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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Peptid und einen Kollagen-Kontraktionsinhibitor.
Sie betrifft insbesondere ein neues Peptid, das spezifisch die Bindung
der Kollagenfaser an Fibronektin inhibiert, den extrazelluläre Matrix
genannten Substanzen, die für
das Binden und Stützen
lebender Zellen erforderlich sind, und einen Kollagen-Kontraktionsinhibitor,
der das Peptid als seinen wirksamen Bestandteil umfasst und bei
der Behandlung von Keloid und Vulnera hochwirksam ist.
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Beschreibung
des Stands der Technik
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Bei
Tieren sind Zellen und die extrazelluläre Matrix für die Aufrechterhaltung der
Gestalt verantwortlich, die deren jeweiligen Arten eigen ist, und
eine Vielzahl von Proteinen und fibrösen Substanzen sind als extrazelluläre Matrixsubstanzen
bekannt, wobei Kollagen das Hauptprotein von Zellen des tierischen
Bindegewebes ist (z. B. Haut, Blutgefäß, Sehne, Knochen und Zähne). Das
Kollagen dient als Stützsubstanz
für Zellen und
spielt daher eine wichtige Rolle bei der Bildung und beim Aufbau
dieser Gewebe. Aufgrund dieser Fähigkeit
zum Stützen
von Zellen wird Kollagen üblicherweise
als Substrat für
die Zellkultur verwendet, und seit kurzem erregen Kollagene Aufmerksamkeit
als medizinische Materialien, beispielsweise als künstliche
Haut, antihämorrhagisches,
künstliches
Gefäß, Adhärenz-verhindernde
Folie oder Kontaktlinse für
lange Benutzung.
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Andererseits
steht zu erwarten, dass das Kollagenmolekül außerordentlich wichtige Informationen
für das
Verständnis
der molekularen Mechanismen der Bildung von Organen und Geweben
beim Vorgang der Erzeugung lebender Organismen liefern wird, wenn
die Funktion dieses Moleküls,
insbesondere das Schema des Zusammenschlusses von Zellen und Kollagen
aufgeklärt
wird. Unter medizinischem Gesichtspunkt erwartet man neue Hinweise
für die
Aufklärung
der Bildungsmechanismen von Keloid und Vulnera, von denen man annimmt,
dass sie auf einen anormalen Zusammenschluss von Zellen und Kollagen
oder auf die übermäßige Kontraktion
der Kollagenfaser zurückzuführen sind.
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In
diesem Zusammenhang stellten die vorliegenden Erfinder einen monoklonalen
Antikörper
(A3A5) her, der spezifisch den Zusammenschluss zwischen Kollagen
und Fibroblast inhibiert, und stellten fest, dass das Epitop dieses
Antikörpers
im zellulären
Fibronektin vorkommt, und dass das Kollagen-Gel-Kontraktionssystem,
das für
die dreidimensionale Anordnung von Zellen verantwortlich ist, auf
die Wechselwirkungen zwischen Kollagenen, Fibronektin und Fibroblast
zurückzuführen ist
(Experimental Cell Research, 193, 167–174, 1991).
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Wie
vorstehend beschrieben wurde, zeigten die von den vorliegenden Erfindern
dazu durchgeführten Untersuchungen,
dass das Kollagen, eines der Proteine der extrazellulären Matrix,
das eine wichtige Rolle bei der Formgebung und Erhaltung lebender
Organismen spielt, das von Zellen hergestellte Fibronektin erkennt, und
dass die spezifische Kombination beider zur Erhaltung der dreidimensionalen
Struktur von Zellen führt.
