CZ20033271A3 - Antibacterial agent - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká použití látek vázajících se na bakteriální translační faktor EF-Tu pro inhibici výstavby cytoskeletu bakteriálních buněk a pro výrobu antibakteriálního prostředku. Vynález se dále týká antibakteriálních prostředků, které obsahují úseky aminokyselinových sekvencí domény 2 nebo/a 3 bakteriálního proteinu EF-Tu o délce s výhodou 4 až 20 aminokyselin.

ío Dosavadní stav techniky

Jako antibakteriální prostředky se dosud používaly mimo jiné penicilín nebo další antibiotika, která vykazovala specifický inhibiční účinek na rostoucí bakteriální buňky. Tento účinek je založen na zabránění rozšiřování peptidoglykanové kostry nutné při růstu buněk působením těchto antibiotik. Rostoucí buňky jsou touto destabilizací mureinů rozhodujícím způsobem oslabovány. Bakterie ve stacionární fázi nejsou inhibovány, protože v této fázi neprobíhá žádné rozšiřování mureinové kostry.

Bakteriální protein EF-Tu obsahuje domény 1, 2 a 3 (Song, H.,

Parsons, M. R., Rowell, S., Leonard, G., Phillips, E. V., J. Mol. Biol. 285, 1245 - 1256, 1999). Sekvence proteinu EF-Tu a genu kódujícího tento protein jsou publikovány pro Escherichia colí a řadu dalších eubakterií a jsou dostupné v databankách. Zde se také uvádí, že při syntéze proteinů má úlohu doména 1 proteinu EF-Tu.

Možná existence trvalého cytoskeletu u prokaryot byla diskutována v časopise Naturwissensch., 85, 1998, 278 - 282 (Mayer a další). Účast bakteriálního proteinu EF-Tu na tvorbě takového cytoskeletu však dosud nebyla známa.

• ·

Dosud se v literatuře (srovnej např. Schilstra, M. J., Slot, J. W., van der Meide, P. H., Posthuma, G., Cremers, a. F., Bosch, L.: Immunocytochemical localization of the elongation factor Tu in Escherichia coli celíš, Biochem. Biophys. Acta 1291 (1996), 122 - 130) z hlediska uspořádání EF-Tu v bakteriálních buňkách vycházelo z toho, že EF-Tu je v cytoplazmě rozdělen prakticky homogenně. Při dosavadních pokusech se však nebral ohled na to, že uměle vyrobené fibrily EF-Tu mohou depolymerovat působením chladu.

Překvapivě bylo zjištěno, že v prokaryotických buňkách se vyskytuje cytoskelet, který je možno barvit protilátkami proti EF-Tu. Tento cytoskelet zahrnuje síť proteinových fibril, která se převážně nalézá v blízkosti povrchu cytoplazmatických membrán směřujících do cytoplazmy a procházejících cytoplazmou. Na cytoplazmatickou membránu a periferní část této sítě je možno pohlížet jako na dvě soustřední duté trubice, přičemž cytoplazmatická membrána představuje vnější trubici a periferní část sítě (cytoskelet) vnitřní trubici. Fibrily procházející cytoplazmou doplňují a stabilizují systém a jsou místy pro přisednutí ribosomů. Ribosomy bylo možno prokázat také na periferní části cytoskeletu, orientované ve směru do cytoplazmy.

Prokaryotický cytoskelet tedy má více variant:

varianty, které zprostředkují speciální funkci, a které jsou založeny na proteinech blízkých aktinu vyšších buněk, a které v případě tyčinkovitých bakterií definují délku a průměr buněk, varianty, které se skládají z proteinů blízkých tubulinu vyšších buněk, a které zabezpečují řízené dělení buněk, a varianty, které se vyskytují obecně u všech prokaryot („základní cytoskelet“), které se skládají ze sítě protofilamentů proteinu EFTu (elongační faktor Tu), které buňkám slouží jako strukturní prvek stabilizující tvar, a které fungují jako struktura umožňující navázání ribosomů a jiných komplexních molekulárních • ·

- 3 • ·· ··· · · agregátů. Tato naposledy uvedená varianta se zde označuje jako cytoskeletární síť.

