WO2000029441A1 - Nouvelle proteine receptrice couplee a la proteine g, son adn et son ligand - Google Patents

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WO2000029441A1
WO2000029441A1 PCT/JP1999/006283 JP9906283W WO0029441A1 WO 2000029441 A1 WO2000029441 A1 WO 2000029441A1 JP 9906283 W JP9906283 W JP 9906283W WO 0029441 A1 WO0029441 A1 WO 0029441A1
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WO
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salt
amide
dna
present
polypeptide
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Application number
PCT/JP1999/006283
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takuya Watanabe
Kuniko Kikuchi
Yasuko Terao
Yasushi Shintani
Shuji Hinuma
Shoji Fukusumi
Ryo Fujii
Masaki Hosoya
Chieko Kitada
Original Assignee
Takeda Chemical Industries, Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/566—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using specific carrier or receptor proteins as ligand binding reagents where possible specific carrier or receptor proteins are classified with their target compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor

Definitions

  • novel G protein-coupled receptor protein its DNA and its leakage field
  • the present invention relates to a novel polypeptide (sometimes referred to as a novel bioactive polypeptide in the present specification).
  • the present invention relates to a partial peptide, a DNA encoding the same, a receptor protein recognizing the polypeptide as a ligand, a partial peptide thereof, a DNA encoding the same, and the like.
  • the present invention relates to a novel polypeptide characterized by having an R amide-like structure and a partial peptide thereof. Background thigh
  • Peptides play an important role as a liver in regulating the functions of living organisms such as metabolism, growth, reproduction, ⁇ m, motility, and control of living organisms. These peptides convey information to cells by binding to specific receptors on Goto. Until now, many of such bioactive peptides have been seeded from male extracts and the like based on their bioactivity and their structures have been determined. In addition, ftifi has been used to produce bioactive peptides from fiber extracts and the like by using receptors.
  • FMRFamide one of the bioactive peptides
  • FMRFamide peptides There have been various reports on the biological activity of FMRFamide peptides.
  • the action of FMRFamide is known to promote and suppress cardiac pulsation, to contract and relax various lingual and visceral muscles and various traction muscles, as well as to hyperpolarize and depolarize nerve cells.
  • PrRP has been reported to have a prolactin release promoting activity
  • LPLRFamide has also been reported to have a nerve cell stimulating effect and a blood pressure increasing effect.
  • G protein conjugated guanine nucleotide-binding protein
  • 7 TMR seven-time receptor protein
  • G protein Recept protein is located on the surface of cells and ⁇ -cells in the body, and is physiologically important as a target for proteins that regulate the functions of those cells and organs, such as hormones, stalks and bioactive substances. Has a role. Recepto Yuichi sends a signal to the cell via binding to a bioactive substance, and this signal triggers various SiKs such as cell suppression.
  • physiological functions are regulated under the control of many hormones, hormones »quality, ⁇ 1 substances, or bioactive substances.
  • physiologically active substances are converted into various a3 ⁇ 4i in the living body, and each of them regulates its physiological function through the JiTT receptor protein.
  • There are many unknown hormones and other physiologically active substances in the body that are unknown, and many of them have not been reported on the structure of their receptor protein. Furthermore, it is often unknown whether subtypes of known receptor proteins are present.
  • Clarifying the relationship between substances that regulate complex functions in living organisms and their specific receptor proteins is a very important means for drug development.
  • the present inventors have made repeated meaning jobs in order to solve the above-mentioned rope, to prepare a primer one based on the sequence information, such as EST, and human ⁇ poly a (A) + RNA ⁇ RT- By PCR, we were able to ⁇ -force the cloning of cDNAs with new sequences. Further, the present inventors have determined that the polypeptide encoded by the obtained cDNA is a useful C * i3 ⁇ 4 ⁇ LPLRF amide-like, LPLRS amide-like, LPQRF amide-like or LPL RL amide-like peptide Was found.
  • the present inventors have designed a cDNA encoding a novel G protein-coupled receptor protein from the periphery of the rat brainstem and the human hypothalamus based on EST information generated by degenerated PCR. I decided to sow and basket the entire assassin array. Then, when this 3 ⁇ 4S sequence was inserted into the amino acid sequence, the 1st to 7th vulnerable regions were identified in the 3 ⁇ 4 ⁇ plot, and the protein encoded by these cDNAs was detected seven times, the common G protein It was confirmed to be a conjugated receptor Yuichi protein.
  • the present inventors have repeatedly studied the surface fiber and found that the above-mentioned R Famide-like polypeptide and the like have a ligand activity for the above-mentioned G protein-coupled receptor protein.
  • polypeptide or an amide or ester thereof, or a salt thereof, comprising an amino acid sequence identical or qualitatively identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a diagnostic agent comprising the DNA of the above (8) or (10) or the antibody of the above (17),
  • an agent comprising the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof or a salt thereof, or the partial peptide according to (3) or an amide or ester or a salt thereof,
  • a pharmaceutical comprising the polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof or a salt thereof, or the partial peptide according to (3) or an amide or ester or a salt thereof,
  • polypeptide or the amide or ester thereof or the salt thereof described in the above (1), or the partial peptide or the amide or ester thereof or the salt thereof described in the above (3) is referred to as ⁇ . If the polypeptide or amide thereof described in (1) above, A method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the compound or its ester or its salt, or the partial peptide or its amide or its ester or its salt according to the above (3);
  • polypeptide according to (1) or its amide or its esteryl or its salt, or the partial peptide as described in (3) or its amide or its ester or its salt, and column number: 37 Use a protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by 7, or a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof.
