KR20030082951A - 프로모터 - Google Patents

Abstract

서열목록의 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나에 의해 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA 또는 그의 단편이고 그람 양성 세균에서 정지기-특이적 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA.

Description

프로모터{Promoters}

발현 시스템은 목적에 따라 유전공학에 의해 유용한 유전자 산물을 제조하는데 사용된다. 발현 시스템에서, 미생물 세포(대장균, 바실러스 서브틸리스, 효모 등), 동물 세포, 곤충 세포 및 식물 세포와 같은 배양기술이 확립된 숙주와, 그 숙주에 적합한 프로모터가 사용된다. 이들 중, 숙주로서 대장균과 lac 프로모터 또는 그 유도체를 사용하는 발현 시스템이 조작의 편이성 때문에 가장 보편적으로 사용되는 시스템 중의 하나이다.

그러나, lac 프로모터나 그의 유도체를 사용하는 발현 시스템은 유전자 산물 발현을 위해 유전자 발현의 유도를 요구하므로 산업적으로 불리하다는 단점을 갖는다. 예를 들어, lac 프로모터, tac 프로모터 등으로부터의 유전자 발현 유도는 고가의 시약, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드(IPTG)의 사용을 요구한다. 따라서, 그러한 시스템은 산업적 규모의 수행에 불리하다는 단점을 갖는다.

자일로스 오페론으로부터 유래된 프로모터와 숙주로서 바실러스 속의 세균을사용하는 발현 시스템도 사용된다. 그러나, 이 시스템은 발현 유도를 위해 자일로스 첨가를 요구하므로 산업적 규모의 수행에 불리하다.

파아지 λ 프로모터의 열유도를 사용하는 발현 벡터가 일반적으로 사용되고 있다.

그러나, 열유도에 의한 재조합 유전자 산물의 과잉발현은 아래와 같은 점에서 불리할 수 있다:

(a) 온도의 상승을 신속하게 달성하는데 있어서의 곤란함:

(b) 높은 배양온도로 인한 불용성 봉입체 형성 가능성 증가;

(c) 열 쇼크 시 대장균에서 몇몇 프로테아제의 유도.

바실러스 서브틸리스는 정지기(stationary phase)-특이적 반응의 결과 아밀라제와 프로테아제와 같은 많은 이화 효소를 생산 분비하는 것으로 알려져 있다. 정지기-특이적 발현 기작을 이용하여 숙주의 완전한 증식 후 정지기 동안에만 유전자를 발현시킬 수 있다면, 숙주에 대한 부담을 줄이고, 외인성 유전자를 효율적으로 발현할 수 있을 것이다. 그러나, 그러한 기작을 이용하는 유전자 발현 기술은 확립되어 있지 않았다.

따라서, 유전자 발현을 인위적으로 유도하지 않고 효율적인 발현을 가능하게 하는 기술이 요구되어 왔다.

발명의 목적

본 발명의 주된 목적은 유전자의 발현을 인위적으로 유도하지 않고 정지기-특이적 방식으로 높은 수준의 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터, 재조합 DNA,유전자를 발현시키기 위한 벡터, 발현 벡터와 형질전환 세포, 및 낮은 비용으로 편리하게 수행할 수 있는 단백질 제조방법, 및 그 방법을 위한 키트를 제공하는 것이다.

발명의 요약

본 발명은 아래와 같이 개괄될 수 있다:

[1] (a) 정지기-특이적 방식으로 그람-양성 세균에서 프로모터 활성을 나타내는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 DNA 또는 그의 단편; 및

(b) 정지기-특이적 방식으로 그람-양성 세균에서 프로모터 활성을 나타내는, 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 단편에 혼성화할 수 있는 분리된 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택된 분리된 DNA;

[2] 유도제 부재 시 외인성 유전자를 DNA가 그 유전자의 상류에 위치할 때 정지기-특이적 방식으로 발현할 수 있는, [1]에 따른 분리된 DNA;

[3] 외인성 유전자가 발현될 수 있도록 [1]에 의해 정의된 DNA와 외인성 유전자가 위치된 재조합 DNA;

[4] 외인성 유전자가 단백질을 코딩하는 핵산, 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산 및 리보자임을 코딩하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산인 [3]에 따른 재조합 DNA;

[5] [1]에 의해 정의된 DNA를 함유하는 유전자를 발현하기 위한 벡터;

[6] 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 및 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터선택되는 [5]에 따른 유전자를 발현하기 위한 벡터;

[7] [3]에 의해 정의된 재조합 DNA를 함유하는 발현 벡터;

[8] 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 및 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택된 [7]에 따른 발현 벡터;

[9] [3]에 의해 정의된 재조합 DNA 또는 [7]에 의해 정의된 발현 벡터를 함유하는 형질전환 세포;

[10] [9]에 의해 정의된 형질전환 세포를 배양하고;

그 배양물로부터 단백질을 모으는 것:

을 포함하는 단백질 제조방법;

[11] [1]에 의해 정의된 DNA 또는 [5]에 의해 정의된 유전자를 발현하기 위한 벡터를 함유하는 단백질을 제조하기 위한 키트.

본 발명은 목적하는 유전자 산물을 낮은 비용과 높은 수준으로 편리하게 발현시킬 수 있는 신규한 프로모터 및 그 프로모터를 이용하여 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.

정지기-특이적 방식으로 발현되는 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)의 상류에 위치하고 프로모터 활성을 나타내는 요소를 함유하는 바실러스 서브틸리스 DB104(Gene, 83: 215-233(1989))로부터 유래된 DNA를 본 발명의 DNA로 사용할 수 있다. 본 발명은 외인성 유전자(목적 유전자라고도 함)가 이 DNA의 하류에 위치하는 경우, 발현 유도제 부재 하에, 목적하는 유전자 산물을 높은 수준, 즉 배지 리터 당 100 내지 500 ㎎으로 발현할 수 있다는 본 발명자들에 의한 놀라운 발견에 기초한다.

본 발명의 DNA는 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA를 포함한다. 본 발명의 DNA는 바람직하게는 그람-양성 세균에서 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA, 더욱 바람직하게는 하기하는 바와 같이 바실러스 속 세균 또는 대장균에서 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA이다.

본 발명에 따르면, "프로모터"는 프리나우(Pribnow) 박스, TATA 박스, 전사 개시 위치(+1)로부터 약 10 내지 30 염기쌍 상류에 위치하고 RNA 중합효소가 정확한 위치에서 전사를 개시할 수 있도록 하는 기능을 담당하는 TATA 박스와 유사한 부위를 포함한다. 이 프로모터는 반드시 그러한 부위나 주변 부위로 제한되는 것은 아니나, 그 부위에 더하여 발현을 제어하기 위하여 RNA 중합효소 이외의 다른 단백질의 결합에 필요한 부위를 포함할 수 있다. 여기서 사용된, 용어 "프로모터 부위"는 본 발명에 따른 프로모터를 함유하는 부위를 가리킨다.

여기서 사용된, "프로모터 활성"은 유전자를 프로모터 하류에 유전자가 발현될 수 있도록 위치시킴으로써 얻어진 제작물을 숙주로 도입할 때, 프로모터가 숙주 내 또는 외에서 유전자의 발현 산물의 생산 능력 및 기능을 가짐을 의미한다.

