CN1507490B - 启动子 - Google Patents
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Abstract
分离的DNA,所述分离的DNA是具有由序列表中SEQ ID NO:1-6中的任何一种表示的碱基序列或其片段、且在革兰氏阳性细菌中显示出稳定期特异性启动子活性的DNA。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够方便地以低成本及高水平表达目的基因产物的新启动子,且涉及一种用该启动子生产蛋白质的方法。
背景技术
表达系统用来根据目的,通过基因工程来生产有用的基因产物。在所述表达系统方面,使用已建立了其培养技术的诸如微生物细胞(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母等等)、动物细胞、昆虫细胞和植物细胞的宿主以及适合于所述宿主的启动子。在这些表达系统中,使用大肠杆菌作为宿主且用lac启动子或其衍生物的一种表达系统,由于操作上的方便因而是最常用的系统之一。
然而,使用lac启动子或其衍生物的表达系统的缺点在于:工业上它是不便的;因为它需要诱导基因表达来表达基因产物。例如,诱导由lac启动子、tac启动子或诸如此类的启动子进行基因表达,则需要使用一种昂贵的试剂——异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。因此,这样的系统的缺点在于:它对工业规模的操作不利。
同样,使用一种利用来源于木糖操纵子的启动子且用芽孢杆菌属(Bacillus)细菌作为宿主的表达系统。但是,该系统对工业规模的操作不利,因为它需要添加木糖来诱导表达。
通常使用利用λ噬菌体启动子的温度诱导的表达载体。
然而,通过温度诱导过量表达重组基因产物在下列方面可能是不利的:
(a)难以快速完成温度的加速,
(b)由于培养温度较高,形成不溶性内涵体的可能性增加,以及
(c)热激时在大肠杆菌中诱导几种蛋白酶。
已知枯草杆菌作为稳定期特异性的反应,产生及分泌许多分解代谢酶,例如淀粉酶和蛋白酶。如果宿主能够利用稳定期特异性的表达机制而仅仅在宿主生长完全后的稳定期期间表达基因,则可能减少该宿主的负担,且可能有效地表达外源基因。但是,尚未建立利用这样一种机制的基因表达技术。
因此,希望有无需人工诱导基因表达而能够有效表达的技术。
发明目的
本发明主要目的是:提供无需人工诱导基因表达而能够以稳定期特异性方式以高水平表达基因的启动子、重组DNA、基因表达用载体、表达载体及转化细胞;以及提供一种可方便而低成本地实施的、生产蛋白质的方法以及一种供该方法用的试剂盒。
发明概述
概述本发明如下:
一种分离的DNA,所述分离的DNA选自:
(a)具有SEQ ID NO:1-6中的任何一种的核苷酸序列的、在革兰氏阳性细菌中以稳定期特异性方式显示出启动子活性的分离的DNA或其片段,和
(b)在严谨性条件下可与(a)的DNA或其片段杂交的、在革兰氏阳性细菌中以稳定期特异性方式显示出启动子活性的分离的DNA;
按照[1]的分离的DNA,所述分离的DNA在被置于外源基因的上游时,则能够在没有诱导物的情况下以稳定期特异性方式使该外源基因表达;
一种重组DNA,其中由[1]限定的DNA和外源基因的配置使得所述外源基因可以表达;
按照[3]的重组DNA,其中所述外源基因为选自编码蛋白质的核酸、编码反义RNA的核酸以及编码核酶的核酸的核酸;
一种基因表达用载体,所述载体包含由[1]限定的DNA;
按照[5]的基因表达用载体,其中所述载体是选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体的一种载体;
一种表达载体,所述表达载体包含由[3]限定的重组DNA;
按照[7]的表达载体,其中所述载体是选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体的一种载体;
一种转化细胞,所述转化细胞含有由[3]限定的重组DNA或由[7]限定的表达载体;
一种用于生产蛋白质的方法,所述方法包括:
培养由[9]限定的转化细胞;
并从所产生的培养物中收集蛋白质,以及
一种用于生产蛋白质的试剂盒,所述试剂盒含有由[1]限定的DNA或由[5]限定的表达基因用载体。
发明详述
可以将来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)DB104(Gene,83:215-233(1989))的、含有一种位于一种以稳定期特异性方式表达的基因之可读框(ORF)上游的元件、且显示出启动子活性的DNA用作本发明的DNA。本发明基于本发明人的意外发现——如果将外源基因(也称为目的基因)置于所述DNA的下游,则在没有表达诱导物的情况下,可以高水平(即每升培养基100-500mg)地表达目的基因的产物。
本发明的DNA包括具有SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列的DNA。本发明的DNA优选是在革兰氏阳性细菌中以稳定期特异性方式显示出启动子活性的分离的DNA,更优选是在下面描述的在芽孢杆菌属细菌或大肠杆菌中以稳定期特异性方式显示出启动子活性的分离的DNA。
按照本发明,“启动子”包括位于转录起始点(+1)上游约10-30个碱基对的一个Pribnow框、一个TATA框或一个类似于TATA框的区域,且负责使RNA聚合酶能从正确位置开始转录的功能。所述启动子不一定限制于这样的区域或周围区域,而是除了该区域外,所述启动子还可包含结合除RNA聚合酶之外的蛋白质结合所必需的供控制表达用的区域。当用于本文时,术语“启动子区”是指包含按照本发明的启动子的区域。
当用于本文时,术语“启动子活性”表示:当把通过将基因置于启动子下游使得能够表达该基因而获得的构成物引入到宿主中时,所述启动子具有在该宿主内或在宿主之外生产该基因的表达产物的能力与功能。
