WO2000073790A1 - Testsystem zum in vitro nachweis einer antigen-spezifischen immunantwort - Google Patents

Testsystem zum in vitro nachweis einer antigen-spezifischen immunantwort Download PDF

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WO2000073790A1
WO2000073790A1 PCT/EP2000/005003 EP0005003W WO0073790A1 WO 2000073790 A1 WO2000073790 A1 WO 2000073790A1 EP 0005003 W EP0005003 W EP 0005003W WO 0073790 A1 WO0073790 A1 WO 0073790A1
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Ingrid Jochmus
John Nieland
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Medigene Aktiengesellschaft
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    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
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    • C12N2501/24—Interferons [IFN]

Definitions

  • the present invention relates to a test system containing at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and at least one antigen-presenting target cell, in particular B cell, macrophage, predendritic cell, dendritic cell , embryonic cell and / or fibroblast, which was incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP, for the in vitro detection of an antigen-specific immune response, in particular a cellular immune response from Effector cells of the immune system, in particular B cells, NK cells, preferably T cells, in a particularly preferred manner cytotoxic T cells or T helper cells, and their use in diagnostics and therapy.
  • an antigen-specific immune response in particular a cellular immune response from Effector cells of the immune system, in particular B cells, NK cells, preferably T cells, in a particularly
  • the papilloma viruses also called wart viruses, are double-stranded DNA viruses with a genome size of approximately 8000 base pairs and an icosahedral capsid with a diameter of approximately 55 nm.
  • more than 100 different human papilloma virus types are known, some of which, e.g. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 or HPV-58, malignant tumors and others e.g. HPV-6, HPV-11 or HPV-42 can cause benign tumors.
  • the genome of the papillomavirus can be divided into three areas:
  • the first area concerns a non-coding region, the regulatory elements for the Contains transcription and replication of the virus.
  • the second region so-called E (early) region, contains various protein-coding sections E1-E7, of which, for example, the E6 and E7 proteins are responsible for the transformation of epithelial cells and the E1 protein controls the DNA copy number.
  • the E6 and E7 regions are so-called oncogenes, which are also expressed in malignant cells.
  • the third region also called the L (late) region, contains two protein-coding sections L1 and L2 which code for structural components of the virus capsid.
  • L1 protein is understood to mean the main capsid protein of papillomaviruses (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445).
  • HPV-6 and HPV-1 1 are blamed for genital warts, some types of papillomavirus such as HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV- 45, HPV-52 and HPV- 58 are associated with malignant tumors of the anogenital tract.
  • HPV-16 has been linked to cervical cancer (Cervixcarcinom).
  • HPV-16 is the main risk factor for the formation of cervical neoplasia.
  • the immune system plays an important role in the progression of the disease. Cellular immune responses and, in particular, antigen-specific T-lymphocytes are probably important for the defense mechanism.
  • the E7 gene in highly malignant cervical intraepithelial neoplasia (CIN II / III) and cervical tumors, the E7 gene is constitutively expressed in all layers of the infected epithelium. Therefore, the E7 protein in particular is regarded as a potential tumor antigen and as a target molecule for activated T cells (see, for example, WO 93/20844).
  • the E7-induced cellular immune response in the patient does not appear to be strong enough to influence the course of the disease. The immune response may be boosted by appropriate vaccines.
  • capsomers are understood to be an oligomeric configuration that is made up of five Ll proteins.
  • the capsomer is the basic building block from which viral capsids are built.
  • Stable capsomers are capsomers that are unable to form capsids.
  • Capsids are understood to mean the shell of the papilloma virus, which is composed, for example, of 72 capsomers (Baker T. et al.
  • VLP is a capsid that is morphologically and antigenically similar to an intact virus.
  • the VLPs could be used in various animal systems to elicit a humoral immune response, which is characterized by the formation of neutralizing antibodies.
  • a humoral immune response which is characterized by the formation of neutralizing antibodies.
  • virus-neutralizing antibodies against L1 and / or L2 protein is of less clinical importance if the virus infection has already taken place, since instead of antibodies for the elimination of virus-infected cells, a virus-specific cytotoxic T cell (CTL) response appears to be necessary.
  • CTL cytotoxic T cell
  • VLPs are able to trigger a cytotoxic T cell response, an immune response directed exclusively against the capsid proteins L1 and / or L2 does not seem to be suitable for combating a tumor caused by papillomaviruses.
  • CVLPs for chimeric virus-like particles
  • a fusion protein of the capsid protein L1 and the potential tumor antigen E7 WO 96/11272 and Müller, M. et al. (1997) Virology , 234, 93
  • the CVLPs only triggered a minor humoral immune response against the E7 protein (Müller, M. et al. (1997), supra).
  • some of the CVLPs tested actually induce the desired E7-specific cytotoxic T cell response in mice (see also Peng S. et al. (1998) Virology 240, 147-57).
  • CVLPs consisting of C-terminally truncated L1 of bovine papillomavirus (BPV) and HPV-16 E7 -57 , which induce E7-specific cytotoxic T cells after vaccination of C57Bl / 6 mice and protect against the growth of E7-expressing tumors.
  • BBV bovine papillomavirus
  • HPV-16 E7 -57 which induce E7-specific cytotoxic T cells after vaccination of C57Bl / 6 mice and protect against the growth of E7-expressing tumors.
  • CVLPs consisting of HPV-16 Ll and HPV-16 L2 fused with the full-length HPV-16 E7 protein, which after immunization of C57Bl Protect / 6 mice against the growth of epithelial E7-expressing tumor cells, although cytotoxic T cells have not been detected and the induction of the cellular immune response thus appears to be less efficient.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • NK natural killer cells have two receptors: one recognizes sugar on the cell surface of antigen-presenting cells, the other recognizes MHC I molecules. The stimulation of the NK cells takes place after detection of a sugar and simultaneous absence of MHC I molecules.
  • the activation of an immune cell achieved by stimulation with an antigen can be achieved, for example, by the synthesis of cytokines such as e.g. Interferon ⁇ , interleukin 3 (IL3) can be detected.
  • cytokines such as e.g. Interferon ⁇ , interleukin 3 (IL3)
  • the corresponding cytokine accumulates intracellularly in these test systems and can then be detected, for example, using fluorescence-coupled antibodies (Kern F. et al. (1998) Nat. Med. 4, 975-8).
  • the proportion of immune cells that could be activated by the respective antigen can then finally be determined in a FACS (fluorescens activated cell sorter).
  • Eliminated cytokines can also be detected, for example, in the ELISA.
  • Other possible detection methods for the activation of immune cells are ELISPOT, prohferation tests or Cr release tests.
  • the peptides are characterized by the MHC molecules of class I, which are expressed on the cell surface, and which are sucked by organisms va ⁇ very strongly bound to organism. This in turn means that a peptide which is very well suited for the detection of T cell responses for one organism cannot be used for another organism of the same type, since this organism corresponds to the corresponding MHC-I Haplotype not available
  • MHC-I Haplotype not available
  • mice from inbred strains that have an identical MHCJ haplotype this system has established itself, however, this experimental approach is not practical in humans, for example, because different peptides are used for each patient to stimulate the T cells
  • the protein fragments or peptides which can represent a cytotoxic T cell epitope, are not known
  • the uptake of the specific antigen is MHC-independent for these systems, so that cells from different organisms can present parts of the specific antigen to the T cells, even if the respectively presented parts of the antigen differ from haplotype Can distinguish haplotype.
  • the vaccinia and the adenovirus system has the disadvantage that such a virus infection of the cells is associated with viral gene expression and viral replication. This additional influence on the antigen-presenting cells makes a quantitative measurement of a cytotoxic T cell response, which is limited to the specific antigen, significantly more difficult. On the other hand, the handling of these systems is difficult and costly, since security level S2 is required when dealing with recombinant vaccines or adenoviruses.
  • the aim of the present invention was therefore to develop a test system for the cellular immune response
  • the immune response in particular from cytotoxic T cells, but also e.g. can be tested by T helper cells, B cells or NK (natural killer) cells, with the possibility of differentiation between the immune cells;
  • a predendritic cell is understood to mean a precursor cell of a dendritic cell which expresses CD 16 strongly, whereas MHC class I and II molecules and CD80, CD86 and CD40 express only relatively weakly.
  • dendritic cells hardly express CD 16, but strongly MHC class I and II molecules as well as CD80, CD86 and CD40 (Woodhead et al. (1998) Immunology 94 (4): 552-9).
  • a CD16 positive cell means a cell for which the expression of CD 16 can be detected using a specific antibody, for example in a FACScan experiment.
  • CVLPs which could trigger a cellular immune response in vivo, could bind in vitro to predendritic cells, for example JAWS II cells.
  • these CVLPs were able to bind to cells of a T-lymphoma cell line. It can thus be concluded that the binding of the CVLPs to the predendritic cell represents a limiting step in triggering a cellular immune response.
  • CD 16 is strongly expressed on predendritic cells, but not or hardly on dendritic cells. In fact, dendritic cells are barely able to bind CVLPs (data not shown).
  • the particular structure of the CVLPs would only abolished in the cytoplasm by disassembly and processing, so that, unlike exogenous proteins, primarily, but not exclusively, MHC-I molecules gain access to antigen fragments, bind them, transport them to the cell surface and present them to the CD8-positive cells intracellular MHC-II molecules are also loaded with antigen fragments which, analogously to MHC-I, present the peptides to the CD4-positive cells, so that both MHC-I and MHC-fl molecules of the antigen-presenting cells are Incubation with CVLPs with CVLP "Load" peptides ("CVLP-loaded cells").
  • Presentation within the meaning of the present invention is understood to mean when a peptide or protein fragment binds to an MHC molecule, this binding being able to take place, for example, in the endoplasmic reticulum or extracellular space, and then when this MHC molecule-peptide complex is on the extracellular side of the cell membrane is bound so that it can be specifically recognized by immune cells.
  • the cytotoxic T cells or T helper cells proliferate. If there is continued stimulation by at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and / or a cell which produces at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one cap sid, at least one VLP, and / or at least one CVLP, cytokines, such as interferon ⁇ or interleukin 4 (IL4), which accumulate in the cytoplasm in this system.
  • cytokines such as interferon ⁇ or interleukin 4 (IL4)
  • the intracellular interferon ⁇ can be used for the detection of specifically activated T cells.
  • capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs surprisingly behave like viruses and not like proteins with regard to the triggered immune response, although they do not trigger expression of viral proteins or viral replication. Because of their ability to pseudoinfect, these compounds thus combine the advantages of the approaches with free peptides / proteins with those of recombinant viruses. Analogous to viruses, capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs are able to enter the cytoplasm as particles and are therefore not MHC-restricted. in the In contrast to the viral system, however, no gene expression is required to release or to express the specific antigen and to load MHC I molecules.
  • capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs activate both CD4 and CD8 positive T cells equally.
  • capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs are only classified with S 1 with regard to their security standards, so that the technical implementation is cheaper than S2 security standards, which are necessary in viral systems, and in many places with less technical Effort can be realized.
  • the present invention therefore relates to a test system comprising at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and at least one antigen-presenting target cell, in particular B cell, macrophage, predendritic cell , Dendritic cell, embryonic cell and / or fibroblast, which has been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP, for the in vitro detection of an antigen-specific immune response, in particular cellular immune response from effector cells of the immune system, in particular B cells, NK cells, preferably T cells, in a particularly preferred manner cytotoxic T cells or T helper cells, and their use in diagnostics and therapy.
  • an antigen-specific immune response in particular cellular immune response from effector cells of the immune system, in particular B cells, NK cells, preferably T cells, in a particularly preferred manner
  • the present invention further relates to a test system which has at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and or at least one CVLP and at least one predendritic cell and or a CD16-positive cell which has at least one Capsomer, at least one stable Capsomer, at least one Capsid, min at least one VLP, and / or at least one CVLP was incubated for the in vitro detection of an antigen-specific immune response, the binding of the stable capsomer, capsid, VLP and / or CVLPs to the cell mentioned being measured.
  • the effector cells are mammalian cells, in particular human or murine cells.
  • the capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs used in the test system contain at least one Ll protein of one or more papilloma viruses, or at least one Ll protein and at least one papilloma virus L2 protein, in particular L1 proteins or Ll and L2 proteins from human, bovine and / or 'cottontail rabbit' papillomaviruses.
  • the capsomers, stable capsomers, capsids, and / or CVLPs contain at least one L1 fusion protein, consisting of an L1 protein portion of one or more papillomaviruses and a protein portion heterologous to the Ll protein.
  • the Ll protein used can be a naturally occurring Ll protein, or it can contain one or more deletions, which can be, for example, C-terminal, N-terminal, and / or internal, and / or one or more mutations.
  • up to at least approximately 35 amino acids preferably at least approximately 25 to approximately 35, in particular at least approximately 32 to approximately 34 amino acids are deleted from the C-terminus of the L1 protein.
  • the protein portion which is heterologous to the L1 protein can be a naturally occurring protein or one or more deletions which, for example, C- may be terminal, N-terminal, and or internal, and / or contain multiple mutations.
  • This protein, which is heterologous to the L1 protein can be of a bacterial or viral origin in a particular embodiment, for example from HIV, HBV, HCV or CMV, preferably from papillomaviruses, in particular from human papillomavirus, such as but not exclusively from E6 or E7.
  • at least approximately 55 amino acids preferably at least approximately 5 to approximately 55, in particular at least approximately 38 to approximately 55, amino acids are deleted from the C-terminus of the E7 protein.
  • proteins can also be derived from autoimmune antigens such as thyroglobulin, myelin or zona pellucida glycoprotein 3 (ZP 3 ), which are associated with certain autoimmune diseases such as thyroiditis, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), oophoritis or rheumatoid arthritis.
  • the protein heterologous to L1 is derived from tumor antigens, preferably melanoma antigens such as MART, ovarian carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1 or CA125, colon carcinoma antigens such as CA125 or breast carcinoma antigens such as Her2 new (c - erbB2), BCRA-1, BCRA-2.
  • This anti gene portion can, but need not, comprise individual domains or epitopes of a protein.
  • the protein portion which is heterologous to the L1 protein is bound, preferably fused.
  • Another object of the present invention is a cell which, after in vitro incubation with capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs, contains proteins and / or protein fragments from said capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs, preferably presented, especially over both MHC-I and MHC-II complexes.
  • the cell according to the invention contains, in particular presents proteins, protein fragments, and / or peptides from capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and or CVLPs which contain at least one L1 protein of one or more papillomaviruses, or at least one Ll protein and at least one a papilloma virus Contain L2 protein.
  • the cell according to the invention contains, in particular, presents proteins, protein fragments, and / or peptides from capsomers, stable capsomers, capsids, and / or CVLPs, which contain at least one L1 fusion protein, consisting of an Ll protein portion of one or more papillomaviruses and contain a protein portion heterologous to the Ll protein.
  • the Ll protein used can be a naturally occurring Ll protein or it can contain one or more deletions, which can be, for example, C-terminal, N-terminal, and / or internal, and / or one or more mutations.
  • up to at least approx. 35 amino acids preferably at least approx. 25 to approx. 35, in particular at least approx. 32 to approx. 34 amino acids are deleted from the C-terminus of the L1 protein.
  • the protein portion heterologous to the L1 protein can be a naturally occurring protein or it can contain one or more deletions, which can be, for example, C-terminal, N-terminal, and or internal, and / or several mutations.
