WO2003004639A1 - Fragments d'adn contenant un gene qui possede une fonction associee a la proliferation autonome d'un plasmide - Google Patents

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WO2003004639A1
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Wataru Mizunashi
Fujio Yu
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Mitsubishi Rayon Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector

Definitions

  • the present invention relates to a DNA fragment containing a gene having a function related to autonomous growth of plasmid, and a DNA fragment containing a gene having a function related to autonomous growth of a plasmid in Rhodococcus bacteria, wherein the copy number of the plasmid is determined.
  • the present invention relates to a DNA fragment in which mutations that can be increased are present in at least one place in the gene, and a high copy number plasmid vector having the DNA fragment.
  • Microorganisms belonging to oral dococcus II are known as microbial catalysts for hydrating nitriles to produce the corresponding amides or acids, as well as degradation of crude oil such as PCB (polychlorinated biphenyl). It is an industrially useful microorganism because it exhibits enzymes that are involved in the desulfurization of biomass, and exhibits a wide variety of properties, such as the production of biosurfactants used in wastewater treatment. It has been known.
  • microorganisms belonging to the species Rhodococcus rhodochrous have extremely high nitrile hydration activity, and are used industrially as catalysts for the production of bio-acrylamide.
  • Rhodococcus genus bacteria include, for example, Brassmid pRC001 held by Rhodococcus rhodochrous ATCC4276, pRC002 held by Rhodococcus rhodochrous ATCC 14349, PRC003 and Rhodococcus rhodochrous Rhodococcus rhodochrous rode
  • the present invention relates to a plasmid which is derived from a plasmid capable of autonomously replicating in Rhodococcus genus bacteria, and comprises a DNA fragment containing a gene relating to autonomous growth of a plasmid, and a plasmid capable of autonomously replicating in oral Bacillus ⁇ bacteria. It is an object of the present invention to provide a DNA fragment containing a gene relating to autonomous growth, wherein the DNA fragment has a mutation point capable of increasing the copy number of a plasmid in at least one place in the gene.
  • the present inventors have clarified a DNA region containing a gene having a function related to autonomous propagation of a plasmid in a bacterium belonging to the genus Oral dococcus, and have a mutation point that increases the copy number of a plasmid in at least one place in the gene.
  • the present invention was completed by obtaining a DNA fragment existing in the present invention.
  • the present invention relates to a DNA fragment derived from a plasmid selected from plasmids pRC001, pRC002, pRCO03 and pRC004 and containing a gene having a function related to autonomous growth of a plasmid in Rhodococcus bacteria,
  • a DNA fragment derived from a plasmid capable of autonomous replication in bacteria and containing a gene related to autonomous propagation of a plasmid, wherein a mutation point capable of increasing the copy number of the plasmid is present in at least one place in the gene , c ie it relates, the present invention is as follows.
  • the DNA fragment of (1) comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, which is contained in PRC004 and contains a gene having a function related to autonomous growth of plasmid in Rhodococcus bacteria;
  • (13) a plasmid, which possesses the DNA fragment of any one of (9) to (12) and is capable of multiplying autonomously in a Rhodococcus bacterium and having a high copy number,
  • DNA fragment hereinafter referred to as multicopy plasmid
  • a DNA fragment is a DNA fragment containing a gene that has the function of autonomous propagation of plasmid, and compared with the copy number of a plasmid vector created using a DNA fragment that has no mutation point. Brass made using DNA fragments with mutation points It means a DNA fragment that has the effect of increasing the copy number of the Smid vector.
  • copy number refers to the number of plasmid molecules per cell (the number of plasmids present)
  • the term multi-copy number refers to a DNA fragment containing a gene having a function related to autonomous replication of a plasmid. Means a copy number higher than the copy number of a plasmid vector prepared using a DNA fragment having no mutation point.
  • the multicopy plasmid DNA fragment of the present invention can be obtained from an appropriately mutated DNA fragment containing a gene capable of autonomous growth in a bacterium belonging to the genus Oral dococcus or a gene containing a gene having a function related to autonomous growth of a plasmid. it can.
  • a vector plasmid having a drug resistance gene that can be used as a marker can be used as a marker for a plasmid that autonomously multiplies in a bacterium belonging to the genus Oral dococcus or a DNA fragment containing a gene having a function related to autonomous growth of plasmid It is inserted into PHSG298 (manufactured by Takara Shuzo), PHSG398 (manufactured by Takara Shuzo) having a chloramphenicol resistance gene, PBR322 (manufactured by Takara Shuzo) having a tetracycline resistance gene or PUC 18 (manufactured by Takara Shuzo) having an ampicillin resistance gene by a known method.
  • PHSG298 manufactured by Takara Shuzo
  • PHSG398 manufactured by Takara Shuzo
  • PBR322 manufactured by Takara Shuzo
  • PUC 18 manufactured by Takara Shuzo
  • the vector plasmid is transformed into a host Rhodococcus bacterium by an electric pulse method, and a plasmid DNA is recovered from the resulting transformant by a known method, for example, an alkaline SDS method, and analyzed by restriction enzyme digestion. The target DNA fragment can be confirmed.
  • Appropriate mutation treatment means irradiating the plasmid-carrying bacteria prepared as described above with ultraviolet rays, X-rays, ⁇ -rays, or the like, or treating with a mutagen such as N-methyl-N'-nitrosoguanidine. And so on. It is also possible to take advantage of spontaneous mutations that occur when organisms multiply.
  • plasmid that grows autonomously in oral Bacillus or a DNA fragment containing a gene that has a function related to plasmid autonomous growth can be directly or single-stranded.
  • mutations can be intensively introduced at a specific location in a DNA sequence. It is possible to specifically introduce a mutation into a DNA fragment containing a gene having a function related to autonomous propagation of a plasmid as described above. It is also possible to synthesize a DNA fragment containing a gene having a function relating to autonomous propagation of a plasmid.
