CN114432349A - 一种大白桩菇总多酚的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种大白桩菇总多酚的制备方法，属于总多酚提取技术领域。本发明提供的大白桩菇总多酚制备方法，包括如下步骤：筛选多酚含量高的大白桩菇菌，液态发酵获得菌丝体，将菌丝体与水混合提取，取上清液，即为水提液，剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取，取上清液，即为醇提液；将水提液与醇提液混合，萃取，纯化，得大白桩菇总多酚。大白桩菇作为一种尚未被驯化的食用菌，本发明首次提出采用液态发酵方式获得大白桩菇资源，具有培养周期短、不受季节性影响、培养简单、投资小、产出高的优势。而且本发明创新地采用水提与醇提两种方式相结合的方法进行多酚类物质的提取，提取率高。

Description

一种大白桩菇总多酚的制备方法
技术领域
本发明属于总多酚提取技术领域，尤其涉及一种大白桩菇总多酚的制备方法。
背景技术
大白桩菇(Leucopaxillusgiganteus)隶属于担子菌门(Basidiomycota)、伞菌目(Agricales)、白蘑科(Tricholomataceae)、白桩菇属(Leucopaxillus)。大白桩菇又名大青蘑、雷蘑、青腿子或竹菇，子实体大、味道鲜美、营养价值丰富，还可治小儿麻疹、烦燥不安等。此外，大白桩菇含有多糖、蛋白质、杯伞素等生物活性物质，具有清除过量自由基、提高免疫功能、抗肿瘤活性等生物学功能。大白桩菇是台蘑的代表种类之一，近年来，由于当地居民的过度采摘，其产量具有逐年缩减的趋势；另外，由于大白桩菇生长周期长，驯化难度大，目前尚未实现人工栽培。
酚类化合物(Phenolics)是植物次生代谢产物中化学成分最丰富、最普遍的一类物质，广泛存在于水果、蔬菜、香料、豆类等高等植物的器官中，对植物的品质、色泽、风味等有一定的影响，同时还具有抗氧化、抗癌、抗逆等重要作用，一直受到国内外的广泛重视，成为研究和开发利用的热点。目前对于大白桩菇的多酚化合物的相关研究属于空白。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大白桩菇总多酚的制备方法，具有方法简单、所需时间短、多酚物质纯度和得率高的优势。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种大白桩菇总多酚的制备方法，包括如下步骤：液态发酵大白桩菇菌种获得菌丝体，将菌丝体与水混合提取，取上清液，即为水提液，剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取，取上清液，即为醇提液；将水提液与醇提液混合，萃取，纯化，得大白桩菇总多酚。
优选的，所述菌丝体与水混合提取为超声提取，所述剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取为超声提取。
优选的，所述液态发酵的液体培养基包括：碳源16-35g/L，氮源4-6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，硫酸镁0.2-0.3g/L，维生素B18-12mg/L，所述液体培养基的pH值为5-7。
优选的，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖中的一种。
优选的，所述氮源包括蛋白胨、硫酸铵、牛肉浸膏、酵母粉和麸皮中的一种。
优选的，所述菌丝体与水的质量体积比为1：20。
优选的，所述沉淀物与无水乙醇溶液的质量体积比为1：10-30。
优选的，所述无水乙醇溶液含有琥珀酸和氯仿，所述无水乙醇、琥珀酸和氯仿的体积比为20-40：0.5-4：2-7。
优选的，所述萃取所用的溶剂为石油醚和乙酸乙酯混合液，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为1-2：1。
优选的，所述纯化为采用非极性大孔树脂过滤。
本发明的有益效果：