  • this protein, which is heterologous to the L1 protein can be of bacterial or viral origin, for example from HIV, HBV, HCV, HSV, EBV, HTLV or CMV, preferably from papillomaviruses, in particular from human papillomavirus, such as, for example, from E6 or E7.
  • At least approximately 55 amino acids preferably at least approximately 5 to approximately 55, in particular at least approximately 38 to approximately 55, amino acids are deleted from the C-terminus of the E7 protein.
  • these proteins can be derived from autoimmune antigens such as, for example, thyroglobulin, myelin or zona pellucida glycoprotein 3 (ZP 3 ), which are associated with certain autoimmune diseases such as, for example, thyroiditis, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), oophoritis or rheumatoid arthritis.
  • the protein heterologous to L1 is derived from tumor antigens, preferably melanoma antigens such as MART, ovarian carcinoma antigens such as Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 or CA125, colon carcinoma antigens such as CA125 or breast carcinoma antigens such as Her2 new (c-erbB2), BCRA-1, BCRA-2.
  • This portion of antigen can, but need not, comprise individual domains or epitopes of a protein.
  • the antigen portion is bound to the Ll protein, preferably fused.
  • the cell is an antigen-presenting cell, in particular B cell, macrophage, predendritic cell, dendritic cell, embryonic cell or fibroblast.
  • Another object of the present invention is a method for producing a target cell, which is based on the incubation of the target cell with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP in vitro.
  • Another object of the present invention is a method for producing a test system in which at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP is genetically engineered and the target cell by incubation with at least one capsomer, one stable capsomer, a capsid, a VLP, and / or CVLP, and the effector cell is an immune cell line and / or cultivated primary immune cell, preferably a murine or human immune cell line and / or cultivated primary immune cell.
  • the genetically engineered proteins which are part of the capsomers, stable capsomers, capsids, VLPs, and / or CVLPs are, in a preferred embodiment, in bacteria such as E.
  • Another object of the present invention is a method for producing a test system in which at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP is produced by genetic engineering, and with a predendritic and or a CD 16 positive cell is incubated.
  • Another object of the present invention is a method for the in vitro detection of the activation of effector cells of the immune system by at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and / or at least one cell, which was incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP, which contains the following steps: a) A test system according to the invention is used in a first step.
  • an incubation of immune cells takes place for at least about 5h, in particular about 17h, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and / or at least one cell which has been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or one CVLP.
  • incubation of, for example, PBMCs, T cellinins or cultured primary T cells with antigens, preferably with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP is carried out only for at least about 5 hours, and / or at least one CVLP and / or at least one cell with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one Capsid, at least one VLP, and / or a CVLP was incubated. During this short time, only the cells are activated by the antigen that have previously been stimulated by the same or a similar antigen. b) In a second step, the possible activation of effector cells is determined.
  • stimulated T cells can be detected by various methods such as the production or secretion of cytokines by the T cells, the expression of surface molecules on T cells, the lysis of target cells or the proliferation of cells.
  • suitable methods are for example, a cytokine assay (Chapter 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999) supra), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), a " 'Cr-release assay (Chapter 3J 1 in Current Protocols in Immunology, supra) or the detection of proliferation (Chapter 3J2 in Current Protocols in Immunology, supra)
  • immune cells such as cytotoxic T cells, T helper cells, B cells, NK cells and other cells.
  • step a ') is inserted before step a) a')
  • At least one effector cell of the test system is used for at least about 8 weeks, in particular at least about 3 weeks, with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or CVLP and / or at least one target cell which has been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or one CVLP, before the step a) connects.
  • This preactivation of the effector cells has the consequence that the effector cells in the subsequent step a) by adding at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or CVLP and / or at least one target cell which has at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least a VLP, and / or a CVLP, is restimulated.
  • Co-cultivation is the growth of at least one effect cell in the presence of at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or CVLP and / or at least one target cell, which has at least one capsomer, at least one stable Capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP was to be understood in the same growth medium and the same tissue culture container.
  • a component of the test system namely at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and / or at least one cell, which is used with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP was incubated as standard while a second component of the test system, the effector cells, is the actual test component.
  • the activation of the effector cell observed in the reaction of both components is combined with the activating effect of a capsomer, stable capsomer, capsid, VLP, and / or CVLP, and / or a cell that comes with at least one capsomer, for example from an industrial production process.
  • at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and or a CVLP was compared. This embodiment allows, for example, the quality control of batches of prophylactic and / or therapeutic vaccines.
  • Another preferred method that uses the test system according to the invention is the selection of particularly effective epitopes for the development of vaccines based on parts of proteins. If, for example, different CVLPs, each containing short peptides of a protein or a pathogen as a fusion component, are examined in separate approaches with regard to their ability to mediate stimulation of immune cells, the quantitative comparison of the immune responses to the respective CVLPs can be particularly effective Identify peptides. Such peptides can then be combined for new vaccines. Proteins can be tested analogously to this.
  • the invention therefore furthermore relates to a method for identifying epitopes, peptides or protein fragments which trigger an immune response, in particular a cellular immune response.
  • Another object of the present invention is a method for the in vitro detection of the activation of effector cells of the immune system by at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and / or at least one cell, which has been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP, which contains the following steps:
  • PBMCs in particular T cells
  • PBMCs are obtained from the blood of a donor, in particular from the blood of a donor who already has at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or CVLP and / or at least one target cell, which incubates with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or one CVLP was vaccinated and the effector cells obtained are cultivated or spleen cells from a mouse are obtained, in particular spleen cells from a mouse that already contain at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or CVLP and / or at least a target cell that has been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP
  • the isolated and / or cultivated cells are used for at least about 5 hours, in particular about
  • At least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP and / or at least one cell which has at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP was added.
  • the incubation is carried out for at least about 5 hours. During this short stimulation time, only the cells that were previously stimulated by the same or a similar antigen are activated by the added antigen.
  • the possible activation of effector cells is determined.
  • stimulated T cells can be detected by various methods such as the detection of the production or secretion of cytokines by the T cells, the expression of surface molecules on T cells, the lysis of target cells. cells or the proliferation of cells. Methods suitable for this are, for example, a cytokine assay (Chapter 6.2 to 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), supra), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), a 51 Cr release test (Chapter 3J 1 in Current Protocols in Immunology, supra) or the
  • step I) is inserted after step I)
  • the isolated cells are kept for at least about 8 weeks, in particular at least about 3 weeks, with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and or CVLP and / or at least one target cell, which has been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP, before the step
  • the effector cells in the subsequent step II) being added by adding at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or CVLP and / or at least one target cell incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and or a CVLP.
  • This type of execution is called restimulation.
  • the first stimulation can also have been carried out as described under point I) within the donor, for example by vaccination, an infection, a tumor or as part of an autoimmune disease. However, it can also be carried out in vitro as described under point I ') in order to obtain specific reactive cell clones or populations.
  • the immune status of an organism can be tested against a pathogen by the method according to the invention.
  • PBMCs of an organism are isolated and restimulated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, and / or CVLP and or at least one target cell, which has at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, and / or incubated with a CVLP that contains a pathogen-specific antigen or a part thereof as a fusion component, it is possible to find reactive immune cells against the respective antigen, such as, for example, cytotoxic T cells, reactive T helper cells or reactive B cells. Cells show a previous infection.
  • the reactive cells can be quantified by quantifying them, so that e.g. the need for booster shots can be analyzed.
  • the success of the vaccination and / or the current immune status of a patient can also be checked after a vaccination that has been in the past.
  • Monitoring is not limited to prophylactic and / or therapeutic vaccination with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, and / or CVLP and / or at least one target cell, which with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, and / or a CVLP, but is also suitable for conventional vaccines.
  • the detection of specific reactive T cells by the present test method can be used to diagnose infections that are difficult to detect. If, for example, CVLPs are constructed with antigens or parts of antigens from known but difficult to detect pathogens, the T cell response to such antigens can provide information about an existing infection.
  • the HLA haplotypes of patient groups which are immune to certain infectious diseases or are not or only poorly immunized are correlated with the reactivity of their T cells towards antigens of the corresponding pathogens, so haplotypes can be identified that mediate immunity to the pathogen.
  • capsomers, stable capsomers, capsids, and / or CVLPs and / or target cells which contain at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, and / or a CVLP incubated are produced that contain these autoimmune antigens or parts. These can then be used to diagnose the respective autoimmune disease by measuring the T cell response of a patient after stimulation of, for example, his isolated PBMCs with the respective autoimmune antigen.
  • Another embodiment of the method according to the invention is the differentiation of tumor types with regard to different specific tumor anti- genes. If different types of tumor are known, which differ among other things in the fact that they express different tumor antigens, and on the other hand you have different T cell populations that can be specifically restimulated by one of the respective tumor antigens, you can by Evidence of restimulation of reactive T cells classify a patient's tumor. Such a classification could then be used, for example, to specifically stimulate the patient's own T cells by vaccination with the respective tumor antigens in order to generate a cytotoxic T cell population against the patient's own tumor cells.
  • the methods according to the invention are suitable, for example, for the quality control of vaccine batches during production, the identification of new antigenic epitopes, the identification of patient haplotypes, the differentiation from autoimmune diseases or the differentiation of tumor types, a high processing speed and reproducibility when using the test system.
  • the invention therefore furthermore relates to a method which activates effector cells by at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP or by at least one cell which has at least one capsomer , at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or a CVLP was incubated in high-throughput systems.
  • peptides or proteins can also be investigated on a large scale with regard to their triggering of immune responses, in particular T-cell responses.
  • Another object of the invention is the use of at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP or at least one antigen-presenting target cell, in particular B cell, macrophage, dendritic cal cell, embryonic cell or fibroblast which have been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP, and effector cells of the immune system, in particular B cells, NK cells, preferably T cells, in a particularly preferred manner cytotoxic T cells or T helper cells for triggering or for detecting an immune response.
  • B cells B cells
  • NK cells preferably T cells
  • the invention further relates to a diagnostic agent containing at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP or at least one antigen-presenting target cell, in particular B cell, macrophage, dendritic cell, embryonic cell or fibroblast which have been incubated with at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP, effector cells of the immune system, in particular B cells, NK cells, preferably T cells , in a particularly preferred manner cytotoxic T-cells or T-helper cells and optionally a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a diagnostic agent containing at least one capsomer, at least one stable capsomer, at least one capsid, at least one VLP, and / or at least one CVLP or at least one antigen-presenting target cell, in particular B cell, macrophage, dendritic cell, embryonic cell or
  • supports known to those skilled in the art are glass, polystyrene, polypropylene, polyethylene, dextran, nylon, amylase, natural or modified cellulose, polyacrylamides, agarose, aluminum hydroxide or magnitide.
  • a diagnostic agent according to the invention can be in solution, bound to a solid matrix and / or an adjuvant added.
  • the diagnostic agent can be administered in various ways. Examples of administration forms known to the person skilled in the art are parenteral, local and / or systemic administration by, for. B. oral, intranasal, intravenous, in- tramuscular, and / or topical application. The preferred form of application is influenced, for example, by the natural route of infection of the respective papillomavirus infection. The amount administered depends on the age, weight and general health of the patient and the type of papilloma virus infection.
  • the diagnostic agent can be administered in the form of capsules, solution, suspension, elixir (for oral administration) or sterile solutions or suspensions (for parenteral or intranasal administration). For example, saline or phosphate-buffered saline can be used as the inert and immunologically acceptable carrier.
  • FIG. 1 shows the graphic evaluation of the restimulation of murine, HPV16L1-specific T cells by two murine antigen-presenting cell lines (C3 and B16F10), which had previously been incubated with increasing amounts of CVLPs.
  • the increasing concentrations of CVLPs are plotted against the percent of stimulated T cells that were detected via interferon ⁇ production.
  • Fig. 2 shows the graphic evaluation of the restimulation of murine, HPV16Ll-peptide-specific T cells by murine C3 cells, which had previously been incubated with different CVLP preparations in the absence and presence of virus-neutralizing antibodies.
  • FIG. 3A shows the evaluation of five FACScan experiments after stimulation of human PBMC with different concentrations of CVLPs (0-10 ⁇ g ml), in which human T cells that are positive for human interferon ⁇ are shifted upwards in the graphic.
  • FIG. 3B shows the graphical evaluation of FIG. 3A, in which the concentration of CVLPs is plotted against the percent of the stimulated cells. Stimulated cells are defined by the detection of human interferon ⁇ .
  • FIG. 4 shows the graphic evaluation of the restimulation of human PBMC by various antigens after the PBMC had been stimulated with CVLPs beforehand.
  • FIG. 5 shows the evaluation of three FACScan experiments after restimulation of human T cells with different antigen-presenting cells after the T cells had previously been stimulated with CVLPs.
  • the content of CD3, which is specific for T cells, and the content of human interferon ⁇ , which is specific for activated cells, are plotted from left to right.
  • 6A shows the graphical evaluation of the specific lysis of various murine, antigen-presenting RMA cells by an E7-specific cytotoxic T cell line. Normal RMA cells were used, RMA cells that expressed E7 or RMA cells that had previously been used with LlE7 ⁇ . 60 CVLPs had been incubated. The ratio of the effector cells to the target cells is plotted against the percentage of the specifically lysed cells.
  • FIG. 6B shows the graphical evaluation of the specific lysis of various murine, antigen-presenting RMA cells by an E7-specific cytotoxic toxic T cell line.
  • RMA cells were used which had previously been incubated with LlE7 ⁇ - 60 CVLPs or with Ll-VLPs, that is to say without an E7 portion.
  • FIG. 7 shows the evaluation of FACScan experiments after incubation of JAWS II cells with increasing amounts of CVLPs, plotted from left to right.
  • the expression of MHC class II molecules was measured by the detection of MHC class II molecules on the cell surface by means of specific antibodies. These values are plotted as relative fluorescence units on the left Y axis.
  • the binding of the CVLPs to the cells was measured by detecting an HPV 16 Ll epitope on the cell surface by means of an Ll -specific antibody. These values are shown as% binding cells, with a negative control without CVLPs being defined as 5% +/- 1% binding cells.
  • FIG. 9 shows the evaluation of FACScan experiments after incubation of RMA cells (left graphic) or JAWS II cells (right graphic) with increasing amounts of CVLPs, plotted from left to right.
  • the binding of the CVLPs to the cells was measured by detecting an HPV 16 Ll epitope on the cell surface using an Ll-specific antibody. The values are given as% binding cells, with a negative control without CVLPs being defined as 5% +/- 1% binding cells.
  • FIG. 10 shows the evaluation of FACScan experiments of T cells from different mice which had been vaccinated with different amounts of CVLPs from different batches.
  • the T cells were stimulated with a known cytotoxic HPV 16 L1 epitope, restimulated with the same peptide under the conditions described in the example, and the relative proportion of the CD8 and interferon ⁇ -positive cells was then determined using specific antibodies in the FACS experiment.
  • mice • C57Bl / 6 mice were purchased from Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA).
  • B6 cells means embyonal stem cells from a C57Bl / 6 mouse.
  • C3 cells means HPV16 and ras-transformed B6 embryo cells (see Feltkamp MC et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 2242-9).
  • RMA cells come from a thymoma of a C57BL / 6 mouse (see Ljunggren HG & Karre K. (1985) J. Exp. Med. 162, 1745-59).
  • RMA-E7 cells are derived from RMA cells, which, however, constitutively express an HPV6 E7 protein by stable transfection.
