WO2002074971A1

WO2002074971A1 - Compose flavonoide et procede de production dudit compose

Info

Publication number: WO2002074971A1
Application number: PCT/JP2002/002445
Authority: WO
Inventors: Toshihiko Osawa; Kenichiro Minato; Yoshiaki Miyake
Original assignee: Japan Science And Technology Corporation; President Of Nagoya University; Pokka Corporation
Priority date: 2001-03-15
Filing date: 2002-03-14
Publication date: 2002-09-26
Also published as: ES2271219T3; US20040152762A1; US7582675B2; CN100381436C; CN1496407A; US20060270009A1; IL157811A; EP1369489A4; IL157811A0; DE60214142D1; DE60214142T2; EP1369489A1; EP1369489B1; US7138429B2

Description

明細書

フラボノィド化合物及びその製造方法 [技術分野]

本発明は新規なフラボノィド化合物及びその製造方法に関する。

[背景技術]

従来より、ビタミン Pとして知られているヘスペリジン（hesperidin) はヘスペレチン（hesperet in) の配糖体であり、オレンジやレモンのような柑橘類、特に未熟果の果皮に多く含まれるフラボノィド化合物である。ヘスペリジンは天然に多く存在し、抗アレルギー作用、抗ウィルス作用、毛細血管強化作用といった生理活性を有するにもかかわらず、その利用範囲は限られていた。例えば、ヘスペリジンは体内へ吸収されにくいため、得られる抗酸化作用は極めて低く、抗酸化剤として利用されていなかった。そこで、ヘスペリジンを有効利用することが期待されている。

[発明の開示]

本発明の目的はヘスペリジンを各種の分野で有効に利用することにある。本発明の別の目的は比較的高い抗酸化作用を有する新規なフラボノィド化合物及びその製造方法を提供することにある。

上記の目的を達成するために、本発明の一態様では、下記の化学式で示される構造を有するフラボノィド化合物が提供ざれる。

前記フラボノィド化合物は抗酸化性を有することを特徴とするものである。前記フラボノィド化合物は、ァスペルギルス ·サイトイを用いて、ヘスベリジンを微生物発酵処理することにより得られることを特徴とするものである。本発明の別の態様ではフラボノィド化合物の製造方法が提供される。その方法は、ヘスペリジンを微生物変換してフラボノイド化合物を生成させるベく、ヘスペリジンをァスペルギルス 'サイトイにて微生物発酵させる工程を含むことを特徴とするものである。

微生物発酵させる工程は、ァスペルギルス 'サイトイの栄養菌糸にヘスベリジンをヘスペレチンに変換させるために、ヘスペリジンとァスペルギルス ' サイトィとを含む培地を振盪培養する菌糸培養工程と、前記栄養菌糸から胞子形成を進行させつつ、前記培地中のヘスペレチンからフラボノィド化合物を微生物変換させる胞子形成工程とを含むことを特徴とするものである。

胞子形成工程は、そのまま振盪培養しても、静置培養に切り替えてもどちらでもよい。但し、静置培養する場合には、ァスペルギルス ·サイトィによる微生物変換効率を高めるべく、培地の深さを浅くして培地の体積に対する表面積の割合

(比表面積）を大きくして培地全体を好気的条件に保つことが好ましい。

前記菌糸培養工程に先立って、ァスペルギルス 'サイトイを含む培地を振盪培養する予備培養工程を行うことが好ましい。

[図面の簡単な説明]

図 1及び図 2はフラボノィド化合物の抗酸化活性の測定結果を示すグラフ。

[発明を実施するための最良の形態]

以下、本発明の一実施形態に従うフラボノィド化合物及びその製造方法について詳細に説明する。

一実施形態のフラボノイド化合物は、化学式 1で示される構造を有する。

(化学式 1 )

