WO2003005005A1 - Procede de mesure optique de prelevement biologique et appareil de mesure optique de prelevement biologique - Google Patents

Procede de mesure optique de prelevement biologique et appareil de mesure optique de prelevement biologique Download PDF

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WO2003005005A1
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biological sample
fluorescence
transmitted light
optical measurement
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Taisaku Seino
Satoshi Takahashi
Kenji Yasuda
Yoshitada Oshida
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Hitachi, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a biological sample optical measurement method and a biological sample optical measurement device for capturing a fluorescence image and a transmitted light image of a biological sample.
  • the method of detecting infection or abnormalities by reacting cells such as infectious disease viruses or cancer with fluorescently labeled antibodies or nucleic acid probes is widely used as a cytodiagnosis or infectious disease inspection method (see “Clinical Testing Extra Number” No. ⁇ Cytodiagnosis I. Prospects for the 21st Century> Vol. 44, No. 11, "Medical Shoin, Tokyo, October 2000”).
  • the fluorescent label may be non-specifically adsorbed to an object or wall other than the target, and it is necessary to detect the presence of the target virus or gene in the cell or tissue. A contrast with an image showing the structure is desired.
  • the fluorescence measurement may be affected by the dye for staining, and it is necessary to devise a method to avoid this. For example, it is possible to obtain a transmission image of cells without performing staining by using a phase difference, but it is difficult to obtain a clear contrast like a stained image. Also, it is extremely difficult to accurately compare the positions of the real cell image and the fluorescence image with manual microscope operation.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2000-310637 is a means for measuring cells, but uses a chemical luminescent substance as a label, and adjusts the field of view of a microscope to a luminescence position detected from a luminescence image. Although it is said that the stained cell structure is observed, it is difficult to determine the correspondence between the luminescent label and the cell, as described above, since each image of luminescence and staining is evaluated individually. .
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-12099 discloses that a fluorescent image generated by irradiation with a fine electron beam or the like is captured by a photoelectric conversion device while capturing a fine image of a biological sample with a tunneling scanning electron microscope, and the fine image is converted into a photoelectric image.
  • a method of superimposing image data obtained by a conversion device is disclosed.
  • since the fluorescence is detected while capturing a fine image with a tunneling scanning electron microscope there is a problem that a device configuration for obtaining a final image becomes very complicated.
  • the present invention has been devised in view of such a situation, and a biological sample optical measurement method and a biological sample optical system capable of detecting an accurate position of fluorescence or luminescence at a predetermined portion of a biological sample. It is intended to provide a measuring device.
  • the present invention that has achieved the above object includes the following.
  • a biological sample optical measurement device characterized by displaying a luminescence image and the transmitted light image in a superimposed manner.
  • the biological sample optical measurement device further comprising an optical measurement means for measuring the fluorescence or luminescence image and the transmitted light image.
  • An optical identification mark is provided, a holder for holding the biological sample is provided, and the fluorescence or luminescence image and the transmitted light image are positioned and imaged with reference to the optical identification mark of the holder.
  • the biological sample optical measurement device according to (6).
  • the optical identification mark is a plurality of ring-shaped patterns. After obtaining the center point coordinates of each ring-shaped pattern from the image data of the optical identification mark, the fluorescent mark is determined using the center point coordinates as a reference point.
  • the optical measurement means first captures the fluorescence or luminescence image, and then captures the transmission light image after performing a staining process on a biological sample for transmission light image measurement.
  • the biological sample optical measurement device according to (7).
  • the biological sample optical measurement device according to (6), further including a staining processing unit for performing a staining process on the biological sample.
  • a fluorescent or luminescent image is obtained from a biological sample to which a fluorescent substance or a luminescent substance is bound, and a transmitted light image is obtained from the biological sample that has been stained.
  • the biological sample optical measurement device according to (6).
  • a fluorescence or emission detection unit for detecting fluorescence or emission emitted from a biological sample, and irradiating the biological sample with light and detecting transmitted light transmitted through the biological sample by the irradiation of the light.
  • a transmitted light detection unit ; an image storage unit for storing each image data of the fluorescence or emission image measured by the fluorescence or emission measurement unit and the transmitted light image measured by the transmission light detection unit; and an image storage unit
  • An image data calculation unit for calculating the image data of the obtained fluorescence or luminescence image and the image data of the transmitted light image, and the image data calculation unit calculates the image data of the fluorescence or luminescence image and the image data of the transmitted light image
  • a biological sample optical measurement device comprising: an image display unit for displaying the fluorescence or emission image and the transmitted light image in a superimposed manner.
  • the fluorescence or emission detection unit irradiates the biological sample with the optical beam while scanning the same, and detects the fluorescence excited from the biological sample by the irradiation of the optical beam.
  • the fluorescence or luminescence detecting section detects luminescence generated by performing luminescence processing on the biological sample, wherein the biological sample optical measurement according to (14) is characterized in that:
  • the fluorescence or emission detection unit inputs the fluorescence excited from the biological sample as two-dimensional image information, and the transmitted light detection unit receives the two-dimensional image information input to the fluorescence or emission detection unit.
  • FIG. 1 is a main part configuration diagram showing a biological sample optical measurement device to which the present invention is applied.
  • FIG. 2A is a top view of a main part of the biological sample holding unit.
  • FIG. 2B is a top view of a main part of another biological sample holding unit.
  • FIG. 2C is a top view of a main part of still another biological sample holding unit.
  • FIG. 3A is a conceptual diagram for explaining the alignment, and is a conceptual diagram showing a transmitted light image of the identification mark.
  • Figure 3 (b) is a conceptual diagram for explaining the alignment, and is a digitized transparent image.
  • FIG. 4 is a conceptual diagram showing a light-exposed image.
  • FIG. 3 (c) is a conceptual diagram for explaining the alignment, and is a characteristic diagram showing the intensity distribution on the “row” side.
  • FIG. 3 (d) is a conceptual diagram for explaining the alignment, and is a characteristic diagram showing the intensity distribution on the “co lumn” side.
  • FIG. 4 (a) is a conceptual diagram for explaining a process of synthesizing a fluorescence image and a transmitted light image, and is a conceptual diagram showing cells to be measured.
  • FIG. 4 (b) is a conceptual diagram for explaining the process of synthesizing the fluorescent light image and the transmitted light image, and is a conceptual diagram showing the fluorescent light image.
  • FIG. 4 (c) is a conceptual diagram for explaining the process of synthesizing the fluorescence image and the transmitted light image, and is a conceptual diagram showing the transmitted light image.
  • FIG. 4D is a conceptual diagram for explaining the process of synthesizing the fluorescent light image and the transmitted light image, and is a conceptual diagram showing an example of the synthesized image.
  • FIG. 4 (e) is a conceptual diagram for explaining the process of synthesizing the fluorescence image and the transmitted light image, and is a conceptual diagram showing another example of the synthesized image.
  • FIG. 4 (f) is a conceptual diagram for explaining the process of synthesizing the fluorescence image and the transmitted light image, and is a conceptual diagram showing still another example of the synthesized image.
  • FIG. 5 is a main part configuration diagram showing another biological sample optical measurement device to which the present invention is applied.
  • FIG. 6 is a main part configuration diagram showing another biological sample optical measurement device to which the present invention is applied.
  • FIG. 7 is a perspective view of a main part showing a sample staining section of the biological sample optical measurement device shown in FIG.
  • Transmitted light image storage unit 14 ... Image buffer, 15 ... Image data Data calculation unit, 16: Image display unit, 17: Mercury lamp, 18: Bandpass filter, 19: Two-dimensional monochromatic image sensor, 20: Biological sample holder with identification mark, 21 ...
  • FIG. 1 shows a biological sample optical measurement apparatus to which the present invention is applied.
  • the biological sample optical measurement device includes a biological sample holding unit 2 holding a sample 1 and a biological sample holding unit driving system 3 for driving the biological sample holding unit 2 to a desired position.
  • the biological sample optical measurement device determines whether the specimen 1 is infected with a virus, for example, HPV, HCV, HIV, etc., and identifies the site of the virus infection.
  • Specimen 1 includes biological tissue sections, cultured cells, or smears to be examined, and shall be subjected to probe DNA hybridization.
  • the probe DNA contains a base sequence that can hybridize to the virus-derived DNA to be discriminated, and has a fluorescent label attached thereto.
  • the fluorescent labeling substance is not particularly limited.
  • a substance which emits fluorescence having a longer wavelength than the wavelength of the excitation laser when irradiated with an excitation laser having a predetermined wavelength can be used.
  • the fluorescent labeling substance include Cy-2, Cy-3, Cy-5, and Cy-7, which are phosphors manufactured by Amersham Pharmacia Biotech.
  • a chemical or bioluminescent substance may be bound to the probe DNA instead of the fluorescent labeling substance.
  • Chemical or bioluminescent substances include alkaline phosphatase, luciferase, luciferin, ⁇ Luoxidase, luminol and the like can be used.
  • the biological sample holder driving system 3 includes a support guide 3-1 for supporting the biological sample holder 2 and a stage 3-2 for rotating the biological sample holder 2 in an in-plane direction ( ⁇ axis).
  • the X-axis fine movement stage 3-3 for moving the biological sample holder 2 in a predetermined direction (X axis) in the plane, and the biological sample holder 2 in the direction (Y axis) orthogonal to the X axis in the plane.
  • the biological sample holder drive system 3 includes the ⁇ -axis adjustment stage 3-2, the X-axis fine movement stage 3-3, the Y-axis fine movement stage 3-4, and the X-axis coarse movement stage 3-5. It has a drive control unit 3-6 that controls the drive of the motor.
  • the drive controller 3-6 controls the driving of the X-axis fine movement stage 3-3 and the Y-axis fine movement stage 3-4, so that the biological sample holder 2 holding the specimen 1 can be scanned in a desired direction. Can be.
  • the biological sample optical measurement device consists of a fluorescence excitation laser light source 4 for measuring the fluorescence image of the specimen 1 held in the biological sample holder 2, an excitation light optical system 5, a long-pass filter 6, a fluorescent optical system 7, and a fluorescence detector. Part 8 is provided.
  • the fluorescence excitation laser light source 4 includes, for example, a semiconductor laser device, a YAG laser device, a He—Ne laser device, an Ar laser device, or the like, and can emit an excitation laser having a predetermined wavelength.
  • a laser light source that emits an excitation laser having a desired wavelength is selected according to the type of the fluorescent labeling substance bound to the probe DNA.
  • the fluorescence excitation laser light source 4 may be a laser device that emits a laser having a plurality of wavelengths corresponding to each fluorescent labeling substance, or each fluorescent labeling substance. A plurality of laser devices that emit lasers of wavelengths corresponding to the wavelengths are used.
  • the excitation light optical system 5 has a lens or the like, and can focus the excitation laser emitted from the fluorescence excitation laser light source 4 on the specimen 1.
  • the long-pass filter 6 can transmit only a wavelength component exceeding a predetermined wavelength.
  • the fluorescent optical system 7 has a condenser lens, and can collect the fluorescent light transmitted through the long-pass filter 6.
  • the fluorescence detection unit 8 has, for example, a photomultiplier tube or an optical sensor such as a CCD, detects the fluorescence collected by the fluorescence optical system 7, and converts the fluorescence intensity of the detected fluorescence into digital data.
  • the biological sample optical measurement device includes a transmitted light source 9, a transmitted light optical system 10, and a two-dimensional color image sensor 11 for measuring a transmitted light image of the specimen 1 held in the biological sample holding unit 2.
  • the transmitted light source 9 is, for example, a halogen lamp, and can emit transmitted light that passes through the specimen 1.
  • the transmitted light optical system 10 has a lens or the like, and can collect transmitted light transmitted through the specimen 1.
  • the two-dimensional color image sensor 11 detects the transmitted light condensed by the transmitted light optical system 10 and converts a color image of the detected transmitted light into image data of R, G, and B colors.
  • the biological sample optical measurement device includes a fluorescence image storage unit 12 for storing digital data relating to a fluorescence image obtained by the fluorescence detection unit 8 and a transmitted light image storage for storing image data obtained by the two-dimensional color image sensor 11.
  • Unit 13 an image buffer 14 for reading and storing digital data and image data stored in the fluorescent image storage unit 12 and the transmitted light image storage unit 13, and a digital data and image data stored in the image buffer 14.
