CN108096478B - 一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及活性物质生产技术领域，公开一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，本发明通过培养桑黄液体发酵菌种、培养燕麦固体桑黄菌质、制备燕麦桑黄谷菌粉的过程，获得了燕麦桑黄谷菌粉，燕麦桑黄谷菌粉经过浸提后测定桑黄总黄酮含量，证明了其富含大量黄酮类物质，本发明提供一种利用常温谷物固体发酵的方法，发酵获得大量的黄酮类物质，经理化实验分析获得的黄酮类物质具有强的抗氧化活性，同时本发明具有操作简单、不依赖于子实体的发生、推广性强的特点，特别适用于高等真菌大规模发酵及活性物质生产，该方法可以在常温条件下短时间快速获得大量黄酮有效成分，可在未来医学领域应用推广。
Description
技术领域
本发明涉及活性物质生产技术领域，尤其涉及一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法。
背景技术
桑黄是一种在中国、日本和韩国广泛流行的一种稀有的重要的药用多孔真菌。桑黄在分类中隶属于担子菌的层菌纲、多孔菌目、多孔菌科的层孔菌属。有关于桑黄的药用价值的记载最早出现在2000年以前最古老的一本中国药典——《神农本草经》，书中称其为“桑耳”，取桑树的耳朵的意义。公元七世纪的唐早期的一些对草药的记载中，已经明确了桑黄的药用价值，但是其高效的抗肿瘤的活性直到近几十年才被人们认识和证实。其中黄酮类物质是桑黄醇溶性提取物中的重要成分，它是一类多酚类物质也是活性重要的活性成分之一。桑黄黄酮被证实可以促进细胞的分化、抗氧化、抗肿瘤、抗诱变和免疫保护的功效。
由于层孔菌属的类群中大多数具有相似的伞形子实体结构，同时多数缺乏对其采集地信息的收集，所以桑黄菌种I. baumii-I. linteus作为一类种群包括了裂蹄木层孔菌、火木层孔菌和暴麻子等多种层孔菌属的真菌，这些真菌很长一段时间在亚洲都被错误的认为是桑黄的双命名系统，并有大量研究针对I. baumii-I. linteus这一类群进行功效成分分析。2010年，Wu et al.和Xie et al. (20等人结合了形态学特征的鉴定和nrDNAITS 序列的测定分析，将I. baumii-I. linteus群类中的菌株均被分为11个分支，将原有的I. baumii-I. linteus这一种群（原指桑黄）分为了8个层孔菌属，其中桑黄（I.sanghuang）被定义为一个新的种，它代表了真正生长在桑树上的桑黄菌种。
目前，生物类黄酮主要是通过从药用植物中提取，由于植物资源的栽培条件和培养成本高，制约着生物类黄酮广泛应用。桑黄菌种I. baumii-I. linteus是大型真菌中少数含有黄酮类的药用真菌。桑黄黄酮可以从桑黄子实体分离获得，也可以通过菌丝体深层发酵法生产。野生桑黄的生长周期相当长，要长成适合药用的大小，需要 20 至 30 年且功效成分稳定性差。人工栽培桑黄目前无法形成子实体。目前商业上所进行的人工栽培的桑黄实际上是生长在丁香树上的暴麻子或生长在杨树上的杨黄这两个近似种，而并非桑树上的纯正桑黄菌种，经过多年尝试目前仍不能获得人工栽培的正宗桑黄菌子实体，这可能主要与桑黄菌株专性寄生的特性有关。由于发酵成本低、黄酮纯度高，深层发酵法正逐步取代组织提取法。目前对菌丝体发酵法生产桑黄黄酮的研究主要集中于培养基优化，反应器设计优化以及发酵参数优化等。对于桑黄发酵而言，培养方式对黄酮产量的提高至关重要。浙江省是中国最重要的桑树栽培地区之一，对应的桑黄的野生资源比较丰富。