  • Plasmid vectors containing the gene for the drug marker into which the mutation has been introduced as described above are cultured under selection with various concentrations of the drug marker to select strains having an increased drug resistance concentration. As a result, a plasmid having an increased copy number can be obtained. Such a strain can be considered to have an increased drug resistance concentration due to a gene amplification effect due to an increase in copy number. Plasmid can be recovered from such a strain to obtain a multicopy plasmid DNA fragment.
  • a drug resistance gene as the marker gene, but it is also possible to use a known method such as alkaline phosphatase, luciferase or the 1acZ gene, which is easy to detect.
  • the extraction can be performed by extracting chromosomal DNA and plasmid DNA from cells and determining the ratio of the numbers of both molecules. More simply, the recombinant carrying the plasmid having no mutation point and the recombinant carrying the plasmid having the mutation point are cultured in exactly the same manner, the plasmid is recovered, and agarose electrophoresis is performed. The copy number can also be compared by staining with ethidium bromide or the like and analyzing by densitometry.
  • SEQ ID NO: 1 shows the result of determining the nucleotide sequence of plasmid PRC004 derived from Rhodococcus rhodochrous IF03338. From the nucleotide sequence information, two open reading frames (0RF) were estimated for PRC004. One is 0RF, which is predicted to be encoded by 921 bases shown in SEQ ID NO: 5 (bases 1142 to 2062 in the base sequence of SEQ ID NO: 1). ) This is the mouth It is similar to the Rep A protein involved in the replication of PKA22, a plasmid derived from Dococcus rhodochrous NCIMB 13064, and PAL5000 from Mycobacterium forzium.
  • 0RF is predicted to be encoded by 282 bases shown in SEQ ID NO: 7 (bases 2052 to 2333 in the base sequence of SEQ ID NO: 1) (amino acid sequence deduced by SEQ ID NO: 8)
  • SEQ ID NO: 7 bases 2052 to 2333 in the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence deduced by SEQ ID NO: 8
  • 0RF is a putative plasmid-replicating factor of DNA binding of plasmid PFAJ2600 derived from Rhodococcus erythrobilis NI86 / 21.
  • the above considerations are based on the similarity of genes, and do not determine their functions. It is highly possible that pseudogenes that do not actually function (pseudogenes) actually function.
  • a DNA fragment of about 1.6 kb (SEQ ID NO: 3) generated by cleavage of PRC004 by Spll and Sacl is a region containing a gene having a function related to autonomous propagation of a plasmid in Rhodococcus bacteria.
  • a DNA fragment of about 1.9 kb generated by cutting PRC004 with Smal and a DNA fragment of about 2.3 kb generated by cutting with Sacl have a function related to autonomous propagation of plasmid in oral Bacteria. It was found that a region containing the gene was included. Furthermore, when a DNA fragment of about 1.9 kb generated by cutting with Smal was digested with about 1.7 kb of the DNA fragment obtained by cutting with SacI, this DNA fragment was also found to have plasmids in bacteria of the genus Oral dococcus. It was found that a region containing a gene having a function related to autonomous growth was included.
  • the approximately 1.6 kb DNA fragment generated by cutting the approximately 1.7 kb DNA fragment with Spll also contains a region containing a gene having a function related to the autonomous growth of plasmid in Bacillus sp. Turned out to be.
  • the BamHI and BglL SphL Xhol recognition sites present in the approximately 1.6 kb DNA fragment having the above-mentioned restriction enzymes Spll and Sacl cleavage point at the end are cleaved with the respective restriction enzymes, and digested with klenow fragment.
  • the function of autonomous growth of plasmid in Rhodococcus bacteria was lost.Therefore, the presence of a functional protein factor in this region was confirmed. found.
  • PRC004 contains a kanamycin resistance gene that can function as a marker
  • PLK006 is a mutant in which the guanine base at position 1336 has been replaced with a thymine base in the region shown in SEQ ID NO: 3 in the region shown in SEQ ID NO: 3 among the regions containing a gene having a function related to autonomous proliferation of a plasmid in oral Bacteria. Number 4).
  • 2 shows a sequence having a mutation at one of the bases.
  • the deduced amino acid sequence of 0RF is a mutation (substitution) of glycine at position 71 in SEQ ID NO: 8 with serine (SEQ ID NO: 10).
  • Plasmid PLK006 was registered with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) at the Patent Organism Depositary Center (1-1, Tsukuba-Higashi 1-Chuo No. 6 Ibaraki, Japan) under the accession number FERM BP-8085 under the accession number of 2001. Deposited on March 22.
  • the DNA fragment of the present invention includes a DNA fragment containing a gene that hybridizes with the DNA under stringent conditions and has a function related to autonomous growth of plasmid in Rhodococcus bacteria, or a DNA fragment that is stringent with the DNA.
  • a DNA fragment that is stringent with the DNA Includes DNA fragments containing genes that hybridize under conditions and have the function of autonomous growth of plasmid in Rhodococcus bacteria and have at least one mutation point that can increase the copy number of plasmid.
  • the stringent condition refers to a condition under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific eight hybrid is not formed.
  • This condition is such that DNAs having high homology, for example, DNAs having homology of at least 60% or more, preferably 80% or more, and more preferably 95% or more hybridize to DNAs having lower homology
  • FIG. 1 is a diagram showing restriction enzyme fragment maps of plasmids pRC001, pRC002, pRC003, and pRC004.
  • Plasmid pRC004 (lAg) extracted from Rhodococcus rhodochrous IF03338 was added with 5 units of the restriction enzyme Smal or Sad and reacted with 37 for 1 hour to cut the plasmid DNA.
  • the plasmid solution cleaved with the restriction enzyme was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis.
