JP2002293779A - フラボノイド化合物及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】 高い抗酸化作用を発揮することができるよう
に構成されたフラボノイド化合物及びその製造方法を提
供する。 【解決手段】 フラボノイド化合物は、下記化１で示さ
れる構造を有し、ナリンゲニンの８位又は６位に水酸基
を備えた８−ヒドロキシナリンゲニン（８ＯＨ−ＮＡ）
又は６−ヒドロキシナリンゲニン（６ＯＨ−ＮＡ）であ
る。これらフラボノイド化合物は、ナリンジン（ＮＡ）
をアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）に
て微生物発酵処理することによって得られる。前記微生
物発酵処理は、ナリンジンとアスペルギルスを添加した
培地を振盪培養し、アスペルギルスの栄養菌糸にナリン
ゲニンを生成させる菌糸培養工程と、アスペルギルスの
栄養菌糸から胞子形成を進行させながら８ＯＨ−ＮＡ及
び６ＯＨ−ＮＡを生成させる胞子形成工程とから構成さ
れる。 【化１】 但し、Ｒ１は水素でＲ２は水酸基、又はＲ１は水酸基で
Ｒ２は水素。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この発明は、高い抗酸化性を
有するフラボノイド化合物及びその製造方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】従来より、ナリンゲニンの配糖体である
ナリンジンは、ザボン、夏みかん、グレープフルーツ等
の柑橘類、特にそれら柑橘類の果皮やじょうのう膜に多
く含まれるフラボノイドである。このナリンジンは、強
い苦味を有していることから、主として飲料等に苦味を
付与するために用いられている。また、このナリンジン
は、抗腫瘍作用や抗炎症作用を有しているうえ、発癌物
質によるラット乳癌の生成に対して抑制作用を有するこ
とが知られている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】ところが、前記ナリン
ジンは、極めて低い抗酸化作用を発揮するに止まってお
り、抗酸化剤としての利用は全く行われていなかった。

【０００４】この発明は、前記ナリンジンのさらなる利
用拡大を目指した鋭意研究の結果なされたものである。
その目的とするところは、高い抗酸化作用を発揮するこ
とができるように構成されたフラボノイド化合物及びそ
の製造方法を提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記の目的を達成するた
めに、請求項１に記載の発明のフラボノイド化合物は、
下記化２で示される構造を有し、抗酸化性を有すること
を特徴とするものである。

【０００６】

【化２】 但し、Ｒ１は水素でＲ２は水酸基、又はＲ１は水酸基で
Ｒ２は水素。

【０００７】請求項２に記載の発明のフラボノイド化合
物は、請求項１に記載の発明において、アスペルギルス
・サイトイ（Aspergillus saitoi）を用いて、ナリンジ
ンを微生物発酵処理することによって得られることを特
徴とするものである。

【０００８】請求項３に記載の発明のフラボノイド化合
物の製造方法は、請求項１又は請求項２に記載のフラボ
ノイド化合物を製造するフラボノイド化合物の製造方法
であって、ナリンジンをアスペルギルス・サイトイ（As
pergillus saitoi）にて微生物発酵処理することによ
り、前記ナリンジンを微生物変換してフラボノイド化合
物を生成させることを特徴とするものである。

【０００９】請求項４に記載の発明のフラボノイド化合
物の製造方法は、請求項３に記載の発明において実施さ
れ、前記微生物発酵処理は、ナリンジンとアスペルギル
ス・サイトイとを含む培地を振盪培養し、アスペルギル
ス・サイトイの栄養菌糸にナリンジンからナリンゲニン
を微生物変換させる菌糸培養工程を行った後、アスペル
ギルス・サイトイの栄養菌糸から胞子形成を進行させつ
つ、前記培地中のナリンゲニンからフラボノイド化合物
を微生物変換させる胞子形成工程を行うように構成した
ことを特徴とするものである。

【００１０】なお、前記菌糸培養工程後の胞子形成工程
は、そのまま振盪培養しても、静置培養に切り替えても
どちらでもよい。但し、静置培養する場合には、培地の
深さを浅くして培地の体積に対する表面積の割合（比表
面積）を大きくすることにより、培地全体を好気的条件
に保ち、アスペルギルス・サイトイによる微生物変換効
率を高めるように構成するのが好ましい。