大白桩菇作为一种尚未被驯化的食用菌，本发明采用液态发酵的方法获得大白桩菇菌丝体，培养周期短、不受季节性影响、培养简单、投资小、产出高。进一步的，本发明选用液态发酵获得的菌丝体产物作为提取多酚的原料，首次采用水提与醇提两种方式相结合的方法进行多酚物质的提取，并在醇提溶剂中加入了能够显著提高多酚物质得率的溶剂，最终能够获得高纯度的多酚物质，且本发明方法具有多酚物质得率高且方法简单易操作的优势。
附图说明
图1为不同地区大白桩菇在相同固体培养基中的菌落形态，其中A-E分别对应编号为1-5的菌株；
图2为不同碳源培养条件下获得的大白桩菇菌丝体的产量及多酚、黄酮含量，其中A图中不同小写字母表示差异显著性(P<0.05)；
图3为不同氮源培养条件下获得的大白桩菇菌丝体产量及活性成分含量，其中A图中不同小写字母表示差异显著性(P<0.05)；
图4为不同碳氮比培养条件下获得的大白桩菇菌丝体的产量及活性成分含量，其中A图中不同小写字母表示差异显著性(P<0.05)；
图5为不同pH培养条件下获得的大白桩菇菌丝体的产量及活性成分含量，其中A图中不同小写字母表示差异显著性(P<0.05)。
具体实施方式
本发明提供了一种大白桩菇总多酚的制备方法，包括如下步骤：液态发酵大白桩菇菌种获得菌丝体，将菌丝体与水混合提取，取上清液，即为水提液，剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取，取上清液，即为醇提液；将水提液与醇提液混合，萃取，纯化，得大白桩菇总多酚。
本发明对于大白桩菇菌种的具体来源没有特殊限定，优选采用多酚含量高的大白桩菇菌种。在本发明具体实施例中，优选的为采自海拔1943.00m、纬度38.69°、经度111.81°的大白桩菇菌种。在本发明中，液态发酵大白桩菇菌种之前，优选的需对大白桩菇菌种进行活化，所述活化用的固体培养基优选为包括马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B110mg/L，所述活化的条件优选为24℃暗培养20天。取活化的大白桩菇菌种接种至液体培养基中进行液态定向发酵，所述液体培养基优选的包括：碳源16-35g/L，氮源4-6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，硫酸镁0.2-0.3g/L，维生素B18-12mg/L，更优选的包括碳源18-32g/L，氮源4.5-5.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.25g/L，维生素B110mg/L，所述液体培养基的pH值为5-7。本发明对于固体活化培养基和液体发酵培养基的各原料来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
在本发明中，所述碳源优选的包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖中的一种，更优选的为葡萄糖，所述氮源优选的包括蛋白胨、硫酸铵、牛肉浸膏、酵母粉和麸皮中的一种，更优选的为蛋白胨。在本发明液体培养基中，碳氮比对大白桩菇菌丝体产量及活性成分含量具有一定影响，所述碳氮比优选为2.5:1-30:1，更优选为10:1，以葡萄糖为碳源和以蛋白胨为氮源为例，葡萄糖的含碳量为40％，蛋白胨的含氮量为16％，则按照最优的碳氮比为10:1计，则总多酚积累最多的葡萄糖与蛋白胨比值为4:1。
液体发酵获得菌丝体后，将菌丝体与水混合提取。所述菌丝体与水的质量体积比优选为1：20。本发明对于水的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。在本发明中，所述菌丝体与水混合提取的提取方式优选为超声提取，所述超声的温度优选为70-100℃，更优选的为80℃，所述超声提取的时间优选为0.5-2h，更优选的为1h。本发明对于提取的次数没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用两次超声提取的方式。提取结束后，取上清液即为水提液，剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取。本发明对于上清液和沉淀物的分离方式没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用离心的方式，所述离心的条件优选为5000r/min、离心10min。