일반적으로, "프로모터 활성"은

(1) 측정하려는 DNA를 쉽게 정량 또는 관찰할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자(이하 리포터 유전자라고도 함)의 상류에 연결하는 단계;

(2) 생성된 제작물을 숙주로 도입하는 단계;

(3) 생성된 형질전환 세포를 배양하여 단백질을 발현하는 단계;

(4) 발현된 단백질의 양을 측정하는 단계:

를 포함하는 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, "프로모터 활성"의 존재는 프로모터 서열을 갖는 것으로 추정되는 서열을 리포터 유전자의 상류에 연결하고, 제작물을 숙주로 도입하고, 숙주 내외에서의 유전자 산물의 발현을 관찰함으로써 결정할 수 있다. 발현의 관찰은 도입된 숙주에서 프로모터의 프로모터 활성의 지표로 사용된다.

여기서 사용된, "정지기-특이적 프로모터"는 대수 증식기 후 정지기 동안에만 전사를 지시하는 프로모터를 가리킨다. "정지기-특이적 프로모터"는 IPTG와 같은 유도제를 사용하는 유도 없이도 정지기 동안에만 프로모터의 하류에 위치하는 유전자를 발현시킬 수 있다.

본 발명의 DNA는 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성을 나타내는 한, 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 DNA의 단편을 포함한다. "단편"은 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성을 나타내도록 적절하게 선택될 수 있다. 그러한 단편은 단계 (1) 내지 (4)를 포함하는 상기 방법을 사용하여 선택할 수 있다.

본 발명의 DNA는 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 구체적으로 하나 또는 몇개의 뉴클레오타이드가 서열번호 1 내지 6의 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나에서 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성을 갖는 DNA를 추가로 포함한다. 일반적으로, 더 짧은 서열을 갖는 DNA의 활성은 적어도 하나의 뉴클레오타이드의 돌연변이(치환, 결실, 삽입 또는 부가)를 갖는 경우 변화될 수 있다. 그러나, "돌연변이를 갖는 DNA" 는 그 DNA에서 단계 (1) 내지 (4)를 포함하는 상기 방법을 사용하여 정지기-특이적 방식의 프로모터 활성이 관찰된다면, 본 발명에 포함된다. 돌연변이는 자연적으로 발생하거나 인공적으로 도입된 돌연변이일 수 있다.

인공 돌연변이를 통상적인 부위-특이적 돌연변이 유발 방법 등에 따라 도입할 수 있다. 사용 가능한 부위-특이적 돌연변이 유발 방법의 예는 앰버(amber) 돌연변이를 사용하는 갭 이합체 방법(Nucleic Acids Research, 12: 9441-9456(1984)); dut(dUTPase) 및 ung(우라실-DNA 글리코실라제) 유전자가 결핍된 숙주를 사용하는 쿤켈 방법(Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 82: 488-492(1985)) 및 앰버 돌연변이를 사용하는 PCR 방법(WO 98/02535)을 포함한다.

본 발명은 또한 엄격한 조건 하에 본 발명의 DNA의 상보쇄에 혼성화할 수 있거나, 예를 들어 본 발명의 DNA에 기초하여 통상적 방법에 따라 설계되고 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드 프로브나 프라이머를 사용하여 얻어지고, 바람직하게는 그람-양성 세균에서 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성을 갖는, 분리된 DNA를 포함한다.

예를 들어, 단계 (1) 내지 (4)를 포함하는 상기 방법을 사용하여 정지기-특이적 방식으로 프로모터 활성이 관찰되는 DNA를 그러한 DNA로 선택할 수 있다. 올리고뉴클레오타이드 프로브가 엄격한 조건 하에서 그 DNA 또는 그 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA에 혼성화하는 한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 뉴클레오타이드 서열에 관해서는 특별한 제한이 없다.

"엄격한 조건"은 Sambrook 등, Molecular cloning, A laboratory manual 2^ndedition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press와 같은 문헌에 기재된 바와 같은 것에 의해 예시된다. 예를 들어, 엄격한 조건은 6×SSC(1×SSC: 0.15 M NaCl, 0.015 M 시트르산 나트륨, pH 7.0), 0.5% SDS, 5×덴하르츠(0.1% 소혈청알부민(BSA), 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 피콜 400) 및 100 ㎍/㎖의 연어 정자 DNA를 함유하는 용액 내에서 밤새 [사용하는 프로브의 Tm-25 ℃]의 온도에서의 인큐베이션이다.

또한 프라이머가 그 DNA나 그 DNA에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA에 어닐링하여 통상의 PCR에 사용되는 조건 하에서 DNA 중합효소로의 신장 반응을 개시할 수 있는 한, 프라이머의 뉴클레오타이드 서열에 관해서는 특별한 제한이 없다.

올리고뉴클레오타이드 프로브나 프라이머의 Tm은 예를 들어 하기 등식에 따라 결정될 수 있다:

Tm = 81.5 - 16.6(log₁₀[Na⁺]) + 0.41(%G+C) - (600/N)

상기 식에서 N은 올리고뉴클레오타이드 프로브나 프라이머의 쇄 길이이고; %G+C는 올리고뉴클레오타이드 프로브나 프라이머의 구아닌 및 시토신 잔기의 함량이다.

올리고뉴클레오타이드 프로브나 프라이머의 쇄 길이가 18 뉴클레오타이드 보다 짧은 경우, Tm은 예를 들어 A+T(아데닌과 티민) 잔기의 수를 2(℃)와 곱한 것과G+C 잔기의 수를 4(℃)와 곱한 것을 더한 것, 즉 [(A+T)×2+(G+C)×4]로 측정된다.

본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 올리고뉴클레오타이드 프로브나 프라이머의 쇄 길이는 비특이적 혼성화나 어닐링을 방지하기 위해 바람직하게는 6 뉴클레오타이드 이상, 더욱 바람직하게는 10 뉴클레오타이드 이상인 것이 바람직하다. 더욱이, 올리고뉴클레오타이드 합성 측면에서 그 길이는 바람직하게는 100 뉴클레오타이드 이하, 더욱 바람직하게는 30 뉴클레오타이드 이하인 것이 바람직하다.

올리고뉴클레오타이드의 설계는 당업자에게 알려져 있고 예를 들어 Labo Manual PCR, pp. 13-16, 1996(다카라 슈조)을 참고로 하여 수행될 수 있다. 다르게는, OLIGO™ 프라이머 분석 소프트웨어(다카라 슈조)와 같은 상업적으로 입수가능한 소프트웨어를 사용할 수 있다.

그 올리고뉴클레오타이드는 공지의 방법에 따라 합성할 수 있다. 예를 들어, 포스포르아미다이트 방법에 따라 DNA 합성기 모델 394(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 합성할 수 있다. 다르게는, 그 합성을 위해 포스페이트 트리에스테르 방법, H-포스포네이트 방법, 티오포스포네이트 방법 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 DNA를 사용하여, 그 DNA와 외인성 유전자가 발현될 수 있도록 위치된 재조합 DNA가 제공된다. 그러한 재조합 DNA는 본 발명에 포함된다.

외인성 유전자의 예는 단백질(예를 들어, 효소, 사이토카인 또는 항체)을 코딩하는 핵산, 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산 및 리보자임을 코딩하는 핵산을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 외인성 유전자 기원의 예는 미생물(예를들어, 세균, 효모, 방선균, 필라멘트성 진균, 담자균류 및 자낭균류); 식물; 곤충; 및 동물을 포함하지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 더욱이, 인공적으로 합성된 유전자를 목적에 따라 사용할 수 있다.

구체적으로, 외인성 유전자의 예는 인터류킨(IL) 1 내지 12 유전자, 인터페론(IFN) α, β 및 γ 유전자, 종양 괴사 인자(TNF) 유전자, 콜로니-자극 인자(CSF) 유전자, 에리트로포이에틴 유전자, 형질전환 성장 인자(TGF)-β 유전자, 면역글로불린(Ig) 유전자, 조직 플라스미노겐 활성자(t-PA) 유전자, 유로키나제 유전자 및 서양 반딧불 루시페라제 유전자를 포함하지만, 그들로 제한되는 것은 아니다.

