1 M 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer) (pH 7.4)에 넣고 용해시켰다. 55℃의 shaking water bath에서 60 rpm으로 7일간 반응시켰으며 pH 수치는 제한하지 않았다.

그 후 상기 반응 혼합물을 0.1 M 인산나트륨 완충액(pH 7.4)에 대해 24시간 안에 3회 투석하고 동결건조시켰다.

<2-2> 마이얄 반응 생성물의 특성 분석

상기 WPC 또는 SC와 유당으로 제조된 마이얄 반응 생성물을 확인하기 위해 마이얄 반응의 초기 지표산물인 퓨로신(furosine)의 생성량 및 형광도를 측정하였다.

상기 실시예 <2-1>에서 제조된 샘플에 8M의 HCl을 넣어 24시간 동안 110°C의 드라이 오븐에서 가수분해시켰다. 산(acid) 가수분해로 수득된 가수분해물은 0.45 mm의 막여과기(13 mm)가 있는 Millipore (Millipore, Milford, MA) system로 여과되었다. 여과된 500 ㎕의 가수분해물에 Sep-pak C₁₈ 카트리지(Millipore), 활성화된 메탄올(5 mL) 및 탈이온수(deionized water)(10 mL)를 첨가하였다. 그 후 3 M HCl 3 mL로 퓨로신을 용출하였고, 퓨로신은 질소 가스하에서 증발되었다. HPLC 분석 이전에, 상기 건조된 샘플을 물, 아세토나이트릴(acetonitrile), 포름산(formic acid)을 95:5:0.2의 비율로 섞은 3 mL의 혼합물에 넣어 용해하였다. 분석을 위해 퓨로신을 Capcell Pak C₁₈ UG 칼럼 (4.6 × 250 mm)에 넣고 30°C로 유지하며포토 다이오드 어레이 검출기(Photo-diode array (PDA) detector)를 갖춘 HPLC 시스템(Alliance, Waters, USA)으로 280 nm 에서 관찰하였다. 분석 조건은 플로우(flow)를 1.0 mL/min 으로 하고, 용리액(eluent)으로 20% (vol/vol) 아세토나이트릴 및 0.2% (vol/vol) 포름산을 첨가한 5 mM sodium heptane sulfonate 용액을 사용하였다.

그 결과, 표 1에서 보는 바와 같이, 퓨로신 함량은 1.19 ± 0.02 에서 16.76 ± 0.13 μg/mL 까지 검출되었다. 열 처리 동안에, 퓨로신 함량은 WPC 및 마이얄 반응한 WPC에서 감소하였으나, 마이얄 반응한 SC에서는 증가하였다. 열 처리 이전에는, WPC에서 16.76 ± 0.13 μg/mL의 퓨로신이 검출되었으나, SC에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과는 퓨로신이 유당(lactose)을 포함하는 WPC의 공정에서 열처리에 의해 이미 합성되었음을 시사한다. 또한, 열을 가하는 동안 퓨로신 함량은 유당 없이 가열한 WPC에서 보다 마이얄 반응한 WPC에서 더 적게 감소하였다. 이는 유당의 존재 하에 마이얄 반응의 초기 단계에서 합성된 추가적인 퓨로신 때문이다. 종래 연구에서도 120°C로 가열한 모델 시스템에서 열처리가 퓨로신 함량에 미치는 효과에 관하여 보고된 바 있다[Angel Rufian-Henares 등, Food Research International(2002), 35(6):527-533]. 상기 연구 결과에 따르면, 유청 단백질 및 유청 단백질- 덱스트리노말토스(dextrinomaltose) 모델 시스템에서 퓨로신 함량은 열처리 동안에 감소하였고, 카제인-유당 및 카제인-덱스트리노말토스 시스템에서는 증가하였으며, 이는 본 발명의 결과와 일치한다.

