JP2015073452A - コロニーのカウント方法およびコロニー計数装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】反射体を配設したフラットベッドスキャナで撮像した撮像画像に基づいて微生物由来コロニーをカウントする方法およびコロニー計数装置を提供する。
【解決手段】光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナで撮像した撮像画像に基づいて、微生物由来コロニーを特定し、特定された前記微生物由来コロニーをカウントすることを特徴とする。反射体が配設されたフラットベッドスキャナで撮像するとコロニーの特定が明瞭となり、特に気泡発生コロニーの場合は、培地と気泡との区別が明瞭となるため気泡発生コロニーの特定が容易となり、感度よく微生物由来コロニーをカウントすることができる。
【選択図】なし
【解決手段】光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナで撮像した撮像画像に基づいて、微生物由来コロニーを特定し、特定された前記微生物由来コロニーをカウントすることを特徴とする。反射体が配設されたフラットベッドスキャナで撮像するとコロニーの特定が明瞭となり、特に気泡発生コロニーの場合は、培地と気泡との区別が明瞭となるため気泡発生コロニーの特定が容易となり、感度よく微生物由来コロニーをカウントすることができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、反射体が配設されたフラットベッドスキャナを利用して撮像した撮像画像に基づいて、培地内のコロニー数をカウントする、コロニーのカウント方法およびコロニー計数装置に関する。
細菌などの微生物量を迅速にカウントすることは、食品、医薬品業界における製品の品質管理や作業環境などを知る上で重要である。このようなコロニーのカウント方法として、ＣＣＤカメラによってコロニーが発生した培地を撮像し、得られた画像データに基づいて自動でコロニーをカウントするコロニー計数装置が開発されている（例えば、特許文献１、特許文献２）。
また、撮像画像を形成する装置としてＣＣＤカメラのほかにスキャナがある。一般に、書籍などの反射原稿をフラットベッドスキャナで読み取る場合には、原稿台に載置した書籍に原稿台の下部から光を照射し、照射光が漏れないように前記書籍を原稿被覆蓋で被覆した状態で、前記書籍からの反射光を撮像素子に導入して画像データを作成する。一方、被写体が透過原稿の場合は反射光が発生しないため、前記原稿被覆蓋側から光を照射し、透過光を撮像素子に導入して画像データを作成する。このため、照明を原稿被覆蓋側に配設する必要があり、原稿背面から光源を照射する透過原稿ユニットが開発されている。しかしながら、原稿の光透過性の有無によって別個の透過原稿ユニットを配設することはコスト高の一因となる。
この点に鑑み、透過原稿を読み取る装置として、フラットベッドスキャナの原稿押さえ板の内側に反射体を配設し、かつ原稿押さえ板に折り曲げ可能な屈曲部を設け、光学ユニットの光源と読み取り光学系とを分離し、前記光源による照明を原稿押さえ板の内側に反射させるようにした、原稿読取装置もある（特許文献３）。原稿押さえ板に設けた屈曲部により原稿台と原稿押さえ板との間に間隙が形成され、光源からの照明光を原稿押さえ板の内側に反射させ、この反射光で透過原稿を背面から照明し、これにより透過原稿からの透過光を撮像素子で受信し、撮像画像を形成するというものである。
従来から、ＪＡＳ製品などに関する品質や衛生面の尺度として生菌数および大腸菌群数検査が行われ、平板培養法による生菌数検査や大腸菌群数検査に代えてフィルム培地も代替法として汎用されている。このようなフィルム培地は台紙に培地を塗工して調製され、微生物培養時には、菌液を接種するため培地は含水して透明または半透明となり、これを撮像する際の被写体としては、寒天培地と同様に透過原稿といえる。
前記特許文献３記載の方法は、原稿押さえ板に屈曲部を形成し、かつ原稿押さえ板の内側に反射体を配設することで照射光を屈折させ、原稿の背面から照射光を入光して透過光を撮像するものである。しかしながら、透過光を集光するために光学ユニットの光源と読み取り光学系とを分離する必要があり、分離後に光源と読み取り光学系との間隙を至適範囲に調整することも容易でない。
更に、コロニーカウントの対象となる微生物として大腸菌群があり、例えば米国ＦＤＡによれば、「代謝発酵過程で乳糖を分解して酸およびガスを発生する無芽胞のグラム陰性桿菌」と定義されている。ガス発生微生物をカウントするには、気泡を検出する必要があり、気泡の検出がカウントの良否に影響する。栄養培地に所定のｐＨ指示薬を混入すると、大腸菌群が生成した酸と前記ｐＨ指示薬とが反応して着色するため、画像データ中でコロニーと培地とを区別することは比較的簡便であるが、培地中に発生する気泡は一般に無色であり、気泡と透明培地との区別は困難である。従って、撮像画像に基づいて、気泡発生コロニー由来のコロニーをカウントするカウント方法の開発が望まれる。
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、微生物培養培地を安価なフラットベッドスキャナで撮像し、前記撮像画像に基づいて微生物由来のコロニーをカウントするコロニーのカウント方法を提供することを目的とする。
本発明は、微生物を培養した培地をスキャナでスキャンして生成した撮像画像に基づいて前記微生物のコロニーをカウントする方法であって、
前記スキャナは、光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナであり、
前記撮像画像は、前記原稿台に前記培地を載置し、前記原稿被覆蓋で前記培地を被覆し、前記光源を前記原稿台に向けて点灯した照射光が前記反射体で反射した反射光を読み取るものであり、
前記カウント方法は、前記撮像画像の培地領域の画素の輝度値に基づいて前記コロニーを検出する微生物由来コロニー検出工程と、
前記検出された微生物由来コロニーをカウントするカウント工程とを含むものである、コロニーのカウント方法を提供するものである。
前記スキャナは、光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナであり、
前記撮像画像は、前記原稿台に前記培地を載置し、前記原稿被覆蓋で前記培地を被覆し、前記光源を前記原稿台に向けて点灯した照射光が前記反射体で反射した反射光を読み取るものであり、
前記カウント方法は、前記撮像画像の培地領域の画素の輝度値に基づいて前記コロニーを検出する微生物由来コロニー検出工程と、
前記検出された微生物由来コロニーをカウントするカウント工程とを含むものである、コロニーのカウント方法を提供するものである。
また本発明は、前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を微生物由来コロニーとして検出する工程とを含むものである、前記コロニーのカウント方法を提供するものである。
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を微生物由来コロニーとして検出する工程とを含むものである、前記コロニーのカウント方法を提供するものである。
また本発明は、前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記撮像画像を色相バンドパスフィルタリング処理してコロニーの色相を決定し、前記培地領域を構成する各画素の輝度値のうち、前記処理により特定した色相以外の色相に最高値を代入した後にグレースケール化して色相補正グレースケール画像を取得する色相補正グレースケール画像取得工程と、
前記色相補正グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行う工程とを含むものである、前記コロニーのカウント方法を提供するものである。
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記撮像画像を色相バンドパスフィルタリング処理してコロニーの色相を決定し、前記培地領域を構成する各画素の輝度値のうち、前記処理により特定した色相以外の色相に最高値を代入した後にグレースケール化して色相補正グレースケール画像を取得する色相補正グレースケール画像取得工程と、
前記色相補正グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行う工程とを含むものである、前記コロニーのカウント方法を提供するものである。
また本発明は、前記微生物が、コロニー形成時に気泡を発生する微生物であり、
