WO2002087554A2 - Ef-tu-bindende substanzen als ntibakterielles mittel - Google Patents

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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents

Definitions

  • the invention relates to the use of substances that bind to the bacterial translation factor EF-Tu, for inhibiting the formation of a cytoskeleton in bacterial cells and for producing antibacterial agents.
  • the invention further relates to antibacterial agents which contain partial sections of the amino acid sequences of domains 2 or / and 3 of a bacterial EF-Tu protein with a length of preferably 4-20 amino acids.
  • Penicillin or other antibiotics which have their specific inhibitory effect on growing bacterial cells have hitherto been used as antibacterial agents. This effect is based on the fact that these antibiotics prevent the expansion of the peptidoglycan structure necessary for cell growth. This destabilization of murine weakens growing cells significantly. Bacteria in the stationary phase are not inhibited, because in this phase there is no expansion of the mooring structure.
  • the bacterial protein EF-Tu contains domains 1, 2 and 3 (Song, H., Parsons, M .R., Rowell, S., Leonard, G., Phillips, EV, J. Mol. Biol. 285, 1 245-1 256, 1 999).
  • the sequences of the EF-Tu protein and its coding gene have been published for Escherichia coli and a number of other eubacteria and are accessible in databases. It also describes that domain 1 of EF-Tu plays a role in protein synthesis.
  • This cytoskeleton comprises a network of protein fibrils that is located close to the surface of the cytoplasmic membrane facing the cytoplasm and running through the cytoplasm.
  • the cytoplasmic membrane and the peripheral part of this network can be regarded as 2 concentric hollow tubes, the cytoplasmic membrane being the outer of the two tubes, the peripheral part of the network (cytoskeleton) the inner tube. Fibrils running through the cytoplasm complement and stabilize the system and are starting points for ribosomes. Ribosomes could also be detected on the peripheral part of the cytoskeleton, oriented towards the cytoplasm.
  • the prokaryotic cytoskeleton thus has several variants:
  • Variants that impart special functions consisting of proteins that are close to the actin of higher cells and define the length and diameter of the cell in rod-shaped bacteria
  • Variants which consist of proteins that are close to the tubulin of the higher cells and ensure the regulated cell division, as well as a variant that occurs generally in all prokaryotes (“basic cytoskeleton"), which consists of a network of protofilaments of the
  • Protein EF-Tu (elongation factor Tu) exists, which serves the cell as a shape-stabilizing structural element and acts as an attachment structure for ribosomes and other complex molecular aggregates.
  • Tu elongation factor
  • EF-Tu is a protein that contains 3 domains, whereby domain 1 is involved in the process of translation. No specific function has been described for domains 2 and 3. It has now been found that the laterally exposed epitopes of domains 2 and 3 form a fit, one surface being convex and one surface being concave. It is believed that these fits can cause the formation of EF-Tu polymers, particularly fibrils lined up linearly, both in vitro and in vivo. These fibrils are the components of the network that acts as a cytoskeleton. From this it can be deduced that substances that bind to EF-Tu, in particular in the area of domains 2 or / and 3, can serve to inhibit the formation of a cytoskeleton in bacterial cells and thus to produce an antibacterial agent.
  • the cytoskeletal network can thus be used as a target for a new class of antibiotics.
  • EF-Tu can serve as a target protein for new bacterial agents which can occupy the fitting sites on domain 2 or / and 3 and thereby prevent the build-up of EF-Tu polymers in the cell which are essential for the structure of the bacterial cell .
  • This mode of operation differs fundamentally from the mode of operation of other antibiotics that act on EF-Tu (see e.g. Vogeley, L., Palm, GJ, Mesters, JR, Hilgenfeld, R.: Conformational change of elongation factor Tu (EF-Tu) induced by antibiotic binding. J. Biol. Chem. 276 (2001), 1 71 49-1 71 55).
  • EF-Tu contains 394 amino acids.
  • Domain 1 includes amino acids 8-204, with amino acids 1 72-204 forming a connection structure to domain 2.
  • Domain 2 includes amino acids 205-298 and domain 3 includes amino acids 299-394.
  • domains 2 and 3 Different secondary structures occur within domains 2 and 3.
  • amino acid sequences from 31 7 to 328 and from 343 to 354, which are in domain 3 and form loops that protrude freely into the space and are candidate sequences for an interaction with amino acid sequences that are in a correspondingly positioned indentation at the Periphery of domain 2 are located, these sequences ranging from amino acid 21 8 to 224.
  • cell damage can generally be achieved in the bacterial cytoskeleton by inhibiting the polymerization of EF-Tu.
  • Such cell damage is achieved in particular in the case of ordinary bacterial cells which have a cell wall.
  • the invention is particularly applicable to eubacteria.
  • the substances which can be used to inhibit the build-up of cytoskeletons can be of a very wide variety of types, provided they are able to inhibit the interaction between domain 2 and domain 3 of two neighboring EF-Tu molecules. Suitable substances can be identified, for example, by a method comprising:
  • This method can be carried out both in vitro and in vivo.
  • purified EF-Tu molecules or suitable partial fragments thereof are preferably incubated under conditions in which fibril formation can take place.
  • the effect of a test substance on fibril formation can be determined in a simple manner, for example by immunological staining using labeled anti-EF-Tu antibodies or by using EF-Tu molecules which carry a labeling group, for example a fluorescent labeling group.
  • the method can also be carried out in vivo, the effect of adding a test substance on the fibril network in a cell being able to be determined by immunological methods, for example immunohistochemically with labeled anti-EF-Tu antibodies and microscopic evaluation.