在本发明中，所述剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取的方式优选为超声提取，所述超声的温度优选为50-65℃，更优选的为60℃，所述超声提取的时间优选为0.5-2h，更优选的为1h。本发明对于提取的次数没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用两次超声提取的方式。在本发明中，所述沉淀物与无水乙醇溶液的质量体积比优选为1：10-30，更优选为1：20。在本发明中，所述无水乙醇溶液优选的为含有琥珀酸和氯仿的无水乙醇溶液，所述无水乙醇、琥珀酸和氯仿的体积比优选为20-40：0.5-4：2-7，更优选为25-35：1-3：3-6。本发明对于无水乙醇、琥珀酸和氯仿的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。提取结束后，取上清液即为醇提液。本发明对于上清液的获得方式没有特殊限定，在本发明具体实施例中，采用离心的方式，所述离心的条件优选为5000r/min、离心10min。
按照上述步骤获得水提液与醇提液后，将两者混合进行萃取。所述萃取所用的溶剂优选为石油醚和乙酸乙酯混合液，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比优选为1-2：1，更优选为1.2：1。本发明对于石油醚和乙酸乙酯的具体来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品均可。
萃取获得精制多酚类物质后，进行纯化。本发明对于纯化的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规纯化方法均可。在本发明具体实施例中，优选的选择非极性大孔树脂过滤纯化的方式，本发明对于非极性大孔树脂的具体类型没有特殊限定，可选择AB-8型、SC-3型、DM-130型等。非极性大孔树脂过滤纯化后，收集洗脱液，减压浓缩后进行喷雾干燥，即得大白桩菇总多酚。本发明对于喷雾干燥和减压浓缩的具体操作和条件等没有特殊限定。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
富含多酚的大白桩菇菌株的筛选
将采自不同地区的五种大白桩菇(采样地点信息见表1)进行营养成分和生物活性物质的检测，检测结果分别见表2和表3。
表1大白桩菇采样地点信息
Figure BDA0003525345150000051
表2不同地区大白桩菇营养成分
Figure BDA0003525345150000052
由表2可知，5个大白桩菇菌株的水分含量在873mg/g～902mg/g，2号样品与3号样品含水量显著高于1、4、5号样品，除菌株差异性之外，主要是由于其采集于雨后，故水分含量最高，水分会直接影响其鲜度、嫩度和口感。5种大白桩菇子实体干物质中，4号样品粗蛋白含量高，其次为5号样品；4号样品粗脂肪含量最低，而灰分含量则无显著差异。
表3不同地区大白桩菇活性物质含量
Figure BDA0003525345150000053
Figure BDA0003525345150000061
将采自5种地区的大白桩菇菌株接种至固体培养基中，观察菌丝的生长情况。结果如表4和图1所示。
表4不同大白桩菇菌株菌丝的生长情况
Figure BDA0003525345150000062
由表4和图1可以看出，不同地区的大白桩菇菌丝的菌丝生长速度、菌丝长势具有差异。2号菌株菌丝生长速度为2.00mm/d，显著的高于其它4个处理(P<0.05)，但菌丝微黄；其次为4号菌株，菌丝生长速度较快，且菌丝浓白、边缘整齐，长势最好。
