WO2000039329A1

WO2000039329A1 - Procede de comptage de micro-organismes et dispositif permettant d'effectuer ledit comptage

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Publication number: WO2000039329A1
Application number: PCT/JP1999/007417
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Takahashi
Original assignee: Sapporo Breweries Ltd.
Priority date: 1998-12-28
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2000-07-06
Also published as: US6385272B1; CA2322072A1; EP1067199A4; EP1067199A1; JP4448251B2

Description

明細書微生物計数方法及びそれを達成するための装置技術分野

本発明は、 AT P—ルシフェラ一ゼ法を利用した微生物迅速検查法に係り、特に微生物の存在を現す発光現象の映像から電気的に正確に菌数又は菌のコロニーの数を力ゥントできるようにした微生物迅速検査法及びこれを達成するための装置に関する。背景技術

微生物の存在を確認する方法として、 AT P—ルシフェラ一ゼ法がある。この A T P—ルシフェラ一ゼ法は、生きた細胞に特異的にまとまつて存在するアデノシン三リン酸（AT P) を利用してルシフヱリンールシフェラ一ゼ反応（R— R 反応）を行わしめ、 AT P含量に比例して発生する微妙な発光を高感度検出器で検出することにより、微生物の存在を確認する方法であり、微生物の迅速検査法として注目されている。

この微生物の検査法を行う方法及び装置として、例えば、特開平 6— 2 3 7 7 9 3号に示されているものがる。ここでは、先ず、検体液を濾過して生菌をフィル夕一上に補足し、このフィル夕一を微生物発光画像解析システムを用いて検出する。この微生物発光画像解析システムは、生菌を捕捉したフィル夕一を抽出試薬及び発光試薬で処理した後、標本ホルダ一にセットし、光学系及び撮像手段 ( C C D等）で構成されたテレビカメラを上記フィルターにできるだけ近接させてセッティングし、フィル夕一の発光状態を撮影し、画像処理装置、データ解析装置を介して画像データをディスプレイで表示、観察したり、解析結果をプリントァゥトする。

図 1は、そのシステムの概要を示し、 1はテーパーファイバー、光増幅部及び撮像管からなる高感度テレビカメラ、カメラコントローラ 2、イメージプロセッサ 3、データ解析装置 4、テレビモニタ一 5から構成されている。測定は、発光処理した生菌を保持したフィル夕一 6を高感度テレビ力メラ 1に接近させておき、カメラコントローラ 2及びィメ―ジプロセッサ 3を用レ、て 2次元的の光子を所定時間、例えば、 3 0〜1 8 0秒間蓄積し、菌体からの発光を撮像し、デ一夕解析装置 4により発光ノィズを消去して生菌による強レ、発光のみを残してテレビモニター 5に表示する。この処理によって菌体由来以外の発光がノイズとして消去され、測定された輝点数は生菌の数又はコロニーの数となる。その発光状態を現す映像であり、培地上で R— R反応をおこさせ、微生物の存在する位置が周囲に対して明るく発光しており、これらの輝点の数が微生物の数に相当する。

このように、微生物の存在と数を画像解析を用レ、て自動的に検出する装置は既に存在している。しかしながら、これまでの検出装置においても不具合は存在していた。図 2はフィルターの A T Pの発光状態を撮影した映像を示す。検出装置が強い光を認識した場合は、高いピークとなって現れ、モニター上ではピークの高さ応じた疑似カラーの点として表示される。

輝点は、図 2の上部のウィンドウ（白い四角）内の輝点のように白い輝点となって表示される。また、図 2の下方は輝点を 3次元的に現したものである。 3 次元の画像において、界面のように波打っている部分が画像データのバックグラゥンド（B K G) となる青い点の集合を示し、広い輝点は中央の高いピークの束となって表示される。これらのピークは全て数値化されており、必要な座標のピーク強度がデ一夕として記憶される。画像デ一夕の低レ、レベルで揺らレ、でいるピーク強度を平均化し、この値を基準にしてある値（閾値）以上の高さと面積を持つピークを認識した場合に輝点 1つとしてカウントする。

画像に表示された点が AT Pによる輝点か B K Gかを区別するために、輝点と B K Gを区別するための閾値は、検出する菌の種類や B K Gの高さにより設定される。

