CN1298739C - 抗菌剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及可与细菌翻译因子EF-Tu结合的物质用于抑制细菌细胞中细胞骨架形成以及用于生产抗菌剂的用途。另外，本发明也涉及抗菌剂，其含有细菌EF-Tu蛋白结构域2和/或3的氨基酸序列的部分片段，长度优选地为4-20个氨基酸。
Description
本发明涉及可与细菌翻译因子EF-Tu结合的物质用于抑制细菌细胞中细胞骨架形成以及用于生产抗菌剂的用途。本发明也涉及抗菌剂，其含有细菌EF-Tu蛋白结构域2或/和3的氨基酸序列的部分片段，优选地长度为4-20个氨基酸。
以前主要使用对细菌细胞的生长具有特异抑制作用的青霉素或其它抗生素作为抗菌剂。这种抑制作用是基于这些抗生素对细胞生长所必需的肽聚糖骨架延伸的抑制。胞壁质的这种不稳定使细胞生长大大减弱。稳定期的细菌不被抑制，因为该阶段胞壁质骨架不延伸。
细菌蛋白EF-Tu含有结构域1、2、3(Song，H.，Parsons，M.R.，Rowell，S.，Leonard，G.，Phillips，E.V.，J.Mol.Biol.285，1245-1256，1999)。大肠杆菌和其它许多真细菌的EF-Tu蛋白及其编码基因的序列已经公开，并且可从数据库中获得。也曾经描述，EF-Tu的结构域1在蛋白质合成中起作用。
Naturwissensch.85，1998，278-282(Mayer等人)讨论了可能存在永久性原核细胞骨架。然而，细菌蛋白EF-Tu在这种细胞骨架形成中的作用还不清楚。
关于EF-Tu在细菌细胞中的位置，以前在文献(参见，例如：Schilstra，M.J.，Slot.，J.W.van der Meide，P.H.，Posthuma，G.，Cremers，A.F.，Bosch，L.：延伸因子Tu在大肠杆菌细胞中的免疫细胞化学定位，Biochem.Biophys.Acta 1291，(1996)，122-130)中曾经认为，EF-Tu在细胞质中几乎均匀分布。然而，以前的实验未考虑低温能够使人工生产的EF-Tu原纤维在体外解聚这一事实。
令人惊讶地发现，在能够用抗-EF-Tu抗体染色的原核细胞中存在细胞骨架。这种细胞骨架包含一个蛋白质原纤维网络，这些原纤维位于细胞质膜朝向细胞质的表面附近，并且穿过细胞质延伸。细胞质膜和该网络的外周部分可被视为两个同心空管，其中细胞质膜是两个管中的外管，网络(细胞骨架)的外周部分是内管。穿过细胞质的原纤维互补并稳定该系统，而且是核糖体附着位点。在细胞骨架朝向细胞质的外周部分中也检测到核糖体。
因此，原核细胞骨架有以下几种变体：
—介导特定功能的变体，它由类似于高等生物细胞肌动蛋白的蛋白质组成，在杆状细菌中，其确定细胞的长度和直径，
—由类似于高等生物细胞微管蛋白的蛋白质组成、并确保受控细胞分裂的变体，和
—在所有原核生物中普遍存在的一种变体(基本细胞骨架)，其包含蛋白质EF-Tu(延伸因子Tu)的原丝网络，细胞用其作为稳定形状的结构元件，并且作为核糖体和其它复杂分子聚集体的附着结构。最后一种变体在此也被称为细胞骨架网络。
EF-Tu是一种含有三个结构域的蛋白质，其中结构域1参与翻译过程。迄今为止尚未描述结构域2和3的具体功能。现在发现，结构域2和3的侧面暴露表位形成一个拟合(fit)，其中一个表面是凸面，另一个表面是凹面。推断这种拟合能导致EF-Tu聚合体的形成，特别是原纤维在体外及在体内的线性排列。这些原纤维是作为细胞骨架的网络的组分。因此，可与EF-Tu结合，特别是在结构域2或/和3的区域内结合的物质能用来抑制细菌细胞中细胞骨架的形成，因而能用来生产一种抗菌剂。
因此，细胞骨架网络能作为一类新抗生素的靶标。
具体而言，EF-Tu能作为新抗菌剂的靶蛋白，该抗菌剂能够占据结构域2或/和3的拟合位点，从而阻止细胞中EF-Tu聚合体的形成，而后者是细菌细胞结构所必需的。