前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記グレースケール画像を白黒反転して反転画像を形成し、前記反転画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値よりも充分に低い輝度値の画素の領域を気泡としてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を気泡として特定する気泡特定工程と、
前記グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を微生物由来コロニーとして特定するコロニー特定工程と、
前記コロニー特定工程で特定されたコロニーの所定範囲内に前記気泡特定工程で特定された気泡が存在するコロニーを気泡発生コロニー由来コロニーとして検出する気泡発生コロニー特定工程とを含むものである、前記コロニーのカウント方法を提供するものである。
前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記グレースケール画像を白黒反転して反転画像を形成し、前記反転画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値よりも充分に低い輝度値の画素の領域を気泡としてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を気泡として特定する気泡特定工程と、
前記グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を微生物由来コロニーとして特定するコロニー特定工程と、
前記コロニー特定工程で特定されたコロニーの所定範囲内に前記気泡特定工程で特定された気泡が存在するコロニーを気泡発生コロニー由来コロニーとして検出する気泡発生コロニー特定工程とを含むものである、前記コロニーのカウント方法を提供するものである。
また本発明は、光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナでスキャンして、微生物の培養後の培地の様子を示すカラー画像を取得するカラー画像取得手段と、
前記カラー画像のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得手段と、
前記グレースケール画像取得手段により取得されたグレースケール画像を、前記培地とコロニーとを識別する閾値で二値化して二値化画像を生成する二値化画像生成手段と、
前記二値化画像にラベリング処理を実行することにより前記二値化画像から連結成分を抽出する連結成分抽出手段と、
前記連結成分情報に基づいて、前記コロニーの個数を計数するコロニー計数手段と、を備える、
ことを特徴とするコロニー計数装置を提供するものである。
前記カラー画像のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得手段と、
前記グレースケール画像取得手段により取得されたグレースケール画像を、前記培地とコロニーとを識別する閾値で二値化して二値化画像を生成する二値化画像生成手段と、
前記二値化画像にラベリング処理を実行することにより前記二値化画像から連結成分を抽出する連結成分抽出手段と、
前記連結成分情報に基づいて、前記コロニーの個数を計数するコロニー計数手段と、を備える、
ことを特徴とするコロニー計数装置を提供するものである。
本実施形態のコロニーのカウント方法によれば、微生物が生育した培地のカラー画像を用いて培地とコロニーとの輝度値の差から正確に微生物由来コロニーを特定し、その数をカウントすることができる。
また、本実施形態のコロニー計数装置によれば、汎用のフラットベッドスキャナの原稿被覆蓋の原稿台側に反射体を配設して、正確に微生物由来コロニーをカウントするコロニー計数装置を構成することができる。
本発明者等は、フラットベッドスキャナによる微生物培養培地の撮像を詳細に検討した結果、スキャナの原稿被覆蓋の被写体側に反射体を配設すると、寒天培地や薄層のフィルム培地などをコロニーの識別が極めて明瞭な状態で撮像することができること、特に、気泡と培地とのコントラストが明瞭となり、気泡発生微生物由来のコロニーを的確に検出できることなどを見出し、本発明を完成させた。培養後の培地を、原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナでスキャンしてカラー画像を形成し、得られた撮像画像に基づいてコロニーをカウントする点に特徴がある。
（１）コロニー計数装置
本実施形態のカウント方法は、撮像装置と、前記撮像装置によって撮像された画像を保存し、保存結果を表示などできる電子機器とを組み合わせて構成されたコロニー計数装置によって実施することができる。このような装置の一例を図１に示す。図１に示すコロニー計数装置１００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１０１、ＲＯＭ（Read Only Memory）１０２、ＲＡＭ（Random Access Memory）１０３、記憶装置１０４、入力装置１０５、撮像制御部１０７、画像記憶部１０９、表示制御部１１０、を備える。コロニー計数装置１００が備えるこれらの構成要素は、バス１２０により相互に接続される。なお、撮像制御部１０７は、ＣＰＵ１０１による制御のもと、撮像制御部１０７に接続された撮像装置１０８を制御する。撮像装置１０８は撮像制御部１０７から供給される制御信号に従って被写体を撮像し、および生成した撮像画像を撮像制御部１０７に送信する。また、表示制御部１１０には、表示装置１１１が接続される。
本実施形態のカウント方法は、撮像装置と、前記撮像装置によって撮像された画像を保存し、保存結果を表示などできる電子機器とを組み合わせて構成されたコロニー計数装置によって実施することができる。このような装置の一例を図１に示す。図１に示すコロニー計数装置１００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）１０１、ＲＯＭ（Read Only Memory）１０２、ＲＡＭ（Random Access Memory）１０３、記憶装置１０４、入力装置１０５、撮像制御部１０７、画像記憶部１０９、表示制御部１１０、を備える。コロニー計数装置１００が備えるこれらの構成要素は、バス１２０により相互に接続される。なお、撮像制御部１０７は、ＣＰＵ１０１による制御のもと、撮像制御部１０７に接続された撮像装置１０８を制御する。撮像装置１０８は撮像制御部１０７から供給される制御信号に従って被写体を撮像し、および生成した撮像画像を撮像制御部１０７に送信する。また、表示制御部１１０には、表示装置１１１が接続される。
（２）フラットベッドスキャナ
本実施態様では、コロニー計数装置を構成する撮像装置１０８として、フラットベッドスキャナを使用する。フラットベッドスキャナによれば、培地などの被写体を原稿台に載置し、培地を動かすことなくカラー画像を作成することができる。図１３に本実施態様で使用するフラットベッドスキャナ３００の一例を示す。光源３１０と原稿台３２０と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋３４０とがこの順に配設され、原稿被覆蓋３４０の原稿台側に反射体３３０が配設されたものである。図１３は、撮像素子としてＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサを使用するＣＩＳ（Contact Image Sensor）方式の一例であり、原稿台３２０の上にシャーレＡが載置され、かつ原稿被覆蓋３４０は、折曲部３４０ａ、３４０ｂに箇所の折曲部を有する態様を示す。原稿台３２０の下部に搬送モーター３７０によって駆動する搬送ベルト３８０が配設され、搬送ベルト３８０にＣＩＳモジュール３６０が固設されている。ＣＩＳモジュール３６０には、光源３１０と、反射体３３０からの反射光を受光して電荷として蓄えることにより原稿を読み取るＣＩＳ３５０とが搭載されている。光源３１０は、赤色光を点灯するＬＥＤ３１０Ｒと、緑色光を点灯するＬＥＤ３１０Ｇと、青色光を点灯するＬＥＤ３１０Ｂの３色の光源からなり、光源からの照射光を原稿台３２０に照射する。前記ＣＩＳ３５０は、一ライン分の複数の受光素子（ＣＭＯＳイメージセンサー）が主走査方向に配列されたものとして構成され、各色のＬＥＤ３１０Ｒ，３１０Ｇ，３１０Ｂの点灯を順次切り替えながら反射光を一色ずつ読み取ることによりカラーイメージデータを生成する。