또한, MRPs의 형광도를 370 nm의 여기(excitation) 및 440 nm의 방출(emission) 파장에서 Synergy H1 plate reader (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, US)로 측정하였다. 형광성 화합물의 발생은 열-유도된 마이얄 반응 동안에 발생한다고 개시되어 있으며[Jing 등, Food and Chemical Toxicology(2002) 40(7):1007-1015], 도 1에서 보는 바와 같이, 마이얄 반응한 WPC 및 SC의 형광도는 7일의 열처리 기간 동안 각 5.89 및 16.65 배씩 서서히 증가한 반면에 마이얄 반응을 하지 않은 WPC 및 SC의 형광도는 각 3.08 및 2.09 배씩 증가하였다. 마이얄 반응한 WPC 및 SC의 형광도 증가 비율은 6일 후에 감소하였다. 7일 후, 비-마이얄 반응 그룹과 비교하여, 마이얄 반응한 WPC 및 SC의 형광도는 각 2.01 및 9.56 배 증가하였다. 종래 연구에서는, 갈색 색소가 발생할 수 있는 전구 물질(precursors)로 여겨지는 형광이 마이얄 반응 중기 동안 특징적으로 발생한다고 개시되어 있었다[Nursten, H. E., Royal Society of Chemistry(2005)]. 다른 연구에서도 포도당-카제인 및 과당-카제인 모델에서 열 처리 시간이 증가하면서 유사한 형광 패턴이 점진적으로 증가함을 보인다는 결과가 보고되었다[Jing 등, Food and Chemical Toxicology(2002), 40(7):1007-1015]. 또한, 일부 연구에서는 MRPs 당류 화합물의 종류(source)가 형광도 및 당류-카제인 모델의 갈변 발생 패턴에 영향을 끼친다고 보고하였다[Hollnagel 등, Zeitschrift fLebensmitteluntersuchung und-Forschung A(1998), 207(1):50-54; Yeboah 등, J Agric Food Chem(1999), 47(8):3164-3172]. 본 발명에서, SC는 WPC보다 더 반응성이 높을 뿐만 아니라 WPC-유당 및 SC-유당 모델에서 유사한 형광 패턴이 관찰되었다. 마이얄 반응의 형광도 변화는 단백질의 종류 뿐만 아니라 당류 타입에 의해서도 영향을 받을 수 있는 것으로 보여진다.

< 실시예 3> 마이얄 반응 생성물의 가수분해

<3-1> 마이얄 반응 생성물의 가수분해

WPC-유당 및 SC-유당의 마이얄 반응 생성물(MRPs)에 대하여 프로타멕스, 뉴트라제, 알칼라제 및 플라보자임의 4 종류의 상용화된 효소를 각각 처리하여 가수분해시켰다. 효소/기질 비율 1:100 (wt/vol)의 가수분해 파라미터(parameter)를 사용하였고, shacking incubator에서 180 rpm으로 shacking하면서 뉴트라제, 알칼라제 및 플라보자임은 50℃로, 프로타멕스는 40℃로 반응시켰다. 각 단백질 가수분해 혼합물로부터 각각 1, 2 및 3시간 처리 후 샘플들을 빼냈고, 즉시 85℃로 5분간 가열하여 효소를 불활성화시켰다. 그 후 10kDa 비바스핀 20(Sartorius, Goettingen, Germany)을 이용하여(7000× g, 30분, 15℃), 가수분해된 MRPs를 원심분리시켜 한외여과(ultra-filtration)하였다.