  • the DNA fragment of about 650 bp and about 1.9 kb was cut with Smal, and the DNA fraction cut with Sacl was about 300 bp and about 2.3 kb. Each DNA fragment was cut out.
  • a plasmid vector PHSG299 manufactured by Takara Shuzo
  • a plasmid vector PHSG299 manufactured by Takara Shuzo
  • 1M-Tris-HC1 pH 9.0
  • the plasmid vector solution cut with the restriction enzyme was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, and a 2.7 kb DNA fragment was cut out.
  • the size of the DNA was calculated using Hindll I digest of lambda phage DNA as a size marker.
  • DNA was recovered from agarose gel using Gene clean kit (Funakoshi Co., Ltd.), and TE buffer (10 mM Tris-HC1, 1 mM EDTA, (H 8.0)).
  • the above reaction mixture was added to the Escherichia coli JM105 Strain Combinent Cell (Takara Shuzo), and the mixture was left at 0 ° (:, left for 1 hour, heat-treated for 42 and 2 minutes, and treated with 2XYT medium (0.5% NaCl, 1% yeast extract, 1.6% tryptone) and shaken for 1 hour at 37.
  • 2XYT medium (0.5% NaCl, 1% yeast extract, 1.6% tryptone
  • 25 81111 Kanamycin, ImM IPTG (isopropyl-3-galactoviranoside), and 0.02% X-gal (5-bromo-4-chloride) Oral-3-indolyl-] 3-D-galactobilanoside
  • Transformation by the electric pulse method was performed by the following method.
  • the cells in the logarithmic growth phase of the Rhodococcus sp. Doctus sp. ATCC12674 strain were collected by a centrifuge, washed three times with ice-cold sterile water, and suspended in sterile water. Plasmid 1 1 and cell suspension 1 0/1 was mixed and cooled on ice. A suspension of DNA and cells was placed in a cuvette, and subjected to electric pulse treatment at 2. OkV, 200 OHMS using a gene transfer device Gene Pulser (BIO RAD).
  • Table 1 shows whether the plasmids used and the transformants were obtained.
  • a kanamycin-resistant recombinant was obtained when a plasmid in which an approximately 1.9 kb Smal digestion fragment and an approximately 2.3 kb Sacl fragment of PRC004 were inserted into a plasmid vector pHSG299 was used. Plasmids were extracted from the obtained recombinant and analyzed by agarose electrophoresis. As a result, plasmids having the same molecular weight as the plasmid used for the transformation were obtained.
  • Plasmid pRC004 (lg) extracted from Rhodococcus rhodochrous IF03338 in the same manner as in Example 1 was added with 5 units of the restriction enzymes Smal and Sacl, and allowed to react for 37 hours for 1 hour to cut the plasmid DNA.
  • the plasmid solution cleaved with the restriction enzyme was subjected to 0.7 agarose gel electrophoresis to cut out a DNA fragment of about 1.7 kb.
  • a plasmid vector PHSG299 manufactured by Takara Shuzo
  • a plasmid vector PHSG299 manufactured by Takara Shuzo
  • 1M-Tris-HCl pH 9.0
  • alkaline phosphatase limit
  • Escherichia coli JM105 was transformed with the above reaction solution to obtain a plasmid into which the above-described DNA fragment of about 1.7 kb was inserted.
  • Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674 was transformed by the electric pulse method, and a kanamycin-resistant transformant was obtained.
  • Plasmid obtained in Example 2 was added with 5un its restriction enzymes Sp 11 and Smal and reacted with 37 for 1 hour to cut the plasmid DNA. After recovering the cleaved plasmid by ethanol precipitation, klenow fragment 5 units is added to blunt the ends, and each component is added so that T4 DNA ligase lunit, ImM ATP, lOmM dithiothreitol, and lOmM MgCl 2 are obtained. 4: Let it react overnight.
  • Escherichia coli JM105 was transformed with the above reaction solution to obtain a plasmid into which the above-mentioned DNA fragment of about 1.6 kb was inserted.
  • the resulting plasmid was used to transform Rhodococcus rhodochrous ATCC 12674 by the electric pulse method, and a kanamycin-resistant transformant was obtained.
  • Rhodococcus sp ⁇ 775 Patent Depositary for Patent Organisms, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan
  • the obtained transformant was cultured in 10 ml of MYK medium for 1 day at 30 and subjected to mutation treatment by irradiating ultraviolet rays in a clean bench.
  • the mutated culture was applied to MYK agar medium containing 50-400 g / ml kanamycin, and cultured at 30 for 3 days.
  • the growing colonies were cultured and the plasmid was recovered.
  • the recovered plasmid was used to re-transform Rhodococcus sp N775 to check for increased kanamycin resistance.
  • Several recombinants with apparently improved levels of kanamycin resistance were obtained. It has a mutation point with PLK006 strain, one of the recombinants obtained.
  • Chromosome and plasmid DNA were prepared from the recombinant transformed with the complex vector pK4, and the copy number of the plasmid was compared.PLK006 obtained by the mutagenesis treatment was about 5 times smaller than ⁇ 4. Double copy number had risen.
  • the nucleotide sequence of the multicopy mutant plasmid PLK006 obtained in Example 3 was determined using a fluorescent sequencer ALFI I manufactured by Pharmacia. As a result, the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 4 was obtained. In the region shown in SEQ ID NO: 2, the guanine base at position 1336 is mutated (substituted) to a thymine base.
  • the expression level of the useful gene can be improved. Genetically modified products in which the expression level of useful genes has been improved in this way are very useful industrially.

