WO2001012827A2 - Verfahren zur herstellung transgener pflanzen mit erhöhtem tocopherol-gehalt - Google Patents

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WO2001012827A2
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Marcus Ebneth
Karin Herbers
Michael Geiger
Isolde Saalbach
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Sungene Gmbh & Co. Kgaa
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    • C12N9/0069—Oxidoreductases (1.) acting on single donors with incorporation of molecular oxygen, i.e. oxygenases (1.13)
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    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein

Definitions

  • the present invention relates to novel genetic constructs such as expression cassettes and vectors for
  • vitamin E tocopherol
  • the eight naturally occurring compounds with vitamin E activity are derivatives of 6-chromanol (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E).
  • the first group (la-d) comprises the tocopherols (I)
  • the second group (2a-d) comprises the tocopherols (II):
  • R 1 , R 2 and R 3 are as defined above.
  • Alpha-tocopherol is currently of greatest economic importance.
  • a first subject of the invention therefore relates to an expression cassette containing, under genetic control, regulatory nucleic acid sequences
  • HPPD 4-hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase
  • anti-HGD at least one nucleic acid sequence which is capable of inhibiting the homogentisate dioxygenase (HGD) activity.
  • Inhibition or blocking of the HGD enzyme activity in the plant or the plant part or tissue transformed with an anti-HGD construct according to the invention also includes a quantitative reduction of active HGD in the plant up to an essentially complete absence (i.e. lack of detectability of HGD enzyme activity or lack of immunological detectability of HGD) of HGD protein.
  • the strategy preferred according to the invention comprises the use of a nucleic acid sequence (anti-HGD) which can be transcribed to an antisense nucleic acid sequence which is capable of inhibiting the homogentisate dioxygenase (HGD) activity, e.g. B. by inhibiting the expression of endogenous HGD.
  • anti-HGD a nucleic acid sequence
  • HGD homogentisate dioxygenase
  • An anti-HGD sequence in the sense of the present invention is therefore selected in particular from: a) antisense nucleic acid sequences; b) nucleic acid sequences coding for homologous HGD and leading to co-suppression c) viral nucleic acid sequences causing expression of HGD-RNA, and expression constructs; d) nonsense mutants of endogenous HGD-encoding nucleic acid sequences; e) nucleic acid sequences coding for knockout mutants; f) nucleic acid sequences suitable for homologous recombination; the expression of each of these sequences being able to "inhibit" the HGD activity in the sense of the invention.
  • a combined application of such sequences is also conceivable.
  • the coding HPPD sequence is preferably functionally linked to the coding sequence of a plant organ-specific transit peptide.
  • the transit peptide preferably has specificity for the seeds or plastids, e.g. the plant's chloroplasts, chromoplasts and / or leukoplasts.
  • the transit peptide directs the expressed HPPD activity to the desired target location in the plant and is preferably cleaved proteolytically from the HPPD protein part after it has been reached.
  • the coding transit peptide sequence is preferably 5 'upstream of the coding HPPD sequence in the expression construct according to the invention.
  • the coding HPPD sequence and the anti-HGD sequence are each under the genetic control of a plant-specific promoter.
  • Expression cassettes which are particularly preferred according to the invention comprise a coding HPPD nucleic acid sequence which codes for a protein containing an amino acid sequence according to SEQ ID NO: 15 or a functional equivalent thereof, or the one Nucleic acid sequence from including nucleotide in position 8 to including nucleotide in position 1153 according to SEQ ID NO: 14 or a functional equivalent thereof.
  • the anti-HGD nucleic acid sequence can contain the coding nucleic acid sequence of homogentisate dioxygenase inserted in the antisense orientation or a functional fragment thereof.
  • a preferred embodiment of the expression cassettes according to the invention comprises an HGD sequence motif according to SEQ ID NO: 1 in an antisense orientation. This leads to the increased transcription of nucleic acid sequences in the transgenic plant which are complementary to the endogenous coding HGD sequence or a part thereof and hybridize with it at the DNA or RNA level.
  • Another object of the invention relates to recombinant vectors comprising at least one expression cassette as defined above.
  • vectors according to the invention include at least one expression construct of the following type:
  • the coding HPPD sequence can also be replaced by a coding sequence for a fusion protein of transit peptide and HPPD.
  • Preferred examples include monomeric vectors containing one of the following expression constructs:
  • Constructs a) and b) require a co-transformation of the plant with both vectors, i.e. with a) and bl) or b2).
  • Preferred examples also include binary vectors containing the following construct:
  • Construct cl) or c2) allows the simultaneous transformation of the plant with HPPD and anti-HGD.
  • Another object of the invention relates to microorganisms containing at least one recombinant vector according to the invention.
  • Preferred organisms are those which are capable of infecting plants and thus of transmitting the constructs according to the invention.
  • Preferred microorganisms are those from the genus Agrobacterium and in particular from the species Agrobacterium tumefaciens,
  • Another object of the invention relates to the use of a vector or microorganism according to the invention for the transformation of plants, plant cells, plant tissues or parts, in particular with the aim of enabling them to improve tocopherol synthesis.
  • Another object of the invention relates to transgenic plants transformed with at least one vector or microorganism according to the invention and transgenic cells, tissues, parts or transgenic reproductive material from such plants.
  • transgenic plants according to the invention are selected in particular from crop plants such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, potatoes, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce, such as cress, and the various tree, Nut and wine species.
  • crop plants such as cereals, corn, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, potatoes, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce, such as cress, and the various tree, Nut and wine species.
  • the invention further relates to a process for the production of transgenic plants with improved tocopherol production, wherein plants which are capable of tocopherol production, or plant cells, tissue or parts or protoplasts thereof, are transformed with at least one vector according to the invention or at least one microorganism according to the invention transformed cells, tissues, parts of plants or protoplasts are cultivated in a growth medium and, if appropriate, plants are regenerated from the culture.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette, a vector, a microorganism or a transgenic plant as defined above
  • the last aspect of the invention relates to a process for the production of tocopherols, which is characterized in that one according to the invention is obtained from a culture transformed plant isolated the desired tocopherol in a manner known per se.
  • a nucleotide or nucleic acid sequence is understood to mean, for example, a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence and semisynthetic or fully synthetic analogues thereof.
  • HPPD or anti-HGD nucleotide sequences of the constructs according to the invention can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, and can consist of various heterologous HGD or HPPD gene segments from different organisms.
  • the anti-HGD sequence can be derived from one or more exons and / or introns, in particular exons of the HGD gene.
  • nucleotide sequences can be generated with codons, which are preferred by the plants to be transformed. These codons preferred by plants can be determined in the usual way for the plant on the basis of the codon usage.
  • various DNA fragments can be manipulated in such a way that a nucleotide sequence with the correct reading direction and correct reading frame is obtained.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • Functional equivalents of the HPPD gene are those sequences which, despite the differing nucleotide sequence, still code for a protein with the functions desired according to the invention, ie for an enzyme with homogentisate-forming activity.
  • Functional equivalents of anti-HGD include those nucleotide sequences which sufficiently prevent the HGD enzyme function in the transgenic plant. This can be done, for example, by hindering or preventing HGD processing, the transport of HGD or its RNA, inhibition of ribosome attachment, inhibition of RNA splicing, induction of an RNA-degrading enzyme and / or inhibition of translation elongation or termination ,
  • Functional equivalents include generally naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for HGD or HPPD, which furthermore show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modification of the HGD or HPPD nucleotide sequence. The aim of such a modification can e.g. further narrowing down the coding sequence contained therein or e.g. also be the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • Functional equivalents also include those variants whose function is weakened or enhanced compared to the starting gene or gene fragment, for example those HPPD genes which code for an HPPD variant with lower or higher enzymatic activity than that of the original gene.