フラボノィド化合物の組成式は〇_{1 6} ^1 _{1 4} 0 ₇でぁり、分子量は 3 1 8 . 2 7であり、名称は 3' ， 5, 7, 8 - tetrahydroxy- 4' - methoxyfl腿匪 e 又は 2， 3- dihydro - 5 ， 7, 8 - trihydroxy_2_ (3 - hydroxy - 4- methoxyphenyl) - 4H-1- benzopyran - 4 - oneでめる。ブラボノィド化合物は、化学式で示されるように、ヘスペレチン（3' , 5， 7- 1 rihydroxy-4^? -raethoxyf lavanone ; C ! ₆ H i ₄ 0 ₆ ) の 8位に水酸基を有する有機ィ匕合物であり、いわゆる 8—ヒドロキシヘスペレチン（8- hydroxyhesperet in) である。

8—ヒドロキシヘスペレチンは、メタノーノレ、エタノール'及びジメチルスル'フォキシド（D M S O ) に容易に溶解し、水にも幾分溶解する。ヘスペレチンは抗酸化作用をほとんど示さないのに対し、 8—ヒドロキシヘスペレチンはひ一トコフェロール（ビタミン E ) と同等の極めて高い抗酸化作用を示す。 8—ヒドロキシヘスペレチンを例えば食品や飲料に添加した場合、 8—ヒドロキシヘスペレチンの抗酸化作用により、健康増進活性を有する健康食品や健康ドリング（8—ヒドロキシヘスペレチンを含む組成物）を製造することができる。摂取された 8— ヒドロキシヘスペレチンは、生体内で活性酸素を消去して過酸化脂質の生成を抑. 制し、酸化ストレスに起因する癌、動脈硬化、糖尿病、及ぴそれらの合併症のような生活習慣病の予防に有効である。

8—ヒドロキシヘスペレチンは、ヘスペリジン（hesperidin) をァスペルギノレス 'サイトイ Aspergillus saitoi にて微生物発酵処理することによって得られる。詳しくは、 8—ヒドロキシヘスペレチンは次のように製造される。まず、ヘスペレチンとルチノース（L一ラムノシル一D—グノレコース）との配糖体であるヘスペリジン（ビタミン P ) を含有する培地中でァスペルギルス 'サイトイを培養する。培養されたァスペルギルス 'サイトイは微生物変換によりヘスペリジンカら 8—ヒドロキシ^^スペレチンを生成する。 8—ヒドロキシヘスペレチンは培養液の上澄み中に含まれる。ァスペルギルス 'サイトイの生育及び微生物変換を良好に行うために、ァスペルギルス 'サイトイは 2 0〜4 0 °Cの培養温度、好気的条件で培養されるのが好ましい。

好ましい培地は、例えば、ポテトデキストロース含有培地ゃッァペック培地のような糸状菌用培地、又はオカラのような有機物を含有する種々の液体培地である。ヘスペリジンから 8—ヒドロキシヘスペレチンに変換させる以外の発酵を阻害するために、必要最小限の栄養素を含有する最小培地であるのが好ましい。例えば、アルコール発酵しないように単糖類及び二糖類を含まない培地が好ましい

。培養開始時点における培地の p Hは、ァスペルギルス ·サイトイの生育を良好にするために、 3〜 7の範囲内であるのが好ましい。 '

培地へのヘスペリジンの溶解性を高めるために、培地に比較的低濃度の有機溶媒を添加するのが好ましい。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、 D M S Oが挙げられる。ヘスペリジンが比較的溶解しやすい D M S Oが最も好ましい。培地中の DM S Oの濃度（含有量）は、好ましくは 0 . 0 1〜5容量％、より好ましくは◦. 0 1〜1容量％である。培地中の DM S Oの濃度が 0 . 0 1容量 %未満の場合には、充分な量のヘスペリジンが培地中に溶解されず、 5容量％を越える場合には、ァスペルギルス 'サイトイの生育が著しく阻害される。有機溶媒はヘスペリジンと同時に培地に添加してもよく、ヘスペリジンの添加に先立つて培地に添加してもよい。

8—ヒドロキシヘスペレチンを効率よく得るために、ヘスペリジンはできるだけ高濃度で培地に添加されるのが好ましい。言い換えると、ヘスペリジンの培地中の含有量は、培地に対するヘスペリジンの飽和濃度（溶解限界）であることが好ましい。ヘスペリジンの飽和濃度は、培地に添加された有機溶媒の量に応じて変化するが、およそ 0 . 3重量％以下である。