  • B 16F 10 cells means the cell line available under ATCC CRL-6475.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells which, for example, according to the in Rudolf M.P. et al. (1999) Biol. Chem. 380, 335-40 processes can be prepared.
  • MVA-L I ⁇ C means recombinant murine vaccinia virus that expresses HPV 16 L1 ⁇ C in infected cells.
  • IL-2 means recombinant cytokine (Becton Dickinson, Hamburg, Germany).
  • • -hu CD28 means a monoclonal mouse antibody that is directed against the extracellular part of human CD28 (ATCC CRL-8001).
  • ⁇ -CD3 / PE means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of human CD3 (e) and contains a fluorescent marker phycoerithrin (Medac, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -CD4 / Cychrome means a monoclonal mouse antibody which is directed against the extracellular part of CD4 and contains a fluorescence marker cychrome (DAKO; Glostrup, Denmark).
  • ⁇ -CD4 / Tricolor means a monoclonal antibody which is directed against the extracellular part of CD4 and contains a fluorescent marker Tricolor (Medac, Hamburg, Germany).
  • ⁇ -mus interferon ⁇ / FITC means a monoclonal rat antibody which is directed against mus interferon ⁇ and contains a fluorescent marker FITC (Medac, Hamburg, Germany).
  • E-7 peptide means amino acids 49 to 57 of the human papillomavirus type 16, sequence: RAHYNIVTF (see Feltkamp M.C et al. (1993) supra).
  • P-12 peptide means amino acids 165 to 173 of the Ll protein from HPV 16, sequence: AGVDNRECI (see Genbank 5559..7154). This peptide could be identified as a cytotoxic, murine T cell epitope (see DE 19925235J-41).
  • AM peptide means amino acids 366 to 374 of the influenza nucleoprotein, sequence: ASNENMETM (see Townsend A.R. et al. (1986) Cell 44, 959-68).
  • HPV16L1 93-101 means amino acids 93 to 101 of the Ll protein of HPV 16, sequence: GLQYRVFRI.
  • Phytohaemaglutinin (PHA) was obtained from Sigma (Deisenhofen, Germany).
  • JAWS II cells are predendritic cells (see US 5,648,219).
  • ⁇ -mouse CD8 / PE antibodies were obtained from Pharmingen (Heidelberg, Germany).
  • ⁇ -mouse interferon ⁇ / FITC antibody was obtained from Caltag (Hamburg, Germany).
  • ⁇ -mouse CD4 / Cychrom-Antikö ⁇ er was obtained from Pharmingen (Heidelberg, Germany). • Zefa membrane means a 45 ⁇ m syringe filter and was obtained from Zefa (Munich, Germany).
  • FACScan calibur or FACS means "fluorescencs activated cell sorter”.
  • the apparatus was purchased from Becton Dickenson (Hamburg, Germany).
  • the spleen cells were isolated for weeks.
  • Step 2 the infected B6 cells were irradiated, thereby preventing further growth.
  • the spleen cells were cultured together with the L l c-expressing B6 cells, which acted as stimulator cells for the T cells of the spleen cells, for 5 days.
  • 2 ⁇ l0 4 murine antigen-presenting cells (C3 or B16F10) were incubated with different concentrations of HPV16 L1 ⁇ C * E7 I -5 CVLPS at 37 ° C overnight. Then 2x10 ⁇ murine CD8 positive T cells (see Example 2), which are specific for a specific HPV 16 Ll peptide, were added and incubated for one hour at 37 ° C. in the presence of 10 IU / ml IL2. The cells were incubated for a further 5 hours at 37 ° C. in the presence of 1 ⁇ l golgi plug.
  • the cells were then fixed, permeabilized, stained with ⁇ -mouse CD3 PE, with ⁇ -mouse CD4 / Tricolor and with ⁇ -mouse interferon ⁇ / FITC and washed.
  • the cells were examined for their labeling in a FACScan calibur (Becton Dickinson, Hamburg, Germany) and the measurement results were analyzed using cellquest software (Becton Dickinson, Hamburg, Germany).
  • Cells with an interferon ⁇ signal greater than 10 1 were defined as stimulated cells.
  • T cells were defined by a CD3 signal of over 10 2 .
  • FIG. 1 shows that as the amount of CVLPs increased, percent more T cells were restimulated by the antigen-presenting cells. the. Since the T cells used here only interact with MHC I-presented peptides, this experiment shows that the CVLPs must have caused pseudo-infection of the antigen-presenting cells. This is the only way to explain that MHC I molecules could be loaded with CVLP peptides in order to be recognized on the cell surface by Ll peptide-specific T cells.
  • Murine C3 target cells were incubated overnight at 37 ° C with 6 different HPV 16 L1 C * E7 ⁇ -55 CVLPs preparations or with the P12 peptide, in each case a) without antibodies b) with 25 / C ⁇ HPV16Ll antibodies (10 ⁇ g / ml ). This antibody is known to prevent infection of the antigen-presenting cells by HPV viruses (or virus-like particles) by binding to the HPVL1 protein. Then HPV16L1 peptide-specific, murine T cells were added and incubated for 6 hours (CVLP 2-6 were incubated in the presence of golgi plug). The cells were analyzed for their interferon ⁇ production (see previous example). C3 cells which had not been incubated with no antigen served as a negative control (see FIG. 2).
  • CVLPs can be prevented from penetrating into antigen-presenting cells by virus-neutralizing antibodies. However, the addition of the antibodies has no influence on the uptake of individual peptides. 5. Stimulation of human PBMC by HPV 16 L1E7 CVLPs
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Human PBMC (4 ⁇ l0 5 ) were stimulated and harvested for 3 weeks with HPV 16 Ll ⁇ C * E7 ⁇ -55 CVLPs at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g / ml CVLPs and 10 D antigen-presenting PBMCs.
  • the cells were then in 100 ul medium at 37 ° C with 10 ug / ml different antigens a) E7 peptide b) HPV16 Ll ⁇ c ⁇ 7 ,. 55 CVLPs c) influenza peptide d) phytohaemaglutinin (PHA) in the presence of 10 IU / ml IL2 and 0.5 ⁇ g / ml anti-human CD28 restimulated.
  • PHA phytohaemaglutinin
  • golgi plug was added.
  • the cells were incubated for a further 5 hours at 37 ° C.
  • the cells were then fixed and permeabilized, stained with ⁇ -human CD3 / PE, with ⁇ -human CD4 / cychrome and with ⁇ -human interferon ⁇ / FITC.
  • the cells were examined for their labeling in a FACScan calibur Becton Dickenson and the measurement results were analyzed using cellquest software (see previous examples).
  • Human PBMCs (4 ⁇ l0 5 ) were stimulated and harvested for 8 weeks with HPV 16 Ll ⁇ C .E7 ⁇ -55 CVLPs at 37 ° C with weekly addition of 1 ⁇ g / ml CVLPs and 10 3 irradiated PBMCs.
  • the cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with 10 ⁇ g / ml different antigens in the presence of 10 IU / ml IL2 and 0.5 ⁇ g / ml anti-human CD28: a) overnight with HPV16 L1 ⁇ C «E7 ⁇ . 55 CVLP-incubated PBMC, b) PBMC incubated overnight with HPV 16 Ll 93-101 peptide.
  • golgi plug was added.
  • the cells were incubated for a further 5 hours at 37 ° C.
  • the cells were then fixed and permeabilized, stained with anti-human CD3 / PE, with anti-human CD4 / Cychrome and with anti-human interferon ⁇ / FITC.
  • the cells were examined for their labeling in a FACScan calibur Becton Dickenson and the measurement results were analyzed using cellquest software (see previous examples).
  • FIG. 5 shows that both the CVLP-incubated PBMC brought about a restimulation of CVLP-stimulated T cells, but not the PBMC incubated with the control peptide.
  • the human antigen-presenting cells were pseudoinfected by the CVLPs (like the mouse cells from Example 3) and were therefore recognized by the CVLP-specific T cells.
  • RMA cells were in the presence of 5 L Cr for 1 hour at 37 ° C
  • Figure 6A shows that both CVLP-incubated cells and cells expressing E7 were effectively lysed by the T cells, but not the RMA cells incubated without antigen.
  • FIG. 6B shows that, in contrast to the CVLPs, incubation of the RMA cells with L1 -VLPs does not bring about an effective solution of the cells.
  • E7 is therefore responsible for the specific stimulation of the cytotoxic T cell line, which leads to the lysis of the antigen-presenting RMA cells. It has little influence whether E7 is generated intracellularly by stable expression or whether it is brought into the cell by pseudo-infection via CVLPs.
  • JAWS II cells were, as described above, in various approaches with HPV16Ll ⁇ c »E7 ⁇ . 55 CVLPs and / or mouse serum incubated over 2 days. The following were added:
  • the cells were then examined as above to determine whether they express MHC class II molecules by first staining them with a 1 ⁇ g / ml MHC IA b antibody and then with 1 ⁇ g / ml FITC-coupled anti-mouse antibodies. Finally, the cells were checked for their Coloring examined in a FACScan calibur and the measurement results analyzed using cellquest software.
  • FIG. 8 shows that the depletion of the CVLPs from the approach like the pre-incubation with CVLP-specific mouse serum prevents the activation of the MHC class JJ expression, which means that this observed activation is specifically caused by CVLPs and not by any Contamination of the CVLP preparations is caused.
  • Each 3x10 " RMA or JAWS II cells were incubated with increasing amounts of HPV 16Ll c * E7 1 -55 CVLPs from different preparations for 3 hours as described in Example 9. The cells were again examined to determine whether they were CVLPs For this purpose, the cells were stained with 1 ⁇ g / ml of the FITC-coupled 25 / C ⁇ -HPV16Ll antibody, examined for their staining in a FACScan calibur and the measurement results were analyzed using cellquest software.
  • FIG. 9 shows that batch 1-3 of the CVLPs can bind to RMA cells, batch 3 binding somewhat poorly at the same CVLP concentrations. In contrast, only the CVLPs of batches 1 and 3 bind to the JAWS II cells, the CVLPs of batch 2 show no clear increase and do not reach 50% binding even at the highest concentration of 100 ⁇ g / ml CVLPs. The binding of the CVLPs to cells thus varies with the CVLP preparation and the cell type. In order to test whether the observed variability of CVLP binding correlates with the in vivo inducibility of a cytotoxic T cell response, the following experiment was carried out:
  • mice Three C57BL6 mice were vaccinated with 10 or 1 ⁇ g CVLP of batches 1 to 3. After two weeks, the mice were boosted by a second identical injection. After a further two weeks, the animals were sacrificed and spleens and serum were obtained. All sera contained antibodies directed against the CVLPs (data not shown).
  • the T cells were isolated from the spleen and purified using nylon wool (see Current Protocols in Immunology, supra. Pages 7.7.2 to 7.7.3).
  • the T cells were stimulated with 10 ⁇ g / ml of the murine cytotoxic P12 peptide for 5 days. The T cells were then restimulated in 100 ⁇ l medium at 37 ° C. with a further 10 ⁇ g of the P12 peptide in the presence of 10 IU / ml IL2. T cells from mice immunized with buffer served as a negative control. After one hour, 1 ⁇ l monensin (300 ⁇ M) was added. The cells were incubated for a further 5 hours at 37 ° C.
  • the cells were then fixed and permeabilized, stained with 1 ⁇ g / ml ⁇ -mouse CD4 / cychrome, ⁇ -mouse CD8 / PE and with ⁇ -mouse interferon ⁇ / FITC antibodies.
  • the cells were examined for their labeling in a FACSscan calibur and the measurement results were analyzed using Cellquest software.
  • Figure 10 shows that no mouse vaccinated with batch 2 CVLPs generated cytotoxic T cells reactive against the P12 peptide, while vaccination of batch 1 and 3 CVLPs each reacted with T cells in multiple mice could induce.
  • the knowledge from these in vivo data that the CVLPs of batch 2 are not suitable for the generation of cytotoxic T cells was already from the in vitro data of the CVLP binding study with the JAWS II cells recognizable, while the RMA cells did not allow such a prediction.
  • predendritic cells such as the JAWS II cells are particularly suitable for the prediction of in vivo T cell activation using CVLPs.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsystem enthaltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und mindestens eine Antigen-präsentierende Zielzelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Prädendritische Zellen, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle und/oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort von Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugter Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.

Description

Testsystem zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testsytem enthaltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und mindestens eine Antigen-präsentierende Zielzelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Prädendritische Zelle, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle und/oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort von Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugter Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Die Papillomviren, auch Warzenviren genannt, sind doppelsträngige DNA-Viren mit einer Genomgröße von etwa 8000 Basenpaaren und einem Ikosaeder- förmigen Kapsid mit einem Durchmesser von ca. 55 nm. Bis heute sind mehr als 100 verschiedene humane Papillomavirustypen bekannt, von denen einige, z.B. HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV-45, HPV-52 oder HPV-58, bösartige Tumore und andere, z.B. HPV-6, HPV-11 oder HPV-42 gutartige Tu- more verursachen können.
Das Genom der Papillomaviren läßt sich in drei Bereiche unterteilen: Der erste Bereich betrifft eine nicht-kodierende Region, die Regulationselemente für die Transkription und Replikation des Virus enthält. Die zweite Region, sogenannte E-(Early)Region enthält verschiedene Protein-kodierende Abschnitte E1-E7, von denen z.B. das E6- und das E7-Protein für die Transformation von Epithelzellen verantwortlich sind und das El -Protein die DNA-Kopienzahl kontrolliert. Bei der E6- und E7-Region handelt es sich um sogenannte Onkogene, die auch in bösartig entarteten Zellen exprimiert werden. Die dritte Region, auch L-(Late)Region genannt, enthält zwei Protein-kodierende Abschnitte Ll und L2, die für Strukturkomponenten des Viruskapsids kodieren. Das Ll -Protein ist zu über 90% im vi- ralen Kapsid vorhanden, wobei das Verhältnis von L 1 :L2 im allgemeinen 30: 1 ist. Unter dem Begriff Ll -Protein versteht man im Sinne der vorliegenden Erfindung das Hauptkapsidprotein der Papillomaviren (Baker T. et al. (1991 ) Biophys. J. 60, 1445).