  • polypeptide comprising the polypeptide according to the above (1) or its amide or its ester or a salt thereof, or the above-mentioned (3) comprising the partial peptide or its amide or its ester or its salt or its salt as described in the above (3)
  • Salt screening kit
  • polypeptide according to (1) or an amide or ester thereof, or a salt thereof obtained by using the screening method according to (22) or the screening kit according to (24). (3) a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the partial peptide or the amide or the ester or the salt thereof according to the above description;
  • (32) the DNA according to (31), which has a base sequence represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56,
  • a diagnostic agent comprising the DNA of (31) or the antibody of (36),
  • a ligand comprising the protein or salt thereof according to (28) above, or the partial peptide or amide or ester thereof or salt thereof according to (30) and a protein according to (28). Or a screening kit for a compound or a salt thereof that changes the binding property to a salt thereof,
  • the present invention relates to the protein or salt thereof according to (28), wherein the antibody according to (36) is used.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is about 70% or more, preferably 80% or more of the amino acid m @ B sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • the polypeptide according to the above (1) which is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more homologous, has the homology of 1 or more, or its amide, its ester or its salt,
  • amino acid sequence that is substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is the OS sequence number: 1, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 33 and column number :
  • Amino Satoshi line represented by 50 Amino acid sequence from which 20 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably:!
  • amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 is at least about 50%, preferably at least about 70%, more than the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 Preferably at least 80%, more preferably at least about 90%, most preferably at least 95% homology.
  • amino acid sequence substantially identical to the amino ⁇ @ 5 sequence represented by SEQ ID NO: 37 is represented by: (!: 20 to 20 amino acids in the amino acid sequence represented by US sequence number: 37 (preferably 1 To: L5 ⁇ , more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3) amino acid sequence deleted, ⁇ SB sequence number: 1 to the amino acid sequence represented by 37 Amino acid sequence of 20 amino acids (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 3), represented by SB number: 37 In the amino acid chain:!
  • amino acids are transmuted with other amino acids
  • polypeptide according to (1) or an amide thereof, an ester thereof or a salt thereof which is obtained by using the screening method according to (22) or the screening kit according to (24).
  • a drug comprising a compound or a salt thereof that inhibits the activity of the partial peptide or the amide or ester or the salt thereof according to the above (63), the antibody according to the above (17), 0 ⁇
  • FIG. 1 shows the sequence of DNA encoding the polypeptide (human type) of the present invention obtained in Difficult Example 2 and the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence.
  • FIG. 2 shows a diagram showing a hydrophobicity plot of the polypeptide of the present invention.
  • FIG. 3 shows the DNA sequence encoding the polypeptide (human type) of the present invention obtained in Example 3 and the amino acid sequence derived from the salt SE sequence.
  • FIG. 4 shows the sequence of the DNA encoding the polypeptide (polytype) of the present invention obtained in Example 4 and the amino acid IB sequence derived from the Chinese nucleotide sequence.
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence of DNA encoding the polypeptide (rat type) of the present invention obtained in Example 5 (rat type) and! The amino sequence deduced from the sequence is shown.
  • FIG. 6 shows a comparison of the amino amino acid sequences of the polypeptides of the invention obtained in Examples 3, 4 and 5.
  • FIG. 7 shows the polypeptide of the present invention obtained in Example 6 (amino sequence of mouse and Shows the nucleotide sequence of the DNA encoding the peptide.
  • FIG. 8 is a graph showing the reactivity of the peptide to CHO cells expressing the ⁇ 7 ⁇ 022 L receptor by the cytosensor performed in Example 7.
  • ⁇ — ⁇ indicate VPNLPQRFamide (SEQ ID NO: 40).
  • FIG. 9 is a diagram showing the cAMP production inhibitory activity of MPHSFA LPLRFamide (SEQ ID NO: 39) and VPNLPQRFamide (SEQ ID NO: 40) on rOT7T022L-expressing CH0 cells performed in Example 10.
  • the mouth-mouth indicates MPHSFANLPLRFamide (SEQ ID NO: 39)
  • the parable-Qin indicates VPNLPQRFamide (SEQ ID NO: 40).
  • a polypeptide having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid mss sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention is a human (for example, guinea pig) , Rats, mice, chicks, egrets, bushes, sheep, whales, monkeys, etc.
  • Cells eg, m. Limb, vesicle,, glial cell, n orchid cell, somatic cell, mesangial cell, Langerin's cell, epidermal cell, epithelial cell, endothelial cell, m cell, mm, invertebrate, Sebum vesicles, ⁇ m.
  • Brain each of the brains (eg, retina, olfactory bulb, w, ⁇ sm.
  • Hippocampus withdrawal, inferior area, «cortex, medulla oblongata, cerebellum), cage, pituitary, stomach, outer kidney, fiber, Ito, Ko ⁇ , gall bladder, bone marrow, adrenal gland, skin, muscle, lung, i (eg,, small intestine), blood vessels, heart, thymus, face, 3 ⁇ 4 ⁇ glands, peripheral blood, m.
  • Testes ovaries, placenta, uterus, bones, joints, skeletal muscle, etc., and hematopoietic cells or their ffl cells (eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2 , WEH 1-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, M ⁇ LT_3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HSB-2 KE-37, SKW-3, HUT-78, HUT-102, H9, U937, THP-1, HEL, JK-1, CMK, KO-812, MEG-01) Or a synthetic polypeptide.
  • ffl cells eg, MEL, Ml, CTLL-2, HT-2 , WEH 1-3, HL-60, JOSK-1, K562, ML-1, M ⁇ LT_3, MOLT-4, MOLT-10, CCRF-CEM, TALL-1, Jurkat, CCRT-HS
  • the amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes about 70% or more, preferably about 80% or more, and more preferably im 90% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. More preferably, there may be mentioned an amino acid sequence having a homology of 95% or more.
  • amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes the amino acid sequence of amino acids 22 to 180 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; Is raised.