8—ヒドロキシヘスペレチンを短期間で効率よく得るために、ァスペルギルス •サイトイは 2 X 1 0 ⁶ c f u m L以上の濃度で培養開始時に培地に添加されるのが好ましい。

ァスペルギルス ·サイトイによる微生物変換効率を高めるために、まず、ァスペルギルス ·サイトイの栄養菌糸を培地中で振盪培養する（菌糸培養工程）。その後、栄養菌糸から胞子形成を進行させるのが好ましい。

栄養菌糸を充分に形成させるために、菌糸培養工程に先立って、菌体（ァスぺルギルス ·サイトイ）のみを含有する培地を予備的に振盪培養するのが好ましい (予備培養工程）。予備培養工程を行った場合、有機溶媒によるァスペルギルス •サイトイの培養初期段階（増殖初期段階）での生育阻害が回避されるので、へスぺリジンの微生物変換効率が向上する。予備培養工程は、ァスペルギルス .サィトイの栄養菌糸が培養液の表面の 1 2程度を占める程度まで行うことが好ましい。

菌糸培養工程では、ヘスペリジンを含有する培地中でァスペルギルス .サイトィが振盪培養される。振盪培養により、ァスペルギルス 'サイトイの栄養菌糸は好気的条件下で微生物変換を行うことができる。詳しくは、菌糸培養工程において、栄養菌糸は、ヘスペリジン中のヘスペレチンとルチノースとの結合を切断することによってヘスペレチンを生成する、グリコシダーゼ反応を効率的に行う。振 ¾培養における振盪速度は、 5 0〜2 0 0 r p m /分の範囲であるのが好ましい。振盪速度が 5 0 r p mZ分未満の場合には、ァスペルギルス ·サイトイを含有した培地全体が十分に好気的に維持されないため、菌糸の増殖が不充分である。逆に振盪速度が 2 0 0 r p m/分を越える場合には、培地の揺れが激しいため菌糸が充分に形成されない。

培地中に添加されるヘスペリジンの量は前記溶解限界を超えてもよい。溶解限界を超えて添加されたヘスペリジンは、添加時点では培地に溶解しない。しかし、振盪による撹拌作用により、ヘスペリジンは適宜培地中に溶解されて微生物発酵に利用される。この場合、ヘスペリジンが培養容器底部に沈澱しにくいように、ヘスペリジンが見えなくなるまで 5 0 r p mZ分程度で振盪するのが好ましい。その結果、より多くのヘスペレチンが生成される。

胞子形成工程は培地中に充分 ¾量のヘスペレチンが生成された後に行われる。胞子形成工程では、菌糸培養工程後の培地を交換せずにァスペルギルス ·サイトィが静置培養又は振盪培養される。胞子形成工程により、ァスペルギルス 'サイトイの栄養菌糸が胞子を形成しながら、微生物変換が行われる。

菌糸培養工程の終了時期には、培地の表面（液面）にァスペルギルス ·サイトィの栄養菌糸が密に存在する。これは目視にて確認することができる。そこで、培地の表面における栄養菌糸密度を指標として、菌糸培養工程から胞子形成工程への移行タイミングが決められる。

胞子形成工程では、ァスペルギルス ' サイトイの栄養菌糸は、胞子の形成を進行しながら、ヘスペレチンの 8位に水酸基を付加させるヒドロキシラーゼ反応を行う。従って、 8—ヒドロキシヘスペレチンが極めて効率的に生成する。 8—ヒドロキシヘスペレチンの生成反応は、培養容器内における胞子形成工程の中期から後期にかけて最も効率的に行われる。一方、胞子形成が完了した段階では、その生成効率は比較的^:い。このため、 8—ヒドロキシヘスペレチンを短時間で効率的に得るために、培養容器の液面全体が胞子で完全に被覆される直前に培養を停止し、生成された 8—ヒドロキシヘスペレチンを抽出するのが好ましい。胞子形成工程において静置培養を行う場合には、振盪のような物理的刺激による胞子形成の抑制が避けられる。なお、静置培養時には、培地の体積に対する表面積の割合（比表面積）を大きくするために、底面積の大きい容器を用いて比較的薄い（浅い）培地をつくるのが好ましい。比較的薄い培地によれば、培地全体が好気的条件に保たれるので、ァスペルギルス ·サイトイの活動が活発化し、微生物変換効率が向上する。