本実施態様では、コロニー計数装置を構成する撮像装置１０８として、フラットベッドスキャナを使用する。フラットベッドスキャナによれば、培地などの被写体を原稿台に載置し、培地を動かすことなくカラー画像を作成することができる。図１３に本実施態様で使用するフラットベッドスキャナ３００の一例を示す。光源３１０と原稿台３２０と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋３４０とがこの順に配設され、原稿被覆蓋３４０の原稿台側に反射体３３０が配設されたものである。図１３は、撮像素子としてＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサを使用するＣＩＳ（Contact Image Sensor）方式の一例であり、原稿台３２０の上にシャーレＡが載置され、かつ原稿被覆蓋３４０は、折曲部３４０ａ、３４０ｂに箇所の折曲部を有する態様を示す。原稿台３２０の下部に搬送モーター３７０によって駆動する搬送ベルト３８０が配設され、搬送ベルト３８０にＣＩＳモジュール３６０が固設されている。ＣＩＳモジュール３６０には、光源３１０と、反射体３３０からの反射光を受光して電荷として蓄えることにより原稿を読み取るＣＩＳ３５０とが搭載されている。光源３１０は、赤色光を点灯するＬＥＤ３１０Ｒと、緑色光を点灯するＬＥＤ３１０Ｇと、青色光を点灯するＬＥＤ３１０Ｂの３色の光源からなり、光源からの照射光を原稿台３２０に照射する。前記ＣＩＳ３５０は、一ライン分の複数の受光素子（ＣＭＯＳイメージセンサー）が主走査方向に配列されたものとして構成され、各色のＬＥＤ３１０Ｒ，３１０Ｇ，３１０Ｂの点灯を順次切り替えながら反射光を一色ずつ読み取ることによりカラーイメージデータを生成する。
反射体３３０は、原稿台３２０下部に配設された光源３１０からの照射光を反射できる反射面を有するものであればよく、例えば鏡のほか、鏡面加工した金属板や鏡面加工したプラスチックフィルムやプラスチック板などであってもよい。反射体３３０は、スキャンの際に原稿台３２０に対して平行になるように原稿被覆蓋３４０の表面に配設される。更に、前記反射体３３０は、原稿被覆蓋３４０表面の原稿台側の全面に配設される必要はない。例えば、原稿台３２０に培地を載置した場合、培地と対向する位置だけに反射体を配設するものであってもよい。
フラットベッドスキャナのスキャン機能は、光学縮小方式であってもよく、被写体に対応して適宜選択することができる。例えば、培地がシャーレに充填された寒天培地の場合には光学縮小方式を好適に使用することができ、培地が薄層のフィルム培地の場合には密着センサ方式を好適に使用することができる。なお、撮像素子もＣＣＤイメージセンサであってもよい。フィルム培地を被写体とする場合は、コンパクトかつ安価である点でＣＭＯＳイメージセンサを撮像素子とする密着センサ方式を好適に使用することができる。このようなスキャナは、光源３１０と原稿台３２０と前記原稿台３２０を被覆する原稿被覆蓋３４０とがこの順に配設される汎用のフラットベッドスキャナの前記原稿被覆蓋３４０表面の原稿台３２０側に反射体３３０を配設して調製することができる。
なお、フラットベッドスキャナ３００は、前記反射体３３０が原稿被覆蓋３４０表面に固設される必要はなく、スキャンの際に被写体の上部に反射体３３０を原稿被覆蓋３４０表面に平行に載置し、要時、前記したフラットベッドスキャナ３３０を構成してもよい。
（３）微生物
本実施態様では、コロニーを形成する微生物をカウント対象とする。一般細菌、大腸菌群、大腸菌、糞便系大腸菌群、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、セレウス菌、クロストリジウム属菌、乳酸菌、腸内細菌科菌群などがある。これらの中でも、大腸菌群、大腸菌（以下、単にＥ．ｃｏｌｉと称する場合がある。）、糞便系大腸菌群、腸内細菌科菌群などの、気泡発生コロニー由来のコロニー数のカウントに好適である。例えば、大腸菌群は、乳糖を分解してガスを産生する細菌群である。本発明によればフラットベッドスキャナに反射体を配設して撮像することで気泡の識別性に優れる撮像画像を作成することができるため、コロニーの近傍に気泡を伴う微生物を的確に検出することができる。
本実施態様では、コロニーを形成する微生物をカウント対象とする。一般細菌、大腸菌群、大腸菌、糞便系大腸菌群、黄色ブドウ球菌、腸炎ビブリオ、サルモネラ、セレウス菌、クロストリジウム属菌、乳酸菌、腸内細菌科菌群などがある。これらの中でも、大腸菌群、大腸菌（以下、単にＥ．ｃｏｌｉと称する場合がある。）、糞便系大腸菌群、腸内細菌科菌群などの、気泡発生コロニー由来のコロニー数のカウントに好適である。例えば、大腸菌群は、乳糖を分解してガスを産生する細菌群である。本発明によればフラットベッドスキャナに反射体を配設して撮像することで気泡の識別性に優れる撮像画像を作成することができるため、コロニーの近傍に気泡を伴う微生物を的確に検出することができる。
（４）培地
使用する培地は、スキャンの際に透明または半透明であり、微生物の生育に適した物であれば特に限定はない。従って、シャーレに寒天を充填した寒天培地や、寒天に代えてゲル化剤その他からなる培地組成物を使用したフィルム培地であってもよい。フィルム培地としては、透明または半透明な台紙の一部に前記培地組成物を塗工して培地層を形成し、その上面を被覆する透明フィルムを配設したものを例示することができる。このような培地組成物に菌液を接種すると含水して透明度を増加させ、この含水培地に前記透明フィルムを被覆すると速やかに密着して培地組成物と透明フィルムとが一体物となり透明物または半透明物となる。なお、培地組成物を塗工する台紙が不透明の厚紙で構成されるなど、培養後のフィルム培地の透明性を有しない場合には、本発明によるカウント方法を実施することができない。なお、フィルム培地の厚さは一般に１〜３ｍｍである。
使用する培地は、スキャンの際に透明または半透明であり、微生物の生育に適した物であれば特に限定はない。従って、シャーレに寒天を充填した寒天培地や、寒天に代えてゲル化剤その他からなる培地組成物を使用したフィルム培地であってもよい。フィルム培地としては、透明または半透明な台紙の一部に前記培地組成物を塗工して培地層を形成し、その上面を被覆する透明フィルムを配設したものを例示することができる。このような培地組成物に菌液を接種すると含水して透明度を増加させ、この含水培地に前記透明フィルムを被覆すると速やかに密着して培地組成物と透明フィルムとが一体物となり透明物または半透明物となる。なお、培地組成物を塗工する台紙が不透明の厚紙で構成されるなど、培養後のフィルム培地の透明性を有しない場合には、本発明によるカウント方法を実施することができない。なお、フィルム培地の厚さは一般に１〜３ｍｍである。
スキャンの際の培地層が透明性を有すれば着色していてもよい。例えば、培地組成物に発色剤などが含有され、呈色によりコロニーと培地とを識別できる組成を好適に使用することができる。なお、複数の発色成分を含有させたフィルム培地を使用して、呈色が異なる複数のコロニーを検出することもできる。また、気泡発生コロニーを検出する培地であってもよい。例えば、大腸菌群は、乳糖の存在下で酸とガスを産生する。このような培地としてＶＲＢ寒天培地などが知られている。ＶＲＢ寒天は、ｐＨ指示薬であるニュートラルレッドが大腸菌群による酸産生により赤く変色し、赤色集落を形成する。この培地に発色酵素基質Ｘ−ＧＬＵＣ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）を加えることによって大腸菌群中のＥ．ｃｏｌｉのみ青色集落を形成し、分別することが可能になる。本実施態様では、ＶＲＢ寒天に代えてグアールガム、キサンタンガム、ローカストビーンガム、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ポリビニルピロリドン、ゲラン、低モノマー含量ポリアクリル酸、その他のゲル化剤および発色酵素基質を基材とする培地組成物を使用したフィルム培地なども好適に使用することができる。
（５）撮像画像の形成
スキャナ３００の原稿台３２０の下部に配設された光源３１０を点灯すると、照射光が原稿台３２０および培地Ａを透過し、原稿被覆蓋３４０に配設した反射体３３０に至る。照射光は、反射体３３０で反射し、反射光は培地Ａおよび原稿台３２０を透過してフラットベッドスキャナ３００に配備された撮像素子３５０に導入され、撮像画像を形成する。撮像画像のアスペクト比や解像度は、適宜調整が可能である。撮像画像は、例えば、ディジタルデータにより表される。このように形成された撮像画像は、例えば、コロニー計数装置１００の画像記憶部１０９や記憶装置１０４等に保存することができる。