  • polypeptide having an amino acid E sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 of the present invention include, for example, a polypeptide substantially identical to the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 Amino acid sequence (for example, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 33 or 3 ⁇ 4 @ 2, amino acid sequence represented by column ID: 50, etc.), ⁇ ⁇ NO: 1
  • a polypeptide having substantially the same activity as the polypeptide having the amino acid sequence B represented by is preferred.
  • Examples of the substantially equivalent activity include, for example, a receptor of the polypeptide of the present invention (specifically, an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by the amino acid sequence represented by No. 37). ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ ⁇ Intracellular Ca 2+ deficiency, intracellular cAMP generation, intracellular cGMP, inositol-trilin ⁇ production, fine potential fluctuation, intracellular protein phosphorylation, activation of C-fos, extracellular pH fluctuation, etc.) And tin secretion regulating activity.
  • a receptor of the polypeptide of the present invention specifically, an
  • the activity such as the activity of controlling the secretion of somato or somatos secretion is equivalent (for example, about 0:! To 100 times, preferably about 0.5 to 10 times, more preferably 0.5 to 10 times).
  • the quantitative factors such as the hepatic amount of the polypeptide may be different.
  • the measurement of fine marks ⁇ boat characteristics and the like can be carried out according to the method of the method itself], for example, it can be measured according to the screening method described later.
  • the polypeptide of the present invention is represented by, for example, 0, column number: 1, sequence number: 8, sequence number: 14, sequence number: 18, sequence number: 33 or sequence number: 50.
  • Amino acid sequence in which 1 to 20 (preferably 1 to 15, more preferably 1 to 5, and more preferably 1 to 3) amino acids in the amino acid ⁇ SB sequence are deleted ® @ ⁇ Column No .: 1, SEQ ID No .: 8, Sequence No .: 14, SEQ ID No .: 18, SEQ ID No .: 33 or 3 ⁇ 4 @ 2 Amino acid sequence represented by Column No .: 50:!
  • more preferably 1 to 5 also include so-called muteins, such as polypeptides containing 1 to 3 amino acids substituted with other amino acids, or amino acids m @ B, which combine amino acids.
  • the amino acid sequence has been inserted, deleted or substituted as described above: ⁇ , Especially for insertions, deletions or substitutions! I won't.
  • polypeptides having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 A polypeptide comprising an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14; a polypeptide substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 A polypeptide comprising an amino acid sequence, a polypeptide comprising two amino acids that are substantially the same as the amino ⁇ SH sequence represented by SEQ ID NO: 33; a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50; And a polypeptide containing an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence to be obtained.
  • the polypeptide includes ⁇ ⁇ (amino terminal) and « ⁇ c * 3 ⁇ 4 (carboxyl) in accordance with the convention of peptide notation, including polypeptides containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. to, the polypeptides of the present invention, Ji * 3 ⁇ 4 normally carboxyl group (- COOH) or is a carboxylate (one COO-), C-terminal amide (one CONH 2) or an ester (one COOR) met You may.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as alkoxy le cyclohexane, for example, phenyl , alpha-C 6 _ 12 7 aryl group such as naphthyl, for example, benzyl, alpha-naphthyl, such as phenyl one _ 2 alkyl or alpha-naphth Rumechiru such phenethyl - _ 2 C 7 _ 14 7 aralkyl such as an alkyl group
  • a bivaloyloxymethyl group which is converted into an ester for oral use is used.
  • the polypeptide of the present invention has a carboxyl group or a carboxylate at C3 ⁇ 43 ⁇ 4 !, and the carboxyl group amidated or esterified is also included in the polypeptide of the present invention.
  • the ester of 3 ⁇ 4 for example, the above-mentioned ester and the like are used.
  • polypeptides of the present invention amino ⁇ S (eg, Mechionin residues) of the N-terminal ⁇ amino group protecting group (e.g., formyl group, etc. 6 ⁇ sill groups such as _ 6 Arukanoiru such Asechiru group ), Glutamine ⁇ S that has been cleaved in vivo and pyroglutamine-oxidized 3 ⁇ 4S, substituents on the side chains of amino acids in the liver (eg, 1 OH, -SH, amino groups, imidazo Ichirumoto, India Ichiru group, etc. Guanijino group) appropriate protecting groups (for example, formyl group, etc. _ 6 Ashiru groups such as _ 6 Arukanoiru group such Asechiru group) those are marrow in, or « Complex proteins, such as so-called glycoproteins, to which is bound.
  • amino ⁇ S e.g, Mechionin residues
  • the N-terminal ⁇ amino group protecting group e
  • polypeptide of the present invention include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • a human-derived polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 (FIG. 1); a human-derived polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8; A polypeptide derived from the rat (FIG. 4), the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 18 and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33
  • a mouse-derived polypeptide (FIG. 7), a rat-derived polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50, and the like are used.
  • polypeptide of the present invention may be a precursor of the following partial peptide.
  • the activity of the following partial peptide eg, Horin * ⁇
  • the partial peptide of the polypeptide of the present invention is a partial peptide of the polypeptide of the present invention that has been hated, and is preferably a receptor for the partial peptide of the polypeptide of the present invention (specifically, SEQ ID NO: 37 A protein characterized in that it contains the same or substantially the same amino acid H sequence as the amino ⁇ sequence represented by 7 or a protein expressed by applying to a cell that expresses the same! 1 ⁇ ((hereinafter simply fine! ⁇ a!
  • a peptide having an R F amide, R S amide or RL amide structure is preferable.
  • the RF Amide structure refers to the C-terminus of the peptide is in Argi nine (arginine) -Phenylal nine (phenylene Ruaranin) -M 2 structure
  • the RS Amide structure peptides of the Arginine (Arginine) - serine (serine) - refers to that is in H 2 structure
  • the RL Amide structure C «is arginine peptide (arginine) -Leucine (leucine) - means that are Do One to NH 2 structure. .