【００１１】請求項５に記載の発明のフラボノイド化合
物の製造方法は、請求項４に記載の発明において実施さ
れ、前記菌糸培養工程に先立って、アスペルギルス・サ
イトイを含む培地を振盪培養する予備培養工程を行うよ
うに構成したことを特徴とするものである。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、この発明を具体化した実施
形態を詳細に説明する。実施形態の第１のフラボノイド
化合物は、下記化３で示される構造を有している。

【００１３】

【化３】 この第１のフラボノイド化合物は、化学式がＣ₁₅Ｈ₁₂Ｏ
₆で、分子量が約２８９のフラボノイド化合物（4',5,7,
8-tetrahydroxyflavanone 又は 2,3-dihydro-5,7,8-tri
hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on
e）である。このフラボノイド化合物は、上記化３で示
される構造より、ナリンゲニン（naringenin；4',5,7-t
rihydroxyflavanone）の８位に水酸基を備えた有機化合
物、いわゆる８−ヒドロキシナリンゲニン（8-hydroxyn
aringenin）である。

【００１４】実施形態の第２のフラボノイド化合物は、
下記化４で示される構造を有している。

【００１５】

【化４】 この第２のフラボノイド化合物は、化学式がＣ₁₅Ｈ₁₂Ｏ
₆で、分子量が約２８９のフラボノイド化合物（4',5,6,
7-tetrahydroxyflavanone 又は 2,3-dihydro-5,6,7-tri
hydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-on
e）である。このフラボノイド化合物は、上記化４で示
される構造より、ナリンゲニン（naringenin）の６位に
水酸基を備えた有機化合物、いわゆる６−ヒドロキシナ
リンゲニン（6-hydroxynaringenin）である。

【００１６】これら８−ヒドロキシナリンゲニン及び６
−ヒドロキシナリンゲニン（第１及び第２のフラボノイ
ド化合物）は、いずれもメタノール、エタノール及びジ
メチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）に可溶で、若干溶解
性が悪いが水にも可溶である。さらに、前記ナリンゲニ
ンには抗酸化作用がほとんど見られないのに対し、第１
及び第２のフラボノイド化合物は極めて高い抗酸化作用
を発揮することができる。特に、前記８−ヒドロキシナ
リンゲニンは、６−ヒドロキシナリンゲニンよりもより
一層高い抗酸化作用を発揮することができる。そして、
この高い抗酸化作用を利用して、例えば食品や飲料等に
添加して健康増進活性を有する健康食品や健康ドリンク
等に利用することができる。このとき、これら第１及び
第２のフラボノイド化合物は、生体内で活性酸素を消去
して過酸化脂質の生成を抑制し、酸化ストレスに起因す
る癌、動脈硬化、糖尿病の合併症等の生活習慣病の予防
に役立つ。

【００１７】第１及び第２のフラボノイド化合物は、ナ
リンジン（naringin）をアスペルギルス・サイトイ（As
pergillus saitoi）にて微生物発酵処理することによっ
て得られる。すなわち、これらフラボノイド化合物は、
ナリンゲニンとネオヘスペリジオース（neohesheridios
e）との配糖体であるナリンジンを含有する培地中でア
スペルギルス・サイトイを培養し、そのアスペルギルス
・サイトイにナリンジンを微生物変換させることによ
り、その培養上澄み液中に生成される。なお、このとき
の培養条件としては、アスペルギルス・サイトイの生育
及び前記微生物変換を良好に行うために、２０〜４０℃
の培養温度、好気的条件であるのが好ましい。

【００１８】前記培地としては、ポテトデキストロース
含有培地やツァペック培地等の糸状菌用培地又はオカラ
等の有機物を含有する種々の液体培地が好適に使用され
る。さらに、ナリンジンから前記フラボノイド化合物を
微生物変換させる目的以外の発酵を阻害するように、必
要最小限の栄養素を含有する最小培地であるのが好まし
く、例えばアルコール発酵しないように単糖類及び二糖
類が培地中に含まれないようにするのが好ましい。ま
た、前記培地は、培養開始時点では、アスペルギルス・
サイトイの生育を良好にするために、ｐＨ３〜７の範囲
内であるのが好ましい。

【００１９】さらに、培地中にナリンジンを添加する際
には、培地中におけるナリンジンの溶解性を高める目的
で、低濃度の有機溶媒が含有されるのが好ましい。前記
有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ＤＭＳＯ
等が挙げられる。この培地中の有機溶媒の含有量として
は、好ましくは０．０１〜５容量％、より好ましくは
０．０１〜０．１容量％である。この培地中の有機溶媒
の含有量が０．０１容量％未満の場合には、培地中に充
分な量のナリンジンを溶解させることができない。逆に
５容量％を越える場合には、アスペルギルス・サイトイ
の生育が阻害される。