HPV-6 und HPV-1 1 werden u.a. für Genitalwarzen verantwortlich gemacht, eini- ge Papillomavirustypen wie HPV-16, HPV-18, HPV-31, HPV-33, HPV-39, HPV- 45, HPV-52 und HPV-58 sind mit bösartigen Tumoren des anogenitalen Traktes assoziiert. In über 50% der Fälle wird HPV-16 mit Gebärmutterhalskrebs (Cer- vixcarcinom) in Verbindung gebracht. HPV- 16 ist der Hauptrisiko faktor für die Ausbildung von cervicalen Neoplasien. Das Immunsystem spielt eine wichtige Rolle beim Fortschreiten der Krankheit. So sind vermutlich zelluläre Immunantworten und insbesondere Antigen-spezi fische T-Lymphozyten wichtig für den Abwehrmechanismus. Es wurde weiterhin gefunden, daß in hochgradig malignen cervicalen intraepithelialen Neoplasien (CIN II/III) und cervicalen Tumoren das E7-Gen konstitutiv in allen Schichten des infizierten Epithels exprimiert wird. Daher wird vor allem das E7-Protein als potentielles Tumorantigen und als Zielmolekül für aktivierte T-Zellen betrachtet (siehe z.B. WO 93/20844). Die E7- induzierte zelluläre Immunantwort im Patienten ist aber anscheinend nicht stark genug, um den Krankheitsverlauf zu beeinflussen. Die Immunantwort kann eventuell durch geeignete Impfstoffe verstärkt werden. Es konnte gezeigt werden, daß die Expression des Ll -Gens bzw. die Coexpressi- on des Ll - und L2-Gens zur Bildung von Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden oder Virus-ähnliche Partikel (VLPs für virus-like particle) führen kann (siehe z.B. WO 93/02184, WO 94/20137 oder WO 94/05792). Unter Capsomeren versteht man eine oligomere Konfiguration, die aus fünf Ll -Proteinen aufgebaut ist. Das Capsomer ist der Grundbaustein, aus denen virale Capside aufgebaut sind. Unter stabilen Capsomeren versteht man Capsomere, die nicht dazu in der Lage sind sich zu Capsiden zusammenzusetzen. Unter Capsiden versteht man die Hülle des Papillomavirus, die beispielsweise aus 72 Capsomeren zusammengesetzt ist (Baker T. et al. (1991) Biophys. J. 60, 1445). Unter VLP versteht man ein Capsid, das morphologisch und in seiner Antigenität einem intakten Virus gleicht. Die VLPs konnten zur Auslösung einer humoralen Immunantwort, die durch Bildung von neutralisierenden Antikörpern charakterisiert ist, in verschiedenen tierischen Systemen verwendet werden. Die Bildung von virus-neutralisierenden Antikör- pern gegen Ll - und/oder L2-Protein ist jedoch von geringerer klinischer Bedeutung, wenn die Virusinfektion bereits stattgefunden hat, da für die Eliminierung virus-infizierter Zellen keine Antikörper, sondern eine virus-spezifische zytotoxi- sche T-Zell-(CTL)-Antwort notwendig zu sein scheint. Und obwohl VLPs in der Lage sind eine zytotoxische T-Zell-Antwort auszulösen, scheint eine ausschließ- lieh gegen die Kapsidproteine Ll und/oder L2 gerichtete Immunantwort nicht zur Bekämpfung eines durch Papillomaviren bedingten Tumors geeignet.
Es wurden daher sogenannte chimäre Papillomavirus-ähnliche Partikel (CVLPs für chimeric virus-like particle) entwickelt, die aus einem Fusionsprotein des Kapsidproteins Ll und des potentiellen Tumorantigen E7 bestehen (WO 96/11272 und Müller, M. et al. (1997) Virology, 234, 93). Die CVLPs lösten nur im geringen Maße eine gegen das E7-Protein gerichtete humorale Immunantwort aus (Müller, M. et al. (1997), supra). Einige der getesteten CVLPs induzieren jedoch tatsächlich die erwünschte E7-spezifische zytotoxische T-Zellantwort in Mäusen (siehe auch Peng S. et al. (1998) Virology 240,147-57). Des weiteren scheinen neutralisierende Antikörper von HPV-assoziierten Erkrankungen in Patienten die Immunantwort auf verabreichtes Ll -Protein zu limitieren (Müller, M. et al. (1997), supra). CVLPs sind jedoch für die Entwicklung eines Impfstoffes nach wie vor interessant, da die über MHC-Moleküle der Klasse I-präsentierten E7- Proteine von Tumorzellen Zielmoleküle von CTLs darstellen würden.
Peng S. et al. (1998; Virology, 240, 147) beschrieben nun CVLPs bestehend aus C-terminal verkürztem Ll des Rinderpapillomavirus (BPV) und HPV- 16 E7 -57, welche nach Impfung von C57Bl/6-Mäusen E7-spezifιsche zytotoxische T-Zellen induzieren und vor dem Auswachsen E7-exprimierender Tumore schützen. Greenstone H.L. et al. (1998; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95, 1800-5) beschreiben CVLPs bestehend aus HPV- 16 Ll und HPV- 16 L2 fusioniert mit dem Vol- längen HPV- 16 E7-Protein, welche nach Immunisierung von C57Bl/6-Mäusen vor dem Auswachsen epithelialer E7-exprimierender Tumorzellen schützen, wo- bei jedoch zytotoxische T-Zellen nicht nachgewiesen wurden und somit die Induktion der zellulären Immunantwort weniger effizient erscheint.
Während die Immunantwort auf Standardvakzine wie z.B. Tetanol über Antikörper vermittelt wird und somit serologisch nachweisbar ist, mußte für eine derarti- ge therapeutische Vakzine ein auch für den Menschen standartisierbares Testsystem für die zelluläre Immunantwort entwickelt werden.
Bisher bestehende Systeme beruhen auf dem Grundprinzip, daß 'peripheral blood mononuclear cells' (PBMC), bei denen es sich um periphere Blutzellen mit einem Nukleus handelt, unter anderem also Lymphozyten, Macrophagen und Dendritische Zellen, aus einem Organismus isoliert, in Kultur gebracht und mit einer bestimmten Form eines Antigens inkubiert werden. Die Antigene werden durch An- tigen-präsentierende Zellen (B-Lymphozyten, Macrophagen, Dendritische Zellen) aufgenommen, intrazellulär prozessiert und über Histokompatibilitätsantigene (major histocompatibility complex MHC) auf der Oberfläche den T-Zellen präsentiert. Dabei gibt es zwei Wege:
• Peptide, die über MHC I-Moleküle präsentiert werden, werden von CD8- positiven T-Zellen erkannt, die sich durch diese Stimulation somit zu akti- vierten zytotoxischen T-Zellen entwickeln bzw. die Antigen-präsentierenden
Zellen lysieren können;
• Peptide, die über MHC II- Moleküle präsentiert werden, werden von CD4- positiven T-Zellen erkannt, die sich durch diese Stimulation somit zu aktivierten T-Helferzellen entwickeln können. B-Zellen binden ein Antigen über ihre Antigen-Rezeptoren auf der Oberfläche (IgM oder IgD). NK(natural killer)-Zellen haben zwei Rezeptoren: Der eine erkennt Zucker auf der Zelloberfläche Antigen-präsentierender Zellen, der andere erkennt MHC I-Moleküle. Die Stimulation der NK-Zellen erfolgt nach Erkennung eines Zuckers und gleichzeitiger Abwesenheit von MHC I-Molekülen.
Die durch die Stimulation mit einem Antigen erreichte Aktivierung einer Immunzelle kann beispielsweise durch die Synthese von Cytokinen wie z.B. Interferon γ, Interleukin 3 (IL3) nachgewiesen werden. Das entsprechende Cytokin sammelt sich in diesen Testsystemen intrazellulär an und kann dann beispielsweise über fluoreszenzgekoppelte Antiköφer nachgewiesen werden (Kern F. et al. (1998) Nat. Med. 4, 975-8). In einem FACS (fluorescens activated cell sorter) kann dann schließlich der Anteil der Immunzellen bestimmt werden, die sich durch das jeweilige Antigen aktivieren ließen. Ausgeschiedene Cytokine können beispielsweise auch im ELISA nachgewiesen werden. Andere mögliche Nachweisverfahren für die Aktivierung von Immunzellen sind ELISPOT, Prohferationstests oder Cr-Freisetzungstests.
In den Systemen von Käst, W.M. et al. (1989; Cell, 17, 603-14), Rock, K.L. et al. (1992; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89, 8918-22) und Cerundolo, V. et al. (1990; Nature, 345, 449-52) werden als Antigen einzelne, definierte Peptide (8-, 9- oder 10-mere) verwendet Die Peptide werden durch die auf der Zelloberflache expπ- mierten MHC-Molekule der Klasse I, die unter Saugern von Organismus zu Organismus sehr stark vaπieren, gebunden Dies bedeutet wiederum, daß ein Peptid, das für den einen Organismus sehr gut zum Nachweis für T-Zellantworten geeignet ist, für einen anderen Organismus derselben Art nicht verwendet werden kann, da dieser den entsprechenden MHC-I-Haplotyp nicht besitzt Für Mause aus Inzuchtstammen, die einen identischen MHCJ-Haplotyp besitzen, hat sich dieses System durchgesetzt, dieser Versuchsansatz ist jedoch beispielsweise für den Menschen in der Praxis nicht anwendbar, da für jeden Patienten unterschiedliche Peptide zur Stimulation der T-Zellen benutzt werden mußten Zudem sind für die meisten Antigene die Proteinfragmente oder Peptide, die ein zytotoxisches T-Zell- epitop darstellen können, nicht bekannt
Werden wie in Allen, P M und Unanue, E R (1984, Immunobiology, 168, 182-8) beschπeben größere Peptide bzw Proteine zur Stimulation von PBMCs verwendet, so werden diese Antigene ins Cytoplasma oder über Endosomen aufgenommen und prozessiert Entstehende Peptide binden an MHC II-Molekule und werden auf der Zelloberflache den CD4-posιtιven Zellen präsentiert Em derartiges System ist somit auf den Nachw eis der Aktivierung von T-Helferzellen limitiert und kann beispielsweise für die Evaluierung therapeutischer Impfstoffe, die auch auf der Auslosung einer zellularen Immunantwort beruhen, nicht bzw nicht ausschließlich verwendet werden
Somit herrscht das Dilemma, daß die Peptide bzw Proteine entweder MHC- restπngiert sind oder aber lediglich T-Helferzellen aktivieren können
Diese Nachteile werden von den Systemen von Taφey, I et al (1994, Immuno >- gy, 81, 222-7) und Nimako, M et al (1997, Cancer Res 57, 4855-61) dadurch umgangen, daß sie rekombinante Vakzinia- bzw. Adenoviren, als Antigenfähren verwenden. Das jeweilige Virus führt die Information für das entsprechende Antigen als Teil seines Genoms durch Infektion in die Zelle ein. Anschließend kommt es zur Expression sowohl viraler Proteine als auch des Antigens innerhalb der Zelle. Die viralen Antigene werden genauso wie auch das spezifische Antigen anschließend prozessiert und über MHC-I-Moleküle den T-Zellen präsentiert. Somit ist für diese Systeme die Aufnahme des spezifischen Antigens im Gegensatz zu dem zuvorgenanntem System MHC-unabhängig, so daß Zellen unterschiedlicher Organismen Teile des spezifischen Antigens den T-Zellen präsentie- ren können, auch wenn die jeweils präsentierten Teile des Antigens sich von Haplotyp zu Haplotyp unterscheiden können.
Das Vakzinia- und das Adenovirus-System hat den Nachteil, daß eine derartige Virusinfektion der Zellen mit viraler Genexpression und viraler Replikation ver- bunden ist. Durch diese zusätzliche Beeinflußung der Antigen-präsentierenden Zellen wird eine quantitative Messung einer zytotoxischen T-Zellantwort, die sich auf das spezifische Antigene beschränkt, deutlich erschwert. Zum anderen ist die Handhabung dieser Systeme schwierig und kostspielig, da im Umgang mit rekom- binanten Vakzinia- bzw. Adenoviren die Sicherheitsstufe S2 erforderlich ist.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es somit, ein Testsystem für die zelluläre Immunantwort zu entwickeln,
• in dem die Immunantwort insbesondere von zytotoxischen T-Zellen, aber auch z.B. von T-Helferzellen, B-Zellen oder NK(natural killer)-Zellen getestet wer- den kann, wobei die Möglichkeit zur Differenzierung zwischen den Immunzellen möglich sein soll;
• in dem die Aufnahme des Antigens in die Zelle unabhängig ist von MHC- Molekülen; in dem keine virale Infektion stattfindet, die verbunden ist mit viraler Proteinexpression und viraler Replikation; das standardisiert werden kann.
Die Lösung dieser Aufgabe gelang dadurch, daß überraschenderweise gezeigt werden konnte, daß in einem in vitro Versuch die Inkubation von PBMCs mit beispielsweise CVLPs zu einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zytotoxischer Immunantwort von Immunzellen, wie z.B. zytotoxischen T- Zellen, T-Helferzellen oder B-Zellen führt. Deshalb ist der grundlegende Unter- schied zwischen den bisherigen Nachweisverfahren und der vorliegenden Erfindung die Art des Antigens, das zur Stimulation bzw. Restimulation verwendet wird.
Darüber hinaus wurde überraschenderweise festgestellt, daß bereits die Bindung von CVLPs an Prädendritische Zellen in vitro auf eine Aktivierung einer Im- munanwort in vivo schließen läßt. Im Rahmen dieser Erfindung wird unter einer Prädendritischen Zelle eine Vorläuferzelle einer Dendritischen Zelle verstanden, die CD 16 stark exprimiert, hingegen MHC Klasse I und II-Moleküle sowie CD80, CD86 und CD40 nur relativ schwach exprimiert. Im Gegensatz dazu exprimieren Dendritische Zellen kaum CD 16, hingegen stark MHC Klasse I und II-Moleküle sowie CD80, CD86 und CD40 (Woodhead et al. (1998) Immunology 94(4):552- 9). Eine CD16-positive Zelle bedeutet eine Zelle, für die die Expression von CD 16 mittels eines spezifischen Antiköφers beispielsweise in einem FACScan- Experiment nachgewiesen werden kann.
Es konnte nun gezeigt werden, daß CVLPs, die in vivo eine zelluläre Immunantwort auslösen konnten, in vitro an Prädendritische Zellen, beispielsweise JAWS II-Zellen, binden konnten. CVLPs einer anderen Charge, die aus nicht bekannten Gründen keine zelluläre Immunantwort, jedoch eine humorale Immunantwort auslösen konnten, waren ebenso nicht in der Lage, an die Prädendritischen Zellen zu binden. Im Gegensatz dazu waren diese CVLPs aber sehr wohl in der Lage, an Zellen einer T-Lymphomzellinie zu binden. Somit kann geschlossen werden, daß die Bindung der CVLPs an die Prädendritische Zelle einen limitierenden Schritt bei der Auslösung einer zellulären Immunantwort darstellt.
Eine mögliche Erklärung für dieses Phänomen ist, daß CVLPs über CD 16 als Rezeptor in die Zelle gelangen. CD 16 wird auf Prädendritschen Zellen stark exprimiert, auf Dendritischen Zellen hingegen nicht oder nur kaum. Tatsächlich sind Dendritische Zellen kaum in der Lage, CVLPs zu binden (Daten nicht gezeigt).