本产品通过对桑黄菌种I. baumii-I. linteus的10个菌株进行生长速度，黄酮产量以及发酵产物抗氧化性比较最终选择了生长速度快、黄酮产量高以及抗氧化活性显著地千岛湖分离桑黄菌株（I.sanghuang）作为固体发酵的品种。产品具有特殊香味，含有桑黄、燕麦的活性成分，营养丰富，可用于未来功能食品的加工和生产。工艺操作简单﹑稳定﹑安全可靠，适合工业化大规模生产。培养基配方中的各组分对生理皆无副作用，可以随桑黄菌丝制成产品。本发明获得的桑黄黄酮类物质为正宗的桑黄产黄酮，同时获得的产量远高于其他文献专利所记录的水平，差异显著。本发明通过燕麦桑黄固体发酵方法，获取大量燕麦桑黄谷菌粉，为开发制成相关的保健品提供了可靠地数据支持。该工艺的应用，发酵获得大量的黄酮类物质，经理化实验分析获得的黄酮类物质具有强的抗氧化活性，对保护野生桑黄资源，缓解桑黄子实体不足，降低成本，工业化开发桑黄保健食品具有重要的实际意义。该方法不依赖于子实体的发生，可以在常温条件下短时间快速获得大量黄酮有效成分，可在未来医学领域应用推广。
发明内容
本发明针对现有技术中不能获得人工栽培的正宗桑黄菌子实体的缺点，提供一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，包括如下步骤：
（1）桑黄液体发酵菌种的培养：将桑黄斜面活化母种接种到PDA培养基上，活化培养，培养温度为23-28℃，培养时间为8-10 d，得到桑黄菌块，取边缘横截面为直径1cm的桑黄菌块接种到装有50 ml-100 ml PD液体培养基的培养瓶中并将培养瓶置于摇床中进行恒温发酵培养，摇床的旋转频率为90-110 rpm，培养温度为23-28℃，培养时间为10-15 d，得到桑黄液体发酵菌种；培养所使用的培养瓶为三角瓶。
（2）燕麦固体桑黄菌质的培养：将桑黄液体发酵菌种用匀浆仪进行菌丝破碎，每破碎3-5s静置30-50s，连续重复操作2-4次，得到菌丝体匀浆液，随后将菌丝体匀浆液按照1:8-1:12的接种量接种到添加了0.5%-1%食品级碳酸钙的燕麦固体培养基内，于培养瓶内进行恒温培养，培养温度为23-28℃，培养时间为6-18d，得到燕麦固体桑黄菌质；菌丝体匀浆液接种到燕麦固体培养基内，6d后菌丝能够长半满瓶，11d后菌丝能长满瓶，实施例中的6d和11d即是菌丝长满半瓶和满瓶的时间，不同的固体培养基中菌丝成长的速度也不同。
（3）燕麦桑黄谷菌粉的制备：将燕麦固体桑黄菌质于50-60℃烘箱中烘干，将烘干的燕麦固体桑黄菌质粉碎，粉碎后得到的粉末过100-200目筛，获得燕麦桑黄谷菌粉。
作为优选，在步骤（2）中恒温培养6-18d后，将培养完后的培养瓶开盖透气培养7-14d，得到燕麦固体桑黄菌质。菌丝在培养过程中需要密封培养瓶，使菌丝的生长速度变快，培养完毕后打开培养瓶的透气孔，使培养瓶中的湿度降低。
作为优选，步骤（1）中所述的桑黄斜面活化母种采用桑黄保藏菌种接种到PDA 培养基活化恒温培养，培养温度为23-28℃，培养时间为10d，直至菌丝长满斜面，得到桑黄斜面活化母种，置于4-10℃下保存。
作为优选，步骤（1）中所述的PDA培养基内含有 200 g/L的去皮马铃薯、20 g/L的葡萄糖 、20 g/L的琼脂和蒸馏水。
作为优选， 步骤（1）中所述的PD液体培养基内含有去皮马铃薯 200 g/L、葡萄糖20 g/L和蒸馏水。
作为优选，步骤（2）中所述的燕麦固体培养基通过将燕麦用冷水洗净后在沸水中浸泡25-35 min，水分被燕麦吸收，并在筛篮里静置1-2 h，然后将未被燕麦吸收的水分沥干；得到燕麦固体培养基的水分含量为45%-50%，将125-135g燕麦固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌1.5-2h。固体培养基的水分含量需要严格控制，因为水分含量过高会产生厌气发酵而使得培养基变酸，造成栽培失败，水分含量过低也同样会影响发酵的进行。