スキャナ３００の原稿台３２０の下部に配設された光源３１０を点灯すると、照射光が原稿台３２０および培地Ａを透過し、原稿被覆蓋３４０に配設した反射体３３０に至る。照射光は、反射体３３０で反射し、反射光は培地Ａおよび原稿台３２０を透過してフラットベッドスキャナ３００に配備された撮像素子３５０に導入され、撮像画像を形成する。撮像画像のアスペクト比や解像度は、適宜調整が可能である。撮像画像は、例えば、ディジタルデータにより表される。このように形成された撮像画像は、例えば、コロニー計数装置１００の画像記憶部１０９や記憶装置１０４等に保存することができる。
例えば、寒天培地の撮像画像を形成する場合は、フラットベッドスキャナ３００の原稿台３２０の上に、寒天培地の蓋面を原稿台３２０に載置し、原稿被覆蓋３４０で寒天培地の底面を被覆する。前記したように、スキャナは使用時に原稿被覆蓋３４０の原稿台３２０側に反射体３３０が配設されていればよい。従って、原稿被覆蓋３４０に反射体３３０が配設されていない場合には、寒天培地の上部に反射体３３０を載置し、反射体３３０を被覆するように原稿被覆蓋３４０を被覆してもよい。図２（ａ）は、寒天培地の上部に反射体３３０を重ね、その上部を原稿被覆蓋３４０で被覆してスキャンした撮像画像であり、図２（ｂ）は、反射体３３０を配設しないフラットベッドスキャナ３００を使用して形成した撮像画像である。共に大小のコロニーが散見されるが、反射体３３０が存在すると培地とコロニーとのコントラストが高くなり、寒天培地で生育するコロニーを容易に検出することができる。
フィルム培地の撮像画像も寒天培地と同様に形成することができる。図３にフィルム培地を説明する平面図を示す。透明または半透明の基材シートに、略中央を円形にくり貫いた不透明の紙を積層した積層体に、捲り可能なようにカバーシートを積層した積層シート２１０であって、前記くり貫き部に培地層２３０を塗工したものである。カバーシートには、培養条件や日付などの培地層２３０に関する識別情報２２０を記載することができる。図３に示すフィルム培地には、気泡２５０ａ、コロニー２５０ｂ、気泡発生呈色コロニー２５０ｃ、２５０ｄが散見される態様を示す。反射体３３０を配設したフラットベッドスキャナ３００の原稿台３２０の上に、フィルム培地の前記カバーシートを原稿台３２０に対向させて載置し、原稿被覆蓋３４０で被覆し、スキャナ３００を始動させる。前記積層シート２１０に形成された培地層２３０は透過原稿となり、反射光による撮像がなされる。なお、くり貫き部以外は不透明原稿として撮像される。なお、本実施態様では、フィルム培地の培地層２３０を培地と称する場合がある。
(６）カウント方法
本実施態様では、撮像画像に基づいてコロニーをカウントすることができ、コロニーが気泡発生コロニーの場合には、気泡とコロニーとを別個に検出し、コロニーの所定範囲内に気泡が存在するものを気泡発生コロニーとして特定してカウントすることができる。更に、培養後の培地に呈色の異なる複数の気泡発生コロニーが含まれる場合には、呈色の異なる気泡発生コロニー毎に検出及びカウントすることができる。以下、呈色の異なる複数の気泡発生コロニーが含まれる場合のカウント方法で説明する。便宜のため、明るい紅色の培地に、気泡を伴う濃い青色のコロニーと気泡を伴う濃い赤色のコロニーとが存在する方法で説明する。
本実施態様では、撮像画像に基づいてコロニーをカウントすることができ、コロニーが気泡発生コロニーの場合には、気泡とコロニーとを別個に検出し、コロニーの所定範囲内に気泡が存在するものを気泡発生コロニーとして特定してカウントすることができる。更に、培養後の培地に呈色の異なる複数の気泡発生コロニーが含まれる場合には、呈色の異なる気泡発生コロニー毎に検出及びカウントすることができる。以下、呈色の異なる複数の気泡発生コロニーが含まれる場合のカウント方法で説明する。便宜のため、明るい紅色の培地に、気泡を伴う濃い青色のコロニーと気泡を伴う濃い赤色のコロニーとが存在する方法で説明する。
図４に、本実施形態に係るコロニー計数装置１００の機能的な構成について説明する。図４に示すように、コロニー計数装置１００は、グレースケール画像取得部１１、反転画像取得部１２、二値化画像生成部１３、連結成分抽出部１４、コロニー計数部１５、カラー画像取得部１６、色相範囲特定部１７、グレースケール画像生成部２０、記憶部３０を備える。
次いで、図５に、本実施形態のコロニーのカウント方法のフローチャートを示す。例えば、作業者によるコロニーカウント処理の開始指示が入力装置１０５に受け付けられたことを検知すると、図５に示すコロニー計数処理が開始される。
（６−１）撮像画像取得工程
まず、ＣＰＵ１０１は、撮像画像を取得する（ステップＳ１０１）。撮像画像の取得元は、典型的には撮像装置１０８であるが、記憶装置１０４、画像記憶部１０９、その他通信可能な外部の装置であってもよい。撮像画像はカラーの画像である。該画像は、表示制御部１１０を介して表示装置で撮像画像を表示することができる。取得したカラー画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
まず、ＣＰＵ１０１は、撮像画像を取得する（ステップＳ１０１）。撮像画像の取得元は、典型的には撮像装置１０８であるが、記憶装置１０４、画像記憶部１０９、その他通信可能な外部の装置であってもよい。撮像画像はカラーの画像である。該画像は、表示制御部１１０を介して表示装置で撮像画像を表示することができる。取得したカラー画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
（６−２）グレースケール形成工程
まず、ＣＰＵ１０１は、カラー画像をグレースケール画像に変換する（ステップＳ１０２）。ＣＰＵ１０１は、ＮＴＳＣ（National Television System Ｃ０mmittee）係数による加重平均法を採用して、カラー画像をグレースケール画像に変換することができる。例えば、カラー画像における各色の輝度値をＲ、Ｇ、Ｂとし、グレースケール画像における輝度値をＹとすると、Ｙ＝（０．２９８９１２＊Ｒ＋０．５８６６１１＊Ｇ＋０．１１４４７８＊Ｂ）で変換することができる。ただし、グレースケール化としては、前記ＮＴＳＣ係数による加重平均法に限定されるものではなく、ＲＧＢの中間値、つまりＲ、Ｇ、Ｂのうちの、最大値と最小値の２つを足して２で割ったものを利用してグレースケール化する中間値法、ＨＤＴＶ係数による加重平均、ＲとＧとＢを足して３で割った単純平均法、ＲＧＢのうちのＧのみを使用するＧチャンネル法、Ｒ、Ｇ、Ｂのうち、最大でも最小でもない真中の大きさの値を選ぶ中央値法などの何れの方法であってもよい。グレースケール画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
まず、ＣＰＵ１０１は、カラー画像をグレースケール画像に変換する（ステップＳ１０２）。ＣＰＵ１０１は、ＮＴＳＣ（National Television System Ｃ０mmittee）係数による加重平均法を採用して、カラー画像をグレースケール画像に変換することができる。例えば、カラー画像における各色の輝度値をＲ、Ｇ、Ｂとし、グレースケール画像における輝度値をＹとすると、Ｙ＝（０．２９８９１２＊Ｒ＋０．５８６６１１＊Ｇ＋０．１１４４７８＊Ｂ）で変換することができる。ただし、グレースケール化としては、前記ＮＴＳＣ係数による加重平均法に限定されるものではなく、ＲＧＢの中間値、つまりＲ、Ｇ、Ｂのうちの、最大値と最小値の２つを足して２で割ったものを利用してグレースケール化する中間値法、ＨＤＴＶ係数による加重平均、ＲとＧとＢを足して３で割った単純平均法、ＲＧＢのうちのＧのみを使用するＧチャンネル法、Ｒ、Ｇ、Ｂのうち、最大でも最小でもない真中の大きさの値を選ぶ中央値法などの何れの方法であってもよい。グレースケール画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
（６−３）培地トリミング工程
ＣＰＵ１０１は、グレースケール画像の培地領域をコロニー培地領域として特定し、トリミングする（ステップＳ１０３）。コロニー培地領域の特定は、グレースケール画像の座標に基づいて、特定領域をコロニー培地領域としてもよい。また、所定の輝度値領域を培地と特定し、その外周に輝度値の最高値を代入してコロニーを含む培地の領域を特定してもよい。このようにして得たトリミング画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。カラー画像には、培地を示す画素と培地の外周を示す画素とが含まれるが、トリミング画像には培地の外周を示す画素は含まれないか、画素の輝度値は最高値で表記される。したがって、培地中のコロニーを特定する際に、トリミング画像に含まれる培地の輝度値とコロニーの輝度値と差を考慮して閾値を決定し、コロニーを特定する二値化画像を作成することができる。
