WO2002072819A1 - Promoteurs - Google Patents

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WO2002072819A1
WO2002072819A1 PCT/JP2002/002341 JP0202341W WO02072819A1 WO 2002072819 A1 WO2002072819 A1 WO 2002072819A1 JP 0202341 W JP0202341 W JP 0202341W WO 02072819 A1 WO02072819 A1 WO 02072819A1
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gene
dna
vector
expression
seq
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PCT/JP2002/002341
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English (en)
French (fr)
Inventor
Tomoko Shimojo
Hikaru Takakura
Kazuyori Ochiai
Kiyozo Asada
Ikunoshin Kato
Original Assignee
Takara Bio, Inc.
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Publication date
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Priority to JP2002571874A priority patent/JP4028388B2/ja
Priority to DK02705116T priority patent/DK1371724T3/da
Priority to DE60229361T priority patent/DE60229361D1/de
Priority to US10/471,868 priority patent/US7125690B2/en
Priority to KR1020037011527A priority patent/KR100730230B1/ko
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria

Definitions

  • the present invention relates to a novel motor and a method for producing a protein using the promoter, which can easily and inexpensively express a product of a target gene at a low cost.
  • microbial cells such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast, animal cells, insect cells, and plant cells, for which culture techniques have been established, are used as hosts according to the purpose.
  • An expression system using a promoter suitable for such a host is used.
  • an expression system using Escherichia coli as a host and using a 1 ac promoter or an inducer thereof is one of the commonly used systems from the viewpoint of easy operation.
  • an expression system using a 1 ac promoter or a derivative thereof has a disadvantage that it is industrially disadvantageous because it is necessary to induce gene expression when expressing a gene product.
  • lac promoters and TAC promoters have the disadvantage that they are disadvantageous for implementation on an industrial scale because they require expensive IPTG (isopropyl- ⁇ -D-thiogalactovyranoside) to induce gene expression.
  • expression vectors using temperature induction of the phage ⁇ promoter are also commonly used.
  • Bacillus subtilis is known to produce and secrete many degrading enzymes such as amylase and protease as stationary phase-specific reactions. After the host has grown sufficiently using this stationary phase-specific expression mechanism, if the gene can be expressed only in the stationary phase, the burden on the host can be reduced and the exogenous gene can be expressed efficiently. However, a method for gene expression utilizing such a mechanism has not yet been established.
  • the present invention provides a promoter, a recombinant DNA, a gene expression vector, an expression vector, and a trait that can express a gene at a high level in a stationary phase-specific manner without artificially inducing the gene expression. It is an object of the present invention to provide a method for producing a protein and a kit thereof, which can be easily converted at low cost, and can be performed easily and inexpensively. Summary of the Invention
  • the gist of the present invention is:
  • the foreign gene is a nucleic acid selected from the group consisting of a nucleic acid encoding a protein, a nucleic acid encoding an antisense RNA, and a nucleic acid encoding a lipozyme; ,
  • a gene expression vector comprising the DNA of (1), (6) the vector is one selected from the group consisting of a plasmid vector, a phage vector, and a virus vector; 5) the vector for gene expression described above;
  • the expression vector according to (7) wherein the vector is one selected from the group consisting of a plasmid vector, a phage vector and a virus vector;
  • [10] a method for producing a protein, comprising: a step of culturing the transformed cell according to the above [9]; and a step of collecting a protein from the obtained culture.
  • a protein production kit comprising the DNA according to (1) or the vector for gene expression according to (5);
  • Bacillus subtilis strain DB104 of Bacillus subtilis [Gene, Vol. 83, Vol. 215 to 233]
  • (11989)] can be used a DNA which is located upstream of the open reading frame (ORF) of a gene derived from the stationary phase specifically and which contains an element exhibiting promoter activity.
  • the present invention relates to a foreign gene downstream of the DNA.
  • target gene (Also called target gene) is placed in the absence of the expression inducer. Based on the surprising finding of the inventors that the progeny product can be expressed at high levels of 100-500 mg per liter of medium.
  • Examples of the DNA of the present invention include a DNA having the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 6 in the sequence listing. More preferably, an isolated DNA exhibiting a promoter activity in a gram-positive bacterium in a stationary phase-specific manner, and even more preferably, a promoter exhibiting a promoter activity in a Bacillus bacterium or Escherichia coli in a stationary-phase-specific manner, as described later The isolated DNA.
  • promoter is located about 10 to 30 base pairs upstream from the transcription start point (+1) and has a function of causing RNA polymerase to start transcription from a precise position. Regions similar to the prive box, TATA box or TATA box are included, but are not necessarily limited to these regions. In addition to this region, RNA is also required to regulate expression. It may contain a region required for proteins other than limerase to associate.
  • promoter region which may be referred to as “promoter region” in the present specification, refers to a region containing a promoter in the present specification.
  • promoter activity refers to the expression of a gene in a host or outside of a host when a gene is placed in an expressible state downstream of the promoter and the resulting construct is introduced into the host. Indicates that it has the ability and function to produce.
  • promoter activity is as follows:
  • the presence or absence of the “promoter activity” may be determined, for example, by linking a sequence suspected of having a promoter sequence upstream of the reporter gene and introducing the gene into the host or outside the host when the gene is introduced into the host. It can be carried out by confirming the expression of the product.
  • the promoter is an indicator of having promoter activity in the introduced host.
  • the term “stationary phase-specific promoter” refers to a promoter that performs transcription only in the stationary phase after a logarithmic growth phase. That is, the “stationary phase-specific promoter” can express a gene arranged downstream of the promoter only in the stationary phase without induction using an inducer represented by IPTG or the like.
  • the DNA of the present invention also includes an isolated DNA fragment having the nucleotide sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 6 as long as promoter activity is specifically observed in the stationary phase. .
  • the “fragment” can be appropriately selected within a range where promoter activity is specifically observed in the stationary phase. Such fragments can be selected by the processes of steps (1) to (4).
  • the DNA of the present invention further comprises at least one base, specifically one or more bases, substitution, deletion, insertion, or DNAs having an additional nucleotide sequence and having promoter activity in a stationary phase-specific manner are also included.
  • DNA having a mutation substitution, deletion, insertion, or addition
  • DNA having a mutation in at least one base in DNA having a short sequence may change its activity.
  • a DNAj having a mutation, whose promoter activity was recognized in the stationary phase specifically by the processes (1) to (4), is included in the present invention. Such a mutation is any of a naturally occurring mutation and an artificially introduced mutation. You may.
  • a conventional site-directed mutagenesis method can be used.
  • a method for introducing a site-specific mutation for example, a method using an amber mutation [gapped duplex (gap ped du lex) method, Nucleic Acids Research), No. 1
  • a DNA that can hybridize with the complementary strand of the DNA of the present invention under stringent conditions, or an oligonucleotide probe or primer that is designed and chemically synthesized by a conventional method based on the DNA of the present invention is used.
  • the DNA obtained by the above method and having a stationary phase-specific promoter activity, preferably an isolated DNA exhibiting a stationary phase-specific promoter activity in Gram-positive bacteria is also encompassed in the present invention. You.
  • Such a DNA may be selected, for example, from those having a promoter activity recognized in the stationary phase specifically by the processes of the above steps (1) to (4).
  • the nucleotide sequence of the oligonucleotide probe is not particularly limited, as long as it hybridizes to the DNA or DNA having a nucleotide sequence complementary to the DNA under stringent conditions.
  • stringent conditions are, for example, Molecular cloning Ryo Laboratory Manual, Second Edition [San Bourke (Sambrook), et al., Molecular cloning, A laboratory manual 2 nd edition s 1989 years, Konoreto Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor
  • the base sequence of the primer is also not particularly limited, and the primer is annealed to the DNA or a DNA having a base sequence complementary to the DNA under normal PCR reaction conditions, and the extension reaction by DNA polymerase is started. Anything that can be done is acceptable.
  • Tm is, for example, the product of the content of A + T (Adeun + thymine) residue and 2 ° C and the content of G + C residue. It can be estimated from the sum of the product of the amount and 4 ° C [(A + T) X24-(G + C) X4].
  • the length of the oligonucleotide probe or primer is not particularly limited. From the viewpoint of preventing non-specific hybridization and non-specific ayling, it is preferably at least 6 bases, more preferably at least 10 bases. Is desirable. In addition, from the viewpoint of oligonucleotide synthesis, it is preferably 100 bases or less, and more preferably 30 bases or less.
  • Oligonucleotide designs are known to those skilled in the art, and can be designed with reference to, for example, Lab Manual PCR, pages 13 to 16, published by Takara Shuzo in 1996. Also, commercially available software, for example, OLI GO TM Primer Analysis of software (Takara Shuzo) can be used.
  • the oligonucleotide can be synthesized using a known method. For example, it can be synthesized by the phosphoramidite method using a DNA synthesizer type 394 (manufactured by Applied Biosystem). In addition, it can be synthesized using a phosphate triestenolate method, an H-phosphonate method, a thiophosphonate method, or the like.
  • the DNA of the present invention further provides a recombinant DNA in which the DNA and the foreign gene are arranged so that the foreign gene can be expressed. Strong recombinant DNA is also included in the present invention.
  • Examples of the foreign gene include, but are not particularly limited to, a nucleic acid encoding a protein (eg, an enzyme, a cytokin or an antibody), a nucleic acid encoding an antisense RNA, and a nucleic acid encoding a ribozyme.
  • the origin of the foreign gene is not particularly limited, but includes, for example, bacteria, yeasts, actinomycetes, and filamentous fungi. Microorganisms such as fungi, ascomycetes, and basidiomycetes; plants; insects; animals; and the like, and also artificially synthesized genes according to the purpose.
  • interleukin interleukin, IL
  • interferon IFN interferon a or "y gene
  • fl severe necrosis factor s TF gene colony Stimulating factor (colony-stimulating factor s CSF) gene
  • erythropoietin gene
  • transforming growth factor (TGF) - ⁇ gene immunoglobulin (immunoglobulin Ig) gene
  • tissue plasminogen activator tissue plasminogen activator ⁇ t-PA
  • urokinase urokinase
  • western firefly luciferase Western firefly luciferase
  • lipozyme refers to one that cleaves the mRNA of a specific protein, and one that inhibits the translation of these specific proteins.
  • a lipozyme can be designed from the sequence of a gene encoding a specific protein.
  • a hammerhead type liposome can be prepared using the method described in FEBS Letter, Vol. 228, pp. 228-230 (1998).
  • it cleaves the mRNA of a specific protein regardless of the type of lipozyme, such as a hairpin lipozyme, delta lipozyme, etc., as well as a hammerhead lipozyme. If they inhibit ribozyme, they are included in the ribozyme herein.
  • the DNA of the present invention exhibits a promoter activity that enables the gene to be exerted at a high level without artificially inducing gene expression
  • the foreign gene which is a nucleic acid encoding a protein, is particularly preferred. Is suitable for expression of
  • the DNA of the present invention provides a vector for gene expression containing the DNA.
  • a powerful gene expression vector is also included in the present invention.
  • the target gene product is expressed, for example, in the case of a protein at a level of 100 to 500 mg per liter of medium. And the desired gene product can be easily expressed according to the purpose of use.
  • examples of the vector include a plasmid vector, a phage vector, a virus vector, and a vector fragment comprising a part of the vector. The vector and vector fragment can be appropriately selected depending on the cells used as the host.
  • Cells that can be used as hosts are not particularly limited, and include Gram-positive bacteria.
  • Gram-positive bacteria include Bacillus bacteria for which a transformation system has been established. Specifically, Bacillus subtilis (Bacillus subtilis), Nothinores stear P thermophilus (Bacillus stearothermophilus), Notchinores licheniformis (Bacillus licheniformis), Bacillus brevis
  • Bacillus brevis Bacillus brevis
  • Bacillus sp. Bacillus sp.
  • Bacillus sp. Bacillus sp.
  • Escherichia coli can also be used as a host.
  • Escherichia coli has a well-established transformation system, and Escherichia coli of various genotypes has been produced. All of them are easily available and widely used as hosts for transformation. Specifically, Escherichia coli K-12
  • the strains include, but are not limited to, 101 strains, C600 strains, JM109 strains, DH5a strains, DH10B strains, XL-1B1ueMRF 'strains, TOP10F strains, etc. These Escherichia coli may be subjected to a mutation treatment or the like, and the resulting Escherichia coli may be used as a host.