  • artificial nucleic acid sequences are suitable as long as, as described above, they impart the desired property, for example increasing the tocopherol content in the plant by overexpressing the HPPD gene or expressing an anti-HGD sequence in crop plants.
  • Such artificial nucleotide sequences can be determined, for example, by back-translating proteins constructed using molecular modeling, which have HGD or HPPD activity, or by in vitro selection. Coding nucleotide sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence in accordance with the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can be determined by a person skilled in plant genetic methods Easily determine computer evaluations of other known genes of the plant to be transformed.
  • DNA fragments can be retranslated, for example, based on the amino acid sequence of a bacterial HPPD and taking into account the plant codon usage, and the complete exogenous HPPD sequence optimized for use in the plant can be produced therefrom.
  • An HPPD enzyme is expressed from this, which is not or only inadequately accessible to plant regulation, which means that the overexpression of enzyme activity can be fully exploited.
  • suitable equivalent nucleic acid sequences are sequences which code for fusion proteins, part of the fusion protein being e.g. an HPPD polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can e.g. be another polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence that can be used to detect HPPD expression (e.g. myc-tag or his-tag).
  • this is preferably a regulatory protein sequence, such as e.g. a signal or transit peptide that directs the HPPD protein to the desired site of action.
  • an increase in the tocopherol content in the plant means the artificially acquired ability of an increased biosynthetic capacity of at least one compound from the group of tocopherols and tocotrienols as defined above in the plant compared to the non-genetically modified plant for at least the duration a generation of plants.
  • the tocopherol biosynthesis site is generally the leaf tissue but also the seed, so that leaf-specific and / or seed-specific expression, in particular of the HPPD gene and, if appropriate, of anti-HGD, is expedient.
  • the tocopherol biosynthesis need not be limited to the seed, but can also be tissue-specific in all other parts of the plant.
  • constitutive expression of the exogenous gene is advantageous.
  • inducible expression may also be desirable.
  • the regulatory nucleic acid sequences contained in the expression cassettes according to the invention optionally control the expression of the coding sequences (such as the HPPD sequence) fused with a transit peptide sequence) and the anti-HGD sequence.
  • the constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5 'upstream of the respective coding sequence and a terminator sequence 3' downstream and optionally further conventional regulative sequences
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence or the antisense sequence.
  • sequences which can be linked operatively are further targeting sequences which differ from the transit peptide and which ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or others compartments; and translation enhancers such as the 5 'leader sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711), and the like.
  • Suitable polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially contain T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine syntha
  • Ti plasmids correspond to pTiACHS (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) or functional equivalents thereof.
  • Examples of particularly suitable terminator sequences are the OCS (octopine synthase) terminator and the NOS (nopalin synthase) terminator.
  • any promoter that can control the expression of genes, in particular foreign genes, in plants is suitable as promoters for the expression cassettes.
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus is particularly preferred (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294).
  • this promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).
  • Another example of a suitable promoter is that of the LeguminB promoter (Accession No. X03677).
  • the expression cassette can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the exogenous gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter such as the PRPl promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a salicylic acid-inducible (WO 95/19443), a benzenesulfonamide-inducible (EP- A-0388186), one which can be induced by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), one which can be induced by abscisic acid (EP-A 335528) or one which can be induced by ethanol or cyclohexanone (WO 93/21334) promoters can also be used.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which the biosynthesis of tocopherol or its precursors takes place. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potato or the ST-LSI promoter from potato (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-245) are to be mentioned. Examples of seed-specific promoters are the
  • Phaseolin promoter (US 5504200), the USP promoter (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or the LEB4 promoter (Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090) together with the LEB4 signal peptide.
  • An expression cassette is produced by fusing a suitable promoter with a suitable anti-HDG or HPPD nucleotide sequence, optionally a sequence coding for a transit peptide, which is preferably arranged between the promoter and the HPPD sequence, and a terminator or polyadenylation signal , Common recombination and cloning techniques, such as those described in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W.
  • expression cassettes can also be used whose DNA sequence encodes an HPPD fusion protein, part of the fusion protein being a transit peptide which controls the translocation of the polypeptide.
  • the following may be mentioned as examples: chloroplast-specific transit peptides, which after translocation of the HPPD gene into the chloroplasts from the HPPD part are enzymatically split off.
  • this transit peptide e.g. the RubisCO small subunit transit peptide or the ferredoxin: NADP oxidoreductase.
  • the promoter and terminator regions can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter, terminator and the other regulatory elements can be both native (homologous) and foreign (heterologous) to the host plant.
  • the expression cassettes according to the invention are preferably inserted into suitable transformation vectors.
  • suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993).
  • agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as, for example. of tobacco plants can be used, for example, by wounded leaves or leaf pieces in one Agrobacteria solution are bathed and then cultivated in suitable media.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, inter alia, from FF White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38.
  • Transgenic plants can be regenerated in a known manner from the transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun, the so-called particle bombardment method, electroporation, the incubation of dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and gene transfer mediated by Agrobacterium.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, published by S.D. Kung and R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 and in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette can also, in a known manner, for the transformation of plants, in particular crop plants, such as cereals, maize, oats, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, plachs, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, Rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, maize, oats, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, plachs, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, Rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species
  • crop plants such as cereals, maize, oats, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, plachs, hemp, potatoes, tobacco, tomatoes, Rapeseed, alfalfa
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette according to the invention, and to transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenes are particularly preferred
  • Cultivated plants such as barley, wheat, rye, corn, oats, soybeans, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, Hemp, potato, tobacco, tomato, rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species.
  • Plants in the sense of the invention are mono- and dicotyledonous plants or algae.
  • Figure 1 is a schematic representation of the tocopherol biosynthetic pathway in plants
  • PP stands for pyrophosphate
  • geranyl-geranyl-PP in the plant (not shown), the corresponding tocotrienols are formed in an analogous manner
  • FIG. 2 shows a binary transformation vector which expresses the HPPDop in seeds of transformed plants and at the same time suppresses the expression of the endogenous HGD:
  • A 35S promoter;
  • B HGD in antisense orientation;
  • C OCS terminator;
  • D Legumin B promoter;
  • E transit peptide of the FNR;
  • F HPPDop;
  • G NOS terminator;
  • FIG. 3 construction schemes of the plasmids pUC19HPPDop and pCRScriptHPPDop encoding HPPD;
  • FIG. 4 construction schemes of the plasmids pBinARHGDanti and pCRScriptHGDanti encoding antiHGD;
  • Figure 5 Construction schemes of the transformation vectors pPTVHGDanti and pPZP200HPPD.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out using a laser fluorescence DNA sequencer from Licor (sold by MWG Biotech, Ebersbach) according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463 - 5467).
  • Example 1 Cloning of a hydroxyphenyl pyruvate dioxygenase (HPPD) with a DNA sequence optimized for expression in Brassica napus
  • the amino acid sequence of the hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) from Streptom ces averwitilis was translated back into a DNA sequence, taking into account the codon usage in Brassica napus (oilseed rape).
  • the codon usage was determined using the database http://www.dna.affrc.go.jp/ -nakamura / index.html.
  • the derived sequence was synthesized by attaching Sall interfaces by ligation of overlapping oligonucleotides with subsequent PCR amplification (Rouwendal, GJA; et al, (1997) PMB 33: 989-999) (SEQ ID NO: 14). The correctness of the sequence of the synthetic gene was checked by sequencing.