通常,可以用包括下述步骤的方法来测量“启动子活性”,该方法包括:
(1)将待测量的DNA连接到编码可被容易地定量或观测的蛋白之基因(在下文也称之为报道基因)上游的步骤;
(2)将所产生的构成物引入到宿主中的步骤;
(3)培养所产生的转化细胞从而表达该蛋白的步骤;以及
(4)测量所表达的蛋白量的步骤。例如,通过将假定具有启动子序列的一段序列连接到报道基因的上游,将所述构成物引入到宿主中,并观测该宿主内或宿主外所述基因产物的表达;则可以测定“启动子活性”的存在。表达的观测值作为所述启动子在所导入的宿主中的启动子活性的一个指标。
当用于本文时,“稳定期特异性启动子”是指仅仅在对数生长期之后的稳定期期间指导转录的启动子。“稳定期特异性启动子”可以只在稳定期期间、在没有用诱导物例如IPTG诱导的情况下,表达置于所述启动子下游的基因。
只要具有SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列的分离DNA的片段以稳定期特异性方式显示出启动子活性,则本发明的DNA包括这样的分离DNA的片段。可以适当地选择“片段”,使得该片段以稳定期特异性方式显示出启动子活性。用上述的包括步骤(1)至(4)的方法,则可选择这样的片段。
本发明的DNA还包括具有在SEQ ID NO:1-6的任一种核苷酸序列中至少一个核苷酸且特别是一个或数个核苷酸被取代、缺失、插入或添加的核苷酸序列、且具有稳定期特异性方式的启动子活性的DNA。一般而言,如果具有短序列的DNA有至少一个核苷酸的突变(取代、缺失、插入或添加),则该DNA的活性可能被改变。然而,如果用上述的包括步骤(1)至(4)的方法观测到“有突变的DNA”以稳定期特异性方式的启动子活性,则本发明包括所述“有突变的DNA”。所述突变或者可以是天然发生的突变,或者可以是人工引入的突变。可按照常规的定点诱变法等等,来引入人工突变。可使用的定点诱变法的实例包括:利用琥珀突变的缺口双链体法(Nucleic AcidsResearch,12:9441-9456(1984)),利用dut(dUTP酶)基因和ung(尿嘧啶-DNA糖基化酶)基因缺陷之宿主的Kunkel法(Proceedings of theNational Academy of Sciences of the USA,82:488-492(1985))以及利用琥珀突变的PCR法(WO 98/02535)。
本发明也包括这样的分离的DNA,所述分离的DNA在严谨性条件下可与本发明DNA的互补链杂交,或者例如用基于本发明DNA而按照常规方法设计并化学合成的寡核苷酸探针或引物而获得,且最好在革兰氏阳性细菌中,具有稳定期特异性方式的启动子活性
例如,用上述的包括步骤(1)至(4)的方法观测到稳定期特异性方式的启动子活性的DNA,可以被选择作为这样的DNA。只要所述寡核苷酸探针在严谨性条件下与所述DNA杂交或与具有互补于所述DNA的核苷酸序列的DNA杂交,那么对于所述寡核苷酸探针的核苷酸序列则没有特别的限制。
“严谨性条件”的示例为文献例如Sambrook等,Molecular cloning,A laboratory manual 2nd edition,1989,Cold Spring Harbor LaboratoryPress中描述的那些严谨性条件。例如,严谨性条件为:在含有6×SSC(1×SSC:0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠,pH7.0)、0.5%SDS、5×Denhardt’s(0.1%的牛血清白蛋白(BSA)、0.1%的聚乙烯吡咯烷酮、0.1%的Ficoll 400)和100μg/ml鲑精DNA的溶液中,于所用探针的Tm-25℃的温度,保温过夜。
只要所述引物在常规PCR所用的条件下能够退火到所述DNA或具有互补于所述DNA的核苷酸序列的DNA上,从而起始用DNA聚合酶的延伸反应,那么对于所述引物的核苷酸序列也没有特别的限制。
例如按照下面的公式,可确定寡核苷酸探针或引物的Tm:
Tm=81.5-16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)
其中,N是寡核苷酸探针或引物的链长,%G+C为寡核苷酸探针或引物中鸟嘌呤残基加胞嘧啶残基的含量。
如果寡核苷酸探针或引物的链长少于18个核苷酸,则可以估算Tm;例如,按残基A+T(腺嘌呤加胸腺嘧啶)数目乘以2(℃)之积与残基G+C残基数目乘以4(℃)之积的和,即[(A+T)×2+(G+C)×4],来估算Tm。
虽然并不打算限制本发明,但为了避免非特异性的杂交或退火,理想的是寡核苷酸探针或引物的链长优选为6个或6个以上的核苷酸、更优选为10个或10个以上的核苷酸。而且,考虑到寡核苷酸的合成,理想的是所述长度优选为100个或100个以下的核苷酸、更优选为30个或30个以下的核苷酸。
对于本领域技术人员,寡核苷酸的设计是已知的,例如可参照Labo Manual PCR,第13-16页,1996(Takara Shuzo)。另一方面,可使用市售的软件,例如OLIGOTM Primer Analysis软件(Takara Shuzo)。
可按照已知的方法来合成寡核苷酸。例如,可以按照亚磷酰胺法,用394型DNA合成仪(Applied Biosystems)来合成寡核苷酸。另一方面,为了合成,可以用磷酸三酯法、H-膦酸酯法、硫代膦酸酯法等等。
使用本发明的DNA,提供一种重组DNA;在所述重组DNA中,本发明DNA和外源基因的配置使得可以表达所述外源基因。本发明包括这样的重组DNA。
外源基因的实例包括但不限于:编码蛋白质(例如酶、细胞因子或抗体)的核酸、编码反义RNA的核酸以及编码核酶的核酸。所述外源基因之起源的实例包括但不限于:微生物(例如细菌、酵母、放线菌、丝状真菌、子囊菌和担子菌)、植物、昆虫和动物。此外,可以随目的而定,使用人工合成的基因。