여기서 사용된, "리보자임"은 특정 단백질의 mRNA를 절단하여 단백질의 번역을 저해하는 것을 가리킨다. 리보자임은 특정 단백질을 코딩하는 유전자의 서열에 기초하여 설계할 수 있다. 예를 들어, 해머헤드 리보자임을 FEBS Letter, 228: 228-230(1988)에 기재된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 리보자임은 리보자임의 유형에 무관하게(예를 들어, 해머헤드, 헤어핀 또는 델타) 특정 단백질의 mRNA를 절단하여 단백질의 번역을 저해하는 어떠한 것도 포함한다.

본 발명의 DNA는 유전자 발현을 인공적으로 유도하지 않더라도 높은 수준의 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터 활성을 나타낸다. 따라서, 단백질을 코딩하는 외인성 유전자의 발현을 위해 특히 바람직하다.

더욱이, 본 발명의 DNA를 사용하여, 그 DNA를 함유하는 유전자를 발현하기 위한 벡터가 제공된다. 그러한 유전자를 발현하기 위한 벡터는 본 발명에 포함된다.

그것은 본 발명의 DNA를 함유하기 때문에 본 발명의 유전자를 발현하기 위한 벡터를 사용하여 배지 리터 당 100 내지 500 ㎎ 수준으로 목적하는 유전자 산물의 예로서 단백질을 발현하는 것이 가능하다. 목적하는 유전자 산물은 의도하는 용도에 따라 쉽게 발현될 수 있다.

플라스미드 벡터, 파아지 벡터 또는 바이러스 벡터, 또는 벡터의 일부로 구성된 벡터 단편을 본 발명의 유전자를 발현하기 위한 벡터에서 벡터로서 사용할 수 있다. 이 벡터 또는 벡터 단편은 숙주로 사용하려는 세포에 따라 적절하게 선택할 수 있다.

숙주로 사용할 수 있는 세포에 관해서는 특별한 제한이 없다. 예를 들어, 그람-양성 세균을 사용할 수 있다. 그람-양성 세균의 예는 형질전환 시스템이 확립된 바실러스 속 세균을 포함한다. 구체적으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 스테아로써모필러스, 바실러스 리케니포미스, 바실러스 브레비스 또는 바실러스 sp.를 사용할 수 있다. 그러한 바실러스 속의 세균을 돌연변이시켜 얻어진 것을 숙주로서 사용할 수 있다. 또한, 대장균을 숙주로 사용할 수 있다. 대장균을 위한 형질전환 시스템은 확립되어 있고, 다양한 유전형을 갖는 대장균 세포가 만들어져 있으며, 그들은 용이하게 입수가능하다. 따라서, 대장균이 형질전환을 위한 숙주로 널리 사용된다. 구체적인 예는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 대장균 K-12로부터 유래된 균주 HB101, C600, JM109, DH5α, DH10B, XL-1BlueMRF' 및 TOP10F를 포함한다. 그러한 대장균 세포를돌연변이시켜 얻은 것을 숙주로서 사용할 수 있다.

바실러스 속 세균을 숙주로 사용하는 경우, 벡터의 예는 pHY, pUB110 및 pE194와 같은 플라스미드 벡터와 ψ105 및 SPβ와 같은 파아지 벡터를 포함한다. 대장균을 숙주로 사용하는 경우, 벡터의 예는 pUC18, pUC19, pBluescript 및 pET와 같은 플라스미드 벡터와 람다 파아지 벡터(예를 들어, λgt10 및 λgt11)와 같은 파아지 벡터를 포함한다. 외인성 유전자를 정지기-특이적 방식으로 발현할 수 있는 본 발명의 유전자 발현용 벡터는 그러한 벡터를 적절하게 선택하고 본 발명의 DNA를 그로 도입함으로써 제작할 수 있다.

본 발명의 유전자 발현용 벡터를 제작하기 위하여 Molecular cloning, A laboratory manual 2^ndedition(상기) 등에 기재된 기술을 사용할 수 있다. 다르게는, 예를 들어, 아래 실시예에 기재된 제작 방법에 따라 제작을 수행할 수 있다.

본 발명의 유전자 발현용 벡터는 종결자(예를 들어, rrnBT1T), 선별 마커 유전자 등을 함유할 수 있다.

선별 마커 유전자는 앰피실린-내성 유전자, 카나마이신-내성 유전자, 클로람페니콜-내성 유전자 및 테트라사이클린-내성 유전자를 포함한다.

본 발명의 유전자를 발현하기 위한 벡터는 목적하는 유전자 산물의 의도하는 용도에 따라 하기하는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 그것은 목적하는 유전자 산물을 분리하는 과정을 단순화기 위하여, 이종 단백질(예를 들어, 글루타티온 S-트랜스퍼라제 또는 말토스-결합 단백질)과의 융합 단백질로서의 발현을 가능하게하는 서열이나, 히스티딘 태그 등이 첨가된 단백질로서의 발현을 가능하게 하는 태그 서열을 함유할 수 있다.

더욱이, 본 발명은 상기 재조합 DNA를 함유하는 발현 벡터를 제공한다. 그러한 발현 벡터는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 발현 벡터는 목적하는 유전자를 상기 유전자 발현용 벡터로 도입시켜 얻은 제작물을 포함한다.

유전자 발현용 벡터에 관하여 상기한 벡터를 본 발명의 발현 벡터로 사용할 수 있다.

본 발명의 발현 벡터는 (a) 재조합 DNA를 적절한 벡터로 도입하고; (b) 목적 유전자를 유전자 발현용 벡터에 도입하거나; (c) 목적 유전자를 유전자 발현용 벡터 단편에 연결함으로써 제작할 수 있다.

본 발명의 재조합 DNA 또는 발현 벡터를 사용하여, 재조합 DNA 또는 발현 벡터를 함유하는 형질전환세포를 또한 제공할 수 있다.

상기한 "숙주로 사용할 수 있는 세포"를 숙주로 사용할 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA를 Idenshikougaku Jikken, pp. 12-23, Japan Radioisotope Association (ed.)(1991); Virology, 52: 456(1973); Molecular and Cellular Biology, 7: 2745(1987); Journal of the National Cancer Institute, 41: 351(1968); 또는 EMBO Journal, 1: 841(1982)에 기재된 방법에 따라 숙주로 도입할 수 있다.

예를 들어, 발현 벡터를 자발적 컴피턴스(competence) 방법(Idenshikougaku Jikken, pp. 12-23, Japan Radioisotope Association (ed.)(1991)); 칼슘 포스페이트 방법(Molecular and Cellular Biology, 7: 2745(1987); 전기천공 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161(1984); DEAE-덱스트란 방법(Nucleic Acids Research, pp. 283, Karam 등(eds.)(1991) CRC Press의 방법); 또는 리포좀 방법(BioTechniques, 6: 682(1989))에 따라 숙주로 도입될 수 있다.

본 발명의 형질전환 세포를 이용하여, 형질전환 세포를 배양하고, 그 배양물로부터 단백질을 모으는 것을 포함하는 단백질 제조방법이 제공된다. 그러한 "단백질 제조방법"은 본 발명에 포함된다.

구체적으로, 단백질은

(Ⅰ) (a) 단백질을 코딩하는 핵산이 본 발명의 DNA의 하류에 위치하여 그 핵산이 발현될 수 있도록 한 재조합 DNA나;

(b) 그 재조합 DNA를 함유하는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계: 및

(Ⅱ) (Ⅰ)에서 얻은 형질전환 세포를 배양하고 그 배양물로부터 단백질을 모으는 단계:

를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

형질전환 세포를 배양하는 방법은 숙주로 사용하는 세포, 발현하려는 단백질의 성질 등에 따라 적절하게 선택될 수 있다.

