WO2002046368A1 - Liquide de conservation de cellules et procede de conservation de cellules dans lequel ledit liquide est utilise - Google Patents

Liquide de conservation de cellules et procede de conservation de cellules dans lequel ledit liquide est utilise Download PDF

Info

Publication number
WO2002046368A1
WO2002046368A1 PCT/JP2001/010389 JP0110389W WO0246368A1 WO 2002046368 A1 WO2002046368 A1 WO 2002046368A1 JP 0110389 W JP0110389 W JP 0110389W WO 0246368 A1 WO0246368 A1 WO 0246368A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
cell
preservation solution
cell preservation
preservation
Prior art date
Application number
PCT/JP2001/010389
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kenzou Bamba
Yasuyuki Kuroiwa
Teruaki Sekine
Original Assignee
Humantec Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Humantec Ltd. filed Critical Humantec Ltd.
Priority to AU18486/02A priority Critical patent/AU1848602A/en
Priority to CA002399423A priority patent/CA2399423A1/en
Priority to DE60116673T priority patent/DE60116673T2/de
Priority to EP01999633A priority patent/EP1347040B1/en
Publication of WO2002046368A1 publication Critical patent/WO2002046368A1/ja

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents

Definitions

  • the present invention relates to a cell preservation solution containing purified albumin and dimethyl sulfoxide and a method for preserving cells using the preservation solution, and aims to improve the percentage of revived effective cells after storage.
  • Background technology :
  • Cell preservation solutions and preservation methods are not uniform depending on the type of cells from which they are derived.
  • cells such as microorganisms, generally 1
  • the microorganisms are suspended in a culture medium for microorganisms containing about 0% glycerol and stored at low temperature, or the microorganisms themselves are stored in a lyophilized state.
  • the cells are generally suspended in a culture solution containing fetal bovine serum supplemented with about 10% dimethyl sulfoxide, pre-cooled, and then placed in a liquid nitrogen storage. It is stored and saved.
  • a phosphate buffer containing albumin alone is used as a preservative solution.
  • a type containing serum for example, a serum containing dimethyl sulfoxide is contained in a culture solution.
  • Cell preservatives are known.
  • a serum-free type is known in which carboxymethylcellulose is contained in a cell preservation solution instead of serum (Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-46840).
  • a cell preservation solution containing serum is often used.
  • a preservation solution for mammalian cells can be used to preserve microbial cells and germ cells, which are easier to preserve than mammalian cells. Also do It has been done.
  • the serum-containing cell preservation solution contains not only various site-inducing factors and hormones as serum-containing components, but also amino acids and various ions.
  • the properties of the preserved cells may be changed, and there is also the problem of the effects of unknown viruses that may be contained in serum. are doing.
  • the properties of stored cells may be changed, the risk of contamination with unknown viruses, and the components of the preservation solution are unclear. It is difficult to ensure quality stability from the beginning.
  • the present invention provides a cell preservation solution which does not contain both serum and culture solution, has clear components and has excellent cell preservation performance, and preservation of cells using the preservation solution. Disclosure of invention c to provide a method:
  • the present invention provides a cell preservation solution containing purified albumin and dimethylsulfoxide.
  • a purified albumin can be derived from the seaweed. It can also contain sugars in addition to purified albumin and dimethyl sulfoxide.
  • the sugar may be a monosaccharide.
  • the sugar in the cell preservation solution of the present invention may be glucose. It can contain phosphate ions in addition to purified albumin and dimethyl sulfoxide, or can contain metal ions in addition to purified albumin and dimethyl sulfoxide.
  • the metal ion is a divalent metal ion. Is also good.
  • the method for storing cells of the present invention uses a cell preservation solution as described above, suspends the cells in the cell preservation solution, dispenses the cells into a plurality of cell storage containers, and freeze-preserves them without preliminary freezing. I did it.
  • Storage method of this cell the cell is stored aliquoted into cells coercive in presence container is suspended from 1 X 1 0 3 in cell preservation solution such that 1 X 1 0 8 or Z m 1 It can be stored frozen.
  • serum-containing cell preservation solutions have the potential to change the properties of stored cells, and risk of contamination with unknown viruses, and because the components of the preservation solution are unclear, the quality is high. Since there are various problems such as difficulty in stabilizing, in the present invention, in order to avoid these problems altogether, both serum and culture medium are not included, and the components have clear and excellent cell storage performance. A cell preservation solution having the same and a cell preservation method using the preservation solution were developed, and various experiments were repeated.
  • albumin contained in phosphate buffer which has been used to store germ cells
  • Serum and culture medium-free cell preservation solution containing a mixture as the main agent and supplements such as phosphate ions, divalent metal ions, and monosaccharides as necessary
  • the present inventors have found that they have excellent cell preservation performance for preserving microbial cells and germ cells, and have realized a cell preservation solution and a cell preservation method using the storage solution according to the present invention.
  • the present invention is characterized in that the present invention contains purified albumin and dimethylsulfoxide as a cell preservation solution, and the dimethylsulfoxide used here is Generally known commercially available products can be used.