具体地讲,外源基因的实例包括但不限于:白介素(IL)1至12的基因,干扰素(IFN)α、β和γ的基因,肿瘤坏死因子(TNF)的基因,集落刺激因子(CSF)的基因,促红细胞生成素的基因,转化生长因子(TGF)-β的基因,免疫球蛋白(Ig)的基因,组织纤溶酶原激活物(t-PA)的基因,尿激酶的基因以及Western firefly荧光素酶的基因。
当用于本文时,“核酶”是指切割特定蛋白的mRNA从而阻止所述蛋白翻译的核酸。可以在编码特定蛋白的基因序列的基础上设计核酶。例如,用FEBS Letter,228:228-230(1988)中描述的方法,可制备锤头型核酶。按照本发明的核酶包括:切割特定蛋白的mRNA从而阻止所述蛋白翻译的任何一种核酶,而不管所述核酶的类型(例如锤头型、发夹型或三角形)。
即使不人工诱导基因的表达,本发明的DNA也显示出能够高水平表达基因的启动子活性。因此,对于作为编码蛋白质之核酸的外源基因的表达,本发明DNA是特别优选的。
此外,用本发明的DNA,提供一种含有本发明DNA的基因表达用载体。本发明则包括这样的基因表达用载体。
用本发明的基因表达用载体,有可能以每升培养基100-500mg的水平表达蛋白质(作为目的基因产物的一个实例);因为所述载体包含本发明的DNA。可以容易地、根据预期效用而表达目的基因产物。
可以将质粒载体、噬菌体载体或病毒载体或者构成所述载体一部分的载体片段,用作本发明的基因表达用载体中的载体。可以根据待用作宿主的细胞,适当地选择所述载体或载体片段。
对于可被用作宿主的细胞,则没有特别的限制。例如,可以用革兰氏阳性细菌。革兰氏阳性细菌的实例包括已建立了转化系统的芽孢杆菌属的细菌。虽然并不打算限制本发明,但具体可使用枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenifomis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)或种名未定的芽孢杆菌(Bacillus sp.)。可以将通过诱变这样的芽孢杆菌属细菌而获得的细菌用作宿主。同样,可以将大肠杆菌用作宿主。已建立了大肠杆菌的转化系统,产生了具有不同基因型的大肠杆菌细胞,并且它们都是容易得到的。因此,大肠杆菌被广泛地用作转化的宿主。虽然并不打算限制本发明,但具体的实例包括来源于大肠杆菌K-12的菌株:HB101、C600、JM109、DH5α、DH10B、XL-1BlueMRF’和TOP10F。可以将通过诱变这样的大肠杆菌细胞而获得的菌株用作宿主。
如果将枯草杆菌属的细菌用作宿主,则所述载体的实例包括:质粒载体例如pHY、pUB110和pE194,以及噬菌体载体例如105和SPβ。如果用大肠杆菌作为宿主,则所述载体的实例包括:质粒载体例如pUC18、pUC19、pBluescript和pET,以及噬菌体载体例如λ噬菌体载体(例如λgt10和λgt11)。通过适当选择这样的载体,并使本发明的DNA结合到所述载体中,则可构建能够以稳定期特异性方式表达外源基因的本发明的基因表达用载体。
为了构建本发明的基因表达用载体,可以使用Molecular cloning,Alaboratory manual 2nd(上述)中描述的或诸如此类的技术。另一方面,例如可按照下面实施例中描述的构建步骤来进行构建。
本发明的基因表达用载体可包含一个终止子(例如rrnBT1T)、一个选择标记基因等等。
选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氯霉素抗性基因和四环素抗性基因。
本发明的基因表达用载体可以根据目的基因产物的预期效用而包含下述元件。例如,为了简化分离目的基因产物的步骤,所述载体可包含一段能够以与异源蛋白(例如谷胱甘肽S-转移酶或麦芽糖结合蛋白)的融合蛋白形式表达的序列;或可包含一段能够以添加了组氨酸尾或诸如此类的蛋白形式表达的标志序列。
此外,本发明提供一种包含上述重组DNA的表达载体。这样的表达载体被本发明所包括。本发明的表达载体包括通过使目的基因结合到上述基因表达用载体中而获得的构成物。
可以将上面关于基因表达用载体而描述的载体用于本发明的表达载体。
通过(a)使所述重组DNA结合到一种合适的载体中,(b)使目的基因结合到一种基因表达用载体中,或(c)将目的基因连接到基因表达用的载体片段上,则可构建本发明的表达载体。
用本发明的重组DNA或表达载体,同样可以提供含有所述重组DNA或所述表达载体的转化细胞。
可将上面描述的“可用作宿主的细胞”用作宿主。
例如,可按照在下述文献中描述的方法,将重组DNA引入到宿主中;所述下述文献即:Idenshikougaku Jikken,第12-23页,JapanRadioisotope Association(编辑)(1991);Virology,52:456(1973);Molecular and Cellular Biology,7:2745(1987);Journal of the NationalCancer Institute,41:351(1968);或EMBO Journal,1:841(1982)。
例如,可按照自发感受态法(Idenshikougaku Jikken,第12-23页,Japan Radioisotope Association(编辑)(1991))、磷酸钙法(Molecular andCellular Biology,7:2745(1987))、电穿孔法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:7161(1984))、DEAE-葡聚糖法(Methods in Nucleic Acids Research,第283页,Karam等(编辑)(1991)CRC Press)或脂质体法(BioTechniques,6:682(1989)),将表达载体引入到宿主中。
使用本发明的转化细胞,提供一种生产蛋白质的方法,所述方法包括培养转化细胞、且从所产生的培养物中收集蛋白质。本发明包括这样的“生产蛋白质的方法”。