EF-Tu je protein obsahující tři domény, přičemž doména 1 se účastní průběhu translace. Pro domény 2 a 3 dosud nebyla popsána žádná specifická funkce. Nyní bylo zjištěno, že na stranách exponované epitopy domén 2 a 3 do sebe zapadají, přičemž jeden povrch je konvexní a druhý konkávní. Je přijímána hypotéza, že tato do se be zapadající místa se mohou účastnit tvorby polymerů EF-Tu, zvláště lineárně za sebou uspořádaných fibril, a to jak in vitro, tak i in vivo. Tyto fibrily jsou složky sítě, která funguje jako cytoskelet. 2 toho je možno vyvodit, že látky vázající se na EF-Tu, zvláště v oblasti domén 2 nebo/a 3, mohou sloužit k inhibici výstavby cytoskeletu v bakteriálních buňkách, a tím i pro výrobu antibakteriálního prostředku.

Cytoskeletární síť se tedy může zařadit k cílům nové třídy antibiotik.

Jako cílový protein pro nové bakteriální prostředky může sloužit zvláště EF-Tu, kde tyto prostředky mohou obsadit do sebe zapadající místa na doméně 2 nebo/a 3, a tím zabránit výstavbě polymerů EF-Tu v buňce, které jsou nezbytné pro strukturu bakteriální buňky.

Tento typ působení se podstatně liší od způsobu působení jiných antibiotik s účinkem na EF-Tu (srovnej např. Vogeley, L., Palm, G. J., Mesters, J. R., Holgenfeld, R.: Conformational change of elongation factor Tu (EF-Tu) induced by antibiotic binding, J. Biol. Chem. 276 (2001), 17149 - 17155). V tomto článku se uvádí, že dosud známá antibiotika typu kiromycinu působí tak, že zabrání reverzibilitě konformační změny na doméně 1, přičemž doména 1 se ohýbá ve směru domény 2, jestliže se naváže GTP. Tento mechanismus se zásadně liší od zde popisovaného mechanismu působení inhibice polymerace, kterého se účastní domény 2 a 3.

EF-Tu obsahuje 394 aminokyselin. K doméně 1 patří aminokyseliny 8 - 204, přičemž aminokyseliny 172 - 204 tvoří ··· ··· ·· ···· vazebnou strukturu pro doménu 2. K doméně 2 náleží aminokyseliny 205 až 298, a k doméně 3 náleží aminokyseliny 299 - 394.

Uvnitř domén 2 a 3 se vyskytují různé sekundární struktury.

Zvláště významné jsou přitom aminokyselinové sekvence 317 až 328 a 5 343 až 354, které se nacházejí v doméně 3 a tvoří smyčky, které vystupují do prostoru a jsou možnými kandidáty jako sekvence interagující s aminokyselinovými sekvencemi, které leží v odpovídajících prohloubeních na okraji domény 2, přičemž tyto sekvence se rozkládají v oblasti 218 až 224.

Podstata vynálezu

Podle vynálezu bylo překvapivě zjištěno, že je možno dosáhnout u bakteriálního cytoskeletu obecně inhibicí polymerace EF-Tu poškození buňky. Toto poškození buňky se dosahuje také zvláště u obvyklých bakteriálních buněk, které mají buněčnou stěnu. Vynález je použitelný zvláště u eubakterií.

Látky použitelné pro inhibici uspořádání látek používaných cytoskelety mohou mít různou povahu, pokud jsou schopny inhibovat interakci mezi doménou 2 a doménou 3 dvou sousedících molekul EF20 Tu. Vhodné látky se mohou identifikovat např. způsobem zahrnujícím následující kroky:

(a) testovaná látka se přivede do styku s bakteriálním EF-Tu nebo jeho částečným fragmentem schopným polymerace, např. fragmentem obsahujícím domény 2 a 3, a (b) určí se, zda může tato látka inhibovat tvorbu polymerů EF-Tu.

Tento způsob je možno provádět jak in vitro, tak i in vivo. Při způsobu prováděném in vitro se s výhodou inkubuje vyčištěná molekula EF-Tu, popř. její vhodné fragmenty, za podmínek, při kterých φ ·

- 5 • · probíhá tvorba fibril. Vliv testované látky na tvorbu fibril je možno určit jednoduchým způsobem, např. imunologickým barvením značenou protilátkou proti EF-Tu, nebo použitím molekul EF-Tu nesoucích značící skupinu, např. skupinu fluorescenční značky. Způsob se také samozřejmě může provádět in vivo, přičemž účinek přídavku testované látky na síť fibril v buňce se může zjišťovat imunologickými metodami, např. imunohistochemicky pomocí značených protilátek proti EF-Tu, a mikroskopickým vyhodnocením.