  • the amount of dimethyl sulfoxide used when the concentration falls below 0.1% (wZw), the preservation capacity of Faint, and conversely 50 ° / with respect to the total volume of the storage solution. (w / w), the effect does not change, so from the viewpoint of effect and economy, it is within the range of 0.1% (w / w) to 50% (w / w), more preferably 1 to 50%. It is preferably in the range of 20% (w / w).
  • albumin to be used in addition to dimethyl sulfoxide the type of albumin can be selected depending on the type of cells to be preserved.
  • human albumin is used for preserving human cells for human treatment. Is best used.
  • the present invention is not necessarily limited to this, and it is also possible to use those derived from pests or other species.
  • albumin purified by any method can be used. Purified albumin can be used with a purity of about fraction V.
  • the metal ions used in this case are various divalent or trivalent metal ions, and the use of divalent metal ions is particularly preferred. Other examples include calcium ions, magnesium ions, and iron ions. Use of ions, zinc ions, copper ions, aluminum ions, etc., can be considered.
  • the use concentration may be very small, but if it is less than 0.001% (w / w), there is no effect, and conversely, if it exceeds 1% (w / w), it will not be effective. There is no change. Therefore, it is economical to use in a concentration range of 0.0 to 0.000 0 1 to 5% (w / w), more preferably in a concentration range of 0.1 to 5% (w / w). .
  • sugar also improves the viable cell rate (effective cell rate) and the subsequent cultivation efficiency when cells are restored.
  • the sugars used here include various monosaccharides such as glucose, galactose, fructose, ribose, trehalose, and pudose, disaccharides, and trisaccharides. Among them, glucose can be recommended in terms of economy and ease of handling.
  • the amount of addition if the amount is less than 0.1% (w / w), there is no effect, and if the amount exceeds 10% (w / w), the effect does not change. w / w), more preferably 1 to 5% (w / w).
  • phosphate ions can be used as a phosphate buffer, and Dulbecco's phosphate buffer, phosphate buffer and the like can be used.
  • various culture solutions can be used in place of the divalent or trivalent metal ion phosphate buffer described above.
  • the preservation of cells the cells were suspended in a tube for cryopreservation merely an example in cell preservation solution such that a LXL 0 3 and 1 x 1 0 8 pieces / m 1, this Store at 80 degrees Celsius or in liquid nitrogen. In this case, the temperature may be about 14 ° C. to 120 ° C. if storage is for a short period.
  • cells can be suspended in the above-mentioned cell preservation solution, dispensed into a plurality of cell storage containers, and frozen and stored without preliminary freezing.
  • the temperature of the cells suspended in the cell preservation solution can be gradually lowered by a program freezer or the like, but it is also possible to directly lower the temperature and store them.
  • the cryopreserved cells are thawed at room temperature or in a constant temperature bath at 37 ° C, and then centrifuged using a centrifuge. Thereby, the cells and the cell preservation solution can be separated and restored. After the separated cells are washed with an appropriate culture solution or the like, they can be cultured by an ordinary method.
  • the method for evaluating cell storage performance is as follows: cells are suspended in a cell preservation solution, frozen, and stored frozen for several hours to several days, and in some cases for several years, After returning the cryopreserved cells to room temperature, they can be cultured by counting the number of living cells at this time.
  • P3U1 'cells derived from mouse myeloma were RPMI1640 + 7S (Niken Biomedical Research Institute, GM1104) in a carbon dioxide incubator for culture (Hirasa Corporation, CPD-300A).
  • a medium containing 5 ml of O ml and fetal serum (Lifetech Oriental Co., Ltd., 26140-079) Is used as the culture medium, and the culture flask (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
  • the number of cells the number of viable cells were 7. Ox 1 0 5 pieces Zml. Transfer each 5 Oml of the cell suspension to two centrifuge tubes (Nippon Becton Dickinson Co., Ltd., 2070), and centrifuge at 150 rpm for 10 minutes at 20 ° C (stock Company Kokusan, H700FR), P3U1 cells were precipitated. The supernatant is discarded by decantation, and the precipitated cells are uniformly loosened using a test tube mixer (Asahi Techno Glass Co., Ltd., MS-1) so that the cell concentration becomes 4.4 ⁇ 10 6 Zm 1.
  • a cell preservative solution prepared in [1] was suspended so that the cells become uniform, serum tubes (manufactured by Asahi Techno glass Corporation, 2722002) as the total number of cells becomes 4. 4x1 0 6 cells / tube Dispensed. Then, it was placed in a black (Asahi Techno Glass Co., Ltd., 9791-081) and stored at 180 ° C freezer (Sanyo Electric Co., Ltd., MDF-382).
  • the K562 cells which are cells derived from human leukemia, [2.] and cultured Ri by the same operation, was counted the number of cells, cell number is the number of viable cells 7.
  • the present invention contains purified albumin and dimethyl sulfoxide as a cell preservation solution, and to which auxiliary agents such as phosphate ions, divalent metal ions, and monosaccharides are added as necessary.
  • auxiliary agents such as phosphate ions, divalent metal ions, and monosaccharides are added as necessary.
  • a self-prepared cell preservation medium as a preservation medium for other cells, and, like a cell preservation medium containing serum
  • a culture solution containing many components that are not essential for cell preservation, such as amino acids and various ions, in addition to various site components, growth factors, hormones, etc. as serum-containing components.
  • there is no danger of changing the properties of the cells by using a different culture solution for each cell to be cultured, or allowing the contamination of unknown viruses, and in addition, There is no need to use the Kuchi' door of serum.
  • the cell preservation solution of the present invention is particularly suitable for storing mammalian cells, but can also be used for storing protoplasts and other plant cells and germ cells. Furthermore, various cell banks can be efficiently constructed using the cell preservation solution of the present invention.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Description