  • the synthetic gene was cloned into the vector pBluescript II SK + (Stratagene).
  • Open flowers were harvested from Brassica napus var. Westa and frozen in liquid nitrogen.
  • the material was then pulverized in a mortar and taken up in Z6 buffer (8 M guanidinium hydrochloride, 20 mM MES, 20 mM EDTA, adjusted to pH 7.0 with NaOH; mixed with 400 ⁇ l mercaptoethanol / 100 ml buffer immediately before use) ,
  • the suspension was then transferred to reaction vessels and shaken with a volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol 25: 24: 1.
  • the supernatant was transferred to a new reaction vessel and the RNA was precipitated with 1/20 volume IN acetic acid and 0.7 volume ethanol (absolute).
  • the pellet was first in 3M
  • RNA 20 ⁇ g of total RNA were first mixed with 3.3 ⁇ l of 3M sodium acetate solution, 2 ⁇ l of IM magnesium sulfate solution and made up to a final volume of 10 ⁇ l with DEPC water. 1 ⁇ l of RNase-free DNase (Boehringer Mannheim) was added and incubated at 37 degrees for 45 min. After removing the enzyme by shaking with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, the RNA was precipitated with ethanol and the pellet was taken up in 100 ⁇ l DEPC water. 2.5 ⁇ g RNA from this solution were transcribed into cDNA using a cDNA kit (Gibco BRL) according to the manufacturer's instructions.
  • a cDNA kit Gibco BRL
  • Oligonucleotides derived to which a Sall had been added at the 5 'end and an Asp718 restriction site had been added at the 3' end comprises the sequence:
  • the oligonucleotide at the 3 'end comprises the sequence:
  • GGTACCTCRAACATRAANGCCATNGTNCC SEQ ID NO: 3
  • N in each case means inosine and R stands for the incorporation of A or G into the oligonucleotide.
  • the PCR reaction was carried out with the Taq polymerase from TAKARA according to the manufacturer's instructions. 0.3 ⁇ g of the cDNA was used as template.
  • the PCR program was:
  • the fragment was purified using NucleoSpin Extract (Machery and Nagel) and cloned into the vector pGEMT (Promega) according to the manufacturer's instructions.
  • the correctness of the fragment was checked by sequencing.
  • Example 3 Production of a plant transformation construct for overexpression of the HPPD with an optimized DNA sequence (HPPDop) and switching off the HGD
  • the components of the cassette for the expression of the HPPDop consisting of the LeguminB promoter (accession no. X03677), the transit peptide of ferredoxin: ADP + oxidoreductase from spinach (FNR; Jansen, T, et al (1988) Current Genetics 13, 517 -522) and the NOS terminator (contained in pBHOl Accession No. U12668) by means of PCR with the required restriction sites.
  • legumin promoter was derived from the plasmid plePOCS (Bäumlein, H, et al. (1986) Plant J. 24, 233-239) with the upstream oligonucleotide:
  • ATGGTACCTTTTTTGCATAAACTTATCTTCATAG (SEQ ID NO: 6)
  • ATGTCGACCCGGGATCCAGGGCCCTGATGGGTCCCATTTTCCC SEQ ID NO: 7
  • the NOS terminator was generated from the plasmid pBHOl (Jefferson, R.A., et al (1987) EMBO J. 6 (13), 3901-3907) by means of PCR with the 5 'oligonucleotide:
  • AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA (SEQ ID NO: 9)
  • the amplicon was cloned into the vector pCR-Script (Stratagene) according to the manufacturer's instructions.
  • the NOS terminator was first cloned as a Sall / HindIII fragment into a correspondingly cut pUC19 vector (Yanisch-Perron, C, et al (1985) Gene 33, 103-119). The transit peptide was then introduced into this plasmid as an Asp718 / Sall fragment. The legumin promoter was then cloned in as an EcoRI / Asp718 fragment. The HPPDop gene was introduced into this construct as a Sall fragment (FIG. 3, construct III).
  • the finished cassette in pUC19 was used as a template for a PCR, for which the oligonucleotide for the legume promoter:
  • AAGCTTGATCTGTCGTCTCAAACTC (SEQ ID NO: 10)
  • AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA (SEQ ID NO: 11) were used.
  • the amplicon was cloned into pCR-Script and called pCR-ScriptHPPDop ( Figure 3, construct IV).
  • the gene fragment was cloned as a Sall / Asp718 fragment into the vector pBinAR (Höfgen, R. and Willmitzer, L., (1990) Plant Sei. 66: 221-230), in which the 35S promoter and the OCS terminator 0 are present (FIG. 4, construct I).
  • the construct served as a template for a PCR reaction with the oligonucleotide:
  • the amplicon was cloned into the vector PCR script (Stratagene) and called HGDanti (FIG. 3, construct II).
  • the construct HGDanti from pCRScriptHGDanti was first cloned as an Xbal fragment into the vector pPTV (Becker, D., (1992) PMB 20, 30 1195-1197) ( Figure 5, construct V).
  • the construct LegHPPDop from pCRScriptHPPDop was inserted into this plasmid as a HindIII fragment. This plasmid was designated pPTVHPPD / HGDanti ( Figure 2, construct VI).
  • transgenic oilseed rape plants were based on a protocol by Bade, J.B. and Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spangenberg, G., ed., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in which also the composition of the media and buffers used is specified.
  • the transformation was carried out with the Agrobacterium tumefaciens strain EHA105 (Li, X.Q., et al., PMB (1992) 20, 1037). Either the abovementioned plasmid 15 pPTVHPPDopHGDanti (FIG. 2) or, after cultivation, mixed cultures of agrobacteria with the plasmids pPTVHGDanti and pPZP200HPPDop (FIG. 5) were used for the transformation.
  • Brassica napus var. Westar seeds were surface-sterilized with 70% ethanol (v / v) 20, washed in water for 10 minutes at 55 ° C, in 1% hypochlorite solution (25% v / v tea powder, 0.1% v / v Tween 20) incubated for 20 minutes and washed six times with sterile water for 20 minutes each.
  • the seeds were dried on filter paper for three days and 10-15 seeds were germinated in a glass flask with 25 15 ml of germination medium.
  • the roots and apices were removed from several seedlings (approx. 10 cm in size) and the remaining hypocotyls were cut into pieces approx. 6 mm long.
  • the approximately 600 explants obtained in this way were washed with 50 ml of basal medium for 30 minutes and transferred to a 300 ml 30 flask. After adding 100 ml of callus induction medium, the cultures were incubated for 24 hours at 100 rpm.
  • the callus induction medium was removed from the oilseed rape explants using sterile pipettes, 50 ml of Agrobacterium solution 45 were added, mixed carefully and incubated for 20 min.
  • Petri dishes transferred containing 25 ml of shoot induction medium with phosphinotricin.
  • the petri dishes were closed with 2 layers of leucopor and incubated at 25 ° C. and 2000 lux with photoperiods of 16 hours light / 8 hours dark.
  • the developing calli were transferred to fresh petri dishes with shoot induction medium every 12 days. All further steps for the regeneration of whole plants were carried out as by Bade, JB and Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. and Spangenberg, G., ed., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30- 38).

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Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Expressionskassetten, enthaltend unter genetischer Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen a) die kodierende Nukleinsäuresequenz für 4-Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) oder für ein funktionales Äquivalent davon; und/oder b) wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (anti-HGD), welche zu einer Inhibition der Homogentisat-Dioxygenase (HGD)-Aktivität befähigt ist, sowie Vektoren, die zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Tocopherol-Gehalt geeignet sind, damit hergestellte transgene Pflanzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhtem Tocopherol-Gehalt.