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Diese
Ergebnisse legen auch die Möglichkeit
künstlicher
Kontrolle über
die Wechselwirkung zwischen Kollagenen und Fibronektin ebenso wie
Möglichkeiten
neuer Verfahren zur Behandlung von Keloid und Vulnera nahe.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung besteht daher in der Bereitstellung
eines neuen Peptids, das im Wesentlichen die gleiche Domäne darstellt
wie die des Fibronektins, welche von Kollagen erkannt wird, und das
die Bindung zwischen den Kollagenen und dem Fibronektin antagonistisch
inhibiert. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die
Bereitstellung eines Kollagen-Kontraktionsinhibitors, der das Peptid
als seinen wirksamen Bestandteil umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Peptid bereit, das wenigstens die
Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 1 umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch einen Kollagen-Kontraktionsinhibitor
bereit, der ein wenigstens die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 1
umfassendes Peptid, dessen pharmakologisch verträgliche Derivate, dessen pharmakologisch
verträgliche
Salze oder ein Gemisch davon umfasst.
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Der
Vorteil des Peptids der vorliegenden Erfindung besteht in der beschleunigten
Aufklärung
der molekularen Mechanismen der Wechselwirkungen zwischen Zellen
und Molekülen
der extrazellulären
Matrix. Der erfindungsgemäße Kollagen-Kontraktionsinhibitor
kann in vorteilhafter Weise für
die Behandlung von Keloid und Vulnera verwendet werden.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
ein Blockdiagramm, das den Verfahrensablauf der experimentellen
Untersuchungen zeigt, die für
die Identifizierung des erfindungsgemäßen Peptids durchgeführt wurden.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
basieren auf einer spezifischen Fibronektincodierenden Aminosäuresequenz,
die von den Erfindern anhand der nachfolgend beschriebenen experimentellen
Untersuchung identifiziert wurde (siehe 1).
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(1) Biochemische Analyse
von Proteinen (Schritt 1)
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Mit
einem Antikörper-Scanningverfahren,
das auf der kombinierten Verwendung einer Vielzahl bekannter Fibronektin-Antikörper und
Peptidkarten, die mit verschiedenen Proteasen erstellt wurden, beruht, wurde
das vom monoklonalen Antikörper
(A3A5) erkannte Fibronektinepitop lokalisiert. Unter Verwendung
der so erhaltenen Informationen wurde bestätigt, dass die vom Antikörper A3A5
erkannte Stelle auf dem Fibronektin zwischen dessen Gelatin-verbindender
Domäne
und der RGD-Sequenz liegt. Die Erfinder identifizierten einige der
mit dem Antikörper
A3A5 reaktiven Fragmente von Pepsin-verdautem Fibronektin und bestimmten
die Aminosäuresequenz
am Aminoterminus von Fibronektin unter Verwendung eines Gasphasen-Peptidsequenzers.
Es zeigte sich, dass zwei Fragmente davon die vierte (III4) bis sechste (III6)
Region der Repeats vom Typ III gemeinsam aufwiesen. Dies bestätigte, dass
der Antikörper
A3A5 diese Stelle von ungefähr
30 kDa erkennt.
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Die
vorstehend beschriebenen Verfahren können wie folgt zusammengefasst
werden:
- a) vollständiger Abbau gereinigten Fibronektins
vom Plasma-Typs mit einer Protease, Pepsin;
- b) Nachweis der vom Antikörper
A3A5 erkannten Fibronektin-Fragmente durch Western Immunoblotting; und
- c) Sequenzieren des aminoterminalen Bereichs des Pepsinfragments
durch einen Gasphasen-Peptidsequenzer.
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(2) Molekularbiologische
Analyse (Schritt 2)
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Die
Erfinder zeigten auch, dass der Antikörper A3A5 eine starke Reaktivität gegenüber den
Expressionsprodukten einer E. coli-Transformante aufweisen, die
das in Schritt 1 identifizierte Fibronektinfragment enthalten. Auf
der Basis dieses Ergebnisses wurde bewiesen, dass der Antikörper A3A5
das Peptid in den Regionen III4 bis III6 des Fibronektins erkennt. Gleichzeitig
wurde gezeigt, dass die Region der Kohlenhydrate innerhalb des Fibronektins
an der spezifischen Antikörpererkennung
nicht beteiligt ist.