一方、胞子形成工程において振盪培養を行う場合には、培地の比表面積によらず容易に好気的条件に保たれるので、比較的多量の 8—ヒドロキシヘスペレチンがー度の培養操作で得られる。

8—ヒドロキシヘスペレチンは培養上澄み液、又は胞子形成工程後の培地から抽出され、精製される。例えば、ァスペルギルス ♦サイトイの細胞膜が破壊されない程度の速度（3 0 0 0 r p m程度）で培地を遠心分離することにより、上澄み画分が得られる。上澄み画分はォクタデシル基化学結合型シリカ（O D S ) 力ラムを用いた逆相液体クロマトグラフィ一により精製される。

遠心分離後の沈澱画分にも比較的多量の 8—ヒドロキシヘスペレチンが含まれているので、沈澱画分から 8—ヒドロキシヘスペレチンを抽出してもよい。例えば、沈澱画分にメタノールやエタノールのような有機溶媒を加え、沈澱画分を充分に洗浄しながら 8—ヒドロキシヘスペレチンを有機溶媒中に抽出する。精製された 8—ヒドロキシヘスペレチンは逆相液体クロマトグラフィ一により抽出液から得られ.る。

一実施形態によれば、以下の利点が得られる。

一実施形態のフラボノィド化合物すなわち 8—ヒドロキシヘスペレチンは、へスぺレチンの 8位に付加された水酸基を有する新規な構造を有する。 8—ヒドロキシヘスペレチンは、ヘスペリジン及びヘスペレチンと比べて著しく高い抗酸化作用を発揮する。そのため、 8—ヒドロキシヘスペレチンは生体内で活性酸素を消去して過酸化脂質の生成を抑制するので、酸化ストレスに起因する癌、動脈硬化、糖尿病、及びそれらの合併症のような生活習慣病の予防に役立つ。一実施形態のフラボノイド化合物（8—ヒドロキシヘスペレチン）は、ァスぺルギルス *サイトイを利用した微生物発酵処理によりヘスペリジンから製造される。詳しくは、ヘスペリジンはァスペルギルス 'サイトイにより、増強された抗酸化性を有するフラボノイド化合物に微生物変換される。従って、 8—ヒドロキシヘスペレチンの製造は比較的容易である。

一実施形態のフラボノイド化合物（8—ヒドロキシヘスペレチン）の原料は柑橘類に含有される天然成分すなわちヘスペリジンである。ヘスペリジンは焼酎のような酒類の醸造に利用されるァスペルギルス 'サイトイにより微生物処理ざれる。従って、フラボノィド化合物はほとんど問題なく人体に摂取される。

新規なフラボノィド化合物（8—ヒドロキシヘスペレチン）はヘスペリジンをァスペルギルス ·サイトイにて微生物発酵処理することにより製造される。従つて、一実施形態のフラボノィド化合物の製造方法によれば、ヘスペリジンの利用範囲が拡大される。

一実施形態のフラボノィド化合物の製造方法によれば、微生物を用いて新規なフラボノィド化合物を極めて容易に製造することができる。

—実施形態の製造方法によれば、ヘスペリジンとァスペルギルス 'サイトイとを含む培地を振盪培養した後に、胞子形成工程が行われる。従って、 8—ヒドロキシヘスペレチンは非常に簡単な作業工程で、極めて効率的に製造される。菌糸培養工程に先立って、予備培養工程を行う場合、スペルギルス ·サイトイの培養初期における生育阻害が回避されるので、ヘスペリジンの微生物変換効率は向上する。

[実施例]