Látky, které inhibují tvorbu polymerů EF-Tu, a které je možno získat výše popsaným způsobem, se mohou stejně jako od nich odvozené látky, které je možno např. získat empirickou derivatizací nebo/a počítačovým modelováním, formulovat jako farmaceutický prostředek, např. s farmaceutickými nosiči, pomocnými látkami a/nebo ředivy.

Farmaceutický prostředek může být např. ve formě kapalného preparátu, pevného preparátu, emulze nebo disperze. Prostředek se může podávat v závislosti na jeho typu injekcí, orálně, rektálně, nazálně, místně atd. Dávkování se bude volit podle účinné látky, způsobu podávání a typu a vážnosti onemocnění tak, aby bylo možno účinně bojovat s bakteriálními infekcemi.

Účinek antibakteriálních prostředků může mít různou povahu. Na jedné straně se používají látky, které přímo působí na do sebe zapadající místa domén 2 nebo/a 3 EF-Tu. Dále se mohou používat také látky, které se vážou na jiné polohy molekuly EF-Tu, přičemž však stále mají inhibiční účinek na do sebe zapadající místa a tím vedou k přerušení tvorby fibril.

Ve výhodném provedení vynálezu se používají peptidické antibakteriální prostředky. Peptidické prostředky jsou založeny na oligopeptidech, které se vážou na EF-Tu, s výhodou v oblasti do sebe zapadajících míst domén 2 nebo/a 3. Tyto oligopeptidy mohou obsahovat částečné úseky aminokyselinových sekvencí domény 2 • · θ ······ ······ nebo/a 3 ο délce s výhodou 4 až 20 aminokyselin, výhodněji 5 až 15 aminokyselin a zvláště výhodně o délce 6 až 12 aminokyselin. Tyto úseky jsou schopny vázat se na komplementární sekvence odpovídající vždy opačné doméně, tzn. sekvence z domény 2 jsou schopny vázat se na doménu 3 a sekvence z domény 3 jsou schopny vázat se na doménu 2.

V dalším výhodném provedení obsahují látky schopné vazby na EF-Tu, úsek aminokyselinových sekvencí z domény 2 o délce alespoň čtyři a zvláště alespoň pět aminokyselin, zvláště úseky z oblastí domény 2 aminokyselin 218 až 224, a současně neobsahují úsek odpovídající oblasti aminokyselin 317 až 328 nebo/a z oblasti aminokyselin 343 až 354 domény 3 EF-Tu. Alternativně jsou výhodné látky, které obsahují úseky aminokyselinové sekvence z domény 3 o délce alespoň čtyři aminokyseliny, zvláště alespoň pět aminokyselin, zvláště výhodně alespoň šest aminokyselin, a neobsahují úseky odpovídající aminokyselinám 218 až 224 domény 2. Tyto úseky mohou být např. „zkrácené“ EF-Tu, které se skládají výhradně z domény 3 bez domén 1 a 2 nebo výlučně z domén 1 a 2 bez domény 3. Takový štěpný produkt EF-Tu v buňce konkuruje s vlastními přirozenými molekulami proteinu syntetizovanými v buňce a při vestavbě do polymerizujícího prekurzoru vlákna způsobí přerušení řetězce, protože vždy chybí druhá doména nezbytná pro prodloužení řetězce. Tak se již nevytvoří neporušená síť. To je souznačné se ztrátou životaschopnosti bakteriální buňky. Porucha při vytváření sítě v bakteriální buňce negativně ovlivní formu a chování bakteriální buňky, což bylo možno experimentálně potvrdit. Negativní vliv na formu a chování buňky vede k očekávané smrti buňky, ke které dojde při použití antibiotika podle vynálezu.

Namísto výše popsaných „zkrácených“ štěpných produktů EF-Tu se může také použít antibiotikum, u kterého se dosáhne zabránění polymerace proteinových molekul EF-Tu a tedy přerušení řetězce • · • · · •y ··· ··· «· ··«· jiným způsobem, např. přítomností úseků, které zabraňují vazbě dalších proteinových molekul EF-Tu.

Zvláštění výhoda antibiotika podle vynálezu spočívá v tom, že je pouze malé nebezpečí vyvinutí rezistence bakterií na tuto novou skupinu antibiotik. Rezistence by znamenala, že by bykterie odbourala peptid vestavěný uvnitř buňky. Pokud by se to stalo, nemohla by bakterie zabránit současnému odbourávání vlastního peptidu se stejnou strukturou, který tvoří složku vlastních proteinů EF-Tu a který má nejvyšší význam pro translaci.