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Die
Regionen III4 bis III6 von
Fibronektin (ungeführ
270 Aminosäurereste:
SEQ ID Nr: 3) wurden funktional in E. coli exprimiert und die lokalisierten
Pepsinfragmente, die vom Antikörper
A3A5 erkannt werden sollten, wurden unter Anwendung ortsspezifischer
Mutagenese (Nucleic Acids Research, 17, 6545, 1989) mit verschiedenen
vom Antikörper
erkannten Mutanten als Indikatoren identifiziert.
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Die
spezifischen verwendeten Verfahren sind nachfolgend aufgeführt:
- d) Herstellung von Pepsinfragmenten in mit
Fibronektin-codierenden Genen transformiertem E. coli;
- e) Bestätigung
der Erkennung der Fragmente durch den Antikörper A3A5 unter Verwendung
von Western Immunoblotting;
- f) Lokalisierung der Pepsinfragmente unter Verwendung funktionaler
Expression;
- g) Herstellung der Mutanten der lokalisierten Pepsinfragmente
durch ortspezifische Mutagenese;
- h) Bestätigung
der Erkennung der Fragmente durch den Antikörper A3A5 unter Verwendung
von Western Immunoblotting;
- i) Identifizierung der Mutanten, die keine Antikörpererkennung
mehr aufweisen.
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(3) Biochemische Analyse
der Peptide (Schritt 3)
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Unter
Bezugnahme auf die bekannten Strukturanalysedaten (The three-dimensional
structure of the tenth type III module of fibronectin: an insight
into RGD-mediated interaction, 71, 671–678, 1992) wurde die Loop-Struktur
des in Schritt identifizierten Pepsinfragments abgeleitet, so dass
der diese Loop-Struktur bildende Peptidteil im Pepsinfragment identifiziert
wurde. Die Erfinder zeigten, dass die vom Antikörper A3A5 erkannte Peptidstelle
der Teil der Aminosäuresequenz
von der 80sten bis 85sten Position in SEQ ID NO: 3 ist. Daraufhin
wurde das aus diesen 6 Aminosäureresten
bestehende Peptid (SEQ ID NO: 1) über bekannte Verfahren chemisch
synthetisiert. Zusätzlich
wurde das aus der Aminosäuresequenz
nach SEQ ID NO: 2 bestehende Peptid, das im Vergleich zu SEQ ID
NO: 1 zusätzliche
8 Aminosäurereste
aufweist, auf ähnliche
Weise synthetisiert.
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Die
angewendeten spezifischen Verfahrensschritte sind nachfolgend aufgeführt:
- j) Ableitung der Loop-Struktur im lokalisierten
Pepsinfragment durch dessen Vergleich mit bekannten Strukturanalysedaten;
und
- k) chemische Synthese des Peptids, das die abgeleitete Loop-Struktur
umfasst.
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(4) Zellbiologische Analyse
(Schritt 4)
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Unter
Verwendung eines Kollagen-Gel-Kontraktionssystems (Experimental
Cell Research, 193, 167–174,
1991) wurden Untersuchungen zur Wirksamkeit der synthetisierten
Peptide nach SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 vorgenommen. Es wurde
bestätigt,
dass die synthetisierten Peptide die Kontraktion von Kollagen-Gel
inhibieren. Die beteiligten analytischen Verfahren werden nachfolgend
aufgeführt:
- l) Untersuchungen bezüglich der Wirkung des synthetisierten
Peptids auf ein Fibroblasten-Gel-Kontraktionssystem; und
- m) Bestätigung
der Inhibierung der Kollagen-Gel-Kontraktion durch das synthetisierte
Peptid.