通过测定不同地区大白桩菇子实体营养成分、活性物质发现，样品4蛋白质含量最高，粗脂肪含量最低，其次为样品5；样品5中的多糖、多酚含量最高，其次为样品1和样品4(两者之间无显著性差异)。通过观察不同大白桩菇菌株的菌丝体在固体培养基上的生长情况发现，4号菌株的菌丝生长速度较快，且菌丝浓白、边缘整齐，长势最好。综上，选择4号菌株作为制备多酚的原始菌株。
实施例2
将实施例1中的4号大白桩菇菌种接种于固体培养基(培养基配方：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂粉20g/L，磷酸二氢钾1g/L，维生素B110mg/L)在24℃下暗培养20天。采用打孔器挑取直径为0.5cm已培养好的菌种置于液体培养基中(培养基配方：葡萄糖(C1)35g/L，蛋白胨(N1)6g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.25g/L，维生素B110mg/L，pH值为5)培养温度25℃，摇床转速150r/min，避光培养15天，终止培养。过150目筛分离菌丝体和发酵液，菌丝体通过蒸馏水冲洗3次，60℃烘干至恒重，称量，记录，检测菌丝体总多酚和总黄酮含量。其中总多酚含量的检测方法(参照林倩,吴昊,刘芊辰,等.响应面法优化福林酚法测定冬枣中总酚含量[J].食品工业,2020,41(04):86-90)，具体如下：准确称取10g大白桩菇粉末于锥形瓶中，加入100mL体积分数50％的乙醇溶液，用保鲜膜封口，并将膜扎出若干小孔，放置于超声波清洗机中，在60℃条件下提取1.5h，经过滤后的滤液以3500r/min离心20min，获得多酚溶液。准确吸取1.5mL多酚溶液于100mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度线并摇匀。取2.1mL大白桩菇多酚溶液，加入1mL 0.8mol/L的福林试剂，混合均匀后加入分别加入0.6mL质量分数为20％的碳酸钠溶液，摇匀至于40℃的恒温水浴锅中，避光反应1h，在720nm处进行吸光度的测定。
总黄酮含量的检测方法(参照刘艳芳,杨焱,贾薇,等.药用真菌桑黄总黄酮测定方法研究[J].食用菌学报,2006(02):45-48.)，具体如下：准确称取芦丁标准品23.2mg，用70％乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中，作为标准液备用。准确称取样品提取物17.3mg于25mL容量瓶中，用70％乙醇定容，作为供试液。
准确吸取标准液3mL加相应试剂做空白，从400nm到900nm范围内进行扫描，记录最大吸收波长。取样品供试液3mL，于25mL容量瓶中，加5％NaNO2溶液1mL，摇匀放置6min，再加10％Al(NO3)3溶液1mL，摇匀放置6min，加4％NaOH溶液10mL，用70％乙醇定容，放置10min。6000r/min离心3min，取上清液，在385nm范围处测定其吸光值。
分别采用水提(菌丝体冷冻干燥后研磨，加入纯水(1:15)进行超声提取)，和醇提工艺(剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合超声提取)，检测水提多酚含量、水提黄酮含量以及醇提多酚含量、醇提黄酮含量，记录。
实施例3
与实施例2的区别在于用海藻糖(C2)替换实施例2中液体培养基的C1碳源，其余均同实施例2。
实施例4
与实施例2的区别在于用蔗糖(C3)替换实施例2中液体培养基的C1碳源，其余均同实施例2。
实施例5
与实施例2的区别在于用麦芽糖(C4)替换实施例2中液体培养基的C1碳源，其余均同实施例2。
实施例6
与实施例2的区别在于用乳糖(C5)替换实施例2中液体培养基的C1碳源，其余均同实施例2。
对比例1
与实施例2的区别在于液体培养基中没有添加碳源(C6)，其余均同实施例2。