  • An image data calculation unit 15 that calculates display data by combining data from the display image data synthesized by the image data calculation unit 15 and stored in the image buffer.
  • an image display unit 16 for displaying.
  • the biological sample holding unit 2 has a measurement target region R and an identification mark for accurately positioning the biological sample optical measurement device.
  • . 2 (a) to 2 (c) show variations of the biological sample holding unit 2, respectively.
  • the biological sample holder 2 shown in FIG. 2 (a) includes a substrate, a measurement target region R arranged substantially at the center of the substrate, and a pair of identification marks arranged so as to sandwich the measurement target region R. It is composed of la and lb.
  • the substrate is made of, for example, a quartz glass plate having a thickness of 0.5 to 5 mm or a material in which at least the measurement target region R is transparent to the above-described excitation laser.
  • the identification marks u la and u lb each have a concentric shape with a diameter of 5 to 100 zm, and are formed by forming a ring portion by etching the substrate and then printing a fluorescent agent inside the ring portion. Is done. By forming the identification marks l-la and lb in this way, it is possible to recognize from both the fluorescence detecting unit 8 and the two-dimensional color T image sensor 11.
  • the biological sample holder 2 shown in Fig. 2 (b) is, for example, a commercially available slide glass.
  • information on the specimen is recorded by a bar code 3 and two identification marks la and lb are provided on a tag seal 2 on which the bar code 3 is printed. That is, the biological sample holder 2 shown in FIG. 2 (b) is formed by attaching the tag shield 2 to a position other than the measurement target region R on a commercially available slide glass or the like.
  • the biological sample holding unit 2 shown in FIG. 2 (c) has a substrate, a measurement target region R arranged substantially at the center of the substrate, and four identifications arranged at four corners of the measurement target region R. It consists of separate la, ulb, l-lc and uId. That is, in the biological sample holder 2 shown in FIG. 2 (c), the region surrounded by connecting the four identification marks 1-la, 1-lb, tolc, and toId in this order is the measurement target area R. It has become.
  • the alignment of the biological sample holder 2 shown in FIGS. 2 (a) to 2 (c) is performed in the following procedure based on the identification mark la, 1-lb (1-lc, 1-ld).
  • the identification mark 1-la is moved so as to be within the measurement range of the transmitted light image, and the transmitted light image of the identification mark la is measured (Fig. 3 (a)).
  • the distance between the origin position of the X-axis fine movement stage 3-3 and the Y-axis fine movement stage 3-4 obtained from the drive control unit 3-6 and the center position of the identification mark 1a is obtained.
  • the obtained transmitted light image of the identification mark la is digitized to obtain a digital image of the mxn matrix-like pixels of the identification mark la (FIG. 3 (b)).
  • the intensity distribution on the “row” side in the obtained digital image is obtained (Fig. 3 (c)). That is, in the graph showing the relationship between the signal strength and the X coordinate shown in Fig. 3 (c), W is set so that the interval between the maximum values of the signal strength is maximum, and the X coordinate that is W / 2 is identified.
  • the intensity distribution on the “column” side in the obtained digital image is obtained (Fig.
  • the center point (Ya-center) of the discrimination mark la in the Y-axis direction is obtained.
  • the center point is obtained as coordinates (Xa-center, Ya-center).
  • the center coordinates (Xa-center, Ya-center) of the obtained identification mark 1-la are set as the origin in image measurement described later.
  • the center coordinates of the identification mark la are recorded in the drive control section 3-6.
  • the X-axis fine movement stage 3-3 and the Y-axis fine movement stage 3-4 are driven, the transmitted light image of the identification mark 1-lb is measured, and the center coordinates of the identification mark lb are obtained.
  • the center coordinates of the identification mark 1-lb can be obtained as (Xb-center, Yb-center), similarly to the identification mark la described above.
  • the 0-axis adjustment stage 3-2 is driven so that the straight line connecting the identification mark la and the center point of 1-lb is parallel to the X axis.
  • the 0-axis adjustment stage 3-2 is driven so that the angle ⁇ between the straight line connecting the center points of the identification marks la and 1-lb and the X-axis becomes zero.
  • the origin of the biological sample holding unit 2 as the center coordinates of the identification mark tra, imaging of a transmitted light image and imaging of a fluorescence image are performed. As described above, the origin used for capturing the transmitted light image and the fluorescent image can be obtained.
  • the identification marks tra and 1-lb can be confirmed with high accuracy and in a short time at the time of alignment.
  • the biological sample holding unit 2 shown in FIG. 2 (b) can use a commercially available slide glass as a consumable, cost can be reduced.
  • the biological sample holder 2 shown in Fig. 2 (c) has discriminating devices la, 1-lb, 1-lc, and 1-Id at the four corners of the measurement target area R, respectively. At the same time as the above-described alignment, the measurement target region R can be recognized with high accuracy and speed. Further, even if the biological sample holder 2 has a different shape, the measurement target region R can be easily confirmed.
  • the biological sample holder is not limited to those shown in FIGS. 2 (a) to 2 (c), but may be used for positioning using the end surface of the biological sample holder 2 as a reference plane, or for fixing the specimen 1. At this time, remarking may be performed with fluorescent beads or the like at an arbitrary location in the vicinity of the measurement target region R, and this may be set as the origin. In such a case, the biological sample holder 2 should perform image measurement alignment without performing special processing in advance. Can be.
  • the fluorescence image and the transmitted light image of the specimen 1 are captured as follows using the biological sample optical measurement device in which the biological sample holding unit 2 is aligned.
  • Cy-5 (R) manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd. was bound as a fluorescent label to a DNA probe having a nucleotide sequence that hybridizes to the virus derived from virus, and the virus against cells was used using the DNA probe. Judgment of infection and identification of infection site.
  • a fluorescence image of the specimen 1 is captured.
  • the specimen 1 is irradiated with an excitation laser from the laser light source 4.
  • an excitation laser from the laser light source 4.
  • Cy-5 (R) manufactured by Amersham Pharmacia Biotech Co., Ltd. is used as the fluorescent label
  • a semiconductor laser that emits a laser for exciting fluorescence at a wavelength of 635 nm is used as the laser light source 4.
  • fluorescence having a wavelength of 670 nm or more is observed in the cells.
  • the fluorescence observed in the cells can pass through the long-pass filter 6, is collected via the fluorescence optical system 7, and enters the fluorescence detection unit 8.
  • the fluorescence excitation laser is shielded by the long-pass filter 6 and does not enter the fluorescence detector 8.
  • fluorescence of the specimen 1 can be detected.
  • the detected fluorescence intensity is converted into, for example, 16-bit digital data and stored in the fluorescence image storage unit 12.
  • the excitation laser is focused by the excitation light optical system 5 to have a spot diameter of 10 m or less.
  • the excitation laser is applied to the specimen 1 from the back surface of the biological sample holder 2, and the biological sample holder 2 is moved by the biological sample holder drive system 3, whereby the laser excitation part for excitation is irradiated.
  • Fluorescence is detected by the fluorescence detector 8 while scanning.
  • the fluorescence detection unit 8 can obtain a fluorescence image with a resolution of lOtm.
  • sample 1 since sample 1 has been subjected to hybridization treatment with probe DNA corresponding to the virus to be tested, it is determined whether or not the sample 1 is infected with the target virus by examining the presence or absence of fluorescence in sample 1.
  • Primary screening can be performed. When fluorescence is observed in the specimen 1 by this primary screening, the position is stored in the drive control unit 3-6, and the position is determined in the transmitted light image measurement described later. In this case, the reference measurement position is used.
  • the intensity of irradiation light on the fluorescent labeling substance can be increased, and as a result, the amount of fluorescence emitted by the fluorescent labeling substance can be increased. And the fluorescence detection sensitivity can be improved.
  • a fluorescent excitation laser light source 4 that can emit excitation lasers of different wavelengths is used.
  • a plurality of fluorescences observed in the specimen 1 can be detected, and a fluorescence image of the plurality of fluorescences can be obtained.
  • the transmitted light image is measured for the specimen 1 in which the presence of the fluorescent labeling substance is confirmed by the fluorescent image.
  • the specimen 1 after the fluorescence image measurement is separated from the biological sample optical measurement device together with the biological sample holding unit 2 and subjected to a staining process so that the cell structure contained in the specimen 1 can be observed. Is preferred.
  • the biological sample holder 2 is attached to the biological sample holder drive system 3.
  • the 0-axis adjustment is performed in the same manner as the alignment of the biological sample holder 2 described with reference to FIG.
  • the stage 3-2 is driven to correct the angle 0 between the straight line connecting the center points of the identification marks u la and lb to the X axis so that it becomes 0, and the center coordinates of the identification mark u la, that is, the origin To match.
  • the X-axis fine movement stage 3 is moved so that the center of the identification mark 1-la observed by the two-dimensional image sensor 11 coincides with the center coordinates of the identification mark 1-la recorded in the drive control unit 3-6.
  • -3 and Y-axis fine movement stage 3-4 are driven.
  • a transmitted light image of the specimen 1 is captured.
  • the coarse movement stage 3-5 in the X-axis direction is driven, and the biological sample is held so that the position (reference measurement position) where the fluorescence was observed at the time of capturing the fluorescence image is at least within the field of view.
  • Move part two The transmitted light image is captured by emitting a continuous spectrum in the visible light region from the transmitted light source 9 and detecting the transmitted light of the specimen 1 by the two-dimensional color image sensor 11.
  • the transmitted light image detected by the two-dimensional color image sensor 11 is stored in the transmitted light image storage unit 13 as image data for each of R, G, and B colors of 8 bits.
  • a transmitted light image can be captured with high resolution. For example,
  • the two-dimensional color image sensor 11 is composed of a CCD with a size of 1000 x 1000 pixels and a size of 12 mm each, and the magnification of the transmitted light optical system 10 is 30 times, the minimum for a 0.4 mm square area is 0.
  • a transmitted light image can be obtained with 4 m pixels.
  • the optical resolution determined by the transmitted light optical system 10 is 0.4 ⁇ or less.
  • the resolution that is, the size of the pixel, becomes ⁇ .
  • the transmitted light image has a resolution of about ⁇ in general, and a cell nucleus of about 2 m, so the transmitted light image must be able to resolve at least the cell nucleus. , 0.1 to 1 m.
  • the resolution of the fluorescence image can be determined by determining whether the fluorescence of the fluorescent labeling substance bound to the probe DNA is inside or outside the nucleus of the cell nucleus, or inside or outside the cell. May be lower than the resolution.
  • the resolution of the transmitted light image is preferably 2 to 20 times the resolution of the fluorescent light image.
  • the fluorescent light image recorded in the fluorescent light image storage unit 12 and the transmitted light image recorded in the transmitted light image storage unit 13 are superimposed on each other and displayed on the image display unit 16.
  • the fluorescent light image is read out from the fluorescent light image storage unit 12 and stored in the image buffer 14
  • the transmitted light image is read out from the transmitted light image storage unit 12 and stored in the image buffer 14.
  • the fluorescence image and the transmitted light image stored in the image buffer 14 are combined by the image data calculation unit 15 to create display screen data.
  • association means, for example, that the mutual position of the fluorescence image and the transmitted light image is virtually adjusted or controlled based on the position information of the biological sample or the biological sample holding unit 2 that holds the biological sample.
  • the image buffer 14 is composed of 8 bits for each color of R, G, and B each corresponding to a pixel of the transmitted light image.
  • the image data of a single color 16 bits of the fluorescent light image is converted by the image data calculation unit 15 so as to be mapped to data of 24 bits gradation.
  • the display screen data is obtained by the image data calculation unit 15 performing a logical OR operation of the corresponding 24-bit pixel data of the fluorescence image and the transmitted light image in the image buffer 14.
  • the obtained display image data is stored again in the image buffer 14.
  • FIG. 4 (d) shows the case where the fluorescence of the fluorescent labeling substance is not detected, suggesting that there is no virus-derived DNA to be detected.
  • FIG. 4 (e) shows the case where the fluorescence of the fluorescent labeling substance was detected in the cytoplasm, suggesting that the virus-derived DNA to be detected is present in the cytoplasm.
  • FIG. 4 (f) shows the case where the fluorescence of the fluorescent labeling substance was detected in the nucleus, suggesting that the virus-derived DNA to be detected exists in the nucleus.
