EP1888620A1 - Verfahren zur herstellung von einen wirkstoff enthaltenden virusartigen partikeln - Google Patents

Verfahren zur herstellung von einen wirkstoff enthaltenden virusartigen partikeln

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EP1888620A1
EP1888620A1 EP06707650A EP06707650A EP1888620A1 EP 1888620 A1 EP1888620 A1 EP 1888620A1 EP 06707650 A EP06707650 A EP 06707650A EP 06707650 A EP06707650 A EP 06707650A EP 1888620 A1 EP1888620 A1 EP 1888620A1
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EP
European Patent Office
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antigen
virus
amino acid
acid sequence
protein
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06707650A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Christoph Reichel
Claus RÜHLAND
Jürgen Hess
Christian Reiser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
responsif GmbH
Original Assignee
responsif GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by responsif GmbH filed Critical responsif GmbH
Publication of EP1888620A1 publication Critical patent/EP1888620A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the invention relates to a process for the preparation of virus-containing particles containing an active substance and to the virus-like particles produced by the process.
  • WO 00/61616 A1 discloses a synthetic biologically active molecule for anchoring an active substance to pentamers of virus protein 1 (VP1) of the polyoma virus.
  • VP1 virus protein 1
  • an amino acid sequence which binds to VPl-pentamers and is derived from the C-terminal end of virus protein 2 (VP2) or 3 (VP3) of the polyoma virus is connected at one end to the active substance.
  • VLPs virus-like particles
  • VP1 polyoma virus
  • the proteins to be assembled are introduced in solution in an increased concentration and incubated until VLPs are formed.
  • E. coli already precipitates in low concentration. Such a hydrophobic domain of VP2 produced in E. coli is often unable to specifically bind to VP1 pentamers.
  • expression of recombinant VP2-binding VP2 in E. coli can be promoted by having the amino acid sequence of VP2 together with a hydrophilic amino acid sequence as described in Abbing et al. the amino acid sequence of GFP expressed as a fusion protein.
  • a recombinant fusion protein which, besides the VPl-pentamer interacting domain of VP2, reverses a predominantly hydrophobic amino acid sequence.
  • the problem of proper protein folding exists. Since the VPl-pentamerically interacting domain of VP2 is also hydrophobic, it can interact with the predominantly hydrophobic amino acid sequence and thereby adversely affect protein folding so that the resulting fusion protein can not bind specifically to VPl-pentamers.
  • the expression of such fusion proteins in E. coli often results in the formation of inclusion bodies, which are also referred to as "inclusion bodies". Proteins contained in the inclusion bodies are denatured and non-functional.
  • a solution of the tumor antigens or peptides in DMSO often also does not lead to a structure as it is present in the native tumor antigens.
  • One against the native Tumor antigens effective immunization can not be ensured.
  • the disadvantage here is that the process is complicated and additional purification is required for in vivo administration in order to remove the reagents required for the covalent coupling.
  • the object of the present invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method is to be provided which allows the preparation of a drug-containing virus-like particles, wherein the drug is to be presented so that it can induce formation of specific cytotoxic T cells in a mammal or human.
  • the virus-like particles and a use of the particles are to be specified.
  • a method for producing virus-like particles containing an active ingredient, wherein proteins which each have a first amino acid sequence derived from a first viral protein and fusion proteins assemble into the virus-like particles.
  • the first amino acid sequence is an amino acid sequence which is sufficient for the formation of capsid-forming and a second viral protein-specific binding capsomeres.
  • the fusion proteins each have a second amino acid sequence which specifically binds to one of the capsomers and is derived from the second virus protein, and a third amino acid sequence which forms the active substance.
  • the proteins and the fusion proteins are coexpressed in yeast cells.
  • the coexpression of the fusion proteins in the yeast cells ensures that the second amino acid sequence is folded so that it can specifically bind to the capsomeres, even if the third amino acid sequence forming the active substance is predominantly hydrophobic.
  • virus-like particles which contain the active ingredient can form from the fusion proteins and the capsules formed from the proteins.
  • the active ingredient is arranged so that it often repeats itself at a small distance.
  • the specific binding of the region of the fusion protein formed by the second amino acid sequence to the capsomers ensures good association of the active ingredient with the virus-like particles.
  • VLPs Process located on the inside of the VLPs and is thus protected from degradation, for example by proteases.
  • capsules are first formed in the yeast cells from the proteins, each of which has the first amino acid sequence. From the capsomeres and the fusion proteins, VLPs form in the yeast cells, which can then be isolated from the hepatic cells.
  • a further advantage of the method according to the invention is that all proteins contained in the VLPs are produced and assembled in an organism. As a result, it is not necessary in the production of a drug to provide a separate proof of production for all components according to GMP practice. All it takes is one
  • VLPs produced in yeasts. Since the VLPs are hydrophilic as a whole, they can easily be precipitated in aqueous solution. ger solution be administered. The use of DMSO for administration is not required.
  • the first virus protein and / or the second virus protein originate from a virus or can be obtained, wherein the virus is selected from the group of non-enveloped viruses comprising Papovaviridae, in particular polyoma and papillomaviruses, Iridoviridae, Adenoviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, in particular polioviruses, Caliciviridae, Reoviridae and Birnaviridae.
  • the first virus protein is virus protein 1 of the polyoma virus (VP1) and the second virus protein is virus protein 2 (VP2) or virus protein 3 (VP3) of the polyoma virus.
  • the capsomers are preferably in the form of pentamers, hexamers or heptamers.
  • the process according to the invention is particularly advantageous if the third amino acid sequence is, at least predominantly, hydrophobic.
  • the hydrophobicity of the amino acid sequence can be determined, for example, by the method known from Kyte, J. and Russell, F.D., Journal of Molecular Biology (1982), Vol. 157, Issue 1, pages 105 to 132. The hydrophilic and hydrophobic properties of each of the 20 amino acid side chains are taken into account.
  • An amino acid sequence is predominantly hydrophobic if the majority of the amino acids forming the sequence are hydrophobic or if a peptide / protein having the amino acid sequence would be sparingly soluble or insoluble in water.
  • Fusion proteins the respective extent of the expression of the proteins and the fusion proteins coordinated so that a maximum in the process of the amount of the active substance-containing virus-like particles is formed. This can be achieved by introducing expression plasmids which code for the proteins and the fusion proteins into the yeast cells in a matched copy number. There may also be nucleic acid sequences which coding for the proteins and the fusion proteins are stably integrated into the genome of the yeast cells in a coordinated copy number.
  • the expression of the proteins takes place under the control of a first promoter, which is contained in a coding for the first plasmid, and the expression of the fusion proteins under the control of a second promoter, which in a coding for the fusion proteins second plasmid is included.
  • the respective extent of the expression of the proteins and the fusion proteins is coordinated by a suitable choice of the first and the second promoter.
  • the first and / or the second promoter are selected from the group consisting of the promoters of the genes of alcohol dehydrogenase 1 (ADHI), alcohol dehydrogenase 2 (ADH2), orthophosphoric monoester phosphohydrolase (Apase) , Format Dehydrogenase (FOD), Galactokinase (GALl), UDP-Glucose-4-Epimerase (GALlO), Glyceraldehyde-3-Phosphate (GAP), Glyceraldehyde-Phosphate-Dehydrogenase (GAPDH), Alcohol-Oxides (AOX) , Methanol oxidase (MOX), no message in thiamine 1 (NMTl), 3-phosphoglycerate kinase (PGK) and pyruvate kinase (PYKl) and the hybrid promoters GAL10 / PYK1 and ADH2 / GAPDH.