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Wie
vorstehend festgestellt wurde, sind die erfindungsgemäßen Peptide
neue aktive Peptide, deren Aminosäuresequenzen bestimmt und deren
spezifische Wirkungen als Ergebnis der von den Erfindern vorgenommenen
Experimente bestätigt
wurden.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
ist ein die in SEQ ID NO: 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfassendes Peptid
und kann chemisch synthetisiert werden, beispielsweise über bekannte
Festphasen-Peptidsyntheseverfahren (Journal of Chemical Society
Perkin I, 538, 1981). Um es genauer zu beschreiben, werden Aminosäureanhydride
hergestellt, deren funktionale Amingruppen durch Fmoc-Gruppen geschützt sind,
und das dem C-terminalen Aminosäurerest
entsprechende Fmoc-Prolinanhydrid dann an ein Harz fixiert. Das
Harz wird gewaschen, um die Schutzgruppe der funktionellen Amingruppe
der C-terminalen Aminosäure
zu entfernen. Danach wird das Fmoc-Lysinanhydrid, das dem zweiten Aminosäurerest
im C-Terminus der Aminosäuresequenz
des Peptids entspricht, an die ungeschützte funktionale Amingruppe
der ersten bereits fixierten Aminosäure gebunden. In ähnlicher
Weise werden nachfolgende Aminosäure
bis zur sechsten fixiert. Nachdem die Bindung aller Aminosäure erfolgt
ist und die Peptidkette mit der Zielaminosäuresequenz gebildet ist, werden alle
Schutzgruppen außer
Acetoamidomethyl entfernt und das Peptid mit einem Lösungsmittel
freigesetzt. Schließlich
wird das Peptid beispielsweise über
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
aufgereinigt.
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Das
erfindungsgemäße Peptid
kann alternativ durch Enzymhydrolyse von Fibronektin und Trennung und
Aufreinigung der resultierenden aktiven Fraktionierungen über Chromatographie
erhalten werden. Das über
eines dieser Verfahren hergestellte Peptid stellt kein Risiko für Tiere
und Menschen dar, da dessen Aminosäuresequenz wie vorstehend beschrieben
im Fibronektin vorliegt, einem der Proteine, das Organismen aufbaut.
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Unter
Verwendung des vorstehend beschriebenen Peptids, dessen pharmakologisch
verträglicher
Derivate, dessen pharmakologisch verträglicher Salze oder eines Gemisches
davon als wirksame Bestandteile kann dann ein erfindungsgemäßer Kollagen-Kontraktionsinhibitor
hergestellt werden. Darunter umfassen die Peptidderivate solche
mit einem Amid am N-Terminus des Peptids und solche mit einem Ester
am OH-Terminus,
wobei diese über
bekannte Verfahren hergestellt werden können. Die pharmakologisch verträglichen
Salze können über anorganische
Säuren
hergestellt werden, einschließlich
Salzsäure,
Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure und
Borsäure,
ebenso wie über
organische Säuren,
einschließlich
A meisensäure,
Essigsäure,
Propionsäure,
Trifluoressigsäure,
Oxalsäure,
Bernsteinsäure,
Maleinsäure,
Fumarsäure,
Milchsäure,
Maleinsäure,
Zitronensäure,
und Salicylat.
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Der
erfindungsgemäße Kollagen-Kontraktionsinhibitor
kann durch Mischen des vorstehend beschriebenen wirksamen Bestandteils
mit beispielsweise pharmakologisch verträglichen Verdünnungsmitteln
und Lösungsmitteln
in ein Medikament umgewandelt werden. Wenn ein solches Medikament
für die
Behandlung für Keloid
und Vulnera verwendet werden soll, kann es direkt auf die Haut aufgetragen
oder gesprüht
werden. Man kann erkennen, dass dieser Kollagen-Kontraktionsinhibitor
im Wesentlichen ausschließlich
aus Peptiden zusammengesetzt ist und als Forschungsreagenz für die molekularbiologische
und zellbiologische Aufklärung der
Funktionen von Kollagen und Fibronektin beim Aufbau der Zellen verwendet
werden kann.
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