  • Substances which inhibit the formation of EF-Tu polymers and which are obtainable by the process described above, and substances derived therefrom, for example by empirical derivatization and / or by co-m ute modeling, can be aspha rm a ze uti cal composition, optionally formulated together with pharmaceutically customary carriers, auxiliaries and / or diluents.
  • the pharmaceutical composition can be present, for example, as a liquid preparation, solid preparation, emulsion or dispersion. Depending on the preparation, it can be administered by injection, orally, rectally, nasally, topically, etc.
  • the dosage is selected depending on the active ingredient, the form of administration and the type and severity of the disease so that it is possible to combat bacterial infections.
  • the effect of the antibacterial agent can be of various types.
  • substances are used that can bind directly to the fitting sites of domains 2 or / and 3 of EF-Tu.
  • substances can also be used which bind to other positions of the EF-Tu molecule, but which have an inhibiting influence on the fit and thus lead to the prevention of fibril formation.
  • peptidic, antibacterial agents are used.
  • the peptidic agents are based on oligopeptides which bind to EF-Tu, preferably in the region of the matching sites of domains 2 and / or 3.
  • These oligopeptides can contain sections of the amino acid sequences of domains 2 or / and 3 with a length of preferably 4 to 20 amino acids, particularly preferably 5 to 15 amino acids and particularly preferably with a length of 6-1 2 amino acids. These sections are able to bind to complementary sequences of the other domain, i.e. Sequences from domain 2 are able to bind to domain 3 and sequences from domain 3 are able to bind to domain 2.
  • the substances which bind to EF-Tu contain partial sections of the amino acid sequences from domain 2 with a length of at least 4 and in particular at least 5 amino acids, in particular partial sections in the area of domain 2 of amino acids 21 8 to 224 and simultaneously no section of the Range of amino acids 31 7 to 328 or / and the range of amino acids 343 to 354 of domain 3 of EF-Tu corresponds.
  • Such sections can be, for example, "truncated" EF-Tu, which consist exclusively of domain 3 without domains 1 and 2 or exclusively of domains 1 and 2 without domain 3.
  • Such an EF-Tu fragment competes in the cell with the natural EF-Tu protein molecules synthesized by the cell and ensures chain termination when it is incorporated into the polymerizing protofilament, since the second domain required for chain extension is missing. This means that an intact network is no longer formed. This is tantamount to the loss of viability of the bacterial cell.
  • a disturbance in the form of the network in the bacterial cell has a negative influence on the shape and behavior of the bacterial cell, as could be determined by experiments. The negative influence on the shape and behavior of the cell is an indication of the expected cell death that occurs when the antibiotic according to the invention is used.
  • a particular advantage of the antibiotics according to the invention is that there is only a slight risk of bacterial resistance to this new class of antibiotics exists. Resistance would mean that the bacterium would degrade a peptide that was introduced into the cell. If this were to happen, the bacterium could not avoid degrading its structurally identical peptide, which is part of the cell's own EF-Tu protein and which is of the greatest importance for translation.
  • the antibacterial agents can include linear or cyclic peptide compounds or peptidomimetics.
  • Peptide compounds can be derived from natural L- amino acids, but also from other amino acids, e.g. D- ⁇ -amino acids, aza-aminic acids, ß-amino acids, non-genetically encoded L or / and D- ⁇ amino acids etc. or combinations thereof.
  • the production of peptidomimetics is described, for example, in RIPKA, A.S. , RICH, D.H. (1,998) Peptidomimetic design, Curr. Op. Chem. Biol. 2, 441-452.
  • the peptidic compounds or peptidomimetics can contain bound hydrophobic groups which facilitate the transfer through the cytoplasmic membrane or groups with a large space filling which hinder the attachment of further EF-Tu molecules and thus the formation of a polymerization product.
  • the antibacterial agents can carry groups with a protective function against degradation.
  • the antibacterial agents can be used against any prokaryotic organisms and archaea, in particular pathogenic organisms. Both gram-positive bacteria, gram-negative bacteria and mycoplasma have an EF-Tu-based cytoskeleton and can therefore be controlled by the agent according to the invention. For example, antibacterial agents against vancomycin-resistant germs, for example staphylococci, can be used. This means that the new class of antibiotics has a wide range of applications. It was found that those areas which are responsible for the binding of the monomers to form the protofilaments are very similar in terms of their amino acid sequence in all the bacteria examined. EF-Tu is highly conserved in this area. The distances between these areas in a given EF-Tu molecule, i.e. the distances between the exposed areas of domains 2 and 3, are also identical, expressed in terms of the number of amino acids, with always 1 26 amino acids between the conserved areas.
  • the antibiotics according to the invention are distinguished by a high specificity and, in particular, very few side effects. Large EF-Tu sequences do not occur in the human cell except in mytochondria. The mytochondrial EF-Tu-like sequences are largely protected against the antibiotic by the double membrane of the mytochondria.
  • FIG. 1 shows the macromolecular architecture of the bacterial protein EF-Tu, in which domains 1, 2 and 3 are designated in more detail.
  • This bacterial protein EF-Tu can assemble during the polymerization to form periodically built fibrils, as shown in FIG. 2.
  • FIG. 3 shows a schematic illustration of the polymerization at the reactive binding regions of the domains 2 and 3 denoted by + or -.