本发明由于采用了以上技术方案，具有显著的技术效果：本发明提供一种利用常温谷物固体发酵的方法，发酵获得大量的黄酮类物质，经理化实验分析获得的黄酮类物质具有强的抗氧化活性，本发明在多种报道桑黄药用菌株的收集和筛选基础之上，利用燕麦固体发酵培养，经过18-25天的固体发酵，即可获得黄酮产量高达21.1 mg rutin/g，比对照发酵时间缩短了50%，黄酮产量提高了约35％，抗氧化能力显著提高，同时本发明具有操作简单、不依赖于子实体的发生、推广性强的特点，特别适用于高等真菌大规模发酵及活性物质生产，该方法可以在常温条件下短时间快速获得大量黄酮有效成分，可在未来医学领域应用推广。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，包括如下步骤：
（1）桑黄液体发酵菌种的培养：将桑黄斜面活化母种接种到PDA培养基上，活化培养，培养温度为25℃，培养时间为10 d，得到桑黄菌块，取边缘横截面为直径1cm的桑黄菌块接种到装有50 ml PD液体培养基的培养瓶中并将培养瓶置于摇床中进行恒温发酵培养，摇床的旋转频率为100 rpm，培养温度为25℃，培养时间为12 d，得到桑黄液体发酵菌种；
（2）燕麦固体桑黄菌质的培养：将桑黄液体发酵菌种用匀浆仪进行菌丝破碎，每破碎3s静置30s，连续重复操作2次，随后菌丝体匀浆液按照1:10的接种量接种到添加了1%食品级碳酸钙的燕麦固体培养基内，于培养瓶内进行恒温培养，培养温度为25℃，培养时间为6 d，将燕麦固体桑黄菌质从组培瓶中取出并于50-60℃烘箱中烘干，粉碎，过100目，得到燕麦固体桑黄菌质；
（3）燕麦桑黄谷菌粉的制备：将燕麦固体桑黄菌质于55℃烘箱中烘干，将烘干的燕麦固体桑黄菌质粉碎，粉碎后得到的粉末过100目筛，获得燕麦桑黄谷菌粉1。
步骤（1）中所述的桑黄斜面活化母种采用桑黄保藏菌种接种到PDA 培养基活化恒温培养，培养温度为25℃，培养时间为10d，直至菌丝长满斜面，得到桑黄斜面活化母种，置于4℃下保存。
步骤（1）中所述的PDA培养基内含有 200 g/L的去皮马铃薯、20 g/L的葡萄糖 、20g/L的琼脂和蒸馏水。
步骤（1）中所述的PD液体培养基内含有去皮马铃薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L和蒸馏水。
步骤（2）中所述的燕麦固体培养基通过将燕麦用冷水洗净后在沸水中浸泡30min，水分被燕麦吸收，并在筛篮里静置2 h，然后将未被燕麦吸收的水分沥干；得到燕麦固体培养基的水分含量为45%，将130g燕麦固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌2h。
实施例2
与实施例1相同，不同之处在于，步骤（2）中燕麦固体桑黄菌质的培养，培养时间为11d，最终得到的为燕麦桑黄谷菌粉2。
实施例3
与实施例1相同，不同之处在于，步骤（2）中燕麦固体桑黄菌质的培养，培养时间为11d，培养完后将培养瓶开盖透气培养7d，最终得到的为燕麦桑黄谷菌粉3。
实施例4
与实施例1相同，不同之处在于，步骤（2）中燕麦固体桑黄菌质的培养，培养时间为11d，培养完后将培养瓶开盖透气培养14d，最终得到的为燕麦桑黄谷菌粉4。
实施例5
与实施例1相同，不同之处在于，步骤（2）中燕麦固体桑黄菌质的培养，培养时间为18d，最终得到的为燕麦桑黄谷菌粉5。
实施例6
与实施例1相同，不同之处在于，步骤（2）中不接种桑黄液体发酵菌种得到的菌丝体匀浆液，最终得到的为燕麦谷粉。
实施例7