Description

Homogentisat-Dioxygenase
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige genetische Konstrukte, wie Expressionskassetten und Vektoren, zur
Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Tocopherol-Gehalt, damit hergestellte transgene Pflanzen sowie Verfahren zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhtem Tocopherol-Gehalt.
Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitaminen, wie z.B. mit erhöhtem Tocopherol (Vitamin E) -Gehalt.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak- tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesellschaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E) . Die erste Gruppe (la-d) umfaßt die Tocopherole (I), die zweite Gruppe (2a-d) umfaßt die Toco- trienole (II) :
Figure imgf000002_0001
la, α-Tocopherol : R1 R2 = R3 = CH3 , lb , ß-Tocopherol : R1 R3 = CH3 , R2 = H lc , γ-Tocopherol : R1 H , R2 = R3 = CH3 ld , δ-Tocopherol : R1 R2 = H , R3 = CH3
Figure imgf000002_0002
2a , α-Tocotrienol : R1 R2 = R3 = CH3 ,
2b , ß-Tocotrienol : R1 R3 = CH3 , R2 = H 2c , γ-Tocotrienol : R1 H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol : R1 R2 = H , R3 = CH3 wobei
R1 , R2 und R3 wie oben definiert sind.
Wirtschaftlich größte Bedeutung besitzt derzeit alpha-Tocopherol .
Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Tocopherol-Gehalt durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits der Tocopherol-Gehalt bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teilweise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre die Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt.
Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, die für die Tocopherol-Syntheseleistung kodierenden, essentiellen Biosynthesegene zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthesewege und deren Regulation bekannt sind und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflussen, identifiziert werden.
Der Tocopherolsyntheseweg in Pflanzen ist schematisch in beiliegender Figur 1 dargestellt. Im Stand der Technik gibt es bisher keinen brauchbaren Ansatz, der eine gezielte Erhöhung der Tocopherol-Biosynthese in Pflanzen gestattet.
Kurze Beschreibung der Erfindung:
Es ist deshalb Aufgabe der Erfindung Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe eine verbesserte Tocopherol-Biosynthese erreicht werden kann.
Diese Aufgabe konnte erfindungsgemäß überraschenderweise durch die Bereitstellung von genetischen Konstrukten gelöst werden, mit deren Hilfe die Biosynthese von Homogentisat, einem Tocopherol-Vorläufer, und damit die Bildung von Tocopherol erhöht werden kann. Gleichzeitig kann erfindungsgemäß der unerwünschte Abfluß von Homogentisat zu Maleylacetoacetat unterbunden und damit die Tocopherolsynthese weiter verbessert werden. Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft daher eine Expressionskassette, enthaltend unter genetischer Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen
a) die kodierende Nukleinsäuresequenz für 4- Hydroxyphenylpyru- vat-Dioxygenase (HPPD) oder für ein funktionales Äquivalent davon, wodurch bei Expression die Homogentisat-Biosynthese- rate erhöht wird; und/oder b) wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (anti-HGD), welche zu ei- ner Inhibition der Homogentisat-Dioxygenase(HGD)-Aktivität befähigt ist.
"Inhibition" ist in diesem Zusammenhang weit auszulegen und umfaßt die teilweise oder im wesentlichen vollständige, auf unterschiedliche zellbiologische Mechanismen beruhende
Unterbindung oder Blockierung der HGD-Enzymaktivität in der mit einem erfindungsgemäßen anti-HGD-Konstrukt transformierten Pflanze oder dem Pflanzenteil oder Gewebe. Eine Inhibition im Sinne der Erfindung umfaßt auch eine mengenmäßige Verringerung von aktiver HGD in der Pflanze, bis hin zu einem im wesentlichen vollständigen Fehlen (d.h. fehlende Nachweisbarkeit von HGD-Enzymaktivität oder fehlende immunologische Nachweisbarkeit von HGD) von HGD-Protein.
Erfindungsgemäß sind verschiedene Strategien zur Verringerung oder Inhibition der HGD-Aktivität umfasst. Der Fachmann erkennt, dass eine Reihe verschiedener Methoden zur Verfügung steht, um die HGD-Genexpression in gewünschter Weise zu beeinflussen.
Die erfindungsgemäß bevorzugte Strategie umfasst die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz (anti-HGD), welche zu einer antisense- Nukleinsäuresequenz transkribierbar ist, die zur Inhibition der Homogentisat-Dioxygenase (HGD)-Aktivität befähigt ist, z. B. indem sie die Expression von endogener HGD inhibiert.
Weitere Methoden zur Inhibition der HGD-Expression umfassen die zu Kosuppression führende Überexpression homologer HGD-Nuklein- säuresequenzen (Jorgensen et al. (1996): "Chalcone synthase co- suppression phenotypes in petunia flowers: Comparison of sense vs . antisense constructs and Single copy vs . complex T-DNA se- quences.", Plant Mol. Biol. 31 (5): 957-973.), die Induktion des spezifischen RNA-Abbaus durch die Pflanze mit Hilfe eines viralen Expressionssystems (Amplikon) (Angell, S. M., Baulcombe, D. C. (1999): "Technical advance: Potato virus x amplicon mediated si- lencing of nuclear genes." Plant J. 20 (3): 357-362.), die Einführung von Nonsense-Mutationen in das Endogen mittels Einführung von RNA/DNA-Oligonukleotiden in die Pflanze (Zhu et al. (2000): 4
"Engineering herbicide resistant maize using chimeric RNA/DNA oligonucleotides." Nat. Biotechnol. 18 (5): 555-558.) oder die Generierung von Knockout-Mutanten mit Hilfe von z. B. T-DNA-Muta- genese (Koncz et al. (1992): "T-DNA insertional mutagenesis in Arabidopsis." Plant Mol. Biol. 20 (5): 963-976.) oder homoiger Rekombination (Hohn, B.; Puchta, H. (1999): "Gene therapy in plants." Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 8321-8323.).
Auf die oben beschriebenen Druckschriften und die darin offenbar- ten Methoden zur Regulation der pflanzlichen Genexpression wird hiermit ausdrücklich Bezug genommen.
Eine anti-HGD-Sequenz im Sinne der vorliegenden Erfindung ist somit insbesondere ausgewählt unter: a) antisense-Nukleinsäuresequenzen; b) für homologe HGD kodierende und zu Kosuppression führende Nu- kleinsäuresequenzen c) HGD-RNA-Abbau bewirkende virale Nukleinsäuresequenzen und Ex- pressionskonstrukte; d) Nonsense-Mutanten von endogenen HGD kodierenden Nukleinsäuresequenzen; e) für Knockout-Mutanten kodierende Nukleinsäuresequenzen; f) zu homologer Rekombination geeignete Nukleinsäuresequenzen; wobei die Expression jeder einzelner dieser Sequenzen eine "Inhi- bition" der HGD-Aktivität im Sinne der Erfindung bewirken kann. Auch eine kombinierte Anwendung solcher Sequenzen ist denkbar.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die kodierende HPPD-Sequenz mit der kodierenden Sequenz eines Pflanzenorganell-spezifischen Transitpeptids funktional verknüpft. Das Transitpeptid besitzt dabei vorzugsweise Spezifität für die Samen oder die Piastiden, wie z.B. die Chloroplasten, Chromoplasten und/oder Leukoplasten, der Pflanze. Das Transitpeptid lenkt die exprimierte HPPD-Aktivität an den gewünschten Zielort in der Pflanze und wird nach dessen Erreichen vom HPPD-Proteinteil vorzugsweise proteolytisch abgespalten. Die kodierende Transitpeptid-Sequenz befindet sich im erfindungsgemäßen Expressionskonstrukt vorzugsweise 5 '-stromaufwärts von der kodierenden HPPD-Sequenz.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stehen die kodierende HPPD-Sequenz und die anti-HGD-Sequenz jeweils unter der genetischen Kontrolle eines pflanzenspezifischen Promotors.