Die beobachtete zytotoxische Immunantwort setzt voraus, daß die exogenen Proteine der CVLPs tatsächlich über MHC-Moleküle der Klasse I den CD8-positiven Zellen präsentiert wurden. Deshalb muß eine intrazelluläre Beladung der MHC-I- Moleküle nach Inkubation mit CVLPs angenommen werden. Wie jedoch beispielsweise der Versuchsansatz von Allen P.M. und Unanue E.R. (supra) lehrt, werden normalerweise exogene Proteine über MHC-Moleküle der Klasse II den CD4-positiven Zellen präsentiert und gelangen nicht in das MHC-I-System. Dieses überraschende, grundlegend unterschiedliche Verhalten der exogenen Proteine und der CVLPs ist möglicherweise darin zu begründen, daß CVLPs durch ihre partikuläre Struktur und rezeptorvermittelte Aufnahme in die Zelle die Fähigkeit der „Pseudoinfektion" von Zellen haben. Die partikuläre Struktur der CVLPs würde in diesem Fall erst im Cytoplasma durch Disassembly und Prozessierung aufgehoben, so daß anders als bei exogenen Proteinen vornehmlich, aber nicht ausschließlich MHC-I-Moleküle Zugang zu Antigen-Fragmenten erhalten, diese binden, auf die Zelloberfläche transportieren und dort den CD8-positiven Zellen präsentieren. Parallel dazu werden auch intrazelluläre MHC-II-Moleküle mit Antigen-Fragmenten beladen, die analog zum MHC-I die Peptide den CD4-positiven Zellen präsentieren. Somit werden sowohl MHC-I- als auch MHC-fl- Moleküle der Antigen-präsentierenden Zellen durch die Inkubation mit CVLPs mit CVLP- Peptiden „beladen" („CVLP-beladene Zellen"). Unter Präsentation im Sinne der vorliegenden Erfindung wird verstanden, wenn ein Peptid oder Proteinfragment an ein MHC-Molekül bindet, wobei diese Bindung beispielsweise im endoplas- matischen Retikulum oder extrazellulären Raum stattfinden kann, und wenn dann dieser MHC-Molekül-Peptid-Komplex auf der extrazellulären Seite der Zellmembran gebunden ist, so daß er durch Immunzellen spezifisch erkannt werden kann.
Nach der Erkennung des MHC-Moleküls mit seinem gebundenen Peptid durch die jeweilige, spezifische T-Zelle über den jeweils spezifischen T-Zellrezeptor kommt es zur Proliferation der zytotoxischen T-Zellen bzw. T-Helferzellen. Diese Zellpopulationen produzieren bei anhaltender Stimulation durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Cap- sid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, Cytokine, wie beispielsweise Interferon γ oder Interleukin 4 (IL4), die sich in diesem System im Cytoplasma anreichern. Wie in Current Protocols of Immunology (Chapter 6.2 bis 6.24 (1999), edited by Coligan J.E, Kruisbeek A.M., Margulies D.H., Shevach E.M. und Strober W., John Wiley & Sons) beschrieben, kann z.B. das intrazelluläre Interferon γ zur Detektion spezifisch aktivierter T-Zellen verwendet werden.
Dies bedeutet, daß sich Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs hinsichtlich der ausgelösten Immunantwort überraschenderweise wie Vi- ren und nicht wie Proteine verhalten, obwohl sie keine Expression von viralen Proteinen bzw. virale Replikation auslösen. Diese Verbindungen vereinen somit aufgrund ihrer Fähigkeit der Pseudoinfektion die Vorteile der Ansätze mit freien Peptiden/Proteinen mit denen von rekombinanten Viren. Analog zu Viren sind Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs in der Lage, als Partikel in das Cytoplasma zu gelangen und sind somit nicht MHC-restringiert. Im Gegensatz zu dem viralen System ist jedoch keine Genexpression zum Freisetzen bzw. zur Expression des spezifischen Antigens und zur Beladung von MHC I- Molekülen notwendig. Anders als im Versuchsaufbau mit freien Peptiden oder Proteinen, die vorwiegend entweder CD4- oder CD8-positive Zellen stimulieren, aktivieren Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs sowohl CD4- als auch CD8-positive T-Zellen gleichermaßen. Schließlich sind Capsomere, stabile Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs hinsichtlich ihrer Sicherheitsstandards lediglich mit S l eingestuft, so daß die technische Durchführung sich gegenüber S2-Sicherheitsstandards, die bei viralen Systemen not- wendig sind, verbilligt und vielerorts mit geπngerem technischen Aufwand verwirklicht werden kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Testsystem enthaltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomere, mindestens ein Capsid, minde- stens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und mindestens eine Antigen- präsentierenden Zielzelle, insbesondere B-Zell, Makrophage, Prädendritische Zelle, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle und/oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort von Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugte Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen, sowie ihre Verwendung in Diagnostik und Therapie.
Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren ein Testsystem, das mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und oder mindestens ein CVLP und mindestens eine Prädendritische Zelle und oder eine CD16-positive Zelle aufweist, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, min- destens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, wobei die Bindung des stabilen Capsomers, Capsids, VLP und/oder CVLPs an die genannte Zelle gemessen wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Effektorzellen Säugerzellen, insbesondere humane oder murine Zellen.
Die im Testsystem verwendeten Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs enthalten mindestens ein Ll -Protein eines oder mehrerer Papil- lomaviren, oder mindestens ein Ll -Protein und mindestens ein Papillomavirus L2-Protein, insbesondere Ll -Proteine oder Ll- und L2-Proteine von humanen, bovinen und/oder 'cottontail rabbit' Papillomaviren. In einer besonderen Ausführunsform enthalten die Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, und/oder CVLPs mindestens ein Ll -Fusionsprotein, bestehend aus einem Ll -Proteinanteil eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum Ll -Protein heterologen Proteinanteil.
Das verwendete Ll -Protein kann ein natürlich vorkommendes Ll- Protein sein, oder es kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C- terminal, N-terminal, und/oder intern sein können, und/oder eine oder mehrere Mutationen enthalten. In einer besonderen Ausführungsform werden vom C- Terminus des Ll -Proteins bis zu mindestens ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens ca. 25 bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäu- ren deletiert.
Der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil kann ein natürlich vorkommendes Protein sein oder es kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C- terminal, N-terminal, und oder intern sein können, und/oder mehrere Mutationen enthalten. Dieses zum Ll -Protein heterologe Protein kann in einer besonderen Ausfuhrungsform bakteriellen oder viralen Ursprungs sein, beispielsweise von HIV, HBV, HCV oder CMV, vorzugsweise von Papillomaviren, insbesondere von humanem Papillomavirus abstammen, wie z.B. aber nicht ausschließlich von E6 oder E7. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vom C-Terminus des E7-Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55, insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert. Femer können diese Proteine von Autoimmunantigenen wie z.B. Thyroglobulin, Myelin oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z.B. Thyroiditis, Experimentelle Autoimmun Encephalomyelitis (EAE), Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind, abgeleitet sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt das zu Ll heterologe Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ova- rialcarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncar- cinomantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c- erbB2), BCRA-1, BCRA-2. Dieser Anti genanteil kann dabei, muß aber nicht, einzelne Domänen oder Epitope eines Proteins umfassen. Der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil liegt gebunden, vorzugsweise fusioniert vor.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Zelle die nach in vitro Inkubation mit Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und/oder CVLPs Proteine und/oder Proteinfragmente aus genannten Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und/oder CVLPs enthält, vorzugsweise präsentiert, insbesondere sowohl über MHC-I- als auch MHC-II-Komplexe.
Die erfindungsgemäße Zelle enthält, insbesondere präsentiert Proteine, Proteinfragment, und/oder Peptide aus Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und oder CVLPs, die mindestens ein Ll -Protein eines oder mehrerer Pa- pillomaviren, oder mindestens ein Ll -Protein und mindestens ein Papillomavirus L2-Protein enthalten. In einer besonderen Ausführungsform enthält, insbesondere präsentiert die erfindungsgemäße Zelle Proteine, Proteinfragmente, und/oder Peptide aus Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, und/oder CVLPs, die mindestens ein Ll -Fusionsprotein, bestehend aus einem Ll -Proteinanteil eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum Ll -Protein heterologen Proteinanteil enthalten. Das verwendete Ll- Protein kann ein natürlich vorkommendes Ll- Protein sein oder es kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C- terminal, N-terminal, und/oder intern sein können, und/oder eine oder mehrere Mutationen enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vom C- Terminus des Ll -Protein bis zu mindestens ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise mindestens ca. 25 bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren deletiert.
Der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil kann ein natürlich vorkommendes Protein sein oder er kann eine oder mehrere Deletionen, die beispielsweise C- terminal, N-terminal, und oder intern sein können, und/oder mehrere Mutationen enthalten. Dieses zum Ll -Protein heterologe Protein kann in einer besonderen Ausführungsform bakteriellen oder viralen Ursprungs sein, beispielsweise von HIV, HBV, HCV, HSV, EBV, HTLV oder CMV, vorzugsweise von Papillomavi- ren, insbesondere von humanem Papillomavirus abstammen, wie beispielsweise von E6 oder E7. In einer bevorzugten Ausführungsform werden vom C-Terminus des E7-Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55, insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert. Ferner können diese Proteine von Autoimmunantigenen wie z.B. Thyroglobulin, Myelin oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3), die mit bestimmten Autoimmunkrankheiten wie z.B. Thyroiditis, Experimentelle Autoimmun Encepha- lomyelitis (EAE), Oophoritis oder rheumatoider Arthritis assoziiert sind, abgeleitet sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt das zu Ll heterologe Protein von Tumorantigenen ab, vorzugsweise Melanomaantigenen wie MART, Ovarialcarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 oder CA125, Coloncarcinomantigenen wie CA125 oder Mammacarcinomantigenen wie Her2 neu (c-erbB2), BCRA-1 , BCRA-2. Dieser Antigenanteil kann dabei, muß aber nicht, einzelne Domänen oder Epitope eines Proteins umfassen. Der Antigenanteil liegt an das Ll -Protein gebunden, vorzugsweise fusioniert vor.
In allen bevorzugten Ausführungsformen ist die Zelle eine Antigen- präsentierenden Zelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Prädendritische Zelle, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle, daß auf der Inkubation der Zielzelle mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP in vitro beruht.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems bei dem mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP gentechnisch und die Zielzelle durch Inkubation mit mindestens einem Capsomer, einem stabilen Capsomer, einem Capsid, einem VLP, und/oder CVLP hergestellt wird, und die Effektorzelle eine Immunzellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, vorzugsweise eine murine oder humane Immunzellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, ist. Die gentechnisch hergestellten Proteine, die Bestandteil der Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, VLPs, und/oder CVLPs sind, werden in einer bevorzugten Ausführungsform in Bakteri- en wie beispielsweise E. coli, Hefen wie beispielsweise S. cerevisiae, insbesondere Insektenzellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa-Zellen, exprimiert. Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Testsystems bei dem mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP gentechnisch hergestellt wird, und mit einer Prädendritischen und oder einer CD 16 positiven Zelle inkubiert wird.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, das folgende Schritte enthält: a) In einem ersten Schritt wird ein erfindungsgemäßes Testsystems ver- wendet. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt für mindestens ca. 5h, insbesondere ca. 17h eine Inkubation von Immunzellen (Effek- torzellen) beispielsweise PBMCs, T-Zellininen oder kultivierten primären T-Zellen mit Antigenen, bevorzugt mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP und/oder mindestens einer Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt lediglich für mindestens ca. 5 h eine Inkubation von beispielsweise PBMCs, T-Zellininen oder kultivierten primären T-Zellen mit Antigenen, bevorzugt mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP und/oder mindestens einer Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde. Während dieser kurzen Zeit werden lediglich die Zellen durch das Antigen aktiviert, die schon zuvor durch dasselbe bzw. ein ähnliches Antigen stimuliert wurden. b) In einem zweiten Schritt wird die möglichen Aktivierung von Effektorzellen bestimmt. Beispielsweise lassen sich stimulierte T-Zellen durch verschiedene Verfahren wie beispielsweise die Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Expression von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Zielzellen oder der Pro- liferation von Zellen nachweisen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Pro- tocols in Immunology (1999) supra), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein "'Cr-Freisetzungstest (Chapter 3J 1 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der Nachweis der Proliferation (Chapter 3J2 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B- Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird vor Schritt a) folgender zusätzlichen Schritt a') eingefügt a') Mindestens eine Effektorzelle des Testsystems wird für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere mindestens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, cokultiviert bevor sich Schritt a) anschließt. Diese Voraktivierung der Effektorzellen hat zur Folge, daß die Effektorzellen im sich anschließenden Schritt a) durch die Zugabe von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, minde- stens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, restimuliert wird. Unter Cokultivierung ist das Wachsen von mindestens einer Effektozelle in der Gegenwart von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, im selben Wachstumsmedium und selben Gewebekulturbehälter zu verstehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dient eine Komponente des Testsystems, nämlich mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, als Standard während eine zweite Komponente des Testsystems, die Effektorzellen, die tatsächliche Testkomponente ist. Die in der Reaktion beider Komponenten beobachteten Aktivierung der Effektorzelle wird mit der aktivierenden Wirkung von einem bei- spielsweise aus einem großtechnischen Produktionsprozess stammenden Capsomer, stabilen Capsomer, Capsid, VLP, und/oder CVLP und/oder einer Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und oder einem CVLP inkubiert wurde, verglichen. Diese Ausführungsform erlaubt beispielsweise die Qualitäts- kontrolle von Chargen prophylaktischer und/oder therapeutischer Impfstoffe ent- haltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine Zelle die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde.
Eine weiteres bevorzugtes Verfahren, daß sich des erfindungsgemäßen Testsystems bedient, ist die Auswahl besonders wirksamer Epitope für die Entwicklung von Vakzinen beruhend auf Teilen von Proteinen. Untersucht man in getrennten Ansätzen beispielsweise verschiedene CVLPs, die jeweils kurze Peptide eines Proteins oder eines Erregers als Fusionsanteil enthalten, im Hinblick auf ihre Fähigkeit, eine Stimulation von Immunzellen zu vermitteln, so lassen sich durch den quantitativen Vergleich der Immunantworten auf die jeweiligen CVLP besonders wirksame Peptide identifizieren. Derartige Peptide können dann für neue Impf- Stoffe kombiniert werden. Analog hierzu können Proteine getestet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist deshalb ein Verfahren zur Identifizierung von Epitopen, Peptiden oder Proteinfragmenten, die eine Immunantwort, insbesondere zelluläre Immunantwort auslösen.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, das folgende Schritte enthält:
I) In einem ersten Schritt werden beispielsweise PBMCs, insbesondere T-Zellen aus dem Blut eines Spenders gewonnen, insbesondere aus dem Blut eines Spenders, der bereits mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens mit einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, geimpft wurde und die erhaltenen Effektorzellen kultiviert oder es werden Milzzellen einer Maus gewonnen, insbesondere Milzzellen einer Maus die bereits mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens mit einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, geimpft wurde.
II) In einem zweiten Schritt wird beispielsweise zu den isolierten und/oder kultivierten Zellen für mindestens ca. 5h, insbesondere ca.
17h mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Cap- sid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, hinzugegeben. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Inkubation für mindestens ca.5 h. Während dieser kurzen Stim- mulationszeit werden lediglich die Zellen durch das hinzugegebene Antigen aktiviert, die schon zuvor durch dasselbe bzw. ein ähnliches Antigen stimuliert wurden.