Description

明細書 プラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片 技術分野
本発明は、 プラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片 に関し、 さらに、 ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を 有する遺伝子を含む DNA断片であって、 プラスミ ドのコピー数を増加させうる変 異点が該遺伝子内の少なくとも 1力所に存在する DNA断片および該 DNA断片を有す る多コピー数プラスミドベクターに関する。 背景技術
口ドコッカス厲に属する微生物は、 二トリル類を水和して対応するアミド類ま たは酸を生産するための微生物触媒として知られており、 また、 PCB (ポリ塩化 ビフエニル） 等の分解あるいは原油の脱硫に関与する酵素を生産すること、 さら には、 排水処理に用いられるようなバイオサーファクタントを生産することなど の非常に多様な性質を示すことから、 工業的に極めて有用な微生物であることが 知られている。
またロドコッカス ロドクロウス種 （Rhodococcus rhodochrous) に属する微 生物が極めて高性能な二トリル水和活性を有することが知られており、 バイォ法 アクリルアミドの製造触媒として工業的に利用されている。
このような状況下、 口ドコッカス属の宿主ベクター系の開発が以前から期待さ れ、 幾つか開発されている。 ロドコッカス属細菌の工業的に有用なプラスミ ドべ クタ一としては、 例えばロドコッカス ロドクロウス ATCC4276が保持するブラ スミ ド pRC001、 ロドコッカス ロドクロウス ATCC 14349が保持する pRC002、 口 ドコッカス ロドクロウス AKC 14348が保持する PRC003およびロドコッカス ロドクロウス IF0 3338が保持するプラスミ ド PRC004 (特許第 2983602号公報参 照） 、 および大腸菌細胞内で複製増殖可能なプラスミ ド DNA領域および薬剤耐性 遺伝子を含む DNA領域を有してなる複合プラスミ ドベクター ρΚ1、 ρΚ2、 ρΚ3および ρΚ4 (特開平 5- 64589号公報参照） 、 ロドコッカス エリス口ポリス IF012320が 保持する PRC020 (特開平 9- 28379号公報参照） などが挙げられる。 ロドコッカス 属細菌を宿主とするプラスミ ドベクターに有用遺伝子を導入して、 該遺伝子を発 現させる場合、 その有用遺伝子の発現量はプラスミドベクターのコピー数にほぼ 比例することが知られている。 しかしながら、 これらのプラスミ ドのロドコッカ ス属細菌の細胞内のコピー数は 2〜6程度であり、 外来遺伝子を高発現させるため には必ずしも充分なものではない。 発明の開示
したがって、 多コピー数プラスミ ドベクターに有用遺伝子を挿入したものを細 胞内に導入することにより高い遺伝子増幅効果が期待される。
本発明は、 ロドコッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、 ブラ スミ ドの自律増殖に関する遺伝子を含む DNA断片、 さらには口ドコッカス厲細菌 内で自律複製し得るプラスミドに由来し、 プラスミドの自律増殖に関する遺伝子 を含む DNA断片であって、 プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が該遺伝 子内の少なくとも 1力所に存在する DNA断片を提供することを目的とする。
本発明者らは、 口ドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機能を 有する遺伝子を含む DNA領域を明らかにし、 プラスミ ドのコピー数を増加させう る変異点が該遺伝子内の少なくとも 1力所に存在する DNA断片を取得することによ り本発明を完成させた。 すなわち、 本発明は、 プラスミド pRC001、 pRC002、 pRCO 03および pRC004から選ばれるプラスミドに由来し、 ロドコッカス属細菌内でブラ スミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片、 さらには、 ロド コッカス属細菌内で自律複製し得るプラスミドに由来し、 プラスミドの自律増殖 に関する遺伝子を含む DNA断片であって、 プラスミドのコピー数を増加させうる 変異点が該遺伝子内の少なくとも 1力所に存在する DNA断片、 に関するものである c すなわち、 本発明は以下のとおりである。
( 1 ) プラスミド pRC001、 pRC002、 pRC003および pRC004から選ばれるプラスミ ドに由来し、 ロドコッカス （Rhodococcus) 属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に 関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片、
( 2 ) 大きさが 1. 6kbであり、 制限酵素 Spl lおよび Sacl切断点を末端に有する ( 1 ) の DNA断片、 (3) 大きさが 1.7kbであり、 制限酵素 Smalおよび Sacl切断点を末端に有する ( 1) の DNA断片、
(4) 大きさが 1.9kbであり、 制限酵素 Smal切断点を両末端に有する （1) の D NA断片、
(5) 大きさが 2.3kbであり、 制限酵素 Sacl切断点を両末端に有する （ 1 ) の D NA断片、
(6) pRC004に含まれ、 ロドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関す る機能を有する遺伝子を含む、 配列番号 1の塩基配列からなる （1) の DNA断片、
(7) PRC004に含まれ、 ロドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関す る機能を有する遺伝子を含む、 配列番号 3の塩基配列からなる （ 1) の DNA断片、
(8) PRC004に含まれ、 ロドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関す る機能を有する遺伝子を含む、 配列番号 7の塩基配列からなる （ 1) の DNA断片、
(9) プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも 1力所に存在 する （ 1) 〜 （8) のいずれかの DNA断片、
( 1 0) プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が 1力所に存在する、 配 列番号 2の塩基配列からなる （9) の DNA断片、