  • plasmid vector for example, when the host is Bacillus ⁇ scan bacteria, as plasmid vector, P HY, and pUB 1 10, pE 194, as phage vector one, phi 105, and the like.
  • plasmid vectors include pUC18, pUC19, pBluescript pET and the like, and phage vectors include lambda phage vectors such as AgtlOgtil.
  • the gene expression vector of the present invention may contain a terminator such as rrnBT1T, a selectable marker gene, and the like.
  • selectable marker genes include an ampicillin resistance gene, a kanamycin resistance '1 to live gene, a chloramphenicol resistance gene, a tetracytaline resistance gene, and the like.
  • the vector for gene expression of the present invention may be used in accordance with the purpose of use of the target gene product, for example, daltathione mono-S-transferase, malt ⁇ It may contain a sequence that can be expressed as a fusion protein with a heterologous protein such as a protein, or a tag sequence that can be expressed as a protein to which a histidine tag or the like has been added.
  • the present invention provides an expression vector containing the recombinant DNA. Powerful expression vectors are also included in the present invention.
  • the expression vector of the present invention also includes a construct obtained by incorporating a target gene into the gene expression vector.
  • the same vector as the vector mentioned above for the gene expression vector can be used.
  • the expression vector of the present invention comprises ( a ) incorporating the recombinant DNA into an appropriate vector, (b) incorporating a target gene into the gene expression vector, or (c) incorporating the gene expression vector. By linking the target gene to the fragment, it can be produced.
  • the recombinant DNA and the expression vector of the present invention further provide the recombinant D
  • a transformed cell holding NA, or a transformed cell holding the expression vector can also be provided.
  • Examples of the host include cells similar to the aforementioned “cells that can be used as a host”.
  • the introduction of the expression vector into the host can be carried out, for example, by the sponteneous coffee etence method [Genetic Engineering Experiments, pp. 12-23, (Corporation) Japan Isotope Association, edited by 1991], the calcium phosphate method [Molecular and Cellular ⁇ - Biology, Volume 7, pp. 2745 (1 987)], Electroporation [Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, Vol. 81, pp. 716, pp. 1 984] ), DEAE-dextran method (Methods in Nucleic Acids Research, p. 283, column et al., Edited by CRC Presne Soil, 1999), ribosome method (BioTechniques, Volume 6, Page 68
  • a method for producing a protein comprising culturing the transformed cell and collecting the protein from the obtained culture.
  • a method for producing a protein is also included in the present invention.
  • Culture of the transformed cells can be appropriately selected depending on the cells used as the host, the properties of the protein to be expressed, and the like.
  • the protein obtained can be purified by conventional protein purification means. Wear.
  • powerful purification means include salting out, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, gel filtration chromatography and the like.
  • a protein production kit containing the DNA of the present invention or the gene expression vector of the present invention can be constructed and used. With such a kit, protein can be produced more easily.
  • B. subtilis Marburg 168 Parent strain of a strain commonly used as a Bacillus subtilis host in a recombinant DNA experiment.
  • B. subtilis DB 104 strain One of the derivatives of B. subtilis Mal burg 168 strain, which is a histidine-requiring strain. Mutations other than auxotrophy (nprR2, nprE18, aprED3) are identical to strain UOT1285. '
  • B. subtilis UOT 1285 strain One of the derivatives of B. subtilis Mal burg 168 strain, which is a tryptophan- and lysine-requiring strain. Mutations other than auxotrophy (nprR2, nprE18, aprED3) are identical to the DBIO4 strain.
  • a PCR primer was designed that can amplify almost the entire length of each ORF of Bacillus subtilis. Using these primers, Bacillus subtilis Marburg strain 168 [Molecular & General Genetics, Vol. 152, pp. 65-69 (1 9 7 7)] using a Ta Ka Ra Ex x && (1 or 1 && 1 ⁇ & 1 & ZT aq (both from Takara Shuzo) in a 96 9 Performed CR.
  • the obtained PCR product was purified, the purity and size were confirmed by agarose gel electrophoresis, and the DNA concentration was calculated by measuring the absorbance.
  • DNA fragment solution was concentrated by isopropanol precipitation, 1.
  • DNA fragment ⁇ ⁇ g / m 1 immobilized on a glass slide in accordance with the way described in WO 0 0 Bruno 2 6404 pamphlet A DNA chip was prepared.
  • the cells were washed twice in 30% XSSC containing 0.2% SDS at 55 ° C. for 30 minutes, 5 minutes at 65 ° C, and further washed in 0.05 ⁇ SSC at room temperature for 5 minutes, and dried.
  • Fluorescence of the hybridized DNA chip was detected with a DNA chip analyzer Affymetrix 418 ArrayScannery (manufactured by Affymetrix). In this fluorescence detection, the signal intensity is represented on the image by successive color steps of blue ⁇ green ⁇ yellow ⁇ orange ⁇ red ⁇ white.
  • DIG digoxigenin
  • Bacillus subtilis is DNA array [manufactured by Eurogentic (EUR0GENTEC), hereinafter referred to as a macromembrane, an estimated ORF derived from B. subtilis Marburg 168 strain. s] was subjected to hybridization.
  • the hybridization was performed in a solution of DIG Easy HybGranules (manufactured by Roche Diagnostics) at 42 ° C for 30 minutes, after prehybridization, and further at 42 ° C and 100 ° C. A high predication was performed. Subsequently, detection was carried out using DIG Wash Hand Block Buier and Detection kit (both manufactured by Roche Diagnostics).
  • the detection result is developed on a photosensitive film.
  • Example 1 For the screening of stationary phase-specific promoters, the searches in Example 1 and Example 2 were performed twice each, and the results showed that the amount of expression significantly increased 5 hours after the stationary phase.
  • the genes that were used were comprehensively determined, and 23 genes (ac ⁇ aco ⁇ iol J sig F si pW spo IIB spo III AH spo I VA S yab S ybc 0 ybc P ybc Q s ybc S ybc T yb dA, elected yb dD, yf iA, yg aB , yjd B N yng J yo bH, y qxA, the yrz E), were used in the following experiments.
  • Screening of stationary phase-specific promoters involves linking the DNA fragments of the above 23 types of genes, which are thought to contain the open motor region of the stationary phase-specific expressed gene, to a foreign gene and constructing a gene expression vector for each. It was done by building. Gene expression vectors were constructed using commercially available enzymes for gel purification and plasmid purification, gel purification kits and plasmid purification kits. Unless otherwise specified, molecular cloning was performed by the method described in Molecular Cloning Laboratory Mayual, 2nd edition (Saint Bruk et al., 1989, Cold Spring Harper Laboratory Press).
  • the primer sequence for amplifying the DNA fragment considered to be the promoter region of the aco A gene includes spo IIB in SEQ ID NO: 7 (primer a AF1) and SEQ ID NO: 8 (primer aARl).
  • the primer sequences for amplifying the DNA fragment considered to be the promoter region of the gene are shown in SEQ ID NO: 9 (primer spBF1) and SEQ ID NO: 10 (primer spBR1), and the DNA considered to be the promoter region of the ybcO gene.
  • the primer sequence for amplifying the fragment is SEQ ID NO: 11 (primer yb OF1) and SEQ ID NO: 12 (primer ybORl), and the primer sequence for amplifying the DNA fragment considered to be the promoter region of the yj dB gene is SEQ ID NO: 13. (Primer yj BF 1) and SEQ ID NO: 14
  • the primer sequence for amplifying a DNA fragment considered to be the promoter region of the yng J gene is SEQ ID NO: 15 (primer yn J F1) and SEQ ID NO: 16 (primer yn JRl) have a primer sequence for amplifying a DNA fragment considered to be the promoter region of the yrz E gene, SEQ ID NO: 17 (primer yr EFl) and SEQ ID NO: 18 (primer yn JRl).
  • yr ER l the primer sequence for amplifying a DNA fragment considered to be the promoter region of the yng J gene.
  • the PCR reaction was performed at 94 ° C for 30 seconds, 50 ° C for 1 minute, and 72 ° C for 1 minute as one cycle.
  • the plasmid pSP0l24 was isolated from the collected cells using QIAGEN Plasmid Minikit (Qiagen) according to the instructions attached to the kit. AC was prepared. At this time, the cells suspended in bufferP1 attached to the kit to which 4 mg / ml Lysozyme was added were treated at 37 ° C for 30 minutes.
  • plasmid pSPO124AC as a ⁇ type, a 5448 bp DNA fragment containing the SD sequence of the apr E gene encoding subtilisin E derived from Bacillus subtilis E, a secretion signal, and a hyperthermostable protease PFUS structural gene, Primer PLF 1 (SEQ ID NO: 19) and Primer PLR1 (SEQ ID NO: 20) Amplified by PCR using This was used as a vector fragment and used below.
  • DNA fragment containing the promoter region of the yngJ gene will be described as an example.
  • the DNA fragment which is thought to contain the promoter region of the yngJ gene amplified above was purified by using restriction enzymes KpnI and EcoRI (both manufactured by Takara Shuzo) and purified.
  • the obtained DNA fragment was mixed with a beta fragment digested with restriction enzymes nI and EcoRI and ligated.
  • Bacillus subtilis DB104 strain was transformed. This was spread on an LB plate containing 1% skim milk and 10 ⁇ g Zm1 kanamycin, and cultured at 37 ° C. for 16 hours.
  • a primer UBF1 (SEQ ID NO: 21) capable of amplifying a DNA fragment containing the promoter region was selected in order to select a clone containing the above-described 180 bp DNA fragment.
  • the primer SBP R 1 (SEQ ID NO: 22) was designed. With the combination of these two primers, a PCR reaction using TaKaRa Ex Taq (Takara Shuzo) in a reaction solution containing ImM PMS F was performed at 94 ° C for 30 seconds and at 55 at 1 minute for 72 minutes. Twenty cycles were performed at 1 ° C for one minute as one cycle.
  • a plasmid was prepared from the selected transformant and named pND20.
  • the Bacillus subtilis DB104 strain (Bacillus subtilis DB104 / pD20) into which the plasmid pND20 containing the hyperthermostable protease PFUS gene prepared in Example 3 was introduced was added with 10 ⁇ g / m 1 kanamycin-containing TKR BS 1 medium (20 mg / m 1 polypeptone, 2 mg / ml yeast extract, l OmgZml meat extract, 40 mg / ml glucose, 20 xg / ml F e S0 4 - 7H 2 0, 20 M g / m 1 Mn S0 4 ⁇ 5 ⁇ 2 ⁇ , 2 ⁇ g / m 1 Z n S0 4 - in 7H 2 O) 1ml, were cultured in 37 ° C. Four, seven, ten, and thirteen days after the start of the culture, 100 ⁇ l of each culture was collected, heat-treated at 95 ° C for 30 minutes, and the supernatant was collected by centr
  • the activity of the hyperthermostable protease PFUS is measured by enzymatic hydrolysis using Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA (Sigma) as a substrate! ) This was done by spectrophotometrically measuring 12 troarin phosphorus.
  • the enzyme preparation whose enzyme activity is to be measured is appropriately diluted with 10 OmM phosphate buffer (pH 7.0), and 1 mM Suc—A1a—A1a- is added to 50 ⁇ l of the sample solution.
  • One unit of the enzyme was defined as the amount of the enzyme that produces 1 / xmo 1 of p-nitroaline in 1 minute at 95 ° C.
  • the amount of the enzyme protein expressed based on the obtained enzyme activity was calculated assuming that the specific activity per protein weight of the hyperthermostable protease PFUS was 9.5 units (unit) / mg.
  • Example 4 Each of the crude enzyme solutions prepared in (1) was used as an enzyme preparation, and the hyperthermostable protease activity was measured. As a result, six plasmids (pNDl, pND6, ND10, pND19, pND20, pND23) were used to produce the hyperthermostable protease PFU.
  • the super-heat-resistant protein is about 1.2 times in 06, about 1.5 times or more in pND10, and about 2 times or more in pND20.
  • the expression level of the protease PFUS increased. In pND6, almost no expression of the hyperthermostable protease PFUS was observed on the fourth day in the early stage of the culture, and the expression level was higher than that of pSP0124AC on the tenth day in the late culture.