明細書
細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法 技術分野：
本発明は、 精製アルブミ ンとジメチルスルフォキシドとを含有する細胞 の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法に関し、 保存後における 復活した有効細胞率の向上をはかることを目的とする。 背景技術：
細胞の保存液や保存方法については、 その由来する細胞の種類などによ つて一様ではない。 例えば微生物のような細胞の場合には、 一般的に 1
0 %程度のグリセロールを含む微生物培養用培地中に微生物を懸濁させる とともに、 これを低温下にて保存し、 あるいは微生物自体を凍結乾燥状態 にて保存することがおこなわれている。 また哺乳類細胞の場合において は、 一般的には 1 0 %程度のジメチルスルフォキシドを添加したゥシ胎児 血清を含む培養液中に懸濁し、 これを予備冷却した後、 液体窒素保管庫内 に格納して保存することがおこなわれている。
さらに精子などの生殖細胞の場合にあっては、 アルブミン単体を含ませ たリン酸緩衝液が保存液として用いられる。 また前記した哺乳類細胞保 存の場合には保存液中に血清を含むタイプと含まないタイプとがあり、 血 清を含むタイプのものとしては、 例えば培養液に血清おょぴジメチルスル フォキシドを含有させた細胞保存液が知られる。 また血清を含まないタ イブでは、 細胞保存液中に、 血清に代えてカルボキシメチルセルロースを 含有させたものが知られる （特開平 6 _ 4 6 8 4 0号）。
しかし血清を含まないものは、 細胞保存性能が低く、 また通常の培養液 には血清が含まれるところから、 多くの場合血清を含ませた細胞保存液が 使用される。 また、 一般的に哺乳類細胞は微生物細胞や生殖細胞よりも 保存が困難であることから、 哺乳類細胞に比して保存が容易な微生物細胞 や生殖細胞の保存に際し、 哺乳類細胞の保存液を代用使用することもおこ なわれている。
しかしながら、 血清を含有する保存液にあっては、 特に培養する細胞毎 に異なった培養液が使用されるのみならず、 血清についても細胞毎に異な つたロッ トが使用されることになることから、 自家調製した細胞保存液を 他の細胞の保存液と して使用することは困難である。 またそればかりで なく、 血清含有の細胞保存液にあっては、 血清含有成分と して各種サイ ト 力イ ンゃ增殖因子、 ホルモン等も含まれるのみならず、 アミノ酸や各種ィ オン等をはじめとした、 本来細胞保存に不必要な多くの成分を含む培養液 を用いる結果、 保存細胞の性質を変えるおそれがあり、 さらに血清に含ま れる可能性のある未知のウィルスによる影響の問題をも内在している。
すなわち、 上記したように血清含有の細胞保存液にあっては、 保存して いる細胞の性質を変えるおそれがあること、 および未知ウィルス混入の危 険性、 ならびに保存液成分が不明瞭であることから品質安定を期すること 'が難しい、 といった種々の課題を有する。
しかして、 本発明は、 斯かる問題が全く生じないよう、 血清および培養 液共に含まず、 しかも成分が明瞭かつ優れた細胞保存性能を有する細胞保 存液および該保存液を用いた細胞の保存方法を提供することを目的とする c 発明の開示 ：
本発明は上記ごとき問題を解消するため、 本発明による細胞の保存液は 精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有する。 斯かる精製アル ブミンがゥシ由来とすることができる。 また、 精製アルブミンとジメチル スルフォキシドのほか、 糖を含有することができる。 糖が単糖であっても よい。
また、 本発明の細胞の保存液における糖がグルコースであってもよい。 また、 精製アルブミンとジメチルスルフォキシドのほか、 リン酸イオンを 含有することができ、 あるいは、 精製アルブミンとジメチルスルフォキシ ドのほか、 金属イオンを含有することができる。
更に、 本発明の細胞の保存液は、 金属イオンが 2価金属イオンであって もよい。
また、 本発明の細胞の保存方法は、 上記ごとき細胞の保存液を用い、 こ れに細胞を懸濁させるとともに、 これを複数の細胞保存用容器に分注し、 予備凍結無しで凍結保存するようにした。 この細胞の保存方法は、 細胞保 存用容器中に分注して保存される細胞が、 1 X 1 0 3から 1 X 1 0 8個 Z m 1 となるように細胞保存液中に懸濁し、 凍結保存するようにできる。
本発明の他の目的、 特長は以下の詳細な説明で明らかにする。 発明を実施するための最良の形態：
上記したように血清含有の細胞保存液にあっては、 保存している細胞の 性質を変えるおそれがあること、 および未知ウィルス混入の危険性、 なら びに保存液成分が不明瞭であることから品質安定を期することが難しい、 といった種々の課題を有するところから、 本発明においてはこれらの問題 が全く生じないよう、 血清および培養液共に含まず、 しかも成分が明瞭か つ優れた細胞保存性能を有する細胞保存液および該保存液を用いた細胞の 保存方法を開発し、 種々の実験を重ねた。
その結果、 意外にもこれまで血清含有保存液への添加剤として用いられ てきたジメチルスルフォキシドに対し、 これまで生殖細胞の保存に用いら れているリン酸緩衝液中に含まれるアルブミンを混合したものを主剤とし、 これに必要に応じてリン酸イオンや二価金属イオン、 単糖などの助剤を添 加したところの、 血清および培養液非含有型の細胞保存液が、 哺乳類細胞 をはじめとし、 微生物細胞や生殖細胞などの保存について優れた細胞保存 性能を有することを見出し、 本発明による細胞の保存液および該保存液を 用いた細胞の保存方法を実現した。
この本発明ついて具体的に説明すると、 本発明は細胞の保存液として精 製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有することを特徴とするも のであるが、 ここで使用されるジメチルスルフォキシドは一般的に知られ ている市販のものを用いることができる。 ジメチルスルフォキシドの使 用量については、 濃度が 0 . 1 % ( w Z w ) を下回ると細胞の保存能力が 薄れ、 また反対に保存液全量に対して 5 0 °/。 (w/w) を超えても効果が 変わらないので、 効果と経済性の面からみて 0. 1 % (w/w) 〜 5 0 % (w/w) の範囲内、 さらに好ましくは 1〜 2 0 % (w/w) の範囲内で あるのが好ましい。