【００２０】一方、培地中に添加されるナリンジンの含
有量としては、多量のフラボノイド化合物を効率よく得
るために、その溶解限界としての飽和濃度まで含有させ
るのが好ましい。なお、前記飽和濃度は、前記有機溶媒
の含有量と深く関連しているが、およそ１重量％以下で
ある。また、培養開始時に培地中に添加されるアスペル
ギルス・サイトイの濃度としては、多量のフラボノイド
化合物を短期間で効率よく得るために、２×１０⁶個／
ｍＬ（ｃｆｕ／ｍＬ）以上であるのが好ましい。

【００２１】さらに、このアスペルギルス・サイトイに
よる微生物変換効率を高めるために、前記培地中でアス
ペルギルス・サイトイの栄養菌糸を振盪培養する菌糸培
養工程を行った後、その栄養菌糸から胞子形成を進行さ
せる胞子形成工程を行うように構成するのが好ましい。

【００２２】なお、前記菌糸培養工程に先立って、アス
ペルギルス・サイトイが栄養菌糸を充分に形成できるよ
うにするために、菌体のみを含有する培地を予備的に振
盪培養（以下、予備培養工程と記載する）するように構
成するのが好ましい。この予備培養工程は、ナリンジン
の溶解性を高めるために培地中に同時に添加される有機
溶媒によるアスペルギルス・サイトイの培養初期段階
（増殖初期段階）での生育阻害を回避することにより、
ナリンジンの微生物変換効率を高めるために行われる。

【００２３】この予備培養工程は、アスペルギルス・サ
イトイの培養初期段階における生育阻害を確実に回避す
るために、好ましくはアスペルギルス・サイトイの栄養
菌糸が培養液面の１／３以上占めるまで、より好ましく
は１／３〜２／３程度占めるまで行うように構成され
る。この予備培養工程において、アスペルギルス・サイ
トイの栄養菌糸が培養液面の１／３〜２／３程度占める
までの期間は概ね１〜２週間である。この予備培養工程
期間が１週間未満では栄養菌糸が液面の１／３を占める
に至らない。逆に２週間を超える場合には、アスペルギ
ルス・サイトイの栄養菌糸が容器全体に増殖してしま
い、培地の栄養成分が欠乏するため、アスペルギルス・
サイトイによりナリンジンの分解が早く進み、工程の制
御が難しくなる。

【００２４】菌糸培養工程は、培地中にナリンジンを添
加してから後の工程であり、前記ナリンジンを含有する
培地中で好気的条件を保ちつつさらにアスペルギルス・
サイトイを振盪培養することにより、アスペルギルス・
サイトイの栄養菌糸にナリンジンを微生物変換させる工
程である。この工程において、アスペルギルス・サイト
イの栄養菌糸は、ナリンジンを構成するナリンゲニンと
ネオネオヘスペリジオースとの結合を切断してナリンゲ
ニンを生成するグリコシダーゼ反応を極めて効率的に行
う。

【００２５】なおこのとき、培地中に添加されるナリン
ジンの含有量は、前記溶解限界を超えて添加されても構
わない。このとき、ナリンジン添加時点では溶解されず
に培養容器の底部に沈澱していたナリンジンが振盪によ
る撹拌作用により適宜培地中に溶解されて微生物発酵に
利用され得る。さらに、培地中に溶解限界を超えてナリ
ンジンを含有させた場合には、培養容器底部のナリンジ
ンの沈澱を防ぐ目的で、５０ｒｐｍ／分程度で沈澱が消
失するまで振盪培養するように構成するのが好ましく、
その結果としてより多くのナリンゲニンを生成させるこ
とができる。

【００２６】胞子形成工程は、前記菌糸培養工程後の培
地をそのまま培地交換せずに静置培養又は振盪培養する
ことによって、アスペルギルス・サイトイの栄養菌糸に
胞子形成を進行させながら微生物変換を行わせる工程で
ある。なお、菌糸培養工程から胞子形成工程に移行する
段階は、菌糸培養工程が終了する前から胞子形成が始ま
る場合もあるため、明確には区別をすることはできない
が、胞子が形成され始めたことを目視にて一応確認可能
となることから、それを指標にして把握することができ
る。