  • ADHI alcohol dehydr
  • the third amino acid sequence preferably comprises a sequence of at least one antigen, of at least one epitope of this antigen or of different epitopes of this antigen. If the third amino acid sequence comprises different epitopes of the antigen, the fusion protein is a so-called multi-epitope construct.
  • the antigen may be a tumor-associated antigen.
  • An antigen is any protein or peptide which can induce an immune reaction in a mammal or human, in particular the formation of cytotoxic T cells. To trigger the immune response, it may be necessary to appropriately present the antigen to the immune system.
  • a tumor-associated antigen an antigen which is expressed by tumor cells in a different way than by the corresponding non-degenerated cells of the same type or an antigen which has a specific influence on the growth or multiplication of tumor cells.
  • the tumor-associated antigen is selected from the group comprising NY-ESO-I, telomerase reverse transcriptase (TERT), p53, MDM2, CYPlB1, HER-2 / neu, CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 ) and the apoptosis-inhibiting protein survivin.
  • the antigen is an antigen of an agent of a viral disease or infectious disease.
  • An antigen of a pathogen is an antigen which the pathogen itself has or for which the pathogen has a coding nucleotide sequence.
  • the viral disease or infectious disease can be a chronic viral disease or infectious disease.
  • the antigen may be selected from a group comprising: HIV-associated antigen, HCV-associated antigen antigen, tuberculosis-associated antigen, in particular Ag85A, Ag85B, Rv3407, Esat-6 and Hsp65, malaria-associated antigen, in particular CSP-I, LSA-I, LSA-3 and EXP-1, with a merozoite stage of the malaria pathogen, in particular MSP-I, and bilharzia-associated antigen.
  • the antigen is associated with one of the pathogens if the pathogen expresses the antigen itself or triggers its expression in the affected organism.
  • the third amino acid sequence forms an MHC class I-specific antigen.
  • the first amino acid sequence derived from the virus protein 1 of the polyomavirus (VP1) does not contain the DNA-binding domain contained in the VP1 and / or the nuclear localization sequence (NLS) contained in the VP1.
  • the DNA-binding domain is contained in the NLS or overlaps with the NLS.
  • the function of NLS is usually to translocate the VPI into the nucleus.
  • the DNA-binding domain can bind any DNA. By omitting the DNA-binding domain or the NLS can be achieved that little or no unwanted DNA from the host organism is packaged in the VLPs. As a result, a higher quality of the VLPs can be achieved. Undesirable side effects of DNA from the host organism are avoided. Tolerability of VLPs when administered to a mammal is improved.
  • yeast cells used for coexpression are preferably yeast cells of the species Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polyraorpha, Kluyveromyces lactis or Kluyveromyces marxianus.
  • the invention further relates to virus-like particles, comprising proteins which each have a first amino acid sequence derived from a first virus protein, and fusion proteins.
  • the first amino acid sequence is an amino acid sequence which is sufficient for the formation of capsid-forming and a second viral protein specific binding capsomeres.
  • the fusion proteins each have a second amino acid sequence which specifically binds to one of the capsomers and is derived from the second virus protein, and a predominantly hydrophobic third amino acid sequence which forms an active substance.
  • Such particles with a predominantly hydrophobic third amino acid sequence could not be produced so far. However, their production succeeds when the proteins and the fusion proteins are coexpressed in yeast cells and the particles are formed in the yeast cells. Another way to make them is unknown.
  • Advantageous embodiments of the particles according to the invention result from the preceding embodiments relating to the method according to the invention.
  • the invention furthermore relates to the particles according to the invention for use as a medicament.
  • virus-like particles by coexpression of the virus protein VP1 of the polyoma virus and of a fusion protein from the virus protein VP3 of the polyoma virus and the tumor antigen Her2 / neu
  • the yeast expression plasmid pGCH-VP1 contains the yeast-specific GAL1 promoter, a yeast-specific CYCl transcription termination sequence, a CEN / ARS DNA fragment (origin of replication), a HIS3 selection marker and the coding DNA for the polyomavirus protein VP1.
  • the extracellular domain and the transmembrane domain of Her2 / neu (amino acids 1-683) are translationally fused with VP3.
  • the yeast expression plasmid pGCL-Her2 / neu (1-683) -VP3 contains - the yeast-specific GAL1 promoter, a yeast-specific CYCl transcription termination sequence,
  • the yeast expression plasmid pGCL-VP3-Her2 / neu contains the yeast-specific GAL1 promoter, a yeast-specific CYCl transcription termination sequence,
  • yeast cells are then centrifuged off at 1,000 ⁇ g for 2 minutes and the cell pellets are incubated with SG medium (6.7 g / l YNB (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany).
  • SG medium 6. g / l YNB (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg, Germany).
  • the virus-like particles For further purification of the virus-like particles to be 6 ml each of the supernatant carefully to 32 ml of a sucrose cushion (45% sucrose, in cell disruption buffer) layered and centrifuged for 4 hours at 4 0 C and 100,000. The pellets formed thereby contain the virus-like particles.
  • Pellets are taken up in cell disruption buffer (without PMSF) and insoluble material is removed by centrifugation at 5,000 xg for 10 minutes. The supernatant is on one Cesium chloride step gradient applied.
  • the cesium chloride step gradient is prepared from 4 ml fractions of increasing density (1.23 g / cm 3 , 1.26 g / cm 3 , 1.29 g / cm 3 , 1.32 g / cm 3 , 1.35 g / cm 3 , 1.38 g / cm 3 in 20 mM Tris-HCl, pH 7.6). Subsequent centrifugation is carried out at 100,000 xg and 4 ° C for 36 hours.
  • the yeast expression plasmid pmSurv-VP2 contains - a yeast-specific MET25 promoter that encodes
  • Cultivation of the hEP cells transformed with both plasmids is carried out as described in Example 1. Subsequently, the yeasts are centrifuged for 10 minutes at 1,000 xg and the yeast pellet in 0.5 ml cell disruption buffer (20 mM Tris-HCl, pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.01% Triton X-100 , 1 mM PMSF) per gram fresh weight of the yeasts.
  • Fig. 3 shows a Western blot analysis of fractions 1 to 38 of the cesium chloride gradient.
  • the upper panel shows a Western blot analysis performed with VPI-specific antibodies and the lower panel a Western blot analysis performed with survivin-specific antibodies.
  • Fractions 18 to 27 show both VP1 and survivin-VP2 fusion protein.
  • FIG. 4 shows an electron micrograph of the VLPS contained in the fractions 24 to 27 of the cesium chloride gradient.
  • the VLPs are purified after culturing the yeast using classical biochemical methods.
  • the cell pellets in buffer QSA (20 mM ethanolamine, 2 mM EDTA, 6 mM DTT, 50 mM NaCl, 5% glycerol, pH 9.0, 10 ml buffer per gram cell pellet + protease inhibitor + benzonase, final concentration 1 U / ml) resuspended.
  • the cells are disrupted with a French press (3 cycles at 2000 bar). Subsequently, by centrifugation at 75,000 xg for 45 min and 4 ° C cell debris removed.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikeln, wobei Proteine, welche je eine von einem ersten Virusprotein abgeleitete erste Aminosäuresequenz aufweisen, und Fusionsproteine zu den virusartigen Partikeln assemblieren. Die Proteine und die Fusionsproteine werden dabei in Hefezellen coexprimiert.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikeln
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikeln sowie die mittels des Verfahrens hergestellten virusartigen Partikel .
Aus der WO 00/61616 Al ist ein synthetisches biologisch aktives Molekül zum Verankern eines Wirkstoffs an Pentamere des Virusproteins 1 (VPl) des Polyoma-Virus bekannt. Dabei ist eine an VPl-Pentamere bindende, vom C-terminalen Ende des Virus Proteins 2 (VP2) bzw. 3 (VP3) des Polyoma-Virus abgelei- tete Aminosäuresequenz an ihrem einen Ende mit dem Wirkstoff verbunden .