그렇게 얻어진 단백질은 단백질을 정제하는 통상적인 수단에 의해 정제될 수 있다. 그러한 정제 수단의 예는 염석, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피를 포함한다.

본 발명의 DNA 또는 본 발명의 유전자 발현용 벡터를 함유하는 단백질 제조용 키트를 제작하여 본 발명의 단백질 제조방법에 사용할 수 있다. 그러한 키트를 사용하여, 단백질을 편리하게 제조할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 그의 범의를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다.

본 발명에 따라 사용된 바실러스 서브틸리스 균주 간의 상관관계 및 성질은 아래 기재하는 바와 같다.

B. 서브틸리스 말버그 168: 재조합 DNA 실험에서 바실러스 서브틸리스 숙주로 일반적으로 사용되는 균주의 모 균주.

B. 서브틸리스 DB104: 히스티딘을 요구하는 B. 서브틸리스 말버그 168 유도체 중 하나. 영양요구성(nprR2, nprE18, aprED3)을 제외한 돌연변이는 UOT1285와 동일하다.

B. 서브틸리스 UOT1285: 트립토판과 라이신을 요구하는 B. 서브틸리스 말버그 168 유도체 중 하나. 영양요구성(nprR2, nprE18, aprED3)을 제외한 돌연변이는 DB104와 동일하다.

실시예 1: 바실러스 서브틸리스 DNA 칩을 이용한 정지기-특이적 방식으로 발현되는 유전자의 스크리닝

PCR 프라이머를 거의 전체 길이의 ORF가 바실러스 서브틸리스의 모든 ORF에 대해 증폭되도록 바실러스 서브틸리스 게놈 데이타베이스(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)의 DNA 서열 정보를 사용하여 설계하였다. PCR을 96-웰 플레이트에서 이들 프라이머, 바실러스 말버그 168의 게놈 DNA(Molecular & General Genetics, 152: 65-69(1977)) 및 TaKaRa Ex Taq(다카라 슈조) 또는 TakaRa Z-Taq(다카라 슈조)을 사용하여 수행하였다.

생성된 PCR 산물을 정제하였다. 순도와 크기를 아가로스 겔 전기영동에 의해 조사한 후, DNA 농도를 각각의 흡광도를 측정하여 계산하였다.

그렇게 얻은 DNA 단편 용액을 이소프로판올 침전에 의해 농축하였다. 각각 1.0 ㎍/㎖ 농도의 DNA 단편을 WO 00/26404에 기재된 방법에 따라 슬라이드 글래스 상에 고정시켜 DNA 칩을 제조하였다.

바실러스 서브틸리스 UOT1285(Journal of General Microbiology, 135: 1335-1345(1989))를 50 ㎖의 2×SG(1.6% 영양 브로쓰, 0.05% MgSO₄·7H₂O, 0.2% KCl, 1 mM Ca(NO₃)₂·4H₂O, 0.1 mM MnCl₂·4H₂O, 0.001 mM FeSO₄·7H₂O, 0.1% 글루코스)에서 37 ℃에서 배양하였다. 배양물의 일부를 배양 시작 3, 4 또는 5 시간 후 채취하여, 세포를 원심분리에 의해 모았다. 그렇게 얻은 세포를 TRIZOL 시약(집코 BRL)에 현탁시켰다. 글래스 비드를 가하였다. 세포를 미니-비드비터(바이오스펙 프로덕츠)를 사용하여 파쇄하였다. RNA를 TRIZOL 시약에 첨부된 프로토콜에 따라 클로로포름 추출과 이소프로판올 침전으로 회수하였다. 회수된 RNA를 RNase-결여 DNase Ⅰ(다카라 슈조)으로 처리한 후, 페놀/클로로포름 추출 후 에탄올 침전으로 회수하였다. 그 결과, 약 90-100 ㎍의 RNA를 얻었다. 그 RNA를 주형으로서의 RNA로 사용하였다.

역전사효소 반응을 상기한 바와 같이 제조한 주형으로서의 RNA 15 ㎍과 Cy3-dUTP(아머샴 파마시아 바이오텍)를 사용하여 수행하여 Cy3-표지된 cDNA 프로브를 제조하였다.

상기한 바와 같이 제조한 DNA 칩을 예비혼성화 용액(4×SSC, 0.2% SDS, 5×덴하르츠 용액, 1 ㎎/㎖의 변성 연어 정자 DNA)에서 실온에서 2 시간 동안 예비혼성화하고, 2×SSC로 세척한 후 0.2×SSC로 세척한 후, 건조하였다. 그 후, 변성 연어 정자 DNA 농도를 0.1 ㎎/㎖로 바꾼 것을 제외하고는 예비혼성화 용액과 조성이 동일한 혼성화 용액 중에서 65 ℃에서 밤새 상기한 바와 같이 제조된 Cy3-표지된 cDNA 프로브를 사용하여 혼성화를 수행하였다. 혼성화 후, DNA 칩을 55 ℃에서 30 분간 0.2% SDS를 함유하는 2×SSC에서(2 회), 65 ℃에서 5 분간(1 회), 0.05×SSC에서 실온에서 5 분간 세척한 후, 건조하였다.

혼성화된 DNA 칩을 DNA 칩 분석 장치 아피메트릭스 418 어레이 스캐너(아피메트릭스)를 사용하여 형광 검출하였다. 형광 검출에 의해 얻은 신호 강도를 아래와 같이 영상의 색상 랭크로 표현하였다: 파란색<녹색<노란색<오렌지색<빨간색<횐색.

그렇게 얻은 영상 데이터를 발현 데이터 분석 소프트웨어 ImaGene(바이오디스커버리)를 사용하여 소프트웨어에 첨부된 지시에 따라 신호 강도 측정하고 분석하였다. 내부 표준으로서 rRNA 신호를 사용하여 보정된 수치로 표현된 Cy3 신호 강도 값을 비교하고, 바실러스 서브틸리스의 각 증식기에 있는 유전자 발현 신호를 결정하였다. 그 결과, 강한 발현 신호가 배양 3 시간 후 관찰되는 유전자, 강한발현 신호가 배양 5 시간 후 관찰되는 유전자 등이 있었다. 따라서, ORF의 발현 양식이 서로 분명히 다른 것으로 나타났다.

발현 신호의 차이를 더 상세히 조사하기 위하여 발현 수준의 증식기-특이성을 배양 4 시간 또는 5 시간 후 발현 신호를 배양 3 시간 후 발현 신호로 나누어 상대적 발현 수준의 비율을 계산함으로써 결정하였다. 대표적인 유전자에 대한 결과를 표 1에 나타내었다.

유전자	신호 비율(4 시간/3 시간)	신호 비율(5 시간/3 시간)
iolJsigFsipWspoⅡBspoⅢAHspoⅣAyabSybcOybcPybcQybcSybcTybdAyjdByngJyobHyqxAyrzE	4.371.170.632.210.551.301.931.151.861.891.301.351.173.111.032.800.102.46	30.580.310.926.510.726.442.818.034.633.127.523.214.331.46.544.1531.238.4

표 1로부터 알 수 있듯이, 배양 5 시간 후, 즉 정지기 동안 발현 수준이 현저히 증가된 유전자가 있었다.

실시예 2: 바실러스 서브틸리스 매크로멤브레인을 이용한 정지기-특이적 방식으로 발현된 유전자의 스크리닝

디곡시제닌(이하 DIG라 함)-표지된 cDNA 프로브를 실시예 1에서 제조된 주형으로서의 RNA 15 ㎍과 DIG-11-dUTP(로쉐 디아그노스틱스)를 사용하여 역전사효소 반응을 수행함으로써 제조하였다.