  • FIG. 4 shows an enlargement (enlargement: approx. 1.5 million) of an electron micrograph of an in vivo polymerized, isolated fibril made of EF-Tu protein molecules. Above the dotted Domain 1 is located on the line, below which are the domains 2 and 3, which are joined together.
  • EM 1 Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum
  • Mp the wallless bacterium Mycoplasma pneumoniae
  • the experiments involve the identification and cellular localization of candidate proteins for such a bacterial cytoskeleton by using anti-actin antibodies (produced against actin of the higher cell), whose more or less strong cross-reactivity with bacterial proteins is due to the fact that it is in bacteria there are known proteins that belong to the actin superfamily, without striking sequence homologies with actin of the higher cell. Prokaryotes have no pronounced actin genes.
  • Network of protein fibrils is located, the components of which cross-react with the anti-actin antibodies.
  • the cytoplasmic membrane and the peripheral part of this network formally form two concentric
  • Tubes represents the peripheral part of the network (cytoskeleton) the inner.
  • Fibrils running through the cytoplasm complement and stabilize the system and are starting points for ribosomes. Ribosomes also attach to the peripheral part of the cytoskeleton, oriented towards the cytoplasm.
  • the cells of EM 1 were disrupted using the French press and SDS gel electrophoresis and Western blotting were carried out with the material obtained (soluble fraction, particulate fraction).
  • Several defined bands were obtained in the SDS gel, one band of which (at approx. 43 kDa) was stainable with both anti-actin antibodies and with anti-EF-Tu antibodies obtained against EF-Tu from Mp. This band increased where the particulate fraction of the cell disruption obtained by low-speed centrifugation was used as material for the SDS gel electrophoresis.
  • the anti-EF-Tu antibodies were used because EF-Tu is usually found at 43 kDa (it accounts for up to 9% of the protein mass of a bacterium), because EF-Tu belongs to the actin superfamily, and because EF-Tu occurs in large quantities in a prokaryotic cell.
  • EF-Tu As a structural component of a bacterial cytoskeleton is new. From this property of the EF-Tu as a building component for a complex network, as represented by the cytoskeleton, it can be deduced that the bacterial cell has to use a large amount of protein for this. A comparison of the construction of this bacterial cytoskeleton with that of the higher cell shows that the bacterial cytoskeleton should also be made up of several protein types.
  • EF-Tu is a main component. In the higher cell, EF-Tu is not involved in the formation of the cytoskeleton (the higher cell does not have EF-Tu), but it is known that a large number of different proteins contribute to the cytoskeleton.
  • Ribosomes which are shown to be the attachment points for the auxiliary function performing EF-Tu in the course of translation (EF-Tu acts here with its domain 1). From this it was concluded that in the course of translation it is not the EF-Tu that goes to the ribosome, but the ribosome that goes to the EF-Tu, which, in its capacity as a component of the cytoskeleton, is spatially fixed to the cell periphery and to those running across the cytoplasm fibrils.

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die an den bakteriellen Translationsfaktor EF-Tu binden, zur Hemmung des Aufbaus eines Cytoskeletts in Bakterienzellen und zur Herstellung antibakterieller Mittel. Weiterhin betrifft die Erfindung antibakterielle Mittel, die Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen der Domänen 2 und/oder 3 eines bakteriellen EF-Tu Proteins mit einer Länge von vorzugsweise 4-20 Aminosaüren enthalten.

Description

Antibakterielles Mittel
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die an den bakteriellen Translationsfaktor EF-Tu binden, zur Hemmung des Aufbaus eines Cytoskeletts in Bakterienzellen und zur Herstellung antibakterieller Mittel. Weiterhin betrifft die Erfindung antibakterielle Mittel, die Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen der Domänen 2 oder/und 3 eines bakteriellen EF-Tu-Proteins mit einer Länge von vorzugsweise 4-20 Aminosäuren enthalten.
Als antibakterielle Mittel wurden bisher unter anderem Penicillin oder andere Antibiotika eingesetzt, welche ihre spezifische Hemmwirkung auf wachsende Bakterienzellen entfalten. Diese Wirkung beruht darauf, dass diese Antibiotika die beim Zellwachstum nötige Erweiterung des Peptidoglycangerüsts verhindern. Wachsende Zellen werden durch diese Destabilisierung des Mureins entscheidend geschwächt. Bakterien in der stationären Phase werden nicht gehemmt, denn in dieser Phase erfolgt keine Erweiterung des Mureingerüsts.
Das bakterielle Protein EF-Tu enthält die Domänen 1 , 2 und 3 (Song, H., Parsons, M .R., Rowell, S., Leonard, G., Phillips, E.V., J . Mol. Biol. 285, 1 245-1 256, 1 999) . Die Sequenzen des Proteins EF-Tu und seines kodierenden Gens sind für Escherichia coli und eine Reihe anderer Eubakterien publiziert und in Datenbanken zugänglich. Hier wird auch beschrieben, dass die Domäne 1 von EF-Tu bei der Proteinsynthese eine Rolle spielt.
Die mögliche Existenz eines prokaryotischen permanenten Cytoskeletts wurde in Naturwissensch. 85, 1 998, 278-282 (Mayer et al.) diskutiert. Eine Beteiligung des bakteriellen Proteins EF-Tu an der Ausbildung eines solchen Cytoskeletts war jedoch nicht bekannt.