Aus der WO 99/25837 ist es bekannt, virusartige Partikel (Virus Like Particles, VLPs) in Hefen durch Expression von Vi- rusprotein 1 des Polyomavirus (VPl) herzustellen.
Aus Palkovä, Z. et al . , FEBS Letters 478 (2000), Seiten 281 bis 289 ist es bekannt, dass die Expression von Virusprotein 1 des Polyomavirus in Hefe das Wachstum der Hefezellen stark inhibiert.
Aus Buonamassa, D. T. et al . , Virology 293 (2002), Seiten 335 bis 344 ist die Coexpression der humanen Papillioma-Virus- Kapsid-Proteine Ll und L2 und die Assemblierung dieser Pro- teine zu VLPs in Hefen bekannt.
Aus Kiessling, R., Proceedings of the Sixth Annual Walker' s Cay Colloquium on Cancer Vaccines and Immunotherapy (2004) , Keynote Address, Seite 4 ist es bekannt, Teile des Tumorantigens Her2/neu am carboxyterminalen Ende des VP2 Strukturkap- sidproteins zu exprimieren und Polyoma VLPs zu verwenden, um das Her2/neu-VP2-Konstrukt transgenen Mäusen als Tumorvakzine zu verabreichen.
Aus Abbing, A. et al . , Journal of Biological Chemistry (2004), Band 279, Nr. 26, Seiten 27410 bis 27421, ist es bekannt, VPl und ein Fusionsprotein, welches die Aminosäurese- quenzen von GFP und dem Virusprotein 2 des Polyomavirus (VP2) aufweist, jeweils in E. coli zu exprimieren. Eine Assemblierung von VPl und dem GFP-VP2 -Fusionsprotein erfolgt nach deren Isolierung in vitro. Dazu werden die zu assemblierenden Proteine in Lösung in erhöhter Konzentration vorgelegt und inkubiert bis sich VLPs bilden.
Ein grundsätzliches Problem bei der Expression von VP2 besteht darin, dass VP2 und insbesondere dessen an VPl-Pentame- re bindende C-terminal gelegene Domäne (siehe Fig. 1) ver- hältnismäßig hydrophob ist und bei einer Expression in
E. coli bereits in niedriger Konzentration ausfällt. Eine derart hydrophobe Domäne von in E. coli hergestelltem VP2 ist häufig nicht in der Lage spezifisch an VPl-Pentamere zu binden. Die Expression von rekombinantem spezifisch an VPl- Pentamere bindendem VP2 in E. coli kann aber dadurch begünstigt werden, dass die Aminosäuresequenz von VP2 zusammen mit einer hydrophilen Aminosäuresequenz, wie bei Abbing et al . der Aminosäuresequenz von GFP, als Fusionsprotein exprimiert wird.
Bei der Expression eines rekombinaten Fusionsproteins, welches neben der mit einem VPl-Pentamer interagierenden Domäne von VP2 eine überwiegend hydrophobe Aminosäuresequenz um- fasst, besteht das Problem der richtigen Proteinfaltung. Da die üblicherweise mit VPl-Pentameren interagierende Domäne von VP2 ebenfalls hydrophob ist, kann sie mit der überwiegend hydrophoben Aminosäuresequenz interagieren und dadurch die Proteinfaltung so negativ beeinflussen, dass das resultierende Fusionsprotein nicht spezifisch an VPl-Pentamere binden kann. Bei der Expression derartiger Fusionsproteine in E. coli kommt es häufig zur Bildung von Einschlusskörpern, welche auch als "Inclusion Bodies" bezeichnet werden. In den Ein- Schlusskörpern enthaltene Proteine sind denaturiert und nicht funktional .
Aus Chen, S. X. et al . , The EMBO Journal (1998), Band 17, Nr. 12, Seiten 3233 bis 3240 ist eine Coexpression von VPl und VP2 bzw. VP3 in E. coli bekannt. Darüber hinaus ist es daraus bekannt, wie das Polyoma-Virusprotein VP2 bzw. VP3 mit dem Polyoma-VirusproteinVPl interagiert und welche Bereiche der Proteine dafür jeweils verantwortlich sind.
Viele bekannte Tumorantigene enthalten stark hydrophobe Proteinbereiche. Diese Tumorantigene oder Peptide, die Sequenzen des Tumorantigens einschließlich dieser Proteinbereiche aufweisen, sind in Wasser häufig nicht löslich. Für eine Immunisierung von Tumorpatienten mit diesen Tumorantigenen werden diese zur Verabreichung üblicherweise in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Das ist beispielsweise aus Gnjatic et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA (2002), Band 99, Nr. 18, Seiten 11813 bis 11818 bekannt. DMSO wird jedoch wegen möglicher Nebenwirkungen, wie Hautreaktionen, zentralnervösen Störungen und Organschäden an Leber und Nieren für schädlich erachtet.
Darüber hinaus führt eine Lösung der Tumorantigene bzw. Peptide in DMSO häufig auch nicht zu einer Struktur, wie sie in den nativen Tumorantigenen vorliegt. Eine gegen die nativen Tumorantigene wirksame Immunisierung kann dadurch nicht sichergestellt werden.
Ein Merkmal chronisch verlaufender Erkrankungen ist es, dass gegen spezifische, mit der Erkrankung assoziierte Antigene eine Toleranz des Immunsystems besteht. Eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Immuntherapie derartiger Erkrankungen ist es daher, diese Toleranz zu überwinden. Dazu ist die Induktion einer B-Zellantwort erforderlich, die eine spezifi- sehe Antikörperantwort gegen die mit der chronischen Erkrankung assoziierten Antigene bewirkt.
Zur effektiven immunologischen Behandlung einer chronischen Erkrankung, wie eines Tumors, einer chronischen Viruserkran- kung, wie z.B. einer Infektion mit HIV oder HCV, oder einer anderen Infektionskrankheit, wie z. B. Malaria, Tuberkulose oder Bilharziose, ist es erforderlich, dass gegen Tumorzellen oder infizierte Zellen gerichtete zytotoxische T-Zellen gebildet werden. Das erfordert eine richtige und starke Akti- vierung der T-Zellen. Dazu ist es nicht ausreichend, ein Tumorantigen oder ein für die infizierten Zellen spezifisches Antigen zusammen mit einem Adjuvans zu applizieren. Es hat sich gezeigt, dass es dazu auf eine häufige Wiederholung des antigenen Motivs in geringem räumlichen Abstand und eine gute Assoziation des Antigens mit einem die Immunantwort stimulierenden Agens, wie beispielsweise VLPs, ankommt. Die Firma Cytos Biotechnology AG, Schweiz koppelt daher Antigene kova- lent an die Außenseite rekombinant hergestellter VLPs. Nachteilig ist dabei, dass das Verfahren aufwändig ist und für eine in vivo Verabreichung eine zusätzliche Reinigung erforderlich ist, um die für die kovalente Kopplung erforderlichen Reagenzien zu entfernen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere soll ein Verfahren bereitgestellt werden, welches die Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikeln erlaubt, wobei der Wirkstoff so präsentiert werden soll, dass er in einem Säugetier oder Menschen eine Bildung spezifischer zytotoxischer T-Zellen auslösen kann. Weiterhin sollen die virusartigen Partikel und eine Verwendung der Partikel angegeben werden.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch die Merkmale der Ansprüche 1, 17 und 28 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 16 und 18 bis 27.