  • Amino acid represented by SEQ ID NO: 14 8th 1st (Met)-92nd (Phe), 124th (Val) ...: L3 1st (Phe), 1st A peptide comprising the amino acid sequence of (Met) to 92nd (Phe) or 1st (Met) to 13th (Phe),
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Preferred examples include a peptide containing the amino acid sequence of the 84th (Pro) to 94th (Phe) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 50.
  • amides of these peptides are preferred.
  • C «of the peptide represented by the amino acid sequence from the 81st (Met) to the 92nd (Phe) of the amino acid sequence represented by column No. 1 is amidated (_CONH 2 ) Peptide (SEQ ID NO: 39), C * 3 ⁇ 40 amidation of the peptide represented by the amino acid sequence from the 101st (Ser) to the 112th (Ser) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (-CONH 2 ) peptide (SEQ ID NO: 41) and the amino acid represented by D ⁇ H column number: 1 ⁇ the 124th (Val) to: L3 1st (Phe) amino acid ⁇
  • the C-amidated (-C ⁇ NH 2 ) peptide (SEQ ID NO: 40) of the peptide represented by column H is exemplified.
  • the partial peptide of the present invention may have 1 to 5 (preferably 1 to 3 depleted amino acids in its amino acid sequence, or 1 to 5 (preferably 1 to 3 Amino acids work or in the amino acid sequence 15:! -5 (preferably 1-3 amino acids are inserted, or 1-5 amino acids in the amino acid sequence ( ⁇ Preferably, one to three amino acids It may contain an amino acid sequence substituted with another amino acid, or may contain an amino acid sequence E combining them.
  • the C-terminus of the partial peptide of the present invention is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (1 C ⁇ 0-1). 2 ) or an ester (one COOR) (R is as defined above). Among them, those having a C-terminal amide (one CONH 2 ) are preferred.
  • the partial peptides of the present invention include those in which the amino group of the amino acid 3 ⁇ 4S (for example, methionine 3 ⁇ 4S) is protected by a protecting group, and the same as the polypeptide of the present invention, which is abominable.
  • Complex peptides such as sugar sugars are also included.
  • the partial peptide of the present invention can be used as an S ! Source for preparing antibodies, it is not necessary to have a cell stimulating activity or a somatosustin secretion regulating activity.
  • the salt of the polypeptide or its amide or its ester or its partial peptide or its amide or its ester according to the present invention may be a physiologically acceptable acid (eg, unscrupulous, arsenic), an assault (eg, alkali metal) : ⁇ ) And the like, and especially preferred are acid operable salts which are acceptable for physiological glue.
  • Such salts include, for example, oxalic acid (eg,, phosphoric acid, oxalic acid, salts with ⁇ , or organic acids (eg, acetic acid, formic acid,
  • the polypeptide of the present invention or a salt thereof can be produced by a method for purifying a polypeptide known per se from human cells or human cells as described above, or a DNA encoding the polypeptide described below.
  • the kit can also be prepared by culturing a trait containing-. Further, it can be produced according to the peptide synthesis method described later.
  • the human or mammalian tissues or cells are homogenized, and then extracted with an acid or the like. Purification can be performed by combining chromatography such as chromatography.
  • a polypeptide synthetic resin that is sold and sold on the market can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethylphenylacetamidomethyl resin, polyacrylamide resin, 4- (2 ', 4'-dimethoxyphenyl-hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2', 4'-dimethoxyphenyl) Lou Finoc aminoethyl) Phenoxy resin.
  • an amino acid in which the amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin in accordance with the sequence of the target polypeptide and in accordance with its own combination method.
  • the polypeptide is cleaved from the resin, and at the same time, various protecting groups are released. humiliate.
  • carbodiimides are particularly preferable.
  • the carbodiimides include DCC, ⁇ , ⁇ '-diisopropylcarboimide, ⁇ -ethyl! / "" '-(3-dimethylaminoprolyl) carbodiimide, etc.
  • Activation by these is racemic il
  • Add protective amino acids directly to the resin with ⁇ J additives eg, HOBt, HOOBt
  • 1 ⁇ 51 can be selected from Note that it is known that it can be used for the polypeptide condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetoamide, N-methylpyrrolidone, halogenated TKs such as methylene chloride, chloroform, and trifluoroethanol.
  • Alcohols such as dimethyl sulfoxide, pyridine, dioxane, tetra Ethers such as hydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitrile, esters such as methyl acetate and ethyl acetate, and mixtures of these lotuses are used.
  • Reaction is polypeptide! 1 ⁇ 2Selected from the range known to be able to adjust, usually selected from the range of about 120 to 50.
  • the activated amino acid derivative is usually used in 1.5 to 4 ⁇ 3 ⁇ 4.
  • sufficient condensation can be performed by repeating the condensation without removing the protective group if the condensation ability is sufficient. If a satisfactory result is not obtained even after repeating the reaction, unreacted amino acids can be acetylated using glacial acetic acid or acetylimidazole so that the subsequent reactions are not affected. .
  • Examples of the protecting group for the starting amino group include Z, Boc, t-pentyloxycarbonyl, isobornyloxycarbonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, CutZ, Br-Z, and adamanti.
  • Roxycarbonyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, formyl, 2-nitrophenylsulfenyl, diphenylphosphinothioyl, Fmoc and the like are used.
  • the lipoxyl group can be, for example, alkyl esterified (eg, methyl, engineered, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc., fibrous, branched or cyclic) Alkyl ester, aralkyl esterification (for example, benzyl ester, 4-nitrobenzyl ester, 4-methoxybenzyl ester, 4-chlorobenzyl ester, benzhydryl ester), phenacyl ester, benzyloxycarbonyl hydrazide, t- It can be protected by butoxycarbonyl hydrazide or trityl hydrazide.