다음으로, 바실러스 서브틸리스 DNA 어레이(유로젠텍; 이하 매크로멤브레인이라 함; B. 서브틸리스 말버그 168로부터 유래된 추정 ORF)에 대한 혼성화를 DIG-표지된 프로브를 사용하여 수행하였다. 혼성화를 위하여, 예비혼성화를 42 ℃에서 30 분간 DIG Easy Hyb Granules(로쉐 디아그노스틱스) 용액 중에서 수행하였다. 검출을 DIG 세척 및 차단 완충액 및 검출 키트(모두 로쉐 디아그노스틱스 제품)를 사용하여 수행하였다.

검출 결과를 감광성 필름 상에서 인화하였다. 영상을 영상 분석 소프트웨어 아도베 포토샵(아도베)을 이용하여 영상 분석 장치 모델 GS-700 영상화 밀도계측기(바이오-래드)로 취합하였다. 신호 강도를 영상 분석 소프트웨어 MultiAnalyst(바이오-래드)를 사용하여 소프트웨어에 첨부된 지시에 따라 측정 분석하였다. 바실러스 서브틸리스의 각 증식기에서 유전자의 발현 신호를 수치로 표시된 DIG 신호 강도에 기초하여 측정하였다. 그 결과, 강한 발현 신호가 배양 3 시간 후 관찰되는 유전자, 강한 발현 신호가 배양 5 시간 후 관찰되는 유전자 등이 있었다. 따라서, ORF의 발현 양식은 서로 분명히 다른 것으로 나타났다.

발현 신호의 차이를 더 상세히 조사하기 위하여 발현 수준의 증식기-특이성을 배양 4 시간 또는 5 시간 후 발현 신호를 배양 3 시간 후 발현 신호로 나누어 상대적 발현 수준의 비율을 계산함으로써 결정하였다. 대표적인 유전자에 대한 결과를 표 2에 나타내었다.

유전자	신호 비율(4 시간/3 시간)	신호 비율(5 시간/3 시간)
acoAacoLsigFsipWspoⅡBspoⅣAyabSybcOybcPybcQybcSybcTybdAybdDyfiAygaByidB	4.427.170.798.162.782.150.803.456.861.416.393.131.810.200.550.164.18	42.868.28.1826.311.63.3510.914.531.851.053.122.28.9518.85.211.6514.4

표 2로부터 알 수 있듯이, 배양 5 시간 후, 즉 정지기 동안 발현 수준이 현저히 증가된 유전자가 있었다.

실시예 3: 정지기-특이적 프로모터의 스크리닝

정지기-특이적 프로모터의 스크리닝을 위하여, 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같은 2 라운드의 각각의 스크리닝을 수행하고, 발현 수준이 배양 5 시간 후, 즉 정지기 동안 현저히 증가된 유전자를 그 결과에 기초하여 전체적으로 결정하고, 아래 23 개의 유전자를 아래 실험을 위해 선별 사용하였다: acoA, acoL, iolJ, sigF, sipW, spoⅡB, spoⅢAH, spoⅣA, yabS, ybcO, ybcP, ybcQ, ybcS, ybcT, ybdA, ybdD, yfiA, ygaB, yjdB, yngJ, yobH, yqxA 및 yrzE.

정지기-특이적 프로모터의 스크리닝을 외인성 유전자를 정지기 특이적 방식으로 발현된 23 개의 유전자로부터의 그 유전자의 프로모터 부위를 함유할 것으로 추정되는 DNA 단편에 연결시켜 외인성 유전자를 발현하기 위한 벡터를 제작함으로써 수행하였다.

겔 정제 및 플라스미드 정제를 위한 상업적으로 입수가능한 효소 및 겔 정제 및 플라스미드 정제를 위한 키트를 유전자를 발현시키기 위한 벡터를 제작하기 위하여 사용하였다. 다르게 기재하지 않는 한, Molecular Cloning, A laboratory manual 2^ndedition(Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된 방법에 따라 과정을 수행하였다.

총 46 개의 프라이머를 정지기-특이적 방식으로 발현된 23 개 유전자의 상류 부위를 함유하는 약 180-bp DNA 단편을 증폭하기 위해 설계하였다. DNA 단편 부위를 유전자의 SD 서열의 상류에 위치시키고 프로모터를 함유할 것으로 추정하였다. 설계를 실시예 1에 기재된 바실러스 서브틸리스 게놈 데이터베이스(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)에 기초하여 수행하였다. 또한, 증폭 이후 과정을 단순화하기 위해 제한효소 KpnⅠ 및 EcoRⅠ 부위를 각각의 설계된 프라이머의 양 쪽에 첨가하였다.

증폭하고자 하는 프로모터 부위를 함유할 것으로 추정되는 DNA 단편 유전자, 증폭에 사용되는 프라이머, 및 프라이머의 서열을 보여주는 서열번호(괄호 내)는 아래와 같다: acoA 유전자, 프라이머 aAF1(서열번호 7) 및 aAR1(서열번호 8); spoⅡB 유전자, 프라이머 spBF1(서열번호 9) 및 spBR1(서열번호 10); ybcO 유전자, 프라이머 ybOF1(서열번호 11) 및 ybOR1(서열번호 12); yjdB 유전자, 프라이머 yjBF1(서열번호 13) 및 pjBR1(서열번호 14); yngJ 유전자, 프라이머 ynJF1(서열번호 15)및 ynJR1(서열번호 16); 및 yrzE 유전자, 프라이머 yrEF1(서열번호 17) 및 yrER1(서열번호 18).

게놈 DNA를 바실러스 서브틸리스 DB104(Gene, 83: 215-233(1989))로부터 ISOPLANT 키트(니뽄 진)을 이용하여 키트에 첨부된 지시에 따라 제조하였다.

PCR을 주형으로 게놈 DNA와 상기한 바와 같이 설계된 프라이머를 사용하여 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 30 분간, 50 ℃에서 1 분간, 72 ℃에서 1 분간 20 사이클.

상기한 바와 같이 증폭된 프로모터를 함유할 것으로 추정되는 23 개의 DNA 단편을 아래와 같이 사용하였다.

WO 98/56926에 기재된 피로코커스 퓨리오서스로부터 유래된 초고온안정성 프로테아제 PFUS 유전자를 정지기-특이적 프로모터를 스크리닝하기 위하여 사용하는 외인성 유전자로 사용하였다.

바실러스 서브틸리스 DB104/pSPO124ΔC(FERM BP-6294)는 WO 98/56926에 기재된 초고온안정성 프로테아제 PFUS 유전자를 함유하는 플라스미드 pSPO124ΔC를 갖는 균주이다. 바실러스 서브틸리스 DB104/pSPO124ΔC를 10 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 5 ㎖의 LB 배지에서 37 ℃에서 밤새 배양하였다. 그 후 플라스미드 pSPO124ΔC를 모은 세포로부터 QIAGEN 플라스미드 미니 키트(퀴아젠)을 사용하여 키트에 첨부된 지시에 따라 제조하였다. 이 경우, 라이소자임을 4 ㎎/㎖의 농도로 첨가한 키트에 첨부된 완충액 P1에 현탁된 세포를 37 ℃에서 30 분간 처리하였다.

5448-bp DNA 단편을 PCR에 의해 플라스미드 pSPO124ΔC를 주형으로 프라이머PLF1(서열번호 19) 및 PLR1(서열번호 20)을 사용하여 증폭하였다. 단편은 바실러스 서브틸리스의 서브틸리신 E를 코딩하는 aprE 유전자의 SD 서열과 분비 신호와 초고온안정성 프로테아제 PFUS의 구조 유전자를 함유하였다. 이 단편을 아래 벡터 단편으로 사용하였다.