Erfindungsgemäß besonders bevorzugte Expressionskassetten umfassen eine kodierende HPPD-Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein, enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 oder ein funktionelles Äquivalent davon kodiert, oder die eine Nukleinsäuresequenz von einschließlich Nukleotid in Position 8 bis einschließlich Nukleotid in Position 1153 gemäß SEQ ID NO: 14 oder ein funktionelles Äquivalent davon umfaßt.
Die anti-HGD-Nukleinsäuresequenz kann gemäß einer bevorzugten Ausführungsform die in antisense-Orientierung insertierte kodierende Nukleinsäuresequenz von Homogentisat-Dioxygenase oder ein funktionales Fragment davon enthalten. Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Expressionskassetten umfaßt eine HGD-Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO:l in antisense-Orientierung. Dies führt zur vermehrten Transkription von Nukeinsäuresequenzen in der transgenen Pfanze, welche komplementär zur endogenen kodierenden HGD-Sequenz oder einem Teil davon sind und mit dieser auf DNA- oder RNA-Ebene hybridisieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft rekombinante Vektoren, umfassend wenigstens eine Expressionskassette gemäß obiger Definition. Beispiele erfindungsgemäßer Vektoren umfassen wenigstens ein Expressionskonstrukt folgenden Typs:
5 '-Pflanzenspezifischer Promotor/HPPD oder anti-HGD/ Terminator-3 ' . Hierbei kann die kodierende HPPD-Sequenz auch durch eine kodierende Sequenz für ein Fusionsprotein aus Transitpeptid und HPPD ersetzt sein.
Bevorzugte Beispiele umfassen monomere Vektoren, enthaltend eines der folgenden Expressionskonstrukte:
a) 5'-35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator-3' ; bl ) 5 ' -LeguminB-Promotor/HPPD/NOS-Terminator-3 ' ; b2 ) 5 ' -LeguminB-Promotor/Transitpeptid-HPPD/NOS-Terminator-3 ' .
Die Konstrukte a) und b) erfordern eine Kotransformation der Pflanze mit beiden Vektoren, d.h. mit a) und bl) bzw. b2 ) .
Bevorzugte Beispiel umfassen außerdem binäre Vektoren, enthaltend folgendes Konstrukt:
cl) 5'-35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator/LeguminB-Promotor/ HPPD/NOS-Terminator-3 ' ; und c2 ) 5 ' -35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator/LeguminB-Promotor/ Transitpeptid-HPPD/NOS-Terminator-3 ' .
Konstrukt cl) bzw. c2) erlaubt die gleichzeitige Transformation der Pflanze mit HPPD und anti-HGD. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Mikroorganismen, enthaltend wenigstens einen erfindungsgemäßen rekombinanten Vektor. Bevorzugt sind solche Organismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Konstrukte befähigt sind.
Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens ,
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Vektors oder Mikroorganismus zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen insbesondere mit dem Ziel, diese zu einer verbesserten Tocopherol-Synthese zu befähigen.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Pflanze, transformiert mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor oder Mikroorganismus und transgene Zellen, Gewebe, Teile oder transgenes Vermehrungsgut von solchen Pflanzen.
Die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat, wie Kresse, und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspecies.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit verbesserter Tocopherolproduktion, wobei man Pflanzen, die zur Tocopherolproduktion befähigt sind, oder Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten davon mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor oder wenigstens einem erfindungsgemäßen Mikroorganismus transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert .
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette, eines Vektors, eines Mikroorganismus oder einer transgenen Pflanze gemäß obiger Definition zur
Gewinnung von Pflanzenmetaboliten, insbesondere Tocopherolen.
Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur Herstellung von Tocopherolen, das dadurch gekenn- zeichnet ist, daß man aus einer Kultur einer erfindungsgemäß transformierten Pflanze das gewünschte Tocopherol in an sich bekannter Weise isoliert.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung:
Die erfindungsgemäße Transformation von Pflanzen mit einem HPPD kodierenden Konstrukt führt zur Überexpression dieses Proteins und damit zur Steigerung der Homogentisatbildung. Durch gleichzeitige Transformation mit anti-HGD, insbesondere dem antisense-HGD Konstrukt wird ein unerwünschter Abfluß dieses Metaboliten zu Maleylacetoacetat vermieden. Eine erhöhte Homogentisatmenge steht in der transgenen Pflanze somit zur Bildung von Tocopherolen über die Intermediate Methyl-6-phytylquinol und 2,3-Dimethyl-phytylquinol (vgl. Figur 1) zur Verfügung.
Unter einer Nukleotid- oder Nukleinsäure-Sequenz versteht man erfindungsgemäß beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon.
Die HPPD- oder anti-HGD-Nukleotidsequenzen der erfindungsgemäßen Konstrukte können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen HGD bzw. HPPD-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Die anti-HGD-Sequenz kann von einem oder mehreren Exons und/oder Introns, insbesondere Exons des HGD-Gens abgeleitet sein.
Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt werden, die von den zu transformierenden Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können anhand der Kodonnutzung in üblicher Weise für die Pflanze bestimmt werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können ver- schiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, daß eine Nukleo- tid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Für die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Funktionale Äquivalente des HPPD-Gens sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch für ein Protein mit der erfindungsgemäß gewünschten Funktionen kodieren, d.h für ein Enzym mit Homogentisat-bildender Aktivität. Funktionale Äquivalente von anti-HGD umfassen solche Nukleotid- sequenzen welche die HGD-Enzymfunktion in der transgenen Pflanze in ausreichendem Maße unterbinden. Dies kann z.B. durch Behinderung oder Unterbindung der HGD-Prozessierung, des Transports von HGD oder deren RNA, Hemmung der Ribosomenanlage- rung, Hemmung des RNA-Spleißens, Induktion eines RNA-abbauenden Enzyms und/oder Hemmung der Translationselongation oder -termina- tion erfolgen.
Funktionale Äquivalente umfassen allgemein natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotidsequenzen.
Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für HGD oder HPPD kodierenden Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der HGD- bzw. HPPD-Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionale Äquivalente umfassen auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist, also beispielsweise solche HPPD-Gene welche für eine HPPD-Variante mit niedrigerer oder höherer enzymatischer Aktivität als der des Ursprungsgens kodieren.
Außerdem sind artifizielle Nukleinsäuresequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression des HPPD-Gens oder Expression einer anti-HGD-Sequenz in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen Nukleotid-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die HGD- bzw. HPPD-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende Nukleotid-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Ko- don-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln. Um unerwünschte pflanzliche Regulationsmechanismen zu umgehen, kann man beispielsweise ausgehend von der Aminosäuresequenz einer bakteriellen HPPD und unter Berücksichtigung der pflanzlichen Kodon-Nutzung DNA-Fragmente rückübersetzen und daraus die vollständige, für einen Einsatz in der Pflanze optimierte exogene HPPD-Sequenz herstellen. Daraus wird ein HPPD-Enzym exprimiert, welches der pflanzlichen Regulation nicht oder nur unzureichend zugänglich ist, wodurch die Überexpression von Enzymaktivität voll zur Geltung gelangen kann.
Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind Sequenzen zu nennen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins z.B. ein HPPD-Polypeptid oder ein funktioneil äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Polypeptid mit enzymati- scher Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz, mit deren Hilfe ein Nachweis der HPPD-Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das HPPD-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Eine Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Biosyntheseleistung wenigstens einer Verbindung aus der Gruppe der Tocopherole und Tocotrienole gemäß obiger Definition in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modi- fizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Der Biosyntheseort von Tocopherol ist im allgemeinen das Blattgewebe aber auch der Samen, so daß eine blattspezifische und/oder samenspezifische Expression insbesondere des HPPD-Gens und gegebenenfalls von anti-HGD sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Biosynthese nicht auf den Samen beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze gewebespezifisch erfolgen kann.
Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert sein.
Die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten enthaltenen regulativen Nukleinsäuresequenzen steuern die Expression der kodierenden Sequenzen (wie der HPPD-Sequenz, gegebenenfalls fusioniert mit einer Transitpeptid-Sequenz) und der anti-HGD-Sequenz. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Konstrukte 5 '-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3 ' -stromabwärts eine Terminator- sequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative
Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz . Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequentiellen Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz oder der antisense-Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind weitere, von den Transitpeptid kodierenden Sequenzen verschiedene, Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten; sowie Translationsverstärker wie die 5 ' -Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693 -8711), und dergleichen.
Geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylie- rungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA-Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des
Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktioneile Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin-Synthase) -Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Ter- minator.
Als Promotoren für die Expressionskassetten ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285 - 294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche ErkennungsSequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202). Ein weiteres Beispiel eines geeigneten Promotors ist der der LeguminB-Promotor (Accessionnr . X03677) . Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z.B. der PRPlPromotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salicylsäure induzierbarer (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzier- barer (EP-A-0388186) , ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397404), ein durch Abscisinsäure-indu- zierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können ebenfalls verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245). Beispiele für samenspezifische Promotoren sind der
Phaseolin-Promotor (US 5504200), der USP-Promotor (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459 - 467) oder der LEB4-Promotor (Fiedler, U. et al., Biotechnology (NY) (1995), 13 (10) 1090) zusammen mit dem LEB4-Signalpeptid.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten anti-HDG- bzw. HPPD-Nukleotidsequenz, gegebenenfalls einer für eine Transitpeptid kodierenden Sequenz, welche vorzugsweise zwischen dem Promotor und der HPPD-Sequenz angeordnet ist, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Wie bereits erwähnt, können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA-Sequenz für ein HPPD-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Als Beispiel können genannt werden: Chloroplasten-spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation HPPD-Gens in die Chloroplasten vom HPPD-Teil enzymatisch abgespalten werden.
Insbesondere ist zu nennen das Transitpeptid, das von der plastidären Transketolase (TK) oder einem funktioneilen
Äquivalent dieses Transitpeptids (z.B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der RubisCO oder der Ferredoxin:NADP Oxidoreduktase) abgeleitet ist.
Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp.
Promotor, Terminator sowie die anderen regulativen Elemente können sowohl nativ (homolog) als auch fremdartig (heterolog) zur Wirtspflanze sein.
Ferner können genetische Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, im Rahmen der Erfindung eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z.B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair" , Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Die erfindngsgemäßen Expressionskassetten werden bevorzugt in geeignete Transformationsvektoren insertiert. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press) , Kap. 6/7, S. 71 - 119 (1993) beschrieben.
Vorzugsweise werden sie in einen Vektor, wie beispielsweise pBinl9 , pBinAR, pPZP200 oder pPTV, kloniert , der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z .B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38.
Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128 - 143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205 - 225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).
Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können, ebenfalls in bekannter Weise, zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Plachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene
Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies. Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.
Die Erfindung wird nun in den folgenden Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren näher erläutert. Dabei zeigt:
Figur 1 eine schematische Darstellung des Tocopherolbiosyntheseweges in Pflanzen; PP steht dabei für Pyrophosphat; wird in der Pflanze Homogentisat mit Geranyl-geranyl-PP umgesetzt (nicht gezeigt) so werden in analoger Weise die entsprechenden Tocotrienole gebildet;
Figur 2 einen binären Transformations-Vektor, welcher die HPPDop in Samen transformierter Pflanzen exprimiert und gleichzeitig die Expression der endogenen HGD unterdrückt: A = 35S-Promotor; B = HGD in antisense-Orientierung; C = OCS Terminator; D = Legumin B-Promotor; E = Transitpeptid der FNR; F = HPPDop; G = NOS-Terminator;
Figur 3 Konstruktionsschemata der HPPD kodierenden Plasmide pUC19HPPDop und pCRScriptHPPDop;
Figur 4 Konstruktionsschemata der antiHGD kodierenden Plasmide pBinARHGDanti und pCRScriptHGDanti; und
Figur 5 Konstruktionsschemata der Transformationsvektoren pPTVHGDanti und pPZP200HPPD.
Allgemeine Methoden:
a) Allgemeine Klonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie- rungsschritte wie z.B. RestriktionsSpaltungen, AgaroseGelelektro- phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. b) Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467).
Beispiel 1 : Klonierung einer Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) mit für Expression in Brassica napus optimierter DNA-Sequenz
Die Aminosäuresequenz der Hydroxyphenylpyruvat-Dioxygenase (HPPD) aus Streptom ces averwitilis (Accessionnr. U11864) wurde unter Berücksichtigung der Codonverwendung in Brassica napus (Raps) in eine DNA-Sequenz zurück übersetzt. Die Codonusage wurde mittels der Datenbank http://www.dna.affrc.go.jp/ -nakamura/index.html bestimmt. Die abgeleitete Sequenz wurde unter Anheftung von Sall Schnittstellen durch Ligation überlappender Oligonukleotide mit anschließender PCR-Amplifikation (Rouwendal, GJA; et al, (1997) PMB 33: 989-999) synthetisiert (SEQ ID NO: 14). Die Richtigkeit der Sequenz des synthetischen Gens wurde durch Sequenzierung überprüft. Das synthetische Gen wurde in den Vektor pBluescript II SK+ (Stratagene) kloniert.
Beispiel 2: Klonierung einer Homogentisat-Dioxygenase (HGD) aus Brassica napus
a) Isolierung von gesamt-RNA aus Blüten von Brassica napus
Von Brassica napus var. Westa wurden offene Blüten geerntet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Das Material wurde anschliessend im Mörser pulverisiert und in Z6-Puffer (8 M Guanidinium-Hydrochlorid, 20 mM MES, 20 mM EDTA, auf pH 7,0 mit NaOH eingestellt; versetzt mit 400 μl Mercaptoethanol/100 ml Puffer unmittelbar vor Gebrauch) aufgenommen. Die Suspension wurde dann in Reaktionsgefässe überführt und mit einem Volumen Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol 25:24:1 ausgeschüttelt. Nach 10 minütiger Zentrifugation bei 15000 U wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und mit 1/20 Volumen IN Essigsäure und 0,7 Volumen Ethanol (absolut) die RNA gefällt. Nach erneuter Zentrifugation wurde das Pellet zunächst in 3M
Natriumacetatlösung und nach einer weiteren Zentrifugation in 70 % Ethanol gewaschen. Anschliessend wurde das Pellet in DEPC (Diethylpyrocarbonat) Wasser gelöst und die RNA-Konzentration photometrisch bestimmt. b) Herstellung von cDNA aus gesamt RNA aus Blüten von Brassica napus
20 μg Gesamt-RNA wurden zunächst mit 3,3 μl 3M Natriumacetatlösung, 2 μl IM Magnesiumsulfatlösung versetzt und auf 10 μl Endvolumen mit DEPC Wasser aufgefüllt. Dazu wurde 1 μl RNase-freie DNase (Boehringer Mannheim) gegeben und 45 min bei 37 Grad inkubiert. Nach Entfernen des Enzyms durch Ausschütteln mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol wurde die RNA mit Ethanol gefällt und das Pellet in 100 μl DEPC Wasser aufgenommen. 2,5 μg RNA aus dieser Lösung wurden mittels eines cDNA-Kits (Gibco BRL) nach Herstellerangaben in cDNA umgeschrieben.