【００２７】この工程において、アスペルギルス・サイ
トイの栄養菌糸は、胞子形成を進行させながら、ナリン
ゲニンの８位又は６位に水酸基を付加させるヒドロキシ
ラーゼ反応を行ってフラボノイド化合物を極めて効率的
に生成させる。なお、この胞子形成工程では、通常８−
ヒドロキシナリンゲニンと６−ヒドロキシナリンゲニン
とが所定の比率で同時に生成される。これら８−ヒドロ
キシナリンゲニン及び６−ヒドロキシナリンゲニンの生
成反応は、培養容器内における胞子形成過程の前期から
中期にかけて最も効率的に行われ、収量も増加する。し
かし、胞子形成が中期から完了する段階につれて、次第
に８−ヒドロキシナリンゲニンと６−ヒドロキシナリン
ゲニンが分解され、含有量が減少する。このため、より
大量の８−ヒドロキシナリンゲニンと６−ヒドロキシナ
リンゲニンを得るために、ナリンジン添加後からの培養
日数が３〜１０日で培養を停止するように構成するのが
好ましく、ここで生成されたフラボノイド化合物を抽出
するとよい。

【００２８】また、この胞子形成工程において静置培養
を行う場合には、振盪時の物理的刺激による胞子形成の
抑制効果を容易に解消することができるため、胞子形成
が速やかに行われ、８−ヒドロキシナリンゲニンと６−
ヒドロキシナリンゲニンの収量のピークも早くでる。な
お、この静置培養時には、培地の深さを浅くして培地の
体積に対する表面積の割合（比表面積）を大きくするこ
とにより、培地全体を好気的条件に保ち、アスペルギル
ス・サイトイの活動を活発化させてその微生物変換効率
を高めるように構成するのが好ましい。

【００２９】一方、胞子形成工程において振盪培養を行
う場合には、培地の深さを適度に深くしても好気的条件
を保つことが容易であり、さらに物理的刺激により胞子
形成を遅らすことができるため微生物変換が緩やかに行
われ、８−ヒドロキシナリンゲニンと６−ヒドロキシナ
リンゲニンの収量のピークも静置培養より遅くなる。

【００３０】本実施形態における振盪培養の振盪速度と
しては、５０〜２００ｒｐｍ／分の範囲内であるのが好
ましい。この振盪速度が５０ｒｐｍ／分未満の場合に
は、アスペルギルス・サイトイを含有した培地全体が好
気的でないため、菌糸の増殖が充分にできない。逆に振
盪速度が２００ｒｐｍ／分を越える場合には、培地の揺
れが激しく、菌糸形成が充分にできない。

【００３１】最後に、上記培養上澄み液又は前記胞子形
成工程後の培地からフラボノイド化合物を抽出して精製
する。このとき、前記培地をアスペルギルス・サイトイ
の細胞膜が破壊されない程度に遠心分離（３０００ｒｐ
ｍ程度）して上澄み画分を得、その上澄み画分を疎水性
カラムによる逆相液体クロマトグラフィーにより精製す
るとよい。なお、前記遠心分離後の沈澱画分にも比較的
多量のフラボノイド化合物が含まれていることから、そ
の沈澱画分にメタノールやエタノール等の有機溶媒を加
えて充分に洗浄しながら抽出した後、その抽出液を逆相
液体クロマトグラフィーにて精製するように構成すると
よい。

【００３２】さらに、８−ヒドロキシナリンゲニンと６
−ヒドロキシナリンゲニンとは、極めて類似した性質を
有していることから、前記逆相液体クロマトグラフィー
において著しく類似した溶出パターンを示す。このた
め、両者を互いに別々の画分に分離するために、必要に
応じて諸条件を僅かに変更しつつ、逆相液体クロマトグ
ラフィーその他の分離精製を行うように構成するのがよ
り好ましい。

【００３３】上記実施形態によって発揮される効果につ
いて、以下に記載する。・ 実施形態の第１のフラボノ
イド化合物は上記化３で示される構造を有する８−ヒド
ロキシナリンゲニンであり、第２のフラボノイド化合物
は上記化４で示される構造を有する６−ヒドロキシナリ
ンゲニンである。これらのフラボノイド化合物は、ナリ
ンゲニンの８位又は６位に水酸基が付加された構造を有
することによって、ナリンジン及びナリンゲニンと比べ
て著しく高い抗酸化作用を発揮することができる。この
ため、生体内で活性酸素を消去して過酸化脂質の生成を
抑制し、酸化ストレスに起因する癌、動脈硬化、糖尿病
の合併症等の生活習慣病の予防に役立てることができ
る。