さらにジメチルスルフォキシドに添加して使用されるアルブミンとして は、 保存する細胞の種類如何によってアルブミンの種類も選択できるが、 一般的にはヒ ト治療用のヒ ト細胞の保存にはヒ トアルブミンの使用が最良 である。 しかし必ずしもこれに限られるものではなく、 この他にもゥシ あるいは他の種に由来するものであっても使用できる。 またアルプミン はどのような方法で精製されたものであっても使用できる。 精製アルブ ミンとしては、 純度がフラクション V程度で使用可能である。
アルブミンの使用濃度については、 0. 0 0 1 %(w/w) を下回ると効果 がなく、 また逆に 2 5 %(w/w) を超えても効果は変わらない。 したがつ て 0. 0 0 1 %〜 2 5 % (w/w) の範囲で使用でき、 さらに好ましくは 0. 1 - 5 %(w/w) の範囲が経済性や取り扱い性の面で良好である。
また金属イオンは、 これを添加することにより細胞を復元した際の生細 胞率 （有効細胞率） およびその後の培養効率が良好となる。 この場合に 使用される金属イオンとしては、 二価あるいは三価の各種金属イオンであ り、 とりわけて二価の金属イオンの使用が好ましいが、 これ以外にも例え ばカルシウムイオン、 マグネシウムイオン、 鉄イオン、 亜鉛イオン、 銅ィ オン、 アルミニウムイオン等の使用が考えられる。 またその使用濃度に ついては、 微量でよいが、 0. 0 0 0 0 0 0 1 % (w/w) を下回ると効果が 無く、 また反対に 1 % (w/w) を超えても効果に変わりがない。 したがつ て 0. 0 0 0 0 0 0 1〜 5 % (w/w) の濃度範囲、 さらに好ましくは 0. 1 〜 5 % (w/w) の濃度範囲での使用が経済的である。
さらに糖は、 これを添加することにより、 やはり細胞を復元した際の生 細胞率 （有効細胞率） およびその後の培養効率が向上する。 ここで使用 される糖と してはグルコース、 ガラク トース、 フルク トース、 リボース、 ト レハロース、 プドウ糖等をはじめとした各種の単糖類、 二糖類、 三糖類 が考えられ、 なかでもグルコースが経済性や扱い易さの点で推奨できる。 添加量については、 0 . 1 % (w/w) に満たないと効果がなく、 また 1 0 % (w/w) を超えても効果が変わらないところから、 0 . 1〜1 0 % (w/w) の濃度範囲、 さらに好ましくは 1〜5 % (w/w) の濃度範囲がよい。
さらにリン酸イオンは、 リ ン酸緩衝液と して用いることができ、 ダルべ ッコリン酸緩衝液、 リン酸緩衝液などの使用が可能である。 また既述し た二価あるいは三価の金属イオンゃリ ン酸緩衝液の代わりに各種の培養液 を使用することも可能である。 さらに細胞の保存と しては、 一例を挙げ れば低温保存用のチューブ中に細胞を l x l 0 3から 1 x 1 0 8個 / m 1 と なるように細胞保存液中に懸濁し、 これを摂氏一 8 0度あるいは液体窒素 中に保存する。 なおこの場合、 保存が短期間であれば一 4 °C〜一 2 0 °C 程度でもよい。 また前記した細胞の保存液を用い、 これに細胞を懸濁さ せるとともに、 これを複数の細胞保存用容器に分注し、 予備凍結無しで凍 結保存することができる。
また保存に際し、 細胞保存液に懸濁した細胞は、 プログラムフリーザー などにより徐々に温度を下げることもできるが、 直接急速に低温化して保 管することも可能である。 さらに凍結保存された細胞の復元について述 ベると、 低温保存された細胞を室温あるいは 3 7 °Cの恒温槽内にて融解さ せ、 さらにこれを遠心分離機を用いた遠心分離などの操作により、 細胞と 細胞保存液とを分離して復元させることができる。 また分離した細胞は 適当な培養液などで洗浄後、 通常の方法により培養をおこなうことができ る。
なお細胞の保存性能について評価する方法について述べれば、 細胞保存 液中に細胞を懸濁し、 これを凍結した後、 数時間から数日間、 また場合に よっては数年にわたって凍結のまま保存するとともに、 本凍結保存細胞を 室温に戻した後、 培養し、 この時に生きている細胞数を計測することによ りおこなうことができる。
【実施例】
本発明を実際に実施した例を以下に詳しく説明する 〔 1 . 細胞保存液の調製〕
電子天秤 （東京硝子器機株式会社、 416-65-81-01) により、 炭酸水素ナ トリ ウム （和光純薬工業株式会社、 191-01305 試薬特級） を 1 . 8 g、 D (+) グルコース （和光純薬工業株式会社、 041-00595 試薬特級） を 3 0 0 g、 H E P E S (株式会社同仁化学研究所、 324-01375 試薬特級） を 3 . 6 g、 P B S (-) 粉末 （日水製薬株式会社、 05913 ) を 9 6 gそれぞれ秤量 し、 1 0リットルのビーカー （旭テクノグラス株式会社、 1000BK10000) に 入れた。
さらに 1 0リットルメスシリ ンダー （株式会社サンプラテック、 1079) で注 射用水 （光製薬株式会社） 8リットルを秤量し、 前記した 1 0リットルのビーカー 内に加え、 これをマグネテイクスターラー (旭テクノグラス株式会社、 BS-38) で攪拌、 溶解した。 さ らに 2リットルメスシリ ンダー （旭テクノグ ラス株式会社、 3022CYL2000S) で D M S O (ナカライテスタ株式会社、
134- 07) 1リットルを秤量し、 これを前記した 1 0リットルのビーカー内に加え、 マグネティクスターラーで撹拌した。
溶解後、 電子天秤で、 塩化カルシウム （和光純薬工業株式会社、
039-00475 ) を l g 、塩化マグネシウム六水和物（和光純薬工業株式会社、
135- 00165 ) を l g それぞれ秤量し、 これらを前記 1 0リットルのビーカ一内 に加え、 マグネティ ックスターラー (旭テクノグラス株式会社、 BS-38 ) で撹拌し、 溶解した。 B S A (シグマアルドリ ッチジャパン株式会社、 A-2934) を 1 0 0 g秤量し、 これを前記 1 0リットル のビーカー内に入れた。 溶解後、 注射用水で 1 0 !)ットル までメスアップして十分に溶解した後、 スパ ィラルキャップ P F (日本ジュネティクス株式会社、 12981 ) でろ過し、 細胞保存液を調製した。
〔2 . P3U1細胞を用いた細胞保存液の細胞保存性能の確認〕
あらかじめ、 マウスミエローマ由来の細胞である P3U1'細胞を、 培養用 炭酸ガスィンキュベータ （株式会社ヒラサヮ、 CPD-300A)内で、 RPMI1640 + 7S (株式会社日研生物医学研究所、 GM1104) 4 5 O mlとゥシ胎児血清 (ライフテックオリェンタル株式会社、 26140-079 ) を 5 O ml混ぜた培地 を培養用培地と し、 培養用フラスコ （住友ベーク ライ ト株式会社、