将实施例2-6以及对比例1所得的结果进行汇总，结果如图2所示。液体发酵过程中，不同的碳源对大白桩菇菌丝体产量及活性成分的含量均有明显的影响，如图2A所示，与对照相比5种碳源均能提高大白桩菇的菌丝体产量，其中海藻糖是菌丝体产量积累的最佳碳源，菌丝体产量(干重)为5.17g/L，其次为葡萄糖和蔗糖。如图2B所示，葡萄糖有利于菌丝体多酚物质的积累，水提物中多酚含量为8.15mg/g，醇提物中多酚含量为0.92mg/g，总多酚为9.07mg/g，其次为蔗糖和麦芽糖。以葡萄糖为碳源的发酵液中多酚浓度最高为1.10mg/mL，其次为麦芽糖，二者无显著性差异。如图2B所示，蔗糖有利于菌丝体黄酮物质的积累，为4.76mg/g，其次为海藻糖。综合菌丝体生物量与多酚含量，6种碳源得到的大白桩菇水提多酚含量分别为9.97mg/L、9.10mg/L、14.01mg/L、9.25mg/L、3.25mg/L和0.69mg/L，总多酚含量分别为44.49mg/L、11.28mg/L、18.55mg/L、11.89mg/L、4.89mg/L和0.73mg/L。综上所述，最适合多酚积累的碳源为葡萄糖，极显著高于其他4种碳源及无碳源培养的菌丝体总多酚含量，多酚积累从高到低的碳源排序为葡萄糖＞蔗糖＞麦芽糖＞海藻糖＞乳糖。
实施例7
与实施例2的区别在于用牛肉浸膏(N2)替换实施例2中液体培养基的N1氮源，其余均同实施例2。
实施例8
与实施例2的区别在于用酵母粉(N3)替换实施例2中液体培养基的N1氮源，其余均同实施例2。
实施例9
与实施例2的区别在于用硫酸铵(N4)替换实施例2中液体培养基的N1氮源，其余均同实施例2。
实施例10
与实施例2的区别在于用麸皮(N5)替换实施例2中液体培养基的N1氮源，其余均同实施例2。
对比例2
与实施例2的区别在于液体培养基中不添加氮源(N6)，其余均同实施例2。
将实施例2、7-10以及对比例2所得的结果进行汇总，结果如图3所示。液体发酵过程中，不同的氮源对大白桩菇菌丝体产量及活性成分的含量均有明显的影响，如图3A所示，与对照相比，5种氮源均能提高大白桩菇的菌丝体产量，其中牛肉浸膏和硫酸铵能显著提高大白桩菇菌丝体产量，二者无显著性差异，其次为蛋白胨。如图3B所示，蛋白胨有利于菌丝体多酚物质的积累，水提物中多酚含量为9.23mg/g，醇提物中多酚含量为2.21mg/g，其次为硫酸铵。以硫酸铵为氮源的发酵液中多酚浓度最高，为1.57mg/mL，其次为酵母粉，多酚浓度为1.47mg/mL。如图3B所示蛋白胨有利于菌丝体黄酮物质的积累，为4.71mg/g，以酵母粉为氮源的发酵液中黄酮浓度最高，为1.09mg/mL，其次为硫酸铵，黄酮浓度为1.04mg/mL。综合菌丝体生物量与多酚含量，6种氮源得到的大白桩菇水提多酚含量分别为38.23mg/L、19.22mg/L、18.54mg/L、40.75mg/L、7.90mg/L和0.96mg/L，总多酚含量分别为47.41mg/L、27.53mg/L、21.51mg/L、46.33mg/L、9.29mg/L和3.23mg/L。综上所述，最适合水提多酚积累的氮源为硫酸铵，其次为蛋白胨，两者之间差异不显著，但极显著高于其他3种碳源及无碳源培养的菌丝体水提多酚含量；最适合总多酚积累的氮源为蛋白胨，其次为硫酸铵，两者之间差异不显著，但极显著高于其他3种碳源及无碳源培养的菌丝体总多酚含量，总多酚积累从高到低的氮源排序为蛋白胨＞硫酸铵＞牛肉浸膏＞酵母粉＞麸皮。
实施例11
以葡萄糖(含碳量40％)为碳源，以蛋白胨(含氮量16％)为氮源，在实施例2其他成分不变的条件下，通过调整葡萄糖和蛋白胨的含量使其碳氮比为10:1，其余均同实施例2。
实施例12
与实施例11的区别在于碳氮比为20:1，其余均同实施例11。
对比例3
与实施例11的区别在于碳氮比为2.5:1，其余均同实施例11。
对比例4
与实施例11的区别在于碳氮比为30:1，其余均同实施例11。
对比例5
与实施例11的区别在于碳氮比为40:1，其余均同实施例11。
对比例6
与实施例11的区别在于碳氮比为50:1，其余均同实施例11。