上述のように、閾値を設定してカウントする従来の検出装置は、輝点を弁別するという点では有効であったが、目視で数えた輝点数と差がでてくる場合があつた。これは、従来のカウントの方法が、ピークの高さと面積だけを基準としてなされており、これだけでは、種々の形状や大きさを有する輝点を正確にカウントすることはできなかった。その原因のひとつして以下の 2つのことが考えられる。 ( 1 ) 一つの輝点の中のピークに山と谷が存在する場合があり、これが実際の数と異なるカウントをする原因となることがある。

一つの輝点は、必ずしも一本のピークからなるものではない。 AT Pの抽出具合や、微生物単独あるいはコロニーへの発光試薬のかかり方により、いびつな形で光る場合があり、 3次元解析をするとピークに肩があったり、幾つかのピークが重なり合っている場合がある。この場合、実質的には輝点であっても、ピ一クに山と谷がある場合は山の数をそれぞれ輝点の数として認識してしまい、目視で数える輝点数との間にずれが生じる。図 3はモニターテレビ上に映し出されたオリジナル画像 (A) と改良前のカウゥント法によるカウント結果 ( B) を示す。オリジナル画像の最上部にある輝点は目視では 1つとカウントされるカ改良前の検出装置においては、この輝点を 4つの輝点と判定している。さらに上部より 2番目の輝点についても、従来のカウント法によれば 2つに判定し、全体として 1 0の輝点をカウントしている。これは、最上部の輝点が図 3 ( B) の部分拡大図に模式的に示すような形状をしており、これを電気的にカウントするとき、各 4つの突出部 a， b， c , dを夫々 1の輝点として数えてしまった結果によるものである。（2 ) 輝度の強い輝点が発生した場合は、拡散した光が輝点の周囲にノくックグラウンドのピークを大きく揺らがせるため、微生物由来の AT Pが存在しない部分に輝点と認識させるピークが発生する場合がある。

図 4に示した画像デ一夕は大きな輝点の画像データであり、輝度が強いため輝点を中心にした光力拡散しているように表示される。そして、この拡散光が強い部分が生じ（輝点の左下の十字状の輝点）、この部分を輝点として認識されている。その他、強い拡散光の存在のため、図 4の例では、本来 1個と計数されるべきものが、 3個と計数されている。

本発明は、上記問題に鑑みなされたものであり、映像信号をもとに電気的に輝点の数をカウントするにあたり、 AT Pの輝点の形状に基づく上記カウント誤差と、大きい輝度に基づくカウント誤差をなくすことのできる菌数の計数方法を提供することを目的とするものである。発明の開示本願発明の一つの態様は、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する方法にぉレ、て、撮像装置で得た画像の輝度データを 2次元のマトリックス状画素に対応させたメモリに読み取る段階と、

得られた輝度デ一夕をバックグラウンド値に基づレ、て補正する段階と、補正された各メモリの輝度データを設定した閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否かを判定する段階と、

前記閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、

前記閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する所定範囲に所定以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数する段階

とカヽらなる。

また、本願発明の他の態様は、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する装置のにぉレ、て、撮像装置で得た画像の輝度デ一夕を 2次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る手段と、

得られた輝度デ一夕をバックグラウンド値に基づレ、て補正する手段と、補正された各メモリの輝度データを設定した閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つカヽ否カヽを判定する手段と、

所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する手段と、

前記所定以上の輝度を持つ輝点の隣接する所定範囲に所定以上の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数する手段

とを有する。

上記発明の態様によれば、微生物から発生する蛍光の輝点を画像解析により電気的に計数するに際し、本来、 1個の微生物から発生している輝点をその不規則な形状によって 2あるいはそれ以上の微生物に由来する蛍光と誤って判断して輝点の計数することを避けることができ、正確な計数を行うことができる。

また、本願発明の他の態様においては、 ^の輝点中の中にピークの山と谷が複数存在する場合、複数のピークを複数の輝点として計数することを避けるため、一つの輝点の隣接する周囲の所定範囲内に存在する輝点は、それぞれを独立した輝点として計数することはせず、それらの集合を一つとして計数処理を行うようにしている。