<3-2> 가수분해도( Degree of Hydrolysis , DH ) 측정

가수분해도는 공지되어 있는 OPA 방법으로 측정하였다[Nielsen 등, Journal of food science(2006), 66(5):642-646]. 펩타이드 농도는 0.25 내지 1.5 mg/mL의 트립톤을 이용하여 작성한 표준 곡선으로부터 계산하였다. 실험군, 비교군(표준) 또는 대조군(탈이온수) 30μL를 각각 1 ml의 OPA 시약과 혼합한 후, 2분 동안 실온에서 반응시켰다. 그 후 Synergy H1 plate reader (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, US)로 340 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, DH 수치는 가수분해 시간에 의해 점차적으로 증가되었고, 사용된 효소(알칼라제, 뉴트라제, 프로타멕스 및 플라보자임)의 종류에 영향을 받았다. 마이얄 반응 여부와 상관없이, WPC 및 SC의 트립톤 함량은 13.36 내지 31.71 mg/mL의 범위에 있었다. 모든 그룹에서, 단백질은 대부분 한 시간 이내에 가수분해되었다. 마이얄 반응을 하지 않은 그룹과 비교해 보았을 때, 트립톤 함량은 가수분해된 MRPs 그룹에서 더 낮았으며, 이는 마이얄 반응으로 형성된 교차결합에 의해 MRPs가 효소에 의한 가수분해에 영향을 덜 받기 때문일 것이다. 3시간의 가수분해 후, 트립톤 함량은 일반적으로 WPC에서 유래된 것 보다 SC에서 유래된 것에서 더 높았다. 다른 효소 처리 시, 플라보자임-처리된 가수분해물은 나머지 효소 처리한 것보다 특이적으로 DH 수치가 높았다. 플라보자임은 엔도펩티다아제 및 엑소펩티다아제 활성을 모두 갖는 조효소(crude enzyme)이며, 이는 다른 효소 처리와 비교하였을 때 높은 트립톤 함량을 유발한다. DH 수치의 패턴은 효소 처리에 의해 다르며, 이는 엔도펩티다아제(endopeptidases) 및 엑소펩티다아제(exopeptidases)의 촉매 자리(catalytic sites)가 다른 특성(nature)이기 때문이다[Reed, Enzymes in food processing. No. Ed. 2. Academic Press, Inc.(1975)]. 플라보자임은 엔도펩티다아제 및 엑소펩티다아제 활성을 모두 갖는 조효소(crude enzyme)이며, 이는 다른 효소 처리와 비교하였을 때 더 높은 트립톤 함량을 유발한다.

<3-3> SDS - PAGE 분석

가수분해된 MRPs는 종래에 알려진 Laemmli 방법에 따라 SDS-PAGE로 분석하였다[Laemmli, U. K., nature(1970), 227(5259):680-685]. 단백질 농도는 Take3 microdrop을 첨가한 Synergy H1 plate reader (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, US)를 이용하여 정량하였다. 각 샘플을 SDS-PAGE 샘플 완충액 (pH 6.8의 62.5 mM Tris-HCl, 2% (wt/vol) SDS, 25%(vol/vol) 글리세롤, 5%(vol/vol)의 2-메르탑토에탄올(02-mercaptoethanol), 0.01% (wt/vol)의 브로모페놀 블루(bromophenol blue)으로 재용해하고, 100°C에서 5분간 변성시켰다. 단백질 샘플 20 ㎍을 10% Ready Gel Tris-HCl Gel (Bio-Rad, Hercules, CA)에 넣고, 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue) R-250 염색액(Bio-Rad, Hercules, CA)으로 염색하였다.

그 결과, 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, WPC에서 락토페린(lactoferrin), α-락토알부민(α-lactalbumin), β-락토글로불린(β-lactoglobulin) 밴드가 확인 되었으며, 고분자량의 밴드는 마이얄 반응한 WPC의 전기이동도(electrophoretogram)에서 확인되었다. 전기영동(electrophoresis)결과 MRPs 분자량은 75 내지 245 kDa 범위를 나타낸다. 상기 밴드는 3시간 알칼라제 처리한 마이얄 반응 WPC 또는 WPC에서 나타나는 것이 아니고, 이는 락토페린, α-락토알부민, β-락토글로불린이 형성된 MRPs로서 완전히 가수분해 되었을 것이라고 추측한다. 반면에, SC는 모든 효소 처리 시 거의 완벽하게 가수분해되었으며, 가장 높은 가수분해 정도가 관찰된 것은 특히 알칼라제 처리이다. 저 분자량을 가진 단백질 밴드 발현결과를 야기하는 뉴트라제에 의한 SC 가수분해는 SC 비처리와는 다르다. 게다가, 고분자량의 밴드는 마이얄반응 이후 SC에서 형성되었으며, 이것은 알칼라제에 의해 완전히 가수분해되고 다른 효소에 의해서는 부분적으로 가수분해되었다. DH (%)에 상관없이, 상기 밴드의 이질적인 패턴은 가수분해 효소가 다른 촉매 사이트 및 상이한 반응 방식을 가진다. 종래 연구에서, α-락토알부민, β-락토글로불린은 알칼라제에 의해 완전히 가수분해되었고, 오직 플라보자임에 의해서만 부분적으로 가수분해 되었음이 기재되어 있으며 이는 본 발명의 결과와 일치한다[Lin 등, International Journal of Food Science & Technology(2012)].