以下、前記実施形態を具体化した実施例及び比較例について説明する。

<ヘスペリジン変換物の製造方法 >

財団法人応用微生物学研究奨励会（通称 I AM) より分讓を受けたァスペルギルス .サイトィ菌株（ I AM N o . 2 2 1 0 ) を用いて、ァスペルギルス -サィトイの胞子の濃度が 2 X I 0 ⁸個./ m L以上になるように、ァスペルギルス · サイトイの胞子懸濁液を調製した。ポテトデキストロース一プロス培地（D I F

C O社製）を複数個の三角フラスコ（容積 5 0 0 m L ) に l O O m Lずつ分取した。フラスコをォートクレーブ内で 1 5分間にわたって 1 2 1°Cに維持することにより培地の滅菌を行った。冷却後、胞子懸濁液を 1. OmLずつ各フラスコに接種した。 30°Cの恒温室（大気と同じ成分の好気的条件）内において 1 00 r p m/'分で振盪培養を行い、栄養菌糸を育成させた。

1 0日間にわたって振盪培養を継続して栄養菌糸を充分に生育させた。ヘスべリジン（S I GMA社製）を DM SOに溶解して 1 0重量％のヘスペリジン希釈液を調製し、オートクレープ滅菌（1 05°C、 5分間）した。ヘスペリジン液を各フラスコに 5mLずつ加えた。栄養菌糸から胞子を形成させるベく、引続き同好気的条件下で振盪培養を行なった。胞子形成の様子を経時的にモニタリングしたところ、ヘスペリジンを投入しておよそ 1週間経過後から胞子の形成が始まり、 3週間後には培地の液面全体が胞子で覆われた。

胞子形成の中期から後期と思われる時期、詳しくは、胞子形成が完全に終了するよりも前で、かつ、ヘスペリジンの投入から 2週間経過した時点において、各フラスコからサンプル培養液を採取した。採取したサンプル液を遠心分離（30 00 r pm、 1 5分間）して不純物を沈澱させた。上澄み液を分析用高速液体ク口マトグラフィー（HP LC) にて分析し、フラボノイド組成の変化を調べた。 HP L C装置は島津製作所製の形式 L C 1 0A、カラムは YMC社製の OD S力ラム A 303を用いた。その結果、フラボノイド組成物全体に占めるヘスペリジン変換物の割合（ピーク面積比）はおよそ 8. 3%であった。

HP LC分析後に残ったサンプルの内、ヘスペリジン変換物を含有するサンプルをエバポレーターにより濃縮した。濃縮されたサンプルを分取用 HP LC (島津製作所製の L C 8 A、ラムは YMC社製の OD Sカラム R 353- 1 5 1 A 、 SH 343 - 5) にて分画し、ヘスペリジン変換物を単離し、精製した。

<構造決定 > .

精製されたヘスペリジン変換物の構造決定についで説明する。

ヘスペリジン変換物の¹ H NMR、 ¹³ C NMR、及ぴ FAB- MSスぺタトルを測定した。 NMR測定では、内部標準として DM SO- に溶解させたテトラメチルシラン（TMS) を用いた。 NMR装置は J EOL社製 J NM— EX 一 400 (^XH NMRでは 400MH z、 ¹³C N1V1Rでは 1 00 MH z ) を用いた。 FAB- MS測定装置は J £0 社製】^13_0 一 705 Lを用いた。測定結果を表 1及び表 2に示す。測定結果の解析により、ヘスべリジン変換物は化学式 1の構造を有する 8—ヒドロキシヘスペレチンであった。

表 2

¹³ C NMR

C δ

2 80 · 6

3 44. 1

4 1 97. 7

5 1 58. 0

6 96. 7

7 1 5 7. 6

8 1 26. 8

9 1 50. 3

1 0 1 03. 2

1， 1 33. 1

2 ' 1 1 2. 6

3， 1 47. 7

4, 1 49. 4

5 ' 1 1 4. 8

6 ' 1 1 9. 3

M e 56. 5 く抗酸化活¾^の測定 1 >

ヘスペリジン（HE) 及び単離された 8—ヒドロキシヘスペレチン（80H— HE) について、親水性溶媒中における抗酸化活性を測定した。なお、抗酸化活性は Yamaguchi, et. al. , Biosci. Biotechnol. Biochem.， 62， 1201-1204, 1998に記載のラジカル捕捉能測定方法に従って測定した。