また、輝度の大きい輝点が存在する場合に、その光が周りに拡散して輝点として認識されることを避けるため、輝度の大きい輝点の周りの所定範囲に現れる輝点は、輝度の大きレ、輝点とともにその集合を一つと計数するように処理する。本願発明のさらに他の態様においては、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する方法にぉレ、て、撮像装置で得た画像の輝度デー夕を 2次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る段階と、

得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する段階と、補正された各メモリの輝度データを設定した第 1の閾値及び第 1の閾値よりも大きい第 2の閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する段階と、

所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、を有し、

前記第 1の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第 1の所定範囲の画素に第 1 の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数し、

前記第 2の閾値以上の輝度を持つ輝点の第 2の所定範囲の画素に前記第 1の闞値以上で前記第 2の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否力、を判定し、存在している場合には該輝点の集合を 1個の輝点として計数することを特徴とする。また、本願発明の他の態様においては、試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物の存在数を計数する装置におレ、て、撮像装置で得た画像の輝度デ一夕を 2次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る手段と、

得られた輝度デ一夕をバックグラウンド値に基づいて補正する手段と、補正された各メモリの輝度デー夕を設定した第 1の閾値及び第 1の閾値よりも大きい第 2の閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する手段と、

所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する手段を有し、

前記第 1の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第 1の所定範囲の画素に第 1 の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在してし、る場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数し、

前記第 2の閾値以上の輝度を持つ輝点の第 2の所定範囲の画素に前記第 1の閾値以上で前記第 2の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否カヽを判定し、存在している場合には該輝点の集合を 1個の輝点として計数するようにしたことを特徴とする。

上記本願は発明の態様によれば、微生物から発生しり蛍光の輝点を画像解析により電気的に計数するに際し、本来、 1個の微生物から発生している輝点をその不規則な形状によって 2あるいはそれ以上の微生物に由来する蛍光と誤って判断して輝点の計数することを避けることができ、また、輝度の大きい輝点が発生した場合、それによる拡散光を独立した輝点と計数することを避けることができる。図面の簡単な説明

図 1は、微生物計数装置のシステムの概要を示す図である。

図 2は、撮像装置で得られる輝点および輝点の 3次元画像を示す図である。図 3は、モニターテレビ画面上の輝点の画像を示す図である。（A) はオリジナル画像を、（B ) は電気的に計数処理した結果を示す画像である。

図 4は、輝度の大きい輝点とその周囲に発生した拡散光を示すモニタ一テレビ画面を示す図である。

図 5は、本発明の第 1の実施例による画像解析装置が行う計数の処理のフローチャートである。

図 6は、各画素に対応するメモリのデ一夕を示す図である。

図 7は、本発明の第 1の実施例の計数法により計数した結果をテレビモニタ一上に映した;!犬態を示す図である。

図 8は、本発明の第 2の実施例による画像解析装置カ行う計数の処理のフローチヤ一トである。図 9は、各画素に対応するメモリのデ一夕を示す図である。（A) は、映像の画素に対応したメモリの輝度値データを示す。 ( B) は、 2つの闘値で 2値かして得たデータをまとめたものである。（C) は、輝点を計数した結果を示す。図 1 0は、本発明の第 2の実施例の計数法により計数した結果をテレビモニ夕一上に映した状態を示す図である。

図 1 1は、本発明の第 3の実施例の処理を示すフローチャートである。

次に、本発明の実施の形態について図面と共に説明する。

先ず、図 5〜図 7により本発明の第 1の実施例について説明する。

本実施例においては図 1に示した生菌測定装置を使用して生菌又はそのコロニーの数を計数するカヾ、画像取得後の輝点の計数方法に改良を加えたものであり、以下、図 5〜図 7に基づいて説明する。