Antibakteriální prostředky mohou zahrnovat přímé nebo cyklické peptidické sloučeniny nebo peptidomimetika. Peptidické sloučeniny mohou být vystavěny z přírodních L-a-aminokyselín, ale i z jiných aminokyselin, např. D-a-aminokyselin, azaaminokyselin, βaminokyselin, L- a/nebo D-a-aminokyselin nekódovaných geneticky atd. nebo jejich kombinací. Výroba peptidomimetík se popisuje např. v Ripka, A. S., Rich, D. H. (1998) Peptidomimetic design, Curr. Op. Chem. Biol. 2, 441 - 452.

Peptidické sloučeniny nebo peptidomimetika mohou dále obsahovat navázaná hydrofobní uskupení, která usnadňují přenos přes cytoplazmatickou membránu nebo uskupení s větším objemem, která zabraňují přístupu další molekuly EF-Tu a tak tvorbě polymeračního produktu. Antibakteriální prostředky mohou dále obsahovat skupiny s ochrannou funkcí proti odbourávání.

Antibakteriální prostředky mohou působit proti libovolným prokaryotickým organismům, zvláště patogenním organismům. Grampozitivní bakterie, gramnegativní bakterie i mykoplazmata mají cytoskelet založený na EF-Tu a mohou být tedy zasaženy prostředky podle vynálezu. Antibakteriální prostředky se mohou např. použít proti bakteriím rezistentním na vankomycin, např. stafylokokům.

Nová třída antibiotik tak má široké spektrum použití. Bylo zjištěno, že úseky přístupné pro vazbu monomerů pro výstavbu • · protofylamentů mají u všech testovaných bakterií velmi podobnou aminokyselinovou sekvenci. EF-Tu je v této oblasti vysoce konzervovaný. Identické jsou také vzájemné vzdálenosti těchto úseků v dané molekule EF-Tu, tedy vzdálenosti exponovaných úseků domény

2 a 3 vyjádřené jako počet aminokyselin, přičemž mezi konzervovanými oblastmi vždy leží 126 aminokyselin.

Antibiotika podle vynálezu se vyznačují vysokou specificitou a zvláště velmi malými vedlejšími účinky. Velké sekvence EF-Tu se v lidské buňce mimo mitochondrií nevyskytují. Mitochondriální io sekvence podobné EF-Tu jsou před antibiotikem do velké míry chráněny dvojitou membránou mitochondrií.

Vynález bude dále blíže osvětlem následujícími obrázky a příklady.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje makromolekulární uspořádání bakteriálního proteinu EF-Tu, ve kterém jsou blíže označeny domény 1, 2 a 3. Tento bakteriální protein EF-Tu se může při polymeraci skládat na periodicky uspořádané fibrily, jak je ukázáno na obr. 2.

Obr. 3 ukazuje schematické znázornění polymerace s reaktivními vazebnými oblastmi domény 2 a 3 označenými + nebo -.

Obr. 4 ukazuje zvětšený snímek (zvětšení přibližně 1,5 miliónkrát) elektronovým mikroskopem izolované fibrily z proteinových molekul EF-Tu polymerované in vivo. Nad tečkovanou linií se nacházejí domény 1, pod ní jsou na sebe naskládané domény 2 a 3.

Jestliže se zabrání polymeraci proteinů EF-Tu v oblastech označených na obr. 3 + a - přídavkem nadbytku částic obsahujících úseky aminokyselinové sekvence domén 2 nebo 3, znemožní se přežití postižené bakteriální buňky, protože se zhroutí buněčná struktura.

• · • to to · · ····

Příklady provedení vynálezu

Příklad

Pokusy byly prováděny s grampozitivní bakterií

Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum EM1 (v následujícím textu zkráceno jako EM1) a bakterií Mycoplazma pneumoniae bez buněčné stěny(v následujícím textu zkráceno jako Mp), přičemž tyto pokusy dokazují, že bakterie mají trvalý cytoskelet založený na EF-Tu.

Tyto pokusy zahrnují identifikaci a buněčnou lokalizaci možných proteinů takového bakteriálního cytoskeletu použitím protilátek proti aktinu (vytvořených proti aktinu vyšších buněk), jejichž silnější nebo slabší zkřížená reaktivita s bakteriálními proteiny je založena na tom, že se u bakterií vyskytují známé proteiny náležející do vyšší skupiny aktinu, aniž by měly nápadnou homologii s aktinem vyšších buněk.

Prokaryoty neobsahují žádný vysloveně aktinový gen.