< 실시예 4> 마이얄 반응한 효소 가수분해물의 항산화 활성 검정

<4-1> DPPH (1,1- diphenyl -2- picrylhydrazyl ) 라디칼 소거활성 측정

MRPs 가수분해물의 라디칼 소거 활성은 공지의 방법을 약간 변형하여 측정하였다[Blois, M. S., nature(1958), 181(4617):1199-1200]. 시료 100μL를 에탄올 내의 200μM DPPH 100μL 에 첨가하였다. 위 용액을 잘 섞은 뒤, 37℃의 암(dark) 조건에서 30분간 두었다. 분광광도계를 이용하여 용액의 흡광도를 517nm 에서 측정하였다. 비교실험을 위해 아스코르브산(ascorbic acid)을 샘플 용액 대신에 첨가하고 같은 방법으로 측정하였다. DPPH 소거 퍼센트는 하기 수학식 1에 따라 산출되었다.

[수학식 1]

DPPH 라디칼 소거 활성(%) =

× 100

그 결과, 도 4 및 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, DPPH 라디칼 소거 활성은, 특히 한 시간 뒤부터, 가수분해 시간에 따라 점차적으로 증가하였다. MRPs 가수분해물의 활성은 순수한 가수분해물 보다 더 현저하게 높았다. 특히, 알칼라제를 3시간 동안 처리한 WPC 및 SC의 MRPs는 다른 효소에 비해 각 30.27 ± 0.76% 및 26.82 ± 0.64%의 가장 높은 소거 활성을 보였다. 이는 양성 대조군인 아스코르브산(100 /mL)의 82.61% 수준이었다. 종래 연구에서, 마이얄 반응의 중간 또는 최종 반응 산물은 수소 공여자(hydrogen donors)로 기능하여, 라디칼 소거 활성을 증진시키는데 기여한다고 보고되었다[Benjakul 등, Journal of food biochemistry(2005), 29(5):470-485].

<4-2> ABTS 라디칼 소거 활성 측정

ABTS (2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt) 검정으로 라디칼 양이온의 감소를 측정함으로써 가수분해된 MRPs의 항산화 활성을 측정할 수 있다[Sun 등, Food Chemistry(1975), 95(3):509-517]. MRPs 가수분해물의 ABTS 라디칼 소거 효과는 공지의 방법에 따라 평가하였다[Re 등, Free Radic Biol Med.(1999), 26(9-10):1231-1237]. 7 mM ABTS 및 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)으로 만든 ABTS 용액을 약 734 nm에서 1.4의 흡광도로 측정하기 위해 탈이온수로 희석하였다. 샘플 20 ㎕를 희석된 180 μL의 ABTS 용액에 첨가하고, 흔든 후 실온의 암 조건에서 6분 정도 두었고 흡광도를 734 nm에서 측정하였다. 아스코르빅산을 양성 대조군으로 사용하였으며 ABTS 소거 퍼센트는 하기 수학식 2에 따라 산출하였다.

[수학식 2]

ABTS 라디칼 소거 활성(%) =

× 100

그 결과, 도 6 및 도 7에서 볼 수 있는 바와 같이, MRPs의 IC₅₀ 수치가 순수한(intact) WPC 및 SC (각각 395.44 ± 38.86 및 47.19 ± 0.75 mg/mL)에서 보다 WPC 및 SC의 MRPs에서 더 현저히 낮았다(각각 106.40 ± 11.18 및 52.21 ± 1.30 mg/mL). 알칼라제에 의한 가수분해 후에, IC₅₀ 수치는 각 2.08 ± 0.25 및 1.17 ± 0.03 mg/mL로 현저히 감소하였다. 반면에, 아스코르빅산의 IC₅₀ 수치는 52.18 ± 0.03 mg/mL였고, 이는 비록 아스코르빅산과 같은 범위가 아닐지라도 마이얄 반응이 라디칼 소거 활성의 증가에 기여할 수 있다는 것을 나타낸다. 다른 종류의 효소로 1시간 동안 가수분해한 후, ABTS 라디칼 소거 활성은 크게 증가하였지만, 1, 2 및 3시간의 효소 처리로 제조된 가수분해물에 대해서는 유의미한 차이가 나타나지 않았다. 3시간의 알칼라제 처리 후에 WPC 및 SC 모두로부터 생성된 MRPs는 다른 효소와 비교하였을 때 가장 높은 ABTS 소거 활성을 나타냈다.