将实施例11、12对比例3-6所得的结果进行汇总，结果如图4所示。液体发酵过程中，不同的碳氮比对大白桩菇菌丝体的产量及活性成分的含量均有明显的影响，如图4A所示，在碳氮比为10:1时菌丝体产量达到最大，随着碳氮比的增大，菌丝体含量总体上呈下降的趋势，这可能是碳源含量过高，造成了富营养状态，抑制了菌丝体的生长。如图4B所示，随着碳氮比的增加，多酚含量总体上呈现上升的趋势，在碳氮比为20:1时菌丝体多酚物质的积累达到最大，此时水提物中多酚含量为8.37mg/g，醇提物中多酚含量为3.35mg/g。随着碳氮比的增加，菌丝体黄酮物质的积累呈现先增加后减少的趋势。在碳氮比为20:1时，菌丝体醇提物的黄酮含量达到最大，为3.56mg/g；在碳氮比为30:1时，菌丝体水提物的黄酮含量达到最大，为0.59mg/g。综合菌丝体生物量与多酚含量2项指标，6种碳氮比得到的大白桩菇水提多酚含量分别为16.80mg/L、22.20mg/L、19.00mg/L、21.24mg/L、14.80mg/L和8.93mg/L，总多酚含量分别为25.72mg/L、38.32mg/L、27.08mg/L、34.62mg/L、20.24mg/L和15.21mg/L。综上所述，最适合水提多酚积累的碳氮比为10:1，其次为30:1和20:1，三者之间差异不显著，但极显著高于其他3种碳氮比培养的菌丝体水提多酚含量；最适合总多酚积累的碳氮比为10:1，其次为30:1，极显著高于其他4种碳氮比培养的菌丝体总多酚含量，总多酚积累从高到低的碳氮比排序为10:1＞30:1＞20:1＞2.5:1＞40:1＞50:1。葡萄糖的含碳量为40％，蛋白胨的含氮量为16％，总多酚积累最多的葡萄糖与蛋白胨比值为4:1。
实施例13
与实施例2的区别在于液体培养基的pH值为6，其余均同实施例2。
实施例14
与实施例2的区别在于液体培养基的pH值为7，其余均同实施例2。
对比例7
与实施例2的区别在于液体培养基的pH值为4，其余均同实施例2。
对比例8
与实施例2的区别在于液体培养基的pH值为8，其余均同实施例2。
对比例9
与实施例2的区别在于液体培养基的pH值为9，其余均同实施例2。
将实施例2、13-14对比例7-9所得的结果进行汇总，结果如图5所示。液体发酵过程中，不同的pH值对大白桩菇菌丝体的产量及活性成分的含量均有明显的影响，如图5A所示，在pH值为5时，菌丝体干重达到最大(4.82g/L)，随着pH的增大或是减小，菌丝体干重都呈下降趋势，因此，pH值为5时最有利于菌丝体干重的积累。如图5B所示，pH值为5时也有利于菌丝体多酚物质的积累，水提物中多酚含量为8.62mg/g，醇提物中多酚含量为0.88mg/g，其次是pH值为6。pH值为7时发酵液中多酚含量最高，为1.16mg/g，其次是pH值为6。pH值为6时有利于菌丝体黄酮物质、粗多糖的积累，醇提物中黄酮含量为5.29mg/g，水提物中黄酮含量为0.56mg/g。综合菌丝体生物量与多酚含量2个指标，6种pH值得到的大白桩菇水提多酚含量分别为16.56mg/L、41.54mg/L、28.86mg/L、16.19mg/L、7.54mg/L和3.51mg/L，总多酚含量分别为18.19mg/L、45.77mg/L、37.32mg/L、19.98mg/L、8.34mg/L和3.91mg/L。综上所述，最适合水提多酚积累的pH值为5，极显著高于其他5种pH值培养的菌丝体水提多酚含量；最适合总多酚积累的pH值为5，极显著高于其他5种pH值培养的菌丝体总多酚含量，总多酚积累从高到低的pH值排序为5＞6＞7＞4＞8＞9。
实施例15
取实施例2所得的经蒸馏水冲洗3次的菌丝体，去除表面水分，冷冻干燥后粉碎，精确称量，加入20倍体积的水，超声(80℃)提取1h，5000r/min离心10min，取上清液，即为水提液，重复提取，合并两次的水提液。
取上清后剩余的沉淀物加入20倍体积的无水乙醇溶液(溶液中无水乙醇：琥珀酸：氯仿＝30：1：4)，超声波(60℃)提取1h，5000r/min离心10min，取上清液，即为醇提液，重复提取，合并两次的醇提液。
将水提液与醇提液混合，减压浓缩后用水稀释，进行溶剂(石油醚：乙酸乙酯＝1.2:1)萃取精制，非极性大孔树脂(AB-8型)过滤，收集洗脱液，再次减压浓缩后进行喷雾干燥，得到大白桩菇总多酚，纯度为82.25％，DPPH自由基清除能力为85.29％，VC最高可达20.02％，是VC的4.26倍，具有强抗氧化活性。计算总多酚的得率。
实施例16
与实施例15的区别在于无水乙醇溶液中不含有琥珀酸和氯仿，其余均同实施例15。