  • more information can be obtained from the display image by combining and displaying the transmitted light image and the fluorescent image in the determination of positive / negative by detecting the fluorescence of the fluorescent labeling substance. it can. Specifically, it is possible to not only determine positive / negative based on the detection of fluorescence, but also to identify a fluorescent site in detail.
  • the transmitted light image is captured at a higher resolution than the fluorescence image. In this case, the site emitting fluorescence can be identified in more detail.
  • the transmission light image is captured after capturing the fluorescence image, and the transmission light image is captured so as to include at least a part where the fluorescence is detected.
  • the excitation laser is applied to the specimen 1 to detect the fluorescence from the fluorescent labeling substance. For this reason, the irradiation light intensity density for the sample 1 can be increased, and the fluorescence of the fluorescent labeling substance can be detected with high sensitivity. Therefore, in this example, the probability of finding cells having MA from the virus to be detected can be increased.
  • the X-axis fine movement stage 3-3 and the Y-axis fine movement stage 3-4 are used to capture the fluorescence image and the transmitted light image.
  • the X-axis coarse movement stage 3-5 is used when switching between imaging and scanning. For this reason, according to the biological sample optical measurement device, the precise alignment and the switching can be performed quickly and with high accuracy.
  • the present invention is not limited to the biological sample optical measuring device as described above, and may be a biological sample optical measuring device as shown in FIG.
  • the biological sample optical measurement device shown in FIG. 5 includes a mercury lamp 17 that emits diffused light that excites a fluorescently labeled substance, and a wavelength component that overlaps with the fluorescence emitted by the fluorescently labeled substance among the wavelengths included in the diffused light.
  • a band-pass filter 18 to be removed and a two-dimensional monochromatic image sensor 19 such as a CCD for detecting fluorescence from the fluorescent labeling substance excited in the sample 1 are provided.
  • a mercury lamp 17 was used to emit diffused light.
  • the present invention is not limited to this.
  • any device capable of emitting diffused light such as a xenon lamp or a mercury-xenon lamp, may be used.
  • a light source can be used as appropriate.
  • Cy-5 (R) when the above-described Cy-5 (R) is used, a bandpass filter 18 that cuts a wavelength component other than 600 to 650 nm is used.
  • the biological sample optical measurement device described in this example has the same configuration as the biological sample optical measurement device shown in FIG. 1 except for these configurations.
  • the diffused light transmitted through the bandpass filter 18 is applied to the specimen 1 when capturing a fluorescence image.
  • the two-dimensional monochrome image sensor 19 detects the fluorescence in a predetermined area in the biological sample holding unit 2.
  • the fluorescent image detected by the two-dimensional monochromatic image sensor 19 is stored in the fluorescent image storage unit 12. '
  • this biological sample optical measurement device irradiates the sample 1 with diffused light and detects fluorescence using the two-dimensional monochromatic image sensor 19.
  • Driving unit drive system 3 to scan diffused light No need. Therefore, the biological sample optical measurement device shown in FIG. 5 can detect the fluorescence of the specimen 1 in a very short time.
  • this biological sample optical measurement device can use any fluorescent labeling substance.
  • the biological sample optical measurement device can transmit only a desired wavelength out of the wavelengths contained in the diffused light emitted from the mercury lamp 17 by simply replacing the bandpass filter 18, Even fluorescent labeling substances can be excited.
  • this biological sample optical measurement device when measuring fluorescence in the specimen 1 using a plurality of fluorescent labeling substances having different excitation wavelengths, a plurality of bandpass filters 18 are sequentially used in accordance with the excitation wavelengths. Thereby, fluorescence from a plurality of fluorescent labeling substances can be sequentially detected.
  • viruses e.g. HPV
  • Hybridization treatment can also be performed on sample 1 using the probe DNA.
  • a plurality of types of bandpass filters 18 are prepared according to the three types of fluorescent labeling substances, and the plurality of bandpass filters 18 are switched as needed during the measurement, so that the fluorescence images of multiple wavelengths in the specimen 1 are individually separated. Can be measured.
  • the type of virus that has infected the sample 1 can be determined, and the site of infection with three types of viruses can be identified.
  • the number of pixels of the two-dimensional monochromatic image sensor 19 is set to 1000 ⁇ 1000
  • the magnification of the fluorescent optical system 7 is set to 10
  • the fluorescence image can be captured with a pixel size of 10 m by performing the image measurement of the measurement target area R in two steps while moving the fine movement stage 3-3 while using the reduction optical system.
  • the transmission light image can be captured, and the fluorescence image and the transmitted light image can be combined and displayed in the same manner as in the biological sample optical measurement device shown in FIG. Special
  • the fluorescence is excited by the mercury lamp 17 as the diffusion light source and the fluorescence is detected by the two-dimensional image sensor 19, so that the fluorescent image of a wide area of the specimen 1 can be captured in a short time.
  • This method has the effect of improving the primary screening throughput when the number of samples 1 is large.
  • a fluorescent labeling substance was bound to the probe DNA and a fluorescent image of the specimen 1 was taken.
  • a bioluminescent substance may be bound.
  • the biological sample optical measurement device since the luminescence reaction of the chemical or bioluminescent substance is performed in a solution, it is preferable to provide the biological sample optical measurement device with a reagent dropping unit for dropping the reagent onto the sample 1. In this case, it is preferable to flatten the surface of the liquid dropped onto the specimen 1 with a cover glass or the like during the measurement of the luminescence image to prevent the focus from being shifted.
  • the luminescence image detection system is arranged so as to measure the luminescence image from the lower part of the biological sample holder 2, it is not necessary to flatten the liquid surface with a cover glass or the like.
  • the biological sample holder 2 needs to be transparent to the emission of a chemical or bioluminescent substance.
  • a chemical or bioluminescent substance is used instead of a fluorescent label, a laser light source for fluorescence excitation to excite the fluorescent label 4, an excitation light optical system 5, a long-pass filter 6, a band-pass filter 18, etc. There is no need to arrange.
  • the biological sample optical measurement apparatus to which the present invention is applied includes a sample staining section 21 for performing a staining process on the specimen 1 before capturing a transmitted light image. It may be something.
  • the specimen 1 is held in the biological sample holding unit 20 with the identification mark.
  • the sample staining section 21 includes a staining processing section including a staining liquid spraying section 22 and a staining liquid collecting section 23, and a washing liquid spraying section 24 and a washing liquid collecting section 25.
  • a cleaning unit the biological sample optical measurement device includes movement control means (not shown) for moving the biological sample holding unit 20 with the identification mark in the direction indicated by arrow A in FIG.
  • the staining liquid spraying section 22 is formed of a cylindrical member having a plurality of spray ports formed on a side facing the staining liquid collecting section 23. Multiple spray ports have identification marks by movement control means When the biological sample holder 20 is moved, a staining solution or the like can be sprayed on at least the entire specimen 1.
  • the cleaning liquid spray unit 24 is formed of a cylindrical member having a plurality of spray ports formed on a side facing the cleaning liquid recovery unit 25. The plurality of spray ports are provided so that a washing liquid or the like can be sprayed on at least the entire sample 1 when the movement control means moves the biological sample holding section 20 with the identification mark.
  • Each of the staining liquid collecting section 23 and the washing liquid collecting section 25 is composed of a waste liquid port formed at the lowest part and a slope inclined downward toward the waste liquid port. Further, between the staining liquid collecting section 23 and the washing liquid collecting section 25, a ridge is formed to prevent mixing of the staining liquid and the washing liquid.
  • the staining liquid spraying section 22 is connected to a staining liquid container group 26 via a staining liquid piping system 36.
  • the staining liquid piping system 36 has one end connected to the staining liquid spraying section 22 and the other end connected to the waste liquid port of the staining liquid collecting section 23.
  • a dye supply pipe 32 and a solenoid valve 29 are provided in a dye solution piping system 36 between the dye spray part 22 and the dye solution group 26.
  • a staining solution supply pump 33 and solenoid valves 28 (28-1, 28-2, 28-3 and 28-4) are provided in the staining solution piping system 36 between the staining solution collection section 23 and the staining solution solution 26. Are arranged.
  • the cleaning liquid spraying section 24 is similarly connected to the cleaning liquid container group 27 via a cleaning liquid piping system 37.
  • the waste liquid port of the cleaning liquid recovery unit 25 is connected to a cleaning liquid waste liquid container 38 via a cleaning liquid piping system 37.
  • a cleaning liquid supply pump 34 and a solenoid valve 31 are provided in a cleaning liquid piping system 37 between the cleaning liquid spraying section 24 and the cleaning liquid container group 27.
  • a cleaning liquid supply pump 35 and solenoid valves 30 (30-1, 30-2, 30-3, and 30-4) are provided in a cleaning liquid piping system 37 between the cleaning liquid recovery section 25 and the cleaning liquid waste liquid container 38. ing.
  • the staining solution container group 26 includes a staining solution A container 26-1, a staining solution B container 26-2, a clearing solution container 26-3, and a pipe washing solution container 26-4. . That is, the staining solution container group 26 includes a plurality of containers separately storing reagents necessary for a staining process for capturing a transmitted light image of the specimen 1 and a washing solution for washing the staining solution piping system 36. I have.
  • the staining solution A container 26-1, the staining solution B container 26-2, the clearing solution container 26-3, and the piping washing solution container 26-4 were respectively disposed in the middle of the staining solution piping system 36.
  • the continuity with the staining solution piping system 36 is controlled by the solenoid valves 28-1, 28-2, 28-3 and 28-4.
  • the cleaning liquid container group 27 includes a cleaning liquid container 27-1 and a separation liquid container. 27-2, affinity liquid A container 27-3 and affinity liquid B container 27-4. That is, the washing liquid container group 27 includes a plurality of containers in which reagents and the like necessary for the washing, sorting, and affinity treatments performed after the completion of the staining process are separately stored.
  • the cleaning solution container 27-1, the separation solution container 27-2, the affinity solution A container 27-3, and the affinity solution B container 27-4 are each provided in the middle of the washing solution piping system 37.
  • the continuity with the cleaning liquid piping system 37 is controlled by valves 30-1, 30-2, 30-3 and 30-4.
  • the continuity of the cleaning liquid waste liquid container 38 with the cleaning liquid waste liquid container 38 is controlled by the solenoid valve 31.
  • a staining process is performed on the specimen 1 before capturing a transmitted light image.
  • hematoxylin and eosin double staining is used as an example of the staining process.
  • the nuclei in the cells are mainly stained blue-violet with hematoxylin, and the cytoplasm, interstitium and fibrin are stained red or dark brown with eosin.
  • this staining method general information in cells can be obtained as a transmitted light image without excess or deficiency. Therefore, this staining method is a cell staining method frequently used in pathological diagnosis. By using this staining method, highly accurate transmitted light images can be obtained, and highly accurate diagnosis of the presence or absence of infection and the identification of the infected site can be made in the diagnosis of virus infection.
  • the biological sample holding unit 2 is moved in a direction indicated by an arrow A in FIG. 6 by a movement control means (not shown), and the biological sample holding unit 2 is transported to the staining processing unit in the sample staining unit 21. .
  • hematoxylin solution supplied from the staining solution A container 26-1 to the sample 1 is sprayed from the staining solution spraying section 22 for about 4 minutes to stain.
  • the dye supply pump 32 and the dye recovery pump 33 are operated while only the solenoid valves 28-1 and 29-1 are opened.
  • the recovered hematoxylin solution is transferred to the staining solution A container 26-1 and circulated for reuse.
  • the biological sample holding unit 2 is moved to the washing processing unit by a movement control means (not shown), and distilled water supplied from the washing liquid container 26-1 to the sample 1 is supplied from the washing liquid spraying unit 24 for about 5 minutes. Wash with water.
  • the cleaning liquid supply pump 34 and the cleaning liquid recovery pump 35 are operated while only the solenoid valves 30-1 and 31 are opened. As a result, it is possible to supply only distilled water without mixing other solutions and the like that have entered the cleaning liquid container 26-1, and to supply the supplied distilled water to the cleaning liquid waste liquid container 38 through the cleaning liquid recovery unit 25. Can be recovered.
  • the cleaning liquid supply pump 34 and the cleaning liquid recovery pump 35 are operated while the solenoid valves 28-1 and 29-1 are closed and the solenoid valves 28-4 and 29-4 are opened. Let it.
