CN101353680B - 一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺 - Google Patents
一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，该工艺包括斜面菌种活化培养、液体菌种制备、液体发酵培养，该工艺以葡萄糖、玉米粉为碳源，以蛋白胨、大豆粉为氮源，采用液体好氧发酵方法进行生产，可以同时获得茶薪菇多糖和三萜类物质，茶薪菇多糖和三萜类物质产量高达2.10g/L以上和842.51mg/L以上，本发明所述方法工艺简单，可达到“一罐两药”的目的，是一种极具工业化前景的生产方法。
Description
技术领域：
本发明涉及一种利用食用菌茶薪菇生产多糖和三萜类物质的液体发酵工艺，属于生物工程技术领域，是利用生物体的培养、发酵而生产已知的，或新的生物体，或其代谢物的技术。
背景技术：
茶薪菇(Agrocybe aegerita)为担子菌纲、粪锈伞科、田头菇属真菌。是一种具有很高开发价值的珍稀食药用真菌。食味独特，营养丰富，具有祛湿、利尿、健脾胃、明目、抗衰老、降低胆固醇、防癌和抗癌的特殊功能，还可治疗头晕、头痛、腹泻、呕吐等症。茶薪菇近年来在国内已进行广泛人工栽培，但由于人工栽培存在周期长、成本高、受环境条件影响大等缺点，在一定程度上限制了对其开发利用，而采用液体发酵技术是目前深度开发食用菌活性成分的有效方法，并已成功在灵芝、香菇、灰树花等珍稀食药用菌实现规模化生产。有关茶薪菇液体深层发酵研究报道较少。已有研究主要集中在茶薪菇菌丝体生物量、多糖或三萜类物质的某一方面的发酵生产。
还有一些相关文献报道茶薪菇液体发酵方法，但是，其主要生理活性物质均较低，至今尚无成熟的液体发酵法高产茶薪菇多糖和三萜类物质的方法，因此，尽快开发研究一种通过液体发酵法能够同时高产茶薪菇多糖和三萜类物质的技术，达到“一罐两药”的目的，是人们所迫切需要的。
发明内容：
本发明的目的在于克服上述已有技术的不足而提供一种达到一罐两药、降低成本，生产产量高的利用食用菌茶薪菇生产多糖和三萜类物质的液体发酵工艺。
本发明的目的可以通过如下措施来达到：一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于其工艺流程为：斜面菌种活化培养→液体菌种制备→液体发酵培养；具体步骤如下：
1、斜面菌种活化培养：将茶薪菇菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，进行斜面菌种的培养，培养温度25～30℃，培养时间5～10天；
2、液体菌种制备：
液体培养基组成：马铃薯150～250g/L、葡萄糖15～25g/L、酵母膏1～5g/L、余量为蒸馏水；pH值自然。
培养条件：挑取活化好的斜面菌种接种于三角瓶中，置于摇床中培养，转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天；
3、液体发酵培养：
发酵培养基组成：葡萄糖10～20g/L、 蛋白胨1～5g/L、玉米粉15～30g/L、大豆粉2～10g/L、余量为蒸馏水；
培养条件：将制备的液体菌种接种于三角瓶中，置于摇床中发酵培养，摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天；
为了进一步实现本发明的目的，所述的液体培养基组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、余量为蒸馏水。
为了进一步实现本发明的目的，所述的发酵培养基组成：葡萄糖16g/L、蛋白胨2.93g/L、玉米粉20.93g/L、大豆粉6.44g/L、余量为蒸馏水。
为了进一步实现本发明的目的，所述的液体菌种制备步骤的培养条件中500mL三角瓶中装有液体培养基50～200mL。
为了进一步实现本发明的目的，所述的液体发酵培养步骤的培养条件中500mL三角瓶中装有液体培养基50～200mL。
为了进一步实现本发明的目的，所述的液体发酵培养步骤的培养条件中初始pH值4～8。
为了进一步实现本发明的目的，所述的液体发酵培养步骤的培养条件中接种量200～800mg湿重/L。