실시예로서 yngL 유전자의 프로모터 부위를 함유하는 DNA 단편에 관하여 과정은 아래 기재되어 있다.

yngJ 유전자의 프로모터 부위를 함유할 것으로 추정되는 증폭 DNA 단편을 제한효소 KpnⅠ 및 EcoRⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해하였다. DNA 단편을 제한효소 KpnⅠ 및 EcoRⅠ으로 분해된 벡터 단편과 혼합하여 결찰시켰다. 반응 혼합물을 사용하여 바실러스 서브틸리스 DB104를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 1% 탈지유 및 10 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트 상에 도말하였다. 플레이트를 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다.

생성된 카나마이신-내성 형질전환체로부터 180-bp DNA 단편이 삽입된 클론을 선별하기 위하여 프로모터 부위를 함유하는 DNA 단편을 증폭시키는데 사용할 수 있는 프라이머 UBF1(서열번호 21) 및 SBPR1(서열번호 22)을 설계하였다. PCR를 1 mM PMSF를 함유하는 반응 혼합물 중에서 이들 두 프라이머와 TaKaRa Ex Taq(다카라 슈조)의 배합물을 사용하여 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 30 초, 55 ℃에서 1 분, 72 ℃에서 1 분의 20 사이클.

따라서, 180-bp DNA 단편이 삽입된 클론을 선별하였다. 플라스미드를 선별된 형질전환체로부터 제조하고 pND20이라 명명하였다.

다른 22 개의 DNA 단편에 대해 유사한 과정을 수행하였다. 그 후, 프로모터 서열이 pN20의 것과 상이한 18 개의 클론을 형질전환체를 얻은 클론 중에서 얻었다. 총 19 타입의 플라스미드를 형질전환체로부터 제조하였다.

실시예 4: 정지기-특이적 발현 벡터를 이용한 초고온안정성 프로테아제의 제조

(1) 초고온안정성 프로테아제 PFUS 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환된 바실러스 서브틸리스 세포의 베양 및 조효소 용액의 제조

바실러스 서브틸리스 DB104/pND20은 바실러스 서브틸리스 DB104로 실시예 3에서 제조한 초고온안정성 프로테아제 PFUS 유전자를 함유하는 플라스미드 pND20을 도입함으로써 제조된 균주이다. 바실러스 서브틸리스 DB104/pND20을 10 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1 ㎖의 TKRBS1 배지(20 ㎎/㎖의 폴리펩톤, 2 ㎎/㎖의 효모 추출물, 10 ㎎/㎖의 고기 추출물, 40 ㎎/㎖의 글루코스, 20 ㎍/㎖의 FeSO₄·7H₂O, 20 ㎍/㎖의 MnSO₄·5H₂O 및 2 ㎍/㎖의 ZnSO₄·7H₂O)에서 37 ℃에서 배양하였다. 100 ㎕의 배양물을 배양 시작 4, 7, 10 또는 13 일 후 모았다. 배양물을 95 ℃에서 30 분간 가열한 후, 원심분리하여 상등액을 모았다. 상등액을 조효소 용액으로 사용하였다.

조효소 용액을 다른 18 개의 플라스미드 중 하나를 갖는 바실러스 서브틸리스 DB104를 사용하여 유사한 방법으로 제조하였다.

(2) 초고온안정성 프로테아제를 생산하는 능력 비교

초고온안정성 프로테아제 PFUS의 활성을 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA(시그마)를 기질로 사용하여 그 효소로의 가수분해 반응에 의해 생성된 p-니트로아닐린을 분광학적으로 측정하여 결정하였다.

구체적으로는, 효소 활성을 결정하고자 하는 효소 제제를 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 적절히 희석하였다. 100 mM 인산염 완충액(pH 7.0)에 Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA를 1 mM의 농도로 함유하는 50 ㎕의 용액을 50 ㎕의 샘플 용액에 가하였다. 혼합물을 95 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물을 빙냉시켜 반응을 중지시켰다. 405 ㎚에서의 흡광도를 측정하여 생성된 p-니트로아닐린의 양을 결정하였다.

1 유닛의 효소를 95 ℃에서 1 분 후 1 μmol의 p-니트로아닐린을 생성시키는 효소의 양으로 정의하였다.

초고온안정성 프로테아제 PFUS의 비활성이 9.5 유닛/㎎ 단백질이라고 가정하여 발현된 효소 단백질의 양을 결정된 효소 활성에 기초하여 계산하였다.

초고온안정성 프로테아제 활성을 효소 제제로서 실시예 4-(1)에서 제조한 조효소 용액을 사용하여 결정하였다. 그 결과, 초고온안정성 프로테아제 PFUS의 발현을 6 개의 플라스미드(pND1, pND6, pND10, pND19, pND20, pND23)를 사용하여 관찰하였다. 이들 6 개의 플라스미드가 도입된 프로모터 부위의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 내지 6에 나타낸 바와 같다. 이들 6 개의 플라스미드를 사용하여 관찰된 발현 수준은 표 3에 나타낸 바와 같다. 표 3에서, 그 결과는 1과 같이 바실러스 서브틸리스 DB104/pSPO124ΔC를 사용하여 관찰된 발현 수준을 정의하는 상대적 값으로 표현되어 있다.

배양 시간(일)
플라스미드	4	7	10	13
pND1pND6pND10pND19pND20pND23	0.100.011.510.801.930.98	0.210.791.530.602.450.98	0.281.181.640.612.171.01	0.290.861.040.522.000.95

표 3으로부터 알 수 있듯이, pSPO124ΔC를 사용하여 관찰된 발현 수준과 비교하여 초고온안정성 프로테아제 PFUS의 발현 수준 증가를 pND6(약 1.2 배), pND10(약 1.5 배 이상) 및 pND20(약 2 배 이상)을 사용하여 관찰하였다. pND6를 사용하여, 배양 초기인 4 일에 초고온안정성 프로테아제 PFUS의 발현이 거의 관찰되지 않았다. 발현 수준은 배양 후기인 10 일에 pSPO124ΔC를 사용하여 관찰된 것 보다 더 높았다.

초고온안정성 프로테아제 PFUS의 발현이 관찰된 플라스미드에 대한, 초고온안정성 프로테아제 PFUS의 최대 발현수준을 일으킨 일수의 배양기간과, 생산성은 프로모터가 유래된 유전자명과 함께 표 4에 나타낸 바와 같다. 표 4의 생산성은 배양물 리터 당 ㎎의 양으로 표현된다.

플라스미드	프로모터가 유래된 유전자	생산성(㎎)	배양기간(일)
pSPO124ΔCpND1pND6pND10pND19pND20pND23	aprEacoAspoⅡBybcOyjdByngJyrzE	34292.9310514243526279	1313101010710

표 4에 나타낸 바와 같이, pSPO124ΔC의 결과에 비해 더 많은 양의 초고온안정성 프로테아제 PFUS를 pND6, pND10 및 pND20을 이용하여 더 짧은 배양기간(일)에 생산하였다.