【００３４】さらに、これらのフラボノイド化合物はい
ずれも、アスペルギルス・サイトイを用いてナリンジン
を微生物発酵処理することによって得られたものである
ことから、天然に多く存在するナリンジンの有効利用を
促進し、その利用範囲の拡大を図ることができる。これ
に対して、第１及び第２のフラボノイド化合物について
は、植物（例えばコガネバナの葉）の抽出物から分離精
製された文献や、植物の抽出物（例えばベニバナ色素の
アグリコン）を酸で異性化することによって化学的に合
成された文献等が知られている。しかしながら、これら
の文献では、いずれも抗酸化性を有することについては
解明されておらず、抗酸化剤としての新たな利用分野の
開拓を示唆するものではなかった。

【００３５】加えて、原料としてのナリンジンは、ザボ
ン、夏みかん、グレープフルーツ等の果皮やじょうのう
膜に多く含有されていることから、果汁を搾汁した後の
残渣（廃棄物）を極めて有効に利用することができる。
前記残渣は、ナリンジンが極めて高濃度に濃縮されてい
るうえ、大量かつ安価に入手することが容易である。こ
のため、これらフラボノイド化合物は、前記残渣を原料
として使用することによって、極めて大量かつ安価に製
造することが可能である。また、原料として柑橘類に含
有されている天然成分であるナリンジンを用いるととも
に、焼酎等の酒類の醸造に利用されるアスペルギルス・
サイトイが用いられていることから、人体への摂取にお
いてもほとんど問題がない。

【００３６】・ 実施形態の第１及び第２のフラボノイ
ド化合物の製造方法は、ナリンジンをアスペルギルス・
サイトイにて微生物発酵処理することにより、前記ナリ
ンジンを微生物変換して得られるものである。このた
め、高い抗酸化作用を発揮することができるフラボノイ
ド化合物を極めて容易に製造することができる。さら
に、前記微生物発酵処理において、ナリンジンとアスペ
ルギルス・サイトイとを含む培地を振盪培養する菌糸培
養工程を行った後に胞子形成工程を行うように構成する
ことによって、非常に簡単な作業工程で、第１及び第２
のフラボノイド化合物を極めて効率的に製造することが
可能となる。また、前記菌糸培養工程に先立って、予備
培養工程を行うことによって、アスペルギルス・サイト
イの培養初期における生育阻害を回避して、ナリンジン
の微生物変換効率を容易に高めることが可能である。

【００３７】

【実施例】以下、前記実施形態を具体化した実施例及び
比較例について説明する。 ＜ナリンジン変換物の製造＞ポテトデキストロース−ブ
ロス培地（ＤＩＦＣＯ社製）を複数個の三角フラスコ
（容積５００ｍＬ）に１００ｍＬずつ分取し、オートク
レーブ滅菌（１２１℃、１５分間）を行った。冷却した
後に、２×１０⁸個／ｍＬ以上の濃度に調製したアスペ
ルギルス・サイトイの胞子懸濁液を１．０ｍＬずつ各フ
ラスコに接種し、３０℃の恒温室（大気と同じ成分の好
気的条件）内において１００ｒｐｍ／分で振盪培養を行
いながら栄養菌糸を育成させた。なお、前記アスペルギ
ルス・サイトイは、(財)応用微生物学研究奨励会（通称
ＩＡＭ）より分譲を受けたアスペルギルス・サイトイ菌
株（ＩＡＭ Ｎｏ．２２１０）が用いられた。

【００３８】１０日間振盪培養を行って栄養菌糸を生育
させた後、オートクレーブ滅菌（１０５℃、５分間）し
た１０重量％のナリンジン（ＳＩＧＭＡ社製）エタノー
ル希釈液を５ｍＬずつ加え、引続き同好気的条件下で振
盪培養を行なって、さらに栄養菌糸からの胞子形成を進
行させた。なお、このときの胞子形成の様子を経時的に
モニタリングしたところ、ナリンジンを投入しておよそ
５日経過後から胞子の形成が始まり、３週間後には培地
の液面全体で胞子の形成が認められたことが分かった。