MS-2080R) で培養しておいた。
その P3U1 細胞浮遊液から 1 Ομ ΐ をピペッ ト （株式会社二チリ ョー、 ΝΡΧ-20) で取り出し、 あらかじめト リパンブルー溶液 (シグマアルドリ ッ チジャパン株式会社、 Τ-8154) 20μ1 を入れておいた 5 0 Ομ ΐチューブ（旭 テクノグラス株式会社、 12301MTB0.5 ) に入れ、 軽く撹拌したあと、 血 球計算版 （エルマ販売株式会社、 03-202-2) に溶液の一部を乗せ、 倒立顕 微鏡 （ォリ ンパス光学工業株式会社、 CK-2) 下で細胞数を数えた。
細胞数は生細胞数が 7. Ox 1 05個 Zml であった。 その細胞浮遊液 5 Omlづっを遠心管 （日本べク トン .ディッキンソン株式会社、 2070) 2 本にそれぞれ移し、 1 5 0 0 r p mで 1 0分間、 2 0°Cの条件下で遠心し (株式会社コクサン、 H700FR)、 P3U1 細胞を沈殿させた。 上澄みをデ カンテーシヨンで捨て、 沈殿した細胞を試験管ミキサー （旭テクノグラス 株式会社、 MS-1) を用いて細胞を均一にほぐし、 細胞濃度が 4. 4x 1 06 個 Zm 1 になるように 〔1.〕 で作製した細胞保存液で、 細胞が均一になる ように懸濁し、 セラムチューブ (旭テクノグラス株式会社、 2722002 ) に 総細胞数が 4. 4x1 06個/チューブとなるように分注した。 その後、 チ ユーブラック (旭テクノグラス株式会社、 9791-081) に入れ、 一 8 0°Cフ リーザ一 （三洋電機株式会社、 MDF-382 ) に保存した。
〔3. 凍結保存した P3U1細胞の取り出しと復活化〕
〔2.〕 で保存した P3U1 細胞を保存してから 1年後に、 一 8 0°Cフ リ 一ザ一から取り出し、あらかじめ 3 7 °Cに温めておいたヒートブロック （タ ィテック株式会社、 TAL-1G) に 4分間入れて溶解した。 クリーンベンチ 内 （三洋電機株式会社、 MCV-131BNF) で 1 5 ml遠沈管 （日本べク トン · ディ ッキンソン株式会社、 2095) に洗浄用培地 （株式会社日研生物医学研 究所、 CM1101) を無菌的に 1 Oml入れ、 そこにヒートプロックで温めて 溶解した P3U1 細胞をスポィ ト （旭テクノグラス株式会社、 SM251-1S) で移し、 雰囲気温度 2 0°C、 回転数 1 2 0 0 r p mの条件下で 5分間遠心 した。 遠心後、 上澄みをデカンテーシヨ ンで捨て、 沈殿した細胞を試験管ミキ サーを用いて細胞を均一にほぐし、 培養用培地 2 mlに懸濁後、 24ゥエル 培養用シャーレ（旭テクノグラス株式会社、 1820-024N )に移した。 P3U1 細胞浮遊液から 1 0m l をピぺッ トで取り出し、 あらかじめトリパンブル 一溶液 20 ml を入れておいた 500 ml チューブに入れ、軽く撹拌したあ と、 血球計算版に溶液の一部を乗せ、 倒立顕微鏡下で細胞数を数えた。 その結果、 保存した P3U1 '細胞の生細胞数 （有効細胞数） は 4. 2x1 06個であり、 細胞保存直前の細胞数が 4。 4 X 1 06個/チューブであつ たことから生細胞率は 9 6 %であることが確認された。 培養 3 日後に顕 微鏡下で観察したところ、 P3U1細胞が増殖している事を確認した。 これ らの結果から本発明の細胞保存液は優れた細胞保存効果を有することがわ かった。
〔4. K562細胞を用いた細胞保存液の細胞保存性能の確認〕
あらかじめ、 ヒ ト白血病由来の細胞である K562 細胞を、 〔2.〕 と同様 の操作によ り培養し、 細胞数を数えたところ、 細胞数は生細胞数が 7. Ox 1 05個/ mlであった。 その細胞浮遊液、 5 Omlを遠心管 （日本べク ト ン - ディ ッキンソン株式会社、 2070) 2本に移し、 雰囲気温度 20°C、 回 転数 1 50 0 r pm、 の条件で遠心分離機 （株式会社コクサン、 H700FR) により 1 0分間遠心し、 K562細胞を沈殿させた。
上澄みをデカンテーシヨ ンで捨て、 沈殿した細胞を試験管ミキサー （旭 テクノグラス株式会社、 MS-1) を用いて細胞を均一にほぐし、 細胞濃度が 3. 0x1 06個 Zmlになるように細胞保存液で、 細胞が均一になるように 懸濁し、 セラムチューブ （旭テクノグラス株式会社、 2722-002) に総細胞 数が 3. Ox 1 06コ /チューブとなるようにした。 その後、 チューブラ ック （旭テクノグラス株式会社、 9791-081) に入れ一 80°Cフリーザー （三 洋電機株式会社、 MDF-382) に保存した。
〔5. 凍結保存した K562細胞の取り出しと復活化〕
〔4 ·〕 で保存した K562 細胞を、 保存してから 1年後に、 〔 3.〕 と同 様に、 取り出しと復活化をおこなった。 その結果、 K562細胞の生細胞数 は 2 . 9 x 1 0 6個であり、 細胞保存直前の細胞数が 3 . 0 x 1 0 6個， ーブであったことから生細胞率は 9 5 %であることが確認された。 次い で 2 4ゥエル培養用シャーレに K562 細胞を移して培養した。 培養 3 [3 後に顕微鏡下で観察したところ、 K562 細胞が増殖している事を確認した。 これらの研究結果から、 本発明の細胞保存液は優れた細胞保存効果を有す ることがわかった。
以上詳述した通り、 本発明は細胞保存液として精製アルブミンとジメチ ルスルフォキシドとを含有し、 またこれに必要に応じてリン酸イオンや二 価金属イオン、 単糖などの助剤を添加するものであるために、 血清および 培養液共に含ませる必要が無く、 その結果自家調製した細胞保存液を他の 細胞の保存液として使用することも可能になり、 また血清含有の細胞保存 液のように、 血清含有成分として各種サイ ト力インや増殖因子、 ホルモン 等のほか、 アミノ酸や各種イオン等をはじめとした、 本来細胞保存に不必 要な多くの成分を含む培養液を用いる必要がないことから、 特に培養する 細胞毎に異なった培養液を使用して細胞の性質を変え、 あるいは未知ウイ ルスの混入を許容したりする危険がなく、 さらには細胞毎に異なった口ッ トの血清を使用する必要がない。
しかも保存液成分が明瞭で品質的にきわめて安定であり、かつ細胞保存性 能に優れた保存液および細胞保存方法を提供することができる。 また本 発明の細胞保存液は、 とくに哺乳類細胞の保存に適するが、 このほかにも プロ トプラス トをはじめとする植物細胞や生殖細胞の保存等にも使用する ことができる。 さらに本発明の細胞保存液を使用して各種細胞バンクを 効率的に構築することも可能である。