詳しくは、まず、 8 OH— HE又は HEをエタノールに溶解することにより、 0. 1 ;χΜ、 1 ^及ぴ1 0 1 の濃度の80^1—11£試料溶液及びト；[£試料溶液を調製した。各試料溶液 200 / を0. 1Mトリス塩酸緩衝液（ ρ Η 7. 4 ) 800 Lに混合した。各混合液に 500 w Μの D Ρ ΡΗ (1， 1- diphenyl- 2-ρ icrylhydrazyl) のエタノール溶液 1 m Lを加えて反応液を調製した。反応液を充分に混合した後に室温、喑所で 20分間反応させた。

次に、マイクロシリンジを用いて各反応液 20 Lを分析用 HP LC (LC— 1 0 A) に注入して D P PHの濃度を分析した。 DP PHの濃度は DP PHのピーク面積から算出した。尚、 HP LC分析では、内径 4. 6mmで長さが 1 50 mmのカラム（YMC社製の TSKg e l O c t y l— 80 TS) が使用され、溶出溶媒は蒸留水ノメタノール = 30 70、流速は l mLZ分、検出波長は 5 1 7 nmであった。

コントロールとして前記試料溶液の代わりにエタノールのみの溶液 200 ju L を使用して、同様に HP L C分析によりコントロールの D P PHのピーク面積を測定した。式 1に示される算出式に従って 8 OH— HE及び HEのラジカル捕捉能（％) を求めた。

なお、ラジカル捕捉能は、数値が高いほど抗酸化活性が高いことを示す。結果を図 1に示す。図 1の結果より、発酵処理により HEから生成された 8 OH— H Eは親水性溶媒中において H Eよりも著しく高い抗酸化活性を発揮することが分かった。く抗酸化活性の測定 2 >

' ヘスペリジン（HE) 、単離された 8—ヒドロキシヘスペレチン（80H— H E) 、及び比較的高い抗酸化活性を有する化合物として知られている _α—トコフエロール（T o e) について、疎水性溶媒中における抗酸化活性を測定した。尚、抗酸化活性は Terao J， et. al.， Lipids, 21 (4) , 255- 260, 1986に記载のリノール酸メチルを用いた HP L C分析法に従って測定した。

詳しくは、まず、 80H— HE、 HE、又は T o cをエタノールに溶解することにより、 1 0 0 μΜの濃度を有する 8〇H— HE試料溶液、 HE試料溶液、及び T o c試料溶液を調製した。リノール酸メチル 8 9 mg (1 0 0 μ L) を内径 1 4 mmの 3本の小型試験管にそれぞれ精秤した。 3つの試験管に試料溶液 1 0 をそれぞれ加え、充分に混合して、混合液を調製した。

次に、真空ポンプを用いて減圧された減圧デシケーター中に各試験管を収容することにより、各混合液から溶媒を完全に除いて乾燥させた。各試験管を 4 0°C の喑所に 1 8時間静置した。その後、各試験管に 0. 0 8%BHT (butyl hydr oxyl toluene) を加えた。リノール酸メチルにより生成した 1 3—ヒドロペルォキシドと 9ーヒドロペルォキシドの HP LCピーク面積の総和を求めた。

さらに、コントロールとして前記試料溶液の代わりにエタノールのみの溶液 1 Ο Ο /x Lを使用して、 HP LC分析を行った。コントロールの H P L Cピーク面積の総和を測定した。各試料の脂質過酸化度（％) を式 2に従って求めた。脂質過酸化度は、数値が低いほど抗酸化活性が高いことを示す。結果を図 2に示す。' ··· 2)

図 2の結果より、発酵処理により HEから生成された 8 OH— HEは、疎水性溶媒中において HEよりも著しく高い抗酸化活性を発揮し、 α— トコフエロールとほぼ同等の抗酸化活性を発揮することがわかる。