【００３９】本実験では、ナリンジン投入後から１週間
経過した時点（胞子が液面に出現しはじめた時期）、す
なわち胞子形成の前期から中期と思われる時期のサンプ
ルを採取した。そして、この採取されたサンプルを遠心
分離（３０００ｒｐｍ、１５分間）して不純物を沈澱除
去した後、その上澄み液を分析用高速液体クロマトグラ
フィー（ＨＰＬＣ）（島津製作所製のＬＣ１０Ａ、カラ
ムはＹＭＣ社製のＡ３０３）にて分析し、フラボノイド
組成の変化を調べた。その結果、フラボノイド組成物全
体に占めるナリンジン変換物のピークの割合はおよそ３
０％であることが分かった。

【００４０】さらに、前記ナリンジン変換物を含有する
ことが確認されたＨＰＬＣ用サンプルの残りをエバポレ
ーターにて濃縮した後、分取用ＨＰＬＣ（島津製作所製
のＬＣ８Ａ、カラムはＹＭＣ社製のＲ３５３−１５１
Ａ、ＳＨ３４３−５）にて分画し、ナリンジン変換物の
単離精製を行った。その結果、極めて近接した位置に２
種類のナリンジン変換物のピークが確認された。これら
２種類のナリンジン変換物のピークの割合は、およそ４
７．５％（第１のナリンジン変換物）及び３３．２％
（第２のナリンジン変換物）であった。

【００４１】＜構造決定＞上記＜ナリンジン変換物の製
造＞で得られた第１及び第２のナリンジン変換物の構造
決定を行った。¹Ｈ ＮＭＲ及び¹³Ｃ ＮＭＲスペクトル
は、内部標準としてＤＭＳＯ−ｄ６に溶解させたテトラ
メチルシラン（Tetramethylsilane；ＴＭＳ）を用いて
ＪＥＯＬ ＪＮＭ−ＥＸ−４００ ＮＭＲ装置（¹Ｈ ＮＭ
Ｒは４００ＭＨｚ、¹³Ｃ ＮＭＲは１００ＭＨｚ）で分
析した。質量スペクトル（ＦＡＢ-ＭＳ）は、ＪＥＯＬ
ＪＭＳ−ＤＸ−７０５Ｌで測定した。また、各ナリンジ
ン変換物を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて展開
（展開溶媒は１−ブタノール／酢酸／水＝４／１／５）
し、そのＲｆ値（移動率）を求めた。結果を表１〜表３
に示す。

【００４２】

【表１】

【００４３】

【表２】

【００４４】

【表３】 その結果、前記第１のナリンジン変換物は上記化３で示
される構造を有する８−ヒドロキシナリンゲニンであ
り、第２のナリンジン変換物は上記化４で示される構造
を有する６−ヒドロキシナリンゲニンであることが確認
された。

【００４５】＜抗酸化活性の測定１＞上記＜ナリンジン
変換物の製造＞で得られた第１のナリンジン変換物とし
ての８−ヒドロキシナリンゲニン（８ＯＨ−ＮＡ）と、
第２のナリンジン変換物としての６−ヒドロキシナリン
ゲニン（６ＯＨ−ＮＡ）と、対照試料としてナリンジン
（ＮＡ）について、ＤＰＰＨを用いたラジカル捕捉能測
定法による抗酸化活性の測定を行った。なお、このラジ
カル捕捉能測定法は、Yamaguchi,et.al.,Biosci.Biotec
hnol.Biochem.,62,1201-1204,1998に記載の方法に従っ
て行われた。

【００４６】すなわち、まず、０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液（ｐＨ７．４）８００μＬに、エタノールに溶解させ
た各試料溶液２００μＬを混合させた後、さらにエタノ
ールに溶解させた５００μＭのＤＰＰＨ（1,1-diphenyl
-2-picrylhydrazyl）を１ｍＬ加えて各反応液を調製
し、充分に混合させた後に室温、暗所で２０分間反応さ
せた。次に、マイクロシリンジを用いて各反応液２０μ
Ｌを前記分析用ＨＰＬＣ（ＬＣ−１０Ａ）に注入して分
析し、ＤＰＰＨのピーク面積を測定した。なお、前記試
料溶液としては、終濃度が０．１μＭ、１μＭ、１０μ
Ｍ及び１００μＭとなるように調製された各４種類の濃
度の８ＯＨ−ＮＡ、６ＯＨ−ＮＡ及びＮＡが使用され
た。また、ＨＰＬＣ分析条件としては、内径４．６ｍｍ
で長さが１５０ｍｍのオクチル（Ｏｃｔｙｌ）カラム
（ＹＭＣ社製）、溶出溶媒が蒸留水／メタノール＝３０
／７０、流速は１ｍＬ／分、検出波長は５１７ｎｍとし
た。