实施例17
与实施例15的区别在于沉淀物与无水乙醇溶液的质量体积比为1：10，无水乙醇溶液中无水乙醇、琥珀酸和氯仿的体积比为20：0.5：2，石油醚和乙酸乙酯的体积比为1：1，其余均同实施例15。
实施例18
与实施例15的区别在于沉淀物与无水乙醇溶液的质量体积比为1：30，无水乙醇溶液中无水乙醇、琥珀酸和氯仿的体积比为40：4：7，石油醚和乙酸乙酯的体积比为2：1，其余均同实施例15。
对比例10
与实施例15的区别在于不含有水提步骤，且醇提时所用溶剂为50％乙醇溶液，乙醇溶液中不含有琥珀酸和氯仿，其余均同实施例15。
对比例11
与实施例15的区别在于不含有水提步骤，且醇提时所用溶剂为70％乙醇溶液，乙醇溶液中不含有琥珀酸和氯仿，其余均同实施例15。
对比例12
与实施例15的区别在于先用20倍70％乙醇溶液(不含有琥珀酸和氯仿)提取，再用20倍水提，其余均同实施例15。
对比例13
与实施例15的区别在于先用20倍70％乙醇溶液(含有琥珀酸和氯仿，溶液中70％乙醇：琥珀酸：氯仿＝30：1：4)提取，再用20倍水提，其余均同实施例15。
实施例15-16和对比例10-13的总多酚得率见表5。由表5可以看出，本发明总多酚提取方法的提取率最高。
表5不同提取方式总多酚提取得率结果
Figure BDA0003525345150000131
Figure BDA0003525345150000141
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种大白桩菇总多酚的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：液态发酵大白桩菇菌种获得菌丝体，将菌丝体与水混合提取，取上清液，即为水提液，剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取，取上清液，即为醇提液；将水提液与醇提液混合，萃取，纯化，得大白桩菇总多酚。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌丝体与水混合提取为超声提取，所述剩余沉淀物与无水乙醇溶液混合提取为超声提取。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述液态发酵的液体培养基包括：碳源16-35g/L，氮源4-6g/L，磷酸二氢钾0.4-0.6g/L，硫酸镁0.2-0.3g/L，维生素B18-12mg/L，所述液体培养基的pH值为5-7。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述碳源包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、海藻糖和乳糖中的一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮源包括蛋白胨、硫酸铵、牛肉浸膏、酵母粉和麸皮中的一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌丝体与水的质量体积比为1：20。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述沉淀物与无水乙醇溶液的质量体积比为1：10-30。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无水乙醇溶液含有琥珀酸和氯仿，所述无水乙醇、琥珀酸和氯仿的体积比为20-40：0.5-4：2-7。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述萃取所用的溶剂为石油醚和乙酸乙酯混合液，所述石油醚和乙酸乙酯的体积比为1-2：1。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化为采用非极性大孔树脂过滤。
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