  • alkyl esterified eg, methyl, engineered, propyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl
  • Serine groups can be consolidated, for example, by esterification or etherification.
  • Suitable groups for this esterification include, for example, groups derived from carbonic acid such as fiber (C ⁇ e alkanol group, aroyl group such as benzoyl group, benzyloxycarbonyl group, ethoxycarbonyl group, etc.).
  • groups suitable for etherification include, for example, a benzyl group, a tetrahydropyranyl group, a t-butyl group and the like.
  • Protecting groups for the phenolic JH47] acid group of tyrosine include, for example, BzK Cl r BzK 2-nitrobenzene
  • BzK Cl r BzK 2-nitrobenzene For example, benzyl, Br-Z, t-butyl, etc. are used.
  • imidazole protecting group for histidine for example, Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethylbenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethyl, Bum, Boc, Trt, Fmoc and the like are used.
  • Examples of the activated carboxylic acid group of the starting material include, for example, acid anhydrides, azides, active esters [alcohols (eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2 , 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, ⁇ 0 ⁇ , ⁇ -hydroxysuccinimide, ⁇ -hydroxyfurimide, ester with ⁇ 0 ⁇ ], etc.
  • active esters eg, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorophenol, 2 , 4-dinitrophenol, cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, ⁇ 0 ⁇ , ⁇ -hydroxysuccinimide, ⁇ -hydroxyfurimide, ester with ⁇ 0 ⁇ ]
  • Activation of the raw amino group For example, phosphoric acid amide is used.
  • Examples of methods for protecting groups include 3 ⁇ 4S ⁇ in a waterline stream in the presence of a marauder such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous fluorine, methanesulfonic acid, With trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid, or a mixture thereof, with physics, diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc .; Also used.
  • the above-mentioned acid treatment is carried out at about "-20" to "40".
  • a cation scavenger such as hydride, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • a cation scavenger such as hydride, 1,4-butanedithiol, 1,2-ethanedithiol, etc.
  • the 2,4-dinitrophenyl group used as an imidazole protecting group of histidine is thiopheno.
  • the formyl group used as an indole-protecting group for tributofan after the treatment with triethylamine is not limited to the above-mentioned deprotection with 1,2-ethanedithiol, 1,4-butanedithiol, etc. It is also removed by alkali treatment with ammonia or the like.
  • the protection of the functional group which should not be involved in the reaction of the material and the protective group, the protective group, the activation of the functional group involved in the reaction, and the like can be selected from the following groups or the means of ⁇ 0.
  • the amide form of the polypeptide or partial peptide of the present invention for example, First, after protecting the ⁇ -carboxyl group of the carboxy amino acid by amidation, the peptide (polypeptide) chain is extended to a desired chain length on an amino fiber, and then the ⁇ -amino group of the peptide chain is protected.
  • a polypeptide having only a group removed and a polypeptide having only a carboxyl group protecting group at C and the like are produced, and both polypeptides are condensed in a mixed solvent as described above. Details of the condensation reaction are the same as described above. After purifying the protected polypeptide obtained by the condensation, all protecting groups are removed by the above method! Then, a desired crude polypeptide can be obtained. The crude polypeptide is purified by various means of purification, and the main transfection is performed to obtain a desired amide of the polypeptide or the partial peptide.
  • an ester of the polypeptide or partial peptide of the present invention for example, after condensing the ⁇ -carboxyl group of a carboxyl amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, in the same manner as the amide of the polypeptide, It is capable of obtaining an ester of the desired polypeptide or partial peptide.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can be produced according to a method for synthesizing the peptide itself, or by cleaving the polypeptide of the present invention with an appropriate peptidase.
  • a method for synthesizing a peptide for example, any of a solid phase synthesis method and a liquid phase synthesis method may be used. That is, a partial peptide or an amino acid that can constitute the partial peptide of the present invention is condensed with a stemoyl moiety, and when the product has a protecting group, the desired peptide is obtained by adding a protecting group. I can do it. Examples of the method for condensing ⁇ ⁇ ! And the method for protecting groups include the methods described in (II) to (D) below.
  • the partial peptide of the present invention can be purified by a conventional purification method after the reaction, for example, a combination of “extraction”, “distillation”, column chromatography, “liquid chromatography”, and recrystallization. If the partial peptide obtained by the above method is difficult, it can be converted to an appropriate salt by the method of or a method analogous thereto.On the contrary, the age obtained with the salt can be determined by a known method or a method analogous thereto.
  • the DNA encoding the polypeptide of the present invention which can be converted into a form or another salt, may be any DNA containing the above-described nucleotide sequence encoding the polypeptide of the present invention. Anything may be used. In addition, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from abused cells 'fibers, cDNA library derived from tiifS cells', or synthetic DNAs.
  • the vector for the library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • amplification can be performed directly by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells and tissues described above.
  • DNA encoding the polypeptide of the present invention examples include, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34, and SEQ ID NO: 15
  • the salt contains the DNA containing the SSH sequence, as well as the “SH sequence number: 2, SEQ ID NO.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 51 Hybridizable with the assault sequence represented by SEQ ID NO: 51 under high stringent conditions
  • the DNA that can be cut is, for example, each represented by '@ ⁇ ; column number: 2; ⁇ sequence and about 70% or more, preferably tt-shape 80% or more, more preferably 90% or more, more preferably about 90% or more 95% or more homology; DNA containing ⁇ S sequence is used.
  • Eighty-dive-yong-yeon was described in the method of ⁇ itself or a method analogous thereto, for example, in Molecular Cloning 2nd (J.
  • the procedure can be performed according to the method described in the instruction manual for the age of a commercially available library. More preferably, it can be carried out according to eight stringent conditions.