図 5は、本実施例における画像読み取り後のデータ解析装置 4カヾ行う輝点の計数処理のための処理フローを示す。先ず、発光処理された生菌を高感度テレビ力メラで画像として読み取る（ステップ S 1 0 )。読み取られた画像は光の強度分布を表す輝度値の画像データとして画像メモリに元画素デ一夕として書き込まれる（S 1 2 )。この画像メモリは、、マトリックス状のアドレスを有するメモリを有し、座標位置と試料のフィルター面の位置とが対応するようにしてある。次に、測定された元画素デ一夕をもとに、ノクグラウンドによる輝度値の補正を行う（S 1 4 ) 。この輝度値の補正は、各アドレスの輝度値に対し、フィルタリングマトリックスの範囲（例えば、特定ァドレスを中心とする 3 X 3のマトリックス）で切り出し、切り出した範囲の輝度値に対して加算平均を計算し、各了ドレスに対応するバックグランド画像値として各ァドレスに書き込む。これにより各アドレス毎に対応するバックグラウンド値力書き込まれる。次いで、各ァドレスに読み込まれた元画像データから各ァドレスに対応するバックグランド値を減算する。これによつて、各アドレスの輝度補正されたデータが書き込まれる。図 6 (A) は、各メモリに書き込まれた補正後の輝度値の例を示している。次に補正された輝度値のデータを所定の閾値により 2値化していく（S 1 6 )。図 6の例では、閾値を 5とし、輝度値が 5以上のものを 1とし、 5未満のものを 0として 2値化した例である。図 6 ( B) は（A) のデ一夕を 2値化して結果を示している。 2値化した結果、 1であるものは、所定レベル以上の輝度を有するものであり、生菌由来の発光に基づくものである。

本実施例においては、 2値化された結果の 1のものを全て生菌又はそのコロ二一（以下、総称して「生菌」という） 1個に対応させて計数することはせず、さらに、発光形態を調査して生菌の数の計数を行う。

2値化されたデータマトリックスにもとづきは、次に、各ァドレスについて順次、 1か 0かの判定を行う（S 1 7 )。そして、該当アドレスの値が 1のものであれば、次に、その該当アドレスの隣接する周囲に 1の値を持つアドレスが存在するかどうかを判断する（S 1 8 ) 。なお、ここで、 1でなければ、即ち、 0であれば、輝点でないと判断する（S 1 9 )。ステップ 1 8において、隣接する周囲に 1が存在している場合には、その画素の集合を 1個と判断し、それらの集合に計数番号を順次付していく。図 6 ( B) の 2値化デ一夕を例にとれば、ァドレス（2 , B) , ( 2 , C)及び（3 , B) は互いに隣接している輝点である。したがって、ステップ 2 0において、アドレス（B, 2 ) の輝点を判断した時点で、アドレス（B, 2 ) , ( C, 2 ) 及び（B, 2 ) のアドレスに計数番号 1を付与する。次に、（2 , E) のアドレスにおいては、輝点を示す 2値化データが存在し、周囲に 1を持つァドレスは存在しないから、この場合は、 1個の輝点と判断し（S 2 2 ) 計数番号 2を付与する。このようにして、以下、計数番号が付与されていないアドレスを順次判定し、すべてのアドレスのついて判定を行い、最終的に、計数番号の最大の値が、生菌による輝点の数となる（S 2 2 )。全てのァドレスの判定力終了したことを確認し（S 2 6 ) 、計数処理を終了する。

以上のように、マトリックス状のメモリに得られた 2値化デ一夕のうち、輝点を表すデータが隣接するものは、それらの集合を 1つの輝点として計数することにより、実際の生菌の数と合致する計数を行うことがでできる。すなわち、生菌 1個に由来する輝点であるにもかかわらず、前述の図 3に示した例のように、 4 個と計数するようなことを回避することができる。

図 7は、本発明による計数の処理方法により画像解析装置が行った計数結果を示し、図 3 (A) のオリジナル画像力示すとおり 6個の生菌の数と一致する、計数値を表示しており、画像解析に基づく電気的な自動計数によっても正確な計数力可能となることを示している。

次に、本発明の第 2の実施例について、図 8〜図 1 0に基づいて説明する。本実施例においては図 1に示した生菌測定装置を使用して生菌の数を計数するカ画像取得後の輝点の計数方法に改良を加えたものである。