Claims

請求の範囲
I . 精製アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含有する細胞の保存 液。
2. 精製アルブミンがゥシ由来のものである請求の範囲 1に記載の細胞 の保存液。
3. 精製アルブミンとジメチルスルフォキシドのほか、 糖を含有すると ころの請求の範囲 1〜 2に記載の細胞の保存液。
4. 糖が単糖であるところの請求の範囲 1〜 3に記載の細胞の保存液。
5. 糖がグルコースであるところの請求の範囲 1〜 3に記載の細胞の保 存液。
6. 精製アルブミンとジメチルスルフォキシドのほか、 リン酸ィオンを 含有するところの請求の範囲 1〜 5に記載の細胞の保存液。
7. 精製アルブミンとジメチルスルフォキシドのほか、 金属イオンを含 有するところの請求の範囲 1〜 5に記載の細胞の保存液。
8. 金属イオンが 2価金属イオンであるところの請求の範囲 7に記載の 細胞の保存液。
9. 精製アルブミンの濃度が 0. 0 1〜 2 5 %(w/w) の範囲内であると ころの請求の範囲 1〜 8に記載の細胞の保存液。
1 0. 精製アルブミ ンの濃度が 0. 1〜 5 %(w/w) の範囲内であるとこ ろの請求の範囲 1〜8に記載の細胞の保存液。
I I . ジメチルスルフォキシドの濃度が 0. 1〜 5 0 % (w/ ) の範 囲内であるところの請求の範囲 1〜 1 0に記載の細胞の保存液。
1 2. ジメチルスルフォキシドの濃度が 1〜 2 0 % (w/w) の範囲内 であるところの請求の範囲 1〜 1 0に記載の細胞の保存液。
1 3. 金属イオンの濃度が 0. 0 0 0 0 0 0 1〜 5 %(w/w) の範囲内で あるところの請求の範囲 1〜 1 2に記載の細胞の保存液。
1 4. 金属イオンの濃度が 0. 1〜 5 %(w/w) の範囲内であるところの 請求の範囲 1〜 1 2に記載の細胞の保存液。
1 5. 糖の濃度が 0. 1〜 1 0 % (w/w) の範囲内であるところの請求の 範囲 1〜 1 4に記載の細胞の保存液。
1 6 · 糖の濃度が 1〜 5 % (w/w) の範囲内であるところの請求の範囲 1 〜 1 4に記載の細胞の保存液。
1 7. 請求の範囲 1〜 1 6に記載の細胞の保存液を用い、 これに細胞を 懸濁させるとともに、 これを複数の細胞保存用容器に分注し、 予備凍結無 しで凍結保存するようにしたことを特徴とした細胞の保存方法。
1 8. 細胞保存用容器中に分注して保存される細胞が、 l xl O 3から 1 X 1 08個/ m 1 となるように細胞保存液中に懸濁し、 凍結保存するように した請求の範囲 1 7に記載の細胞の保存方法。
PCT/JP2001/010389 2000-12-04 2001-11-28 Liquide de conservation de cellules et procede de conservation de cellules dans lequel ledit liquide est utilise WO2002046368A1 (fr)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU18486/02A AU1848602A (en) 2000-12-04 2001-11-28 Cell-preservation liquid and method of preserving cells by using the liquid
CA002399423A CA2399423A1 (en) 2000-12-04 2001-11-28 Cell-preservation liquid and method for preserving cells by using the liquid
DE60116673T DE60116673T2 (de) 2000-12-04 2001-11-28 Zellkonservierungsflüssigkeit und verfahren zur zellkonservierung mit dieser flüssigkeit
EP01999633A EP1347040B1 (en) 2000-12-04 2001-11-28 Cell-preservation liquid and method of preserving cells by using the liquid