III) In einem zweiten Schritt wird die möglichen Aktivierung von Effektorzellen bestimmt. Beispielsweise lassen sich stimulierte T-Zellen durch verschiedene Verfahren wie beispielsweise der Nachweis der Produktion oder Sekretion von Cytokinen durch die T-Zellen, der Ex- pression von Oberflächenmolekülen auf T-Zellen, der Lyse von Ziel- zellen oder der Proliferation von Zellen. Hierfür geeignete Methoden sind beispielsweise ein Cytokinassay (Chapter 6.2 bis 6.24 in Current Protocols in Immunology (1999), supra), ELISPOT (Chapter 6.19 in Current Protocols in Immunology, supra), ein 51Cr-Freisetzungstest (Chapter 3J 1 in Current Protocols in Immunology, supra) oder der
Nachweis der Proliferation (Chapter 3J2 in Current Protocols in Immunology, supra). Je nach verwendeter Methode kann dabei auch zwischen den Immunzellen wie zytotoxischen T-Zellen, T- Helferzellen, B-Zellen, NK-Zellen und anderen Zellen unterschieden werden.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens wird nach Schritt I) folgender zusätzlichen Schritt I') eingefügt
I') Die isolierten Zellen werden für mindestens ca. 8 Wochen, insbeson- dere mindestens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, cokultiviert bevor sich Schritt
II) anschließt. Diese Voraktivierung der Effektorzellen hat zur Folge, das im sich anschließenden Schritt II) die Effektorzellen durch die Zugabe von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und oder einem CVLP inkubiert wurde, restimuliert wird. Diese Art der Ausführung wird als Restimulation bezeichnet. Die erste Stimulation kann dabei jedoch auch wie unter Punkt I) beschrieben innerhalb des Spenders z.B. durch eine Impfung, eine Infektion, einen Tumor oder im Rahmen einer Autoimmunkrankheit erfolgt sein. Sie kann aber auch wie unter Punkt I') beschrieben in vitro durchgeführt werden, um spezifische reaktive Zeilklone oder -popu- lationen zu erhalten.
In einer besonderen Ausführungsform kann durch das erfindungsgemäße Verfahren der Immunstatus eines Organismus gegenüber einem Erreger getestet werden. Isoliert man beispielsweise PBMCs eines Organismus und restimuliert sie mit mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder CVLP und oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, die als Fusionsanteil ein erreger- spezifisches Antigen oder einen Teil davon enthalten, so kann man durch den Befund von reaktiven Immunzellen gegen das jeweilige Antigen, wie beispielsweise zytotoxischen T-Zellen, reaktiven T-Helferzellen oder reaktiven B-Zellen eine vorangegangene Infektion nachweisen. Durch das Quantifizieren der reaktiven Zellen kann man in einer weiteren Ausführungsform den quantitativ bestimmen, so daß z.B. die Notwendigkeit von Auffrischungsimpfungen analysiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann auch der Erfolg der Impfung und/oder der aktuelle Immunstatus eines Patienten nach einer bereits länger zurückliegen- den Impfung übeφrüft werden. Dabei beschränkt sich die Überwachung nicht nur auf prophylaktischen und/oder therapeutischen Impfung mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zielzelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, sondern ist genauso für herkömmlichen Impfstoffen geeignet.
Der Nachweis spezifischer reaktiver T-Zellen durch das vorliegende Testverfahren kann dazu benützt werden, um schwer nachweisbare Infektionen zu diagnostizieren. Konstruiert man beispielsweise CVLPs mit Antigenen oder Teilen von Antigenen von bekannten, jedoch schwer nachweisbaren Erregern, so kann die T- Zellantwort auf derartige Antigene Aufschluß über eine bestehende Infektion geben.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die HLA-Haplotypen von Patientengruppen, die gegen bestimmte Infektionskrankheiten immun sind bzw. sich nicht oder nur schlecht immunisieren lassen, mit der Reaktivität ihrer T-Zellen gegenüber Antigenen der entsprechenden Erreger korreliert, so kann man Haplotypen identifizieren, die die Immunität gegenüber dem Erreger vermitteln.
Kennt man die Antigene, die für bestimmte Autoimmunkrankheiten verantwortlich sind, so können Capsomere, stabilen Capsomere, Capside, und/oder CVLPs und/oder Zielzellen, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, und/oder einem CVLP inkubiert wurden, hergestellt werden, die dieses Autoimmunantigenen oder Teilen enthalten. Diese können dann zur Diagnose der jeweiligen Autoimmunkrankheit dienen, indem in vitro die T-Zellantwort eines Patienten nach Stimulation beispielsweise seiner isolierten PBMCs mit den jeweiligen Autoimmunantigen gemessen wird.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Unterscheidung von Tumortypen hinsichtlich unterschiedlicher spezifischer Tumoranti- gene. Kennt man hinsichtlich eines Tumors verschiedene Typen, die sich unter anderem darin unterscheiden, daß sie unterschiedliche Tumorantigene exprimie- ren, und hat man auf der anderen Seite verschiedene T-Zellpopulationen, die sich spezifisch durch eines der jeweiligen Tumorantigene restimulieren lassen, so kann man durch den Nachweis einer Restimulation der reaktiven T-Zellen den Tumor eines Patienten klassifizieren. Eine derartige Klassifizierung ließe sich dann z.B. dazu nutzen, die Patienten-eigenen T-Zellen durch eine Impfung mit den jeweiligen Tumorantigenen spezifisch zu stimulieren, um so eine zytotoxische T- Zellpopulation gegen die eigenen Tumorzellen zu generieren.
Die erfindungsgemäßen Verfahren eignen sich beispielsweise für die Qualitätskontrolle von Impfstoffchargen während der Produktion, die Identifizierung von neuen antigenen Epitopen, die Identifikation von Patienten Haplotypen, die Unterscheidung von Autoimmunkrankheiten oder die Unterscheidung von Tumorty- pen eine hohe Bearbeitungsgeschindigkeit und Reproduzierbarkeit bei der Anwendung des Testsystems. Deshalb ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung ein Verfahren, das die Aktivierung von Effektorzellen durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLPs oder durch mindestens eine Zelle, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder einem CVLP inkubiert wurde, in Hochdurchsatz-Systemen durchgeführt wird. In Hochdurchsatz-Systemen können neben den genannten Verbindungen beispielsweise auch Peptide oder Proteine im großen Maßstab hinsichtlich ihrer Auslösung von Immunantworten, insbesondere T-Zellantworten untersucht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP oder mindestens einer Antigen-präsentierenden Zielzelle, insbesondere B-Zell, Makrophage, Dendriti- sche Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurden und Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T- Zellen, in besonders bevorzugte Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Diagnostikum enthaltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine Antigen-präsentierenden Zielzelle, insbesondere B-Zell, Makrophage, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurden, Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK-Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugte Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Beispiele von dem Fachmann bekannten Trägern sind Glas, Polystyren, Polypro- pylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylase, natürliche oder modifizierte Zellulose, Polyacrylamide, Agarose, Aluminiumhydroxid oder Magnitid.
Ein erfindungsgemäßes Diagnostikum kann in Lösung vorliegen, an eine feste Matrix gebunden sein und/oder mit einem Adjuvans versetzt sein.
Das Diagnostikum kann auf verschiedene Weisen verabreicht werden. Beispiele von dem Fachmann bekannten Verabreichungsformen sind parenterale, lokale und/oder systemische Applikation durch z. B. orale, intranasale, intravenöse, in- tramuskuläre, und/oder topische Applikation. Die bevorzugte Applikationsform wird beispielsweise durch den natürlichen Infektionsweg der jeweiligen Papillo- mavirusinfektion beeinflußt. Die verabreichte Menge richtet sich nach Alter, Gewicht und allgemeinem Gesundheitszustand des Patienten und dem Typ der Pa- pillomavirusinfektion. Das Diagnostikum kann in Form von Kapseln, Lösung, Suspension, Elixier (für orale Applikation) oder sterile Lösungen bzw. Suspensionen (für parenterale oder intranasale Applikation) verabreicht werden. Als inerter und immunologisch akzeptabler Träger kann beispielsweise Salzlösung oder phosphatgepufferte Salzlösung verwendet werden.
Die Figuren und die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, ohne sie zu beschränken.
Fig. 1 zeigt die graphische Auswertung der Restimulation von murinen, HPV16Ll-spezifischen T-Zellen durch zwei murine Antigen-präsentierende Zel- linien (C3 und B16F10), die zuvor mit ansteigenden Mengen an CVLPs inkubiert worden waren. Aufgetragen sind die ansteigenden Konzentrationen von CVLPs gegen die Prozent der stimulierten T-Zellen, die über Interferon γ-Produktion nachgewiesen wurden.
Fig. 2 zeigt die graphische Auswertung der Restimulation von murinen, HPV16Ll-Peptid-spezifιschen T-Zellen durch murine C3-Zellen, die zuvor mit unterschiedlichen CVLP-Präparationen in Ab- und Anwesenheit von virusneutralisierenden Antiköφern inkubiert worden waren.
Fig. 3A zeigt die Auswertung von fünf FACScan-Experimenten nach Stimulation von humanen PBMC mit unterschiedlichen Konzentrationen von CVLPs (0 - 10 μg ml), bei denen humane T-Zellen, die für humanes Interferon γ positiv sind, in der Graphik nach oben verlagert sind.
Fig. 3B zeigt die graphische Auswertung von Fig. 3A, in der die Konzentration an CVLPs gegen die Prozent der stimulierten Zellen aufgetragen ist. Stimulierte Zellen definieren sich durch den Nachweis von humanem Interferon γ.
Fig. 4 zeigt die graphische Auswertung der Restimulation von humanen PBMC durch verschiedene Antigene, nachdem die PBMC zuvor mit CVLPs stimuliert worden waren.
Fig. 5 zeigt die Auswertung von drei FACScan-Experimenten nach Restimulation humaner T-Zellen mit verschiedenen Antigen-präsentierenden Zellen, nachdem die T-Zellen zuvor mit CVLPs stimuliert worden waren. Von links nach rechts ist jeweils der Gehalt an CD3 aufgetragen, das für T-Zellen spezifisch ist, und von unten nach oben der Gehalt an humanem Interferon γ, das für aktivierte Zellen spezifisch ist.
Fig. 6A zeigt die graphische Auswertung der spezifischen Lyse von verschiede- nen murinen, Antigen-präsentierenden RMA-Zellen, durch eine E7-spezifιsche zytotoxische T-Zellinie. Dabei wurden normale RMA-Zellen verwendet, RMA- Zellen, die E7 exprimierten oder RMA-Zellen, die zuvor mit LlE7ι.60-CVLPs inkubiert worden waren. Aufgetragen ist das Verhältnis der Effektorzellen zu den Zielzellen gegen die Prozent der spezifisch lysierten Zellen.
Fig. 6B zeigt die graphische Auswertung der spezifischen Lyse von verschiedenen murinen, Antigen-präsentierenden RMA-Zellen, durch eine E7-spezifische zyto- toxische T-Zellinie. Dabei wurden RMA-Zellen verwendet, die zuvor mit LlE7ι- 60-CVLPs oder mit Ll-VLPs, also ohne E7- Anteil, inkubiert worden waren.
Fig. 7 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Inkubation von JAWS Il-Zellen mit steigenden Mengen von CVLPs, aufgetragen von links nach rechts. Zum einen wurde über den Nachweis von MHC Klasse II-Molekülen auf der Zelloberfläche mittels spezifischen Antiköφern die Expression von MHC Klasse II-Molekülen gemessen. Diese Werte sind als relative Fluoreszenzeinheiten auf der linken Y-Achse aufgetragen. Zum anderen wurde über den Nachweis eines HPV 16 Ll-Epitops auf der Zelloberfläche mittels eines Ll -spezifischen Antiköφers die Bindung der CVLPs an die Zellen gemessen. Diese Werte sind als % bindende Zellen darsgestellt, wobei eine Negativ-Kontrolle ohne CVLPs als 5% +/- 1% bindende Zellen definiert wurde.
Fig. 8 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Inkubation von JAWS Il-Zellen mit den indizierten Mengen an CVLPs bzw. Serum aus CVLP- geimpften Mäusen. "Depl" bedeutet die Depletierung der CVLPs aus den Inkubationsansätzen, bevor diese zu den JAWS Il-Zellen gegeben wurden. In dem Ansatz CVLP+Serum wurden die CVLPs zuvor mit dem Serum inkubiert, bevor die- se zu den JAWS Il-Zellen gegeben wurden. Über den Nachweis von MHC Klasse II-Molekülen auf der Zelloberfläche mittels spezifischer Antiköφer wurde die Expression von MHC Klasse II-Molekülen gemessen. Die Werte sind als relative Fluoreszenzeinheiten auf der Y-Achse aufgetragen.
Fig. 9 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten nach Inkubation von RMA-Zellen (linke Graphik) bzw. JAWS Il-Zellen (rechte Graphik) mit steigenden Mengen an CVLPs, aufgetragen von links nach rechts. Über den Nachweis eines HPV 16 Ll-Epitops auf der Zelloberfläche mittels eines Ll -spezifischen Antiköφers wurde die Bindung der CVLPs an die Zellen gemessen. Die Werte sind als % bindende Zellen angegeben, wobei eine Negativ-Kontrolle ohne CVLPs als 5% +/- 1% bindende Zellen definiert wurde.
Fig. 10 zeigt die Auswertung von FACScan-Experimenten von T-Zellen aus ver- schiedenen Mäusen, die mit unterschiedlichen Mengen an CVLPs aus unterschiedlichen Chargen geimpft worden waren. Die T-Zellen wurden mit einem bekannten zytotoxischen HPV 16 Ll-Epitop stimuliert, mit demselben Peptid unter den im Beispiel beschriebenen Bedingungen restimuliert und anschließend der relative Anteil der CD8- und Interferon γ-positiven Zellen mittels spezifischer Antiköφer im FACS Experiment bestimmt.
Beispiele
1. Beschreibung der Ausgangsmaterialien: • Die Herstellung von HPV 16 LlΔc*E7ι-55 CVLPs erfolgte gemäß der deutschen Patentanmeldung DE 198 12 941.6 (siehe auch Müller M. et al. (1997) Virology 234, 93-1 1 1).
• Die Herstellung von HPV16LlΔc*E7ι-60 CVLPs erfolgte gemäß Müller M. et al. (1997; supra). • Die Herstellung von Ll VLPs erfolgt gemäß Müller M. et al. (1997); Virology 234, 93-11 1.
• C57Bl/6-Mäuse wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA, USA) bezogen.
• B6-Zellen bedeutet embyonale Stammzellen aus einer C57Bl/6-Maus. • C3-Zellen bedeutet HPV16 und ras-transformierte B6-Embryozellen (siehe Feltkamp M.C. et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23, 2242-9). • RMA-Zellen stammt aus einem Thymom einer C57BL/6-Maus (siehe Ljung- gren H.G. & Karre K. (1985) J. Exp. Med. 162, 1745-59).
• RMA-E7-Zellen stammen von RMA-Zellen ab, die jedoch durch stabile Transfektion konstitutiv ein HPV6 E7 Protein exprimieren.
• B 16F 10-Zellen bedeutet die unter ATCC CRL-6475 erhältliche Zellinie.
• PBMC bedeuten periphere Blutmononukleäre Zellen, die beispielsweise gemäß dem in Rudolf M.P. et al. (1999) Biol. Chem. 380, 335-40 beschriebenen Verfahren hergestellt werden können.
• MVA-L I ΛC bedeutet rekombinantes murines Vakziniavirus, das in infizierten Zellen HPV 16 L1ΛC exprimiert.
• IL-2 bedeutet rekombinantes Cytokin (Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland).
• 25/C α-HPV16Ll bedeutet einen monoklonaler Maus-Antiköφer, der gegen Ll gerichtet ist.
• -hu CD28 bedeutet einen monoklonalen Maus-Antiköφer, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD28 gerichtet ist (ATCC CRL-8001).
• α-CD3/PE bedeutet einen monoklonalen Maus-Antiköφer, der gegen den extrazellulären Teil von humanem CD3 (e) gerichtet ist und einen Fluores- zensmarker Phycoerithrin enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
• α-CD4/Cychrome bedeutet einen monoklonalen Maus-Antiköφer, der gegen den extrazellulären Teil von CD4 gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker Cychrome enthält (DAKO; Glostrup, Dänemark).