<4-3> FRAP ( ferric - reducing antioxidant power ) 활성 측정

MRPs 가수분해물의 환원 능력을 FRAP (ferric-reducing antioxidant power) 어세이를 이용하여 측정하였다[Benzie 등, Anal Biochem.(1996), 239(1):70-76]. FRAP 시약은, 0.3 M 아세트산나트륨 완충액(sodium acetate buffer) (pH 3.6), 40 mM HCl에 용해된 10 mM TPTZ, 및 20 mM FeCl₃·6H₂O 를 각 10:1:1의 비율로 혼합하여 준비하였다. 가수분해된 MRPs 용액 6 ㎕를 상기 준비된 FRAP 시약 180 μL와 혼합하고, 37℃에서 30분간 배양하였다. 그 후 상기 혼합물을 562 nm에서 측정하였다. 아스코르빅산을 양성 대조군으로 사용하였고, FRAP 수치는 Fe₂SO₄ 표준 곡선에 기초하여 산출하였다.

그 결과, 도 8 및 도 9에서 볼 수 있는 바와 같이, 아스코르빅산(100 ㎍/mL)은 2.04 ± 0.01 mM FeSO₄7H₂O 등가물(equivalents) 수치를 나타내었다. 각각 4개의 효소로 처리한 WPC 및 SC 가수분해물은 0.16 ± 0.02 내지 1.08 ± 0.07 mM FeSO₄7H₂O 등가물의 범위에서 폭넓은 항산화력을 나타내었다. 가장 높은 환원력을 나타낸 것은 알칼라제로 3시간 동안 처리한 WPC 및 SC 가수분해물로서, 각 1.08 ± 0.07 및 0.68 ± 0.05 mM FeSO₄7H₂O 등가물에서 관찰되었다. 마이얄 반응을 진행시키지 않은 WPC 및 SC의 수치는 각 0.37 ± 0.04 및 0.48 ± 0.11 mM FeSO₄7H₂O 등가물이었으며, 이는 마이얄 반응이 우유 단백질 가수분해물의 환원력에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타낸다. 순수한 WPC 및 SC의 FRAP 수치는 가수분해 시간이 지남에 따라 증가되지 않았지만, WPC 및 SC의 MRPs의 경우에는 시간에 따라 상당히 증가하였다. 라디칼 소거 능력은 환원력과 강하게 관련되어 있다. 상기 항산화 활성 결과는 마이얄 반응이 항산화 활성의 증가에 상당히 기여한다는 것을 보여준다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

유단백질 및 유당 시료를 인산나트륨 완충액에 넣고 50 - 60℃로 가열하는 조건에서 이루어지는 마이얄 반응을 일으키는 단계; 및 상기 마이얄 반응 생성물에 가수분해효소를 처리하는 단계를 포함하는 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 유단백질은 유청 단백질(whey protein) 또는 카제인 나트륨(sodium caseinate)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 유단백질 및 유당 시료는 완충액(buffer)에 용해되어 액체 상태로 혼합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제3항에 있어서,
상기 유단백질과 유당 시료는 1:5의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 가열은 6 - 8일간 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 가수분해효소는 프로타멕스(Protamex), 뉴트라제(Neutrase), 알칼라제(Alcalase) 및 플라보자임(Flavourzyme)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 것임을 특징으로 하는 제조방법.
제7항에 있어서,
상기 가수분해효소는 알칼라제(Alcalase)인 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 가수분해효소는 유단백질과 1:100 (wt/vol)의 비율이 되는 양만큼 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 가수분해효소 처리는 1 내지 3시간 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제10항에 있어서,
상기 가수분해효소 처리는 뉴트라제(Neutrase), 알칼라제 (Alcalase) 또는 플라보자임(Flavourzyme)의 경우 50℃에서, 프로타멕스(Protamex)의 경우 40℃에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제1항 내지 제4항 및 제6항 내지 제11항 중의 어느 한 항의 방법으로 제조된 유단백질 마이얄 반응물의 가수분해물.
제12항의 가수분해물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 효과를 나타내는 약학적 조성물.
제12항의 가수분해물 또는 이의 식품학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 건강기능식품.
제12항의 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 활성을 갖는 화장료 조성물.