  • Table 4 shows the number of cultures B and the amount of production in which the expression level of hyperthermostable protease PFUS was maximized, together with the name of the gene from which the promoter originated. The production in the table is shown in mg per liter of culture solution.
  • pND1, pND6, pND10, pND19 and pND23 SPO124 ⁇ C each as type III, reporter gene
  • the region excluding the protease PFUS gene i.e., the region containing the promoter region, SD sequence, secretory signal, and vector, was used for primer NDF 1 (SEQ ID NO: 23) and primer NDR 1 (SEQ ID NO: 24). Amplified by PCR. The obtained amplified fragment was purified with restriction enzymes SpeI and MluI (both manufactured by Takara Shuzo) and purified. This was used as a vector fragment and used below.
  • the plasmid A2GR7310 carrying the alkaline protease gene from the hyperthermophilic bacterium Aeropyrum pernix K1 strain was transferred.
  • the region encoding the alkaline protease was amplified by PCR using primers AP1F1 (SEQ ID NO: 25) and AP1R1 (SEQ ID NO: 26).
  • the resulting amplified fragment was purified with restriction enzymes SpE I and MluI (both from Takara Shuzo) and purified. This was used as a reporter gene fragment and used below.
  • the nucleotide sequence of the alkaline protease gene derived from A. pernix used as the reporter gene is shown in SEQ ID NO: 33 in the sequence listing.
  • the reporter gene fragment was constructed using pND6, pND10 and pSPO124 ⁇
  • the recombinant plasmids were ligated with the beta-fragment from C, respectively, and the resulting recombinant plasmids (expression vectors) were named pND6Al, ND10A1 and pSPOA1, respectively.
  • the plasmid A2GR0030 carrying the nitrophenyl phosphatase gene derived from the hyperthermophilic bacterium AeropyrumpernixK1 strain was transferred from the National Institute of Technology and Evaluation. Using this as a poem, the region encoding nitrophenyl phosphatase was amplified by PCR using primers AP7F1 (SEQ ID NO: 27) and primer AP7R1 (SEQ ID NO: 28). did. The resulting amplified fragment was digested with the restriction enzymes Spel and MluI (both from Takara Shuzo) and purified. This was used as a reporter gene fragment and used below.
  • the nucleotide sequence of the A. pernix-derived -trofeninole phosphatase gene used as the reporter gene is shown in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing.
  • the reporter gene fragment was ligated with vector fragments derived from pND10, pND23 and pSPO124AC, respectively, and the resulting recombinant plasmids (expression vectors) were pND10A7, ND23A7 and pSPOA, respectively. Named 7.
  • Hyperthermophilic bacterium Pyrococcus from National Institute of Technology and Evaluation
  • the plasmid 2708 carrying the pyrrolidone carboxyl peptidase gene from horikoshii OT3 strain was transferred.
  • the region encoding the pyrrolidone-potency lipoxyl peptidase was amplified by PCR using primers PH1F1 (SEQ ID NO: 29) and primer PH1R1 (SEQ ID NO: 30).
  • the resulting amplified fragment was digested with the restriction enzymes SpeI and M1uI (both from Takara Shuzo) and purified. This was used as a reporter gene fragment and used below.
  • the nucleotide sequence of the pyrrolidonecarboxyl peptidase gene derived from P.horikoshii used as the reporter gene is shown in SEQ ID NO: 35 in the sequence listing.
  • the reporter gene fragment was ligated with vector fragments derived from pND10, pND19 and pSPO124AC, respectively, and the resulting recombinant plasmids (expression vectors) were pND10P1, pND19P1 and pND10P1, respectively. Named SPO P 1.
  • CR amplified fragment PH0628 PCR was received. Using this as a type I, a region encoding methionyl aminopeptidase was amplified by PCR using primers PH2F1 (SEQ ID NO: 31) and PH2R1 (SEQ ID NO: 32). The obtained amplified fragment was purified with restriction enzymes SpE I and MluI (both from Takara Shuzo) and purified. This was used as a reporter gene fragment and used below.
  • the base sequence of the methioninoreaminopeptidase gene derived from P.horikoshiii used as the reporter gene is shown in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing.
  • the reporter gene fragment was ligated to each of the vector fragments derived from pND1, pND19 and pSPO124mC, and the obtained ligated plasmid (expression vector) was ligated into pND1P2, pND19P2 and pND19P2, respectively.
  • Bacillus subtilis DB104 strain was transformed using each of the expression vectors prepared in Example 5- (2) above. This is 1% The seeds were spread on an LB plate containing 10 ⁇ g / m 1 kanamycin and incubated at 37 ° C. for 16 hours.
  • a clone containing the gene encoding the above enzyme was selected and cultured at 37 ° C. in 1 ml of TK RBS1 medium containing 10 ⁇ g Zm1 and kanamycin. After 10 days of culture
  • the culture was heat-treated at 95 ° C for 30 minutes, and the supernatant was recovered by centrifugation to obtain a crude enzyme solution (enzyme standard).
  • the activity of acaliproteases was measured using gelatin (manufactured by Nacalai Tesque) as a substrate as follows.
  • the enzyme preparation whose enzyme activity is to be measured is diluted appropriately with 5 OmM sodium phosphate buffer (pH 7.0), mixed with SDS-PAGE loading buffer, and incubated at room temperature for 30 minutes or more. I left it. This was loaded on a 10% polyatarylamide gel containing SDS containing 0.05% gelatin, and electrophoresis was performed. After the electrophoresis, the gel was washed with 5 OmM sodium phosphate buffer (pH 7.0). The washed genole was incubated in a 5 OmM sodium phosphate buffer (pH 7.0) at 95 ° C for 3 hours.
  • the reaction was stopped by cooling on ice and then stained with Coomassie blue, the gel image was image-filed using the image analysis software Adobe Pho toshop (manufactured by Adobe), and the activity signal was quantified using the NIH image software. .
  • the activity of etrophenyl phosphatase was measured using p-nitrophenylphosphoric acid (Sigma) as a substrate as follows.
  • the enzyme preparation to be'll measure enzyme activity moderately diluted with 100m M Tr is- HC 1 buffer containing 1 mM ZnC 1 2 (pH7. 5), the sample solution
  • the activity of pyrrolidone carboxyl peptidase was measured using the following method with the use of pyroglutamic acid-141-methylcoumarilu 7-amide (hereinafter abbreviated as Pyr-MCA) [Peptide Laboratory (PEPTIDE INSTITUTE)] as a substrate. I did it.
  • Pyr-MCA pyroglutamic acid-141-methylcoumarilu 7-amide
  • the enzyme preparation whose enzyme activity is to be measured is appropriately diluted with a 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM DTT and 1 mM EDTA, and then diluted to 50 // 1 with the sample solution.
  • 2 mM Pyr-MCA solution prepared with 50 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM DTT and ImM EDTA 50 ⁇ l was added, and the mixture was reacted at 95 ° C. for 30 minutes. After that, the reaction was stopped by cooling on ice,
  • Fluorescence emission at 460 nm with 355 nm excitation light was measured to determine the amount of MCA generated.
  • One unit of the enzyme was defined as the amount of the enzyme that produced 1 jumo 1 of MCA per minute at 95 ° C.
  • the activity of methionylaminopeptidase was measured using Met-Ala_Ser (manufactured by BACHEM) as a substrate as follows.
  • the enzyme preparation to be'll measure enzyme activity moderately diluted with 0. 5 mM C o C 1 2 10 0 mM phosphate Kariumu buffer containing (pH7. 5), the sample solution
  • ImM Met—Al a—Ser prepared in 10 OmM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 0.5 mM CoCl 2 ) in 5 ⁇ l The reaction was performed for 5 minutes. Then, the mixture was cooled on ice, and the reaction was stopped by adding 10 1 of 10 OmM EDTA, and then a mixed solution of 50 ⁇ 1 A (0.18 mg / m 1 L-amino acid oxidase, 50 ⁇ g / m 1 peroxidase and 0.1 mg / m 1 o-diamanidine-containing 100 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5)], and reacted at 37 ° C. for 10 minutes. After that, the reaction was stopped by cooling on ice,
  • the absorbance at 450 nm was measured.
  • the present invention provides a promoter capable of expressing the gene in a high stationary phase without inducing the gene expression. Sequence listing free text
  • SEQ ID NO: 2 Promoter region on pND 6.
  • SEQ ID NO: 3 Promoter region on p DlO.
  • SEQ ID N0: 4 Promoter region on p D19.
  • SEQ ID NO: 5 Promoter region on pND20.
  • SEQ ID NO: 6 Promoter region on pND23.
  • SEQ ID NO: 7 Primer aARl for amplifying promoter sequence of acoA gene.
  • SEQ ID NO: 8 Primer aARl for amplifying promoter sequence of acoA gene.
  • SEQ ID NO: 9 Primer spBFl for amplifying promoter sequence of spoIIB gene.
  • SEQ ID NO: 12 Primer ybORl for amplifying promoter sequence of ybcO gene.
  • SEQ ID NO: 14 Primer yjBRl for amplifying promoter sequence of yjdB gene.
  • SEQ ID NO: 15 Primer ynJFl for amplifying promoter sequence of yngj gene.
  • SEQ ID NO: 16 Primer ynJRl for amplifying promoter sequence of yngj gene.
  • SEQ ID NO: 17 Primer yrEFl for amplifying promoter sequence of yrzE gene.
  • SEQ ID NO: 18 Primer yrERl for amplifying promoter sequence of yrzE gene.
  • SEQ ID NO: 25 Primer AP1F1 for amplifying coding region of alkaline protease gene.
  • SEQ ID NO: 26 Primer AP1R1 for amplifying coding region of alkaline protease gene.
  • SEQ ID NO: 27 Primer AP7F1 for amplifying coding region of nitrophenyl phosphatase gene.
  • SEQ ID NO: 28 Primer AP7R1 for amplifying coding region of nitrophenyl phosphatase gene.
  • SEQ ID NO: 30 Primer PH1R1 for amplifying coding region of pyrro 1 i done-carboxy 1 eptidase gene.
  • SEQ ID NO: 31 Primer PH2F1 for amplifying coding region of methionyl aminopeptidase gene.
  • SEQ ID NO: 32 Primer PH2R1 for amplifying coding region of methionyl aminopeptidase gene.