ＣＰＵ１０１は、グレースケール画像の培地領域をコロニー培地領域として特定し、トリミングする（ステップＳ１０３）。コロニー培地領域の特定は、グレースケール画像の座標に基づいて、特定領域をコロニー培地領域としてもよい。また、所定の輝度値領域を培地と特定し、その外周に輝度値の最高値を代入してコロニーを含む培地の領域を特定してもよい。このようにして得たトリミング画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。カラー画像には、培地を示す画素と培地の外周を示す画素とが含まれるが、トリミング画像には培地の外周を示す画素は含まれないか、画素の輝度値は最高値で表記される。したがって、培地中のコロニーを特定する際に、トリミング画像に含まれる培地の輝度値とコロニーの輝度値と差を考慮して閾値を決定し、コロニーを特定する二値化画像を作成することができる。
（６−４）気泡検出工程
（ａ）反転画像形成工程
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０３の処理を完了すると、グレースケール画像を白黒反転した、反転画像を形成する（ステップＳ１０４）。反転画像を使用することで、コロニーの検出工程と同様の操作により、コロニーに代えて気泡を検出することができる。すなわち、グレースケール画像を構成する各画素が０〜２５５までの２５６階調で表現されている場合、これを二値化した二値化画像を構成する各画素は０もしくは１の２階調で表現される。コロニーのように暗い部分を示す画素の輝度値を０（黒）とし、培地のように明るい部分を示す画素の輝度値を１（白）とする閾値を選択してグレースケール画像を二値化すれば、コロニーを表す画素を特定し検出する二値化画像を得ることができる。一方、気泡は培地よりも淡色であるから、気泡を輝度値０（黒）で特定することはできない。しかしながら、白黒反転画像を使用すれば、気泡を示す画素は培地を示す画素よりも濃色で示される。反転画像が２５６階調で表現されている場合、気泡を示す画素の輝度値を０（黒）とし、培地を示す画素の輝度値を１（白）とする閾値を選択して二値化画像を形成することで、気泡を表す画素を特定することができる。生成した反転画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
（ａ）反転画像形成工程
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０３の処理を完了すると、グレースケール画像を白黒反転した、反転画像を形成する（ステップＳ１０４）。反転画像を使用することで、コロニーの検出工程と同様の操作により、コロニーに代えて気泡を検出することができる。すなわち、グレースケール画像を構成する各画素が０〜２５５までの２５６階調で表現されている場合、これを二値化した二値化画像を構成する各画素は０もしくは１の２階調で表現される。コロニーのように暗い部分を示す画素の輝度値を０（黒）とし、培地のように明るい部分を示す画素の輝度値を１（白）とする閾値を選択してグレースケール画像を二値化すれば、コロニーを表す画素を特定し検出する二値化画像を得ることができる。一方、気泡は培地よりも淡色であるから、気泡を輝度値０（黒）で特定することはできない。しかしながら、白黒反転画像を使用すれば、気泡を示す画素は培地を示す画素よりも濃色で示される。反転画像が２５６階調で表現されている場合、気泡を示す画素の輝度値を０（黒）とし、培地を示す画素の輝度値を１（白）とする閾値を選択して二値化画像を形成することで、気泡を表す画素を特定することができる。生成した反転画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
（ｂ）二値化画像形成工程
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０４の処理を完了すると、反転画像を二値化し二値化画像を形成する（ステップＳ１０５）。まず、ＣＰＵ１０１は、反転画像のヒストグラムを形成する。具体的には、反転画像を構成する画素の階調が、０〜２５５の２５６階調であるものとすると、ＣＰＵ１０１は、０〜２５５の輝度値のそれぞれについて、反転画像を構成する画素のうち、この輝度値である画素の数（度数）を求める。次いで、生成したヒストグラムに移動平均をかける。かかる移動平均処理により、ヒストグラム上のノイズ成分が除去され、なめらかなヒストグラムが生成される。生成したヒストグラムを表す情報は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０４の処理を完了すると、反転画像を二値化し二値化画像を形成する（ステップＳ１０５）。まず、ＣＰＵ１０１は、反転画像のヒストグラムを形成する。具体的には、反転画像を構成する画素の階調が、０〜２５５の２５６階調であるものとすると、ＣＰＵ１０１は、０〜２５５の輝度値のそれぞれについて、反転画像を構成する画素のうち、この輝度値である画素の数（度数）を求める。次いで、生成したヒストグラムに移動平均をかける。かかる移動平均処理により、ヒストグラム上のノイズ成分が除去され、なめらかなヒストグラムが生成される。生成したヒストグラムを表す情報は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
図６に、白黒反転画像の輝度値のヒストグラムの一例を示す。反転画像は、気泡、コロニーおよび培地を表す画像であるため、面積の広い培地を表す輝度値の画素の度数が大きいヒストグラムとなる。反転画像では、気泡は培地に比べ暗い色であり、気泡を表す画素の輝度値は、培地を表す画素の輝度値よりも低くなる。例えば、培地を表す画素の輝度値の最高値（Ｎｍａｘ）の所定割合、例えば２０％を気泡を表す画素の輝度値の最大値とし、気泡を表す画素の輝度値の最低値を最小値とすれば、前記最小値と最大値との間を気泡を示す画素の輝度値の範囲として特定することができる。前記所定割合は、２０％に限定されない。
本実施形態では、二値化変換の際の閾値として、例えば前記最小値または最大値を使用することができる。また、前記最大値と最小値との平均値を使用してもよい。更に、前記最小値から最大値まで輝度値をインクリメントし、最大の気泡数となる輝度値を閾値としてもよい。
ＣＰＵ１０１は、反転画像を構成する各画素の輝度値が指定した閾値以上であるか否かを判別し、判別結果に従って各画素を二値化し、二値化画像を生成する。生成した二値化画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
（ｃ）連結成分検出工程
図７（ａ）に、得られた二値化画像の一部を示す。図７（ａ）において、ハッチングで示している画素は、輝度値が０（黒）の画素であり、白抜きで示している画素は、輝度値が１（白）の画素である。気泡は複数の画素のまとまりで表示され、輝度値は０（黒）である。二値化画像上において輝度値が０(黒）で数個のまとまりを構成し、連結する画素は気泡を示す。以下、輝度値が０(黒）で連結する画素を、適宜、連結成分という。図７（ａ）に示す例では、Ｃ０１、Ｃ０２、Ｃ０３で示される３つの連結成分、すなわち３つの気泡が検出されている。
図７（ａ）に、得られた二値化画像の一部を示す。図７（ａ）において、ハッチングで示している画素は、輝度値が０（黒）の画素であり、白抜きで示している画素は、輝度値が１（白）の画素である。気泡は複数の画素のまとまりで表示され、輝度値は０（黒）である。二値化画像上において輝度値が０(黒）で数個のまとまりを構成し、連結する画素は気泡を示す。以下、輝度値が０(黒）で連結する画素を、適宜、連結成分という。図７（ａ）に示す例では、Ｃ０１、Ｃ０２、Ｃ０３で示される３つの連結成分、すなわち３つの気泡が検出されている。
ステップＳ１０５に次いで、ＣＰＵ１０１は、二値化画像に含まれる各連結成分を、定法に従いラベル付けする（ステップＳ１０６）。なお、図７（ｂ）に示すように、連結成分は、この連結成分に外接する矩形で近似することができる。図７（ｂ）では、Ｃ０１で示された連結成分をＣ１１で近似し、Ｃ０２で示された連結成分をＣ１２で近似し、Ｃ０３で示された連結成分をＣ１３で近似する例を示している。連結成分に関する情報は、各連結成分の位置情報と共にＲＡＭ１０３に記憶される。連結成分の位置情報としては、気泡を示す連結成分の座標がある。
（６−５）青色コロニー検出工程
（ａ）色相バンドパスフィルタリング処理工程