[産業上の利用可能性]

本発明によれば、親水性溶媒及び疎水性溶媒中において、比較的高い抗酸化活性を有するフラボノィド化合物及びその製造方法が提供される。その方法によれば、ヘスペリジンよりも効率よく体内に吸収される新規なフラボノィド化合物がヘスペリジンから製造される。そのフラボノィド化合物を含む組成物は抗酸化活性を発揮するので、例えば栄養食品として利用可能である。従って、ヘスベリジンの利用範囲が拡大される。

Claims

請求の範囲下記化学式 1で示される構造を有するフラボノィド化合物。

(化学式 1 )

2 , 抗酸化性を有することを特徴とする請求の範囲第 1項に記載のフラボノィド化合物。

3 . ァスペルギルス ·サイトイによるヘスペリジンの微生物発酵により得られることを特徴とする請求の範囲第 1項又は第 2項に記載のフラボノィド化合物。

4 . 下記化学式 1で示される構造を有するフラボド化合物の製造方法であつ、

HO (化学式 1 )

ヘスペリジンから前記フラボノィド化合物を生成すべく、ァスペルギルス -サィトイにより前記ヘスペリジンを微生物発酵させる工程を備えることを特徴とすド化合物の製造方法。

5 . 前記発酵工程は、

ヘスペリジンとァスペルギルス 'サイトイとを含有する培地を培養し、ァスルギルス .サイトイの栄養菌糸を成長させることにより、前記ヘスペリジンをハスぺレチンに微生物変換させるための菌糸培養工程と、

前記ァスペルギルス .サイトイの栄養菌糸から胞子を形成させることにより、前記へスペレチンからフラボノィド化合物に微生物変換させるための胞子形成ェ程とを含むことを特徴とする請求の範囲第 4項に記載のフラボノィド化合物の製造方法。

6 . 前記菌糸培養工程に先立って、ァスペルギルス ·サイトィを振盪培養する予備培養工程を更に備える請求の範囲第 5項に記載のフラボノィド化合物の製造方法。 .

7 . 前記培地は 0 . 0 1〜5容量。 /₀のジメチルスルフォキシドを含有することを特徴とする請求の範囲第 4項から第 6項のいずれか一項に記載のフラボノィド化合物の製造方法。

8 . 前記発酵工程後に、 O D Sカラムを用いた逆相液体クロマトグラフィーにより、前記フラボノィド化合物を精製する工程を更に備えることを特徴とする請求の範囲第 4項から第 6項のいずれか一項に記載のフラボノィド化合物の製造方法

9 . 下記化学式 1で示される構造を有する抗酸化性フラボノィド化合物を含有する組成物。

OCHs (化学式 1 )

1 0 . 前記化学式 1で示される構造を有する抗酸化性フラボノィド化合物の製造方法であって

(化学式 1 )

ァスペルギルス 'サイトイの胞子懸濁液を調製する工程と、

前記胞子懸濁液を滅菌された培養液に接種する工程と、

前記培養液を好気性下で振盪培養して、前記ァスペルギルス ·サイトイの栄養菌糸を成長させる工程と、

ヘスペリジンを含むジメチルスルフォキシド液を前記培養液に添加する工程と前記ァスペルギルス · サイトイに前記ヘスペリジンを前記フラボノィド化合物に変換させるベく、前記培養液を好気性下で振盪培養して前記栄養菌糸から胞子を形成させる工程と、

前記培養液の上澄み液から、前記フラボノィド化合物を収集する工程とを備えるフラボノィド化合物の製造方法。

1 1 . 前記ジメチルスルフォキシドは前記培養液中の濃度が 0 . 0 1 ^ 5容量％になるように添加される請求の範囲第 1 0項のフラボノィド化合物の製造方法。

1 2 . 前記収集工程は、 O D Sカラムを用いた逆相液体クロマトグラフィーにより、前記上澄み液から前記フラボノィド化合物を精製する工程を含む請求の範囲第 1 0項のフラボノィド化合物の製造方法。