Erfindungsgemäß ist ein Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikeln vorgesehen, wobei Proteine, welche je eine von einem ersten Virusprotein abgeleitete erste Aminosäuresequenz aufweisen, und Fusions- proteine zu den virusartigen Partikeln assemblieren. Dabei ist die erste Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz, welche für die Bildung von Kapsoid-bildenden und ein zweites Virusprotein spezifisch bindenden Kapsomeren ausreichend ist. Die Fusionsproteine weisen je eine spezifisch an je eines der Kapsomere bindende vom zweiten Virusprotein abgeleitete zweite Aminosäuresequenz und eine den Wirkstoff bildende dritte Aminosäuresequenz auf. Die Proteine und die Fusionsproteine werden in Hefezellen coexprimiert .
Eine Aminosäuresequenz ist von einem Protein abgeleitet, wenn sie gegenüber der vollständigen oder unvollständigen Ami- nosäuresequenz des Proteins unverändert ist oder sich davon durch Aminosäureaustausche, Insertionen oder Deletionen unterscheidet .
Durch die Coexpression der Fusionsproteine in den Hefezellen wird erreicht, dass die zweite Aminosäuresequenz so gefaltet wird, dass sie spezifisch an die Kapsomere binden kann, selbst wenn die den Wirkstoff bildende dritte Aminosäuresequenz überwiegend hydrophob ist. Dadurch können sich aus den Fusionsproteinen und den aus den Proteinen gebildeten Kapso- meren virusartige Partikel bilden, welche den Wirkstoff enthalten. Der Wirkstoff ist dabei so angeordnet, dass er sich häufig in geringem räumlichen Abstand wiederholt. Durch die spezifische Bindung des durch die zweite Aminosäuresequenz gebildeten Bereichs des Fusionsproteins an die Kapsomere ist eine gute Assoziation des Wirkstoffs mit den virusartigen Partikeln sichergestellt.
Die Besonderheit des Verfahrens besteht darin, dass die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten VLPs in Säuge- tieren eine starke gegen den Wirkstoff gerichtete Immunantwort auslösen. Dabei werden insbesondere auch zytotoxische T- Zellen gebildet, welche Zellen angreifen, die den Wirkstoff auf ihrer Oberfläche tragen. Da die VLPs selbst die Wirkung eines Adjuvans aufweisen, d. h. eine gegen den Wirkstoff ge- richtete Immunantwort auslösen, ist die Gabe eines zusätzlichen Adjuvans nicht erforderlich. Gegenüber dem von der Firma Cytos Biotechnology AG bekannten Verfahren ist kein aufwändiges chemisches Binden des Wirkstoffs an die Außenseite der VLPs und keine anschließende Reinigung der VLPs erforderlich. Darüber hinaus wird der Wirkstoff bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren auf der Innenseite der VLPs lokalisiert und ist dadurch vor einem Abbau, beispielsweise durch Proteasen, geschützt . Bei der Coexpression der Proteine und der Fusionsproteine in den Hefezellen bilden sich in den Hefezellen zunächst Kapso- mere aus den Proteinen, welche jeweils die erste Aminosäure- sequenz aufweisen. Aus den Kapsomeren und den Fusionsproteinen bilden sich in den Hefezellen VLPs, die dann aus den He- fezellen isoliert werden können.
Im Gegensatz zu der aus der Chen et al . bekannten Coexpressi- on in E. coli, besteht bei der Coexpression in Hefen nicht die Gefahr, dass bei der Isolierung der VLPs aus den zur Coexpression verwendeten Zellen Verunreinigungen durch Endoto- xine nicht vollständig von den VLPs getrennt werden. Damit wird der Aufwand für die Reinigung der den Wirkstoff enthal- tenden VLPs und für kostspielige toxikologische Tests deutlich reduziert. Werden die gereinigten, in Hefe hergestellten VLPs einem Säugetier verabreicht besteht dabei nicht die Gefahr einer Auslösung von Fieber oder eines anaphylaktisehen Schocks durch Endotoxin aus den zur Coexpression verwendeten Zellen. Gegenüber einer Expression in Säugerzellen besteht bei einer Coexpression in Hefezellen darüber hinaus nicht die Gefahr einer Kontamination mit humanpathogenen Erregern, wie z. B. Viren, Bakterien oder Prionen.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass alle in den VLPs enthaltenen Proteine in einem Organismus hergestellt und assembliert werden. Dadurch ist es bei der Herstellung eines Arzneimittels nicht erforderlich, für sämtliche Komponenten einen separaten Nachweis der Her- Stellung nach GMP-Praxis zu erbringen. Es genügt ein einziger
Nachweis für die in Hefen hergestellten VLPs. Da die VLPs insgesamt hydrophil sind, können diese problemlos in wässri- ger Lösung verabreicht werden. Die Verwendung von DMSO zur Verabreichung ist nicht erforderlich.
Besonders vorteilhaft ist es, wenn das erste Virusprotein und/oder das zweite Virusprotein aus einem Virus stammt/stammen oder gewonnen werden kann/können, wobei das Virus ausgewählt ist aus der Gruppe der nicht mit einer Hülle versehenen (non-enveloped) Viren, umfassend Papovaviridae, insbesondere Polyoma- und Papillomaviren, Iridoviridae, Adenoviridae, Par- voviridae, Picornaviridae, insbesondere Polioviren, Calicivi- ridae, Reoviridae und Birnaviridae . Vorzugsweise ist das erste Virusprotein das Virusprotein 1 des Polyomavirus (VPl) und das zweite Virusprotein das Virusprotein 2 (VP2) oder das Virusprotein 3 (VP3) des Polyomavirus. Bevorzugt liegen die Kapsomere in Form von Pentameren, Hexameren oder Heptameren vor.
Besonders vorteilhaft ist das erfindungsgemäße Verfahren, wenn die dritte Aminosäuresequenz, zumindest überwiegend, hy- drophob ist. Die Hydrophobizität der Aminosäuresequenz lässt sich beispielsweise mittels des aus Kyte, J. und Russell, F.D., Journal of Molecular Biology (1982), Band 157, Ausgabe 1, Seiten 105 bis 132 bekannten Verfahrens ermitteln. Dabei werden die hydrophilen und die hydrophoben Eigenschaften von jeder der 20 Aminosäureseitenketten berücksichtigt. Überwiegend hydrophob ist eine Aminosäuresequenz dann, wenn die Mehrzahl der die Sequenz bildenden Aminosäuren hydrophob ist oder wenn ein die Aminosäuresequenz aufweisendes Peptid/Protein in Wasser schwerlöslich oder unlöslich wäre.
Die Besonderheit der Coexpression der Proteine und der Fusionsproteine in Hefezellen besteht darin, dass an sich schwerlösliche oder unlösliche Fusionsproteine bei ihrer Bildung in situ sofort mit Kapsomeren interagieren, die aus den Proteinen gebildet worden sind. Dadurch entstehen lösliche Komplexe, welche sich dann zu VLPs zusammenlagern.
Gegenüber der aus Abbing et al . bekannten Assemblierung von aus E. coli isoliertem VPl und VP2 -Fusionsprotein ermöglicht es das erfindungsgemäße Verfahren erstmals, virusartige Partikel aus Kapsomeren und Fusionsproteinen herzustellen, wobei die Fusionsproteine je eine überwiegend hydrophobe Aminosäu- resequenz als Wirkstoff umfassen. Bei der Assemblierung in den Hefezellen besteht nicht das Problem des Ausfallens der gebildeten Fusionsproteine. Die Ursache dafür ist vermutlich, dass die Konzentration der freien, d. h. noch nicht an die Kapsomere gebundenen, Fusionsproteine stets niedrig bleibt.