  • distilled water can be supplied from the pipe washing liquid container 26-4 into the staining liquid spraying section 22 and the staining liquid piping system 36, and the hematoxylin solution in the staining liquid spraying section 22 and the staining liquid piping system 36 can be supplied. Can be removed.
  • the distilled water supplied to the staining liquid spraying section 22 and the staining liquid piping system 36 is collected in the staining liquid collecting section 23.
  • a 0.2% hydrochloric acid / 70% alcohol mixed solution supplied from the separation liquid container 27-2 to the sample 1 is supplied from the cleaning liquid spraying section 24 to perform a separation process.
  • the solenoid valves 28-2 and 29-2 are opened, and the cleaning liquid supply pump 34 and the cleaning liquid recovery pump 35 are operated.
  • washing with distilled water is performed again in the washing treatment section in the same manner as the washing described above.
  • the sample 1 is sprayed with a 95% alcohol solution supplied from the affinity solution A container 27-3 to perform the affinity treatment.
  • the solenoid valves 28-3 and 29-3 are opened, and the cleaning liquid supply pump 34 and the cleaning liquid recovery pump 35 are operated. By performing this fractionation process, the staining process with hematoxylin is completed.
  • the step of staining with eosin solution is performed.
  • the biological sample holding unit 2 is moved to the staining processing unit by a movement control means (not shown), and the eosin 'floxin B solution supplied from the staining solution B container 26-2 is sprayed for 7 minutes. And stain.
  • a movement control means not shown
  • the eosin 'floxin B solution supplied from the staining solution B container 26-2 is sprayed for 7 minutes.
  • stain When spraying the eosin / phloxin B solution, operate the dye supply pump 32 and the dye recovery pump 33 while keeping only the solenoid valves 28-2 and 29-2 open. As a result, only the eosin 'Phloxine B solution is sprayed without mixing other staining solutions etc.
  • the containers other than the staining solution B container 26-2 can be atomized and the sprayed eosin / phloxin B solution can be collected in the staining solution collecting section 23.
  • the recovered eosin 'floxin B solution is transferred to the staining solution B container 26-2, circulated and reused.
  • the biological sample holding unit 2 is moved to the washing processing unit by a movement control means (not shown), and the specimen 1 is washed with water as in the case of the staining step with the hematoxylin solution, and the staining solution spraying unit 22 is used. And remove the eosin 'phloxine B solution in the staining solution piping system 36.
  • the sample 1 is first subjected to a separation / dehydration treatment by spraying (95% alcohol) and then pure alcohol supplied from the affinity liquid B container 27-4.
  • a separation / dehydration treatment by spraying (95% alcohol) and then pure alcohol supplied from the affinity liquid B container 27-4.
  • the solenoid valves 28-4 and 29-4 are opened, and the cleaning liquid supply pump 34 and the cleaning liquid recovery pump 35 are operated.
  • the biological sample holding unit 2 is moved to the staining processing unit by movement control means (not shown), and the sample 1 is sprayed with xylol supplied from the clearing liquid container 26-3 to perform the clearing process.
  • the dye supply pump 32 and the dye recovery pump 33 are operated while only the solenoid valves 28-3 and 29-3 are opened.
  • the xylol in the staining solution spraying section 22 and the staining solution piping system 36 is removed in the same manner as in the above-described water washing.
  • the biological sample holding unit 20 with the identification mark is transported and fixed in the direction opposite to the arrow A in FIG. 6, and the transmitted light image of the sample 1 is captured.
  • the imaging of the transmitted light image can be performed in the same manner as in the above-described example.
  • the staining process can be performed by the biological sample optical measurement device, it is possible to measure the transmitted light image after the staining process in a short time after capturing the fluorescent image.
  • the biological sample optical measurement device of the present example a large amount of the sample 1 can be processed in a short time, for example, in a virus test or the like, which is effective in improving the throughput.
  • the amount of the staining solution used in the examination of a large amount of the sample 1 can be suppressed by circulating and reusing the staining solution.
  • the hematoxylin solution used in this example has the following composition. Hematoxylin 5g
  • the eosin / phloxin B solution used in this example has the following composition.
  • the fluorescence or luminescence image of the biological sample and the transmitted light image are displayed in a superimposed manner. An accurate position of fluorescence or luminescence at a predetermined site of a biological sample can be detected.

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Description

明 細 書 生体試料光学測定方法及び生体試料光学測定装置 技術分野
本発明は、 生体試料の蛍光画像及び透過光画像を撮像する生体試料光学測定方 法及び生体試料光学測定装置に関する。 背景技術
感染症原因ウィルスやガンなどの細胞を蛍光標識抗体や核酸プローブと反応さ せ、 感染や異常の検知を行う方法が、広く細胞診や感染症検査の手法として用い られている （ 『臨床検査 増刊号 <細胞診一 2 1世紀への展望〉 Vo l . 44，No. 1 1』 医学書院，東京、 2000年 10月刊行参照） 。 しかし、 蛍光標識物は対象物以外の 物体や壁面に非特異的に吸着することもあり、 細胞や組織に確実に対象ウィルス や遺伝子が存在することを検知するには、 細胞や組織などの実構造を示す画像と の対照が望まれる。 このような蛍光画像と実画像とを撮像することは、 従来の蛍 光顕微鏡でも可能であるが、 その場合には蛍光測定用の試料と実画像 （染色画 像） 用の試料を別々に用意するのが一般的である。 組織切片のように近接した細 胞の薄片では試料間の相違はわずかであるが、 塗沫標本のように、 同一の試料片 を用意するのが困難な試料の場合、 このような別個の試料では正確な判定が困難 である。
そこで同一の試料から蛍光標識画像と染色画像を得ることを試みると、 染色用 の色素のために蛍光測定が影響を受けることがあり、 これを回避する方法を考案 する必要がある。 例えば、 位相差を利用し、 染色を行わず、 細胞の透過画像を得 ることも可能であるが、 染色画像のような鮮明なコントラストが得にくい。 また 実細胞像と蛍光画像を精度よく位置を対比させることは、 手作業の顕微鏡操作で は困難を極める。
また、 細胞計測を目的とする手段として特開 2000- 310637号公報があるが、 化 学発光物質を標識とし、 発光画像から検出した発光位置に顕微鏡の視野をあわせ、 染色された細胞構造を観察するとしているが、 発光、 染色各画像を個別に評価す ることから、 発光している標識と細胞との対応関係の判別が上述のように困難で ある問題がある。
さらに、 特開平 8- 1 12099号公報には、 トンネル走査型電子顕微鏡で生体試料の 微細映像を撮像しつつ、 微細電子ビーム等の照射により発する蛍光を光電変換装 置で捕らえ、 微細画像に光電変換装置で得られた画像データを重ね合わせる方法 が開示されている。 しかしながら、 この公開公報では、 トンネル走査型電子顕微 鏡で微細画像を撮像しながら蛍光を検出しているため、 最終的な画像を得るため の装置構成が非常に複雑になるという問題がある。