図 8は、本実施例における画像読み取り後のデータ解析装置 4カ行う輝点の計数処理のための処理フローを示す。先ず、発光処理された生菌を高感度テレビ力メラで画像として読み取る（ステップ S 1 0 0 )。読み取られた画像は光の強度分布を表す輝度値の画像データとして画像メモリに元画素データとして書き込まれる（S 1 0 2 ) 。この画像メモリは、、マトリックス状のアドレスを有するメモリを有し、座標位置と試料のフィルタ一面の位置と力対応するようにしてある。次に、測定された元画素データをもとに、ノくックグラウンドによる輝度値の補正を行う（S 1 0 4 )。この輝度値の補正は、各アドレスの輝度値に対し、フィル夕リングマトリックスの範囲（例えば、特定ァドレスを中とする 3 X 3のマトリックス）で切り出し、切り出した範囲の輝度値に対して加算平均を計算し、各ァドレスに対応するバックグランド画像値として各ァドレスに書き込む。これにより各アドレス毎に対応するバックグラウンド値が書き込まれる。次いで、各ァドレスに読み込まれた元画像デ一タカ、ら各ァドレスに対応するバックグランド値を減算する。これによつて、各アドレスの輝度補正されたデータが書き込まれる。図 9 (A) は、各メモリに書き込まれた補正後の輝度値の例を示している。次に補正された輝度値のデータを所定の閾値により 2値化していく（S 1 0 6 ) 。本実施例では、輝度値 (L) を 2値化を 2つの閾値 L 1 , L 2 (L 2 > L 1 ) を設定し、 L≥L 2にあるもの（A) と L 2 > L≥L 1のもの（B) を夫々判別して画像に対応させてマトリックス状のメモリに書き込むようにしている。図 9 ( B) は、 2段階で 2値化した結果をまとめて書き込んだものである。この例では L 2 = 8、 L 1 = 5と設定している。 L I = 5は、輝度値が 5以上のものを生菌よりの発光と識別するものであり、 L 2 = 8は、そのうちでも特に輝度の大きレ、輝点を識別するための閾値である。

本実施例においては、 2値化して得た所定レベルの輝度値のものを全て生菌 1 個に対応させて計数することはせず、さらに、発光形態と、発光の強さを識別してこれを考慮して生菌の数の計数を行う。

先ず、作成されたデータマトリックスにもとづき、輝点と判定されたものうち、輝度がレベル L 2より大であるかを判断する（S 1 08)。そして、 Aと判定されたものについては、さらに、その周囲に輝度 B以上のものがあるかどうかを判断する（S 1 1 0)。輝度 B以上のの輝点が存在すれば、それは、もとの輝点と同じ生菌由来の蛍光であると判断し 1つ集合として 1と計数する（S 1 1 2)。

図 9 (B) に示した例では、座標（E, 6) と（E， 7) に対応する輝点は、 1つの集合のものとして計数される。ステップ 1 1 0において、周囲に輝度 Aが存在しない場合は 1個をカウントする（S I 1 4)。

ステップ 1 08において、輝度 Aではない場合は、輝度 Bの輝点かどうかが判断される（S 1 1 6)。輝度 Bであると判断されると、次にその画素を中心として、周囲に輝度 Bの輝点が存在しているかどうかが判断される（S 1 1 8) 。そして、輝点 Bが隣接して存在していれば、その輝点は、中心の輝点と同じ生菌由来の蛍光と判断し、それらの集合を 1と計数する（S 1 22)。

ステップ 1 1 8において、周囲の範囲内にない場合は、さらに、その画素を中心に周囲に輝度 Aの輝点力存在しているかどうかが確認される（S 1 20)。そして、存在していれば、その輝点は輝度 Aの輝点の拡散光により発生したものであると判断し、カウントしない（S 1 24)。なおステップ 30において、輝点 Bが存在し、その周囲 5画素の範囲に輝度 Aが存在しなければ、 1をカウントする（S 1 26) 。なお、ステップ 1 1 8において周囲 3画素内に輝度 Bがあれば、輝度 Bの輝点の集合として 1個と判断する。

以上の処理でカウントされた輝点あるいはその集合は、最終的に合計される (S 1 28) 。図 9 (C) は周囲に所定レベル以上の画素が存在しているものつレ、て、それらの輝点の集合を生菌 1とカウントするために画素に対応したメモリにカウント番号を付した様子を示すものである。座標（E, 1) ， (E, 2) , (F, 2) の輝点は通常の輝度レベル Bの蛍光を発する生菌 1をしめし、座標 (E, 6) , (E, 7) , (H, 6) は、輝度レベル Aを持つ輝点とその拡散光によるものと判断し、 1つの集合として生菌の 2番目のカウント番号を付した状態を示す。全輝度マップのすべてのアドレスのメモリが判定されたことを確認して（S 1 3 0 ) 、この計数処理を終了する。