具体地讲,可以用包括下述步骤的方法来生产蛋白质:
(I)用下述(a)或(b)转化宿主细胞的步骤,
(a)一种重组DNA,其中编码蛋白质的核酸置于本发明DNA的下游,使得所述核酸可被表达;或
(b)一种包含所述重组DNA的载体;以及
(II)培养按(I)而获得的转化细胞、并从所产生的培养物中收集蛋白质的步骤。
可根据用作宿主的细胞、待表达蛋白的性质等等,适当地选择培养转化细胞的方法。
可以用常规的纯化蛋白质的方法来纯化如此获得的蛋白质。这样的纯化方法的实例包括盐析、离子交换层析、疏水层析、亲和层析以及凝胶过滤层析。
可构建生产蛋白质用的试剂盒,所述试剂盒包含本发明的DNA或者本发明的基因表达用载体,所述试剂盒可以用于本发明的生产蛋白质的方法。用这样的试剂盒,可更方便地生产蛋白质。
实施例
下面的实施例更详细地阐明了本发明,但不应解释为这些实施例限制本发明的范围。
下面描述了按照本发明使用的枯草芽孢杆菌菌株之间的关系及其特性。
枯草芽孢杆菌Marburg 168:在重组DNA实验中通常用作枯草芽孢杆菌宿主之菌株的亲代菌株。
枯草芽孢杆菌DB104:枯草芽孢杆菌Marburg 168的衍生菌株中的一种需要组氨酸的菌株。除所述辅源营养之外的突变(nprR2、nprE18、aprED3)与UOT1285的相应突变是等同的。
枯草芽孢杆菌UOT1285:枯草芽孢杆菌Marburg 168的衍生菌株中的一种需要色氨酸和赖氨酸的菌株。除所述辅源营养之外的突变(nprR2、nprE18、aprED3)与DB104的相应突变是等同的。
实施例1:用枯草芽孢杆菌DNA芯片筛选以稳定期特异性方式表达的基因
使用枯草芽孢杆菌基因组之数据库(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)中的DNA序列信息,来设计PCR的引物;使得对枯草芽孢杆菌的所有可读框,都可扩增出几乎全长的可读框。用这些引物、来自枯草芽孢杆菌Marburg 168的基因组DNA(Molecular & General Genetics,152:65-69(1977))以及TaKaRaEx Taq(Takara Shuzo)或TaKaRa Z-Taq(Takara Shuzo),在96孔板中进行PCR。
纯化所产生的PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳来检查纯度和大小;然后,通过测量每个样品的吸光度,来计算所述DNA的浓度。
通过异丙醇沉淀而浓缩如此获得的DNA片段的溶液。按照WO00/26404中描述的方法,浓度分别为1.0μg/ml的各种DNA片段固定到载玻片上,从而制备DNA芯片。
在50ml的2×SG(1.6%的营养肉汤、0.05%的MgSO4·7H2O、0.2%KCl、1mM的Ca(NO3)2·4H2O、0.1mM MnCl2·4H2O、0.001mM的FeSO4·7H2O、0.1%的葡萄糖)中于37℃培养枯草芽孢杆菌UOT1285(Journal of General Microbiology,135:1335-1345(1989))。在培养开始后的3小时、4小时或5小时,取出一部分培养物;并通过离心收集细胞。将如此获得的细胞悬浮于TRIZOL Reagent(Gibco BRL)中。向所述悬浮液中添加玻璃珠。用Mini-BeadBeater(Biospec Products)破裂细胞。按照TRIZOL Reagent所附带的方案,通过氯仿抽提及异丙醇沉淀,来回收RNA。用无RNA酶的DNA酶I(Takara Shuzo)处理所回收的RNA,然后,通过苯酚/氯仿抽提,继之以乙醇沉淀,来回收RNA。结果获得约90-100μg的RNA。将所述RNA用作作为模板的RNA。
用15μg按上面描述方法制备的作为模板的RNA和Cy3-dUTP(Amersham Pharmacia Biotech)进行逆转录酶反应,以制备Cy3-标记的cDNA探针。
使按照上述方法制备的DNA芯片于室温下在预杂交溶液(4×SSC、0.2%SDS、5×Denhardt溶液、1mg/ml变性鲑精DNA)中预杂交2小时,用2×SSC洗涤,继之以用0.2×SSC洗涤,然后干燥。接着,使用按上述方法制备的Cy3-标记的cDNA探针,在杂交溶液中于65℃进行杂交过夜;所述杂交溶液除了变性鲑精DNA浓度变为0.1mg/ml外,其组成与预杂交溶液的组成相同。杂交之后,用含有0.2%SDS的2×SSC于55℃洗涤所述DNA芯片达30分钟(两次),并于65℃将其洗涤5分钟(一次),且在0.05×SSC中于室温洗涤5分钟;然后干燥。
用DNA芯片分析仪Affymetrix 418Array Scanner(Affymetrix),对经过杂交的DNA芯片进行荧光检测。将通过荧光检测而获得的信号强度如下以固相中的色阶表示:蓝色<绿色<黄色<橙黄色<红色<白色。
用表达数据分析软件ImaGene(BioDiscovery),按照所述软件所附的说明书,对如此获得的图象数据进行信号强度的测量与分析。比较用rRNA之信号作为内标而校正过的、用数字表示的Cy3信号强度值,并测定枯草芽孢杆菌各个生长期的基因表达信号。结果,有在培养3小时后观测到强表达信号的基因,有在培养5小时后观测到强表达信号的基因等等。因此,显示出所述可读框的表达方式显然是相互不同的。
为了更详细地研究表达信号的差异,通过用培养3小时后的表达信号除培养4或5小时后的表达信号计算相对表达水平的比率,来确定表达水平的生长期特异性。在表1中显示了有代表性基因的结果。
表1
正如从表1中所看到的,在培养5小时后即在稳定期期间,有表达水平显著升高的基因。
实施例2:用枯草芽孢杆菌的大膜片(macromembrane)来筛选以稳定期特异性方式表达的基因
通过用15μg实施例1中制备的作为模板的RNA和DIG-11-dUTP(Roche Diagnostics)进行逆转录酶反应,来制备地高辛配基(在下文称之为DIG)-标记的cDNA探针。