• α-CD4/Tricolor bedeutet einen monoklonalen Ratten-Antiköφer, der gegen den extrazellulären Teil von CD4 gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker Tricolor enthält (Medac, Hamburg, Deutschland). • α-mus Interferon γ/FITC bedeutet einen monoklonalen Ratten-Antiköφer, der gegen mus Interferon γ gerichtet ist und einen Fluoreszensmarker FITC enthält (Medac, Hamburg, Deutschland).
• E-7-Peptid bedeutet Aminosäuren 49 bis 57 des Humanen Papillomavirus Typ 16, Sequenz: RAHYNIVTF (siehe Feltkamp M.C et al. (1993) supra).
• P-12-Peptid bedeutet Aminosäuren 165 bis 173 des Ll-Proteins vom HPV 16, Sequenz: AGVDNRECI (siehe Genbank 5559..7154). Dieses Peptid konnte als zytotoxisches, murines T-Zellepitop identifiziert werden (siehe DE 19925235J-41). • AM-Peptid bedeutet Aminosäuren 366 bis 374 des Influenza Nukleoproteins, Sequenz: ASNENMETM (siehe Townsend A.R. et al. (1986) Cell 44, 959- 68).
• HPV16L1 93-101 bedeutet Aminosäuren 93 bis 101 des Ll-Proteins von HPV 16, Sequenz: GLQYRVFRI. • Phytohämaglutinin (PHA) wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
• Golgi Plug wurde von Pharmingen (Hamburg. Deutschland) bezogen.
• Zellen wurden jeweils bei 37°C und 5% C02 in RPMI-Medium (Gibco BRL, Eggenstein, Deutschland) mit 10% fötalem Kälberserum, Kanamycin und Ampicillin kultiviert.
• JAWS Il-Zellen sind Prädendritische Zellen (siehe US 5,648,219).
• Monensin wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
• MHC IAb-Antiköφer wurde von Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) bezogen. • FITC-gekoppelter anti-Maus-Antiköφer wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. • FITC-gekoppelter 25/C α-HPV16Ll Antiköφer bedeutet einen monoklonalen Maus-Antiköφer, der gegen Ll gerichtet und selbst an FITC gekoppelt ist. FITC wurde von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen.
• α-Maus CD8/PE-Antiköφer wurde von Pharmingen (Heidelberg, Deutsch- land) bezogen.
• α-Maus Interferon γ/FITC-Antiköφer wurde von Caltag (Hamburg, Deutschland) bezogen.
• α-Maus CD4/Cychrom-Antiköφer wurde von Pharmingen (Heidelberg, Deutschland) bezogen. • Zefa-Membran bedeutet ein 45 μm Spritzenaufsatzfilter und wurde von Zefa (München, Deutschland) bezogen.
• FACScan calibur oder FACS bedeutet "fluorescencs activated cell sorter". Die Apparatur wurde von Becton Dickenson (Hamburg. Deutschland) bezogen.
• Cellquest Software wurde von Becton Dickenson (Hamburg, Deutschland) bezogen.
2. Herstellung muriner CD8 positiver T-Zellen
a) Immunisierung von Mäusen mit VLPs: Zwei C57Bl/6-Mäuse wurden mit 10 μg Ll VLPs immunisiert. Nach 6
Wochen wurden die Milzzellen isoliert.
b) Herstellung von Antigen-präsentierenden Zellen (Zielzellen):
B6-Zellen wurden für 2,5 Tage mit Interferon γ inkubiert, anschließend über Nacht mit MVA-L1ΔC-Viren (MOI = 5) für die Herstellung Antigen- präsentierender Zellen infiziert und für 16h kultiviert. In einem nächsten - ..
Schritt wurden die infizierten B6-Zellen bestrahlt und dadurch am weiteren Wachstum gehindert.
c) Restimulation der isolierten Milzzellen:
Die Milzzellen wurden jeweils gemeinsam mit den L l c-exprimierenden B6-Zellen, die als Stimulatorzellen für die T-Zellen der Milzzellen fungierten, für 5 Tage kultiviert.
3. Restimulation von T-Zellen durch Antigen-präsentierende Zellen
2χ l04 murine Antigen-präsentierende Zellen (C3 oder B16F10) wurden mit verschiedenen Konzentrationen an HPV16 L1 ΛC*E7I -5 CVLPS bei 37°C über Nacht inkubiert. Daraufhin wurden 2x10^ murine CD8 positive T-Zellen (siehe Beispiel 2), die für ein spezifisches HPV 16 Ll -Peptid spezifisch sind, zugegeben und für eine Stunde bei 37°C in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 inkubiert. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C in Anwesenheit von 1 μl golgi plug inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert, permeabilisiert, mit α-Maus CD3 PE, mit α-Maus CD4/Tricolor und mit α-Maus Interferon γ/FITC gefärbt und gewaschen. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur (Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland) untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software (Becton Dickinson, Hamburg, Deutschland) analysiert. Zellen mit einem Interferon γ-Signal von größer 101 wurden als stimulierte Zellen definiert. T-Zellen wurden über ein CD3-Signal von über 102 definiert.
Ergebnis: In Fig. 1 ist dargestellt, daß mit ansteigender Menge an CVLPs prozentual mehr T-Zellen durch die Antigen-präsentierenden Zellen restimuliert wur- den. Da die hier verwendeten T-Zellen ausschließlich mit MHC I-präsentierten Peptiden wechselwirken, zeigt dieser Versuch, daß die CVLPs eine Pseudoinfek- tion der Antigen-präsentierenden Zellen bewirkt haben müssen. Nur so ist zu erklären, daß MHC I-Moleküle mit CVLP-Peptiden beladen werden konnten, um dann auf der Zelloberfläche durch Ll-Peptid-spezifische T-Zellen erkannt zu werden.
4. Inhibition der Pseudoinfektion durch virusneutralisierende Antiköφer
Murine C3 Zielzellen wurden über Nacht bei 37°C mit 6 verschiedenen HPV 16 Ll C*E7ι-55 CVLPs -Präparationen oder mit dem P12-Peptid inkubiert, jeweils a) ohne Antiköφer b) mit 25/C αHPV16Ll Antiköφer (10 μg/ml). Von diesem Antiköφer ist bekannt, daß er durch Bindung an das HPVLl-Protein die Infektion der Antigen-präsentierenden Zellen durch HPV-Viren (bzw. virusähnliche Partikel) verhindert. Anschließend wurden HPV16L1-Peptid- spezifische, murine T-Zellen zugegeben und für 6 Stunden inkubiert (CVLP 2-6 wurden in Anwesenheit von golgi plug inkubiert). Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Interferon γ-Produktion analysiert (siehe vorheriges Beispiel). Als Negativkontrolle dienten C3-Zellen, die mit keinem Antigen inkubiert wurden (siehe Fig. 2).
Ergebnis: Wie bei einer viralen HPV-Infektion lassen sich CVLPs durch virus- neutralisierende Antiköφer von einem Eindringen in Antigen-präsentierende Zellen abhalten. Die Zugabe der Antiköφer hat jedoch keinen Einfluß auf die Aufnahme von einzelnen Peptiden. 5. Stimulation humaner PBMC durch HPV 16 L1E7 CVLPs
PBMC (4χ l06) wurden in 100 μl Medium über Nacht bei 37°C mit unterschiedlichen Konzentrationen HPV16 Ll_-c*E7ι.55 CVLPs sowie 10 IU/ml IL2 und 0,5 μg/ml anti-human CD28 inkubiert. A darauffolgenden Tag wurde 1 μl golgi plug hinzugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit anti-human CD3 PE, mit anti-human CD4/ und mit anti-human Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur Becton Dickenson untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert (siehe vorherige Beispiele).
Ergebnis: Es zeigte sich, daß mit ansteigender CVLP-Konzentration der Anteil an T-Zellen, die Interferon γ im Cytoplasma akkumulieren, linear ansteigt (siehe Fig. 3A und B). Dieser Anstieg macht somit die Stimulation der T-Zellen durch die CVLPs deutlich.
6. Restimulation von CVLP-stimulierten PBMC mit unterschiedlichen Antigenen
Humane PBMC (4χl05) wurden für 3 Wochen mit HPV 16 LlΔC*E7ι-55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 10D Antigen- präsentierende PBMCs stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit 10 μg/ml verschiedener Antigene a) E7-Peptid b) HPV16 LlΔcΕ7,.55 CVLPs c) Influenza Peptid d) Phytohämaglutinin (PHA) in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 und 0,5 μg/ml anti-human CD28 restimuliert. Nach einer Stunde wurde 1 μl golgi plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit α-human CD3/PE, mit α-human CD4/Cychrome und mit α- human Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur Becton Dickenson untersucht und die Meßergeb- nisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert (siehe vorherige Beispiele).
Ergebnis: Dreimal mehr T-Zellen ließen sich durch CVLPs restimulieren als durch das E7- oder Influenza-Peptid (siehe Fig. 4). Phytohämaglutinin stimulierte als unspezifisches Stimulans wie erwartet die meisten T-Zellen. Durch die drei- wöchige Inkubation mit CVLPs wurde somit ein Teil der humanen PBMC spezifisch durch CVLPs restimulierbar.
7. Restimulation von CVLP-stimulierten T-Zellen mit unterschiedlichen Antigen- präsentierenden Zellen
Humane PBMCs (4χl05) wurden für 8 Wochen mit HPV 16 LlΔC.E7ι-55 CVLPs bei 37°C unter wöchentlicher Zugabe von 1 μg/ml CVLPs sowie 103 bestrahlte PBMCs stimuliert und geerntet. Anschließend wurden die Zellen in 100 μl Medi- um bei 37°C mit 10 μg/ml verschiedener Antigene in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 und 0,5 μg/ml anti-human CD28 restimuliert: a) über Nacht mit HPV16 LlΔC«E7ι.55 CVLP-inkubierten PBMC, b) über Nacht mit HPV 16 Ll 93- 101 -Peptid inkubierten PBMC.
Nach einer Stunde wurde 1 μl golgi plug zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und per- meabilisiert, mit anti-human CD3/PE, mit anti-human CD4/Cychrome und mit anti-human Interferon γ/FITC gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACScan calibur Becton Dickenson untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert (siehe vorherige Beispiele).
Ergebnis: Fig. 5 zeigt, daß sowohl die CVLP-inkubierten PBMC eine Restimula- tion von CVLP-stimulierten T-Zellen bewirkten, nicht aber die mit dem Kontroll- Peptid inkubierten PBMC. Somit waren durch die achtwöchige Inkubation der humanen T-Zellen mit CVLPs spezifisch restimulierbare T-Zellen entstanden. Des weiteren kann man daraus schließen, daß die humanen Antigen- präsentierenden Zellen durch die CVLPs pseudoinfiziert wurden (wie die Maus- Zellen aus Beispiel 3) und deshalb durch die CVLP-spezifischen T-Zellen erkannt wurden.
8. Lvse von CNLP-inkubierten Zellen durch E7-spezifische zytotoxische T- Zellen
RMA-Zellen wurden in Anwesenheit von 5 lCr für 1 Stunde bei 37°C mit
• HPV16LlΔC«E7ι_60 CVLPs oder
• Ll-VLPs inkubiert. Desgleichen wurden RMA-E7-Zellen in Anwesenheit von 51Cr für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, jedoch ohne Zugabe von Antigen. Anschließend wurden in unterschiedlichen Verhältnissen zu den Zielzellen (RMA-Zellen) E7- spezifϊsche zytotoxische T-Zellen (C57BL/6-Maus (H2b)) (siehe Beispiel 2) zuge- geben. Die mit der Lyse der Zielzellen verbundene Freisetzung des ^Cr wurde in einem ß-Counter gemessen und in Relation zu vollständig lysierten Zellen gesetzt.
Fig. 6A zeigt, daß sowohl CVLP- inkubierte Zellen wie auch die Zellen, die E7 exprimieren, effektiv durch die T-Zellen lysiert wurden, nicht aber die ohne Antigen inkubierten RMA-Zellen.
Fig. 6B zeigt, daß im Gegensatz zu den CVLPs eine Inkubation der RMA-Zellen mit Ll -VLPs keine effektive Lvse der Zellen bewirkt.
Ergebnis: Somit ist E7 für die spezifische Stimulation der zytotoxischen T- Zellinie verantwortlich, die zur Lyse der Antigen-präsentierenden RMA-Zellen führt. Dabei hat es kaum einen Einfluß, ob E7 durch stabile Expression intrazellulär erzeugt wird oder durch eine Pseudoinfektion über CVLPs in die Zelle ge- bracht wird.
9. Aktivierung Prädendritischer Zellen
Zum einen wurden 3x10" JAWS Il-Zellen mit steigenden Mengen HPV 16LlΔc*E71_55 CVLPs für 2 Tage inkubiert. Anschließend wurden die Zellen darauf untersucht, ob sie MHC Klasse II-Moleküle exprimieren, indem sie zunächst mit einem 1 μg/ml MHC IAb-Antiköφer und anschließend mit 1 μg/ml FITC-gekoppelten anti-Maus-Antiköφer inkubiert wurden. Abschließend wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Färbung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert. Zum anderen wurden JAWS Il-Zellen wie zuvor mit steigenden Mengen HPV16LlΔc»E7iό5 CVLPs für lediglich 3 Stunden inkubiert. Diese Zellen wurden dahingehend untersucht, ob sie CVLPs gebunden hatten. Hierzu wurden die Zellen zunächst mit dem FITC-gekoppelten 25/C α-HPV16Ll Antiköφer gefärbt. Anschließend wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Färbung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert.
Aus Fig. 7 ist ersichtlich, daß mit steigenden CVLP-Konzentrationen, mit denen JAWS Il-Zellen inkubiert wurden, die Bindung der CVLPs an die Zellen anstieg und die Zellen zur Expression der MHC-Klasse II-Moleküle aktiviert wurden.
Des weiteren wurden JAWS Il-Zellen wie zuvor beschrieben in verschiedenen Ansätzen mit HPV16LlΛc»E7ι.55 CVLPs und/oder Mausserum über 2 Tage inku- biert. Dabei wurden zugesetzt:
• 80 bzw. 10 μg CVLPs,
• eine Lösung mit 80 bzw. 10 μg CVLPs, die durch über Zefa-Membran gefiltert wurde, von der bekannt ist, daß sie die CVLPs effektiv aus der Lösung entfernt wobei die meisten der Verunreinigungen den Filter passieren (deputierter Ansatz),
• 10 μl einer 1/20 Verdünnung eines Mausserum, das aus einer mit den genannten CVLPs immunisierten Maus gewonnen wurde und
• 10 μg CVLPs, die mit 10 μl des genannten Mausserums für 5 min vorin- kubiert waren.
Anschließend wurden die Zellen wie oben untersucht, ob sie MHC Klasse II- Moleküle exprimieren, indem sie zunächst mit einem 1 μg/ml MHC IAb- Antiköφer und anschließend mit 1 μg/ml FITC-gekoppelten anti-Maus- Antiköφer gefärbt wurden. Abschließend wurden die Zellen hinsichtlich ihrer Färbung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert.