测定不同时间的燕麦谷菌粉的抗氧化性，取实施例1-6的燕麦桑黄谷菌粉或燕麦桑黄谷粉1.0g，加入30mL 70% 乙醇，超声波浸提30 min，离心过滤获得提取液采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定桑黄总黄酮含量，得到的数据如下：
表1 不同燕麦谷菌粉的黄酮含量及抗氧化性测定数据表
实验结果：在保证发酵时间和成本效率的前提下，此时黄酮含量达到峰值的条件是发酵11天至菌丝满瓶后开盖透气7-14天降低湿度，综合培养时间、成本和培养效果，最适合采用的条件是发酵11天至菌丝满瓶后开盖透气7-14天降低湿度。
实施例8
一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，包括如下步骤：
（1）桑黄液体发酵菌种的培养：将桑黄斜面活化母种接种到PDA培养基上，活化培养，培养温度为25℃，培养时间为10 d，得到桑黄菌块，取边缘横截面为直径1cm的桑黄菌块接种到装有50 mlPD液体培养基的培养瓶中并将培养瓶置于摇床中进行恒温发酵培养，摇床的旋转频率为100rpm，培养温度为25℃，培养时间为15d，得到桑黄液体发酵菌种；
（2）燕麦固体桑黄菌质的培养：将桑黄液体发酵菌种用匀浆仪进行菌丝破碎，每破碎3s静置30s，连续重复操作2次，随后菌丝体匀浆液按照1:10的接种量接种到添加了1%食品级碳酸钙的燕麦固体培养基内，于培养瓶内进行恒温培养，培养温度为25℃，培养至菌丝长满培养瓶，开盖透气培养7d，将燕麦固体桑黄菌质从组培瓶中取出并于60℃烘箱中烘干，粉碎，过100目，得到燕麦固体桑黄菌质；
（3）燕麦桑黄谷菌粉的制备：将燕麦固体桑黄菌质于60℃烘箱中烘干，将烘干的燕麦固体桑黄菌质粉碎，粉碎后得到的粉末过100目筛，获得燕麦桑黄谷菌粉。
步骤（1）中所述的桑黄斜面活化母种采用桑黄保藏菌种接种到PDA 培养基活化恒温培养，培养温度为25℃，培养时间为10d，直至菌丝长满斜面，得到桑黄斜面活化母种，置于4℃下保存。
步骤（1）中所述的PDA培养基内含有 200 g/L的去皮马铃薯、20 g/L的葡萄糖 、20g/L的琼脂和蒸馏水。
步骤（1）中所述的PD液体培养基内含有去皮马铃薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L和蒸馏水。
步骤（2）中所述的燕麦固体培养基通过将燕麦用冷水洗净后在沸水中浸泡30min，水分被燕麦吸收，并在筛篮里静置2 h，然后将未被燕麦吸收的水分沥干；得到燕麦固体培养基的水分含量为45%，将130g燕麦固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌2h。
实施例9
与实施例8相同，不同之处在于，燕麦固体培养基为玉米固体培养基，玉米固体培养基通过将用冷水洗净后在沸水中浸泡30min，水分被玉米吸收，并在筛篮里静置2 h，然后将未被玉米吸收的水分沥干；得到玉米固体培养基的水分含量为45%，将130g玉米固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌2h，最终得到的为玉米桑黄谷菌粉。
实施例10
与实施例8相同，不同之处在于，燕麦固体培养基为小米固体培养基，小米固体培养基通过将用冷水洗净后在沸水中浸泡30min，水分被小米吸收，并在筛篮里静置2 h，然后将未被小米吸收的水分沥干；得到小米固体培养基的水分含量为45%，将130g小米固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌2h，最终得到的为小米桑黄谷菌粉。
实施例11