したがって、 従来において、 上記のような臨床検査作業は、 顕微鏡操作、 染色 操作とも手作業で行うこととなり、 作業者の肉体的よ疲労等によりエラ一を生じ がちであった。 発明の開示
そこで、 本発明は、 このような実状に鑑みて案出されたものであり、 生体試料 の所定の部位における蛍光又は発光について正確な位置を検出することができる 生体試料光学測定方法及び生体試料光学測定装置を提供することを目的としてい る。
上記目的を達成した本発明は、 以下を包含する。
( 1 ) 生体試料の少なくとも一部の蛍光又は発光画像を撮像し、 上記生体試料 の少なくとも一部の透過光画像を撮像し、 上記蛍光又は発光画像と上記透過光画 像とを、 上記生体試料の上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを対応づけて 重ね合わせて表示することを特徴とする生体試料光学測定方法。
( 2 ) 上記透過光画像は、 上記蛍光又は発光画像と比較して高解像度であるこ とを特徴とする （ 1 ) 記載の生体試料光学測定方法。
( 3 ) 上記透過光画像の解像度を、 上記蛍光又は発光画像の解像度と比較して 2〜 2 0倍とすることを特徴とする （ 1 ) 記載の生体試料光学測定方法。
( 4 ) 上記蛍光又は発光画像を撮像した後、 上記生体試料に染色処理を施し、 その後、 上記透過光画像を撮像することを特徴とする （ 1 ) 記載の生体試料光学 測定方法。
( 5 ) 上記生体試料を保持する保持部に設けられた光学識別マークを基準にし て、 上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特 徴とする （ 1 ) 記載の生体試料光学測定方法。
( 6 ) 生体試料の少なくとも一部を測定した蛍光又は発光画像と当該生体試料 の少なくとも一部を測定した透過光画像とを記憶する画像データ記憶機能と、 上 記蛍光又は発光画像の画像データと上記透過光画像の画像データと演算する演算 機能とを備え、 上記画像データ記憶機能に記憶した上記蛍光又は発光画像と上記 透過光画像とを、 上記演算機能により演算処理した上で、 上記蛍光又は発光画像 と上記透過光画像と重ね合わせて表示することを特徴とする生体試料光学測定装
( 7 ) 上記蛍光又は発光画像及び上記透過光画像を測定する光学測定手段を備 えることを特徴とする （6 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 8 ) 上記光学測定手段は、 上記透過光画像と比較して上記蛍光又は発光画像 を高解像度で撮像することを特徴とする （7 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 9 ) 光学識別マークが設けられ、 上記生体試料を保持する保持部を備え、 上 記保持部の光学識別マークを基準として上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像 とを位置決めして撮像することを特徴とする （6 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 1 0 ) 上記光学識別マークは複数のリング状パターンであり、 当該光学識別 マークの画像データからそれぞれのリング状パターンの中心点座標を取得した後、 当該中心点座標を基準点として、 上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位 置決めして撮像することを特徴とする （9 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 1 1 ) 上記光学測定手段は、 先ず、 上記蛍光又は発光画像を撮像し、 次いで 透過光画像測定のための生体試料の染色処理が実施された後、 上記透過光画像を 撮像することを特徴とする （7 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 1 2 ) 上記生体試料に対して染色処理を行う染色処理手段を備えることを特 徴とする （6 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 1 3 ) 蛍光物質又は発光物質が結合した生体試料から蛍光又は発光画像を取 得し、 染色処理を施した上記生体試料から透過光画像を取得することを特徴とす る （6 ) 記載の生体試料光学測定装置。
( 1 ) 生体試料から発せられた蛍光又は発光を検出する蛍光又は発光検出部 と、 上記生体試料に対して光を照射するとともに当該光の照射により当該生体試 料を透過した透過光を検出する透過光検出部と、 上記蛍光又は発光測定部で測定 した蛍光又は発光画像及び上記透過光検出部で測定した透過光画像の各画像デー タを記憶する画像記憶部と、 上記画像記憶部に記憶された蛍光又は発光画像の画 像データ及び透過光画像の画像データを演算する画像データ演算部と、 上記画像 データ演算部で蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の画像データを演 算し、 当該蛍光又は発光画像及び当該透過光画像を重ね合わせて表示する画像表 示部とを有することを特徴とする生体試料光学測定装置。
( 1 5 ) 上記蛍光又は発光検出部は、 上記生体試料に対して光学的ビームを走 査しながら照射するとともに当該光学的ビームの照射により当該生体試料から励 起された蛍光を検出することを特徴とする （ 1 4 ) 記載の生体試料光学測定装置 c
( 1 6 ) 上記蛍光又は発光検出部は、 上記生体試料に対して発光処理を施すこ とにより発する発光を検出することを特徴とする （ 1 4 ) 記載の生体試料光学測
( 1 7 ) 上記蛍光又は発光検出部は、 上記生体試料から励起された蛍光を 2次 元画像情報として入力し、 上記透過光検出部は、 上記蛍光又は発光検出部に入力 した 2次元画像情報よりも高解像度の透過光画像情報を入力することを特徴とす る （ 1 4 ) 記載の生体試料光学測定装置。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明を適用した生体試料光学測定装置を示す要部構成図である。 図 2 (a) は、 生体試料保持部の要部上面図である。
図 2 (b) は、 他の生体試料保持部の要部上面図である。
図 2 (c) は、 更に他の生体試料保持部の要部上面図である。
図 3 (a) は、 位置合わせを説明するための概念図であり、 識別マークの透過 光画像を示す概念図である。
図 3 (b) は、 位置合わせを説明するための概念図であり、 デジタイズした透 過光画像を示す概念図である。
図 3 (c) は、 位置合わせを説明するための概念図であり、 「row」 側の強度分 布を示す特性図である。
図 3 (d) は、 位置合わせを説明するための概念図であり、 「co lumn」 側の強 度分布を示す特性図である。
図 4 ( a) は、 蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図で あり、 測定対象の細胞を示す概念図である。
図 4 (b) は、 蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図で あり、 蛍光画像を示す概念図である。
図 4 (c) は、 蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図で あり、 透過光画像を示す概念図である。
図 4 (d) は、 蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図で あり、 合成した画像の一例を示す概念図である。
図 4 (e) は、 蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図で あり、 合成した画像の他の例を示す概念図である。
図 4 ( f) は、 蛍光画像と透過光画像との合成過程を説明するための概念図で あり、 合成した画像の更に他の例を示す概念図である。
図 5は、 本発明を適用した他の生体試料光学測定装置を示す要部構成図である。 図 6は、 本発明を適用した他の生体試料光学測定装置を示す要部構成図である。 図 7は、 図 6に示した生体試料光学測定装置の試料染色部を示す要部斜視図で ある。
符号の説明
1……検体、 1- la、 b、 c、 d……識別マーク、 2……生体試料保持部、 3……生 体試料保持部駆動系、 3-1……支持ガイド、 3-2…… 0軸調整用ステージ、 3-3— ·'·Χ軸方向微動ステージ、 3-4…… Υ軸方向微動ステージ、 3-5…… X軸方向粗動ス テージ、 3-6……駆動制御部、 4……蛍光励起用レーザ光源、 5……励起光光学 系、 6……ロングパスフィルタ、 7……蛍光光学系、 8……蛍光検出部、 9…… 透過光光源、 10……透過光光学系、 1 1…… 2次元カラ一イメージセンサ、 12…… 蛍光画像記憶部、 13……透過光画像記憶部、 14……画像バッファ、 15……画像デ ータ演算部、 16……画像表示部、 17……水銀ランプ、 18……バンドパスフィルタ、 19…… 2次元単色イメージセンサ、 20……識別マーク付き生体試料保持部、 21 · · · …試料染色部、 22……染色液噴霧部、 23……染色液回収部、 24……洗浄液噴霧部、 25……洗浄液回収部、 26……染色液容器群、 26- 1……染色液 A容器、 26-2……染 色液 B容器、 26-3……透徹液容器、 26-4……配管洗浄液容器、 27……洗浄液容器 群、 27- 1……洗浄液容器、 27-2……分別液容器、 27-3……親和液 A容器、 27-4· · · …親和液 B容器、 28……電磁弁、 29……電磁弁、 30……電磁弁、 31……電磁弁、 32……染色液供給ポンプ、 33……染色液回収ポンプ、 34……洗浄液供給ポンプ、 35……洗浄液回収ポンプ、 36……染色液配管系、 37……洗浄液配管系、 38……洗 浄液廃液容器 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに具体的に説明する。 但し、 本発明は、 これらの形態にそ の技術的範囲を限定するものではない。
本発明を適用した生体試料光学測定装置を図 1に示す。 生体試料光学測定装置 は、 検体 1を保持した生体試料保持部 2と、 生体試料保持部 2を所望の位置に駆 動する生体試料保持部駆動系 3とを備えている。 生体試料光学測定装置は、 検体 1に対してウィルス、 例えば HPV、 HCV、 HIV等が感染しているか否かを判別する とともに、 ウィルスの感染部位を同定するものである。 検体 1 としては、 検査対 象となる生体組織切片、 培養細胞、 あるいは塗沫標本をあげることができ、 プロ —ブ DNAによるハイプリダイゼーション処理をされているものとする。 プローブ DNAは、 判別対象のウィルス由来 DNAにハイブリダィズできる塩基配列を含み、 蛍 光標識物質が結合されている。 蛍光標識物質としては、 特に限定されないが、 例 えば所定の波長の励起用レーザが照射されると当該励起用レーザの波長よリも長 波長の蛍光を発するものを使用することができる。 具体的に、 蛍光標識物質とし ては、 アマシャム フアルマシア バイオテク社製の蛍光体である Cy- 2、 Cy- 3、 Cy-5、 Cy- 7等を例示することができる。 また、 プローブ DNAに対しては、 蛍光標 識物質の替わりに化学又は生物発光物質を結合させても良い。 化学又は生物発光 物質としては、 アルカリフォスファタ一ゼ、 ルシフェラーゼ、 ルシフェリン、 ぺ ルォキシダーゼ及びルミノール等を使用することができる。
生体試料保持部駆動系 3は、 生体試料保持部 2を支持する支持ガイ ド 3- 1と、 生体試料保持部 2を面内方向 （ Θ軸） で回転させる Θ軸調整用ステージ 3- 2と、 生体試料保持部 2を面内の所定の方向 （X軸） に移動させる X軸方向微動ステージ 3- 3と、 生体試料保持部 2を面内の X軸と直交する方向 （Y軸） に移動させる Y軸方 向微動ステージ 3- 4と、 生体試料保持部 2を X軸方向に比較的大きく駆動する X軸 方向粗動ステージ 3-5とを備える。 また、 生体試料保持部駆動系 3は、 これら Θ 軸調整用ステージ 3-2、 X軸方向微動ステージ 3-3、 Y軸方向微動ステージ 3-4及び X 軸方向粗動ステ一ジ 3-5の駆動を制御する駆動制御部 3-6を備えている。 駆動制御 部 3-6が X軸方向微動ステージ 3-3及び Y軸方向微動ステージ 3-4の駆動を制御する ことによって、 検体 1を保持した生体試料保持部 2を所望の方向に走査させるこ とができる。
生体試料光学測定装置は、 生体試料保持部 2に保持された検体 1の蛍光画像を 測定するための蛍光励起用レーザ光源 4と励起光光学系 5とロングパスフィルタ 6と蛍光光学系 7と蛍光検出部 8とを備えている。 蛍光励起用レーザ光源 4は、 例えば、 半導体レーザ装置、 YAGレーザ装置、 He- Neレーザ装置又は Arレーザ装置 等からなり、 所定の波長の励起用レーザを出射することができる。 蛍光励起用レ —ザ光源 4は、 プローブ DNAに結合した蛍光標識物質の種類に応じて、 所望の波 長の励起用レーザを出射するものを選択する。 例えば、 複数種類の蛍光標識物質 を使用した場合、 蛍光励起用レーザ光源 4としては、 それぞれの蛍光標識物質に 応じた複数の波長のレーザを出射するレーザ装置か、 或いは、 それぞれの蛍光標 識物質に応じた波長のレーザを出射する複数のレーザ装置を使用する。 励起光光 学系 5は、 レンズ等を有し、 蛍光励起用レーザ光源 4から出射された励起用レ一 ザを検体 1上に集光することができる。 ロングパスフィルタ 6は、 所定の波長を 越える波長成分のみを透過することができる。 蛍光光学系 7は、 集光レンズを有 し、 ロングパスフィルタ 6を透過した蛍光を集光することができる。 蛍光検出部 8は、 例えば、 光電子増倍管又は CCD等の光センサを有し、 蛍光光学系 7で集光 した蛍光を検出するとともに、 検出した蛍光の蛍光強度をデジタルデータに変換 する。 生体試料光学測定装置は、 生体試料保持部 2に保持された検体 1の透過光画像 を測定するための透過光光源 9、 透過光光学系 10、 2次元カラ一イメージセンサ 11を備えている。 透過光光源 9は、 例えば、 ハロゲンランプであり、 検体 1 を透 過する透過光を出射することができる。 透過光光学系 10は、 レンズ等を有し、 検 体 1を透過した透過光を集光することができる。 2次元カラ一イメージセンサ 11 は、 透過光光学系 10で集光された透過光を検出するとともに、 検出した透過光の カラー画像を R、 G、 B各色の画像データに変換する。