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Description

明 細 書 プロモーター 技術分野
本発明は、 目的遺伝子の産物を簡便に、 かつ安価に高発現させうる、 新規なプ 口モーターおよび該プロモーターを用いたタンパク質の製造方法に関する。 背景技術
有用遺伝子産物を遺伝子工学的に製造する場合、 目的に応じて、 培養手法が確 立された大腸菌、 枯草菌、 酵母などの微生物細胞、 動物細胞、 昆虫細胞、 植物細 胞などを宿主として用い、 かかる宿主に適したプロモーターを利用した発現系が 利用されている。 なかでも、 大腸菌を宿主とし、 1 a cプロモーターやその誘導 体等を用いた発現系は、 その操作の容易性の観点から、 よく使用されている系の 1種である。
しかしながら、 1 a cプロモーターやその誘導体を用いた発現系には、 遺伝子 産物の発現の際に、 遺伝子発現の誘導を行なう必要があるため、 工業的に不利で あるという欠点を有する。 例えば、 l a cプロモーター、 t a cプロモーターな どは、 遺伝子発現の誘導に高価な I P T G (イソプロピル一 β一 D—チォガラク トビラノシド） を必要とするため、 工業規模での実施には不利であるという欠点 を有する。
同様に、 キシロースオペロンに由来するプロモーターを利用し、 バチルス属細 菌を宿主とする発現系が利用されているが、 その発現誘導にもキシロースの添加 を必要としているため工業規模での実施には不利である。
一方、 ファージ λプロモーターの温度誘導を用いる発現ベクターも、 一般的に 使用されている。
しかしながら、 組換遺伝子産物の温度誘導された過剰発現は、
( a ) 迅速な温度シフトアップを達成することの困難性、
( b ) より高い培養温度での不溶性ィンクルージョンボディ一を形成する可能性 の増大、 および
( C ) 熱ショック時の大腸菌におけるいくつかのプロテアーゼの誘導、 などの点で不利な場合がある。
枯草菌は定常期特異的反応として、 アミラーゼ、 プロテアーゼなど多くの分解 酵素を生産、 分泌することが知られている。 この定常期特異的な発現機構を利用 して宿主が十分生育した後、 定常期でのみ遺伝子を発現することができれば宿主 に対する負担を軽減し、 外来遺伝子の発現を効率良く行なうことができる。 しか しながら、 そのような機構を利用した遺伝子発現の手法は、 いまだ確立されてい ない。
従って、 遺伝子発現を人為的に誘導しなくても、 効率のよい発現が可能な手法 が望まれている。 発明の目的
本発明は、 遺伝子発現を人為的に誘導しなくても、 該遺伝子を高レベルで定常 期特異的に発現することができるプロモーター、 組換え DNA、 遺伝子発現用べ クタ一、発現ベクター、 及び形質転換細胞、 並びに操作が簡便であり、 かつ安価 に行ないうる、 タンパク質の製造方法及びそのキットを提供することを目的とす る。 発明の概要
本発明の要旨は、
〔1〕 以下からなる群より選択される単離された D NA：
( a ) 配列表の配列番号 1〜 6のいずれかに示された塩基配列を有する D N A若 しくはその断片であって、 かつグラム陽性菌において定常期特異的にプロモータ 一活性を呈する単離された D N A；及び
( b ) ( a ) の D NA若しくはその断片にストリンジェントな条件下、 ハイプリ ダイズ可能であって、 カゝっグラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活 性を呈する単離された D N A、
〔2〕 外来遺伝子の上流に配置された場合、 誘導物質の非存在下に該遺伝子を 定常期特異的に発現しうる、 前記 〔1〕 記載の単離された D NA、
〔3〕 前記 〔1〕 記載の D NAと外来遺伝子とが、 該外来遺伝子が発現可能な 状態で配置されてなる組換え D NA、
〔4〕 外来遺伝子が、 タンパク質をコードする核酸、 アンチセンス R NAをコ ードする核酸及びリポザィムをコードする核酸からなる群より選択された核酸で ある、 前記 〔3〕 記載の組換え D NA、
〔5〕 前記 〔1〕 記載の DNAを含有してなる遺伝子発現用ベクター、 〔6〕 ベクターが、 プラスミドベクター、 ファージベクター及びウィルスべク ターからなる群より選択された 1種である、 前記 〔5〕 記載の遺伝子発現用べク ター、
〔7〕 前記 〔3〕 記載の組換え D NAを含有してなる発現ベクター、
〔8〕 ベクターが、 プラスミドベクター、 ファージべクタ一及びウィルスべク ターからなる群より選択された 1種である、 前記 〔7〕 記載の発現ベクター、
〔9〕 前記 〔3〕 記載の組換え D NA、 又は前記 〔7〕 記載の発現ベクターを 保持してなる形質転換細胞、
〔1 0 ] 前記 〔9〕 記載の形質転換細胞を培養する工程、 及び得られた培養物 からタンパク質を採取する工程を包含することを特徴とする、 タンパク質の製造 方法、 並びに
〔1 1〕 前記 〔1〕 記載の D NA、 又は前記 〔5〕 記載の遺伝子発現用べクタ 一を含有してなる、 タンパク質製造用キット、
に関する。 発明の詳細な説明
本発明の D N Aとしては、 枯草菌のバチルス サブチリス （Bacillus subtilis) D B 1 0 4株 〔ジーン （Gene) 、 第 8 3卷、 第 2 1 5〜 2 3 3頁
( 1 9 8 9 ) 〕 由来の定常期特異的に発現する遺伝子のオープンリーディングフ レーム （O R F ) の上流に局在し、 かつプロモーター活性を呈するエレメントを 含む D NAを使用することができる。 本発明は、 前記 D N Aの下流に外来遺伝子
(目的遺伝子ともいう） を配置した場合、 発現誘導物質の非存在下で、 目的遺伝 子産物を培地 1リットル当たり 1 0 0〜5 0 0 m gの高レベルで宪現することが できるという、 本発明者らの驚くべき知見に基づく。
本発明の D NAとしては、 配列表の配列番号 1〜 6のいずれかに示された塩基 配列を有する D NAが挙げられる。 より好ましくは、 グラム陽性菌において定常 期特異的にプロモーター活性を呈する単離された D NA、 さらに好ましくは、 後 述のように、 バチルス属細菌又は大腸菌において定常期特異的にプロモーター活 性を呈する単離された D NAである。
本明細書において、 「プロモーター」 とは、 転写開始点 （+ 1 ) から約 1 0〜 3 0塩基対上流にあって、 正確な位置から R NAポリメラーゼに転写を開始させ る機能を担っているプリブナゥボックス （P r i b n o w b o x ) 、 TA TA ボックス又は T A T Aボックス類似の領域が含まれるが、 必ずしもこれらの領域 の前後に限定されるものではなく、 この領域以外に、 発現調節のために R NAポ リメラーゼ以外のタンパク質が会合するために必要な領域を含んでいてもよい。 また、 本明細書中で 「プロモーター領域」 と記載する場合がある力 かかる用語 は、 本明細書におけるプロモーターを含む領域のことをいう。
本明細書において、 「プロモーター活性」 とは、 プロモーターの下流に発現可 能な状態で遺伝子を配置し、 得られた構築物を宿主に導入した際、 宿主内または 宿主外において該遺伝子の発現産物を生産する能力および機能を有することを示 す。
—般的に、 前記 「プロモーター活性」 は、 下記：
① 定量または確認が容易なタンパク質をコードした遺伝子 （以下、 レポーター 遺伝子ともいう） の上流に測定対象の D N Aを連結するステップ、
② 得られた構築物を宿主に導入するステップ、
③ 得られた形質転換細胞を培養して、 該タンパク質を発現させるステップ、 及 ぴ
④ 該タンパク質の発現量を測定するステップ
のプロセスにより、 測定することができる。 また、 「プロモーター活 ¾Ξ」 の有無 は、 例えば、 プロモーター配列を有すると思われる配列をレポーター遺伝子の上 流に連結し、 宿主に導入した際、 宿主内または宿主外において該遺伝子の遺伝子 産物の発現を確認することにより実施でき、 ここで、 発現が認められた場合、 そ のプロモーターは導入した宿主においてプロモーター活性を有することの指標と なる。
本明細書において、 「定常期特異的プロモーター」 とは、 対数増殖期を経た後、 定常期においてのみ転写を行なうプロモーターをいう。 すなわち、 「定常期特異 的プロモーター」 は、 I PTGなどに代表される誘導物質を用いて誘導すること なく、 該プロモーターの下流に配置された遺伝子を定常期でのみ発現させうる。 本発明の DNAには、 定常期特異的にプロモーター活性が認められるものであ れば、 前記配列番号 1〜 6のいずれかに示された塩基配列を有する単離された D N Aの断片も含まれる。 ここで、 「断片」 は、 定常期特異的にプロモーター活性 が認められる範囲内で適宜選択することができる。 かかる断片は、 前記ステップ ①〜④のプロセスにより選択することができる。
本発明の DN Aには、 さらに、 配列番号 1〜 6のいずれかに示された塩基配列 において、 少なくとも 1塩基、 具体的には、 1又は複数個の塩基の置換、 欠失、 挿入、 又は付加を有する塩基配列を有し、 かつ定常期特異的にプロモーター活性 を有する DN Aも含まれる。 一般的に、 短い配列を有する DN Aにおいて、 少な くとも 1塩基に変異 （置換、 欠失、 揷入、 又は付加） を有する DNAは、 その活 性が変化することもあるが、 前記ステップ①〜④のプロセスにより定常期特異的 にプロモーター活性が認められた 「変異を有する DNAj は、 本発明に包含され る。 かかる変異は、 天然由来の変異及び人為的に導入された変異のいずれであつ てもよい。
人為的な変異の導入方法としては、 慣用の部位特異的変異導入法などにより行 なうことができる。 部位特異的変異を導入する方法としては、 例えば、 アンバー 変異を利用する方法 〔ギャップド デュプレックス （g a p p e d du l e x) 法、 ヌクレイック ァシッズ リサーチ (Nucleic Acids Research) 、 第 1
2巻、 第 9441~9456頁 （1984) 〕 、 d u t (dUTP a s e) とひ n g (ゥラシルー DNAグリコシラーゼ） 遺伝子を欠損した宿主を利用する方法
〔クンケル （Kunk e 1 ) 法、 プロシーディングス ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォプ ザ USA (Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA) 、 第 82卷、 第 488〜 492頁 (1985) 〕 、 アンバー変異を利用した PC Rによる方法 （国際公開第 98/ 02535号^?ンフレツト） 等を用いることができる。
また、 本発明の D N Aの相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズ 可能な DNA、 又は本発明の DNAを基に、 例えば、 常法により設計し化学的に 合成したオリゴヌクレオチドプローブ若しくはプライマーを用いて得られた DN Aであって、 かつ定常期特異的にプロモーター活性を有する DNA、 好ましくは、 グラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活性を呈する単離された DN Aも本発明に包含される。
かかる DNAは、 例えば、 前記ステップ①〜④のプロセスにより定常期特異的 にプロモーター活性が認められたものを選択すればよい。 該オリゴヌクレオチド プローブの塩基配列には特に限定はないが、 前記 DNA又は該 DNAに相補的な 塩基配列を有する DN Aにストリンジェントな条件下にハイプリダイズするもの であればよい。
ここで 「ストリンジェントな条件」 とは、 例えば、 モレキュラー クローニン グ 了 ラボラトリー マニュアル 第 2版 〔サンブルーク (Sambrook) ら、 Molecular cloning, A laboratory manual 2nd editions 1989年、 コーノレト スプリング ハーバー ラボラトリー プレス （Cold Spring Harbor
Laboratory Press) 社発行〕 等の文献に記載の条件が挙げられ、 6XS SC
(1 XS SCは、 0. 15M Na C l、 0. 015M クェン酸ナトリウム、 pH7. 0) と 0. 5%SD Sと 5 Xデンノヽ /レト 〔De nhL a r d t's、 0. 1 %ゥシ血清アルブミン （B S A) 、 0. 1 %ポリビュルピロリ ドン、 0. 1 % フイコール 400〕 と 100 μ g/m 1サケ精子 DNAとを含む溶液中、 用いる プローブの Tm— 25 °Cの温度でー晚保温する条件等が挙げられる。
また、 プライマーの塩基配列にも特に限定はなく、 通常の PCRの反応条件に おいて、 前記 DNA又は該 DNAに相補的な塩基配列を有する DNAにァニーリ ングし、 DNAポリメラーゼによる伸長反応を開合できるものであればよい。 オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの Tmは、 例えば、 下記式： Tm=81.5-16.6 (loglfl [Na+] ) +0.41 (%G+C) 一 (600/N) (式中、 Nはオリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長であり、 ％G + Cはオリゴヌクレオチドプロープ又はプライマー中のグァニン及びシトシン残基 の含有量である）