然后,用DIG-标记的cDNA探针来进行与枯草芽孢杆菌DNA阵列(Eurogentec,在下文称之为大膜片;来源于枯草芽孢杆菌Marburg 168的推定的可读框)的杂交。至于杂交,在42℃于DIG Easy Hyb Granules(Roche Diagnostics)溶液中预杂交达30分钟,然后,在42℃杂交过夜。用DIG洗涤与阻断缓冲液(Wash and Block Buffer)以及检测试剂盒(Detection kit)(两者都得自Roche Diagnostics)进行检测。
在感光胶片上显出检测的结果。用图像分析软件Adobe Photoshop(Adobe),将所述结果的图像收入图像分析仪Model GS-700ImagingDensitometer(BioRed)中。用图像分析软件MultiAnalyst(Bio-Red),按照所述软件所附的说明书,来测量与分析所述信号的强度。根据数字表示的DIG信号强度,来测定基因在枯草芽孢杆菌各个生长期的表达信号。结果,有在培养3小时后观测到强表达信号的基因,有在培养5小时后观测到强表达信号的基因等等。因此,显示出所述可读框的表达方式显然是互不相同的。
为了更详细地研究表达信号的差异,通过用培养3小时后的表达信号除培养4或5小时后的表达信号计算相对表达水平的比率,来确定表达水平的生长期特异性。在表2中显示了有代表性基因的结果。
表2
正如从表2中所看到的,在培养5小时后即在稳定期期间,有表达水平显著升高的基因。
实施例3:稳定期特异性启动子的筛选
为了筛选稳定期特异性的启动子,如实施例1和实施例2中所述,进行了两轮相应的筛选;根据结果,来总体判断表达水平在培养5小时后即在稳定期期间显著升高的基因,且挑选出下面的23种基因,并将其用于下面的实验;所述基因为:acoA、acoL、iolJ、sigF、sipW、spoIIB、spoIIIAH、spoIVA、yabS、ybcO、ybcP、ybcQ、ybcS、ybcT、ybdA、ybdD、yfiA、ygaB、yjdB、yngJ、yobH、yqxA以及yrzE。
通过连接外源基因到来自所述23种以稳定期特异性方式表达的基因、推测含有所述基因的启动子区的DNA片段上,构建外源基因表达用的载体,进行稳定期特异性启动子的筛选。
使用市售的用于凝胶纯化和质粒纯化的酶以及用于凝胶纯化和质粒纯化的试剂盒,来构建所述基因表达用载体。除非另有说明,按照Molecular cloning,A laboratory manual 2nd(Sambrook等,1989,ColdSpring Harbor Laboratory Press)中描述的方法,进行操作。
为了扩增包含以稳定期特异性方式表达的所述23种基因之上游区的、大约180bp的DNA片段,设计了总共46种引物。所述DNA片段中的所述区位于所述基因SD序列的上游,且推测这些区包含启动子。根据实施例1中描述的枯草芽孢杆菌基因组数据库(http://genolist.pasteur.fr/SubtiList/genome.cgi)的序列,来进行设计。另外,为了简化扩增后的操作,在所设计的各个引物的两侧,添加了限制性内切酶KpnI和EcoRI的位点。
准备从中扩增推测含有启动子区的DNA片段的基因、扩增用的引物以及显示所述引物序列的SEQ ID NO(在园括号中)如下:acoA基因,引物aAF1(SEQ ID NO:7)和aAR1(SEQ ID NO:8);spoIIB基因,引物spBF1(SEQ ID NO:9)和spBR1(SEQ ID NO:10);ybcO基因,引物ybOF1(SEQ ID NO:11)和ybOR1(SEQ ID NO:12);yjdB基因,引物yjBF1(SEQ ID NO:13)和pjBR1(SEQ ID NO:14);yngJ基因,引物ynJF1(SEQ ID NO:15)和ynJR1(SEQ ID NO:16);以及yrzE基因,引物yrEF1(SEQ ID NO:17)和yrER1(SEQ ID NO:18)。
用ISOPLANT试剂盒(Nippon Gene),按照所述试剂盒所附的说明书,由枯草芽孢杆菌DB104(Gene,83:215-233(1989))制备基因组DNA。
用作为模板的所述基因组DNA与如上所述设计的引物,如下进行PCR:94℃达30秒、50℃达1分钟以及72℃达1分钟的循环20个。
在下面,使用如上所述扩增的、推测含有启动子的23种DNA片段。
将来源于WO 98/56926中描述的激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)的超耐热蛋白酶PFUS的基因,用作用来筛选稳定期特异性启动子的外源基因。
枯草芽孢杆菌DB104/pSPO124ΔC(FERM BP-6294)是一株WO98/56926中描述的含有质粒pSPO124ΔC的菌株,质粒pSPO124ΔC包含超耐热蛋白酶PFUS的基因。在5ml含有10μg/ml卡那霉素的LB培养基中,于37℃培养枯草芽孢杆菌DB104/pSPO124ΔC过夜。然后用QIAGEN Plasmid Mini试剂盒(Qiagen),按照所述试剂盒所附的说明书,由所收集的细胞制备出质粒pSPO124ΔC。在这种情况下,于37℃处理悬浮于添加了4mg/ml浓度的溶菌酶的缓冲液P1中的细胞达30分钟;缓冲液P1是所述试剂盒所附的缓冲液。
用作为模板的质粒pSPO124ΔC和引物PLF1(SEQ ID NO:19)与PLR1(SEQ ID NO:20),通过PCR,扩增一种5448bp的DNA片段。所述片段不仅包含所述SD序列以及编码来自枯草芽孢杆菌的枯草蛋白酶之aprE基因的分泌信号,而且包含超耐热蛋白酶PFUS的结构基因。在下面,将这种片段用作载体片段。
作为一个实例,下面描述了关于包含yngL基因之启动子区的DNA片段的操作。