Bisher ist in der Literatur (vgl. z.B. Schilstra, M .J., Slot., J.W. van der Meide, P.H., Posthuma, G ., Cremers, A.F., Bosch, L. : Immunocytochemical localization of the elongation factor Tu in Escherichia coli cells., Biochem. Biophys. Acta 1291 , (1 996), 1 22-1 30) im Hinblick auf die Anordnung von EF-Tu in Bakterienzellen davon ausgegangen worden, dass EF-Tu praktisch homogen im Cytoplasma verteilt ist. Bei bisherigen Versuchen wurde dabei wohl nicht berücksichtigt, dass künstlich hergestellte EF-Tu-Fibrillen in vitro durch Kälte depolymerisiert werden können.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass in prokaryotischen Zellen ein Cytoskelett vorliegt, welches mit Anti-EF-Tu-Antikörpern angefärbt werden kann. Dieses Cytoskelett umfasst ein Netzwerk von Proteinfibrillen, das sich nahe der zum Cytoplasma gerichteten Oberfläche der cytoplasmatischen Membran und durch das Cytoplasma verlaufend befindet. Die cytoplasmatische Membran und der periphere Teil dieses Netzwerks können als 2 konzentrische Hohlröhren angesehen werden, wobei die cytoplasmatische Membran die äußere der beiden Röhren darstellt, der periphere Teil des Netzwerks (Cytoskelett) die innere Röhre. Durch das Cytoplasma verlaufende Fibrillen ergänzen und stabilisieren das System und sind Ansatzstellen für Ribosomen. Ribosomen konnten auch am peripheren Teil des Cytoskeletts, orientiert in Richtung Cytoplasma, nachgewiesen werden.
Das prokaryotische Cytoskelett weist somit mehrere Varianten auf:
Varianten, welche spezielle Funktionen vermitteln, bestehend aus Proteinen, welche dem Actin von höheren Zellen nahestehen und bei stäbchenförmigen Bakterien Länge und Durchmesser der Zelle definieren, Varianten, welche aus Proteinen bestehen, die dem Tubulin der höheren Zellen nahestehen und für die geregelte Zellteilung sorgen sowie eine generell bei allen Prokaryonten vorkommende Variante ("basic cytoskeleton"), welche aus einem Netzwerk von Protofilamenten des
Proteins EF-Tu (elongation factor Tu) besteht, welche der Zelle als formstabilisierende Strukturelement dient und als Anheftungsstruktur für Ribosomen und andere komplexe Molekülaggregate fungiert. Die letzte Variante wird hierin auch als cytoskeletales Netzwerk bezeichnet.
EF-Tu ist ein Protein, welches 3 Domänen enthält, wobei Domäne 1 am Vorgang der Translation beteiligt ist. Für die Domänen 2 und 3 wurde bisher keine spezifische Funktion beschrieben. Nun wurde gefunden, dass die seitlich exponierten Epitope der Domänen 2 und 3 eine Passung bilden, wobei eine Oberfläche konvex und eine Oberfläche konkav ist. Es wird angenommen, dass diese Passungen die Ausbildung von EF-Tu-Polymeren, insbesondere linear aneinander gereihten Fibrillen, bewirken können und zwar sowohl in vitro als auch in vivo. Diese Fibrillen sind die Komponenten des Netzwerks, welches als Cytoskelett fungiert. Daraus kann abgeleitet werden, dass Substanzen, die an EF-Tu binden, insbesondere im Bereich der Domänen 2 oder/und 3, zur Hemmung des Aufbaus eines Cytoskeletts in Bakterienzellen und somit zur Herstellung eines antibakteriellen Mittels dienen können.
Das cytoskeletale Netzwerk kann somit als Angriffspunkt (Target) für eine neue Klasse von Antibiotika herangezogen werden.
Insbesondere kann EF-Tu als Target-Protein für neue bakterielle Mittel dienen, welche die Passungsstellen auf Domäne 2 oder/und 3 besetzen können und dadurch den Aufbau von EF-Tu-Polymeren in der Zelle unterbinden, die für die Struktur der Bakterienzelle essenziell sind . Diese Funktionsweise unterscheidet sich grundsätzlich von der Funktionsweise anderer auf EF-Tu-wirkender Antibiotika (vgl. z.B. Vogeley, L., Palm, G.J., Mesters, J.R., Hilgenfeld, R. : Conformational change of elongation factor Tu (EF-Tu) induced by antibiotic binding. J. Biol. Chem. 276 (2001 ), 1 71 49-1 71 55) . Dort wird gezeigt, dass bisher bekannte Antibiotika vom Kirromycintyp dadurch wirken, dass sie die Reversibilität einer Konformationsänderung an Domäne 1 verhindern, wobei sich die Domäne 1 in Richtung der Domäne 2 biegt, wenn GTP gebunden wird. Dieser Mechanismus ist grundsätzlich verschieden von dem hierin beschriebenen Wirkungsmechanismus einer Polymerisationshemmung bei dem die Domänen 2 und 3 involviert sind.
EF-Tu umfasst 394 Aminosäuren. Zur Domäne 1 gehören die Aminosäuren 8-204, wobei die Aminosäuren 1 72-204 eine Verbindungsstruktur zur Domäne 2 bilden. Zur Domäne 2 gehören die Aminosäuren 205-298 und zur Domäne 3 gehören die Aminosäuren 299-394.
Innerhalb der Domänen 2 und 3 treten unterschiedliche Sekundärstrukturen auf. Von besonderem Interesse sind dabei die Aminosäuresequenzen von 31 7 bis 328 und von 343 bis 354, welche in Domäne 3 liegen und Schleifen bilden, die frei in den Raum ragen und Kandidatensequenzen für eine Wechselwirkung mit Aminosäuresequenzen sind, welche in einer entsprechend positionierten Eindellung an der Peripherie von Domäne 2 liegen, wobei diese Sequenzen von Aminosäure 21 8 bis 224 reichen.
Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt, dass man beim bakteriellen Cytoskelett generell durch Hemmung der Polymerisation von EF-Tu eine Zellschädigung erreichen kann. Eine solche Zellschädigung wird insbesondere auch bei gewöhnlichen Bakterienzellen, welche eine Zellwand besitzen erzielt. Die Erfindung ist insbesondere auf Eubakterien anwendbar. Die zur Hemmung des Aufbaus von Cytoskeletten verwendbaren Substanzen können unterschiedlichster Natur sein, sofern sie in der Lage sind, die Wechselwirkung zwischen Domäne 2 und Domäne 3 von zwei benachbarten EF-Tu-Molekülen zu hemmen. Geeignete Substanzen können beispielsweise durch ein Verfahren identifiziert werden, umfassend:
(a) Inkontaktbringen einer zu testenden Substanz mit bakteriellem EF-Tu oder einem zur Polymerisation fähigen Teilfragment davon, beispielsweise einem Fragment, welches die Domänen 2 und 3 enthält, und (b) Bestimmen, ob die Substanz die Ausbildung von EF-Tu-Polymeren hemmen kann.
Dieses Verfahren kann sowohl in vitro als auch in vivo durchgeführt werden. Bei einem in 'rro-Verfahren werden vorzugsweise aufgereinigte EF-Tu-Moleküle bzw. geeignete Teilfragmente davon unter Bedingungen inkubiert, bei denen Fibrillenbildung stattfinden kann. Die Wirkung einer Testsubstanz auf die Fibrillenbildung lässt sich auf einfache Weise bestimmen, z.B. durch immunologische Anfärbung mittels markierter Anti- EF-Tu-Antikörper oder durch Verwendung von EF-Tu-Molekülen, die eine Markierungsgruppe, z.B. eine Fluoreszenzmarkierungsgruppe tragen. Selbstverständlich kann das Verfahren auch in vivo durchgeführt werden, wobei die Wirkung der Zugabe einer Testsubstanz auf das Fibrillennetzwerk in einer Zelle durch immunologische Methoden, z.B. immunhistochemisch mit markierten Anti-EF-Tu-Antikörpern und mikroskopische Auswertung, bestimmt werden kann.
Substanzen, welche die Ausbildung von EF-Tu-Polymeren hemmen, und die durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich sind sowie davon abgeleitete Substanzen, z.B. durch empirische Derivatisierung oder/und d u rc h Co m p ute r- M o d e l l i n g , kö n n e n a l s p h a rm a ze uti s c h e Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Hilfs- oder/und Verdünnungsmitteln formuliert werden. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann beispielsweise als Flüssigpräparat, Festpräparat, Emulsion oder Dispersion vorliegen. Die Verabreichung kann - je nach Präparat - durch Injektion, oral, rektal, nasal, topisch etc. erfolgen. Die Dosierung wird abhängig vom Wirkstoff, der Verabreichungsform und der Art und Schwere der Erkrankung so gewählt, dass eine Bekämpfung von bakteriellen Infektionen möglich ist.
Die Wirkung des antibakteriellen Mittels kann unterschiedlicher Natur sein. Einerseits werden Substanzen verwendet, die direkt an die Passungsstellen der Domänen 2 oder/und 3 von EF-Tu binden können. Andererseits können auch Substanzen verwendet werden, die an anderen Positionen des EF-Tu- Moleküls binden, jedoch einen hemmenden Einfluss auf die Passung nehmen und somit zu einer Unterbindung der Fibrillenbildung führen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden peptidische, antibakterielle Mittel eingesetzt. Die peptidischen Mittel basieren auf Oligopeptiden, welche an EF-Tu, vorzugsweise im Bereich der Passungsstellen der Domänen 2 oder/und 3 binden. Diese Oligopeptide können Teilabschnitte der Aminosäure-Sequenzen der Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von vorzugsweise 4 bis 20 Aminosäuren, besonders bevorzugt 5 bis 1 5 Aminosäuren und insbesondere bevorzugt mit einer Länge von 6-1 2 Aminosäuren enthalten. Diese Teilabschnitte sind in der Lage, an komplementäre Sequenzen der jeweils anderen Domäne zu binden, d.h. Sequenzen aus der Domäne 2 sind in der Lage, an Domäne 3 zu binden und Sequenzen aus Domäne 3 sind in der Lage, an Domäne 2 zu binden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthalten die Substanzen, welche an EF-Tu binden, Teilabschnitt der Aminosäuresequenzen aus der Domäne 2 mit einer Länge von mindestens 4 und insbesondere mindestens 5 Aminosäuren, insbesondere Teilabschnitte im Bereich der Domäne 2 der Aminosäuren 21 8 bis 224 und gleichzeitig keinen Abschnitt der den Bereich der Aminosäuren 31 7 bis 328 oder/und dem Bereich der Aminosäuren 343 bis 354 von Domäne 3 von EF-Tu entspricht. Alternativ s i nd Su bsta n z en b evo rzugt, w e l c h e Te i l a b s c h n itte d e r Aminosäuresequenzen aus der Domäne 3 mit einer Länge von mindestens 4 Aminosäuren, insbesondere von mindestens 5 Aminosäuren, besonders bevorzugt mindestens 6 Aminosäuren enthält und keine Teilabschnitte entsprechend den Aminosäuren 21 8 bis 224 von Domäne 2 umfasst. Solche Abschnitte können beispielsweise "truncated" EF-Tu sein, welche ausschließlich aus der Domäne 3 ohne die Domänen 1 und 2 oder ausschließlich aus den Domänen 1 und 2 ohne die Domäne 3 bestehen. Ein solches EF-Tu-Bruchstück konkurriert in der Zelle mit den von der Zelle synthetisierten eigenen natürlichen EF-Tu-Proteinmolekülen und sorgt bei seinem Einbau in das aufpolymerisierende Protofilament für einen Kettenabbruch, da jeweils die zweite für die Kettenverlängerung erforderliche Domäne fehlt. Dadurch bildet sich kein intaktes Netzwerk mehr. Dies ist gleichbedeutend mit dem Verlust der Lebensfähigkeit der Bakterienzelle. Eine Störung der Ausprägung des Netzwerkes in der Bakterienzelle beeinflusst Form und Verhalten der Bakterienzelle negativ, wie durch Versuche festgestellt werden konnte. Der negative Einfluss auf Form und Verhalten der Zelle stellt einen Hinweis auf den zu erwartenden Zelltod dar, der bei Anwendung des erfindungsgemäßen Antibiotikums eintritt.