( 1 1 ) プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が 1力所に存在する、 配 列番号 4の塩基配列からなる （9) の DNA断片、
( 1 2) プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が 1力所に存在する、 配列 番号 9の塩基配列からなる （9) の DNA断片、
(1 3) (9) 〜 （12) のいずれかの DNA断片を保有する、 ロドコッカス属 細菌内で自立増殖し多コピー数存在し得るプラスミド、 および
(14) 請求項 1 1に記載の DNA断片を保有する、 ロドコッカス属細菌内で自 律増殖し多コピー数存在し得るプラスミ ド pLK006。
本発明の、 口ドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有す る遺伝子を含む DNA断片であって、 プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点 が該遺伝子内の少なくとも 1力所に存在する DNA断片 （以下、 多コピープラスミ ド
DNA断片という） とは、 プラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含 む DNA断片であって、 変異点を有さない DNA断片を用いて作成されたプラスミドべ クタ一のコピー数と比較して、 変異点を有する DNA断片を用いて作成されたブラ スミ ドベクターのコピー数を増加させうる作用を有する DNA断片を意味する。 本 明細書においては、 コピー数という術語は 1細胞当たりのプラスミド分子数 （プ ラスミドの存在数） を意味し、 多コピー数という述語は、 プラスミドの自律増殖 に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片であって、 変異点を有さない DNA断片 を用いて作成されたプラスミ ドベクターのコピー数よりも多いコピー数を意味す る。
本発明の多コピープラスミ ド DNA断片は、 口ドコッカス属細菌内で自律増殖す るプラスミ ドあるいはプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片を適当な変異処理したものの中から取得することができる。
通常は、 口ドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミ ドあるいはプラスミ ド の自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片をマーカーとなりうる薬 剤耐性遺伝子を有するベクタープラスミ ド、 例えばカナマイシン耐性遺伝子を有 する PHSG298 (宝酒造製） 、 クロラムフエ二コール耐性遺伝子を有する PHSG398 (宝酒造製） 、 テトラサイクリン耐性遺伝子を有する PBR322 (宝酒造製） あるい はアンピシリン耐性遺伝子を有する PUC 18 (宝酒造製） に公知の方法で挿入し、 このベクタープラスミドを電気パルス法により宿主ロドコッカス属細菌に形質転 換し、 得られる形質転換体から公知の方法、 例えばアルカリ SDS法などによりプ ラスミド DNAを回収し、 制限酵素処理断片の解析などにより目的 DNA断片を確認す ることができる。
適当な変異処理とは、 上記のようにして作成したプラスミド保持菌に、 紫外線、 X線、 ァ線などを照射させるか、 あるいは N-メチル -N' -ニトロソグァ二ジンなど の変異剤で処理することなどである。 また、 生物が増殖する際に起こる自然突然 変異を利用することも可能である。
あるいは、 口ドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミ ドあるいはプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片を直接、 あるいは 1本鎖
DNAにした後に、 ヒドラジン、 ギ酸あるいは亜硝酸で処理すること、 または、 適 当なプライマーを選択して、 ヌクレオチドアナログあるいはマンガンイオンの存 在下などで PCRを行うことによるエラー誘発 PCRなどを含む公知の方法により DNA 断片に直接変異を導入することも効果的である。 この方法によれば、 DNA配列の 特定の場所に集中的に変異を導入することが可能なため、 例えば本発明で開示し ているようなプラスミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片 に特異的に変異を導入することが可能である。 また、 プラスミドの自律増殖に関 する機能を有する遺伝子を含む DNA断片を合成することも可能である。
以上のようにして変異を導入した薬剤マーカ一遺伝子を有するプラスミ ドべク 夕一を保持する組換え体を各種濃度の薬剤マーカーによる選択下で培養して薬剤 耐性濃度の上昇した菌株を選択することによりプラスミドコピー数の上昇したも のを得ることができる。 このような菌株は、 コピー数上昇による遺伝子増幅効果 により薬剤耐性濃度が上昇したものと考えることができる。 このような菌株から プラスミ ドを回収して多コピープラスミド DNA断片を得ることができる。
変異処理を施した口ドコッカス属細菌内で自律増殖するプラスミドあるいはプ ラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む DNA断片の場合には適当 な薬剤耐性遺伝子を有する上述のプラスミドベクターを挿入した後、 電気パルス 法により宿主口ドコッカス属細菌に形質転換し、 各種濃度の薬剤マーカ一による 選択下で培養して薬剤耐性濃度の上昇した菌株を選択することによりプラスミド コピー数の上昇したものを得ることができる。
マーカー遺伝子は、 薬剤耐性遺伝子を用いるのが簡便であるが、 アルカリホス ファターゼ、 ルシフェラーゼあるいは 1 ac Z遺伝子など検出が簡便な公知の方法を 使用することもできる。
コピー数の解析は、 例えば Journal of Bac ter i ol ogy, 152, p. 722 (1982)に 記載の方法に従い行うことができる。 すなわち、 細胞より染色体 DNAおよびブラ スミ ド DNAを抽出し、 双方の分子数の比を求めることにより行うことができる。 より簡便には、 変異点を有しないプラスミドを保持する組換え体と変異点を有す るプラスミドを保持する組換え体を全く同様に培養し、 プラスミドを回収してァ ガロース電気泳動を行い、 ェチジゥムブロミ ドなどで染色した後デンシトメトリ 一により分析することによりコピー数の比較を行うこともできる。