为了进一步实现本发明的目的，所述的茶薪菇菌种为田头菇属真菌茶薪菇(Agrocybe aegerita)，为普通栽培品种，购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No.5.778。
多糖和三萜类物质的提取与测定：
从发酵培养的产物中收集茶薪菇菌丝体，采用常规的方法分离茶薪菇多糖和三萜类物质。
茶薪菇多糖可通过乙醇沉淀法获得，三萜类物质通过甲醇超声提取后经过初步纯化获得，采用常规的分析方法对产物进行分析测试。
本发明同已有技术相比可产生如下积极效果：本发明采用液体发酵法同时高效生产茶薪菇多糖和三萜类物质，且多糖和三萜类物质产量分别达到2.10g/L以上和842.51mg/L以上，均高于现有文献报道水平，为采用“一罐两药”进行工业化生产奠定了基础；本发明所筛选的以玉米粉和大豆粉为主要原料的发酵培养基有利于进一步降低工业化发酵生产成本。
具体实施方式：
采用的菌种：菌种为田头菇属真菌茶薪菇(Agrocybe aegerita)，为普通栽培品种，购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为CGMCCNo.5.778。茶薪菇菌种还可采用其他普通栽培品种。
实施例1
(1)斜面菌种活化培养：将茶薪菇菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，进行斜面菌种的培养，培养温度27℃，培养时间7天。
(2)液体菌种制备：
液体培养基组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、余量为蒸馏水；pH值自然。
培养条件：挑取活化好的斜面菌种3块，接种于500mL三角瓶中(装有液体培养基100mL)，置于摇床中培养，转速150r/min，温度27℃，时间7天。
(3)液体发酵培养：
发酵培养基组成：葡萄糖16g/L、蛋白胨2.93g/L、玉米粉20.93g/L、大豆粉6.44g/L，余量为蒸馏水。
培养条件：将制备的液体菌种接种于500mL三角瓶中(装有液体培养基100mL)，置于摇床中发酵培养，初始pH值6，接种量500mg湿重/L，摇床转速150r/min，温度27℃，时间7天；
茶薪菇多糖和三萜类物质提取和测定：
从发酵培养的产物中收集茶薪菇菌丝体，菌丝体在45℃干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85％乙醇于60℃浸提30min，重复2次，去除单糖、双糖、低聚糖等干扰成分，再于沸水浴中浸提1h。3000r/min，离心20min，取上清液定容至100mL，浓硫酸～苯酚法测定多糖含量为2.1g/L。
1g样品中加50mL甲醇超声提取3h，过滤，上清蒸干，加甲醇定容至5mL，紫外比色法测定三萜类物质含量为842.51mg/L。
实施例2：
(1)斜面菌种活化培养：将茶薪菇菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，进行斜面菌种的培养，培养温度25℃，培养时间10天。
(2)液体菌种制备：
液体培养基组成：马铃薯150g/L、葡萄糖15g/L、酵母膏1g/L、余量为蒸馏水；pH值自然。
培养条件：挑取活化好的斜面菌种2块，接种于500mL三角瓶中(装有液体培养基50mL)，置于摇床中培养，转速100r/min，温度25℃，时间8天。
(3)液体发酵培养：
发酵培养基组成：葡萄糖10g/L、蛋白胨1g/L、玉米粉15g/L、大豆粉2g/L，余量为蒸馏水。
培养条件：将制备的液体菌种接种于500mL三角瓶中(装有液体培养基50mL)，置于摇床中发酵培养，初始pH值4，接种量200mg湿重/L，摇床转速100r/min，温度25℃，时间8天；
茶薪菇多糖和三萜类物质提取和测定：
从发酵培养的产物中收集茶薪菇菌丝体，菌丝体在45℃干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85％乙醇于60℃浸提30min，重复2次，去除单糖、双糖、低聚糖等干扰成分，再于沸水浴中浸提1h。3000r/min，离心20min，取上清液定容至100mL，浓硫酸～苯酚法测定多糖含量为1.60g/L。
1g样品中加50mL甲醇超声提取3h，过滤，上清蒸干，加甲醇定容至5mL，紫外比色法测定三萜类物质含量为543.39mg/L。
实施例3：