这种作用模式根本不同于作用于EF-Tu的其它抗生素的作用模式(参见，例如：Vogeley，L.，Palm，G.J.，Mesters，J.R.，Hilgenfeld，R.：抗生素结合诱导的延伸因子Tu(EF-Tu)的构象改变。J.Biol.Chem.276(2001)，17149-17155)。该文献表明，以前所知的黄色霉素类抗生素的作用是由于它们能阻止结构域1的构象改变的可逆性，当结合GTP时导致结构域1向结构域2弯曲。这种机制根本不同于此处所述的涉及结构域2和3的聚合抑制作用机制。
EF-Tu包含394个氨基酸。氨基酸8-204属于结构域1，氨基酸172-204构成与结构域2的连接结构。氨基酸205-298属于结构域2，结构域3包含氨基酸299-394。
在结构域2和3内存在不同的二级结构。在本文中，位于结构域3内的氨基酸序列317-328和343-354特别重要，因为它们形成自由突出于间隙内的环，是与位于结构域2外周相应位置上的凹陷内的氨基酸序列(这些序列是氨基酸218-224)相互作用的候选序列。
根据本发明，令人惊讶地发现，对于细菌细胞骨架，通过抑制EF-Tu的聚合而损伤细胞基本上是可能的。特别是，在具有细胞壁的普通细菌细胞中也能实现这种细胞损伤。本发明特别适用于真细菌。
有多种物质能用于抑制细胞骨架的形成，只要它们能抑制相邻两个EF-Tu分子的结构域2和结构域3之间的相互作用。例如，能用一种方法鉴定合适的物质，该方法包括：
(a)使待测物质接触细菌EF-Tu或其能够聚合的部分片段，如含有结构域2和3的片段，和
(b)确定该物质是否能抑制EF-Tu聚合体的形成。
该方法能够在体外以及在体内进行。在一种体外方法中，纯化的EF-Tu分子或其适当的部分片段优选地在能够形成原纤维的条件下温育。待测物质对原纤维的影响能够用一种简单的方法测定，例如利用标记抗-EF-Tu抗体的免疫染色，或者使用携带标记基团(例如荧光标记基团)的EF-Tu分子。当然该方法也能在体内进行，在此情况下，添加待测物质对细胞内原纤维网络的影响能够用免疫学方法测定，例如使用标记抗-EF-Tu抗体的免疫组织化学和显微评价。
抑制EF-Tu聚合体形成并且能够通过上述方法获得的物质，以及由此(例如通过经验产生或/和通过计算机模建)产生的物质，能够任选地与常用药物载体、辅助物质或/和稀释剂一起配制成药物组合物。
例如，该药物组合物可以是液体制剂、固体制剂、乳剂或分散剂。根据制剂的不同，能够通过注射或经口、直肠、鼻、局部等施用。根据活性物质、施用形式和疾病的类型及严重程度选择剂量，使其能够对抗细菌感染。
抗菌剂可能有多种作用。一方面，使用能与EF-Tu结构域2或/和3的拟合位点直接结合的物质。另一方面，也能使用与EF-Tu分子上的其它位置结合，但是对拟合有抑制作用，从而阻止原纤维形成的物质。
在本发明的一个优选实施方案中使用肽抗菌剂。肽剂是基于可与EF-Tu结合，优选地在结构域2或/和3的拟合位点区内结合的寡肽。这些寡肽可能含有结构域2或/和3的氨基酸序列的部分片段，其长度优选地为4-20个氨基酸，特别优选地为5-15个氨基酸，特别优选地为6-12个氨基酸。这些部分片段能够与其它结构域的互补序列结合，即来自结构域2的序列能够与结构域3结合，来自结构域3的序列能够与结构域2结合。
在另一个优选实施方案中，可与EF-Tu结合的物质含有来自结构域2的氨基酸序列的部分片段，其长度至少为4个氨基酸，特别是至少为5个氨基酸，尤其是结构域2区域中氨基酸218-224的部分片段，同时不含对应于EF-Tu结构域3的氨基酸317-328区或/和氨基酸343-354区的片段。此外也优选如下物质，其含有来自结构域3的氨基酸序列的部分片段，该片段的长度为至少4个氨基酸，特别是至少5个氨基酸，特别优选地至少6个氨基酸，并且不含对应于结构域2的氨基酸218-224的部分片段。例如，这些片段可以是截短的EF-Tu，其仅由结构域3组成，不含结构域1和2，或者仅由结构域1和2组成，不含结构域3。这种EF-Tu片段在细胞内与细胞合成的天然EF-Tu蛋白分子竞争，在掺入聚合的原丝内时导致链的终止，因为在所有情况下都不含链延伸所需的第二个结构域。结果不再形成完整的网络。这与细菌细胞生存能力的丧失含义相同。实验证明，细菌细胞内网络发育的紊乱对细菌细胞的形状和行为具有不利影响。对细胞形状和行为的不利影响表明，当使用根据本发明的抗生素时发生预期的细胞死亡。