Anstelle des beschriebenen "truncated" EF-Tu-Bruchstücks kann auch ein Antibiotikum eingesetzt werden, bei welchem eine Verhinderung der Polymerisierung von EF-Tu-Proteinmolekülen, also ein Kettenabbruch durch andere Mittel erzielt wird, beispielsweise durch das Vorhandensein von Abschnitten, welche die Anbindung von weiteren EF-Tu-Proteinmolekülen verhindern.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäßen Antibiotika besteht darin, dass nur eine geringe Gefahr zur Entstehung bakterieller Resistenz gegen diese neue Klasse von Antibiotika besteht. Eine Resistenz würde bedeuten, dass das Bakterium ein ins Zellinnere eingeschleustes Peptid abbauen würde. Würde das geschehen, könnte das Bakterium nicht vermeiden, sein strukturell gleiches eigenes Peptid, welches ja Bestandteil des zelleignenen EF-Tu-Proteins darstellt und welches für die Translation von größter Bedeutung ist, mit abzubauen.
Die antibakteriellen Mittel können lineare oder cyclische peptidische Verbindungen oder Peptidomimetika umfassen. Peptidische Verbindungen können aus natürlichen L- -Aminosäuren, andererseits jedoch auch aus anderen Aminosäuren, z.B. D-α-Aminosäuren, Azaaminidsäuren, ß- Aminosäuren, nicht genetisch kodierten L- oder/und D-σ-Aminosäuren etc. oder Kombinationen davon aufgebaut sein . Die Herstellung von Peptidomimetika ist beispielsweise in RIPKA, A.S. , RICH, D.H. ( 1 998) Peptidomimetic design, Curr. Op. Chem. Biol.2, 441 -452, beschrieben.
Weiterhin können die peptidischen Verbindungen oder Peptidomimetika gebundene hydrophobe Gruppierungen, die den Transfer durch die cytoplasmatische Membran erleichtern oder Gruppierungen mit großer Raumerfüllung, welche die Anlagerung weiterer EF-Tu-Moleküle und so die Ausbildung eines Polymerisationsprodukts behindern, enthalten. Weiterhin können die antibakteriellen Mittel Gruppen mit Schutzfunktion gegen einen Abbau tragen.
Die antibakteriellen Mittel können gegen beliebige prokaryotische Organismen und Archaea, insbesondere pathogene Organismen, eingesetzt werden. Sowohl gram-positive Bakterien, gram-negative Bakterien als auch Mykoplasmen besitzen ein auf EF-Tu-basierendes Cytoskelett und können daher durch das erfindungsgemäße Mittel bekämpft werden. Beispielsweise können antibakteriellen Mittel gegen Vancomycin-resistente Keime, z.B. Staphylococcen, eingesetzt werden. Für die neue Klasse von Antibiotika ergibt sich somit ein breites Anwendungsspektrum. Es wurde festgestellt, dass diejenigen Bereiche, welche für die Bindung der Monomeren zur Ausbildung der Protofilamente zuständig sind, bei allen untersuchten Bakterien bezüglich ihrer Aminosäuresequenz sehr ähnlich sind. EF-Tu ist in diesen Bereich hoch konserviert. Auch die Abstände dieser Bereiche voneinander in einem gegebenen EF-Tu-Molekül, also die Abstände der exponierten Bereiche der Domänen 2 und 3 sind, ausgedrückt in der Anzahl von Aminosäuren, identisch, wobei immer 1 26 Aminosäuren zwischen den konservierten Bereichen liegen.
Die erfindungsgemäßen Antibiotika zeichnen sich durch eine hohe Spezifität und insbesondere sehr geringe Nebenwirkungen aus. Große EF- Tu-Sequenzen treten in der menschlichen Zelle außer in Mytochondrien nicht auf. Die mytochondrialen EF-Tu-ähnlichen Sequenzen sind durch die Doppelmembran der Mytochondrien gegen das Antibiotikum weitestgehend geschützt.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert werden.
Die Figur 1 zeigt die makromolekulare Architektur des Bakterienproteins EF- Tu, in dem die Domänen 1 , 2 und 3 näher bezeichnet sind. Dieses bakterielle Protein EF-Tu kann sich bei der Polymerisation zu periodisch gebauten Fibrillen zusammenlagern, wie in Figur 2 gezeigt ist.