により求められる。
また、 オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの鎖長が 18塩基より短い 場合、 Tmは、 例えば A+T (アデユン +チミン） 残基の含有量と 2 °Cとの積と、 G+C残基の含有量と 4°Cとの積との和 〔 （A + T) X 24- (G+C) X4〕 により推定することができる。
前記オリゴヌクレオチドプロープ又はプライマーの鎖長は、 特に限定されない 力 非特異的なハイブリダィゼーション及び非特異的なァユーリングを防止する 観点から、 好ましくは 6塩基以上、 更に好ましくは 10塩基以上であることが望 ましい。 また、 オリゴヌクレオチドの合成の観点から、 好ましくは 100塩基以 下であり、 更に好ましくは 30塩基以下であることが望ましい。
オリゴヌクレオチドの設計は当業者に公知であり、 例えば、 ラボマニュアル P C R、 第 13〜 16頁、 1996年宝酒造社発行を参考に設計することができる。 また市販のソフト、 例えば、 OL I GOTM P r ime r An a l y s i s s o f twa r e (宝酒造社製） を使用することができる。
また、 前記オリゴヌクレオチドの合成は、 公知の方法を用いて合成することが 可能である。 例えば、 DNAシンセサイザー 394型 〔アプライド バイオシス テム （Applied Biosystem) 社製〕 を用いて、 ホスホアミダイト法による合成が できる。 他にもリン酸トリエステノレ法、 H—ホスホネート法、 チォホスホネート 法等を用いて合成することができる。
本発明の DNAにより、 さらに、 前記 DN Aと外来遺伝子とが、 該外来遺伝子 が発現可能な状態で配置されてなる組換え D N Aが提供される。 力かる組換え D NAも本発明に含まれる。
外来遺伝子としては、 特に限定されないが、 例えば、 タンパク質 （例えば、 酵 素、 サイト力イン類又は抗体等） をコードする核酸、 アンチセンス RNAをコー ドする核酸及びリボザィムをコードする核酸などが挙げられる。 力、かる外来遺伝 子の起源は、 特に限定されないが、 例えば、 細菌類、 酵母類、 放線菌類、 糸状菌 類、 子嚢菌類、 担子菌類等の微生物；植物；昆虫；動物等が挙げられ、 更に目的 に応じ、 人工的に合成した遺伝子も挙げられる。
より具体的には、 例えば、 インターロイキン (interleukin、 IL) 1 〜 1 2遺 伝子、 インターフェロン （interferon IFN) a 若しくは" y遺伝子、 fl重瘍壌 死因子 (tumor necrosis factors T F) 遺伝子、 コロニー刺激因子 (colony- stimulating factors CSF) 遺伝子、 エリスロポエチン （erythropoietin) 遺伝 子、 形質転換増殖因子 （transforming growth factor, TGF) 一 β遺伝子、 免疫 グロブリン （immunoglobulin Ig) 遺伝子、 組織プラスミノーゲン活性化因子 (tissue plasminogen activator^ t - PA) fe子、 ゥロキナーセ (urokinase; 遺伝子、 西洋ホタルルシフェラーゼ （Western firefly luciferase) 遺伝子等が 挙げられるが、 これらに限定されるものではない。
本明細書でいう 「リポザィム」 とは、 特定のタンパク質の m R NAを切断する ものをいい、 これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものをいう。 リポザィム は特定のタンパク質をコードした遺伝子の配列より設計可能である。 例えば、 ハ ンマーヘッド型リポザィムは、 フエブス レター （FEBS Letter) , 第 2 2 8卷、 第 2 2 8 〜 2 3 0頁 （1 9 8 8 ) に記載の方法を用いて作製されうる。 また、 ハ ンマーへッド型リポザィムだけでなく、 ヘアピン型リポザィム、 デルタ型リポザ ィムなどのリポザィムの種類に関わらず、 特定のタンパク質の m R N Aを切断す るもので、 これら特定のタンパク質の翻訳を阻害するものであれば、 本明細書に おけるリボザィムに含まれる。
本発明の D N Aは、 遺伝子発現を人為的に誘導しなくても、 該遺伝子を高レべ ルで努現することができるプロモーター活性を呈するため、 特にタンパク質をコ ードする核酸である外来遺伝子の発現に好適である。
また、 本発明の D NAにより、 当該 D N Aを含有してなる遺伝子発現用べクタ 一が提供される。 力かる遺伝子発現用ベクターも本発明に含まれる。
本宪明の遺伝子発現用ベクターによれば、 本発明の D NAを含有しているため、 目的遺伝子産物を、 例えばタンパク質の場合、 培地 1リツトル当たり 1 0 0〜 5 0 0 m gのレベルで発現することができ、 かつ目的遺伝子産物をその使用目的な どに応じて容易に発現させることが可能になる。 本発明の遺伝子発現用ベクターにおいて、 ベクターとしては、 プラスミ ドべク ター、 ファージベクター、 ウィルスベクターおよぴ該ベクターの一部から成るベ クタ一断片が挙げられる。 前記ベクター、 ベクター断片は、 宿主として用いられ る細胞により適宜選択することができる。
宿主として用いられうる細胞としては、 特に限定はないが、 グラム陽†生菌が挙 げられる。 グラム陽性菌の例として、 形質転換系が確立されているバチルス属細 菌が挙げられる。 具体的には、 バチルス サプチリス （Bacillus subtilis) 、 ノ チノレス ステァ Pサーモフィラス (Bacillus stearothermophilus) 、 ノ チノレ ス リケニホルミス (Bacillus licheniformis) 、 バチルス ブレビス
(Bacillus brevis) 、 バチノレス スピーシーズ （Bacillus sp. ) などが挙げら れるが、 これらに限定されるものではなく、 これらバチルス属細菌に変異処理な どを行い、 得られたものも宿主として用いることができる。 また宿主として大腸 菌も使用できる。 大腸菌は形質転換系が確立されており、 また様々な遺伝子型の 大腸菌が作製され、 そのいずれもが入手容易であることから形質転換用宿主とし て広く用いられている。 具体的には、 大腸菌 K- 12 (Escherichia coli K-
12) 系統の ΗΒ 101株、 C600株、 JM109株、 DH5 a株、 DH10B 株、 XL— 1 B 1 u eMRF' 株、 TO P 10 F株などが挙げられるが、 これら に限定されるものではなく、 これら大腸菌に変異処理などを行い、 得られたもの も宿主として用いることができる。
前記ベクターとしては、 例えば、 宿主がバチ ^ス属細菌である場合、 プラスミ ドベクターとして、 PHY、 pUB 1 10, pE 194などが、 ファージベクタ 一として、 φ 105、 などが挙げられる。 また、 宿主が大腸菌である場合、 プラスミドベクターとして、 pUC 18、 pUC 19、 pB l ue s c r i p t pETなどが、 ファージべクタ一として、 A g t l O g t i lなどのラムダ ファージベクターなど挙げられる。 これらべクタ一を適宜選択し、 本発明の DN Aを含めることにより、 定常期特異的に外来遺伝子を発現させることが可能な、 本発明の遺伝子発現用べクターを構築することができる。
本発明の遺伝子発現用ベクターの構築には、 前記モレキュラー クロー-ング ァ ラボラトリー マニュアル 第 2版などに記載の手法を利用することができ る。 また、 例えば、 後述の実施例に記載の構築に従って作製することができる。 本発明の遺伝子発現用ベクターは、 r r n B T 1 T等のターミネータ一、選択 可能なマーカー遺伝子などを含んでもよい。
選択可能なマーカー遺伝子としては、 アンピシリン耐性遺伝子、 カナマイシン 耐'1~生遺伝子、 クロラムフエニコール耐性遺伝子、 テトラサイタリン耐性遺伝子な どが挙げられる。
また、 本発明の遺伝子発現用ベクターは、 目的遺伝子産物の使用目的に応じて、 例えば、 目的遺伝子の産物の単離操作の簡便化をはかるために、 ダルタチオン一 S -トランスフェラーゼ、 マルト ^"ス結合タンパク質などの異種タンパク質との 融合タンパク質として発現できるような配列、 あるいはヒスチジンタグなどが付 加されたタンパク質として発現できるようなタグ配列を含有してもよい。
さらに、 本発明により、 前記組換え D NAを含有した発現ベクターが提供され る。 力かる発現ベクターも本発明に含まれる。 また、 本発明の発現ベクターには、 前記遺伝子発現用べクターに目的遺伝子を組み込むことにより得られた構築物を も含まれる。
また、 本発明の発現ベクターには、 前記遺伝子発現用ベクターで挙げられたべ クタ一と同様のベクターを使用できる。
本発明の発現ベクターは、 （a ) 前記組換え D N Aを適当なベクターに組み込 むこと、 （b ) 前記遺伝子発現用ベクターに目的遺伝子を組み込むこと、 あるい は （c ) 前記遺伝子発現用ベクター断片に目的遺伝子を連結すること、 により作 製することができる。
また、 本発明の組換え D NA及び発現ベクターにより、 さらに、 前記組換え D
NAを保持してなる形質転換細胞、 あるいは前記発現ベクターを保持してなる形 質転換細胞も提供することができる。
宿主としては、 前出 「宿主として用いられうる細胞」 と同様な細胞が挙げられ る。
組換え D N Aの宿主への導入は、 例えば、 遺伝子工学実験、 第 1 2頁〜第 2 3 頁、 （社） 日本アイソトープ齒会編、 平成 3年発行；ビロロジー （Virology) 、 第 5 2卷、 第 4 5 6頁 （1 9 7 3 ) ；モレキュラー アンド セルラー バイオ ロジー （Molecular and Cellular Biology) 、 第 7卷、 第 2745頁 （1 98 7) ；ジャーナノレ ォブ ザ ナショナノレ キャンサー インスティテュート (Journal of the National Cancer Institute) 、 第 41卷、 第 35 1頁 （1 9 68) ；ェンポ ジャーナル （EMBO Journal) 、 第 1卷、 第 841頁 （1 98 2) 等に記載の方法により行なうことができる。
発現ベクターの宿主への導入は、 例えば、 s p o n t e n e o u s c omp e t e n c e法 〔遺伝子工学実験、 第 1 2〜23頁、 （社〉 日本アイソトープ協 会編、 平成 3年発行〕 、 リン酸カルシウム法 〔モレキュラー アンド セルラ^- バイオロジー、 第 7卷、 第 2745頁 （1 987) 〕 、 電気穿孔法 〔プロシーデ イングス ォブ ザ ナショナル アカデミー ォブ サイエンシーズ ォブ ザ USA、 第 8 1卷、 第 71 6 1頁 （1 984) 〕 、 DEAE—デキストラン 法 〔メソッズ イン ヌクレイック ァシッズ リサーチ （Methods in Nucleic Acids Research) 、 第 28 3頁、 カラムら編、 1 99 1年 C R Cプレスネ土発行〕 、 リボソーム法 〔バイオテクニータス （BioTechniques) 、 第 6卷、 第 68 2頁
1 989) 〕 等により行なうことができる。
さらに、 本発明の形質転換細胞によれば、 形質転換細胞を培養して、 得られた 培養物からタンパク質を採取することを特徴とする、 タンパク質の製造方法が提 供される。 かかる 「タンパク質の製造方法」 も本発明に含まれる。
より具体的には、
(I ) a) 本発明の DNAの下流にタンパク質をコードする核酸が発現可能に配 置された組換え DNA、 又は
b) 該組換え DN Aを含有したベクター
を用いて、 宿主細胞を形質転換する工程、
(II) (I) で得られた形質転換細胞を培養して、 得られた培養物から該タンパ ク質を採取する工程、
により、 タンパク質を製造することができる。
形質転換細胞の培養は、 宿主として用いられた細胞、 発現対象のタンパク質の 性質などにより適宜選択することができる。
得られたタンパク質は、 慣用のタンパク質の精製手段により精製することがで きる。 力かる精製手段としては、 例えば、 塩析、 イオン交換クロマトグラフィー、 疎水クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグラフィー、 ゲル濾過クロマ トグラフィ一等が挙げられる。
また、 本発明のタンパク質の製造方法には、 本発明の DNA又は本発明の遺伝 子発現用ベクターを含有した、 タンパク質の製造用キットを構築し、 使用するこ とができる。 かかるキットにより、 より簡便にタンパク質の製造を行なうことが できる。
実施例
以下、 本発明を実施例により具体的に説明する力 本宪明の範囲はこれら実施 例に限定されるものではない。
ここで、 本発明において用いられる B a c i l l u s s ub t i l i s各株 の関係および特徴について以下に示す。
B. s ub t i l i s Ma r bu r g 168株：組換え DNA実験におけ る、 枯草菌宿主として汎用されている菌株の親株。
B. s ub t i l i s DB 104株： B. s ub t i l i s Ma r b u r g 168株の誘導体の 1つであり、 ヒスチジン要求株である。 栄養要求性以外 の変異 （np r R2、 np r E18、 a p r ED 3) は UOT 1285株と同一 である。 '