生体試料光学測定装置は、 蛍光検出部 8で得られた蛍光画像に関するデジタル データを記憶する蛍光画像記憶部 12と、 2次元カラ一イメージセンサ 11で得られ た画像データを記憶する透過光画像記憶部 13と、 これら蛍光画像記憶部 12及び透 過光画像記憶部 13に記憶されたデジタルデータ及び画像データを読み出して保存 する画像バッファ 14と、 画像バッファ 14に保存されたデジタルデータ及び画像デ ータを演算して表示画像データを合成する画像データ演算部 15と、 画像データ演 算部 15で合成され画像バッファに保存された表示画像データから蛍光画像及び透 過光画像を重ね合わせた画像を表示する画像表示部 16とを備えている。
一方、 生体試料保持部 2は、 図 2 (a) 〜 （c) に示すように、 測定対象領域 R と、 生体試料光学測定装置において正確に位置決めを行うための識別マークとを 有している。 なお、 図 2 (a) 〜 （c) は、 生体試料保持部 2のバリエーションを それぞれ示している。
図 2 (a) に示す生体試料保持部 2は、 基板と、 基板の略中心部に配置された 測定対象領域 Rと、 この測定対象領域 Rを挟み込むように配設された一対の識別 マーク卜 la、 卜 lbとから構成されている。 基板は、 例えば、 厚さ 0. 5〜し 5m mの 石英ガラス板又は少なくとも測定対象領域 Rが上述した励起用レーザに対して透 明である材料から構成されている。 識別マーク卜 la、 卜 lbは、 それぞれ、 直径 5 〜100 z mの同心円状を呈してなリ、 基板に対するエッチング処理等でリング部 を形成した後に当該リング部内側に蛍光剤をプリントすることにより形成される。 識別マーク l-la、 卜 lbをこのように形成することによって、 蛍光検出部 8と 2次 元カラ一^ Tメ一ジセンサ 11のいずれからも認識することができる。
また、 図 2 (b) に示した生体試料保持部 2は、 例えば市販のスライ ドグラス に対して、 検体に関する情報をバーコード卜 3で記録し、 当該バーコード卜 3をプ リントしたタグシール卜 2上に 2個所の識別マーク卜 la、 卜 lbを設けたものであ る。 すなわち、 図 2 (b) に示した生体試料保持部 2は、 市販のスライ ドグラス 等における測定対象領域 R以外の位置にタグシール卜 2を貼り付けることによつ て形成される。
さらに、 図 2 (c) に示した生体試料保持部 2は、 基板と、 基板の略中心部に 配置された測定対象領域 Rと、 この測定対象領域 Rの四隅に配設された 4つの識 別マ一ク卜 la、 卜 lb、 l-lc、 卜 Idとから構成されている。 すなわち、 図 2 (c) に示した生体試料保持部 2では、 4つの識別マーク 1- la、 1- lb、 卜 lc、 卜 Idをこ の順で結んで囲まれた領域が測定対象領域 Rとなっている。
これら図 2 (a) 〜 （c) に示した生体試料保持部 2の位置合わせは、 識別マ一 ク卜 la、 1-lb ( 1-lc, 1-ld) を基準として以下の手順で行われる。 まず、 識別マ —ク 1- laを透過光画像の測定範囲に位置するよう移動し、 識別マーク卜 laの透過 光画像の測定を行う （図 3 (a) ) 。 次いで、 駆動制御部 3-6から得られる X軸方 向微動ステージ 3- 3及び Y軸方向微動ステージ 3- 4の原点位置と識別マーク卜 1 aの 中心位置との距離を求める。
具体的には、 得られた識別マーク卜 laの透過光画像をデジタイズし、 識別マー ク卜 laの m x nマトリックス状ピクセルのデジタル画像 （図 3 (b) ) を得る。 次に、 得られたデジタル画像における 「row」 側の強度分布を求める （図 3 (c) ) 。 すなわち、 図 3 (c) に示した信号強度と X座標との関係を示すグラフ において、 信号強度の最大値の間隔が最大となるように Wを設定し、 W/2となる X 座標を識別マーク卜 laの X軸方向の中心点 （Xa-center) とする。 同様に、 得られ たデジタル画像における 「column」 側の強度分布を求め （図 3 (d) ) 、 識別マ ーク卜 laの Y軸方向の中心点 （Ya- center) を求める。 このように、 識別マーク卜 laについて、 中心点が座標 （Xa-center，Ya-center) として求められる。 求めら れた識別マーク 1-laの中心座標 （Xa-center, Ya-center) を、 後述する画像測定 における原点とする。 識別マーク卜 laの中心座標は、 駆動制御部 3-6に記録する。 次に X軸方向微動ステージ 3-3及び Y軸方向微動ステージ 3- 4を駆動し、 識別マ一 ク 1- lbの透過光画像を測定し、 当該識別マーク卜 lbについて中心座標を求める。 識別マーク 1- lbの中心座標は、 上述した識別マーク卜 laと同様に、 （Xb- center, Yb- center) として求めることができる。
次に、 0軸調整用ステージ 3- 2を駆動して、 識別マーク卜 la及び 1-lbの中心点 を結ぶ直線が X軸とを平行にする。 言い換えると、 識別マーク卜 la及び 1-lbの中 心点を結ぶ直線と X軸とのなす角 Θが 0となるように、 0軸調整用ステ一ジ 3- 2を 駆動する。 具体的には、 識別マーク 1- laの中心座標 （Xa-center, Ya- center) と 識別マーク 1-lbの中心座標 （Xb-center，Yb-center) とにおいて、 Ya-centerと Yb - centerとが一致するように 0軸調整用ステージ 3- 2を駆動する。
そして、 生体試料保持部 2の原点を識別マーク卜 laの中心座標とし、 透過光画 像の撮像及び蛍光画像の撮像を行う。 以上のようにして、 透過光画像の撮像及び 蛍光画像の撮像の際に用いる原点を得ることができる。 図 2 (a) に示した生体 試料保持部 2では、 位置合わせの際の識別マーク卜 la及び 1-lbの確認を高精度且 つ短時間で行うことができる。 また、 図 2 (b) に示した生体試料保持部 2は、 消耗品となる市販のスライドグラスを用いることができるため低コスト化を図る ことができる。 図 2 (b) に示した生体試料保持部 2は、 一旦、 生体試料光学測 定装置から取り外された場合でも、 バ一コードに記録された検体情報等をバーコ —ドで記録しているため、 検体 1の管理を容易に行うことができる。 このとき、 撮像した透過光画像及び/又は蛍光画像の画像データを関連づけて記録すること によって、 検体 1の管理とともに生体試料保持部 2を容易に管理することが可能 となる。 図 2 (c) に示した生体試料保持部 2は、 測定対象領域 Rの四隅にそれ ぞれ識別マ一力卜 la、 1-lb, 1- lc、 1- Idを配設しているため、 上述した位置合わ せと同時に、 測定対象領域 Rを高精度に且つ迅速に認識することができる。 また、 生体試料保持部 2が異なる形状であっても、 測定対象領域 Rを容易に確認するこ とができる。
なお、 生体試料保持部としては、 図 2 (a) 〜 （c) に示したものに限定されず、 生体試料保持部 2の端面を基準面として位置合わせを行うもの、 或いは検体 1 を 固定する際に測定対象領域 R付近の任意の箇所に蛍光ビーズ等によリマーキング を行い、 これを原点とするものであってもよい。 このような場合、 生体試料保持 部 2としては、 予め特殊な処理を施すことなく画像測定の位置合わせを行うこと ができる。
以上のように、 生体試料保持部 2を位置合わせした生体試料光学測定装置を用 いて、 以下のように検体 1の蛍光画像及び透過光画像を撮像する。 本例では、 ゥ ィルス由来 DNAに対してハイブリダィズする塩基配列を有する DNAプローブに蛍光 標識物としてアマシャム フアルマシア バイオテク社製の Cy- 5 (R)を結合させ、 当該 DNAプローブを用いて細胞に対する上記ウィルスの感染判定及び感染部位の 同定を行う。
先ず、 生体試料光学測定装置では、 検体 1の蛍光画像を撮像する。 蛍光画像を 撮像する際には、 レーザ光源 4から励起用レーザを検体 1に対して照射する。 本 例では、 蛍光標識物としてアマシャム フアルマシア バイオテク社製の Cy-5 (R) を使用しているため、 波長 635nm蛍光励起用レーザを出射する半導体レーザをレ —ザ光源 4として用いる。 当該励起用レーザを照射すると、 細胞中に 670nm以上 の波長の蛍光が観察される。 細胞で観察される蛍光は、 ロングパスフィルター 6 を透過することができ、 蛍光光学系 7を介して集光され、 蛍光検出部 8に入射す る。 なお、 蛍光励起用レーザは、 ロングパスフィルター 6により遮蔽され、 蛍光 検出部 8に入射することはない。
これにより、 検体 1における蛍光検出が可能となる。 検出した蛍光強度は、 例 えば、 16b i tのデジタルデータに変換し、 蛍光画像記憶部 12に保存する。 このと き、 例えば、 励起用レーザを励起光光学系 5により集光して直径 10 m以内のス ポット径とする。 そして、 生体試料保持部 2の裏面から検体 1に対して当該励起 用レーザを照射し、 生体試料保持部駆動系 3により生体試料保持部 2を移動させ ることによリ励起用レーザ照射部分を走査しながら蛍光検出部 8で蛍光を検出す る。 これにより、 蛍光検出部 8では、 解像度 lO t mの蛍光画像を得ることができ る。
このとき、 検体 1は、 検査対象のウィルスに対応したプローブ DNAによりハイ プリダイゼ一シヨン処理されているため、 検体 1中の蛍光の有無を調べることで 対象とするウィルスに感染しているか否かの一次スクリーニングを行うことがで きる。 この一次スクリーニングによって検体 1中に蛍光が観察された場合、 その 位置を駆動制御部 3- 6において記憶し、 後述する透過光画像測定の位置合わせの 際に基準測定位置とする。 本例において、 蛍光の励起を直径 ΙΟ μ πι以内に集光し た励起用レーザで行うことにより、 蛍光標識物質に対する照射光強度を向上する ことができ、 その結果、 蛍光標識物質の発する蛍光量を増大させ蛍光の検知感度 を向上させることができる。
また、 本例において、 複数のプローブ DNAそれぞれに対して異なる蛍光標識物 質を用いた場合には、 異なる波長の励起用レーザを出射できる蛍光励起用レーザ 光源 4を用いる。 これにより、 検体 1中に観察される複数の蛍光を検出すること ができ、 これら複数の蛍光についての蛍光画像を得ることができる。
次に、 蛍光画像により蛍光標識物質の存在が確認された検体 1について、 透過 光画像の測定を行う。 透過光画像の測定に先だって、 蛍光画像測定後の検体 1を 生体試料保持部 2ごと生体試料光学測定装置から分離し、 検体 1に含まれる細胞 構造を観察可能とするための染色処理を行うことが好ましい。 染色処理後、 生体 試料保持部 2を生体試料保持部駆動系 3に装着する。
このとき、 生体試料保持部 2の識別マーク 1- la、 卜 lbを二次元イメージセンサ 11により観察しながら、 図 3を用いて説明した生体試料保持部 2の位置合わせと 同様に、 0軸調整用ステージ 3-2を駆動して識別マーク卜 la及び卜 lbの中心点を 結ぶ直線と X軸とのなす角 0が 0となるように補正するとともに、 識別マーク卜 laの中心座標すなわち、 原点を一致させる。 具体的に、 二次元イメージセンサ 11 で観察した識別マーク 1- laの中心が駆動制御部 3- 6に記録された識別マーク 1-la の中心座標と一致するように、 X軸方向微動ステージ 3-3及び Y軸方向微動ステー ジ 3- 4を駆動する。
次に、 検体 1の透過光画像を撮像する。 透過光画像の撮像に際しては、 X軸方 向粗動ステージ 3-5を駆動し、 上記蛍光画像の撮像に際して蛍光が観察された位 置 （基準測定位置） が少なくとも視野に入るように生体試料保持部 2を移動する。 透過光画像は、 可視光域において連続したスペクトルを透過光光源 9から出射し、 検体 1の透過光を 2次元カラーイメージセンサ 11によって検出することによって 撮像する。 2次元カラ一イメージセンサ 11によって検出された透過光画像は、 R、 G、 B各色 8 bi tずつの画像データとして透過光画像記憶部 13に保存される。
このとき、 透過光画像の撮像は、 蛍光が観察された周辺領域のみに限定して行 えばよい。 したがって、 透過光画像を高解像度に撮像することができる。 例えば、
2次元カラーイメージセンサ 1 1を 1000 X 1000画素、 一片 12mmサイズの CCDによリ 構成し、 透過光光学系 10による拡大倍率が 30倍である場合、 0. 4mmの正方形領域 について最小で 0. 4 mの画素で透過光画像を得ることができる。 ただし、 この 場合、 透過光光学系 10で決まる光学的解像度は 0. 4 μ πι以下とする。 これに対し て、 上述した蛍光画像の撮像に際しては、 検体 1の全領域について測定する必要 があるため、 検体 1の測定対象領域を 20 X 40腿、 蛍光画像の画素数を 2000 X 4000 画素とすると、 解像度、 つまり画素の大きさは ΙΟ μ ηιとなる。