실시예 5: 정지기-특이적 발현 벡터를 사용한 알칼라인 프로테아제, 니트로페닐포스파타제, 피롤리돈 카복실 펩티다제 및 메티오닐 아미노펩티다제의 생산

(1) 벡터 제조

리포터 유전자로서 프로테아제 PFUS 유전자를 제외한 부위, 즉 프로모터 부위, SD 서열, 분비 서열 및 벡터를 함유하는 부위를 PCR로 증폭시켰다. PCR에서, 프라이머 NDF1(서열번호 23) 및 NDR1(서열번호 24) 및 주형으로서 위 실시예 3에서 제작된 플라스미드 pND1, pND6, pND10, pND19 및 pND23 중 하나 또는 pSPO124ΔC(대조)를 사용하였다. 증폭 단편을 제한효소 SpeⅠ 및 MluⅠ(모두 다카라 슈조 제품)로 분해하고 정제하였다. 이들 단편을 아래 벡터 단편으로 사용하였다.

(2) 리포터 유전자의 제조 및 발현 벡터의 제작

(ⅰ) 알칼라인 프로테아제 유전자

초고온성 균주 아에로피럼 페르닉스 K1의 알칼라인 프로테아제 유전자를 함유하는 플라스미드 A2GR7310을 National Institute of Technology and Evaluation으로부터 얻었다. 알칼라인 프로테아제를 코딩하는 부위를 프라이머 AP1F1(서열번호 25) 및 AP1R1(서열번호 26) 및 주형으로서 그 플라스미드를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭 단편을 제한효소 SpeⅠ 및 MluⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시키고 정제하였다. 이 단편을 아래 리포터 유전자 단편으로 사용하였다.

리포터 유전자로 사용된 A. 페르닉스의 알칼라인 프로테아제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 33에 나타낸 바와 같다.

리포터 유전자를 pND6, pND10 및 pSPO124ΔC로부터 유래된 벡터 단편에 결찰시켜 얻은 재조합 플라스미드(발현 벡터)를 pND6A1, pND10A1 및 pSPOA1이라 각각 명명하였다.

(ⅱ) 니트로페닐포스파타제 유전자

초고온성 균주 아에로피럼 페르닉스 K1으로부터의 니트로페닐포스파타제 유전자를 함유하는 플라스미드 A2GR0030을 National Institute of Technology and Evaluation으로부터 얻었다. 니트로페닐포스파타제를 코딩하는 부위를 프라이머 AP7E1(서열번호 27) 및 AP7R1(서열번호 28) 및 주형으로서 그 플라스미드를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭 단편을 제한효소 SpeⅠ 및 MluⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시키고 정제하였다. 이 단편을 아래 리포터 유전자 단편으로 사용하였다.

리포터 유전자로 사용된 A. 페르닉스의 니트로페닐포스파타제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 34에 나타낸 바와 같다.

리포터 유전자 단편을 pND10, pND23 및 pSPO124ΔC로부터 유래된 벡터 단편에 결찰시켜 얻은 재조합 플라스미드(발현 벡터)를 pND10A7, pND23A7 및 pSPOA7이라 각각 명명하였다.

(ⅲ) 피롤리돈 카복실 펩티다제 유전자

초고온성 균주 피로코커스 호리코쉬이 OT3의 피롤리돈 카복실 펩티다제 유전자를 함유하는 플라스미드 2708을 National Institute of Technology and Evaluation으로부터 얻었다. 피롤리돈 카복실 펩티다제를 코딩하는 부위를 프라이머 PH1F1(서열번호 29) 및 PH1R1(서열번호 30) 및 주형으로서 그 플라스미드를 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭 단편을 제한효소 SpeⅠ 및 MluⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시키고 정제하였다. 이 단편을 아래 리포터 유전자 단편으로 사용하였다.

리포터 유전자로 사용된 P. 호리코쉬이의 피롤리돈 카복실 펩티다제 유전자의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 35에 나타낸 바와 같다.

리포터 유전자 단편을 pND10, pND19 및 pSPO124ΔC로부터 유래된 벡터 단편에 결찰시켜 얻은 재조합 플라스미드(발현 벡터)를 pND10P1, pND19P1 및 pSPOP1이라 각각 명명하였다.

(ⅳ) 메티오닐 아미노펩티다제 유전자

초고온성 균주 피로코커스 호리코쉬이 OT3의 메티오닐 아미노펩티다제 유전자에 대한 PCR-증폭 단편 PH0628PCR을 National Institute of Technology and Evaluation으로부터 얻었다. 메티오닐 아미노펩티다제를 코딩하는 부위를 프라이머 PH2F1(서열번호 31) 및 PH2R1(서열번호 32) 및 주형으로서 그 단편을 이용하여 PCR로 증폭시켰다. 증폭 단편을 제한효소 SpeⅠ 및 MluⅠ(모두 다카라 슈조 제품)으로 분해시키고 정제하였다. 이 단편을 아래 리포터 유전자 단편으로 사용하였다.

리포터 유전자로 사용된 P. 호리코쉬이의 메티오닐 아미노펩티다제 유전자의뉴클레오타이드 서열은 서열번호 36에 나타낸 바와 같다.

리포터 유전자 단편을 pND1, pND19 및 pSPO124ΔC로부터 유래된 벡터 단편에 결찰시켜 얻은 재조합 플라스미드(발현 벡터)를 pND1P2, pND19P2 및 pSPOP2라 각각 명명하였다.

(3) 형질전환체의 제조 및 리포터 유전자의 발현

실시예 5-(2)에서 제작한 각각의 발현 벡터를 사용하여 바실러스 서브틸리스 DB104를 형질전환시키는데 사용하였다. 형질전환된 세포를 1% 탈지유와 10 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 LB 플레이트에 도말하였다. 그 플레이트를 37 ℃에서 16 시간 동안 인큐베이션하였다.

효소를 코딩하는 유전자 중 하나가 삽입된 클론을 생성된 카나마이신-내성 형질전환체로부터 선별하고, 37 ℃에서 10 ㎍/㎖의 카나마이신을 함유하는 1 ㎖의 TKRBS1 배지에서 배양하였다. 배양 10 일 후 모은 배양물(알칼라인 포스파타제의 경우에만 7 일)을 95 ℃로 30 분 동안 가열하고 원심분리하여 상등액을 모았다. 상등액을 조효소 용액(효소 제제)으로 사용하였다.

(4) 활성 측정

(ⅰ) 알칼라인 프로테아제

알칼라인 프로테아제 활성을 젤라틴(나칼라이 테스크)를 기질로 사용하여 아래와 같이 측정하였다.

효소 활성을 결정하고자 하는 효소 제제를 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 희석시켰다. 희석물을 SDS-PAGE 로딩 완충액과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 30 분 이상 방치한 후, SDS와 0.05% 젤라틴을 함유하는 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 겔을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)으로 세척하였다. 세척한 겔을 50 mM 인산나트륨 완충액(pH 7.0)에서 95 ℃에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후 반응 혼합물을 빙냉시켜 반응을 중지시켰다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다. 겔 영상을 영상 분석 소프트웨어 아도베 포토샵(아도베)을 사용하여 영상 화일로 전환시키고 활성 신호를 NIH 영상 소프트웨어를 이용하여 수치로 표현하였다.

(ⅱ) 니트로페닐포스파타제

니트로페닐포스파타제 활성을 p-니트로페닐포스페이트(시그마)를 기질로 사용하여 아래와 같이 측정하였다.

효소 활성을 결정하고자 하는 효소 제제를 1 mM ZnCl₂를 함유하는 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 적절히 희석시켰다. 1 mM ZnCl₂를 함유하는 100 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5) 중에 2 mM 농도로 p-니트로페닐포스페이트를 함유하는 50 ㎕의 용액을 50 ㎕의 샘플 용액에 가하였다. 혼합물을 95 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물을 빙냉시켜 반응을 중지시켰다. 생성된 유리 인산염의 양을 파이퍼 인산염 분석 키트(몰레큘라 프로브)를 사용하여 544 ㎚에서의 여기로 인한 590 ㎚에서의 형광 발광을 측정함으로써 결정하였다

(ⅲ) 피롤리돈 카복실 펩티다제

피롤리돈 카복실 펩티다제 활성을 피로글루탐산 4-메틸-쿠마릴-7-아미드(이하 Pyr-MCA라 함; 펩타이드 인스티튜트)를 기질로 사용하여 아래와 같이 측정하였다.