B. s ub t i l i s UOT 1285株： B. s ub t i l i s Ma r b u r g 168株の誘導体の 1つであり、 トリプトファンおよびリジン要求株で ある。 栄養要求性以外の変異 （n p r R 2、 n p r E 18, a p r ED 3) は D B I O 4株と同一である。
実施例 1 枯草菌 DNAチップを用いた定常期特異的発現遺伝子の探索 枯草菌ゲノムデータベース
(http://genolist. pasteur. fr/SubtiList/genome. cgi) の DNA配列情報を用 レ、、 枯草菌の全 OR Fについて各々のほぼ全長を増幅できるような PCRプライ マーを設計した。 これらのプライマーを用いて B a c i l l u s s u b t i l i s Ma r b u r g 168株 〔モレキュラー アンド ジエネラノレ ジエネ テイクス （Molecular & General Genetics) 、 第 152卷、 第 65〜 69頁 （1 9 7 7) ] のゲノム DNAに対して 9 6ゥエルプレート中で T a Ka R a E x 丁& (1又は丁& 1^& 1 & Z-T a q (共に宝酒造社製） を用いて、 P CRを行 つた。
得られた P C R産物を精製し、 ァガロースゲル電気泳動で純度及びサイズを確 認した後、 吸光度測定により DNA濃度を算出した。
得られた DNA断片溶液をイソプロパノール沈澱によって濃縮し、 1. Ο μ g /m 1の DNA断片を、 国際公開第 0 0ノ2 6404号パンフレットに記載の方 法に準じてスライドグラス上に固定化し、 DNAチップを作製した。
B a c i l l u s s u b t i l i s U〇T 1 28 5株 〔ジャーナル ォブ ジェネラル マイクロバイオロジー (Journal of General Microbiology) 、 第
1 3 5卷、 第 1 3 3 5〜 1 34 5頁 （1 98 9) 〕 を 50m lの 2 X SG 〔1. 6% Nu t r i e n t B r o t h、 0. 0 5% Mg S04 · 7Η2 0、 0. 2% C 1、 ImM C a (N03 ) 2 ■ 4H2 0、 0. 1 mM MnC 1 2 · 4H2 0、 0. 00 ImM F e S04 · 7Η2 0、 0. 1 % ダルコ一 ス〕 中、 3 7 °Cで培養し、 培養開始 3、 4、 5時間後にそれぞれ培養液の一部を 取り、 遠心分離により集菌した。 得られた菌体を TR I ZOL試薬 〔ギブコ ビ 一アールエル （GIBC0 BRL) 社製〕 に懸濁し、 ガラスビーズを力 Uえて MI N I _ BEAD BEATER 〔バイオスペック プロダクツ （BI0SPEC PRODUCTS) 社 製〕 で菌体を破碎後、 TR I ZOL試薬のプロトコールに従って、 クロ口ホルム 抽出、 イソプロパノール沈澱により RNAを回収した。 回収した RNAは RNa s e— f r e e DN a s e I (宝酒造社製） で処理した後、 フエノーノレ/ク ロロホルム抽出、 次いでエタノール沈澱で回収した結果、 約 9 0〜1 0 0 μ §得 られた。 これをテンプレート用 RNAとした。
上記で調製したテンプレート用 RN A 1 5 gを用い、 C y 3— dUTP 〔アマシャム ファノレマシァ ノィォテク （Atnersham Pharmacia Biotech) 社 製〕 を用いて逆転写酵素反応を行い、 Cy 3で標識された c DNAプローブを調 製した。
次に、 上記で作製した D N Aチップをプレハイブリダイゼーション液 （ 4 X S S C、 0. 20/oSD S、 5 Xデンノ、ノレト溶液、 lmgZml d e n a t u r e d s a lmo n s e rm DNA) 中、 室温で 2時間のプレハイプリ ダイゼーシヨン後、 2 33〇次ぃで0. 2XSSCで洗浄し、 乾燥させた。 続いて、 d e n a t u r e d s a lmo n s e rm DNA濃度を 0. 1 mg/ralとしたほかは、 プレハイプリダイゼーシヨン液と同じ組成のハイブリダイ ゼーシヨン液中で、 上記で調製した Cy 3標識 cDNAプローブを用いて、 6
5 °C、 ー晚、 ハイプリダイゼーシヨンを行った。 ハイプリダイゼーシヨン後、 0. 2%SD S含有 2 X S S C中、 55 °Cで 30分 2回、 65°0で5分、 更に0. 05 X S S C中、 室温で 5分間洗浄し、 乾燥した。
このハイプリダイゼーションした DN Aチップについて DN Aチップ解析装置 Af f yme t r i x 418 Ar r a y S c a nn e r 〔ァフィメトリツ クス （Affymetrix) 社製〕 で蛍光検出した。 この蛍光検出では、 画像上、 シグナ ル強度は青 <緑 <黄<橙 <赤<白の連続した色段階で表現される。
得られた画像データについて、 発現データ解析ソフトウェア I ma G e n e 〔バイオディスカバリー （BioDiscovery) 社製〕 を用いて、 該ソフトウェアに添 付の説明書に従い、 シグナル強度の測定及び解析を行った。 尚、 数値化された C y 3のシグナル強度を、 r RN Aのシグナルを内部標準として調整した値で比較 し、 枯草菌の生育ステージ毎の遺伝子の発現シグナルを計測した。 その結果、 培 養 3時間後での発現シグナルが強い遺伝子や、 培養 5時間後に発現シグナルが強 V、遺伝子が認められ、 O R Fによつて発現パターンが明らかに異なっていること が分かった。
これらの発現シグナルの違いを更に詳細に検討するため、 培養 3時間後の発現 シグナルを分母として 4時間後、 5時間後の相対的な発現量比を算出し、 発現量 の生育ステージ特異性を観た。 主な遺伝子の結果を表 1に示す。 1¾/ ΰ y寸间1 遺伝子
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yrzE 2.46 38,4 表 1から明らかなように、 定常期である培養 5時間後での発現量が著しく増大 している遺伝子が認められた。 .
実施例 2 枯草菌マク口メンブレンを用いた定常期特異的発現遺伝子の探索 実施例 1で調製したテンプレート用 RNA 15 μ §を用い、 D I G— 11— dUTP 〔ロシュ ダイァグノスティックス （Roche Diagnostics) 社製〕 を用 いて逆転写酵素反応を行い、 ジゴキシゲニン （以下、 D I Gと略す） で標識され た c D N Aプローブを調製した。 次に、 この D I G標識 c DNAプローブを用いて、 B a c i l l u s s ub t i 1 i s DNA a r r a y 〔ユーロゲンティック （EUR0GENTEC) 社製、 以 下マクロメンブレンと記す、 B. s ub t i l i s Ma r b u r g 168株 由来推定 ORF s〕 に対してハイプリダイゼーシヨンを行った。 ハイブリダィゼ シヨンは、 D I G Ea s y Hy b Gr a nu l e s (ロシュ ダイァグ ノスティックス社製） の溶液中で、 42°C、 30分間、 プレハイブリダィゼーシ ヨン後、 更に 42°C、 一晚、 ハイプリダイゼーシヨンを行った。 次いで、 D I G Wa s h a n d B l o c k Bu i i e r及ぴ D e t e c t i on k i t (共にロシュ ダイァグノスティックス社製） を用いて検出した。
検出結果は、 感光フィルムに現像されるが、 これを画像解析装置 Mo d e 1
G S— 700 Ima g i ng De n s i t ome t e r しノ ィオラッド
(BioRad) 社製〕 で、 画像解析ソフト Ad o b e Pho t o s ho p 〔アド ビ （Adobe) 社製〕 による画像取り込みを行い、 画像解析ソフト Mu 1 t i A n a 1 y s t (バイオラッド社製） を用いて、 該ソフトウェアに添付の説明書に 従い、 シグナル強度を測定及び解析を行った。 尚、 数値化された D I Gのシグナ ル強度により、 枯草菌の生育ステージ毎の遺伝子の発現シグナルを計測した。 そ の結果、 培養 3時間後での発現シグナルが強い遺伝子や、 培養 5時間後に発現シ グナルが強い遺伝子が認められ、 OR Fによって発現パターンが明らかに異なつ ていることが分かった。
これらの発現シグナルの違いを更に詳細に検討するため、 培養 3時間後の発現 シグナ^/を分母として 4時間後、 5時間後の相対的な発現量比を算出し、 発現量 の生育ステージ特異性を観た。 主な遺伝子の結果を表 2に示す。
表 2
Figure imgf000018_0001
表 2から明らかなように、 定常期である 5時間後での発現量が著しく増大して いる遺伝子が認められた。
実施例 3 定常期特異的プロモーターのスクリーニング
定常期特異的プロモーターのスクリーエングには、 実施例 1及び実施例 2での 探索をそれぞれ 2回ずつ行い、 得られた結果から、 定常期である 5時間後での発 現量が著しく増大していた遺伝子を総合的に判断し、 23種の遺伝子 （a c οΑ a c oレ i o l J s i g F s i pW s p o I I B s p o I I I AH s p o I VAS y a b S y b c 0 y b c P y b c Qs y b c S y b c T yb dA、 yb dD、 y f iA、 y g aB、 y j d BN y n g J y o bH、 y qxA、 y r z E) を選出し、 以下の実験に使用した。
定常期特異的プロモーターのスクリーユングは、 定常期特異的発現遺伝子のプ 口モーター領域を含むと考えられる上記 23種類の遺伝子の DN A断片を外来遺 伝子に連結し、 遺伝子発現用ベクターをそれぞれ構築することにより行った。 遺伝子発現用ベクターの構築は、 市販のゲル精製及びプラスミド精製用の酵素、 ゲル精製用キット及びプラスミド精製用キットを用いた。 また、 特に明記しない かぎり、 モレキュラー クローニング ァ ラボラトリー マエユアル 第 2版 (サンブルークら、 1989年、 コールド スプリング ハーパー ラボラトリ 一 プレス社発行） に記載の方法で行った。
まず、 上記 23種類の遺伝子の定常期特異的発現遺伝子の S D配列よりさらに 上流域に存在するプロモーターを含むと考えられる約 180 b pの DNA断片を 増幅するために、 実施例 1に記載の枯草菌ゲノムデータベース
(http://genolist. pasteur. fr/SubtiList/genome. cgi) の 歹 (f¾r¾にして、 2 3種類の遺伝子のそれぞれの上流領域を増幅するためのプラィマーを設計した
(計 46種類のプライマー） 。 また、 増幅後の操作を簡便にするため、 設計した プライマーの両サイドにそれぞれ制限酵素 K p n Iサイトと Ec oR Iサイトを 導入した。
尚、 a c o A遺伝子のプロモーター領域と考えられる DN A断片を増幅するた めのプライマー配列は、 配列表の配列番号 7 (プライマ一 a A F 1 ) 及び配列番 号 8 (プライマー aARl) に、 s p o I I B遺伝子のプロモーター領域と考え られる DNA断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号 9 (プライマー s pBF 1) 及び配列番号 10 (プライマー s pBRl) に、 y b c O遺伝子のプ 口モータ一領域と考えられる DNA断片を増幅するためのプライマー配列は配列 番号 11 (プライマー y b OF 1) 及び配列番号 12 (プライマー ybORl) に、 y j dB遺伝子のプロモーター領域と考えられる DNA断片を増幅するため のプライマー配列は配列番号 13 (プライマー y j BF 1) 及ぴ配列番号 14
(プライマー： j BRl) に、 y n g J遺伝子のプロモーター領域と考えられる DNA断片を増幅するためのプライマー配列は配列番号 15 (プライマー y n J F 1) 及び配列番号 16 (プライマー yn JRl) に、 y r z E遺伝子のプロモ 一ター領域と考えられる D N A断片を増幅するためのブラィマー配列は配列番号 17 (プライマー y r EF l) 及び配列番号 18 (プライマー y r ER l) に示 す。
次に、 I SO PLANT k i t 〔二ツボンジーン （NIPPON GENE) 社製〕 を 用いて、 該キットに添付の説明書に従って、 バチルス サブチリス DB 104 株 〔ジーン （Gene) 、 第 83巻、 第 215〜 233頁 （1989) 〕 よりゲノム DN Aを調製した。
得られたゲノム DNAを鏡型として、 上記設計したプライマーを用い、 PCR 反応を、 94 °Cで 30秒、 50°〇で1分、 72 °Cで 1分を 1サイクルとして、 2
0サイクル行なった。
こうして増幅されたプロモーターを含むと考えられる 23種類の DNA断片を、 以下に用いた。
定常期特異的プロモーターをスクリーニングするための外来遺伝子として、 国 際公開第 98Z56926号パンフレットに記載のピロコッカス フリオサス