  • High stringency conditions include, for example, a sodium mystery of about 19 to 40 mM, preferably 19 to 20 OmM, and a temperature of about 50 to 70, preferably about 60 to 6 The condition of 5 is shown.
  • sodium is most preferably about 19 mM and about 65 :.
  • DNA encoding the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 a DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or the like is used.
  • DNA encoding the polypeptide that encodes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 DNA having the sequence represented by SEQ ID NO: 9 is used, and the DNA represented by SEQ ID NO: 14 is used.
  • the DNA encoding the polypeptide that encodes the @ 2 sequence is, for example, a DN that represents the assault sequence represented by SEQ ID NO: 15, and the rain code: the amino acid represented by 18
  • a DNA encoding a polypeptide having a sequence a DNA having an assault sequence represented by SEQ ID NO: 19 is used, and a DNA encoding an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 33 is encoded.
  • a DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 34 or the like is used.
  • SEQ ID NO: 51 The DNA having the SH sequence represented by is used.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention may be any DNA that encodes the aforementioned partial peptide of the present invention; Further, it may be any of genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from cells that dislike S cells, cDNA library derived from cells that disfavored cells, or synthetic DNA.
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention is represented by, for example, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 51 DNA having a partial nucleotide sequence of DNA having a nucleotide sequence, or SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34 or ⁇
  • a DNA sequence is used.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, Sequence number. '34 or DNA represented by SEQ ID NO: 51. Show significance.
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 51 Represented by: Polypeptide encoded by DNA capable of hybridizing with ⁇ S sequence
  • the peptide can be prepared in the same manner as in the method for producing the polypeptide of the present invention described below, and the amide, ester, and salt of the polypeptide are the same as the amide, ester, and salt of the polypeptide of the present invention. And the like.
  • Amino acid represented by SEQ ID NO: 1 8th 1st (Met)-92nd (Phe), 101st (Ser)-112th (Ser), 124th (Val) ⁇ 1 3 1st (Phe), 1st (Met)-9th (Phe), 1st (Met) ⁇ 1 1 2nd (Ser) or 1st (Met) ⁇ 1 3 Encodes a peptide containing the first (Phe) amino acid sequence; DNA containing sequenced DNA, or DNA containing a sequence that is sequenced with them under stringent conditions.
  • DNA that hybridizes with them under highly stringent conditions DNA containing the DNA with the ⁇ 3 ⁇ 4 sequence,
  • DNA containing the DNA includes the DNA having the sequence ⁇ i ⁇ represented by SEQ ID NO: 42 (the sequence represented by SEQ ID NO: 2: »
  • Amino acids from the 1st (Ser) to the 1st (Ser) amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 ⁇ Code the peptide containing the @H sequence ii As a DNA containing the DNA, a DNA having an associative sequence represented by SEQ ID NO: 43 (DNA having nucleotides 301 to 336 of the sequence represented by SEQ ID NO: 2 DNA)
  • Salt encoding the peptide containing the amino acid sequence from the first (Met) to ninth (Phe) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 45 (DNA representing the first to 276th; ⁇ S of the ⁇ IB sequence represented by SEQ ID NO: 2) is used.
  • the peptide containing the amino acid sequence of the 1st (Met) to 112th (Ser) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is encoded; ⁇
  • the DNA includes DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 46 (the first to third bases of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 are the same).
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 includes a peptide encoding the peptide including the first (Met) to 131st (Phe) amino acid sequence and a DNA including the IS sequence.
  • 3 ⁇ 4T ⁇ D ⁇ ⁇ is represented by SEQ ID NO: 47; »DNA representing the sequence (represented by SEQ ID NO: 2; ⁇ 5S5 from the 1st to 393rd 3 ⁇ 4S And DNA containing #T DNA.
  • polypeptide of the present invention or its partial peptide, the receptor protein or its partial peptide of the present invention described below, and DNA encoding these proteins or peptides are labeled by a method known per se. May be labeled specifically, isotope-labeled; ⁇ labeled (for example, fluorescent labeling with fluorescein, etc., biotinylated or ⁇ -toned) Can be labeled specifically, isotope-labeled; ⁇ labeled (for example, fluorescent labeling with fluorescein, etc., biotinylated or ⁇ -toned) Can be
  • Polypeptides or partial peptides of the present invention (hereinafter, in the description of cloning and research of DNAs encoding these polypeptides, etc., when these polypeptides and the like are simply abbreviated as polypeptides of the present invention)
  • the DNA fragment can be amplified by the PCR method of the present invention using the synthetic DNA primers for the partial associative sequence of the polypeptide of the present invention, or an appropriate vector.
  • the DNA incorporated into the DNA is purified using a DNA fragment or a synthetic DNA encoding the " ⁇ " or region of the polypeptide of the present invention.
  • Hybridization can be performed according to, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). . In addition, it can be carried out according to the method described in the instruction manual for the age and size of commercially available libraries.
  • the conversion of the salt group can be performed by a known method such as the Guppedduplex method or the Kimkel method using a kit such as MutanTM-G (Takara Co., Ltd.) or MutanTM-K (Takara Shuzo Co., Ltd.). Alternatively, it can be performed according to a method equivalent thereto.
  • the DNA encoding the cloned polypeptide can be subjected to ⁇ ffl digestion with a peptide or digestion with a linker, if desired, or as desired.
  • the DNA may have ATG as its translation initiation codon at its 5 '5', and TAA, TGA or TAG as its translation stop codon at its 3 '. These translation initiation codons and stop codons can also work using a suitable synthetic DNA adapter.