Vorteilhaft ist es, wenn die dritte Aminosäuresequenz den N- Terminus des Fusionsproteins bildet. Das ermöglicht mit besonders hoher Wahrscheinlichkeit eine richtige Faltung des Wirkstoffs, vermutlich weil die Faltung des Wirkstoffs wegen der vom N-Terminus zum C-Terminus hin erfolgenden Synthese nicht durch eine bereits erfolgte Bindung an das Kapsomer be- einflusst wird. Dadurch erfolgt eine besonders effektive Assemblierung in den Hefezellen.
Vorzugsweise wird bei der Coexpression der Proteine und der
Fusionsproteine das jeweilige Ausmaß der Expression der Proteine und der Fusionsproteine so aufeinander abgestimmt, dass eine bei dem Verfahren größtmögliche Menge der den Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikel gebildet wird. Das kann dadurch erreicht werden, dass Expressionsplasmide, welche für die Proteine und die Fusionsproteine codieren, in einer aufeinander abgestimmten Kopienzahl in die Hefezellen eingebracht werden. Es können auch Nukleinsäuresequenzen, welche für die Proteine und die Fusionsproteine codieren, in einer aufeinander abgestimmten Kopienzahl stabil ins Genom der He- fezellen integriert werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt die Expression der Proteine unter der Kontrolle eines ersten Promotors, welcher in einem für die Proteine codierenden ersten Plasmid enthalten ist, und die Expression der Fusionsproteine unter der Kontrolle eines zweiten Promotors, welcher in einem für die Fusionsproteine codierenden zweiten Plasmid enthalten ist. Dabei wird das jeweilige Ausmaß der Expression der Proteine und der Fusionsproteine durch eine geeignete Wahl des ersten und des zweiten Promotors aufeinander abgestimmt. Durch eine sinnvolle Wahl des stöchiometrischen Verhältnisses zwischen der Expression des Fusionsproteins und der ersten Aminosäuresequenz oder des Proteins kann es verhindert werden, dass das Fusionsprotein, die erste Aminosäuresequenz oder das Protein in den Hefezellen in einer überflüssigen Menge exprimiert wird. Wird eine zu große Menge der Fusions- proteine exprimiert, wird ein Teil der gebildeten Fusionspro- teine nicht in VLPs integriert. Wird eine zu große Menge der ersten Aminosäuresequenz oder des Proteins exprimiert, bilden sich VLPs, welche keinen oder wenig Wirkstoff enthalten.
Vorzugsweise sind/ist der erste und/oder der zweite Promotor aus einer Gruppe ausgewählt, bestehend aus den Promotoren der Gene von Alkohol-Dehydrogenase 1 (ADHl) , Alkohol-Dehydrogenase 2 (ADH2) , Orthophosphoric-Monoester-Phosphohydrolase (Apa- se) , Format-Dehydrogenase (FOD) , Galaktokinase (GALl) , UDP- Glucose-4-Epimerase (GALlO) , Glyceraldehyd-3 -Phosphate (GAP) , Glyceraldehyd-Phosphate-Dehydrogenase (GAPDH) , Alkohol-Oxi- dase (AOX) , Methanol-Oxidase (MOX) , no message in thiamine 1 (NMTl) , 3 -Phosphoglycerat-Kinase (PGK) und Pyruvat-Kinase (PYKl) sowie den Hybridpromotoren GAL10/PYK1 und ADH2/GAPDH. Vorzugsweise umfasst die dritte Aminosäuresequenz eine Sequenz aus mindestens einem Antigen, aus mindestens einem Epi- top dieses Antigens oder aus unterschiedlichen Epitopen die- ses Antigens. Umfasst die dritte Aminosäuresequenz unterschiedliche Epitope des Antigens handelt es sich bei dem Fusionsprotein um ein so genanntes Multiepitopkonstrukt . Bei dem Antigen kann es sich um ein Tumor-assoziiertes Antigen handeln. Unter einem Antigen ist jedes Protein oder Peptid zu verstehen, welches in einem Säugetier oder Menschen eine Immunreaktion, insbesondere die Bildung zytotoxischer T-Zellen, auslösen kann. Zur Auslösung der Immunreaktion kann es erforderlich sein, das Antigen dem Immunsystem in geeigneter Weise zu präsentieren. Unter einem Tumor-assoziierten Antigen ist ein Antigen zu verstehen, welches durch Tumorzellen in anderer Weise exprimiert wird als durch die entsprechenden nicht entarteten Zellen des gleichen Typs oder ein Antigen, welches einen spezifischen Einfluss auf das Wachstum bzw. die Vermehrung von Tumorzellen hat. Bevorzugt ist das Tumor-assoziierte Antigen aus der Gruppe ausgewählt, umfassend NY-ESO-I, TeIo- merase Reverse Transkriptase (TERT), p53, MDM2 , CYPlBl, HER- 2/neu, CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5) und das Apoptose inhibierende Protein Survivin.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung ist das Antigen ein Antigen eines Erregers einer Viruserkrankung oder Infektionskrankheit. Ein Antigen eines Erregers ist dabei ein Antigen, welches der Erreger selbst aufweist oder für welches der Erreger eine codierende Nukleotidsequenz aufweist. Bei der Viruserkrankung oder der Infektionskrankheit kann es sich um eine chronisch verlaufende Viruserkrankung oder Infektionskrankheit handeln. Das Antigen kann ausgewählt sein aus einer Gruppe umfassend: HIV-assoziiertes Antigen, HCV-assozi- iertes Antigen, Tuberkulose-assoziiertes Antigen, insbesondere Ag85A, Ag85B, Rv3407, Esat-6 und Hsp65, Malaria-assoziier- tes Antigen, insbesondere CSP-I, LSA-I, LSA-3 und EXP-I, mit einem Merozoiten-Stadium des Malariaerregers assoziiertes An- tigen, insbesondere MSP-I, und Bilharziose-assoziiertes Antigen. Das Antigen ist mit einem der Erreger assoziiert, wenn der Erreger das Antigen selbst exprimiert oder dessen Expression im befallenen Organismus auslöst.
Für die Auslösung einer Immunantwort ist es besonders vorteilhaft, wenn die dritte Aminosäuresequenz ein MHC-Klasse I- spezifisches Antigen bildet.
In einer Ausgestaltung der Erfindung weist die vom Viruspro- tein 1 des Polyomavirus (VPl) abgeleitete erste Aminosäuresequenz nicht die im VPl enthaltene DNA-bindende Domäne und/oder nicht die im VPl enthaltene Nukleare Lokalisations- sequenz (NLS) auf. Die DNA-bindende Domäne ist in der NLS enthalten oder überlappt mit der NLS. Die Funktion der NLS besteht normalerweise darin, das VPl in den Zellkern zu translozieren. Die DNA-bindende Domäne kann beliebige DNA binden. Durch das Weglassen der DNA-bindenden Domäne oder der NLS kann erreicht werden, dass wenig oder keine unerwünschte DNA aus dem Wirtsorganismus in die VLPs verpackt wird. Da- durch kann eine höhere Qualität der VLPs erreicht werden. Unerwünschte Nebenwirkungen durch DNA aus dem Wirtsorganismus werden vermieden. Die Verträglichkeit der VLPs bei Verabreichung an ein Säugetier wird verbessert.
Bei den zur Coexpression verwendeten Hefezellen handelt es sich vorzugsweise um Hefezellen der Art Saccharomyces cerevi- siae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula polyraorpha, Kluyveromyces lactis oder Kluyveromyces marxia- nus .