用限制性内切酶KpnI和EcoRI(两者都来自Takara Shuzo)消化所扩增的、推测包含yngJ基因之启动子区的DNA片段,并将其纯化。将所述DNA片段与用限制性内切酶KpnI和EcoR I消化的载体片段混合,并使其连接。用所述反应混合物转化枯草芽孢杆菌DB104。将转化的细胞涂布在含有1%脱脂乳和10μg/ml卡那霉素的LB平板上。在37℃保温所述平板达16小时。
为了从所产生的卡那霉素抗性转化子中选择出其中插入了所述180bp DNA片段的克隆,设计了可用来扩增含有所述启动子区的DNA片段的引物UBF1(SEQ ID NO:21)和SBPR1(SEQ ID NO:22)。用这两种引物的组合以及TaKaRa Ex Taq(Takara Shuzo),在含有1mM PMSF的反应混合物中如下进行PCR:94℃达30秒、55℃达1分钟以及72℃达1分钟的循环20个。
如此,选择出其中插入了所述180bp DNA片段的克隆。由所选的转化子制备质粒,并将其称为pND20。
对其它22种DNA片段进行类似的操作。于是,在得到了转化子的克隆之中,得到了启动子序列不同于pND20中的启动子序列的18个克隆。由所述这些转化子制备了总计19类的质粒。
实施例4:用稳定期特异性表达载体生产超耐热蛋白酶
(1)用包含超耐热蛋白酶PFUS之基因的质粒转化的枯草芽孢杆菌细胞的培养及粗酶溶液的制备
枯草芽孢杆菌DB104/pND20是通过将实施例3中制备的包含超耐热蛋白酶PFUS基因的质粒pND20引入到枯草芽孢杆菌DB104中而产生的菌株。在37℃于1ml含有10μg/ml卡那霉素的TKRBS1培养基(20mg/ml的聚胨、2mg/ml的酵母膏、10mg/ml的肉膏、40mg/ml的葡萄糖、20μg/ml的FeSO4·7H2O、20μg/ml的MnSO4·5H2O以及2μg/ml的ZnSO4·7H2O)中,培养枯草芽孢杆菌DB104/pND20。在开始培养后4、7、10或13天,收集100μl的培养物。在95℃加热所述培养物达30分钟,然后离心收集上清液。将所述上清液用作粗酶溶液。
使用含有其它18种质粒中的一种的枯草芽孢杆菌DB104,以类似的方式制备粗酶溶液。
(2)生产超耐热蛋白酶之能力的比较
通过光谱测量由使用Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA(Sigma)作为底物的酶之水解反应产生的对硝基苯胺,来确定超耐热蛋白酶PFUS的活性。
具体地讲,用100mM的磷酸缓冲液(pH 7.0)适当地稀释准备测定酶活性的酶制剂。将50μl在100mM磷酸缓冲液(pH 7.0)中含有1mM浓度的Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NA的溶液加入到50μl样品溶液中。让混合物在95℃反应30分钟。然后,在冰上使所述反应混合物冷却而终止反应。测量在405nm的吸光度,从而确定所产生的对硝基苯胺的量。
将所述酶的一个单位定义为在95℃时1分钟内产生1μmol对硝基苯胺的酶量。
假定超耐热蛋白酶PFUS的比活为9.5单位/mg蛋白,则根据所测定的酶活性来计算表达的酶蛋白的量。
用实施例4-(1)中制备的粗酶溶液作为酶制剂,测定超耐热蛋白酶的活性。结果,用六种质粒(pND1、pND6、pND10、pND19、pND20、pND23),观测到超耐热蛋白酶PFUS的表达。在SEQ ID NOS:1-6中,显示了结合到这六种质粒中的启动子区的核苷酸序列。在表3中显示了用这六种质粒而观测到的表达水平。在表3中,结果以规定用枯草芽孢杆菌DB104/pSPO124ΔC所观测到的表达水平为1时的相对值表示。
表3
正如从表3中所看到的,与使用pSPO124ΔC所观测到的表达水平相比,使用pND6、pND10和pND20,观测到超耐热蛋白酶PFUS表达水平升高(pND6,大约1.2倍;pND10,大约1.5倍或更高;pND20,大约2倍或更高)。使用pND6,则在培养早期的第4天,几乎没观测到超耐热蛋白酶PFUS的表达。在培养晚期的第10天,所述表达水平则高于使用pSPO124ΔC所观测到的表达水平。
至于用以观测到超耐热蛋白酶PFUS表达的质粒,在表4中显示了按天计算的达到超耐热蛋白酶PFUS最高表达水平的培养期和生产力以及启动子所来源的基因名称。表4中的生产力以每升培养基中的mg量来表示。
表4
正如从表4中所看到的,与pSPO124ΔC的结果相比,使用pND6、pND10和pND20,则在较短的培养期(以天计算)内生产出较大量的超耐热蛋白酶PFUS。
实施例5:用稳定期特异性表达载体生产碱性蛋白酶、硝基苯磷酸酶、吡咯烷酮羧肽酶和甲硫氨酰氨肽酶
(1)载体的制备
通过PCR,扩增除去了作为报道基因的蛋白酶PFUS基因的区域,即扩增包含启动子区、SD序列、分泌信号以及所述载体的区域。在所述PCR中,使用引物NDF1(SEQ ID NO:23)与NDR1(SEQ ID NO:24),而且使用上面实施例3中构建的质粒pND1、pND6、pND10、pND19和pND23中的一种或pSPO124ΔC(对照)作为模板。用限制性内切酶SpeI和MluI(两者都得自Takara Shuzo)消化所扩增的片段,并将其纯化。在下面,将这些片段用作载体片段。
(2)报道基因的制备及表达载体的构建
(i)碱性蛋白酶基因
从National Institute of Technology and Evaluation得到含有来自超级嗜热菌Aeropyrum pernix K1的碱性蛋白酶基因的质粒A2GR7310。通过用所述质粒作为模板以及用引物AP1F1(SEQ ID NO:25)与AP1R1(SEQ ID NO:26)进行PCR,来扩增编码碱性蛋白酶的区域。用限制性内切酶SpeI和MluI(两者都得自Takara Shuzo)消化所扩增的片段,并将其纯化。在下面,将这片段用作报道基因片段。