  • the expression vector for the polypeptide of the present invention includes, for example, (a) cutting out a DNA fragment of interest from DNA encoding the polypeptide of the present invention, and (mouth) a promoter in an appropriate expression vector. Can be manufactured by connecting to the downstream of
  • the vector examples include a plasmid derived from a bacterium (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUCl3), a plasmid derived from dying (eg, pUBl10, pTP5, pCl94), a plasmid derived from yeast (eg, pSHl9, pSHl5) ), Bacteriophage such as ⁇ phage, animal viruses such as retrovirus, vaccinia virus, and baculovirus, as well as pAl-11, pXTl, pRc / CMV, pRc / RSV, and cDNAI / Neo.
  • a plasmid derived from a bacterium eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUCl3
  • a plasmid derived from dying eg, pUBl10, pTP5, pCl94
  • the promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for expression of the remaining ⁇ .
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ using animal cells as a host includes SRa promoter, SV40 promoter, HIV / LTR promoter, CMV promoter and HSV-TK promoter. Of these, it is preferable to use CMV (Cytomegalovirus) Promo Overnight, SRa Promo Overnight, and the like.
  • the age at which the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia is as follows: trp promoter, lac promoter, rec A promoter, ⁇ PL promoter, 1 ⁇ ⁇ promoter, ⁇ 7 promoter, etc.
  • a PH05 promoter When the genus is a genus, it is preferable to use a PH05 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, etc. for the age of the host, such as SP01 promoter, SPO2 promoter and penP promoter.
  • ⁇ ⁇ whose host is a kelp cell, is preferably a polyhedrin promoter, P10 promoter, etc.
  • an expression vector containing, if desired, an enhancer, a splicing signal, a PoUA signal, a selection marker, and an SV40 replication origin (hereinafter sometimes abbreviated as SV40ori) may be used.
  • selection markers include, for example, dihydroenzyme (hereinafter sometimes abbreviated as dh fr).
  • dh fr dihydroenzyme
  • Amp 1 Amp 1
  • Neomycin resistance ffitfe ⁇ (hereinafter, although Ru Neo gamma approximately TT, G418iftt) and the like.
  • the target gene can be selected even on a thymidine-free medium.
  • a signal sequence suitable for the host is used on the N-terminal side of the polypeptide of the present invention. If the host is a bacterium belonging to the genus Escherichia, the Pho A signal sequence, Omp A signal sequence, etc., and if the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the ⁇ -amylase. Signal sequence, subtilisin. The age of the host is MFa. Signal sequence, SUC 2 'signal sequence, etc. If the host is a somatic cell, insulin. Signal sequence, a-interferon signal sequence, antibody molecule. A signal sequence or the like can be used. A transformant can be produced using the thus constructed # 1 to # 4 vector containing DNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • hosts include Escherichia, Notils, yeast, M ⁇ cells, insects, and animals. Cells and the like are used.
  • Escherichia examples include, for example, Escherichia coli Kl 2 ⁇ DH1 [Procedures of the National Academy of Sciences of the United States of America] Natl. Acad. Sci. USA), 60, 160 (1968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of 'Molecular] 'Zoology (Journal of Molecular Biology)], 120 volume, 517 (1978)], 101 C journal' ob molecular 'biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics (Genetics), 39, 440 (1954)].
  • Bacillus bacteria examples include, for example, Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)], 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)].
  • yeast examples include Saccharomyces cerevisiae A
  • the age of a virus is Ac NPV, a strain derived from a larva of a night rob moth! ⁇ Vesicle
  • S fM podoptera frugiperda cell
  • TM cells derived from Trichoplusia ni eggs cells derived from Mamestra brassicae or cells derived from Estigmena acre are used.
  • viruses When the virus is BmNP V, a silkworm-derived strain im (Bombyx mori cell; BmN » etc. is used.
  • Sf cell for example, Sf9 cell (ATCC CRL1711), Sf21 cell (above, Vaughn, JL et al., Inn 'Vipo (ATCC CRL1711), Sf21 cell (above, Vaughn, JL et al., Inn 'Vipo (
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 315, 592 (1985)].
  • animal cells include cell COS—7, Vero, Chinese hamster cell C HO (hereinafter abbreviated as CH ⁇ cell), dh fr ⁇ ⁇ -deficient Chinese muss Yuichi cell CHO
  • CHO (dhfr-) cells mouse L cells, mouse AtT-20, mouse myeoma cells, rat GH3, human FL cells, and the like.
  • the bacterium of the genus Bacillus can be transformed by the method described in, for example, Molecular & General Genetics, Vol. 168, 111 (1979).
  • Insect cells or insects can be transformed, for example, according to the method described in Bio Z Technology (Bio / Technology, 6, 47-55 (1988)).
  • Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained.
  • carbon sources include glucose, dextrin, soluble 3 ⁇ 4 » and sucrose.
  • ⁇ ⁇ sources include ammonia, m ⁇ m, Fibers or organic substances such as corn chip liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract and the like, and inorganic substances include, for example, calcium chloride, phosphoric acid: sodium nitrate, magnesium chloride and the like.
  • yeast, vitamins, raw: 3 ⁇ 4Si factor, etc. may be added. PHtt of the medium 5 ⁇ 8 force wall.
  • Examples of a medium for culturing Escherichia bacteria include, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acids [Miller, Journal of Obsexpermentin] Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-43, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • M9 medium containing glucose and casamino acids Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecular Genetics), 431-43, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972].
  • 3 / 3-indolylacrylic acid can be added in order to make the boat motor more efficient.
  • culturing is usually performed at about 15 to 43 for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and / or aeration can be added.
  • cultivation can be carried out at about 30 to 40 for about 6 to 24 hours, and a win can be obtained by the following method.
  • Burkholder Burkholder Minimal medium [Bostian, K.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. US, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
  • the medium used is Grace's Insect.
  • ⁇ 3 tranquil additives are used.
  • the pH of the medium is preferably adjusted to about 6.2 to 6.4.