以上のように、本発明においては、マトリックス状のメモリに得られた 2値化デ一夕のうち、輝点を表すデ一夕が隣接するものは、それらの集合を 1つの輝点として計数し、また所定レベル以上の大きい強い輝度を持つ輝点については、その周囲の 5画素の範囲内に通常レベルの輝度を持つ輝点が存在していても、それらを 1つの生菌に由来する蛍光と判断し、輝点の集合を 1としてカウントするようにしたものである。これにより、実際の生菌の数と合致する計数を行うことがでできる。すなわち、生菌 1個に由来する輝点であるにもかかわらず、前述の図 3に示した例のように、 4個と計数するようなことを回避することができ、また、図 4に示したように、大きい輝度をもつ輝点の場合に発生する近傍の拡散光を別の生菌由来の蛍光による輝点としてカウン卜することを避けることができる。図 1 0は、本発明による計数の処理方法により画像解析装置が行った計数結果を示し、図 4の画像が拡散による蛍光をカウントして 3個と計数したものは、それらの集合を 1と適切に計数している。

画像解析に基づく電気的な自動計数によっても正確な計数カヾ可能となることを示している。

上述の第 2の実施例は計数すべき微生物による輝点の拡散光という偽輝点を計数しないようにして精密な計数を可能にするものであるカヾ、微生物の有無を確認するだけで簡易的な計測であれば、先の第 1の実施例に示した方法で十分である。ただし、本発明者の研究によれば、拡散光による偽輝点は条件にもよるカヾ大量に発生する場合があり、その場合、計数値が 1 0倍〜 5 0倍も多くなることがあり、少なくともこの拡散光の影響を除去したい場合には、第 1の実施例の図 5に示した処理フローにおいて、ステップ 1 4の画像デ一夕をチェックし、拡散光を発生するような輝度が高く、所定以上の大きさを持った輝点の有無を確認し、そのような輝点の確認したら、第 2のしきい値 L 2で 2値化する。得られた 2値化マトリックスは拡散光の影響を除去したものが得られる。

次に図 1 1は、本発明の第 3の実施例を示し、拡散光の影響がどの程度か大まかに把握した場合に実施する例を示す。なお、本実施例は、図 5に示す処理を基本にしており、説明の便宜上、同一の処理には同一の符号を用いて説明している。図 1 0に示すフローチャートに示すように、ステップ 1 4でで得た画像データはさらに、拡散光を発生するような輝点が存在するかどうかを、所定以上の輝度

(例えば、輝度値 1 0 ) で画素面積 3 X 3以上の輝点力存在するかどうかを確認し（S 3 0 0 ) 、そのような輝点が存在しない場合 (M l ) , 存在する場合（M 2 ) それぞれメモリに記憶する。そして、第 1の実施例のように、第 1のしきい値 1で 2値化し、輝点を計数してその数を確認しておく（S 1 0〜S 2 6 ) 。なお、ここで、ステップ 2 0の後、更に、離れた画素であってもその距離が 2画素以内のものは、同一輝点のものとしてカウントするための処理を加えている ( S 3 0 6〜S 3 1 2 )。第 1のしきい値に基づく計数の終了後、ステップ 3 0 0においてか確認されたメモリ M 2に輝点力記憶されたか否かの判断が実行されたかどうかの判断を経て（S 3 1 6 ) 、始めての判断の結果、輝点の存在が在れば（S 3 1 8 ) , ステップ 1 4で得た画像データ（別途メモリにデータを保存しておくものとする。）を第 2のしいき値 L 2により、 2値化する（S 3 2 0 ) そして、ステップ 1 7よりステップ 2 6の処理を同様に実行する。

第 1のしきい値 L 1と第 2のしきい値 L 2とにより得られた輝点の数はそれぞれ記録してし保持しておき、これらの輝点計数の差を知ることにより、大まかな拡散光の影響を数量的に把握することができる。