也能用其它方法，例如由于存在可阻止其它EF-Tu蛋白分子结合的片段，使用可阻止EF-Tu蛋白分子聚合(即链终止)的抗生素，代替所述的截短EF-Tu片段。
根据本发明的抗生素的一个独特优点是，只存在极小的细菌产生对这类新抗生素的抗性的危险。抗性意味着细菌可降解转移到细胞内的肽。如果这样，细菌将无法避免同样降解其自身的结构相同的肽，而这种肽是细胞EF-Tu蛋白的一种成分，对于翻译而言是非常重要的。
抗菌剂可能含有线性或环状肽化合物或拟肽。肽化合物可能含有天然L-α-氨基酸，而且也可能含有其它氨基酸，例如，D-α-氨基酸、氮杂氨基酸(azaamino acid)、β-氨基酸、非基因编码的L-或/和D-α-氨基酸等，或其组合。拟肽的制备例如在RIPKA，A.S.，RICH，D.H.(1998)拟肽设计，Curr.Op.Chem.Biol.2，441-452中有描述。
另外，肽化合物或拟肽也可能含有有利于通过细胞质膜转移的结合疏水基，或者可阻止更多EF-Tu分子附着，从而阻止形成聚合产物的极大基团。该抗菌剂也可能携带保护其免遭降解的基团。
该抗菌剂能够用来对抗任何原核生物和古生物(archaea)，尤其是病原生物。革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和支原体含有一个基于EF-Tu的细胞骨架，因此根据本发明的药物能够对抗它们。例如，能够使用对抗万古霉素抗性微生物如葡萄球菌的抗菌剂。
因此，这类新抗生素具有广泛的用途。已经发现，在检测的所有细菌中，负责结合单体以形成原丝的区域具有极其相似的氨基酸序列。EF-Tu在该区高度保守。特定EF-Tu分子内这些区域之间的距离，即结构域2和3的暴露区之间的距离，在氨基酸数量上也是相同的，在保守区之间总有126个氨基酸。
根据本发明的抗生素的特征在于高度的特异性，尤其是极低的副作用。在人类细胞中，除了线粒体之外，不含大的EF-Tu序列。线粒体的双层膜基本保护了线粒体EF-Tu样序列免遭抗生素的作用。
本发明通过下列附图和实施例加以阐明。
图1显示细菌蛋白EF-Tu的大分子结构，其中比较详细地描述了结构域1、2、3。在聚合过程中，这种细菌蛋白EF-Tu能够结合，从而形成如图2所示的周期性结构的原纤维。
图3显示在结构域2和3(以+或-标记)的反应性结合区处聚合的示意图。
图4显示从EF-Tu蛋白分子分离的、体内聚合的原纤维的电子显微照片的放大图(放大约150万倍)。结构域1位于虚线上方，并列的结构域2和3位于下方。
如果加入含有结构域2或3的氨基酸序列的部分片段的过量颗粒能够在结合区(在图3中以+和-标记)处抑制EF-Tu蛋白的聚合，则受影响的细菌细胞因为细胞结构破坏而不能存活。
实施例
用革兰氏阳性菌热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum)EM1(以下简称EM1)和缺乏细胞壁的细菌肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)(以下简称Mp)进行实验，证实这些细菌含有基于EF-Tu的永久性细胞骨架。
实验包括利用抗肌动蛋白抗体(针对高等生物细胞的肌动蛋白而制备)对候选蛋白质的鉴定和相对于细菌细胞骨架的细胞定位，因为已知细菌含有属于肌动蛋白超家族、但与高等生物细胞的肌动蛋白没有显著序列同源性的蛋白质，抗肌动蛋白抗体可与细菌蛋白质较高或较低程度地交叉反应。原核生物不含不同的肌动蛋白基因。