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2000-368290 2000-12-04
JP2000368290 2000-12-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2002046368A1 true WO2002046368A1 (fr) 2002-06-13

Family

ID=18838570

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2001/010389 WO2002046368A1 (fr) 2000-12-04 2001-11-28 Liquide de conservation de cellules et procede de conservation de cellules dans lequel ledit liquide est utilise

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20030013074A1 (ja)
EP (1) EP1347040B1 (ja)
CN (1) CN1230524C (ja)
AT (1) ATE315635T1 (ja)
AU (1) AU1848602A (ja)
CA (1) CA2399423A1 (ja)
DE (1) DE60116673T2 (ja)
WO (1) WO2002046368A1 (ja)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1471140A4 (en) * 2002-01-31 2005-02-16 Asahi Techno Glass Cosporation LIQUIDITY FOR DEEP-FREEZE STORAGE OF EMBRYONIC PRIMATIVE STEM CELLS AND DEEP-FREEZE STORAGE PROCESS
EP1647186A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-19 Nipro Corporation Cell-preservation liquid
US8628960B2 (en) 2007-09-24 2014-01-14 Hememics Biotechnologies, Inc. Desiccated biologics and methods of preparing the same
US9943075B2 (en) 2010-02-17 2018-04-17 Hememics Biotechnologies, Inc. Preservation solutions for biologics and methods related thereto
CN111718908A (zh) * 2020-08-11 2020-09-29 杭州博日科技有限公司 病毒样本保存液及其制备方法和应用

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100425693C (zh) * 2004-02-16 2008-10-15 瑞德肝脏疾病研究(上海)有限公司 一种保存体外肝细胞系统的方法
EP1820847B1 (en) 2004-09-24 2014-06-11 Seiren Kabushiki Kaisha Composition for cell frozen-storage
CN101672853B (zh) * 2009-09-28 2014-11-05 江西特康科技有限公司 血细胞分析仪校准品及其制备工艺
JP6142142B2 (ja) * 2012-04-10 2017-06-07 株式会社リンフォテック メモリーｔ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法
CN112806352A (zh) * 2013-03-15 2021-05-18 特拉基应用基因组学有限责任公司 用于保持已手术去除的组织中的癌细胞活力的方法和试剂
CN107779432A (zh) * 2016-08-29 2018-03-09 灏灵赛奥（天津）生物科技有限公司 一种car‑t细胞制剂及低温保存介质
CN108235981B (zh) * 2016-12-23 2021-07-23 西比曼生物科技（香港）有限公司 一种可临床使用的细胞冻存液
CN106993606A (zh) * 2017-04-20 2017-08-01 苏州新赛美生物科技有限公司 一种不含蛋白和血清的细胞冻存液及其制备方法
CN107646831A (zh) * 2017-11-13 2018-02-02 重庆斯德姆生物技术有限公司 一种用于mcf‑7乳腺癌细胞的冻存液
CN107926930A (zh) * 2017-11-22 2018-04-20 瑞柏生物（中国）股份有限公司 一种精子冷冻液及其制备方法
CN107996558A (zh) * 2017-12-21 2018-05-08 湖南丰晖生物科技有限公司 细胞冻存液及其应用
CN113056556A (zh) * 2018-08-31 2021-06-29 学校法人同志社 用于对眼细胞进行保存或培养的组合物以及方法
CN109349270A (zh) * 2018-11-09 2019-02-19 合肥诺森医学检验有限公司 细胞保存液及使用细胞保存液保存细胞的方法
CN109497043A (zh) * 2018-12-28 2019-03-22 中国医学科学院整形外科医院 无血清纳米材料冻存剂及其制备方法、使用方法，冻存液
CN109907036A (zh) * 2019-02-27 2019-06-21 北京益华生物科技有限公司 细胞冻存液、细胞冻存液制备方法和细胞冻存方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0646840A (ja) * 1992-08-04 1994-02-22 Nippon Zenyaku Kogyo Kk 細胞凍結保存液
JPH07255469A (ja) * 1994-03-17 1995-10-09 Kurabo Ind Ltd 動物細胞の凍結保存液
JP2000201672A (ja) * 1999-01-11 2000-07-25 Asahi Medical Co Ltd 有核細胞の凍結保存用組成物
JP2001354575A (ja) * 2000-06-09 2001-12-25 Human Tekku:Kk 癌の再発予防法および癌の再発予防用活性化リンパ球を含む製剤、ならびにそれらの細胞の凍結および加工委・受託システム

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4004975A (en) * 1975-12-30 1977-01-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Method of isolating and cryopreserving human white cells from whole blood
JPH07500597A (ja) * 1991-10-23 1995-01-19 セルプロ　インコーポレイテッド 移植用細胞の冷凍方法
WO1995010291A1 (en) * 1993-10-08 1995-04-20 Cellpro Ii Methods for collection and cryopreservation of human granulocytes
AU4751697A (en) * 1996-10-10 1998-05-05 Douglas Danner Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients
US6485959B1 (en) * 1998-10-07 2002-11-26 Cedars Sinai Medical Center Cell preconditioning and cryopresevation medium
US6060252A (en) * 1999-04-12 2000-05-09 Becton Dickinson And Company Amplification and detection of shigella spp. and enteroinvasive strains of Escherichia coli