上述の如く本発明によれば、生菌ょり発生する蛍光の輝点を電気的に計数して生菌の個数を計数する方法において、輝点の形状により 1個を複数個に計数することにより生ずる計数誤差を無くすことができ、正確な生菌の計数が可能となる。また、生菌より発生する蛍光の輝点を電気的に計数して生菌の個数を計数する方法において、輝点の形状により 1個を複数個に計数することにより生ずる計数誤差を無くすことができ、また、輝度の大きい輝点から発生する拡散光を独立して発生した輝点と判断して計数することを避けることができる。これにより、微生物を電気的の正確に計数すること力く可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度データを 2次元のマトリックス状画素に対応させたメモリに読み取る段階と、

得られた輝度デー夕をノくックグラウンド値に基づレ、て補正する段階と、補正された各メモリの輝度デ一夕を設定した閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する段階と、

前記閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、

前記閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する所定範囲内の画素に所定以上の輝度を持つ輝点が存在するか否力、を判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数する段階

とからなる微生物計数方法。

2 . 試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する装置のにおいて、撮像装置で得た画像の輝度データを 2次元のマトリックス状画素に対応させたメモリに読み取る手段と、

得られた輝度データをバックグラウンド値に基づレ、て補正する手段と、補正された各メモリの輝度データを設定した閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する手段と、

前記閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する手段と、

前記閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する所定範囲に所定以上の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数する手段

とを有する微生物計数装置。

3 . 試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度データを 2次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る段階と、

得られた輝度デ一夕をノくックグラゥンド値に基づレ、て補正する段階と、補正された各メモリの輝度データを設定した第 1の閾値及び第 1の閾値よりも大きい第 2の閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つか否を判定する段階と、

前記第 2の閾値以上の輝度を持つ輝点の第 2の所定範囲の画素に前記第 1の閾値以上で前記第 2の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否カヽを判定し、存在している場合には該輝点の集合を 1個の輝点として計数することを特徴とする微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法。

4 . 試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する装置において、撮像装置で得た画像の輝度データを 2次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る手段と、

得られた輝度データをバックグラウンド値に基づレ、て補正する手段と、補正された各メモリの輝度デ一夕を設定した第 1の閾値及び第 1の閾値よりも大きい第 2の閾値により 2値化し、所定レベル以上の輝度値を持つ力、否を判定する手段と、

所定レベル以上の輝度を持つ輝点を計数する手段を有し、

前記第 1の閾値以上の輝度を持つ輝点の隣接する第 1の所定範囲の画素に第 1 の閾値以上の輝点を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在してレ、る場合には隣接する輝点の集合を 1個の輝点として計数し、

前記第 2の閾値以上の輝度を持つ輝点の第 2の所定範囲の画素に前記第 1の閾値以上で前記第 2の閾値以下の輝度を持つ輝点が存在するか否かを判定し、存在している場合には該輝点の集合を 1個の輝点として計数するようにしたことを特徵とする微生物又はそのコロニーの存在数を計数する装置。

5 . 試薬により発光処理を施した微生物からの蛍光を撮像装置で得た画像の輝点の数を計数して微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法において、撮像装置で得た画像の輝度デ一夕を 2次元のマトリックス状座標に対応させたメモリに読み取る段階と、

得られた輝度データをバックグラウンド値に基づいて補正する段階と、補正された輝度デ一夕を第 1の閾値で 2値化する段階と、

前記第 1の閾値よりも大きい第 2の閾値で 2値化する段階と、

前記第 1閾値以上の輝度値を持つか否かを判定する段階と、

前記第 2の閾値以上の輝度値を持つ力、否かを判定する段階と、

前記第 1の閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、

前記第 2の閾値以上の輝度を持つ輝点を計数する段階と、

前記補正された輝度デ一夕内に所定以上の面積を有し、前記第 2の閾値を越える輝点の存在の有無を確認する段階を有し、

前記所定以上の面積を有し前記第 2の閾値を越える輝点を持つ輝点が存在した場合には少なくとも前記第 2の閾値で画像データを 2値化した後、前記第 2の閾値以上の輝度値を持つ輝点を計数することを特徴とする微生物又はそのコロニーの存在数を計数する方法。