Fig. 8 zeigt, daß die Depletierung der CVLPs aus dem Ansatz wie die Vorinkuba- tion mit CVLP-spezifischem Mausserum die Aktivierung der MHC-Klasse JJ- Expression verhindert, was bedeutet, daß diese beobachtete Aktivierung spezifisch durch CVLPs hervorgerufen wird und nicht durch etwaige Verunreinigungen der CVLP-Präparationen bedingt ist.
10. Prädendritsche Zellen als Testzellinie für die in vivo-T-Zellaktivierung
Jeweils 3x10" RMA- bzw. JAWS Il-Zellen wurden wie in Beispiel 9 beschrieben mit steigenden Mengen an HPV 16Ll c*E71 -55 CVLPs aus verschiedenen Präpara- tionen für 3 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden erneut dahingehend untersucht, ob sie CVLPs gebunden hatten. Hierzu wurden die Zellen mit 1 μg/ml des FITC- gekoppelten 25/C α-HPV16Ll Antiköφers gefärbt, hinsichtlich ihrer Färbung in einem FACScan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von cellquest Software analysiert.
Fig. 9 zeigt, daß Charge 1-3 der CVLPs an RMA-Zellen binden können, wobei Charge 3 bei gleichen CVLP-Konzentrationen etwas schlechter bindet. An die JAWS Il-Zellen binden hingegen nur die CVLPs der Chargen 1 und 3, die CVLPs der Charge 2 zeigen keinen deutlichen Anstieg und erreichen selbst bei der höch- sten Konzentration von 100 μg/ml CVLPs keine 50%-ige Bindung. Die Bindung der CVLPs an Zellen variiert somit mit der CVLP-Präparation und dem Zelltyp. Um zu testen, ob die beobachtete Variabilität der CVLP-Bindung mit der in vivo- Induzierbarkeit einer zytotoxischen T-Zellantwort korreliert, wurde das folgende Experiment durchgeführt:
Je drei C57BL6 Mäuse wurden mit 10 oder 1 μg CVLP der Chargen 1 bis 3 geimpft. Nach zwei Wochen wurden die Mäuse durch eine zweite identische Injektion geboostert. Nach weiteren zwei Wochen wurden die Tiere geopfert und Milz sowie Serum gewonnen. Alle Seren enthielten Antiköφer gerichtet gegen die CVLPs (Daten nicht gezeigt). Aus der Milz wurden die T-Zellen isoliert und über Nylonwolle aufgereinigt (siehe Current Protocols in Immunology, supra. Seite 7.7.2 bis 7.7.3).
Die T-Zellen wurden mit 10 μg/ml des murinen zytotoxischen P12-Peptids über 5 Tage stimuliert. Anschließend wurden die T-Zellen in 100 μl Medium bei 37°C mit weiteren 10 μg des P12-Peptids in Anwesenheit von 10 IU/ml IL2 restimuliert. Als Negativ-Kontrolle dienten T-Zellen aus mit Puffer immunisierten Mäusen. Nach einer Stunde wurde 1 μl Monensin (300 μM) zugegeben. Die Zellen wurden für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert, mit je 1 μg/ml α-Maus CD4/Cychrom-, α-Maus CD8/PE- und mit α-Maus Interferon γ/FITC-Antiköφern gefärbt. Die Zellen wurden hinsichtlich ihrer Markierung in einem FACSscan calibur untersucht und die Meßergebnisse mit Hilfe von Cellquest Software analysiert.
Fig. 10 zeigt, daß keine Maus, die mit CVLPs der Charge 2 geimpft worden war, gegen das P12-Peptid reaktive zytotoxische T-Zellen generiert hatte, während die Verimpfung von CVLPs der Chargen 1 und 3 jeweils in mehreren Mäusen reaktive T-Zellen induzieren konnte. Die Erkenntnis aus diesen in vivo-Daten, daß sich die CVLPs der Charge 2 nicht zur Generierung von zytotoxischen T-Zellen eignen, war bereits aus den in vitro-Daten der CVLP-Bindungsstudie mit den JAWS II-Zellen erkennbar, während die RMA-Zellen eine derartige Voraussage nicht zuließen. Somit eignen sich insbesondere Prädendritische Zellen wie die JAWS Il-Zellen für die Vorhersage einer in vivo-T-Zellaktivierung mit Hilfe von CVLPs.

Claims

0
43
Patentansprüche
1. Testsystem zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunant- wort, insbesondere zellulären Immunantwort, enthaltend: a) mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und mindestens eine Antigen-präsentierenden Zielzelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Prädendritische Zelle, Dendriti- sehe Zelle, embryonalen Zelle und/oder Fibroblast, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurden, und b) Effektorzellen des Immunsystems, insbesondere B-Zellen, NK- Zellen, vorzugsweise T-Zellen, in besonders bevorzugter Weise zytotoxische T-Zellen oder T-Helferzellen.
2. Testsystem zum in vitro Nachweis einer Antigen-spezifischen Immunantwort, insbesondere zellulären Immunantwort, wobei das Testsystem min- destens a) ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP und mindestens eine Prädendritische Zelle und/oder eine CD16-positive Zelle aufweist, die mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP inkubiert wurde, und b) die Bindung des stabilen Capsomers, Capsids, VLPs und/oder
CVLPs an die Pradendπtische Zelle und oder die CD16-posιtιve Zelle gemessen wird
Testsystem nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen Saugerzellen, insbesondere humane oder muπne Zellen sind
Testsystem nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, stabile Capsomer, Capsid, VLP, und/oder CVLP mindestens ein Ll -Protein eines oder mehrerer Papillomaviren, oder mindestens em Ll -Protein und mindestens em Papillomavirus L2-Protem, insbesondere Ll -Proteine oder Ll- und L2-Proteιne von humanen, bovinen und/oder cottontail rabbit' Papillomaviren, enthalt
Testsystem nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, stabile Capsomer, Capsid, und/oder CVLP mindestens ein Ll-
Fusionsprotein, bestehend aus einem Ll-Proteinanteil eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum Ll -Protein heterologen Proteinanteil, enthalt
Testsystem nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ll-
Proteinanteil ein naturlich vorkommendes Ll -Protein ist
Testsystem nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Ll- Proteinanteil deletiert und/oder mutiert ist
Testsystem nach Anspruch 7 dadurch gekennzeichnet, daß vom C- Terminus des Ll -Proteinanteils bis zu mindestens ca 35 Aminosäuren, 0
- 45 -
vorzugsweise mindestens ca. 25 bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren deletiert sind.
Testsystem nach einem der Ansprüche 4-8, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil ein natürlich vorkommendes Protein ist.
10. Testsystem nach einem der Ansprüche 4-8, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil deletiert und/oder mutiert ist.
1 1. Testsystem nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil von einem bakteriellen oder viralen Protein abgeleitet ist, vorzugsweise von einem Papillomavirus-Protein, insbesondere von einem Protein eines humanen Papillomavirus.
12. Testsystem nach Anspruch 1 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomavirus-Protein ein E-Protein, insbesondere ein E6- oder E7-Protein ist.
13. Testsystem nach Anspruch 12 dadurch gekennzeichnet, daß vom C- Terminus des E7-Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise mindestends ca. 5 bis ca. 55, insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert sind.
14. Testsystem nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil von einem Autoimmunantigen, insbesondere Thyroglobulin, Myelin oder Zona Pellucida Glycoprotein 3 (ZP3) oder von einem Tumorantigen, insbesondere einem Melanoma-, Ovarialcarcinom- oder Mammacarcinom-Antigen abgeleitet ist.
15. Zelle dadurch gekennzeichnet, daß sie nach in vitro Inkubation mit Cap- someren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs. und/oder CVLPs Proteine und/oder Proteinfragmente aus genannten Capsomeren, stabilen Capsomeren, Capsiden, VLPs, und/oder CVLPs enthält, vorzugsweise präsentiert.
16. Zelle nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, sta- bile Capsomer, Capsid, VLP, und/oder CVLP mindestens ein Ll -Protein eines oder mehrerer Papillomaviren, oder mindestens ein Ll -Protein und mindestens ein Papillomavirus L2-Protein enthält.
17. Zelle nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß das Capso- mer, stabile Capsomer, Capsid, und/oder CVLP mindestens ein Ll-
Fusionsprotein, bestehend aus einem Ll-Proteinanteil eines oder mehrerer Papillomaviren und einem zum Ll -Protein heterologen Proteinanteil, enthält.
18. Zelle nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Ll- Proteinanteil ein natürlich vorkommendes Ll -Protein ist.
19. Zelle nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Ll- Proteinanteil deletiert und/oder mutiert ist.
20. Zelle nach Anspruch 19 dadurch gekennzeichnet, daß vom C-Terminus des Ll -Proteinanteils bis zu mindestens ca. 35 Aminosäuren, vorzugsweise - 47 -
mindestens ca. 25 bis ca. 35, insbesondere mindestens ca. 32 bis ca. 34 Aminosäuren deletiert sind.
21. Zelle nach einem der Ansprüche 16-20, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil ein natürlich vorkommendes Protein ist.
22. Zelle nach einem der Ansprüche 16-20, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil deletiert und/oder mutiert ist.
23. Zelle nach Anspruch 21 oder 22 dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll- Protein heterologe Proteinanteil von einem bakteriellen oder viralen Protein abgeleitet ist, vorzugsweise von einem Papillomavirus-Protein, insbesondere von einem Protein eines humanen Papillomavirus.
24. Zelle nach Anspruch 23 dadurch gekennzeichnet, daß das Papillomavirus- Protein ein E-Protein, insbesondere ein E6- oder E7-Protein ist.
25. Zelle nach Anspruch 24 dadurch gekennzeichnet, daß vom C-Terminus des E7-Proteins mindestens ca. 55 Aminosäuren, vorzugsweise minde- stends ca. 5 bis ca. 55, insbesondere mindestens ca. 38 bis ca. 55 Aminosäuren deletiert sind.
26. Zelle nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeichnet, daß der zum Ll -Protein heterologe Proteinanteil von einem Autoantigen, insbesondere
Thyroglobulin, Myelin oder ZP3 oder von einem Tumorantigen, insbeson- - 48 -
dere einem Melanoma-, Ovarialcarcinom- oder Mammacarcinom-Antigen abgeleitet ist.
27. Zelle nach einem der Ansprüche 15-26, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Antigen-präsentierenden Zelle, insbesondere B-Zelle, Makrophage, Prädendritische Zelle, Dendritische Zelle, embryonalen Zelle oder Fibroblast ist.
28. Verfahren zur Herstellung einer Zielzelle nach einem der Ansprüche 15- 27, dadurch gekennzeichnet, daß die Zielzelle mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP in vitro inkubiert wird.
29. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1- 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP gentechnisch hergestellt wird und mit einer Prädendritischen und oder eine CD16-positiven Zelle inkubiert wird.
30. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1- 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP gentechnisch und die Zielzelle gemäß Anspruch 28 hergestellt wird, und daß die Effektorzelle eine Immunzellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, vorzugsweise eine murine oder humane Immunzellinie und/oder kultivierte primäre Immunzelle, ist.
31. Verfahren zur Herstellung eines Testsystems nach einem der Ansprüche 1- 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Capsomer, das stabile Capsomer, das Capsid, das VLP, und/oder das CVLP in Bakterien wie beispielsweise E. coli, Hefen wie beispielsweise S. cerevisiae, insbesondere Insektenzellen wie beispielsweise Spodoptera frugiperda Zellen oder Trichoplusia ni Zellen oder Säugerzellen wie beispielsweise COS-Zellen oder HeLa- Zellen, hergestellt wird.
32. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles
Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26, das folgende Schritte enthält: a) Verwenden eines Testsystems gemäß Ansprüchen 1 -14; b) Bestimmen der möglichen Aktivierung von Effektorzellen.
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es vor Schritt a) folgenden zusätzlichen Schritt a') enthält: a') Cokultivieren der Effektorzelle des Testsystems gemäß Anspruch 1 oder 3 für mindestens ca. 8 Wochen, insbesondere mindestens ca. 3
Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP, mindestens einer Zielzelle des Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1 -14, und/oder mit mindestens einer Zelle ge- maß einem der Ansprüche 15-27, bevor sich Schritt a) anschließt.
34. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und oder mindestens ein CVLP und einer Prädendritschen und/oder eine CD16-positive Zelle gemäß einem der Ansprüche 15-27, das folgende Schritte enthält: a) Verwendung eines Testsystems gemäß Ansprüche 1-14; b) Bestimmung der Bindung des stabiles Capsomers, Capsids, VLPs und/oder CVLPs an die Prädendrische Zelle und/oder CD16- positive Zelle.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34 dadurch gekennzeichnet, daß es für die Qualitätskontrolle von Chargen prophylaktischer und/oder therapeutischer Impfstoffe enthaltend mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLP oder mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 14-26 verwendet wird.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Identifizierung von Epitopen, Peptiden oder Proteinfragmenten, die eine Immunantwort, insbesondere eine zelluläre Immunantwort auslösen, verwendet wird.
37. Verfahren zum in vitro Nachweis der Aktivierung von Effektorzellen des Immunsystems durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und oder mindestens ein CVLP und/oder mindestens eine Zelle gemäß einem der Ansprü- ehe 15-27, das folgende Schritte enthält:
I) Gewinnen und präparieren von Proben enthaltend Effektorzellen des Immunsystems und anschließende Kultivierung. II) Zugeben von mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder mindestens einem CVLP und/oder mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 15-27. III) Bestimmen der möglichen Aktivierung von Effektorzellen.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß es nach Schritt I) folgenden zusätzlichen Schritt I') enthält:
I') Cokultivieren der Effektorzelle für mindestens ca. 8 Wochen, insbe- sondere mindestens ca. 3 Wochen mit mindestens einem Capsomer, mindestens einem stabilen Capsomer, mindestens einem Capsid, mindestens einem VLP, und/oder CVLP und/oder mindestens einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 15-27, bevor sich Schritt II) anschließt.
39. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Überwachung des Immunstatus eines Organismus gegenüber einem Erreger, insbesondere eines schwer nachweisbaren Erregers verwendet wird.
40. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Überwachung einer Impfung verwendet wird.
41. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Identifikation von HLA-Haplotypen verwendet wird, die die Immunität gegenüber einem bestimmten Erreger vermitteln.
42. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Unterscheidung und Charakterisierung von Autoimmunerkrankungen hinsichtlich unterschiedlicher spezifischer Autoimmunantigene verwendet wird.
43. Verfahren nach Anspruch 37 oder 38, dadurch gekennzeichnet, daß es für die Unterscheidung von Tumortypen hinsichtlich unterschiedlicher spezifischer Tumorantigene verwendet wird.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 32-43, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivierung der Effektorzelle durch mindestens ein Capsomer, mindestens ein stabiles Capsomer, mindestens ein Capsid, mindestens ein VLP, und/oder mindestens ein CVLPs in Hochdurchsatz-Systemen durchgeführt wird.
45. Verwendung mindestens eines Testsystems gemäß einem der Ansprüche 1 -14 und oder einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 15-26 zur Auslösung oder zum Nachweis einer Immunantwort.
46. Diagnostikum enthaltend mindestens ein Testsystem gemäß einem der Ansprüche 1 -14 und/oder einer Zelle gemäß einem der Ansprüche 15-27 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
47. Diagnostikum nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Testsystem gemäß einem der Ansprüche 1-14 und/oder eine Zelle gemäß einem der Ansprüche 15-26 in Lösung vorliegt, an eine feste Matrix gebunden ist, und/oder mit einem Adjuvans versetzt ist.
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