Figur 3 zeigt eine schematische Darstellung der Polymerisation an den mit + oder - bezeichneten, reaktiven Bindungsbereichen der Domäne 2 und 3.
Die Figur 4 zeigt eine Vergrößerung (Vergrößerung: ca. 1 ,5 Millionen) einer elektronenmikroskopischen Aufnahme einer in vivo polymerisierten, isolierten Fibrille aus EF-Tu-Proteinmolekülen. Oberhalb der punktierten Linie befinden sich die Domänen 1 , unterhalb davon die aneinandergelagerten Domänen 2 und 3.
Wird die Polymerisation des EF-Tu-Proteins an den in Figur 3 mit + und - bezeichneten Bindungsbereichen durch Zugabe eines Überschusses an Partikeln, enthaltend Teilabschnitte der Aminosäure-Sequenz der Domänen 2 oder 3, zurückgedrängt, so wird das Überleben der betroffenen Bakterienzelle unmöglich gemacht, weil die Zellstruktur zusammenbricht.
Beispiel:
Es wurden Versuche mit dem g ram-positiven Ba kterium Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum EM 1 (im Folgenden abgekürzt als EM 1 ) und dem wandlosen Bakterium Mycoplasma pneumoniae (im Folgenden abgekürzt als Mp) durchgeführt, welche belegen, dass diese Bakterien ein permanentes Cytoskelett auf Basis von EF-Tu besitzen.
Die Versuche umfassen die Identifizierung und zelluläre Lokalisation von Kandidaten-Proteinen für ein solches bakterielles Cytoskelett durch Anwendung von Anti-Actin-Antikörpern (hergestellt gegen Actin der höheren Zelle), deren mehr oder weniger starke Kreuzreaktivität mit bakteriellen Proteinen darauf beruht, dass es bei Bakterien bekanntermaßen Proteine gibt, welche zur Actin-Superfamilie gehören, ohne auffällige Sequenzhomologien mit Actin der höheren Zelle aufzuweisen. Prokaryonten haben keine ausgesprochenen Actin-Gene.
Neben Immunelektronenmikroskopie mit den oben genannten Antikörpern an Ultradünnschnitten durch Bakterien wurden auch "Whole mount"-
Techniken verwendet. Es wurde durch die Kombination dieser Techniken gefunden, dass sich nahe der zum Cytoplasma gerichteten Oberfläche der cytoplasmatischen Membran und durch das Cytoplasma verlaufend ein
Netzwerk aus Proteinfibrillen befindet, dessen Komponenten mit den Anti- Actin-Antikörpern kreuzreagieren. Cytoplasmatische Membran und der periphere Teil dieses Netzwerks bilden formal zwei konzentrische
Hohlröhren, wobei die cytoplasmatische Membran die äußere der beiden
Röhren darstellt, der periphere Teil des Netzwerks (Cytoskelett) die innere.
Durch das Cytoplasma verlaufende Fibrillen ergänzen und stabilisieren das System und sind Ansatzstellen für Ribosomen. Ribosomen setzen sich auch an den peripheren Teil des Cytoskeletts, orientiert Richtung Cytoplasma. Mit Hilfe der French-Presse wurden die Zellen von EM 1 aufgeschlossen und mit dem gewonnenen Material (lösliche Fraktion, partikuläre Fraktion) SDS- Gelelektrophorese und Western-Blotting durchgeführt. Im SDS-Gel wurden mehrere definierte Banden erhalten, von denen eine Bande (bei ca. 43 kDa) sowohl mit Anti-Actin-Antikörpern als auch mit Anti-EF-Tu-Antikörpern, gewonnen gegen EF-Tu von Mp, anfärbbar war. Diese Bande trat verstärkt dort auf, wo als Material für die SDS-Gelelektrophorese die partikuläre Fraktion des Zellaufschlusses, gewonnen durch niedrigtourige Zentrifugation, verwendet worden war. Die Anti-EF-Tu-Antikörper wurden benutzt, weil bei 43 kDa üblicherweise EF-Tu zu finden ist (es macht bis 9 % der Proteinmasse eines Bakteriums aus), weil EF-Tu zur Actin- Superfamilie gehört, und weil EF-Tu in großer Menge in einer prokaryotischen Zelle vorkommt.
Die Rolle von EF-Tu als Baukomponente eines bakteriellen Cytoskeletts ist neu. Aus dieser Eigenschaft des EF-Tu als Baukomponente für ein komplexes Netzwerk, wie es das Cytoskelett darstellt, kann abgeleitet werden, dass die Bakterienzelle hierfür eine große Proteinmenge einsetzen muss. Ein Vergleich des Baus dieses bakteriellen Cytoskeletts mit dem der höheren Zelle macht deutlich, dass auch das bakterielle Cytoskelett aus mehreren Proteintypen aufgebaut sein dürfte. EF-Tu ist eine Hauptkomponente. Bei der höheren Zelle ist zwar nicht EF-Tu an der Ausbildung des Cytoskeletts beteiligt (die höhere Zelle besitzt kein EF-Tu), jedoch ist bekannt, dass hier eine große Zahl unterschiedlicher Proteine zum Cytoskelett beiträgt.