【００４７】さらに、コントロールとして前記試料溶液
の代わりにエタノールのみの溶液２００μＬを使用して
同様にＨＰＬＣ分析してコントロールのＤＰＰＨのピー
ク面積を測定し、下記数１に示される算出式を用いて各
試料のラジカル捕捉能（％）を求めた。なお、このラジ
カル補足能は、数値が高いほど抗酸化活性が高いことを
示している。結果を図１に示す。

【００４８】

【数１】 その結果、発酵処理によりＮＡから生成された８ＯＨ−
ＮＡ及び６ＯＨ−ＮＡは、親水性溶媒中で、ＮＡよりも
著しく高い抗酸化活性を発揮することが分かった。

【００４９】＜抗酸化活性の測定２＞上記＜ナリンジン
変換物の製造＞で得られた第１のナリンジン変換物とし
ての８−ヒドロキシナリンゲニン（８ＯＨ−ＮＡ）と、
第２のナリンジン変換物としての６−ヒドロキシナリン
ゲニン（６ＯＨ−ＮＡ）と、対照試料としてナリンジン
（ＮＡ）と、高い抗酸化活性を有するα−トコフェロー
ル（Ｔｏｃ）について、リノール酸メチルを用いたＨＰ
ＬＣ分析法による抗酸化活性の測定を行った。なお、こ
のリノール酸メチルを用いたＨＰＬＣ分析法は、Terao
J,et.al.,Lipids,21(4),255-260,1986に記載の方法に従
って行われた。

【００５０】すなわち、まず、内径１４ｍｍの小型試験
管に、リノール酸メチル８９ｍｇ（１００μＬ）を精秤
した後、エタノールに溶解させた各試料溶液１００μＬ
を加えた各混合液を調製し、充分に混合させた。なお、
前記各混合液中の試料の終濃度は１００μＭである。次
に、これら混合液を減圧デシケーター中で真空ポンプを
用いて減圧乾燥させて溶媒を完全に除いた後、４０℃の
暗所に１８時間静置した。その後、０．０８％ＢＨＴ／
ヘキサン溶液（５．０ｍＬ）を加えた。そして、リノー
ル酸メチルにより生成した１３−ヒドロペルオキシドと
９−ヒドロペルオキシドのＨＰＬＣピーク面積の総和を
求めた。

【００５１】さらに、コントロールとして前記試料溶液
の代わりにエタノールのみの溶液１００μＬを使用して
同様にＨＰＬＣ分析してコントロールのＨＰＬＣピーク
面積の総和を測定し、下記数２に示される算出式を用い
て各試料の脂質過酸化度（％）を求めた。なお、この脂
質過酸化度は、数値が低いほど抗酸化活性が高いことを
示している。結果を図２に示す。

【００５２】

【数２】 その結果、発酵処理によりＮＡから生成された８ＯＨ−
ＮＡ及び６ＯＨ−ＮＡは、疎水性溶媒中で、ＮＡよりも
著しく高い抗酸化活性を発揮することが分かった。さら
に、８ＯＨ−ＮＡは、極めて高い抗酸化性を有すること
が知られているα−トコフェロールとほぼ同等の抗酸化
活性を発揮することも分かった。

【００５３】さらに、前記実施形態より把握できる技術
的思想について以下に記載する。・ 前記微生物発酵処
理を０．０１〜５容量％の有機溶媒を含有する培地中で
行うことを特徴とする請求項３から請求項５のいずれか
に記載のフラボノイド化合物の製造方法。このように構
成した場合、アスペルギルス・サイトイの生育阻害を低
減させつつ、比較的多量のナリンジンを培地中に溶解さ
せて、その微生物変換効率を容易に高めることができ
る。

【００５４】・ さらに前記微生物発酵処理後の培養上
澄み液を、疎水性カラムを用いた逆相液体クロマトグラ
フィーにより精製することを特徴とする請求項３から請
求項５のいずれかに記載のフラボノイド化合物の製造方
法。このように構成した場合、極めて容易にフラボノイ
ド化合物を単離することができる。