ロドコッカス ロドクロウス IF0 3338由来のプラスミド PRC004塩基配列を決 定した結果を配列番号 1に示す。 塩基配列情報から、 PRC004には 2つのオープン リーディング フレーム（0RF)が推定された。 1つは配列番号 5に示される 921 塩基 （配列番号 1の塩基配列の 1142番から 2062番の塩基） にコードされると予想 される 0RFであり （配列番号 6に推定されるアミノ酸配列を示す） 、 これは、 口 ドコッカス ロドクロウス NCIMB 13064由来のプラスミ ドの PKA22およびマイコ バクテリゥム フォルツィ夕ム由来の PAL5000のプラスミ ドの複製に関与する Rep Aタンパクと類似している。 もう 1つは配列番号 7に示される 282塩基 （配列番号 1の塩基配列の 2052番から 2333番の塩基） にコードされると推定される 0RFであ り （配列番号 8に推定されるアミノ酸配列を示す） 、 ロドコッカス エリスロボ リス NI86/21由来のプラスミド PFAJ2600の DNA結合性のプラスミ ド複製因子と推 定されている 0RFと類似している。 しかしながら、 以上の考察は遺伝子の類似性 に基づくものであり、 それらの機能を決定しているわけではなく、 実際には機能 していない疑似遺伝子 （シユードジーン） の可能性も高い。
本発明により初めて、 PRC004の Spl lと Saclによる切断で生じる約 1. 6kbの DNA断 片 （配列番号 3 ) 力 ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する機 能を有する遺伝子を含む領域であることが判明した。
すなわち、 PRC004を Smalで切断して生じた約 1. 9kbの DNA断片および Saclで切断 して生じた約 2. 3kbの DNA断片に口ドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に 関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。 さらにこ の Smalで切断して生じた約 1. 9kbの DNA断片を Sac lで切断して生じた約 1. 7kbを調 ベたところ、 この DNA断片にも口ドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に 関する機能を有する遺伝子を含む領域が含まれていることが判明した。 さらにこ の約 1. 7kbの DNA断片を Spl lで切断することにより生じた約 1. 6kbの DNA断片にも口 ドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む 領域が含まれていることが判明した。
上記の制限酵素 Sp l lおよび Sacl切断点を末端に有する約 1. 6kbの DNA断片中に存 在する BamHI、 Bgl l L SphL Xhol認識部位をそれぞれの制限酵素で切断して klen ow f ragmentなどで処理して末端平滑化してセルフライゲーションしたところ、 ロドコッカス属細菌内でのプラスミ ドの自律増殖の機能が失われたことから、 こ の領域に実際に機能しうるタンパク性の因子が存在することが判明した。
さらに、 PRC004の該 DNA断片における少なくとも 1力所の変異点の導入により プラスミ ドのコピー数を増加させうるという知見は、 本発明により初めて開示さ れたものである。
すなわち、 PRC004にマーカ一として機能しうるカナマイシン耐性遺伝子を含む プラスミドベクターを挿入した複合プラスミ ドベクターを用いて、 カナマイシン 耐性度が向上した変異体を取得することにより、 多コピー変異プラスミドを本発 明により初めて取得することができた。
この口ドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺伝 子を含む領域に変異点を少なくとも 1力所導入することにより多コピー変異ブラ スミドが得られることを初めて見いだした意義は大きく、 この発明を基に公知の 方法により容易に多コピー変異プラスミ ドが得られることを意味しているものと 思われる。
このような多コピー変異プラスミ ドの例としては、 本発明で得られたプラスミ ド PLK006などを挙げることができる。 PLK006では、 口ドコッカス属細菌内でブラ スミドの自律増殖に関する機能を有する遺伝子を含む領域のうち、 配列番号 3に 示される領域において 1336番目のグァニン塩基がチミン塩基へ置換した変異体で ある （配列番号 4 ) 。 これは、 配列番号 1の塩基配列の 2262番目の塩基、 配列番 号 7の塩基配列の 21 1番目の塩基に相当し、 配列番号 2および配列番号 9はそれ ぞれ配列番号 1および配列番号 7の 1-つの塩基において変異を有する配列を示し ている。 推定される 0RFのコードするアミノ酸配列は、 配列番号 8の 71番目のグ リシンがセリンに変異 （置換） したものである （配列番号 1 0 ) 。
なお、 プラスミ ド PLK006は、 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄 託センター （日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6 ) に、 受託番号 FERM BP-8085として、 2001年 6月 22日に寄託されている。
また、 本発明の DNA断片には、 該 DNAとストリンジェントな条件でハイブリダィ ズし、 かつロドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する 遺伝子を含む DNA断片、 または該 DNAとストリンジェントな条件でハイプリダイズ し、 かつロドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有し、 プ ラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも 1力所に存在する遺伝子 を含む DNA断片も含まれる。 ここで、 ストリンジェン卜な条件とは、 いわゆる特 異的なハイプリッドが形成され、 非特異的な八イブリッドが形成されない条件を いう。 この条件は、 相同性が高い DNA同士、 例えば少なくとも 60 %以上、 好まし くは 80 %以上、 さらに好ましくは 95 %以上の相同性を有する DNA同士がハイプリ ダイズし、 それより相同性の低い DNA同士がハイブリダィズしない条件、 あるい は通常のサザンハイブリダィゼーシヨン洗いの条件である 60° (：、 1XSS 0.1¾SS D、 好ましくは、 0.1XSS 0. SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件 があげられる。 このような DNAは、 例えば部位特異的変異法によって、 本発明の D NA断片の塩基配列を改変することによって得られる。 図面の簡単な説明
図 1は、 プラスミ ド pRC001、 pRC002, pRC003、 pRC004の制限酵素断片地図を示 す図である。
発明を実施するための最良の形態
次に、 実施例により本発明を更に具体的に説明するが、 下記の実施例は本発明 の技術的範囲を限定するものではない。