Die Erfindung betrifft weiterhin virusartige Partikel, ent- haltend Proteine, welche je eine von einem ersten Virusprotein abgeleitete erste Aminosäuresequenz aufweisen, und Fusionsproteine. Die erste Aminosäuresequenz ist dabei eine Aminosäuresequenz, welche für die Bildung von Kapsoid-bildenden und ein zweites Virusprotein spezifisch bindenden Kapsomeren ausreichend ist. Die Fusionsproteine weisen je eine spezifisch an j e eines der Kapsomere bindende vom zweiten Virusprotein abgeleitete zweite Aminosäuresequenz und eine einen Wirkstoff bildende überwiegend hydrophobe dritte Aminosäuresequenz auf. Derartige Partikel mit einer überwiegend hydrophoben dritten Aminosäuresequenz konnten bisher nicht hergestellt werden. Deren Herstellung gelingt jedoch, wenn die Proteine und die Fusionsproteine in Hefezellen coexpri- miert und die Partikel in den Hefezellen gebildet werden. Ein anderer Weg zu deren Herstellung ist nicht bekannt. Vorteil- hafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Partikel ergeben sich aus den vorhergehenden das erfindungsgemäße Verfahren betreffenden Ausführungen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die erfindungsgemäßen Parti- kel zur Verwendung als Medikament.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung der Virusproteine VP2 und VP3 des Polyomavirus sowie der darin enthaltenen VPl-bindenden Domäne, Fig. 2 ein Coomassie-gefärbtes SDS-Polyacrylamid-Gel, in welchem Proben aus Fraktionen 1 bis 38 eines Cäsiumchlorid-Gradienten gelelektrophore- tisch aufgetrennt worden sind,
Fig. 3 eine Western blot-Analyse mit VPl-spezifischen Antikörpern (oben) und Survivin-spezifischen Antikörpern (unten) der Fraktionen 1 bis 38 des Cäsiumchlorid-Gradienten und
Fig. 4 eine elektronenmikroskopische Aufnahme der vereinigten VPl-Peak-Fraktionen 24 bis 27 des Cäsiumchlorid-Gradienten in 100.000-facher Vergrößerung .
Beispiel 1 :
Herstellung virusartiger Partikel durch Coexpression des Virusproteins VPl des Polyomavirus und eines Fusionsproteins aus dem Virusprotein VP3 des Polyomavirus und dem Tumoranti- gen Her2/neu
Es werden drei Hefeexpressionsplasmide hergestellt .
Das Hefeexpressionsplasmid pGCH-VPl enthält den Hefe-spezifischen GALl Promotor, eine Hefe-spezifische CYCl Transkriptionsterminationsse- quenz , - ein CEN/ARS DNA-Fragment (origin of replication) , - einen HIS3 Selektionsmarker und die kodierende DNA für das Polyomavirusprotein VPl . Die extrazelluläre Domäne und die Transmembrandomäne von Her2/neu (Aminosäuren 1-683) wird mit VP3 translational fusioniert. Das Hefeexpressionsplasmid pGCL-Her2/neu (1-683) -VP3 enthält dazu - den Hefe-spezifischen GALl Promotor, eine Hefe-spezifische CYCl Transkriptionsterminationsse- quenz ,
- ein CEN/ARS DNA-Fragment (origin of replication) , einen LEU2 Selektionsmarker und - die kodierende DNA für das Fusionsprotein aus Her2/neu und VP3 , wobei Her2/neu (Aminosäuren 1-683) an den N- Terminus von VP3 (Aminosäuren 116-297, siehe Fig. 1) fusioniert wurde.
Das Hefeexpressionsplasmid pGCL-VP3-Her2/neu (1-683) enthält den Hefe-spezifischen GALl Promotor, eine Hefe-spezifische CYCl Transkriptionsterminationsse- quenz ,
- ein CEN/ARS DNA-Fragment (origin of replication) , - einen LEU2 Selektionsmarker und die kodierende DNA für das Fusionsprotein aus VP3 und Her2/neu, wobei Her2/neu (Aminosäuren 1-683) an den C- Terminus von VP3 (Aminosäuren 116-297, siehe Fig. 1) fusioniert wurde.
Zur Coexpression virusartiger Partikel werden Hefezellen des Stamms Saccharomyces cerevisiae JD53 (Ieu2, his3, trpl, Iys2 , ura3) jeweils mit dem Hefeexpressionsplasmid pGCH-VPl sowie dem Hefeexpressionsplasmid pGCL-Her2/neu (1-683) -VP3 oder dem Hefeexpressionsplasmid pGCL-VP3-Her2/neu (1-683) nach der Methode von Schiestl, R. H. und Gietz, R. D. (1989) Current Ge- netics, Band 16, Seiten 339 bis 346, transformiert. Die mit beiden Plasmiden transformierten Hefezellen werden auf Agar- platten mit synthetischem SD-Medium (6,7 g/l YNB (Becton Dik- kinson GmbH, Heidelberg, Deutschland) , 200 mg/1 Lysin, 200 mg/1 Tryptophan, 200 mg/1 Uracil, 2 % Glukose) bei 300C kultiviert. Für die Herstellung und Reinigung virusartiger Par- tikel wird die Anzucht der transformierten Hefen in 1000 ml SD-Medium durchgeführt. Die Kulturen werden bis zu einer optischen Dichte (OD600) von 4-8 kultiviert. Zur Induktion der GALl Promotoren werden die Hefezellen anschließend bei 1.000 x g für 2 Minuten abzentrifugiert und die Zellpellets mit SG- Medium (6,7 g/l YNB (Becton Dickinson GmbH, Heidelberg,
Deutschland) , 200 mg/1 Lysin, 200 mg/1 Tryptophan, 200 mg/1 Uracil, 2 % Galaktose) auf eine OD6oo von 2 eingestellt und für 24 Stunden weiter bei 3O0C kultiviert.
Anschließend werden die Hefen für 10 Minuten bei 1.000 x g zentrifugiert und das Hefepellet in 2,5 ml Zellaufschluss- Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1 Λ° Triton X-100, 1 mM PMSF) pro Gramm Frischgewicht der Hefen aufgenommen. Der ZellaufSchluss wird mittels eines BeadBea- ters (Biospec Products, Inc., Bartlesville, OK 74005, USA) unter Verwendung von Glasperlen von 0 , 5 mm Durchmesser durchgeführt. Dazu wird die Zellsuspension unter ständiger Kühlung 15-mal in Intervallen von 15 Sekunden mit dem BeadBeater behandelt. Anschließend werden unlösliche Rückstände durch 20 minütige Zentrifugation bei 10.000 x g abgetrennt. Zur weiteren Reinigung der virusartigen Partikel werden je 6 ml des Überstands vorsichtig auf 32 ml eines Saccharose-Kissens (45 % Saccarose, in Zellaufschluss-Puffer) geschichtet und für 4 Stunden bei 40C und 100.000 x g zentrifugiert. Die dabei ge- bildeten Pellets enthalten die virusartigen Partikel. Die
Pellets werden in Zellaufschluss-Puffer (ohne PMSF) aufgenommen und unlösliches Material wird durch 10-minütige Zentrifugation bei 5.000 x g entfernt. Der Überstand wird auf einen Cäsiumchlorid-Stufengradienten aufgetragen. Der Cäsiumchlorid-Stufengradient wird aus 4 ml Fraktionen ansteigender Dichte (1,23 g/cm3, 1,26 g/cm3, 1,29 g/cm3, 1,32 g/cm3, 1,35 g/cm3, 1,38 g/cm3 in 20 mM Tris-HCl, pH 7,6) aufgeschichtet. Eine anschließende Zentrifugation erfolgt für 36 Stunden bei 100.000 x g und 4°C. 1 ml-Fraktionen des Gradienten werden anschließend mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western blot analysiert. Gereinigte virusartige Partikel VPl/VP3-Her2/neu (1-683) bzw. VPl/Her2/neu (1-683) -VP3 werden durch Negativkontrastierung mit 1 % Uranylacetat im Elektronenmikroskop nachgewiesen.