透過光画像の解像度としては、 一般的な細胞の大きさが ΙΟ μ πι程度、 細胞核の 大きさが 2 m程度であるため、 透過光画像が少なくとも細胞核を解像可能であ る必要があるため、 0. 1〜1 mであることが好ましい。 一方、 蛍光画像の解像度 としては、 プローブ DNAに結合した蛍光標識物質の蛍光が細胞核の核内又は核外 にあるか、 若しくは細胞内又は外にあるかどうかの判定ができれば良いことから 透過光画像の解像度よりも低くて良い。 具体的に、 透過光画像の解像度を蛍光画 像の解像度の 2〜20倍とすることが好ましい。
次に、 蛍光画像記憶部 12に記録された蛍光画像と透過光画像記憶部 13に記録さ れた透過光画像とを対応づけて重ね合わせ、 画像表示部 16に表示する。 このとき、 先ず、 蛍光画像記憶部 12から蛍光画像を読み出し画像バッファ 14に蓄積するとと もに、 透過光画像記憶部 12から透過光画像を読み出し画像バッファ 14に蓄積する。 次に、 画像バッファ 14に蓄積された蛍光画像及び透過光画像を、 画像データ演算 部 15で合成して表示画面データを作製する。
ここで、 「対応づけ」 とは、 例えば、 蛍光画像と透過光画像とが生体試料又は それを保持する生体試料保持部 2の位置情報により、 相互の位置が仮想的に調整 又は制御されることを意味する。
例えば、 図 4 (a) に示す細胞を、 図 4 (b) に示すように画素サイズ 2 μ mで 蛍光画像を撮像し、 図 4 (c) に示すように画素サイズ 1 mで透過光画像を撮 像した場合、 蛍光画像の解像度は透過光画像に対して 2倍であるので、 蛍光画像 記憶部 12中の画像データ 1画素を、 2 X 2=4画素に分割した上で読み出しを行う。 画素の分割数は蛍光画像と透過光画像の解像度の比に応じて決まり、 前述のよ うに蛍光画像の解像度が 10 m、 透過光画像の解像度が 0. 5 mの場合には、 蛍 光画像の 1画素は 20 x 20=400画素に分割される。 また、 画像バッファ 14は、 透過 光画像の画素に合わせて 1画素あたリ R、 G、 B各色 8 b i tで構成される。 一方、 蛍光画像の単色 16b i tの画像データは、 24bi t階調のデータに写像されるように画 像データ演算部 15で変換処理されるものとする。 表示画面データは、 画像データ 演算部 15で、 画像バッファ 14内の蛍光画像と透過光画像の対応する各 24bi tの画 素データとの論理和をとることによって得られる。 得られた表示画像デ一タは、 画像バッファ 14に再度保存する。 画像バッファ 14内の表示画面データを画像表示 部 16で表示することにより、 蛍光画像と透過光画像の合成した画面を観察するこ とができる。
蛍光画像及び透過光画像を重ね合わせた結果としては、 例えば、 図 4 ( d) 、 (e) 及び （f) に示すように、 画像表示部 16に表示画面データが表示される。 図 4 (d) は、 蛍光標識物質の蛍光が検出されない場合であり、 検出対象のウィル ス由来 DNAが存在しないことを示唆している。 また、 図 4 (e) は、 蛍光標識物質 の蛍光が細胞質に検出された場合であり、 検出対象のウィルス由来 DNAが細胞質 に存在することを示唆している。 また、 図 4 ( f) は、 蛍光標識物質の蛍光が核 に検出された場合であり、 検出対象のウィルス由来 DNAが核内に存在することを 示唆している。
本例によれば、 蛍光標識物質の蛍光を検出することによって陽性/陰性などの 判定において、 透過光画像と蛍光画像を合成して表示することにより、 表示画像 からより多くの情報を得ることができる。 詳しくは、 蛍光の検出に基づく陽性/ 陰性の判定のみならず、 蛍光を発する部位を詳細に同定することができる。 特に、 生体試料光学測定装置では、 透過光画像を蛍光画像と比較して高解像度に撮像し ている。 この場合には、 蛍光を発する部位を更に詳細に同定することができる。 また、 本例では、 蛍光画像を撮像した後に透過光画像の撮像を行っており、 少 なくとも蛍光が検出された部位を含むように透過光画像を撮像している。 すなわ ち、 透過光画像としては、 判定対象の細胞全体にわたって撮像する必要が無く、 当該細胞の一部のみを撮像すればよい。 このため、 透過光画像の解像度が高くて も、 透過光画像記憶部に記録するデータ量を少なくすることができる。 また、 本例では、 励起用レーザを検体 1に対して照射して蛍光標識物質からの 蛍光を検出している。 このため、 検体 1に対する照射光量密度を上げることがで き、 蛍光標識物質の蛍光を高感度に検出することができる。 したがって、 本例に おいては、 検出対象のウィルス由来 MAを有する細胞の発見確率を高めることが できる。 また、 本例で説明した生体試料光学測定装置では、 励起用レーザを走査 する際に X軸方向微動ステージ 3-3及び Y軸方向微動ステージ 3-4を用い、 蛍光画像 の撮像と透過光画像の撮像とを切り替える際に X軸方向粗動ステージ 3-5を用いて いる。 このため、 生体試料光学測定装置によれば、 精密な位置合わせと上記切り 替えとを迅速且つ高精度に行うことができる。
ところで、 本発明は上述したような生体試料光学測定装置に限定されず、 図 5 に示すような生体試料光学測定装置であってもよい。 図 5に示す生体試料光学測 定装置は、 蛍光標識物質を励起させる拡散光を出射する水銀ランプ 17と、 当該拡 散光に含まれる波長のうちで蛍光標識物質が発する蛍光と重複する波長成分を除 去するバンドバスフィルタ 18と、 検体 1において励起された蛍光標識物質からの 蛍光を検出する CCD等の 2次元単色イメージセンサ 19とを備えている。 本生体試 料光学測定装置において、 拡散光を出射するために水銀ランプ 17を用いたが、 こ れに限定されず、 拡散光を出射できるものであればキセノンランプ、 水銀—キセ ノンランプ等の拡散光光源を適宜使用することができる。 また、 バンドパスフィ ルタ 18は、 例えば前述の Cy-5 (R)を使用した場合、 600〜650nm以外の波長成分を カットするものを使用する。 なお、 本例で説明する生体試料光学測定装置は、 こ れらの構成以外は図 1に示した生体試料光学測定装置と同じ構成となっている。 以上のように構成された生体試料光学測定装置では、 蛍光画像を撮像するに際 してバンドパスフィルタ 18を透過した拡散光を検体 1に対して照射する。 そして、 生体試料保持部 2における所定の領域の蛍光を 2次元単色イメージセンサ 19で検 出する。 2次元単色イメージセンサ 19で検出した蛍光画像は、 蛍光画像記憶部 12 に保存される。 '
この生体試料光学測定装置では、 拡散光を検体 1に対して照射するとともに 2 次元単色イメージセンサ 19を用いて蛍光を検出するため、 図 1に示した生体試料 光学測定装置と異なり、 生体試料保持部駆動系 3を駆動させて拡散光を走査する 必要がない。 したがって、 図 5に示した生体試料光学測定装置は、 検体 1におけ る蛍光を非常に短時間に検出することができる。
特に、 この生体試料光学測定装置は、 いかなる蛍光標識物質を用いた場合であ つても。、 拡散光光源である水銀ランプ 17を交換する必要が無く、 蛍光標識物質を 励起する励起光の波長に応じてバンドバスフィルタ 18を交換するだけでよい。 す なわち、 この生体試料光学測定装置は、 単にバンドパスフィルタ 18を交換するこ とによって、 水銀ランプ 17から出射した拡散光に含まれる波長のうち所望の波長 のみを透過させることができ、 いかなる蛍光標識物質であっても励起させること ができる。
さらに、 この生体試料光学測定装置によれば、 励起波長の異なる複数の蛍光標 識物質を用いて検体 1中の蛍光を測定する場合、 これら励起波長に応じて複数の バンドパスフィルタ 18を順次用いることによって、 複数の蛍光標識物質からの蛍 光を順次検出することができる。
複数種類のウィルス、 例えば HPVでは high -、 l ow -、 intermed i ate-の 3種類の r i sk群に分類されることから、 これら 3種類のウィルスに対応し、 異なる蛍光標 識物質を結合したプローブ DNAにより検体 1に対してハイプリダイゼ一シヨン処 理を行うこともできる。 この場合、 バンドパスフィルタ 18として 3種類の蛍光標 識物質に応じて複数種類用意し、 測定中に複数のバンドパスフィルタ 18を随時切 リ替えることによって、 検体 1における複数波長の蛍光画像を個別に測定するこ とができる。 これにより、 生体試料光学測定装置によれば、 検体 1に感染したゥ ィルスの種類を判別することができ、 また、 3種類のウィルスの感染部位を同定 することができる。
本例で蛍光画像を測定する場合、 例えば測定対象領域 Rの大きさを 20 X 40腿と すると、 2次元単色イメージセンサ 19の画素数を 1000 X 1000とし、 蛍光光学系 7 の倍率を 1 0の縮小光学系とし、 微動ステージ 3- 3で移動しながら 2回に分けて 測定対象領域 Rの画像測定を行うことにより、 画素サイズ 10 mで蛍光画像を撮 像することができる。
蛍光画像を撮像した後、 図 1に示した生体試料光学測定装置と同様にして、 透 過光画像の撮像、 蛍光画像と透過光画像との合成 ·表示を行うことができる。 特 に、 本例によれば、 蛍光の励起を拡散光源である水銀ランプ 17で行い、 かつ蛍光 検知を 2次元イメージセンサ 19で行うことにより、 検体 1の広い領域の蛍光画像 の撮像を短時間に行うことが可能で、 検体 1の数が多い場合に一次スクリ一ニン グのスループットを向上できる効果がある。
一方、 図 1及び図 5に示した生体試料光学測定装置においては、 プローブ DNA に対して蛍光標識物質を結合し、 検体 1の蛍光画像を撮像する例を説明したが、 プローブ DNAに対して化学又は生物発光物質を結合してもよい。 この場合、 化学 又は生物発光物質の発光反応は溶液中で行われることから、 生体試料光学測定装 置には当該試薬を検体 1に対して滴下する試薬滴下部を設けることが好ましい。 また、 この場合、 発光画像測定中はカバ一グラス等により検体 1に滴下した液 表面を平坦化し、 焦点のずれを防止することが好ましい。 ただし、 生体試料保持 部 2の下部から発光画像を測定するように発光画像検出系を配置すれば、 カバ一 グラス等による液表面の平坦化をする必要はない。 この場合、 生体試料保持部 2 は、 化学又は生物発光物質の発光に対して透明である必要がある。 蛍光標識物質 の替わりに化学又は生物発光物質を標識とした場合には、 蛍光標識物質を励起す るための蛍光励起用レーザ光源 4、 励起光光学系 5、 ロングパスフィルタ 6及び バンドパスフィルタ 18等を配設する必要がない。 従って、 化学又は生物発光物質 を標識として使用する場合には、 生体試料光学測定装置の光学系を簡略化するこ とができ、 装置全体を小型化することができ、 且つ低コスト化することができる。 ところで、 本発明を適用した生体試料光学測定装置としては、 図 6及び図 7に 示すように、 透過光画像の撮像に先立って検体 1に対して染色処理を施すための 試料染色部 21を備えるものであっても良い。 本例では、 検体 1が識別マーク付き 生体試料保持部 20に保持されている。 図 6及び図 7に示す生体試料光学測定装置 において、 試料染色部 21は、 染色液噴霧部 22及び染色液回収部 23からなる染色処 理部と、 洗浄液噴霧部 24及び洗浄液回収部 25からなる洗浄処理部とを備える。 ま た、 生体試料光学測定装置は、 図示しないが、 識別マーク付き生体試料保持部 20 を図 6中矢印 Aで示す方向に移動する移動制御手段を備えている。
染色液噴霧部 22は、 染色液回収部 23に対向する側に穿設された複数の噴霧口を 有する筒状部材からなる。 複数の噴霧口は、 移動制御手段によって識別マーク付 き生体試料保持部 20を移動した時に、 少なくとも検体 1全体に対して染色液等を 噴霧できるように穿設されている。 洗浄液噴霧部 24は、 洗浄液回収部 25に対向す る側に穿設された複数の噴霧口を有する筒状部材からなる。 複数の噴霧口は、 移 動制御手段によって識別マーク付き生体試料保持部 20を移動した時に、 少なくと も検体 1全体に対して洗浄液等を噴霧できるように穿設されている。 染色液回収 部 23及び洗浄液回収部 25は、 それぞれ最低部に形成された廃液口と、 廃液口に向 かって下に傾斜した傾斜面とで構成されている。 また、 染色液回収部 23及び洗浄 液回収部 25の間には、 染色液と洗浄液との混合を防止するための突条部が形成さ れている。
染色液噴霧部 22は、 染色液配管系 36を介して染色液容器群 26と連結されている。 染色液配管系 36は、 一方の端部が染色液噴霧部 22と連結され、 他方の端部が染色 液回収部 23の廃液口と連結されている。 また、 染色液噴霧部 22と染色液溶液群 26 との間の染色液配管系 36には、 染色液供給ポンプ 32と電磁弁 29とが配設されてい る。 染色液回収部 23と染色液溶液 26との間の染色液配管系 36には、 染色液供給ポ ンプ 33と電磁弁 28 (28- 1、 28-2、 28- 3及び 28- 4) とが配設されている。
また、 洗浄液噴霧部 24は、 同様に、 洗浄液配管系 37を介して洗浄液容器群 27と 連結されている。 洗浄液回収部 25の廃液口は、 洗浄液配管系 37を介して洗浄液廃 液容器 38と連結されている。 洗浄液噴霧部 24と洗浄液容器群 27との間の洗浄液配 管系 37には、 洗浄液供給ポンプ 34と電磁弁 31とが配設されている。 洗浄液回収部 25と洗浄液廃液容器 38との間の洗浄液配管系 37には、 洗浄液供給ポンプ 35と電磁 弁 30 (30- 1、 30-2、 30- 3及び 30-4) とが配設されている。