Vedle imunoelektronové mikroskopie s výše uvedenými protilátkami a ultratenkými řezy bakterií byly také použity technologie „Whole mount“. Kombinací těchto technik bylo zjištěno, že se v blízkosti povrchu cytoplazmatické membrány přivrácené

2o k cytoplazmě vyskytuje a cytoplazmou prochází síť proteinových fibril, jejichž složky zkříženě reagují s protilátkami proti aktinu. Cytoplazmatická membrána a periferní část těchto sítí formálně tvoří dvě soustředné duté trubice, přičemž cytoplazmatická membrána tvoří vnější z obou trubic, periferní část sítě (cytoskelet) vnitřní. Fibrily procházející cytoplazmou rozšiřují a stabilizují tento systém a jsou místy přisednutí ribosomů. Ribosomy přisedají na periferní části cytoskeletu, orientované ve směru do cytoplazmy.

Pomocí homogenizátoru French-Press byly rozbity buňky EM1 a u získaného materiálu (rozpustná frakce, nerozpustná frakce) byla provedena SDS-elektroforéza a westernový přenos. Na SDS gelu byl

- 10 • · · · · · získán větší počet definovaných pruhů, z nichž jeden pruh (přibližně 43 kDa) byl barvitelný jak protilátkami proti aktinu, tak i protilátkami proti EF-Tu získanými proti EF-Tu Mp. Tento pruh je silnější v případech, kdy byla jako materiál pro elektroforézu SDS použita částicová frakce buněčného homogenizátu získaná nízkootáčkovou centrifugací. Protilátky proti EF-Tu byly použity, protože při 43 kDa se obvykle EF-Tu nachází (tvoří až 9 % hmotnosti proteinů bakterie), protože EF-Tu náleží do vyšší skupiny aktinu, a protože EF-Tu se ve velkém množství vyskytuje v prokaryotické buňce.

io Úloha EF-Tu jako stavební komponenty bakteriálního cytoskeletu je nová. Z této vlastnosti EF-Tu jako stavební složky komplexní sítě tvořící cytoskelet je možno odvodit, že pro tento účel musí bakteriální buňka použít velké množství proteinu. Porovnání výstavby tohoto bakteriálního cytoskeletu s vyššími buňkami jasně naznačuje, že také bakteriální cytoskelet by mohl být vystavěn z většího množství typů proteinů. EF-Tu je hlavní složka. U vyšších buněk se sice EF-Tu na výstavbě cytoskeletu nepodílí (vyšší buňky neobsahují žádný EF-Tu), je však známo, že cytoskelet tvoří v tomto případě velký počet různých proteinů.

Podařilo se prokázat, že jak na řezech, tak i použitím technologie Whole mount reagovaly složky výše popsané sítě cytoskeletu reagující s protilátkami proti aktinu také intenzívně s protilátkami proti EF-Tu.

Tato reakce probíhala v případě Mp na celém, působením tritonu odkrytém (odstranění cytoplazmatické membrány), nyní do vnějšího prostředí exponovaném, původně zakrytém povrchu. Kontrola připravená s použitím buněk neošetřených tritonem, ale jinak zpracovaných stejným způsobem (buňky tedy neztratily cytoplazmatické membrány), neukázala žádnou reakci. Při tomto

3o kontrolním pokusu tedy překrývala cytoplazmatické membrána potenciální vazebná místa pro EF-Tu.

·· · • ·

- 11 Povrch obnažený odstraněním cytoplazmatické membrány je periferní částí cytoskeletu buňky. Neexponované jsou v této situaci vnitřní složky buněk, jako např. ribosomy, z čehož vyplývá, že jsou v průběhu translace místy přisednutí pro pomocnou funkci vykonávající

EF-Tu (EF-Tu přitom působí svou doménou 1). Z toho byly vyvozeny závěry, že v průběhu translace se nepohybuje EF-Tu k ribosomu, ale ribosom k EF-Tu, protože EF-Tu jako složka cytoskeletu je prostorově fixován na periferii buňky a na fibrily procházející cytoplazmou.

Přítomnost trvalého bakteriálního cytoskeletu mohla být dále io dokázána u eubakterií Escherichia coli, Bacillus sp., Ralstonia eutropha a Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes, stejně jako u archaei Methanococcus jannaschii a Methanococcus voltae.