(Pyrococcus furiosus) 由来の超耐熱性プロテアーゼ P FU S遺伝子を用いた。 国際公開第 98/56926号パンフレツトに記載の超耐熱性プロテアーゼ P F US遺伝子を含有するプラスミド p S PO 124 ACを保有する菌株、 B a c i 1 1 u s s ub t i l i s D B 104/p S P O 124 Δ C (FERM BP— 6294) を、 10 μ g /m 1カナマイシン含有 L B培地 5ml中、 3
7 °Cでー晚培養した後、 集めた菌体より Q IAGEN P l a smi d Mi n i k i t 〔キアゲン （QIAGEN) 社製〕 を用いて、 該キットに添付の説明書に従 い、 プラスミド p SPOl 24 ACを調製した。 その際、 4mg/ml Ly s o z ymeを添加した k i tに添付されている bu f f e r P 1に懸濁した菌 体は、 37 °Cで 30分間処理を行った。
得られたプラスミド p S PO 124 ACを铸型として、 バチルス サプチリス 由来のズプチリシン Eをコードする a p r E遺伝子の SD配列、 分泌シグナル、 超耐熱性プロテアーゼ PF US構造遺伝子を含む 5448 b pの DNA断片を、 プライマー PLF 1 (配列番号 19) 及びプライマー PLR1 (配列番号 20) を用いた PCRにより増幅した。 これをベクター断片とし、 以下に用いた。
以下、 y n g J遺伝子のプロモーター領域を含む DNA断片を例として示す。 上記で増幅された y n g J遺伝子のプロモーター領域を含むと考えられる DN A断片を、 制限酵素 Kp n Iと E c o R I (共に宝酒造社製） とで消ィ匕し、 精製 した。 得られた DN A断片を、 制限酵素 n Iと E c o R Iとで消化したベタ ター断片と混合してライゲーシヨン行い、 この反応液を用い、 バチルス サプチ リス DB 104株を形質転換した。 これを、 1%スキムミルク及ぴ 10 μ gZ m 1カナマイシン含有の LBプレートにまき、 37°C、 16時間、 静置培養を行 つた。
得られたカナマイシン耐性の形質転換体について、 上記 180 b pの DNA断 片が揷入されているクローンを選択するため、 上記プロモーター領域を含む DN A断片を増幅できるプライマー UBF 1 (配列番号 21) 及びプライマー SBP R 1 (配列番号 22) を設計した。 この 2つのプライマーの組合わせで、 ImM PMS Fを含有する反応液中、 TaKaRa Ex T a q (宝酒造社製） を用 いた PC R反応を、 94°Cで 30秒、 55でで1分、 72°Cで 1分を 1サイクル として、 20サイクル行った。
こうして 180 b pの DNA断片が揷入されたクローンを選択した。 選択した 形質転換体よりプラスミドを調製し、 これを p ND 20と命名した。
また、 他の 22種類の DN A断片についても同様の操作を行い、 形質転換体が 得られたクローンの中からプロモーター配列が; ND 20とは異なる 18種類の クローンを得た。 この形質転換体よりプラスミ ドを調製した （合計 19種類） 。 実施例 4 定常期特異的発現べクターによる超耐熱性プロテア ゼの生産 (1) 超耐熱性プロテアーゼ PFUS遺伝子を含有するプラスミドで形質転換し たバチルス サブチリスの培養と粗酵素液の調製
実施例 3で作製した、 超耐熱性プロテアーゼ PFUS遺伝子を含有するプラス ミド p ND 20を導入したバチルス サブチリス DB 104株 （Bacillus subtilis DB104/p D20) を、 10 μ g/m 1カナマイシン含有 TKR B S 1培地 ( 20 m g /m 1 ポリペプトン、 2mg/ml 酵母エキス、 l OmgZml 肉エキス、 40mg/ml グルコース、 20 x g/ml F e S04 - 7H2 0、 20 M g /m 1 Mn S04 · 5Η2 Ο、 2 μ g /m 1 Z n S04 - 7H 2 O) 1ml中、 37 °Cで培養した。 培養開始後、 4、 7、 10、 13日後に それぞれ 100 μ 1の培養液を採取し、 95°Cで 30分間熱処理後、 遠心分離に より上清を集め、 粗酵素液とした。
また、 他の 18種類のプラスミドをそれぞれ 1種類ずつ導入したバチルス サ プチリス DB 104株についても、 同様に、 粗酵素液を調製した。
(2) 超耐熱性プロテアーゼ生産能の比較
超耐熱性プロテアーゼ P FUSの活性測定は S u c— A l a— Al a— P r o -Ph e-p-NA 〔シグマ （Sigma) 社製〕 を基質とし、 酵素による加水分解 反応によって生成する！)一二トロア二リンを分光学的に測定することによって行 なった。
すなわち、 酵素活性を測定しようとする酵素標品を 10 OmMリン酸緩衝液 (pH7. 0) で適度に希釈し、 その試料溶液 50 μ 1に 1 mM S u c— A 1 a— A 1 a -P r o-P h e— ; — NA溶液 〔10 OmMリン酸緩衝液 ( H 7. 0) にて調製〕 50 /z lを加え、 95 °Cで 30分間反応させた。 その後、 氷冷して反応を停止した後、 405 nmにおける吸光度を測定し、 p—二トロア 二リンの生成量を求めた。
酵素 1単位は、 95°Cにおいて 1分間に 1 /xmo 1の p—二トロア二リンを生 成する酵素量とした。
更に、 得られた酵素活性をもとに発現された酵素タンパク質量を、 超耐熱性プ 口テアーゼ P F U Sのタンパク質重量当たりの比活个生を 9 · 5単位 （ u n i t ) /mgとして算出した。
実施例 4一 (1) で調製した各粗酵素液を酵素標品とし、 超耐熱性プロテア一 ゼ活性を測定した。 その結果、 6種類のプラスミド （pND l、 pND6、 N D 10、 pND 19、 pND 20、 pND 23) で超耐熱性プロテアーゼ P FU
Sの発現が認められた。 この 6種類のプラスミドに糸且込まれたプロモーター領域 の塩基配列をそれぞれ配列表の配列番号 1〜 6に示す。 更に、 これら発現が認め られた 6種類のプラスミドについて、 B a c i l l u s s ub t i l i s D B 104/p SPO124 A Cでの発現量を 1とした場合の相対値を表 3に示す。 表 3
培養時間 （日）
Figure imgf000023_0001
表 3から明らかなように、 p S PO 124 ACと比較して、 06で約1. 2倍、 p N D 10で約 1. 5倍以上、 p N D 20では約 2倍以上に超耐熱性プロ テアーゼ P F U S発現量が増加した。 p ND 6では培養初期の 4日目では、 超耐 熱性プロテアーゼ P F U Sの発現がほとんど認められず、 培養後期の 10日目で は p SP0124ACよりも発現量は大となった。
超耐熱性プロテアーゼ PFUSの発現が認められたプラスミドについて、 超耐 熱性プロテアーゼ P F U Sの発現量が最大となつた培養 B数と生産量を、 プロモ 一ターの起源となる遺伝子名とともに表 4に示す。 表中の生産量は培養液 1リツ トル当たりの m g数で示す。
表 4
Figure imgf000024_0001
表 4から明らかなように、 ϊ> S PO 1 24 ACと比較して pND 6、 pND 1 0、 pND 20では、 より短期間の培養日数で、 より多くの超耐熱性プロテア一 ゼ P FUSが生産された。
実施例 5 定常期特異的発現ベクターによる、 アルカリプロテアーゼ、 ニトロ フエニルホスファターゼ、 ピロリ ドンカルボキシルぺプチダーゼおよぴメチォニ ^^ァミノぺプチダーゼの生産
(1) ベクターの調製
前述の実施例 3において構築されたプラスミドのうち、 p ND l、 p ND 6、 pND 1 0, pND 1 9および pND 2 3、 ならびにコントロールとして： S P O 1 24 Δ Cをそれぞれ铸型として、 リポーター遺伝子であるプロテアーゼ P F US遺伝子を除いた領域、 すなわち、 プロモーター領域、 SD配列、 分泌シグナ ル、 ベクターを含む領域を、 プライマー NDF 1 (配列番号 2 3) およびプライ マー NDR 1 (配列番号 24) を用いた PC Rにより増幅した。 得られた増幅断 片を、 制限酵素 S p e Iおよび M l u I (共に宝酒造社製） とで消ィヒし、 精製し た。 これをベクター断片とし、 以下に用いた。
(2) リポーター遺伝子の調製および発現ベクターの構築
( i ) アルカリプロテアーゼ遺伝子
独立行政法人 製品評価技術基盤機構 (National Institute of Technology and Evaluation) より、 超好熱菌 A e r o p y r um p e r n i x K 1株由 来アルカリプロテアーゼ遺伝子を保有するプラスミド A2GR7310を譲受し た。 これを铸型として、 アルカリプロテアーゼをコードする領域を、 プライマー AP 1 F 1 (配列番号 25) およぴプライマー A P 1 R 1 (配列番号 26) を用 いた PCRにより増幅した。 得られた増幅断片を、 制限酵素 Sp e Iおよび Ml u I (共に宝酒造社製） とで消ィ匕し、 精製した。 これをリポーター遺伝子断片と し、 以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いた A. p e r n i x由来アルカリプロテアーゼ遺 伝子の塩基配列を、 配列表の配列番号 33に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、 pND6、 pND 10および p S PO 124 Δ
C由来のベタタ一断片とそれぞれラィゲーシヨンし、 得られた組換えプラスミド (発現ベクター） をそれぞれ pND6Al、 ； ND 10A1および p S POA1 と命名した。
( i i ) ニトロフエニルホスファターゼ遺伝子
独立行政法人 製品評価技術基盤機構より、 超好熱菌 A e r o p y r um p e r n i x K 1株由来ニトロフエニルホスファターゼ遺伝子を保有するプラス ミド A2GR0030を譲受した。 これを詩型として、 ニトロフエニルホスファ ターゼをコ一ドする領域を、 プライマー A P 7 F 1 (配列番号 27) およぴプラ イマ一 AP 7R 1 (配列番号 28) を用いた PCRにより増幅した。 得られた増 幅断片を、 制限酵素 Sp e Iおよび Ml u I (共に宝酒造社製） とで消化し、 精 製した。 これをリポーター遺伝子断片とし、 以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いた A. p e r n i x由来-トロフエ二ノレホスファ ターゼ遺伝子の塩基配列を、 配列表の配列番号 34に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、 pND 10、 pND 23および p S PO 124 AC由来のベクター断片とそれぞれライゲーシヨンし、 得られた組換えプラスミ ド （発現ベクター） をそれぞれ pND 10A7、 ： ND23A7およぴ p SPO A 7と命名した。
( i i i) ピロリ ドンカルポキシルぺプチダーゼ遺伝子
独立行政法人 製品評価技術基盤機構より、 超好熱菌 P y r o c o c c u s h o r i k o s h i i OT 3株由来ピロリ ドンカルポキシルぺプチダーゼ遺伝 子を保有するプラスミド 2708を譲受した。 これを铸型として、 ピロリドン力 ルポキシルぺプチダーゼをコードする領域を、 プライマー P H 1 F 1 (配列番号 29) およぴプライマー PH1R1 (配列番号 30) を用いた PC Rにより增幅 した。 得られた増幅断片を、 制限酵素 S p e Iおよび M 1 u I (共に宝酒造社 製） とで消化し、 精製した。 これをリポーター遺伝子断片とし、 以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いた P. h o r i k o s h i i由来ピロリ ドンカル ポキシルぺプチダーゼ遺伝子の塩基配列を、 配列表の配列番号 35に示す。 前記リポーター遺伝子断片を、 pND 10、 pND 19および p S PO 124 AC由来のベクター断片とそれぞれライゲーシヨンし、 得られた組換えプラスミ ド （発現ベクター） をそれぞれ pND 10 P 1、 pND 19 P 1および p SPO P 1と命名した。
( i V ) メチォニルァミノぺプチダーゼ遺伝子
独立行政法人 製品評価技術基盤機構より、 超好熱菌 P y r o c o c c u s h o r i k o s h i i O T 3株由来メチォ-ルアミノぺプチダーゼ遺伝子の P
CR増幅断片 PH0628 PCRを譲受した。 これを鍀型として、 メチォニルァ ミノぺプチダーゼをコードする領域を、 プライマー PH2F 1 (配列番号 31) およびプライマー PH2R 1 ズ配列番号 32) を用いた PCRにより増幅した。 得られた増幅断片を、 制限酵素 Sp e Iおよび Ml u I (共に宝酒造社製） とで 消ィ匕し、 精製した。 これをリポーター遺伝子断片とし、 以下に用いた。
リポーター遺伝子として用いた P. h o r i k o s h i i由来メチォニノレアミ ノぺプチダーゼ遺伝子の塩基配列を、 配列表の配列番号 36に示す。
前記リポーター遺伝子断片を、 pND l、 pND 19および p SPO 124厶 C由来のベクター断片とそれぞれライゲーシヨンし、 得られた糸且換えプラスミド (発現ベクター） をそれぞれ pND 1 P 2、 pND 19 P 2および p S POP 2 と命名した。