在SEQ ID NO:33中,显示了来自A.pernix、用作报道基因的碱性蛋白酶基因的核苷酸序列。
通过将报道基因片段分别连接到来源于pND6、pND10和pSPO124ΔC的载体片段上而获得的重组质粒(表达载体),则相应地被称为pND6A1、pND10A1和pSPOA1。
(ii)硝基苯磷酸酶基因
从National Institute of Technology and Evaluation得到含有来自超级嗜热菌Aeropyrum pernix K1的硝基苯磷酸酶基因的质粒A2GR0030。通过用所述质粒作为模板以及用引物AP7F1(SEQ IDNO:27)与AP7R1(SEQ ID NO:28)进行PCR,来扩增编码硝基苯磷酸酶的区域。用限制性内切酶SpeI和MluI(两者都得自Takara Shuzo)消化所扩增的片段,并将其纯化。在下面,将这片段用作报道基因片段。
在SEQ ID NO:34中,显示了来自A.pernix的、被用作报道基因的硝基苯磷酸酶基因的核苷酸序列。
通过将所述报道基因片段分别连接到来源于pND10、pND23和pSPO124ΔC的载体片段上而获得的重组质粒(表达载体),则相应地被称为pND10A7、pND23A7和pSPOA7。
(iii)吡咯烷酮羧肽酶基因
从National Institute of Technology and Evaluation获得含有来自超级嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的吡咯烷酮羧肽酶基因的质粒2708。通过用所述质粒作为模板以及用引物PH1F1(SEQ ID NO:29)与PH1R1(SEQ ID NO:30)进行PCR,来扩增编码吡咯烷酮羧肽酶的区域。用限制性内切酶SpeI和MluI(两者都得自Takara Shuzo)消化所扩增的片段,并将其纯化。在下面,将这片段用作报道基因片段。
在SEQ ID NO:35中,显示了来自P.horikoshii的、被用作报道基因的吡咯烷酮羧肽酶基因的核苷酸序列。
通过将所述报道基因片段分别连接到来源于pND10、pND19和pSPO124ΔC的载体片段上而获得的重组质粒(表达载体),则相应地被称为pND10P1、pND19P1和pSPOP1。
(iv)甲硫氨酰氨肽酶基因
从National Institute of Technology and Evaluation获得一种来自超级嗜热菌Pyrococcus horikoshii OT3的甲硫氨酰氨肽酶基因的PCR扩增片段PH0628PCR。通过用所述片段作为模板以及用引物PH2F1(SEQID NO:31)与PH2R1(SEQ ID NO:32)进行PCR,来扩增编码甲硫氨酰氨肽酶的区域。用限制性内切酶SpeI和MluI(两者都得自Takara Shuzo)消化所扩增的片段,并将其纯化。在下面,将这一片段用作报道基因片段。
在SEQ ID NO:36中,显示了来自P.horikoshii的、被用作报道基因的甲硫氨酰氨肽酶基因的核苷酸序列。
通过将所述报道基因片段分别连接到来源于pND1、pND19和pSPO124ΔC的载体片段上而获得的重组质粒(表达载体),则相应地被称为pND1P2、pND19P2和pSPOP2。
(3)转化子的制备及报道基因的表达
用在实施例5-(2)中构建的各种表达载体,转化枯草芽孢杆菌DB104。将转化的细胞涂布在含有1%脱脂乳和10μg/ml卡那霉素的LB平板上。在37℃保温所述平板达16小时。
从所产生的卡那霉素抗性转化子中,选择出其中插入了编码所述酶的基因之一的克隆;并在37℃于1ml含有10μg/ml卡那霉素的TKRBS1培养基中培养。将培养10天(在碱性蛋白酶的情况下只培养7天)后收集的培养物于95℃加热30分钟,并离心收集上清液。将所述上清液用作粗酶溶液(酶制剂)。
(4)活性的测定
(i)碱性蛋白酶
用明胶(Nacalai Tesque)作为底物,如下测定碱性蛋白酶的活性。
用50mM的磷酸钠缓冲液(pH 7.0)适当地稀释准备测定酶活性的酶制剂。使所述稀释液与SDS-PAGE加样缓冲液混合。让所述混合物于室温静置30分钟或更长时间,然后,使其在含有SDS和0.05%明胶的10%聚丙烯酰胺凝胶上电泳。电泳后,用50mM的磷酸钠缓冲液(pH7.0)洗涤所述凝胶。使经洗涤的凝胶在95℃于50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)中保温达3小时。然后,在冰上冷却所述反应混合物以终止反应。用考马斯蓝使所述凝胶着色。运用图像分析软件Adobe Photoshop(Adobe),将所述凝胶的图像转变成图像文件;且使用NIH图像软件,用数字来表示活性信号。
(ii)硝基苯磷酸酶
用对硝基苯磷酸(Sigma)作为底物,如下测定硝基苯磷酸酶的活性。
用含有1mM ZnCl2的100mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5),适当地稀释准备测定酶活性的酶制剂。将50μl在含有1mM ZnCl2的100mM
Tris-HCl缓冲液(pH7.5)中含有浓度2mM的对硝基苯磷酸的溶液加到50μl样品溶液中。使所述混合物在95℃反应10分钟。然后,在冰上冷却所述反应混合物以终止反应。用Piper Phosphate Assay Kit(试剂盒)(Molecular Probe),通过测量由于544nm的激发而产生的590nm的荧光发射,来测定所产生的游离磷酸的量。
(iii)吡咯烷酮羧肽酶
用焦谷氨酸4-甲基-香豆满基(coumaryl)-7-酰胺(在下文称之为Pyr-MCA;Peptide Institute)作为底物,如下测定吡咯烷酮羧肽酶的活性。