与实施例8相同，不同之处在于，燕麦固体培养基为大麦固体培养基，大麦固体培养基通过将用冷水洗净后在沸水中浸泡30min，水分被大麦吸收，并在筛篮里静置2 h，然后将未被大麦吸收的水分沥干；得到大麦固体培养基的水分含量为45%，将130g大麦固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌2h，最终得到的为大麦桑黄谷菌粉。
实施例12
取不同实施例8-11的谷物桑黄谷菌粉1.0g，加入30mL 70% 乙醇，于超声波浸提30min，离心过滤获得提取液采用硝酸铝-亚硝酸钠比色法测定桑黄总黄酮含量，以及谷物桑黄谷菌粉抗氧化性，测得的数据如下：
表2 谷物桑黄谷菌粉的黄酮含量及抗氧化性测定数据表
实验结果：在保证发酵时间、合适的培养条件的前提下，使用不同的谷物作为固体培养基，从培养效果上来看，最适合采用的为燕麦固体培养基，其培养出的燕麦桑黄谷菌粉黄酮含量远高于其他谷物桑黄谷菌粉。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
Claims (4)
1.一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）桑黄液体发酵菌种的培养：将桑黄斜面活化母种接种到PDA培养基上，活化培养，培养温度为23-28℃，培养时间为8-10 d，得到桑黄菌块，取边缘横截面为直径1cm的桑黄菌块接种到装有50 ml-100 ml PD液体培养基的培养瓶中并将培养瓶置于摇床中进行恒温发酵培养，摇床的旋转频率为90-110 rpm，培养温度为23-28℃，培养时间为10-15d，得到桑黄液体发酵菌种；
（2）燕麦固体桑黄菌质的培养：将桑黄液体发酵菌种用匀浆仪进行菌丝破碎，每破碎3-5s静置30-50s，连续重复操作2-4次，得到菌丝体匀浆液，随后将菌丝体匀浆液按照1:8-1:12的接种量接种到添加了0.5%-1%食品级碳酸钙的燕麦固体培养基内，于培养瓶内进行恒温培养，培养温度为23-28℃，培养时间为6-18d，将培养完后的培养瓶开盖透气培养7-14d，得到燕麦固体桑黄菌质；
其中，燕麦固体培养基通过将燕麦用冷水洗净后在沸水中浸泡25-35 min，水分被燕麦吸收，并在筛篮里静置1-2 h，然后将未被燕麦吸收的水分沥干；得到燕麦固体培养基的水分含量为45%-50%，将125-135g燕麦固体培养基装入植物培瓶，于121℃的温度下灭菌1.5-2h；
（3）燕麦桑黄谷菌粉的制备：将燕麦固体桑黄菌质于50-60℃烘箱中烘干，将烘干的燕麦固体桑黄菌质粉碎，粉碎后得到的粉末过100-200目筛，获得燕麦桑黄谷菌粉。
2. 根据权利要求1所述的一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，其特征在于：步骤（1）中所述的桑黄斜面活化母种采用桑黄保藏菌种接种到PDA 培养基活化恒温培养，培养温度为23-28℃，培养时间为10d，直至菌丝长满斜面，得到桑黄斜面活化母种，置于4-10℃下保存。
3. 根据权利要求1所述的一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PDA培养基内含有 200 g/L的去皮马铃薯、20 g/L的葡萄糖 、20 g/L的琼脂和蒸馏水。
4. 根据权利要求1所述的一种富含桑黄黄酮的燕麦桑黄谷菌粉的生产方法，其特征在于：步骤（1）中所述的PD液体培养基内含有去皮马铃薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L和蒸馏水。
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