Es gelang zu zeigen, dass die am Schnitt und bei Whole mount mit Anti- Actin-Antikörpern reagierenden Komponenten des oben bezeichneten Netzwerks des Cytoskeletts auch intensiv mit Anti-EF-Tu-Antikörpern reagierten. Diese Reaktion erfolgte bei Mp an der gesamten, durch Triton-Behandlung (Entfernen der cytoplasmatischen Membran) freigelegten, jetzt in Richtung Außenwelt exponierten, ursprünglich verdeckten Oberfläche. Die Kontrolle, hergestellt unter Verwendung von Zellen, welche nicht mit Triton, ansonsten jedoch gleich behandelt waren und somit nicht die cytoplasmatische Membran verloren hatten, zeigten keine Markierung. In diesem Kontrollversuch kaschierte also die cytoplasmatische Membran die potenziellen Bindungsstellen für EF-Tu.
Die durch Entfernen der cytoplasmatischen Membran freigelegte Oberfläche ist der periphere Teil des Cytoskeletts der Zelle. Nicht exponiert sind in dieser Situation innere Zellbestandteile, wie z.B. Ribosomen, von denen gezeigt ist, dass sie im Verlauf der Translation die Anheftungsstellen für das eine Hilfsfunktion ausführende EF-Tu sind (EF-Tu agiert hierbei mit seiner Domäne 1 ) . Daraus wurde geschlossen, dass im Verlauf der Translation nicht das EF-Tu zum Ribosom geht, sondern das Ribosom zum EF-Tu, welches ja, in seiner Eigenschaft als Komponente des Cytoskeletts, räumlich fixiert ist auf die Zellperipherie und auf quer durch das Cytoplasma verlaufende Fibrillen.
Das Vorkommen eines permanenten bakteriellen Cytoskeletts konnte weiterhin in den Eubakterien Escherichia coli, Bacillus sp., Ralstonia eutropha und Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes sowie in den Archaea Methanococcus jannaschii und Methanococcus voltae nachgewiesen werden.

Claims

Ansprüche
1 . Verwendung von Substanzen, die an EF-Tu binden, zur Hemmung des Aufbaus eines Cytoskeletts in Bakterienzellen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen im Bereich der Domäne 2 (Aminosäuren 205- 298) oder/und der Domäne 3 (Aminosäuren 299 bis 394) an EF-Tu binden.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen im Bereich der Aminosäuren 21 8 bis 224 von
Domäne 2 an EF-Tu binden.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen im Bereich der Aminosäuren 31 7 bis 328 oder/und 343 bis 354 von Domäne 3 an EF-Tu binden .
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen Teilabschnitte der Aminosäuresequenzen aus den Domänen 2 oder/und 3 mit einer Länge von 4 bis 20 Aminosäuren enthalten.
6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilabschnitte eine Länge von 5 bis 1 5 Aminosäuren, insbesondere von 6 bis 1 2 Aminosäuren aufweisen.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanzen ausgwählt werden aus linearen oder cyclischen peptidischen Verbindungen oder Peptidomimetika.
8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die peptidischen Verbindungen oder Peptidmimetika gebundene hydrophobe Gruppierungen, Gruppierungen mitgroßer Raumerfüllung oder/und Gruppen mit Schutzfunktionen gegen Abbau enthalten.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Herstellung eines antibakteriellen Mittels.
1 0. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das anti ba kterielle M ittel a ls pha rmazeutische Zusammensetzung gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Verdünnungs- oder/und Hilfsmitteln formuliert wird.
1 1 . Verwendung nach Anspruch 9 oder 10 zur Herstellung eines Mittels gegen gram-positive oder gram-negative Bakterien.
1 2. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10 zur Herstellung eines Mittels gegen Mycoplasmen.
1 3. Antibakterielles Mittel, enthaltend die Teilabschnitte der Aminosäure- Sequenzen der Domänen 2 und/oder 3 des bakteriellen Proteins EF- Tu mit einer Länge von 4 bis 20 Aminosäuren.
1 4. Antibakterielles Mittel nach Anspruch 1 3, enthaltend Teilabschnitte mit einer Länge von 5 bis 1 5 Aminosäuren.
1 5. Antibakterielles Mittel nach Anspruch 1 3 oder 14, enthaltend Teilabschnitte mit einer Länge von 6 bis 1 2 Aminosäuren.
1 6. Antibakterielles Mittel nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 5, dadurch gekennzeichnet, dass es an die Teilabschnitte gebundene hydrophobe Gruppierungen, Gruppierungen mit großer Raumerfüllung und/oder Gruppierungen mit Schutzfunktion gegen Abbau enthält.
1 7. Antibakterielles Mittel nach einem der Ansprüche 1 3 bis 1 6, formuliert als pharmazeutische Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Verdünnungsoder/und Hilfsmitteln.
1 8. Verfahren zur Identifizierung neuer antibakterieller Wirkstoffe, umfassend :
(a) Inkontaktbringen einer zu testenden Substanz mit bakteriellem EF-Tu oder einem zur Polymerisation fähigen Teilfragment davon und (b) Bestimmen, ob die Substanz die Ausbildung von EF-Tu-
Polymeren hemmen kann.
1 9. Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als in vitro - Test durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 1 8, dadurch gekennzeichnet, dass es als in vivo - Test durchgeführt wird.
21 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass zum Bestimmen der Ausbildung von EF-Tu-Polymeren markierte Antikörper oder/und markierte EF-Tu-Proteine oder polymerisierbare Teilfragmente davon verwendet werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 8 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass man eine Substanz, welche die Ausbildung von EF-Tu- Polymeren hemmt, oder eine davon abgeleitete Substanz, als pharmazeutische Zusammensetzung, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-, Verdünnungs oder/und Hilfsmitteln formuliert.
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