c) PCR-Amplifikation eines Teilfragments der HGD aus Brassica napus
Durch Vergleich der DNA-Sequenzen der bekannten Homogentisat-Dioxygenasen (HGD) aus Arabidopsis thaliana (Accessionnr. U80668), Homo sapiens (Accessionnr. U63008) und Mus musculus (Accessionnr. U58988) wurden für eine PCR
Oligonukleotide abgeleitet, denen am 5 '-Ende eine Sall und am 3 '-Ende eine Asp718 Restriktionsschnittstelle angefügt worden war. Das Oligonukleotid am 5 '-Ende umfaßt die Sequenz:
GTCGACGGNCCNATNGGNGCNAANGG (SEQ ID NO:2),
beginnend mit der Base 661 des Arabidopsis-Gens. Das Oligonukleotid am 3 ' -Ende umfaßt die Sequenz :
GGTACCTCRAACATRAANGCCATNGTNCC (SEQ ID NO:3),
beginnend mit der Base 1223 des Arabidopsis-Gens, wobei N jeweils Inosin bedeutet und R für den Einbau von A oder G in das Oligonukleotid steht.
Die PCR-Reaktion wurde mit der Taq-Polymerase von TAKARA nach Herstellerangaben durchgeführt. Als Template wurden 0,3 μg der cDNA eingesetzt. Das PCR-Programm lautete:
1 Zyklus: 94 Grad 1 min
5 Zyklen: 94 Grad 4 sec
50 Grad 30 sec
72 Grad 1 min
5 Zyklen: 94 Grad 4 sec 48 Grad 30 sec
72 Grad 1 min
25 Zyklen: 94 Grad 4 sec 46 Grad 30 sec 72 Grad 1 min 1 Zyklus: 72 Grad 30 min
Das Fragment wurde mittels NucleoSpin Extract (Machery und Nagel) gereinigt und nach Herstellerangaben in den Vektor pGEMT (Promega) kloniert.
Die Richtigkeit des Fragments wurde durch Sequenzierung überprüft.
Beispiel 3 Herstellung eines Pflanzentransformations-Konstrukts zur Überexpression der HPPD mit optimierter DNA-Sequenz (HPPDop) und Ausschaltung der HGD
Zur Herstellung von Pflanzen, welche die HPPDop in Samen exprimieren und in denen die Expression der endogenen HGD mittels antisense-Technik unterdrückt ist, wurde ein binärer Vektor angefertigt, der beide Gensequenzen enthält (Figur 2, Konstrukt VI) .
a) Herstellung einer HPPDop-Expressionskassette
Dazu wurden zunächst die Komponenten der Kassette zur Expression der HPPDop, bestehend aus dem LeguminB-Promotor (Accessionnr. X03677), dem Transitpeptid der Ferredoxin: ADP+ Oxidoreduktase aus Spinat (FNR; Jansen, T, et al (1988) Current Genetics 13, 517-522) und dem NOS-Terminator (enthalten im pBHOl Accessionnr. U12668) mittels PCR mit den benötigten Restriktionsschnittstellen versehen.
Der Legumin-Promotor wurde aus dem Plasmid plePOCS (Bäumlein, H, et al.(1986) Plant J. 24, 233-239) mit dem stromaufwärts-Oligonukleotid:
GAATTCGATCTGTCGTCTCAAACTC (SEQ ID NO: 4)
und dem stromabwärts-Oligonukleotid:
GGTACCGTGATAGTAAACAACTAATG (SEQ ID NO: 5)
mittels PCR amplifiziert und in den Vektor PCR-Script (Stratagene) nach Herstellerangaben kloniert. Das Transitpeptid wurde aus dem Plasmid pSK-FNR (Andrea Babette Regierer "Molekulargenetische Ansätze zur Veränderung der Phosphat-Nutzungseffizienz von höheren Pflanzen", P+H Wissenschaftlicher Verlag, Berlin 1998 ISBN: 3-9805474-9-3) mittels PCR mit dem 5 '-Oligonukleotid:
ATGGTACCTTTTTTGCATAAACTTATCTTCATAG (SEQ ID NO: 6)
und dem 3 '-Oligonukleotid:
ATGTCGACCCGGGATCCAGGGCCCTGATGGGTCCCATTTTCCC (SEQ ID NO: 7)
amplifiziert.
Der NOS-Terminator wurde aus dem Plasmid pBHOl (Jefferson, R.A. , et al (1987) EMBO J. 6 (13), 3901-3907) mittels PCR mit dem 5 ' -Oligonukleotid:
GTCGACGAATTTCCCCGAATCGTTC : (SEQ ID NO: 8)
und dem 3 '-Oligonukleotid
AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA (SEQ ID NO: 9)
amplifiziert.
Das Amplikon wurde jeweils in den Vektor pCR-Script (Stratagene) nach Herstellerangaben kloniert.
Für die Expressionskassette wurde zunächst der NOS-Terminator als Sall/Hindlll-Fragment in einen entsprechend geschnittenen pUC19-Vektor (Yanisch-Perron, C, et al (1985) Gene 33, 103-119) umkloniert. In dieses Plasmid wurde anschließend das Transitpeptid als Asp718/Sall-Fragment eingeführt. Der Legumin-Promotor wurde dann als EcoRI/Asp718 Fragment einkloniert. Das Gen HPPDop wurde als Sall-Fragment in dieses Konstrukt eingeführt (Figur 3, Konstrukt III).
Die fertige Kassette in pUC19 wurde als Template für eine PCR verwendet, wozu für den Leguminpromotor das Oligonukleotid:
AAGCTTGATCTGTCGTCTCAAACTC (SEQ ID NO: 10)
und für den Nos-Terminator das Oligonukleotid:
AAGCTTCCGATCTAGTAACATAGA (SEQ ID NO: 11) verwendet wurden. Das Amplikon wurde in pCR-Script kloniert und pCR-ScriptHPPDop genannt (Figur 3, Konstrukt IV).
b) Herstellung einer antiHGD-Expressionskassette 5
Für die Ausschaltung der HGD mit antisense-Technik wurde das Genfragment als Sall/Asp718-Fragment in den Vektor pBinAR (Höfgen, R. und Willmitzer, L., (1990) Plant Sei. 66: 221-230) kloniert, in dem der 35S-Promotor und der OCS-Terminator 0 vorliegen (Figur 4, Konstrukt I). Das Konstrukt diente als Vorlage für eine PCR Reaktion mit dem Oligonukleotid:
ATTCTAGACATGGAGTCAAAGATTCAAATAGA (SEQ ID NO: 12),
5 spezifisch für die 35S-Promotor-Sequenz; und dem Oligonukleotid:
ATTCTAGAGGACAATCAGTAAATTGAACGGAG (SEQ ID NO: 13).
0 spezifisch für OCS-Terminator-Sequenz
Das Amplikon wurde in den Vektor PCR-Script (Stratagene) kloniert und HGDanti genannt (Figur 3, Konstrukt II).