ステップＳ１０６が終了すると、ＣＰＵ１０１は、撮像画像（以下、カラー画像とも称する。）に色相バンドパスフィルタリング処理をする（ステップＳ１０７）。まず、ＣＰＵ１０１は、カラー画像の色相のヒストグラムを生成する。具体的には、ＣＰＵ１０１は、カラー画像を構成する各画素について、３原色の輝度値の割合に基づいて、色相を決定する。そして、ＣＰＵ１０１は、色相毎に、この色相の画素の数を集計し、この色相の度数を求める。図８に、カラー画像の色相のヒストグラムを示す。ＣＰＵ１０１は、カラー画像を構成する各画素について、Ｒ（赤）の輝度値とＧ（緑）の輝度値とＢ（青）の輝度値との割合により、この画素の色相を決定する。色相は、赤→橙→黄→緑→青→藍→紫→赤により表され、０〜３６０度により表される。ヒストグラム上には、培地を表す画素の色相により構成される山状領域と、コロニーを表す画素の色相により構成される山状領域とを含む。図８では、コロニーを表す色相として、青と赤とにそれぞれ山状領域が形成されている。
（ａ）色相バンドパスフィルタリング処理工程
ステップＳ１０６が終了すると、ＣＰＵ１０１は、撮像画像（以下、カラー画像とも称する。）に色相バンドパスフィルタリング処理をする（ステップＳ１０７）。まず、ＣＰＵ１０１は、カラー画像の色相のヒストグラムを生成する。具体的には、ＣＰＵ１０１は、カラー画像を構成する各画素について、３原色の輝度値の割合に基づいて、色相を決定する。そして、ＣＰＵ１０１は、色相毎に、この色相の画素の数を集計し、この色相の度数を求める。図８に、カラー画像の色相のヒストグラムを示す。ＣＰＵ１０１は、カラー画像を構成する各画素について、Ｒ（赤）の輝度値とＧ（緑）の輝度値とＢ（青）の輝度値との割合により、この画素の色相を決定する。色相は、赤→橙→黄→緑→青→藍→紫→赤により表され、０〜３６０度により表される。ヒストグラム上には、培地を表す画素の色相により構成される山状領域と、コロニーを表す画素の色相により構成される山状領域とを含む。図８では、コロニーを表す色相として、青と赤とにそれぞれ山状領域が形成されている。
ＣＰＵ１０１は、次いで、ヒストグラムにおける最大の山状領域を特定し、および、最大の山状領域の除外後の山状領域を、コロニーの色相範囲として特定する。ＣＰＵ１０１は、最大の山状領域の除外後のヒストグラムにおける山状領域を求めることができる。次いで、ＣＰＵ１０１は、０〜３６０度により表される色相の表示順にコロニーを表す色相を特定し、表示順に青色コロニーを表す画素の色相により構成される山状領域を有効な色相範囲に設定する。具体的には、ヒストグラム上から培地を表す画素の色相により構成される山状領域を除外し、除外後のヒストグラム上にみられる、カウント対象コロニーを表す画素の色相（青色系）により構成される山状領域を有効な色相範囲に設定する。このような色相バンドパスフィルタリング処理により、有効な色相範囲以外の色相範囲の画素は無効にされ、かつ培地の持つざらつきやフィルム培地に記載される罫線がコロニーとして誤認識されにくくなる。ＣＰＵ１０１は、特定したコロニーの色相範囲を示す情報を、ＲＡＭ１０３に記憶する。
次いで、ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０３で得たグレースケール画像を構成する画素のうち、カウント対象コロニーの色相範囲（青色系）外の色相を表す画素を、輝度値の最大値に設定したグレースケール画像を形成する。ここで、輝度値の最大値は、グレースケール画像が２５６階調である場合には２５５（白）である。この処理によれば、グレースケール画像を二値化する際の閾値がどのような値に設定されても、輝度値の最大値に設定された画素は、二値化画像において１（白）に設定される。ＣＰＵ１０１は、形成された色相補正グレースケール画像を、ＲＡＭ１０３に記憶する。上記により、青色コロニー検出のための色相バンドパスフィルタリング処理を終了する。
（ｂ）二値化画像形成工程
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０７の処理を完了すると、色相補正グレースケール画像を構成する画素の輝度値のヒストグラムを生成する。生成したヒストグラムは、前記した反転画像から生成したヒストグラムと同様に、移動平均をかける。かかる移動平均処理により、ヒストグラム上のノイズ成分が除去され、なめらかなヒストグラムが生成される。生成したヒストグラムを表す情報は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０７の処理を完了すると、色相補正グレースケール画像を構成する画素の輝度値のヒストグラムを生成する。生成したヒストグラムは、前記した反転画像から生成したヒストグラムと同様に、移動平均をかける。かかる移動平均処理により、ヒストグラム上のノイズ成分が除去され、なめらかなヒストグラムが生成される。生成したヒストグラムを表す情報は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
ヒストグラムは、培地を表す輝度値の画素の度数が大きいヒストグラムとなる。カウント対象コロニーは培地に比べ暗い色であり、カウント対象コロニーを表す画素の輝度値は、培地を表す画素の輝度値よりも低くなる。前記した反転画像から生成したヒストグラムと同様に、培地を表す画素の輝度値の最高値（Ｎｍａｘ）の所定割合、例えば２０％をコロニーを表す画素の輝度値の最大値とし、コロニーを表す画素の輝度値の最低値（頻度が０でなくなった最小値）を最小値とすれば、前記最小値と最大値との間をコロニーを示す画素の輝度値の範囲として特定することができる。前記所定割合は、２０％に限定されず、撮像した培地の種類その他によって適宜選択することができる。
本実施形態では、二値化変換の際の閾値として、例えば前記最小値または最大値を使用することができる。また、前記最大値と最小値との平均値を使用してもよい。また、前記最小値から最大値まで輝度値をインクリメントし、最大のコロニー数となる輝度値を閾値としてもよい。更に、最小値から最大値まですべてラベリングを行い、その個数が安定したときの値を輝度値を閾値としてもよい。なお、「安定」の判断も任意であるが、例えば、輝度値Ｍのラベリング数をＲとした場合に、輝度値Ｍ−１、輝度値Ｍ−２・・・輝度値Ｍ−ｎにおけるラベリング数の平均（ＲＢ）を算出し、同様にして輝度値Ｍ＋１、輝度値Ｍ＋２・・・輝度値Ｍ＋ｎのラベリング数の平均（ＲＡ）を算出し、ＲＡ−ＲＢが０以下となった輝度値Ｍを閾値とすることができる。０以下となるＭが存在しない場合は、前記した最大値を採用してもよい。なお、ｎは２以上の正の整数であり、任意に設定することができる。
ＣＰＵ１０１は、色相補正グレースケール画像を構成する各画素の輝度値が閾値以上であるか否かを判別し、判別結果に従って各画素を二値化し、二値化画像を生成する（ステップＳ１０８）。二値化画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
（ｃ）連結成分検出工程
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０８に次いで、生成した二値化画像に基づいて、ステップＳ１０６と同様にして、コロニーを示す複数の画素として輝度値が０（黒）の連結成分を検出し、定法に従いラベル付けする（ステップＳ１０９）。なお、連結成分は、この連結成分に外接する矩形で近似することができる。連結成分に関する情報は、各連結成分の位置情報と共にＲＡＭ１０３に記憶される。連結成分の位置情報としては、コロニーを示す連結成分の座標がある。
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０８に次いで、生成した二値化画像に基づいて、ステップＳ１０６と同様にして、コロニーを示す複数の画素として輝度値が０（黒）の連結成分を検出し、定法に従いラベル付けする（ステップＳ１０９）。なお、連結成分は、この連結成分に外接する矩形で近似することができる。連結成分に関する情報は、各連結成分の位置情報と共にＲＡＭ１０３に記憶される。連結成分の位置情報としては、コロニーを示す連結成分の座標がある。
（ｄ）気泡発生青色コロニーカウント工程
ＣＰＵ１０１は、気泡を示す連結成分の座標の情報と、コロニーを示す連結成分の座標の情報とから、コロニーを示す座標の所定範囲内に気泡を示す座標が存在するコロニーを、気泡発生コロニーとして特定し、その数をカウントする（ステップＳ１１０）。コロニーと気泡との所定範囲は、気泡発生コロニーのみを培養した培地の撮像画像結果を参照し、カウントするコロニーの種類や培地組成、スキャン画像の大きさなどに基づいて決定することができる。具体的には、全気泡の平均直径を示す画素数に最大間隔係数、例えば１．３を乗じた画素数Ｚをコロニーと気泡との最大間隔に設定する。ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０９で検出したコロニーを示す連結成分の座標からＺ画素以内に、ステップＳ１０６で検出した気泡を示す連結成分の座標が存在するコロニーを気泡発生青色コロニーとして特定し、カウントする。カウント結果は、記憶装置１０４に記憶される。なお、前記した最大間隔係数も、任意に設定することができる。