【００５５】・ 前記ナリンジンは、柑橘類の果皮又は
じょうのう膜から抽出されたものであることを特徴とす
る請求項３から請求項５のいずれかに記載のフラボノイ
ド化合物の製造方法。このように構成した場合、フラボ
ノイド化合物を大量かつ安価に製造することが容易であ
る。

【００５６】・ 上記化１で示される構造を有し、抗酸
化性を有することを特徴とする抗酸化物質。但し、Ｒ１
は水素でＲ２は水酸基、又はＲ１は水酸基でＲ２は水
素。このように構成した場合、高い抗酸化作用を発揮す
ることができる。

【００５７】・ 上記化３で示される構造を有し、アス
ペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）を用いて
ナリンジンを微生物発酵処理することによって得られ、
抗酸化性を有することを特徴とするフラボノイド化合
物。このように構成した場合、高い抗酸化作用を発揮す
ることができる。

【００５８】・ 上記化４で示される構造を有し、アス
ペルギルス・サイトイ（Aspergillus saitoi）を用いて
ナリンジンを微生物発酵処理することによって得られ、
抗酸化性を有することを特徴とするフラボノイド化合
物。このように構成した場合、高い抗酸化作用を発揮す
ることができる。

【００５９】

【発明の効果】以上詳述したように、この発明によれ
ば、次のような効果を奏する。請求項１及び請求項２に
記載の発明のフラボノイド化合物によれば、高い抗酸化
作用を発揮することができる。

【００６０】請求項３から請求項５に記載の発明のフラ
ボノイド化合物の製造方法によれば、高い抗酸化作用を
発揮することができるフラボノイド化合物を容易に製造
することができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 実施例の抗酸化活性の測定１の試験結果を示
すグラフ。

【図２】 実施例の抗酸化活性の測定２の試験結果を示
すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:66 Ｃ１２Ｒ 1:66） (72)発明者 三宅 義明 愛知県西春日井郡師勝町大字熊之庄字十二 社45−２ 株式会社ポッカコーポレーショ ンＲ＆Ｄ部門内 (72)発明者 大澤 俊彦 愛知県名古屋市東区徳川町2615−409 (72)発明者 湊 健一郎 愛知県名古屋市西区市場木町164−203 Ｆターム(参考） 4B018 LB08 MD08 MD52 ME06 ME08 MF13 4B064 AE46 BA03 BH04 BH05 BH08 CA05 CB07 CC03 CD09 DA01 DA10 4C062 EE54 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 BA08 MA01 MA04 NA14 ZA45 ZB26 ZC21 ZC35

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記化１で示される構造を有し、抗酸化
   性を有することを特徴とするフラボノイド化合物。 【化１】 但し、Ｒ１は水素でＲ２は水酸基、又はＲ１は水酸基で
   Ｒ２は水素。
2. 【請求項２】 アスペルギルス・サイトイ（Aspergillu
   s saitoi）を用いて、ナリンジンを微生物発酵処理する
   ことによって得られることを特徴とする請求項１に記載
   のフラボノイド化合物。
3. 【請求項３】 請求項１又は請求項２に記載のフラボノ
   イド化合物を製造するフラボノイド化合物の製造方法で
   あって、 ナリンジンをアスペルギルス・サイトイ（Aspergillus
   saitoi）にて微生物発酵処理することにより、前記ナリ
   ンジンを微生物変換してフラボノイド化合物を生成させ
   ることを特徴とするフラボノイド化合物の製造方法。
4. 【請求項４】 前記微生物発酵処理は、 ナリンジンとアスペルギルス・サイトイとを含む培地を
   振盪培養し、アスペルギルス・サイトイの栄養菌糸にナ
   リンジンからナリンゲニンを微生物変換させる菌糸培養
   工程を行った後、 アスペルギルス・サイトイの栄養菌糸から胞子形成を進
   行させつつ、前記培地中のナリンゲニンからフラボノイ
   ド化合物を微生物変換させる胞子形成工程を行うように
   構成したことを特徴とする請求項３に記載のフラボノイ
   ド化合物の製造方法。
5. 【請求項５】 前記菌糸培養工程に先立って、アスペル
   ギルス・サイトイを含む培地を振盪培養する予備培養工
   程を行うように構成したことを特徴とする請求項４に記
   載のフラボノイド化合物の製造方法。