Beispiel 2 :
Herstellung virusartiger Partikel durch Coexpression des Virusproteins VPl des Polyomavirus und eines Fusionsproteins aus dem Virusprotein VP2 des Polyomavirus und dem murinen Tu- morantigen mSurvivin
Das Virusprotein VP2 des Polyomavirus ist aus Abbing, A. et al . , 2004, Journal of Biological Chemistry, Band 279, Seiten 27410 bis 27421 bekannt.
Es werden zwei Hefeexpressionsplasmide hergestellt. Das Hefe- expressionsplasmid pGCH-VPl ist bereits in Beispiel 1 beschrieben.
mSurvivin wurde an den N-Terminus von VP2 fusioniert. Das He- feexpressionsplasmid pmSurv-VP2 enthält - einen Hefe-spezifischen MET25 Promotor, die kodierende
DNA für das Fusionsprotein aus mSurvivin (Aminosäuren 1- 140) und VP2 (Aminosäuren 252-297, siehe Fig. 1), ge- folgt von einer Hefe-spezifischen PGK Transkriptionster- minationssequenz , einen Hefe-spezifischen ADHl Promotor, die kodierende DNA für das Fusionsprotein aus mSurvivin (Aminosäuren 1- 140) und VP2 (Aminosäuren 252-297, siehe Fig. 1), gefolgt von einer Hefe-spezifischen ADHl Transkription- sterminationssequenz , ein 2μ (2 micron) DNA-Fragment des Hefe 2μ Plasmids (origin of replication) und - einen TRPl Selektionsmarker .
Zur Coexpression virsusartiger Partikel werden Hefezellen des Stamms Saccharomyces cerevisiae JD53 (Ieu2, his3, trpl, Iys2 , ura3) mit den beiden Hefeexpressionsplasmiden nach der Metho- de von Schiestl, R. H. und Gietz, R. D. (1989) Current Gene- tics, Band 16, Seiten 339 bis 346, transformiert.
Die Kultivierung der mit beiden Plasmiden transformierten He- fezellen erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben. Anschließend werden die Hefen für 10 Minuten bei 1.000 x g zentrifugiert und das Hefepellet in 0,5 ml Zellaufschluss-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01 % Triton X- 100, 1 mM PMSF) pro Gramm Frischgewicht der Hefen aufgenommen. Der ZellaufSchluss wird mittels einer hydraulischen Presse nach dem Prinzip der „French Press" (One Shot, Con- stant Cell Disruption Systems Ltd., Northants, NNIl 4SD, Großbritannien) in drei Zyklen bei 2000 bar durchgeführt. Die weitere Aufarbeitung der aufgeschlossenen Zellen zur Reinigung der darin exprimierten VLPs erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben.
Fig. 2 zeigt eine Coomassie-Färbung eines SDS-Polyacrylamid- GeIs, auf welchem je eine Probe der Fraktionen 1 bis 38 des Cäsiumchlorid-Gradienten gelelektrophoretisch aufgetrennt worden ist. Auf den mit M bezeichneten Spuren sind jeweils Molekulargewichtsmarker aufgetrennt worden. Auf der mit P bezeichneten Spur ist gereinigtes VPl als positive Kontrolle aufgetragen worden. In den Fraktionen 24 bis 27 ist gereinigtes VPl zu erkennen.
Fig. 3 zeigt eine Western blot-Analyse der Fraktionen 1 bis 38 des Cäsiumchlorid-Gradienten. In der oberen Abbildung ist eine mit VPl-spezifischen Antikörpern durchgeführte Western blot-Analyse und in der unteren Abbildung eine mit Survivin- spezifischen Antikörpern durchgeführte Western blot-Analyse gezeigt. In den Fraktionen 18 bis 27 ist sowohl VPl als auch Survivin-VP2 -Fusionsprotein zu erkennen.
Gereinigte virusartige Partikel VPl/mSurvivin-VP2 werden durch Negativkontrastierung mit 1 % Uranylacetat im Elektronenmikroskop nachgewiesen. Fig. 4 (100.000 x vergrößert) zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme der in den ver- einigten Fraktionen 24 bis 27 des Cäsiumchlorid-Gradienten enthaltenen VLPS.
Beispiel 3 :
Alternativ zu der in den Beispielen 1 und 2 beschriebenen Reinigung der VLPs mittels Ultrazentrifugation werden die VLPs nach der Kultivierung der Hefen mit klassischen biochemischen Methoden gereinigt. Dazu werden die Zellpellets in Puffer QSA (20 mM Ethanolamin, 2 mM EDTA, 6 mM DTT, 50 mM NaCl, 5 % Glyzerin, pH 9,0; 10 ml Puffer pro Gramm Zellpellet + Proteaseinhibitor + Benzonase, Endkonzentration 1 U/ml) re- suspendiert . Der ZellaufSchluss erfolgt mit einer French- Press (3 Zyklen bei 2000 bar) . Anschließend werden durch Zen- trifugation bei 75.000 x g für 45 min und 4°C Zelltrümmer entfernt. Der pH Wert des Überstands wird durch Zugabe von 0,1 M NaOH auf 9,0 eingestellt. Die erste Reinigung erfolgt über Kationen-Austauschchromatographie (POROS (R) 50 HS, Applied Biosystems, Foster City, CA 94404, USA) mit einem Gradienten auf 100 % Puffer QSB (20 πiM Ethanolamin, 2 inM EDTA, 6 TtiM DTT, 1 M NaCl, 5 % Glyzerin, pH 9,0) über 10 Säulenvolumen. Fraktionen mit hoher VPl-Konzentration werden vereinigt und die Leitfähigkeit auf 9 ms/cm durch Zugabe von Puffer QSA eingestellt. Im Anschluss erfolgt eine Reinigung über Anionen-Austauschchromatographie (Q Sepharose (R) , GE Healthcare, 80807 München, Deutschland) mit einem Gradienten auf 60 % Puffer QSB über 8 Säulenvolumen. Erneut werden Fraktionen mit hoher VPl-Konzentration vereinigt. Zuletzt erfolgt eine Umpufferung und weitere Reinigung durch Gelfiltration (Superdex(R) 200, GE Healthcare) in PBS Puffer. Fraktionen mit gereinigten virusartigen Partikeln werden durch Negativ- kontrastierung mit 1 % Uranylacetat im Elektronenmikroskop nachgewiesen .

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von einen Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikeln, wobei Proteine, welche je eine von einem ersten Virusprotein abgeleitete erste Aminosäuresequenz aufweisen, und Fusionsproteine zu den virusartigen Partikeln assemblieren, wobei die erste Aminosäuresequenz eine Aminosäuresequenz ist, welche für die Bildung von Kapsoid- bildenden und ein zweites Virusprotein spezifisch bindenden Kapsomeren ausreichend ist, wobei die Fusionsproteine je eine spezifisch an je eines der Kapsomere bindende vom zweiten Virusprotein abgeleitete zweite Aminosäuresequenz und eine den Wirkstoff bildende dritte Aminosäuresequenz aufweisen, wobei die Proteine und die Fusionsproteine in Hefezellen coexpri- miert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Virusprotein und/oder das zweite Virusprotein aus einem Virus stammt/stammen oder gewonnen werden kann/können, wobei das Virus ausge- wählt ist aus der Gruppe der nicht mit einer Hülle versehenen (non-enveloped) Viren, umfassend Papovaviridae, insbesondere Polyoma- und Papillomaviren, Iridoviridae, Adenoviridae, Par- voviridae, Picornaviridae, insbesondere Polioviren, Calicivi- ridae, Reoviridae und Birnaviridae .