(1)斜面菌种活化培养：将茶薪菇菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，进行斜面菌种的培养，培养温度30℃，培养时间5天。
(2)液体菌种制备：
液体培养基组成：马铃薯250g/L、葡萄糖25g/L、酵母膏5g/L、余量为蒸馏水；pH值自然。
培养条件：挑取活化好的斜面菌种4块，接种于500mL三角瓶中(装有液体培养基200mL)，置于摇床中培养，转速180r/min，温度30℃，时间5天。
(3)液体发酵培养：
发酵培养基组成：葡萄糖16g/L、蛋白胨2.93g/L、玉米粉20.93g/L、大豆粉6.44g/L，余量为蒸馏水。
培养条件：将制备的液体菌种接种于500mL三角瓶中(装有液体培养基200mL)，置于摇床中发酵培养，初始pH值8，接种量800mg湿重/L，摇床转速180r/min，温度30℃，时间5天；
茶薪菇多糖和三萜类物质提取和测定：
从发酵培养的产物中收集茶薪菇菌丝体，菌丝体在45℃干燥至恒重，研磨成粉末，取100mg，用15mL85％乙醇于60℃浸提30min，重复2次，去除单糖、双糖、低聚糖等干扰成分，再于沸水浴中浸提1h。3000r/min，离心20min，取上清液定容至100mL，浓硫酸～苯酚法测定多糖含量为2.07g/L。
1g样品中加50mL甲醇超声提取3h，过滤，上清蒸干，加甲醇定容至5mL，紫外比色法测定三萜类物质含量为630.76mg/L。
Claims (7)
1.一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于其具体步骤如下：
(1)、斜面菌种活化培养：将茶薪菇菌种接种于PDA斜面培养基上活化后，转接到PDA平板培养基上，进行斜面菌种的培养，培养温度25～30℃，培养时间5～10天；所述的茶薪菇菌种为田头菇属真菌茶薪菇(Agrocybe aegerita)，为普通栽培品种，购自中国普通微生物菌种保藏中心，编号为CGMCC No.5.778；
(2)、液体菌种制备：
液体培养基组成：马铃薯150～250g/L、葡萄糖15～25g/L、酵母膏1～5g/L、余量为蒸馏水；pH值自然；
培养条件：挑取活化好的斜面菌种接种于三角瓶中，置于摇床中培养，转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天；
(3)、液体发酵培养：
发酵培养基组成：葡萄糖10～20g/L、蛋白胨1～5g/L、玉米粉15～30g/L、大豆粉2～10g/L、余量为蒸馏水；
培养条件：将制备的液体菌种接种于三角瓶中，置于摇床中发酵培养，摇床转速100～180r/min，温度25～30℃，时间5～8天，得到茶薪菇菌丝体。
2.根据权利要求1所述的一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于所述的液体培养基组成：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、酵母膏2g/L、余量为蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于所述的发酵培养基组成：葡萄糖16g/L、蛋白胨2.93g/L、玉米粉20.93g/L、大豆粉6.44g/L、余量为蒸馏水。
4.根据权利要求1所述的一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于所述的液体菌种制备步骤的培养条件中500mL三角瓶中装有液体培养基50～200mL。
5.根据权利要求1所述的一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于所述的液体发酵培养步骤的培养条件中500mL三角瓶中装有液体培养基50～200mL。
6.根据权利要求1所述的一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于所述的液体发酵培养步骤的培养条件中初始pH值4～8。
7.根据权利要求1所述的一种高产多糖和三萜类物质的茶薪菇菌丝体的液体发酵工艺，其特征在于所述的液体发酵培养步骤的培养条件中接种量200～800mg湿重/L。
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