実施例 1
PRC004の口ドコッカス属細菌でプラスミ ドの自律増殖に関する機能を有する遺 伝子を含む DNA断片の調製
ロドコッカス ロドクロウス IF0 3338から抽出したプラスミ ド pRC004(l Ag) を制限酵素 Smalあるいは Sadを 5units加え 37で、 1時間反応させプラスミド DNAを 切断した。 制限酵素で切断したプラスミ ド液を 0.7% ァガロースゲル電気泳動に 供し、 Smalで切断したものは、 約 650bp、 約 1.9kbの DNA画分を、 Saclで切断した ものは、 約 300bp、 約 2.3kbの DNA断片をそれぞれ切り出した。
一方、 カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミ ドベクター PHSG299 (宝酒造 製） 0.5 gを制限酵素 Smalあるいは Saclを 5imits加え 37で、 1時間反応させブラ スミド DNAを切断した。 反応液に 1M-Tris- HC1 (pH9.0) を 1/10量加え、 アルカリホ スファ夕ーゼ（limit) と 65°C、 1時間反応させた。 制限酵素で切断したプラスミ ドベクター液を 0.7% ァガロースゲル電気泳動に供し、 それぞれ 2.7kbの DNA断片 を切り出した。
DNA断片の切り出しの際は、 サイズマ一カーとしてラムダファージ DNAの Hindll I消化物を用い、 DNAのサイズを算出した。 Gene clean kit (フナコシ （株））を用 いてァガロースゲルより DNAを回収し TE緩衝液 （lOmMTris- HC1, 1 mMEDTA, ( H 8.0)) に溶解した。
それぞれの DNA断片を含む液を等量ずつ混合し、 T4DNAリガ一ゼ limit, 1 m AT P, lOmM ジチオスレィ トール， 10mM MgCl2となるように各成分を加えて 4 ：、 1夜 反応させた。
大腸菌 JM105株のコンビテントセル （宝酒造製） に上記反応液を加え、 0° (：、 1 時間静置後、 42 、 2分間の熱処理を行い、 2XYT培地 （0.5%NaCl, 1%イースト エキス、 1.6%トリプトン） を加えて 37で、 1時間振とうした。 25 8ノ1111カナ マイシン、 ImM IPTG (イソプロピル- 3-ガラクトビラノシド） 、 および 0.02% X-gal (5-ブロモ -4-ク口口- 3-ィンドリル- ]3 -D-ガラクトビラノシド）を含む 2 XYT 寒天培地に塗布し、 37で、 1夜静置培養した。 出現したコロニーより白色のコロ 二一を選択し、 50 g/mlカナマイシン入りの 2XYT培地 （3ml) で 37でにて 8時間 振とう培養した。
15, OOOrpm, 5分間の遠心分離により菌体を回収し、 0.35ml STET溶液 （8%シュ 一クロース、 0. 5 % TritonX-100, 50mM EDTA, 10mM Tris-HCl (pH8.0) ) に懸濁 した。 リゾチーム液 （lOmgZml) 25^1を加え、 Vortexで 3秒間攪拌後、 沸騰して いる湯に 50秒間浸した。 15, 000rpm、 15分間の遠心分離により沈澱を取り除き上 清を得た。 これに TE飽和フエノール： クロ口ホルム （1:1) 液を 0.5ml加え攪拌後、 15，000rpm、 5分遠心分離を行い、 上層を得た。 ジェチルエーテル 0.5mlを加えて 混合後、 遠心分離を行い上層を除去した。 イソプロパノール 0.5ml、 2.5M酢酸ナ トリウム液 （pH4.5) 50 1を加え、 — 80 ：、 30分静置後 15, 000rpm、 10分遠心分 離を行い沈澱を得た。 70%エタノールで洗浄し、 減圧乾燥させ、 0.1mlの TE緩衝 液に溶解させた。
このようにして調製した上記プラスミド溶液を用いて、 制限酵素 Smalあるいは Saclで切断して、 目的の DNA断片が挿入されていることを確認した。 それぞれの D NA断片が挿入されたプラスミ ドを用いて、 電気パルス法によりロドコッカス 口 ドク口ウス ATCC12674を宿主として形質転換を行った。
電気パルス法による形質転換は、 以下の方法で行った。 ロドコッカス 口ドク 口ウス ATCC12674株の対数増殖期の細胞を遠心分離機により集菌し、 氷冷した 滅菌水にて 3回洗浄し、 滅菌水に懸濁した。 上記のプラスミ ド 1 1と菌体懸濁液 1 0/ 1を混合し氷冷した。 キュベットに DNAと菌体の懸濁液を入れ、 遺伝子導入装 置 Gene Pulser (BIO RAD)により 2. OkV、 200 OHMSで電気パルス処理を行った。 電 気パルス処理液を氷冷下、 10分間静置し、 37 で 10分間ヒートショックを行い、 MYK培地 （0.5%ポリペプトン、 0.3%バクトイーストエキス、 0.3%バクトモルト エキス、 0.2%KHP04、 0.2%KH2P04) 500 1を加え、 30 ：、 5時間静置した後、 50mg
/Lカナマイシン入り MYK寒天培地に塗布し、 30 、 3日間培養した。
表 1に使用したプラスミ ドと形質転換体の取得の有無を示す。 PRC004の約 1.9k bの Smal切断断片及び約 2.3kbの Sacl断片をプラスミドベクター pHSG299に挿入し たプラスミドを用いた場合にカナマイシン耐性組換え体が得られた。 得られた組 換え体からプラスミドを抽出してァガロース電気泳動により分析したところそれ ぞれ形質転換に使用したプラスミドと同じ分子量を示すプラスミドが得られた。
Figure imgf000011_0001
実施例 2
実施例 1と同様にしてロドコッカス ロドクロウス IF0 3338から抽出したプ ラスミ ド pRC004 (l g)を制限酵素 Smal及び Saclを 5units加え 37 、 1時間反応さ せプラスミド DNAを切断した。 制限酵素で切断したプラスミ ド液を 0.7 ァガロー スゲル電気泳動に供し、 約 1.7kbの DNA断片を切り出した。
一方、 カナマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドベクター PHSG299 (宝酒造 製） 0.5 gを制限酵素 Smal及び Saclを 5units加え 37で、 1時間反応させプラスミ ド DNAを切断した。 反応液に lM-Tris-HCl (pH9.0) を 1/10量加え、 アルカリホスフ ァターゼ（limit) と 65で、 1時間反応させた。 制限酵素で切断したプラスミドべ クタ一液を 0.7 ァガロースゲル電気泳動に供し、 2.7kbの DNA断片を切り出した。 それぞれの DNA断片を含む液を等量ずつ混合し、 T4DNAリガーゼ limit, 1 mM AT P、 lOmM ジチオスレィ トール， 10mM MgCl2となるように各成分を加えて 4 、 1 夜反応させた。