25 c) Herstellung des binären Vektors
Zur Erstellung eines binären Vektors zur Raps-Transformation wurde zunächst das Konstrukt HGDanti aus pCRScriptHGDanti als Xbal-Fragment in den Vektor pPTV (Becker, D.,(1992) PMB 20, 30 1195-1197) kloniert (Abbildung 5, Konstrukt V). In dieses Plasmid wurde das Konstrukt LegHPPDop aus pCRScriptHPPDop als Hindlll-Fragment eingefügt. Dieses Plasmid wurde mit pPTVHPPD/HGDanti bezeichnet (Figur 2, Konstrukt VI).
35 Beispiel 4: Herstellung von Konstrukten zur Kotransformation zur Überexpression von HPPDop und Ausschaltung von HGD in Brassica napus Pflanzen
Zur Kotransformation von Pflanzen mit HPPDop und antiHGD wurde 40 das Konstrukt LeguminB-Promotor/Tansitpeptid/HPPDop/NOS aus dem Vektor pCRScriptHPPDop (Figur 3, Konstrukt IV) als Hindlll-Fragment herausgeschnitten und in den entsprechend geschnittenen Vektor pPZP200 (Hajdukiewicz, P., et al., (1994) PMB 25(6): 989-94) eingefügt (Figur 5, Konstrukt VII). Dieses 45 Plasmid diente später zur Kotransformation von Pflanzen zusammen mit dem Vektor pPTVHGDanti (Figur 5, Konstrukt V) aus Beispiel 3 c).
Beispiel 5: Herstellung transgener Brassica napus Pflanzen 5
Die Herstellung transgener Raps Pflanzen orientierte sich an einem Protokoll von Bade, J.B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., Hrsg., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die 10 Zusammensetzung der verwendeten Medien und Puffer angegeben ist.
Die Transformation erfolgte mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm EHA105 ( Li, X.Q., et al., PMB (1992) 20, 1037). Zur Transformation wurde entweder das oben genannte Plasmid 15 pPTVHPPDopHGDanti (Figur 2) oder nach Anzucht gemischte Kulturen von Agrobakterien mit den Plasmiden pPTVHGDanti und pPZP200HPPDop (Figur 5) verwendet.
Samen von Brassica napus var. Westar wurden mit 70% Ethanol (v/v) 20 oberflächensteril gemacht, 10 Minuten bei 55°C in Wasser gewaschen, in l%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) 20 Minuten inkubiert und sechsmal mit sterilem Wasser jeweils 20 Minuten gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glaskolben mit 25 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehreren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explantate wurden 30 Minuten mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einem 300 ml 30 Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallusinduktionsmedium wurden die Kulturen für 24 Stunden bei 100 U/min inkubiert.
Von den Agrobacterium Stämmen wurden Übernachtkulturen bei 29°C in Luria Broth-Medium mit Kanamycin (20mg/l) angesetzt, davon 2ml in
35 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 Stunden bei 29°C bis zu einer OD600 von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine ODgoo
40 von 0,3 eingestellt. Zur Kotransformation wurde die Lösung der beiden Stämme zu gleichen Teilen vermischt.
Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit sterilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung 45 hinzugefügt, vorsichtig gemischt und 20 min inkubiert. Die
Agrrobacterien-Suspension wurde entfernt, die Raps-Explantate 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus-Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co-Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explantate zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explantaten wurde in 15 cm Petrischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten entfernt.
Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explantate in 90 mm
Petrischalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Phosphinotricin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25 °C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/ 8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß-Induktionsmedium umgesetzt. Alle weiteren Schritte zur Regeneration ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J.B und Damm, B. (in: Gene Transfer to Plants, Potrykus, I. und Spangenberg, G., Hrsg., Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

Claims

Patentansprüche
1. Expressionskassette, enthaltend unter genetischer Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen
a) die kodierende Nukleinsäuresequenz für 4- Hydroxyphenyl- pyruvat-Dioxygenase (HPPD) oder für ein funktionales Äquivalent davon; und/oder
b) wenigstens eine Nukleinsäuresequenz (anti-HGD), welche zu einer Inhibition der Homogentisat-Dioxygenase(HGD)-Aktivität befähigt ist.
2. Expressionskassette nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die anti-HGD-Sequenz zu einer antisense-Nukleinsäurese- quenz transkribierbar ist, die zur Inhibition der HGD-Aktivität befähigt ist.
3. Expressionskassette nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende HPPD-Sequenz mit der kodierenden Sequenz eines Pflanzenorganell-spezifischen Transitpeptids funktional verknüpft ist.
4. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende HPPD-Sequenz und die anti-HGD-Sequenz jeweils unter der genetischen Kontrolle eines pflanzenspezifischen Promotors stehen.
5. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die kodierende HPPD-Nukleinsäuresequenz für ein Protein enthaltend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 oder ein funktionales Äquivalent davon kodiert oder eine Nukleinsäuresequenz von Rest 8 bis Rest 1153 gemäß SEQ ID NO: 14 oder ein funktionales Äquivalent davon umfaßt.
6. Expressionskassette nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein HGD-Sequenzmotiv gemäß SEQ ID NO:l in antisense-Orientierung umfaßt.
7. Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
8. Vektor nach Anspruch 7, umfassend wenigstens ein Expressionskonstrukt des Typs: 5 '-Pflanzenspezifischer Promotor/HPPD oder anti-HGD/ Terminator-3 ' ,
wobei die Einzelelemente miteinander funktional verknüpft 5 sind und wobei HPPD gegebenenfalls für ein Fusionsprotein, umfassend ein abspaltbares Transitpeptid und ein Polypeptid mit HPPD-Aktivität, kodiert.
9. Vektor nach Anspruch 8, umfassend eines der folgenden Expres- 0 sionskonstrukte:
a) 35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator
b) LeguminB-Promotor/HPPD/NOS-Terminator 5 c ) 35S-Promotor/anti-HGD/OCS-Terminator/LeguminB-Promotor/ HPPD/NOS-Terminator
10. Mikroorganismus, enthaltend einen rekombinanten Vektor nach 0 einem der Ansprüche 7 bis 9.
11. Mikroorganismus nach Anspruch 10 aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens . 5
12. Verwendung eines Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 9 oder eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 10 und 11 zur Transformation von Pflanzen, Pflanzenzellen, -geweben oder -teilen.
30
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Pflanzen, Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile zu einer verbesserten Tocopherol-Synthese befähigt werden.
35 14. Transgene Pflanze, transformiert mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 oder mit einem Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 10 und 11, oder transgene Zellen, Gewebe, Teile oder transgenes Vermehrungsgut davon.
40 15. Transgene Pflanze nach Anspruch 14, ausgewählt unter
Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat, wie Kresse, und den verschiedenen Baum- , Nuß- und Weinspecies .
45
16. Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen nach einem der Ansprüche 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß man Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile oder Protoplasten mit einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 7 bis 9 oder mit einem Mikroorganismus gemäß einem der Ansprüche 10 und 11 transformiert, die transformierten Zellen, Gewebe, Pflanzenteile oder Protoplasten in einem Wachstumsmedium kultiviert und gegebenenfalls aus der Kultur Pflanzen regeneriert .
17. Verwendung einer Expressionskassette nach einem der Ansprüche 1 bis 6, eines Vektors nach einem der Ansprüche 7 bis 9, eines Mikroorganismus nach einem der Ansprüche 10 oder 11 oder einer transgenen Pflanze nach einem der Ansprüche 14 und 15 zur Gewinnung von Pflanzenmetaboliten, insbesondere Tocopherolen .
18. Verfahren zur Herstellung von Tocopherolen, dadurch gekennzeichnet, daß man aus einer Kultur einer transformierten Pflanze nach einem der Ansprüche 14 und 15 das Tocopherol isoliert.
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