除了用上述抗体对细菌超薄切片进行免疫电子显微镜检外，也使用完整的封固(mount)技术。通过这些技术组合发现，蛋白质原纤维网络位于细胞质膜朝向细胞质的表面附近，并且穿过细胞质延伸。这些原纤维的成分与抗肌动蛋白抗体交叉反应。细胞质膜和该网络的外周部分形成两个同心空管，其中细胞质膜构成两个管中的外管，网络(细胞骨架)的外周部分构成内管。穿过细胞质延伸的原纤维互补并稳定该系统，而且是核糖体附着位点。核糖体也位于细胞骨架朝向细胞质的外周部分上。
用弗氏压碎器(French press)破裂EM1细胞，获得的物质(可溶性级分，颗粒性级分)进行SDS凝胶电泳和Western印迹分析。在SDS凝胶上获得几条确定的带，其中一条带(约43kDa)能用抗肌动蛋白抗体以及针对Mp的EF-Tu获得的抗EF-Tu抗体染色。当用通过低速离心获得的细胞裂解液的颗粒性级分作为SDS凝胶电泳物时，这条带特别明显。使用抗EF-Tu抗体是因为EF-Tu通常在43kDa处发现(约含细菌蛋白质质量的9％)，因为EF-Tu属于肌动蛋白超家族，并且因为EF-Tu在原核细胞中大量存在。
EF-Tu作为细菌细胞骨架的一种结构成分的作用是新的发现。EF-Tu作为类似于细胞骨架的复杂网络的一种结构成分的这种性质，意味着细菌细胞不得不利用大量蛋白质用于该目的。通过这种细菌细胞骨架的结构与高等生物细胞结构的比较，显然细菌细胞骨架必然也由几种类型的蛋白质组成。EF-Tu是一种主要成分。尽管在高等生物细胞中EF-Tu与细胞骨架的形成无关(高等生物细胞不含EF-Tu)，然而，已知有大量不同的蛋白质在细胞骨架的形成中起作用。
在切片和整个封固中能够显示，可与抗肌动蛋白抗体反应的上述细胞骨架网络的成分也可与抗EF-Tu抗体强烈反应。
对于含有原来覆盖、但通过Triton处理(除去细胞质膜)暴露于环境的完整表面的Mp，发生这种反应。以未用Triton处理、但其它均同样处理、因而未失去其细胞质膜的细胞进行对照，其不显示标记。因此，在该对照实验中，细胞质膜掩盖了EF-Tu的可能的结合位点。
通过去除细胞质膜暴露的表面是细胞骨架的外周部分。然而这不暴露内部细胞成分，如核糖体，已经显示它们是EF-Tu的附着位点，在翻译过程中行使辅助功能(在该情况下EF-Tu的结构域1起作用)。因此推断，在翻译过程中，EF-Tu不是去往核糖体，而是核糖体去往EF-Tu，因为它作为细胞骨架成分的性质在空间上固定于细胞外周和交叉穿过细胞质的原纤维上。
在真细菌大肠杆菌、杆菌属的种、Ralstonia eutropha和热产硫磺热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes)以及古细菌詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)和沃氏甲烷球菌(Methanococcus voltae)中也检测到永久性细菌细胞骨架的存在。
Claims (7)
1.EF-Tu的结构域2和/或结构域3的片段，其中EF-Tu的结构域2的片段为氨基酸218-224区，EF-Tu的结构域3的片段为氨基酸317-328和/或343-354区。
2.如权利要求1所述的片段用于筛选针对革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌的药物的用途。
3.如权利要求1所述的片段用于筛选针对支原体的药物的用途。
4.鉴定新抗菌物质的方法，包括：
(a)使待测物质接触权利要求1所述的片段，和
(b)确定该物质是否能抑制EF-Tu聚合体的形成。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法作为一种体外试验进行。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该方法作为一种体内试验进行。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于，利用标记抗体或/和标记EF-Tu蛋白或其可聚合部分片段测定EF-Tu聚合体的形成。
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