上記反応液で大腸菌 JM105を形質転換し、 上記の約 1. 7kbの DNA断片の挿入され たプラスミドを取得した。 得られたプラスミ ドを用いて電気パルス法によりロド コッカス ロドクロウス ATCC 12674を形質転換したところカナマイシン耐性の 形質転換体が取得できた。
実施例 3
実施例 2で得られたプラスミ ドを制限酵素 Sp 11および Smalを 5un i t s加え 37で、 1時間反応させプラスミ ド DNAを切断した。 切断したプラスミドをエタノール沈殿 により回収した後、 klenow f ragment 5uni ts添加して末端平滑化し、 T4DNAリガ ーゼ luni t、 ImM ATP, lOmM ジチオスレィトール， lOmM MgCl2となるように各成分 を加えて 4 ：、 1夜反応させた。
上記反応液で大腸菌 JM105を形質転換し、 上記の約 1. 6kbの DNA断片の挿入され たプラスミ ドを取得した。 得られたプラスミドを用いて電気パルス法によりロド コッカス ロドクロウス ATCC 12674を形質転換したところカナマイシン耐性の 形質転換体が取得できた。
実施例 4
多コピープラスミド DNA断片の取得。
プラスミ ド PRC004とプラスミ ド PHSG299とからなる複合プラスミ ドベクタ一 pK4 を用いて、 電気パルス法によりロドコッカス sp Ν775 (独立行政法人 産業技 術総合研究所 特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中 央第 6 ) に受託番号 FERM BP-961として、 1986年 1月 10日に寄託されている） を形 質転換した。 得られた形質転換体を 10mlの MYK培地で 30 にて 1日培養したものを クリーンベンチ内で紫外線を照射することにより変異処理を行った。 変異処理を 行つた培養液を 50〜400 g/mlのカナマイシンを含む MYK寒天培地に塗布し、 30で， 3日間培養した。
生育してきたコロニーを培養し、 プラスミ ドを回収した。 回収したプラスミ ド を用いてロドコッカス sp N775を再形質転換して、 カナマイシン耐性濃度が上 昇していることをチェックした。 明らかにカナマイシン耐性濃度が向上している 組換え体が数株得られた。 得られた組換え体の一つである PLK006株と変異点を有 さない複合ベクター pK4で形質転換した組換え体とから各々、 染色体及びプラス ミ ド DNAを調製してプラスミ ドのコピー数を比較したところ変異処理により得ら れた PLK006は ρΚ4と比べて約 5倍コピー数が上昇していた。
上記微生物のうち、 本発明者らにより作製された遺伝子組換え体に関しては、 上記番号にて独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託 されている。
実施例 5
変異点の決定。
実施例 3により得られた多コピー変異プラスミ ド PLK006の塩基配列をフアルマ シァ社蛍光シーケンサ ALFI Iを用いて決定した。 その結果、 配列番号 4に示され る塩基配列が得られた。 配列番号 2に示される領域において 1336番目のグァニン 塩基がチミン塩基へと変異 （置換） している。
産業上の利用可能性
本発明により提供されるロドコッカス属細菌を宿主とする多コピー数プラスミ ドベクターに有用遺伝子を導入することにより、 有用遺伝子の発現量を向上させ ることが可能である。 このようにして有用遺伝子の発現量が向上した遺伝子組換 え体は産業上非常に有用である。
本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取 り込むものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発 明の範囲を逸脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能である ことは当業者には容易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形およ び変更をも包含することを意図している。

Claims

請求の範囲
1. プラスミド pRC001、 pRC002、 pRC003および pRC004から選ばれるプラスミド に由来し、 ロドコッカス （Rhodococcus) 属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関 する機能を有する遺伝子を含む DNA断片。
2. 大きさが 1.6kbであり、 制限酵素 Spllおよび Sacl切断点を末端に有する請 求項 1に記載の DNA断片。
3. 大きさが 1.7kbであり、 制限酵素 Smalおよび Sacl切断点を末端に有する請 求項 1に記載の DNA断片。
4. 大きさが 1.9kbであり、 制限酵素 Smal切断点を両末端に有する請求項 1に 記載の DNA断片。
5. 大きさが 2.3kbであり、 制限酵素 Sacl切断点を両末端に有する請求項 1に 記載の DNA断片。
6. PRC004に含まれ、 ロドコッカス属細菌内でプラスミドの自律増殖に関する 機能を有する遺伝子を含む、 配列番号 1の塩基配列からなる請求項 1に記載の DN A断片。
7. pRC004に含まれ、口ドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する 機能を有する遺伝子を含む、配列番号 3の塩基配列からなる請求項 1に記載の DNA断 片。
8. pRC004に含まれ、 ロドコッカス属細菌内でプラスミ ドの自律増殖に関する 機能を有する遺伝子を含む、 配列番号 7の塩基配列からなる請求項 1に記載の DN A断片。
9. プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が少なくとも 1力所に存在す る請求項 1〜8のいずれか 1項に記載の DNA断片。
1 0. プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が 1力所に存在する、 配列 番号 2の塩基配列からなる請求項 9に記載の DNA断片。
1 1. プラスミ ドのコピー数を増加させうる変異点が 1力所に存在する、 配列 番号 4の塩基配列からなる請求項 9に記載の DNA断片。
1 2. プラスミドのコピー数を増加させうる変異点が 1力所に存在する、 配列 番号 9の塩基配列からなる請求項 9に記載の DNA断片。
1 3. 請求項 9〜 1 2のいずれか 1項に記載の DNA断片を保有する、 ロドコッカ ス属細菌内で自立増殖し多コピー数存在し得るプラスミド。
1 4. 請求項 1 1に記載の DNA断片を保有する、 ロドコッカス属細菌内で自律 増殖し多コピー数存在し得るプラスミド pLK006。
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