3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das erste Virusprotein das Virusprotein 1 des Polyomavirus
(VPl) und das zweite Virusprotein das Virusprotein 2 (VP2) oder das Virusprotein 3 (VP3) des Polyomavirus ist.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kapsomere in Form von Pentameren, Hexameren oder Heptame- ren vorliegen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dritte Aminosäuresequenz, zumindest überwiegend, hydrophob ist .
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dritte Aminosäuresequenz den N-Terminus des Fusionsproteins bildet.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei bei der Coexpression der Proteine und der Fusionsproteine das jeweilige Ausmaß der Expression der Proteine und der Fusionsproteine so aufeinander abgestimmt wird, dass eine bei dem Verfahren größtmögliche Menge der den Wirkstoff enthaltenden virusartigen Partikel gebildet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Expression der Proteine unter der Kontrolle eines ersten Promotors, welcher in einem für die Proteine codierenden ersten Plasmid enthalten ist, und die Expression der Fusionsproteine unter der Kontrolle eines zweiten Promotors, welcher in einem für die Fusionsproteine codierenden zweiten Plasmid enthalten ist, erfolgt und wobei das jeweilige Ausmaß der Expression der Proteine und der Fusionsproteine durch eine geeignete Wahl des ersten und des zweiten Promotors aufeinander abgestimmt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der erste und/oder der zweite Promotor ausgewählt sind/ist aus einer Gruppe, bestehend aus den Promotoren der Gene von Alkohol-Dehydrogenase 1 (ADHl) , Alkohol-Dehydrogenase 2 (ADH2) , Orthophosphoric-
Monoester-Phosphohydrolase (Apase) , Format-Dehydrogenase (FOD) , Galaktokinase (GALl) , UDP-Glucose-4-Epimerase (GALlO) , Glyceraldehyd-3 -Phosphate (GAP) , Glyceraldehyd-Phosphate- Dehydrogenase (GAPDH) , Alkohol-Oxidase (AOX) , Methanol- Oxidase (MOX) , no message in thiamine 1 (NMTl) , 3- Phosphoglycerat-Kinase (PGK) und Pyruvat-Kinase (PYKl) sowie den Hybridpromotoren GAL10/PYK1 und ADH2/GAPDH.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dritte Aminosäuresequenz eine Sequenz aus mindestens einem Antigen, insbesondere einem Tumor-assoziierten Antigen, aus mindestens einem Epitop dieses Antigens oder aus unter- schiedlichen Epitopen dieses Antigens umfasst.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Tumor-assoziierte Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend NY-ESO-I, Te- lomerase Reverse Transkriptase (TERT), p53, MDM2 , CYPlBl, HER-2/neu, CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell ad- hesion molecule 5) und das Apoptose inhibierende Protein Sur- vivin.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Antigen ein Antigen eines Erregers einer, insbesondere chronischen, Viruserkrankung oder Infektionskrankheit ist.
13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Antigen ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend HIV-assoziertes Antigen, HCV- assoziertes Antigen, Tuberkulose-assoziertes Antigen, insbesondere Ag85A, Ag85B, Rv3407, Esat-6 und Hsp65, Malariaassoziiertes Antigen, insbesondere CSP-I, LSA-I, LSA-3 und EXP-I, mit einem Merozoiten-Stadium des Malariaerregers assoziiertes Antigen, insbesondere MSP-I, und Bilharziose- assoziiertes Antigen.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dritte Aminosäuresequenz ein MHC-Klasse I-spezifisches Antigen bildet .
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 14, wobei die vom Virusprotein 1 des Polyomavirus (VPl) abgeleitete erste Aminosäuresequenz nicht die im VPl enthaltene DNA-bindende Domäne und/oder nicht die im VPl enthaltene Nukleare Lokali- sationssequenz (NLS) aufweist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hefezellen Hefezellen der Art Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Hansenula poly- morpha, Kluyveromyces lactis oder Kluyveromyces marxianus sind.
17. Virusartige Partikel, enthaltend Proteine, welche je eine von einem ersten Virusprotein abgeleitete erste Aminosäuresequenz aufweisen, und Fusionsproteine, wobei die erste Ami- nosäuresequenz eine Aminosäuresequenz ist, welche für die
Bildung von Kapsoid-bildenden und ein zweites Virusprotein spezifisch bindenden Kapsomeren ausreichend ist, wobei die Fusionsproteine je eine spezifisch an je eines der Kapsomere bindende vom zweiten Virusprotein abgeleitete zweite Ami- nosäuresequenz und eine einen Wirkstoff bildende überwiegend hydrophobe dritte Aminosäuresequenz aufweisen.
18. Partikel nach Anspruch 17, wobei das erste Virusprotein und/oder das zweite Virusprotein aus einem Virus stammt/stammen oder gewonnen werden kann/können, das ausgewählt ist aus der Gruppe der nicht mit einer Hülle versehenen (non-enveloped) Viren, umfassend Papovaviridae, insbesondere Polyoma- und Papillomaviren, Iridoviridae, Adenoviridae, Par- voviridae, Picornaviridae, insbesondere Polioviren, Calicivi- ridae, Reoviridae und Birnaviridae.
19. Partikel nach einem der Ansprüche 17 oder 18, wobei das erste Virusprotein das Virusprotein 1 des Polyomavirus (VPl) und das zweite Virusprotein das Virusprotein 2 (VP2) oder das Virusprotein 3 (VP3) des Polyomavirus ist.
20. Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Kapsomere in Form von Pentameren, Hexameren oder Heptameren vorliegen.
21. Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei die dritte Aminosäuresequenz den N-Terminus des Fusionsproteins bildet.
22. Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei die dritte Aminosäuresequenz eine Sequenz aus mindestens einem Antigen, insbesondere einem Tumor-assoziierten Antigen, aus mindestens einem Epitop dieses Antigens oder aus unterschiedlichen Epitopen dieses Antigens umfasst.
23. Partikel nach Anspruch 22, wobei das Tumor-assoziierte Antigen ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend NY-ESO-I, Te- lomerase Reverse Transkriptase (TERT) , p53, MDM2, CYPlBl,
HER-2/neu, CEACAM (Carcinoembryonic antigen-related cell ad- hesion molecule 5) und das Apoptose inhibierende Protein Sur- vivin.
24. Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 22, wobei das
Antigen ein Antigen eines Erregers einer, insbesondere chronischen, Viruserkrankung oder Infektionskrankheit ist.
25. Partikel nach Anspruch 24, wobei das Antigen ausgewählt ist aus einer Gruppe umfassend HIV-assoziertes Antigen, HCV- assoziertes Antigen, Tuberkulose-assoziertes Antigen, insbesondere Ag85A, Ag85B, Rv3407, Esat-6 und Hsp65, Malaria- assoziiertes Antigen, insbesondere CSP-I, LSA-I, LSA-3 und EXP-I, mit einem Merozoiten-Stadium des Malariaerregers assoziiertes Antigen, insbesondere MSP-I, und Bilharziose- assoziiertes Antigen.
26. Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei die dritte Aminosäuresequenz ein MHC-Klasse I-spezifisches Antigen bildet .
27. Partikel nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei die vom Virusprotein 1 des Polyomavirus des abgeleitete erste
Aminosäureseguenz nicht die im Virusprotein 1 enthaltene DNA- bindende Domäne und/oder nicht die im Virusprotein 1 enthaltene Nukleare Lokalisationssequenz (NLS) aufweist.
28. Partikel nach einem der Ansprüche 17 bis 27 zur Verwendung als Medikament .
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