用含有10mM DTT与1mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH7.0),适当地稀释准备测定酶活性的酶制剂。将50μl在含有10mM DTT与1mM EDTA的50mM磷酸缓冲液(pH7.0)中含有浓度0.2mM的Pyr-MCA的溶液加到50μl样品溶液中。使所述混合物在95℃反应30分钟;然后,在冰上冷却所述反应混合物以终止反应。通过测量由于355nm的激发而导致的460nm的荧光发射,来测定所产生的MCA的量。
将所述酶的一个单位定义为在95℃1分钟内产生1μmol的MCA的酶量。
(iv)甲硫氨酰氨肽酶
用Met-Ala-Ser(Bachem)作为底物,如下测定甲硫氨酰氨肽酶的活性。
用含有0.5mM CoCl2的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5),适当地稀释准备测定酶活性的酶制剂。将45μl在含有0.5mM CoCl2的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)中含有浓度1mM的Met-Ala-Ser的溶液加到5μl样品溶液中。使所述混合物在75℃反应5分钟。然后,在冰上冷却所述反应混合物,并向其中加入10μl100mM的EDTA而终止所述反应。向所述混合物中加入50μl的混合物A(含有0.18mg/ml L-氨基酸氧化酶、50μg/ml过氧化物酶和0.18mg/ml邻联二茴香胺的100mM磷酸钾缓冲液(pH7.5))。使所述混合物在37℃反应10分钟。然后,在冰上冷却所述反应混合物以终止反应。测定在450nm的吸光度。
(5)生产能力的比较
根据如实施例5-(4)中所述而测定的酶制剂的酶活性,来计算培养物中所包含的总的酶活性。
将使用具有aprE基因启动子的表达载体(pSPOA1、pSPOA7、pSPOP1或pSPOP2)所观测到的表达水平规定为1。在表5中显示了各种表达载体的相对表达水平。
表5
工业应用性
本发明提供无需诱导基因表达而能够以稳定期特异性方式高水平表达基因的启动子。
序列表的独立文本
SEQ ID NO:1:pND1上的启动子区。
SEQ ID NO:2:pND6上的启动子区。
SEQ ID NO:3:pND10上的启动子区。
SEQ ID NO:4:pND19上的启动子区。
SEQ ID NO:5:pND20上的启动子区。
SEQ ID NO:6:pND23上的启动子区。
SEQ ID NO:7:用于扩增acoA基因的启动子序列的引物aAF1。
SEQ ID NO:8:用于扩增acoA基因的启动子序列的引物aAR1。
SEQ ID NO:9:用于扩增spoIIB基因的启动子序列的引物spBF1。
SEQ ID NO:10:扩增spoIIB基因的启动子序列的引物spBR1。
SEQ ID NO:11:用于扩增ybcO基因的启动子序列的引物ybOF1。
SEQ ID NO:12:用于扩增ybcO基因的启动子序列的引物ybOR1。
SEQ ID NO:13:用于扩增yjdB基因的启动子序列的引物yjBF1。
SEQ ID NO:14:用于扩增yjdB基因的启动子序列的引物yjBR1。
SEQ ID NO:15:用于扩增yngJ基因的启动子序列的引物ynJF1。
SEQ ID NO:16:用于扩增yngJ基因的启动子序列的引物ynJR1。
SEQ ID NO:17:用于扩增yrzE基因的启动子序列的引物yrEF1。
SEQ ID NO:18:用于扩增yrzE基因的启动子序列的引物yrER1。
SEQ ID NO:19:引物PLF1。
SEQ ID NO:20:引物PLR1。
SEQ ID NO:21:引物UBF1。
SEQ ID NO:22:引物SBPR1。
SEQ ID NO:23:引物NDF1。
SEQ ID NO:24:引物NDR1。
SEQ ID NO:25:用于扩增碱性蛋白酶基因编码区的引物AP1F1。
SEQ ID NO:26:用于扩增碱性蛋白酶基因编码区的引物AP1R1。
SEQ ID NO:27:扩增硝基苯磷酸酶基因编码区的引物AP7F1。
SEQ ID NO:28:扩增硝基苯磷酸酶基因编码区的引物AP7R1。
SEQ ID NO:29:扩增吡咯烷酮羧肽酶基因编码区的引物PH1F1。
SEQ ID NO:30:扩增吡咯烷酮羧肽酶基因编码区的引物PH1R1。
SEQ ID NO:31:扩增甲硫氨酰氨肽酶基因编码区的引物PH2F1。
SEQ ID NO:32:扩增甲硫氨酰氨肽酶基因编码区的引物PH2R1。
Claims (10)
1.一种分离的DNA,所述分离的DNA由SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成,且在革兰氏阳性细菌中以稳定期特异性方式显示出启动子活性。
2.一种重组DNA,其中由权利要求1限定的DNA和外源基因的配置使得所述外源基因可以表达,其中所述外源基因置于由权利要求1限定的DNA的下游。
3.按照权利要求2的重组DNA,其中所述外源基因为选自编码蛋白质的核酸、编码反义RNA的核酸以及编码核酶的核酸。
4.一种基因表达用载体,所述载体包含由权利要求1限定的DNA。
5.按照权利要求4的基因表达用载体,其中所述载体是选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体的一种载体。
6.一种表达载体,所述表达载体包含由权利要求2限定的重组DNA。
7.按照权利要求6的表达载体,其中所述载体是选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体的一种载体。
8.一种转化细胞,所述转化细胞含有由权利要求2限定的重组DNA或由权利要求6限定的表达载体。
9.一种用于生产蛋白质的方法,所述方法包括:
培养由权利要求8限定的转化细胞;并且
从所产生的培养物中收集蛋白质。
10.一种用于生产蛋白质的试剂盒,所述试剂盒含有由权利要求1限定的DNA或由权利要求4限定的表达基因用载体。
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