( 3 ) 形質転換体の作製およびリポータ一遺伝子の発現
上記実施例 5— (2) において作製した、 それぞれの発現ベクターを用い、 バ チルス サプチリス DB 104株をそれぞれ形質転換した。 これを、 1%スキ ムミルクおょぴ 10 μ g/m 1カナマイシン含有 LBプレートにまき、 37°C、 16時間、 静置培養を行った。
得られたカナマイシン耐性形質転換体より、 上記酵素をコードする遺伝子が揷 入されているクローンを選択し、 1mlの 10 μ gZm 1カナマイシン含有 TK RBS 1培地中、 37 °Cで培養した。 培養 10日後 (アル力リプロテアーゼのみ
7日後） の培養液を 95°C、 30分間熱処理後、 遠心分離により上清を回収し、 粗酵素液 （酵素標品） とした。
(4) 活性測定
( i ) アルカリプロテアーゼ
ァ カリプロテア一ゼの活 '性測定は、 ゼラチン 〔ナカライテスタ （nacalai tesque) 社製〕 を基質として、 以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しようとする酵素標品を 5 OmM リン酸ナトリゥム緩衝液 (pH7. 0) にて適度に希釈し、 これと SDS— PAGEローデイングバッフ ァ一とを混合し、 室温で 30分以上放置した。 これを、 0. 05%ゼラチンを含 む S D S含有 10 %ポリアタリルァミドゲルに負荷し、 電気泳動を行つた。 泳動 後、 5 OmM リン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 0) にてゲルを洗浄した。 洗 浄したゲノレを、 5 OmM リン酸ナトリウム緩衝液 （pH 7. 0) 中、 95°Cで 3時間保温した。 その後、 氷冷して反応を停止した後、 クマシ一ブルー染色し、 画像解析ソフト Ad o b e Pho t o s h o p (ァドビ社製） にてゲル像を 画像フアイル化し、 N I Hイメージソフトにて活性シグナルを数値化した。
( i i ) ニ トロフエ二ノレホスファターゼ
エトロフエニルホスファターゼの活性測定は、 p—ニトロフエ二ルリン酸 （シ グマ社製） を基質として、 以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しょうとする酵素標品を、 1 mM ZnC 12を含む 100m M Tr i s— HC 1緩衝液 (pH7. 5) にて適度に希釈し、 その試料溶液
50 1に2111]^ p—ニトロフエ-ルリン酸溶液 〔lmM ZnC 12を含む 10 OmM T r i s— HC 1緩衝液 （pH7. 5) にて調製〕 50 /z 1をカロ え、 95°Cで 10分間反応させた。 その後、 氷冷して反応を停止し、 P i e r Ph o s p h a t e As s a y K i t 〔モレキュラー プローブ (Molecular Probe)社製〕 を用いて、 544 nmの励起光による 590 nmにおける蛍光発光 を測定し、 遊離リン酸の生成量を求めた。
( i i i ) ピロリドンカルボキシルぺプチダーゼ
ピロリドンカルボキシルぺプチダーゼの活性測定は、 ピログルタミン酸一 4一 メチルークマリルー 7—アミド （以下、 Py r—MC Aと略す） 〔ペプチド研究 所 （PEPTIDE INSTITUTE) 製〕 を基質として、 以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しようとする酵素標品を、 10 mM D T Tおよび 1 mM E DTAを含む 50mM リン酸緩衝液 (pH7. 0) にて適度に希釈し、 その試 料溶液 50// 1に0. 2mM P y r—MC A溶液 〔 10 mM DTTおよび ImM EDTAを含む50mM リン酸緩衝液 （pH 7. 0) にて調製〕 5 0 μ 1を加え、 95°Cで 30分間反応させた。 その後、 氷冷して反応を停止し、
355 nmの励起光による 460 n mにおける蛍光発光を測定し、 MCAの生成 量を求めた。
酵素 1単位は、 95°Cにおいて 1分間に 1 jumo 1の MCAを生成する酵素量 とした。
( i V ) メチォ -ルァミノぺプチダーゼ
メチォニルァミノぺプチダーゼの活性測定は、 Me t—A l a_S e r 〔バッ ヘム （BACHEM) 社製〕 を基質として、 以下のようにして行なった。
酵素活性を測定しょうとする酵素標品を、 0. 5 mM C o C 12を含む 10 0 mM リン酸カリゥム緩衝液 (pH7. 5) にて適度に希釈し、 その試料溶液
5 μ 1に ImM Me t— Al a— S e r 〔0. 5 mM CoC l 2を含む 10 OmM リン酸カリウム緩衝 （pH7. 5) にて調製〕 45 1をカ卩え、 7 5 °Cで 5分間反応させた。 その後、 氷冷し、 10 1の 10 OmM EDTAを 加えて反応を停止した後、 50^ 1の混合溶液 A 〔0. 18mg/m 1 Lーァ ミノ酸ォキシダーゼ、 50 μ g /m 1 ペルォキシダーゼおよび 0. 18 m g / m 1 o—ジァニシジンを含む 100 mM リン酸カリゥム緩衝 (pH7. 5) 〕 を加え、 37°Cで 10分間反応させた。 その後、 氷冷して反応を停止し、
450 nmにおける吸光度を測定した。
(5) 産生能の比較 上記実施例 5— （4) で測定した各酵素標品の酵素活性より、 培養液中の総酵 素活性を算出した。
a p r E遺伝子のプロモーターを有する発現べクタ一 （p SPOAl、 p SP OA7、 p S POP 1および p S POP 2) による発現量ををそれぞれ 1とした、 各発現ベクターでの相対発現量を、 以下の表 5に示す。 表 5
1] f^. _ 、 _ ^ ^ Z.
ソ AIヽ Λ .1 ^Γ \ノク ノ て ク 个日 墓 Λ Λ. ρΘ丄 νη fl丄 ν
l lJDA丄 s enpro>丄丁丁丄 β β Ό. 丄 0 ァノレ力リプロァァーセ pNDlOAl ybcO 23.8
pSPOAl aprE 1.00
A. pernix P D10A7 ybcO 2.29 二トロフエ二ノレホスファターゼ PND23A7 yrzE 1.68
pSP0A7 aprE 1.00
P. horikoshii pNDlOPl ybcO 1.43 ピロリ ドンカルボキシルぺプチダーゼ PND19P1 yjdB 3.73
pSPOPl aprE 1.00
P. horikoshii PND1P2 acoA 1.81 メチォニルァミノぺプチダーゼ PND19P2 yjdB 1.98
PSP0P2 aprE 1.00 産業上の利用の可能性
本発明により、 遺伝子発現を誘導しなくても、 該遺伝子を高 定常期特 異的に発現することができるプロモーターが提供される。 配列表フリーテキスト
SEQ ID N0:l; Promoter region on pNDl.
SEQ ID NO: 2; Promoter region on pND6.
SEQ ID NO: 3； Promoter region on p DlO. SEQ ID N0: 4; Promoter region on p D19.
SEQ ID NO: 5； Promoter region on pND20.
SEQ ID NO: 6; Promoter region on pND23.
SEQ ID NO: 7; Primer aAFl for amplifying promoter sequence of acoA gene. SEQ ID NO: 8; Primer aARl for amplifying promoter sequence of acoA gene.
SEQ ID NO: 9; Primer spBFl for amplifying promoter sequence of spoIIB gene.
SEQ ID NO'. 10； Primer spBRl for amplifying promoter sequence of spoIIB gene.
SEQ ID NO: 11； Primer ybOFl for amplifying promoter sequence of ybcO gene.
SEQ ID NO: 12； Primer ybORl for amplifying promoter sequence of ybcO gene.
SEQ ID NO: 13； Primer yjBFl for amplifying promoter sequence of yjdB gene.
SEQ ID NO: 14； Primer yjBRl for amplifying promoter sequence of yjdB gene.
SEQ ID NO: 15 ; Primer ynJFl for amplifying promoter sequence of yngj gene.
SEQ ID NO: 16； Primer ynJRl for amplifying promoter sequence of yngj gene.
SEQ ID NO: 17； Primer yrEFl for amplifying promoter sequence of yrzE gene.
SEQ ID NO: 18 ; Primer yrERl for amplifying promoter sequence of yrzE gene.
SEQ ID NO: 19； Primer PLFl.
SEQ ID NO: 20； Primer PLRl.
SEQ ID NO: 21； Primer UBFl.
SEQ ID NO: 22； Primer SBPRl. SEQ ID NO: 23 ; Primer NDFL
SEQ ID NO : 24; Primer DRL
SEQ ID NO: 25 ; Primer AP1F1 for amplifying coding region of alkaline protease gene.
SEQ ID NO: 26; Primer AP1R1 for amplifying coding region of alkaline protease gene.
SEQ ID NO: 27； Primer AP7F1 for amplifying coding region of nitrophenyl phosphatase gene.
SEQ ID NO: 28； Primer AP7R1 for amplifying coding region of nitrophenyl phosphatase gene.
SEQ ID NO-" 29； Primer PH1F1 for amplifying coding region of pyrro li done-carboxy 1 peptidase gene.
SEQ ID NO: 30 ; Primer PH1R1 for amplifying coding region of pyrro 1 i done-carboxy 1 eptidase gene.
SEQ ID NO: 31 ; Primer PH2F1 for amplifying coding region of methionyl aminopeptidase gene.
SEQ ID NO: 32； Primer PH2R1 for amplifying coding region of methionyl aminopeptidase gene.

Claims

請 求 の 範 囲
I. 以下からなる群より選択される単離された DNA：
( a ) 配列表の配列番号 1〜 6のいずれかに示された塩基配列を有する D N A若 しくはその断片であって、 かつグラム陽性菌において定常期特異的にプロモ タ 一活性を呈する単離された DNA；及び
(b) (a) の DNA若しくはその断片にストリンジェントな条件下、 ハイプリ ダイズ可能であって、 かつグラム陽性菌において定常期特異的にプロモーター活 性を呈する単離された D N A。
2. 外来遺伝子の上流に配置された場合、 定常期特異的に該遺伝子を発現しう る、 請求項 1記載の単離された DNA。
3. 請求項 1記載の DNAと外来遺伝子と力 該外来遺伝子が発現可能な状態 で配置されてなる組換え D N A。
4. 外来遺伝子が、 タンパク質をコードする核酸、 アンチセンス RNAをコー ドする核酸及びリボザィムをコ一ドする核酸からなる群より選択された核酸であ る、 請求項 3記載の糸且換え DNA。
5. 請求項 1記載の D N Aを含有してなる遺伝子発現用べクタ一。
6. ベクターが、 プラスミドベクター、 ファージベクター及びウイ/レスベクタ 一からなる群より選択された 1種である、 請求項 5記載の遺伝子発現用べクタ一。
7. 請求項 3記載の組換え DNAを含有してなる発現ベクター。
8. ベクターが、 プラスミドベクター、 ファージベクター及びゥイノレスべクタ 一からなる群より選択された 1種である、 請求項 7記載の発現べクタ一。
9. 請求項 3記載の糸且換え D N A、 又は請求項 7記載の発現べクタ一を保持し てなる形質転換細胞。
10. 請求項 9記載の形質転換細胞を培養する工程、 及び得られた培養物から タンパク質を採取する工程を包含することを特徴とする、 タンパク質の製造方法。
I I. 請求項 1記載の DNA、 又は請求項 5記載の遺伝子発現用ベクターを含 有してなる、 タンパク質製造用キット。
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