ＣＰＵ１０１は、気泡を示す連結成分の座標の情報と、コロニーを示す連結成分の座標の情報とから、コロニーを示す座標の所定範囲内に気泡を示す座標が存在するコロニーを、気泡発生コロニーとして特定し、その数をカウントする（ステップＳ１１０）。コロニーと気泡との所定範囲は、気泡発生コロニーのみを培養した培地の撮像画像結果を参照し、カウントするコロニーの種類や培地組成、スキャン画像の大きさなどに基づいて決定することができる。具体的には、全気泡の平均直径を示す画素数に最大間隔係数、例えば１．３を乗じた画素数Ｚをコロニーと気泡との最大間隔に設定する。ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０９で検出したコロニーを示す連結成分の座標からＺ画素以内に、ステップＳ１０６で検出した気泡を示す連結成分の座標が存在するコロニーを気泡発生青色コロニーとして特定し、カウントする。カウント結果は、記憶装置１０４に記憶される。なお、前記した最大間隔係数も、任意に設定することができる。
（６−６）赤色コロニー検出工程
（ａ）色相バンドパスフィルタリング処理工程
ステップＳ１１０が終了すると、ステップＳ１０７と同様にして色相バンドパスフィルタリング処理工程（ステップＳ１１１）をする。具体的には、ＣＰＵ１０１は、ステップ１０７の色相バンドパスフィルタリング処理工程で記憶したコロニーの色相範囲を示す情報の中から、ヒストグラムのコロニーの色相範囲に含まれる２番目の山状領域（赤色系）を有効な色相範囲に設定する。
（ａ）色相バンドパスフィルタリング処理工程
ステップＳ１１０が終了すると、ステップＳ１０７と同様にして色相バンドパスフィルタリング処理工程（ステップＳ１１１）をする。具体的には、ＣＰＵ１０１は、ステップ１０７の色相バンドパスフィルタリング処理工程で記憶したコロニーの色相範囲を示す情報の中から、ヒストグラムのコロニーの色相範囲に含まれる２番目の山状領域（赤色系）を有効な色相範囲に設定する。
次いで、ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０３で得たグレースケール画像を構成する画素のうち、コロニーの色相範囲（赤色系）外の色相を表す画素を、輝度値の最大値に設定した色相補正グレースケール画像を形成する。ＣＰＵ１０１は、形成された色相補正グレースケール画像を、ＲＡＭ１０３に記憶する。上記により、赤色コロニー検出のための色相バンドパスフィルタリング処理を終了する。
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１１１の処理を完了すると、青色コロニー検出工程のステップＳ１０８、ステップＳ１０９、ステップＳ１１０と同様にして二値化画像形成（ステップＳ１１２）、連結成分検出（ステップＳ１１３）、気泡発生赤色コロニーカウント（ステップＳ１１４）を行う。
（６−７）カウント結果表示工程
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１１４の気泡発生赤色コロニーカウントを完了すると、カウント結果表示処理を実行する（ステップＳ１１５）。具体的には、ＣＰＵ１０１は、記憶装置１０４に記憶されているカウント結果をカラー画像と共に画面共に表示する。カウント数に加えて、気泡やコロニーを示す連結成分の位置、大きさ、形状、二値化画像形成の際の閾値情報などを表示してもよい。図９（ａ）は、カウント結果表示処理により提示される画面の一例であり、図９（ｂ）は図９（ａ）の部分拡大図である。図９（ａ）の左ウィンドウは撮像したカラー画像であり、右ウィンドウは、カラー画像に重ねて、検出された気泡発生コロニーの検出位置マークを×で表示し、検出された気泡に対応する不定形の連結成分を検出位置マーク＋で表示し、および検出された青色コロニーに対応する不定形の連結成分を矩形で近似して検出位置マークとして表示したものである。なお、図９には、理解が容易なように赤色の気泡発生コロニーのみを検出した結果を示した。赤色の気泡発生コロニーと共に青色の気泡発生コロニーを検出した場合は、色相の異なるコロニー毎に異なる検出マークを使用して表示してもよい。
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１１４の気泡発生赤色コロニーカウントを完了すると、カウント結果表示処理を実行する（ステップＳ１１５）。具体的には、ＣＰＵ１０１は、記憶装置１０４に記憶されているカウント結果をカラー画像と共に画面共に表示する。カウント数に加えて、気泡やコロニーを示す連結成分の位置、大きさ、形状、二値化画像形成の際の閾値情報などを表示してもよい。図９（ａ）は、カウント結果表示処理により提示される画面の一例であり、図９（ｂ）は図９（ａ）の部分拡大図である。図９（ａ）の左ウィンドウは撮像したカラー画像であり、右ウィンドウは、カラー画像に重ねて、検出された気泡発生コロニーの検出位置マークを×で表示し、検出された気泡に対応する不定形の連結成分を検出位置マーク＋で表示し、および検出された青色コロニーに対応する不定形の連結成分を矩形で近似して検出位置マークとして表示したものである。なお、図９には、理解が容易なように赤色の気泡発生コロニーのみを検出した結果を示した。赤色の気泡発生コロニーと共に青色の気泡発生コロニーを検出した場合は、色相の異なるコロニー毎に異なる検出マークを使用して表示してもよい。
比較のため、反射体３３０を配設せずにフラットベッドスキャナを使用して撮像したカラー画像に基づいて、上記と同様に操作して赤色の気泡発生コロニーをカウントした結果を図１０(ａ)、（ｂ）に示す。図９では、気泡発生コロニー数は９５であるが、図１０では、気泡発生コロニー数は８０であった。反射体が存在しないと、コロニーと培地とのコントラストが低く、検出が充分でなく、検出するコロニー数が減少していた。
なお、作業者は、適宜、入力装置１０５などを操作して、カラー画像を拡大、縮小、スクロールすることにより、提示された連結成分を自由に観察することができる。
ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１１５の処理を完了すると、コロニー計数処理を完了する。
（７）変形例
（７−１）変形例Ｉ
上記は、呈色の異なる２種の気泡発生コロニーをカウントする方法を記載した。しかしながら、本発明では気泡を発生しないコロニーをカウントすることができる。培地として寒天培地で培養したコロニーを対象に、説明する。
（７−１）変形例Ｉ
上記は、呈色の異なる２種の気泡発生コロニーをカウントする方法を記載した。しかしながら、本発明では気泡を発生しないコロニーをカウントすることができる。培地として寒天培地で培養したコロニーを対象に、説明する。
気泡を発生しないコロニーをカウントする場合は、前記した気泡検出工程は不要である。ＣＰＵ１０１は、ステップＳ１０１、ステップＳ１０２、ステップＳ１０３に次いで、色相バンドパスフィルタリング処理を（参照ステップＳ１０７）を行う。具体的には、ＣＰＵ１０１は、カラー画像の色相のヒストグラムを生成し、コロニーの色相範囲を特定する。生成したヒストグラムを表す情報は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。次いで、ステップＳ１０３で得たグレースケール画像を構成する画素のうち、コロニーの色相範囲外の色相を表す画素を、輝度値の最大値に設定したグレースケール画像を形成する。ＣＰＵ１０１は、形成された色相補正グレースケール画像を、ＲＡＭ１０３に記憶する。
次いで、ＣＰＵ１０１は、色相バンドパスフィルタリング処理工程を完了すると、生成した色相補正グレースケール画像を構成する画素の輝度値のヒストグラムを生成し、コロニーを表す画素の輝度値を特定し、当該輝度値を閾値として前記色相補正グレースケール画像に基づく二値化画像を形成する（参照ステップＳ１０８）。二値化画像は、適宜、ＲＡＭ１０３に記憶される。
ＣＰＵ１０１は、二値化画像に含まれるコロニーを示す画素からなる各連結成分を定法に従いラベル付けし、およびカウントする（参照ステップＳ１０９）。連結成分は、この連結成分に外接する矩形で近似することができる。