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0646840A (ja) * 1992-08-04 1994-02-22 Nippon Zenyaku Kogyo Kk 細胞凍結保存液
JPH07255469A (ja) * 1994-03-17 1995-10-09 Kurabo Ind Ltd 動物細胞の凍結保存液
JP2000201672A (ja) * 1999-01-11 2000-07-25 Asahi Medical Co Ltd 有核細胞の凍結保存用組成物
JP2001354575A (ja) * 2000-06-09 2001-12-25 Human Tekku:Kk 癌の再発予防法および癌の再発予防用活性化リンパ球を含む製剤、ならびにそれらの細胞の凍結および加工委・受託システム

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HIROAKI KASAI ET AL.: "Straw cut ho ni yoru ushi taigai jusei yurai hai no glasska toketsu", BULLETIN OF THE STUDIES OF TOKUSHIMA PRIFECTUAL LIVESTOCK EXPERIMENT STATION, vol. 41, November 2000 (2000-11-01), pages 1 - 6, XP002951071 *
HIROSHI KANO ET AL.: "Golden hamster mijuseiran no toketsu yukaigo no seizonsei ni tsuite", JOURNAL OF MAMMALIAN OVA RESEARCH, vol. 6, no. 1, April 1989 (1989-04-01), pages 79 - 80, XP002951072 *
LUSCINSKAS F.W. ET AL.: "Long-term cryopreservation of dog granulocytes", CRYOBIOLOGY, vol. 20, no. 1, 1983, pages 1 - 6, XP002909463 *
VAN DER ELST J. ET AL.: "The effect of equilibration temperature and time on the outcome of ultrarapid freezing of 1-cell mouse embryos", HUM. REPROD., vol. 10, no. 2, 1995, pages 379 - 383, XP002909462 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1471140A4 (en) * 2002-01-31 2005-02-16 Asahi Techno Glass Cosporation LIQUIDITY FOR DEEP-FREEZE STORAGE OF EMBRYONIC PRIMATIVE STEM CELLS AND DEEP-FREEZE STORAGE PROCESS
EP1647186A1 (en) * 2004-10-12 2006-04-19 Nipro Corporation Cell-preservation liquid
US8628960B2 (en) 2007-09-24 2014-01-14 Hememics Biotechnologies, Inc. Desiccated biologics and methods of preparing the same
US9642353B2 (en) 2007-09-24 2017-05-09 Hememics Biotechnologies, Inc. Desiccated biologics and methods of preparing the same
US9943075B2 (en) 2010-02-17 2018-04-17 Hememics Biotechnologies, Inc. Preservation solutions for biologics and methods related thereto
CN111718908A (zh) * 2020-08-11 2020-09-29 杭州博日科技有限公司 病毒样本保存液及其制备方法和应用
CN111718908B (zh) * 2020-08-11 2022-05-24 杭州博日科技股份有限公司 病毒样本保存液及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP1347040B1 (en) 2006-01-11
US20030013074A1 (en) 2003-01-16
DE60116673T2 (de) 2006-08-10
CN1230524C (zh) 2005-12-07
CA2399423A1 (en) 2002-06-13
EP1347040A4 (en) 2004-10-27
ATE315635T1 (de) 2006-02-15
DE60116673D1 (de) 2006-04-06
EP1347040A1 (en) 2003-09-24
AU1848602A (en) 2002-06-18
CN1396951A (zh) 2003-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2002046368A1 (fr) Liquide de conservation de cellules et procede de conservation de cellules dans lequel ledit liquide est utilise
Thirumala et al. Clinical grade adult stem cell banking
AU2003238620B2 (en) Liquid for frozen storage of primate embryo stem cells and frozen storage method
JP6850360B2 (ja) 臨床使用可能な細胞凍結保存液
Sasnoor et al. Supplementation of conventional freezing medium with a combination of catalase and trehalose results in better protection of surface molecules and functionality of hematopoietic cells
US9617515B2 (en) Non-embryonic totipotent blastomere-like stem cells and methods therefor
JP2008501320A (ja) 細胞保存方法
CA3046169C (en) Mammalian cell cryopreservation liquid
JPWO2018084228A1 (ja) 動物細胞又は動物組織の凍結保存用溶液、凍結物、及び凍結保存方法
Campos et al. Definition of optimal conditions for collection and cryopreservation of umbilical cord hematopoietic cells
KR102391629B1 (ko) 펙틴과 알라닌을 이용한 세포 동결 보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결 보존 방법
CN110637810A (zh) 一种临床级树突状细胞冻存液
JP4385158B2 (ja) 細胞の保存液および該保存液を用いた細胞の保存方法
Di et al. Development and evaluation of a trehalose‐contained solution formula to preserve HUC‐MSCs at 4 C
Riau et al. Isolation and propagation of human corneal stromal keratocytes for tissue engineering and cell therapy
EP0647267B1 (en) Stem cell storage
JP2022131878A (ja) 凍結された腎臓細胞の製造方法及び凍結された腎臓細胞
KR20180109600A (ko) 동결보존효과가 개선된 줄기세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 방법
Munévar et al. Evaluation of two human dental pulp stem cell cryopreservation methods
JP2014183825A (ja) 再生医療に資するヒトｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）由来の心筋細胞あるいはヒト心筋細胞を安定的に大量培養して保存する方法に関する。
Anagnostakis et al. Successful short‐term cryopreservation of volume‐reduced cord blood units in a cryogenic mechanical freezer: effects on cell recovery, viability, and clonogenic potential
Lionetti et al. Factors affecting the stability of cryogenically preserved granulocytes
JPS63216476A (ja) 無血清凍結保存用培地
CN114762497B (zh) 细胞冻存液及细胞冻存方法
JP2008104407A (ja) 細胞保存方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AU CA CN US

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LU MC NL PT SE TR

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 18486/02

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10182908

Country of ref document: US

Ref document number: 018044581

Country of ref document: CN

Ref document number: 2399423

Country of ref document: CA

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2001999633

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2001999633

Country of ref document: EP

WWG Wipo information: grant in national office

Ref document number: 2001999633

Country of ref document: EP