Claims (22)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití látek, které se vážou na EF-Tu, pro výrobu prostředku pro inhibici výstavby cytoskeletu u bakteriálních buněk, přičemž

   5 tyto látky se vážou na EF-Tu v oblasti domény 2, tedy aminokyselin 205 až 298, nebo/a domény 3, tedy aminokyselin 299 až 394.
2. 2. Použití podle nároku 1, vyznačující se tím, io že tyto látky se vážou na EF-Tu v oblasti aminokyselin 218 až 224 domény 2.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že tyto látky se vážou na EF-Tu v oblasti

   15 aminokyselin 317 až 328 nebo/a 343 až 354 domény 3.
4. 4. Použití podle některého z nároků 1až3, vyznačující se tím, že tyto látky obsahují úseky aminokyselinových sekvencí domény 2 nebo/a 3 o délce 4 až

   20 2 0 aminokyselin.
5. 5. Použití podle nároku 4, vyznačující se tím, ž e úseky mají délku 5 až 15 aminokyselin, zvláště 6 až 12 aminokyselin.
6. 6. Použití podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že tyto látky jsou zvoleny z přímých nebo cyklických peptidických sloučenin nebo peptidomimetik.

   - 13
7. 7. Použití podle nároku 6, vyznačující se tím, ž e peptidické sloučeniny nebo peptidomimetika obsahují navázaná hydrofobní uskupení, objemná uskupení nebo/a

   5 uskupení s ochrannou funkcí proti odbourávání.
8. 8. Použití podle některého z nároků 1 až 7 pro výrobu antibakteriálního prostředku.

   io
9. 9. Použití podle nároku 8, vyznačující se tím, ž e antibakteriální prostředek je formulován jako farmaceutický prostředek popřípadě spolu s farmaceuticky obvyklými nosiči, ředivy nebo/a pomocnými látkami.

   15
10. 10. Použití podle nároku 8 nebo 9 pro výrobu prostředku proti grampozitivním nebo gramnegativním bakteriím.
11. 11. Použití podle nároku 8 nebo 9 pro výrobu prostředků proti mykoplazmatům.
12. 12. Antibakteriální prostředek, vyznačující se tím, ž e obsahuje úseky aminokyselinových sekvencí domén 2 a/nebo 3 bakteriálního proteinu EF-Tu o délce 4 až 20 aminokyselin.
13. 13. Antibakteriální prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje úseky o délce 5 až 15 aminokyselin.

    ♦ · • · • ····

    - 14 • · · · · · ·· ···· ·· ·
14. 14. Antibakteriální prostředek podle vyznačující se tím, o délce 6 až 12 aminokyselin.

    nároku 12 nebo 13, ž e obsahuje úseky
15. 15. Antibakteriální prostředek podle některého z nároků 12 až 14, vyznačující se tím, že obsahuje na tyto úseky navázaná hydrofobní uskupení, objemná uskupení nebo/a uskupení s ochrannou funkcí proti odbourávání.
16. 16. Antibakteriální prostředek podle některého z nároků 12 až 15, vyznačující se tím, že je formulovaný jako farmaceutický prostředek, popř. spolu s farmaceuticky obvyklými nosiči, ředivy nebo/a pomocnými látkami.
17. 17. Způsob identifikace nových antibakteriálních účinných látek, vyznačující se tím, že zahrnuje následující kroky:

    (a) testovaná látka se přivede do styku s bakteriálním EF-Tu

    20 nebo jeho fragmentem schopným polymerace, a (b) určí se, zda látka může inhibovat výstvbu polymeru EF-Tu.
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se provádí jako test in vitro.
19. 19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se provádí jako test in vivo.

    • · ·· ·· ·· · • · · · · ·· · · · · • · ·· · · · · · • · ·· · · ·· ·«··· • * · · · ··· . ··· ··· ·· ···· ·· ·

    - 15
20. 20. Způsob podle některého z nároků 17 až 19, vyznačující se tím, že se pro zjištění vytváření polymerů EF-Tu použijí značené protilátky a/nebo značené proteiny EF-Tu nebo jejich fragmenty schopné

    5 polymerace.
21. 21. Způsob podle některého z nároků 17 až 20, vyznačující se tím, že se látka inhibující tvorbu polymerů EF-Tu nebo od ní odvozená látka, formuluje io jako farmaceutický prostředek, popř. spolu s farmaceuticky obvyklými nosiči, ředivy nebo/a pomocnými látkami.
22. 22. Způsob podle některého z nároků 18 až 21, vyznačující se tím, že se látka inhibující

    15 tvorbu polymerů EF-Tu, nebo od ní odvozená látka, formuluje jako farmaceutický prostředek, popř. spolu s farmaceuticky obvyklými nosiči, ředivy nebo/a pomocnými látkami.