ＣＰＵ１０１は、前記連結成分カウント処理を完了すると、カウント結果表示処理を実行する（参照ステップＳ１１５）。具体的には、ＣＰＵ１０１は、記憶装置１０４に記憶されている連結成分情報などに基づいて、各連結成分の位置、大きさ、形状、ならびに、連結成分の個数を、カラー画像とともに画面内に表示する。
図１１は、カウント結果表示処理により提示される画面を示す図である。図１１（ａ）は、カラー画像に重ねて、検出された不定形の連結成分が矩形の連結成分に近似されて検出位置マークとして表示されている例を示す。図１１（ｂ）は、図１１（ａ）でカウントした寒天培地を被写体とし、反射体３３０を配設せずに、フラットベッドスキャナで撮像したカラー画像に基づいてコロニーを検出した結果を示す図である。反射体３３０を使用しない図１１（ｂ）は画像のコントラストが低いため、隣接する複数のコロニーが区分されずにカウントされ、正確なコロニーのカウントができていない。
ＣＰＵ１０１は、カウント結果を表示するとコロニー計数処理を完了する。
（７−２）変形例ＩＩ
１画像に複数の培地が含まれる場合は、培地を示す矩形領域を切出し、これを上記したカラー画像として扱うことができる。図１２に示す画像は、１画像に６枚のフィルム培地に対応する６箇所の培地層が含まれる態様である。これら６箇所の矩形領域を切り取り、保存する。このようにして矩形に切り取られた領域は、画像に含まれる記号、図１２の場合で例示すれば、４００３０５４１、４００３０５３１、４００３０５２１、４００３０５４２、４００３０５３２、４００３０５２２で識別することができる。まず、上記ステップＳ１０１において、まず、前記４００３０５４１で識別される画像を用いる。４００３０５４１で識別される画像についてステップＳ１１５を終了した後、順次、４００３０５３１、４００３０５２１、４００３０５４２、４００３０５３２、４００３０５２２で識別される画像についてステップＳ１０１からステップＳ１１５を行うことができる。
１画像に複数の培地が含まれる場合は、培地を示す矩形領域を切出し、これを上記したカラー画像として扱うことができる。図１２に示す画像は、１画像に６枚のフィルム培地に対応する６箇所の培地層が含まれる態様である。これら６箇所の矩形領域を切り取り、保存する。このようにして矩形に切り取られた領域は、画像に含まれる記号、図１２の場合で例示すれば、４００３０５４１、４００３０５３１、４００３０５２１、４００３０５４２、４００３０５３２、４００３０５２２で識別することができる。まず、上記ステップＳ１０１において、まず、前記４００３０５４１で識別される画像を用いる。４００３０５４１で識別される画像についてステップＳ１１５を終了した後、順次、４００３０５３１、４００３０５２１、４００３０５４２、４００３０５３２、４００３０５２２で識別される画像についてステップＳ１０１からステップＳ１１５を行うことができる。
（７−３）変形例ＩＩＩ
本発明は、上記実施形態に開示したものに限られない。
本発明は、上記実施形態に開示したものに限られない。
例えば、閾値の最小値と閾値の最大値とを決定する手法は、上記実施形態において開示した手法に限られない。例えば、コロニーを表す画素の輝度値の範囲があらかじめ予測可能な場合、閾値の範囲があらかじめ定められていてもよい。
また、色相バンドパスフィルタリング処理の手法も、上記実施形態において開示した手法に限られない。例えば、カラー画像に基づく種々の手法により、例えば、青色コロニーをカウントする場合は、２５６階調からなるグレーススケールの青系以外の配列に２５５を代入してもよい。カウント対象のコロニーの呈色が１種の場合などは、色相バンドパスフィルタリング処理はなくてもよい。
更に、色相バンドパスフィルタリング処理の前後や、グレースケール画像にガウシアンフィルタリング処理を施してもよい。さらに、ガウシアンフィルタリング処理の代わりに、移動平均フィルタ処理などが実行されてもよい。
一種類の気泡発生コロニーをカウントする場合は、前記したステップＳ１０１〜ステップＳ１１０に次いでステップ１１５を行い、カウント処理を終了してもよい。
１１ グレースケール画像取得部、１２ 反転画像取得部、１３ 連結成分抽出部、１４ 連結成分抽出部、１５ コロニー計数部、１６ カラー画像取得部、１７ 色相範囲特定部、２０ グレースケール画像生成部、３０ 記憶部、１００ コロニー計数装置、１０１ ＣＰＵ、１０２ ＲＯＭ、１０３ ＲＡＭ、１０４ 記憶装置、１０５ 入力装置、１０７ 撮像制御部、１０８ 撮像装置、１０９ 画像記憶部、１１０ 表示制御部、１１１ 表示装置、１２０ バス、２１０ 積層シート、２２０ 識別情報、２３０ 培地層、２５０ａ 気泡、２５０ｂ コロニー、２５０ｃ、２５０ｄ 気泡発生呈色コロニー
Claims (5)
- 微生物を培養した培地をスキャナでスキャンして生成した撮像画像に基づいて前記微生物のコロニーをカウントする方法であって、
前記スキャナは、光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナであり、
前記撮像画像は、前記原稿台に前記培地を載置し、前記原稿被覆蓋で前記培地を被覆し、前記光源を前記原稿台に向けて点灯した照射光が前記反射体で反射した反射光を読み取るものであり、
前記カウント方法は、前記撮像画像の培地領域の画素の輝度値に基づいて前記コロニーを検出する微生物由来コロニー検出工程と、
前記検出された微生物由来コロニーをカウントするカウント工程とを含むものである、コロニーのカウント方法。 - 前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を微生物由来コロニーとして検出する工程とを含むものである、請求項１記載のコロニーのカウント方法。 - 前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記撮像画像を色相バンドパスフィルタリング処理してコロニーの色相を決定し、前記培地領域を構成する各画素の輝度値のうち、前記処理により特定した色相以外の色相に最高値を代入した後にグレースケール化して色相補正グレースケール画像を取得する色相補正グレースケール画像取得工程と、
前記色相補正グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行う工程とを含むものである、請求項１または２記載のコロニーのカウント方法。 - 前記微生物が、コロニー形成時に気泡を発生する微生物であり、
前記微生物由来コロニー検出工程は、
前記培地領域のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得工程と、
前記グレースケール画像を白黒反転して反転画像を形成し、前記反転画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値よりも充分に低い輝度値の画素の領域を気泡としてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を気泡として特定する気泡特定工程と、
前記グレースケール画像に含まれる、前記培地領域の培地を表す画素の輝度値より充分に低い輝度値の画素の領域をコロニーとしてラベリング処理を行い、当該ラベリングされた領域を微生物由来コロニーとして特定するコロニー特定工程と、
前記コロニー特定工程で特定されたコロニーの所定範囲内に前記気泡特定工程で特定された気泡が存在するコロニーを気泡発生コロニー由来コロニーとして検出する気泡発生コロニー特定工程とを含むものである、請求項１記載のコロニーのカウント方法。 - 光源と原稿台と前記原稿台を被覆する原稿被覆蓋とがこの順に配設され、前記原稿被覆蓋の原稿台側に反射体が配設されたフラットベッドスキャナでスキャンして、微生物の培養後の培地の様子を示すカラー画像を取得するカラー画像取得手段と、
前記カラー画像のグレースケール画像を取得するグレースケール画像取得手段と、
前記グレースケール画像取得手段により取得されたグレースケール画像を、前記培地とコロニーとを識別する閾値で二値化して二値化画像を生成する二値化画像生成手段と、
前記二値化画像にラベリング処理を実行することにより前記二値化画像から連結成分を抽出する連結成分抽出手段と、
前記連結成分情報に基づいて、前記コロニーの個数を計数するコロニー計数手段と、を備える、
ことを特徴とするコロニー計数装置。
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| JP2013210608A JP2015073452A (ja) | 2013-10-07 | 2013-10-07 | コロニーのカウント方法およびコロニー計数装置 |
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