효소 활성을 측정하고자 하는 효소 제제를 10 mM DTT와 1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 인산염 완충액(pH 7.0)으로 적절히 희석시켰다. 10 mM DTT와 1 mM EDTA를 함유하는 50 mM 인산염 완충액(pH 7.0) 중에 0.2 mM의 농도로 Pyr-MCA를 함유하는 50 ㎕의 용액을 50 ㎕의 샘플 용액에 가하였다. 혼합물을 95 ℃에서 30 분간 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물을 빙냉시켜 반응을 중지시켰다. 생성된 MCA의 양을 355 ㎚에서의 여기로 인한 460 ㎚에서의 형광 발광을 측정함으로서 결정하였다.

1 유닛의 효소를 95 ℃에서 1 분후 1 μmol의 MCA를 생성시키는 효소의 양으로 정의하였다.

(ⅳ) 메티오닐 아미노펩티다제

메티오닐 아미노펩티다제 활성을 Met-Ala-Ser(바켐)을 기질로 사용하여 아래와 같이 측정하였다.

효소 활성을 결정하고자 하는 효소 제제를 0.5 mM CoCl₂를 함유하는 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5)으로 적절히 희석시켰다. 0.5 mM CoCl₂를 함유하는 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5) 중에 1 mM의 농도로 Met-Ala-Ser를 함유하는 45 ㎕의 용액을 5 ㎕의 샘플 용액에 가하였다. 혼합물을 75 ℃에서 5 분간 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물을 빙냉시키고 10 ㎕의 100 mM EDTA를 가하여 반응을 중지시켰다. 50 ㎕의 혼합물 A(0.18 ㎎/㎖의 L-아미노산 옥시다제, 50 ㎍/㎖의 퍼옥시다제 및0.18 ㎎/㎖의 o-디아니시딘을 함유하는 100 mM 인산칼륨 완충액(pH 7.5))를 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 10 분간 반응시켰다. 그 후 반응 혼합물을 빙냉시켜 반응을 중지시켰다. 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다.

(5) 생산능력의 비교

배양물에 함유되어 있는 총 효소 활성을 실시예 5-(4)에 기재된 바와 같이 측정한 효소 제제의 효소 활성에 기초하여 계산하였다.

aprE 유전자(pSPOA1, pSPOA7, pSPOP1 또는 pSPOP2)의 프로모터를 갖는 발현 벡터를 사용하여 관찰된 발현 수준을 1과 같이 정의하였다. 각각의 발현 벡터의 상대적 발현 수준은 표 5에 나타낸 바와 같다.

리포터 유전자	벡터	프로모터	상대적 발현 수준
A 페르닉스 알칼라인 프로테아제	pND6A1pND10A1pSPOA1	spoⅡBybcOaprE	6.1623.81.00
A. 페르닉스 니트로페닐포스파타제	pND10A7pND23A7pSPOA7	ybcOyrzEaprE	2.291.681.00
P. 호리코쉬이 카복실 펩티다제	pND10P1pND19P1pSPOP1	ybcOyjdBaprE	1.433.731.00
P. 호리코쉬이 아미노펩티다제	pND1P2pND19P2pSPOP2	acoAyjdBaprE	1.811.981.00

본 발명은 유전자의 유도 없이 정지기-특이적 방식으로 고수준의 유전자 발현을 가능하게 하는 프로모터를 제공한다.

서열목록 프리 텍스트

서열번호 1; pND1의 프로모터 부위.

서열번호 2; pND6의 프로모터 부위.

서열번호 3; pND10의 프로모터 부위.

서열번호 4; pND19의 프로모터 부위.

서열번호 5; pND20의 프로모터 부위.

서열번호 6; pND23의 프로모터 부위.

서열번호 7; acoA 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 aAF1.

서열번호 8; acoA 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 aAR1.

서열번호 9; spoⅡB 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 spBF1.

서열번호 10; spoⅡB 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 spBR1.

서열번호 11; ybcO 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 ybOF1.

서열번호 12; ybcO 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 ybOR1.

서열번호 13; yjdB 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 yjBF1.

서열번호 14; yjdB 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 yjBR1.

서열번호 15; yngJ 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머ynJF1.

서열번호 16; yngJ 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 ynJR1.

서열번호 17; yrzE 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 yrEF1.

서열번호 18; yrzE 유전자의 프로모터 서열을 증폭하기 위한 프라이머 yrER1.

서열번호 19: 프라이머 PLF1.

서열번호 20: 프라이머 PLR1.

서열번호 21: 프라이머 UBF1.

서열번호 22: 프라이머 SBPR1.

서열번호 23: 프라이머 NDF1.

서열번호 24: 프라이머 NDR1.

서열번호 25: 알칼라인 프로테아제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 AP1F1.

서열번호 26: 알칼라인 프로테아제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 AP1R1.

서열번호 27: 니트로페닐 포스파타제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 AP7F1.

서열번호 28: 니트로페닐 포스파타제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한프라이머 AP7R1.

서열번호 29: 피롤리돈-카복실 펩티다제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 PH1F1.

서열번호 30: 피롤리돈-카복실 펩티다제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 PH1R1.

서열번호 31: 메티오닐 아미노펩티다제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 PH2F1.

서열번호 32: 메티오닐 아미노펩티다제 유전자의 코딩 부위를 증폭하기 위한 프라이머 PH2R1.

Claims (11)

1. (a) 정지기-특이적 방식으로 그람-양성 세균에서 프로모터 활성을 나타내는 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 DNA 또는 그의 단편; 및

   (b) 정지기-특이적 방식으로 그람-양성 세균에서 프로모터 활성을 나타내는, 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 단편에 혼성화할 수 있는 분리된 DNA:

   로 구성된 그룹으로부터 선택된 분리된 DNA.
2. 제1항에 있어서, 외인성 유전자를 DNA가 그 유전자의 상류에 위치할 때 정지기-특이적 방식으로 발현할 수 있는 분리된 DNA.
3. 외인성 유전자가 발현될 수 있도록 제1항에 정의된 DNA와 외인성 유전자가 위치된 재조합 DNA.
4. 제3항에 있어서, 외인성 유전자가 단백질을 코딩하는 핵산, 안티센스 RNA를 코딩하는 핵산 및 리보자임을 코딩하는 핵산으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 핵산인 재조합 DNA.
5. 제1항에 의해 정의된 DNA를 함유하는 유전자를 발현하기 위한 벡터.
6. 제5항에 있어서, 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 및 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 유전자를 발현하기 위한 벡터.
7. 제3항에 의해 정의된 재조합 DNA를 함유하는 발현 벡터.
8. 제7항에 있어서, 플라스미드 벡터, 파아지 벡터 및 바이러스 벡터로 구성된 그룹으로부터 선택되는 발현 벡터.
9. 제3항에 의해 정의된 재조합 DNA 또는 제7항에 의해 정의된 발현 벡터를 함유하는 형질전환 세포.
10. 제9항에 의해 정의된 형질전환 세포를 배양하고;

    그 배양물로부터 단백질을 모으는 것:

    을 포함하는 단백질 제조방법.
11. 제1항에 의해 정의된 DNA 또는 제5항에 의해 정의된 유전자를 발현하기 위한 벡터를 함유하는 단백질을 제조하기 위한 키트.