染色液容器群 26は、 例えば図 7に示すように、 染色液 A容器 26-1、 染色液 B容器 26-2、 透徹液容器 26-3及び配管洗浄液容器 26-4とから構成されている。 すなわち、 染色液容器群 26は、 検体 1の透過光画像を撮像するための染色工程に必要な試薬 や、 染色液配管系 36を洗浄するための洗浄液等を別個に保存した複数の容器を備 えている。 これら染色液 A容器 26- 1、 染色液 B容器 26-2、 透徹液容器 26-3及び配管 洗浄液容器 26-4は、 ぞれぞれ、 染色液配管系 36の中途部に配設された電磁弁 28 - 1、 28-2、 28- 3及び 28-4により染色液配管系 36との導通が制御されている。
洗浄液容器群 27は、 例えば図 7に示すように、 洗浄液容器 27- 1、 分別液容器 27-2, 親和液 A容器 27-3及び親和液 B容器 27- 4とから構成されている。 すなわち、 洗浄液容器群 27は、 染色工程の終了後に行う洗浄処理、 分別処理及び親和処理に 必要な試薬等を別個に保存した複数の容器を備えている。 これら洗浄液容器 27 - 1、 分別液容器 27- 2、 親和液 A容器 27-3及び親和液 B容器 27-4は、 ぞれぞれ、 洗浄液配 管系 37の中途部に配設された電磁弁 30- 1、 30-2、 30-3及び 30- 4により洗浄液配管 系 37との導通が制御されている。 洗浄液廃液容器 38は、 電磁弁 31により洗浄液廃 液容器 38との導通が制御されている。
以上のように構成された生体試料光学測定装置では、 上述した例と同様に蛍光 画像を撮像した後、 透過光画像を撮像するのに先立って、 検体 1に対して染色処 理を施す。 以下では、 染色処理の一例として、 へマトキシリン 'ェォジン重染色 法を用いた場合について説明する。 へマトキシリン ·ェォジン重染色法では、 へ マトキシリンにより主として細胞内の核を青紫色に染色するとともに、 ェォジン により細胞質、 細胞間質及び繊維素等を赤褐色又は暗褐色に染色する方法である。 本染色法よれば、 細胞内の一般的な情報を過不足なく透過光画像として得ること ができる。 したがって、 本染色法は、 病理診断において多用されている細胞染色 法である。 本染色法を用いることによって、 高精度な透過光画像を得ることがで き、 ウィルス感染の診断等において感染の有無及び感染部位の同定について精度 の高い診断が可能となる。
染色処理では、 先ず、 図示しない移動制御手段によって生体試料保持部 2を図 6中矢印 Aで示す方向に移動させ、 当該生体試料保持部 2を試料染色部 21におけ る染色処理部に搬送する。
次に、 検体 1に対して染色液 A容器 26- 1から供給されるへマトキシリン液を、 染色液噴霧部 22から約 4分間噴霧して染色する。 へマトキシリン液を噴霧する際 には、 電磁弁 28- 1及び 29- 1のみを開放状態としながら染色液供給ポンプ 32及び染 色液回収ポンプ 33を動作させる。 これによリ、 染色液 A容器 26- 1以外の容器に入 つた他の染色液等を混入させることなくへマトキシリン液のみを噴霧させること ができ、 且つ、 噴霧されたへマトキシリン液を染色液回収部 23で回収することが できる。 回収されたへマトキシリン液は、 染色液 A容器 26- 1に移送され循環して 再使用される。 次に、 図示しない移動制御手段によって生体試料保持部 2を洗浄処理部に移動 し、 検体 1に対して洗浄液容器 26- 1より供給される蒸留水を洗浄液噴霧部 24から 約 5分間供給して水洗する。 蒸留水を供給する際には、 電磁弁 30- 1及び 31のみを 開放状態としながら洗浄液供給ポンプ 34及び洗浄液回収ポンプ 35を動作させる。 これにより、 洗浄液容器 26- 1以外に入った他の溶液等を混入させることなく蒸留 水のみを供給することができ、 且つ、 供給された蒸留水を洗浄液回収部 25を介し て洗浄液廃液容器 38に回収することができる。
なお、 上述した水洗の際には、 電磁弁 28- 1及び 29- 1を閉鎖状態とし、 電磁弁 28-4及び 29- 4を開放状態としながら、 洗浄液供給ポンプ 34及び洗浄液回収ポンプ 35を動作させる。 これにより、 染色液噴霧部 22及び染色液配管系 36内に配管洗浄 液容器 26-4から蒸留水を供給することができ、 染色液噴霧部 22及び染色液配管系 36中のへマトキシリン液を除去することができる。 染色液噴霧部 22及び染色液配 管系 36に供給された蒸留水は、 染色液回収部 23で回収する。
次に、 検体 1に対して分別液容器 27- 2より供給される 0. 2 %塩酸、 70 %アルコ ール混合溶液を洗浄液噴霧部 24から供給して分別処理を施す。 分別処理の際には、 電磁弁 28-2及び 29-2を開放状態とし、 洗浄液供給ポンプ 34及び洗浄液回収ポンプ 35を動作させる。 分別処理の後、 再度、 上述した水洗と同様にして洗浄処理部で 蒸留水による水洗を行う。
次に、 検体 1に対して親和液 A容器 27- 3よリ供給される 95 %アルコール液を噴 霧して、 親和処理を行う。 親和処理の際には、 電磁弁 28- 3及び 29-3を開放状態と し、 洗浄液供給ポンプ 34及び洗浄液回収ポンプ 35を動作させる。 この分別処理を 施すことによって、 へマトキシリンによる染色工程を完了する。
へマトキシリンによる染色工程の後、 ェォジン液による染色工程を実施する。 ェォジン液による染色工程では、 先ず、 図示しない移動制御手段によって生体試 料保持部 2を染色処理部に移動し、 染色液 B容器 26- 2より供給されるェォジン'フ ロキシン B液を 7分間噴霧して染色を行う。 ェォジン ·フロキシン B液を噴霧す る際には、 電磁弁 28- 2及び 29-2のみを開放状態としながら染色液供給ポンプ 32及 び染色液回収ポンプ 33を動作させる。 これにより、 染色液 B容器 26- 2以外の容器 に入った他の染色液等を混入させることなくェォジン'フロキシン B液のみを噴 霧させることができ、 且つ、 噴霧されたェォジン ·フロキシン B液を染色液回収 部 23で回収することができる。 回収されたェォジン'フロキシン B液は、 染色液 B 容器 26-2に移送され循環して再使用される。
次に、 図示しない移動制御手段によって生体試料保持部 2を洗浄処理部に移動 し、 へマトキシリン液による染色工程の際と同様に、 検体 1に対して水洗をほど こすとともに、 染色液噴霧部 22及び染色液配管系 36中のェォジン 'フロキシン B 液を除去する。
次に、 検体 1に対して先ず （95 %アルコール） 、 続いて親和液 B容器 27- 4より 供給される純アルコールを噴霧することによって、 分別 ·脱水処理を行う。 分 別 ·脱水処理の際には、 電磁弁 28-4及び 29- 4を開放状態とし、 洗浄液供給ポンプ 34及び洗浄液回収ポンプ 35を動作させる。
次に、 図示しない移動制御手段によって生体試料保持部 2を染色処理部に移動 し、 検体 1に対して透徹液容器 26-3より供給されるキシロールを噴霧して透徹処 理を行う。 透徹処理の際には、 電磁弁 28-3及び 29- 3のみを開放状態としながら染 色液供給ポンプ 32及び染色液回収ポンプ 33を動作させる。 透徹処理の後、 上述し た水洗と同様にして、 染色液噴霧部 22及び染色液配管系 36中のキシロールを除去 する。
以上により検体 1に対する全ての染色工程が終了する。 染色工程終了後、 識別 マーク付き生体試料保持部 20を図 6中矢印 Aと反対方向に搬送して固定し、 検体 1の透過光画像の撮像を行う。 透過光画像の撮像は、 上述した例と同様にして行 うことができる。 本例によれば、 染色処理を生体試料光学測定装置にて行うこと ができるため、 蛍光画像撮像後に短時間で染色処理後の透過光画像を測定するこ とが可能となる。 本例の生体試料光学測定装置によれば、 例えばウィルス検査等 に際して多量の検体 1を短時間に処理することができ、 スループット向上に有効 である。 また、 本例の生体試料光学測定装置では、 染色液を循環させて再利用す ることにより、 大量の検体 1の検査において染色液の使用量を抑制できる。
なお、 本例で使用したへマトキシリン液は以下のような組成となっている。 へマトキシリン 5g
蒸留水 700ml アンモニゥム ' ミヨゥバン 50g
ヨウ素酸ナトリウム 0. 5g
グリセリン 300ml
また、 本例で使用したェォジン · フロキシン B液は以下のような組成となって いる。
1%ェォジン 100ml
ェォジン Y lg
蒸留水 100ml
1%フロキシン Β 10ml
フロキシン Β lg
蒸留水 100ml
95%アルコール 780ml
氷酢酸 5ml 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書に取リ入れるものとする。 産業上の利用の可能性
以上、 詳細に説明したように、 本発明に係る生体試料光学測定方法及び生体試料 光学測定装置では、 生体試料の蛍光又は発光画像と透過光画像とを対応づけて重 ね合わせて表示するため、 生体試料の所定の部位における蛍光又は発光について 正確な位置を検出することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生体試料の少なくとも一部の蛍光又は発光画像を撮像し、
上記生体試料の少なくとも一部の透過光画像を撮像し、
上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを、 上記生体試料の上記蛍光又は発 光画像と上記透過光画像とを対応づけて重ね合わせて表示する
ことを特徴とする生体試料光学測定方法。
2 . 上記透過光画像は、 上記蛍光又は発光画像と比較して高解像度であること を特徴とする請求項 1記載の生体試料光学測定方法。
3 . 上記透過光画像の解像度を、 上記蛍光又は発光画像の解像度と比較して 2 〜2 0倍とすることを特徴とする請求項 1記載の生体試料光学測定方法。
4 . 上記蛍光又は発光画像を撮像した後、 上記生体試料に染色処理を施し、 そ の後、 上記透過光画像を撮像することを特徴とする請求項 1記載の生体試料光学 測定方法。
5 . 上記生体試料を保持する保持部に設けられた光学識別マークを基準にして、 上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位置決めして撮像することを特徴と する請求項 1記載の生体試料光学測定方法。
6 . 生体試料の少なくとも一部を測定した蛍光又は発光画像と当該生体試料の 少なくとも一部を測定した透過光画像とを記憶する画像データ記憶機能と、 上記 蛍光又は発光画像の画像データと上記透過光画像の画像データと演算する演算機 能とを備え、
上記画像データ記憶機能に記憶した上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像と を、 上記演算機能により演算処理した上で、 上記蛍光又は発光画像と上記透過光 画像と重ね合わせて表示することを特徴とする生体試料光学測定装置。
7 . 上記蛍光又は発光画像及び上記透過光画像を測定する光学測定手段を備え ることを特徴とする請求項 6記載の生体試料光学測定装置。
8 . 上記光学測定手段は、 上記透過光画像と比較して上記蛍光又は発光画像を 高解像度で撮像することを特徴とする請求項 7記載の生体試料光学測定装置。 '
9 . 光学識別マークが設けられ、 上記生体試料を保持する保持部を備え、 上記 保持部の光学識別マークを基準として上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像と を位置決めして撮像することを特徴とする請求項 6記載の生体試料光学測定装置。
1 0 . 上記光学識別マークは複数のリング状パターンであり、 当該光学識別マ —クの画像データからそれぞれのリング状パターンの中心点座標を取得した後、 当該中心点座標を基準点として、 上記蛍光又は発光画像と上記透過光画像とを位 置決めして撮像することを特徴とする請求項 9記載の生体試料光学測定装置。
1 1 . 上記光学測定手段は、 先ず、 上記蛍光又は発光画像を撮像し、 次いで透 過光画像測定のための生体試料の染色処理が実施された後、 上記透過光画像を撮 像することを特徴とする請求項 7記載の生体試料光学測定装置。
1 2 . 上記生体試料に対して染色処理を行う染色処理手段を備えることを特徴 とする請求項 6記載の生体試料光学測定装置。
1 3 . 蛍光物質又は発光物質が結合した生体試料から蛍光又は発光画像を取得 し、 染色処理を施した上記生体試料から透過光画像を取得することを特徴とする 請求項 6記載の生体試料光学測定装置。
1 4 . 生体試料から発せられた蛍光又は発光を検出する蛍光又は発光検出部と、 上記生体試料に対して光を照射するとともに当該光の照射により当該生体試料 を透過した透過光を検出する透過光検出部と、
上記蛍光又は発光測定部で測定した蛍光又は発光画像及び上記透過光検出部で 測定した透過光画像の各画像データを記憶する画像記憶部と、
上記画像記憶部に記憶された蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の 画像データを演算する画像データ演算部と、
上記画像データ演算部で蛍光又は発光画像の画像データ及び透過光画像の画像 データを演算し、 当該蛍光又は発光画像及び当該透過光画像を重ね合わせて表示 する画像表示部と
を有することを特徴とする生体試料光学測定装置。
1 5 . 上記蛍光又は発光検出部は、 上記生体試料に対して光学的ビームを走査 しながら照射するとともに当該光学的ビームの照射により当該生体試料から励起 された蛍光を検出することを特徴とする請求項 1 4記載の生体試料光学測定装置。
1 6 . 上記蛍光又は発光検出部は、 上記生体試料に対して発光処理を施すこと により発する発光を検出することを特徴とする請求項 1 4記載の生体試料光学測
1 7 . 上記蛍光又は発光検出部は、 上記生体試料から励起された蛍光を 2次元 画像情報として入力し、 上記透過光検出部は、 上記蛍光又は発光検出部に入力し た 2次元画像情報よりも高解像度の透過光画像情報を入力することを特徴とする 請求項 1 4記載の生体試料光学測定装置。
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