  • Cultivation 3 ⁇ 41 Always at about 27 ° C for about 3 to 5 days, and add aeration and / or aeration as necessary. I can.
  • examples of the medium include MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 122, 501 (1952)], DMEM Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640 medium [Journal of the American Medical Association, Vol. 199, 519 (1967)] 199 medium [Proceding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)].
  • the pH is about 6-8.
  • Culture is usually performed at about 30 to 40X for about 15 to 60 hours, and if necessary, aeration is added.
  • polypeptide of the present invention can be produced in the cells of a transformant or the like.
  • polypeptide of the present invention can be produced from the culture by, for example, the following method.
  • the polypeptide of the present invention is extracted from cultured cells or cells, the following method is used after culture.
  • the cells or cells are collected, and the resulting cells are ⁇ -plated in an appropriate buffer. After the cells or cells are destroyed by freezing and thawing, there is a method of obtaining polypeptide effluent by centrifugation or filtration.
  • the buffer may contain a protein denaturing agent such as urinary guanidine or a surfactant such as Triton X-100 TM .
  • the method itself is separated from the vesicles and the supernatant, and the supernatant is collected.
  • the purification of the polypeptide contained in the culture supernatant or the extract obtained in this manner can be performed by a combination of the isolation and purification methods.
  • Methods for separating and purifying these species include methods for determining the solubility such as salt solubility, dialysis, victory filtration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrodialysis.
  • the polypeptide thus obtained When the polypeptide thus obtained is obtained in a waking body, it can be converted into a salt by its own method or a method analogous thereto. It can be converted into the body or other salts by any method or its equivalent.
  • the polypeptide produced by the human body can be arbitrarily modified or partially removed by the action of an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification.
  • an appropriate protein-modifying enzyme for example, trypsin, chymotrypsin, arginyl endopeptidase, protein kinase, glycosidase and the like are used.
  • the presence or activity of the thus produced polypeptide of the present invention or a salt thereof can be measured by a binding experiment with a labeled ligand and an enzyme immunoassay using a specific antibody.
  • receptor-protein The polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt (hereafter referred to as receptor-protein) has a function as a receptor.
  • a receptor protein containing the same or substantially the same amino sequence as the amino ⁇ S sequence represented by ⁇ number: 37 can be mentioned.
  • the receptor protein of the present invention may be, for example, a human mammal (for example, guinea pig, rat, mouse, mouse, egret, bush, sheep, horsetail, monkey, etc.) in any cell (eg, invertebrate, sight cell, Glial cells, knee) 3 cells, bone cells, mesangial cells, Langerhans cells, epidermal cells, upper cells, inner cells, m, mm, cells, adipocytes, mm (e.g., macrophage, T cells , B cells, natural killer cells, fertilizers, neutrophils, basophils, eosinophils, warfare), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, Cells, ff cells or cells, or their precursors, stem cells or cancer cells, etc., or cells of the blood system, or any cell that contains those cells, for example, the brain, various parts of the brain (eg, Threat, m
  • the amino acid sequence S5 which is substantially the same as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, may be, for example, about 50% or more, preferably 70% or more, preferably the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37. % Or more, more preferably about 80% or more, even more preferably about 90% or more, and most preferably about 95% or more.
  • Examples of the protein having an amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 of the present invention include, for example, an amino acid sequence substantially identical to the amino amino sequence represented by SEQ ID NO: 37 It is preferable to use a protein having substantially the same activity as that of the amino group m @ H represented by the ban-no: 37 sequence. # 1 "proteins containing amino acid sequences.
  • Substantially the same quality of activity includes, for example, ligand binding activity, signal transduction activity, and somatosustin secretion regulating activity. Substantially the same means that their activities are physically the same. Therefore, activities such as ligand binding activity, signa JHf3 ⁇ 4e3 ⁇ 4 activity or somatotostin secretion regulating activity are equivalent (eg, about 0.01 to 100 times, preferably 0,5 to 20 times, Preferably, tt (0.5 to 2 times), but quantitative factors such as ⁇ of these activities and the molecular weight of the protein may be different.
  • Activity such as ligand binding activity, signaling if signaling activity or somatosustin secretion regulating activity can be measured in accordance with the method of the method itself. For example, the determination of a key ligand is determined by screening. You can measure according to the method.
  • the receptor protein of the present invention includes 1 or 2 or more amino acids in the amino acid sequence represented by SH sequence number: 37 or SEQ ID NO: 54 (preferably: from! To 30 ⁇ , More preferred Is 1 to: L, and more preferably several (one or two) amino amino acid deleted sequences; (Dffi sequence number: 37 or amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54; 1 or An amino acid sequence in which two or more (preferably 1 to 30, more preferably 1 to 10, and still more preferably several (1 or 2)) amino acids work; (H2 column number: 3 7 or Wffi column number: 54 1 or 2 or more in amino ⁇ H column represented by 4 ($?
  • Or 1 to 30 ⁇ more preferably 1 to: 0 Ligm, more preferably for example, an amino acid sequence in which several (one or two) amino acids are substituted with other amino acids, or a protein containing an amino ⁇ S sequence in which ⁇ ⁇ ′′ is combined is also used.
  • the receptor protein in the present specification is ⁇ (amino) at the left end and (carpoxyl) at the left end.
  • the receptor protein including the amino-hidden sequence represented by SEQ ID NO: 37 includes
  • c ⁇ m is usually a carboxyl group (—COOH) or a carboxylate (one C ⁇ O—), but the C terminal is an amide (one CONH 2 ) or an ester ( (One COOR).
  • R in the ester for example, methylene, Echiru, n- propyl, alkyl groups such as isopropyl or n- butyl, cyclopentyl, C 3 _ 8 cycloalkyl group such as alkoxy le cyclohexane, for example, phenyl , C 6 _ 1 2 7 aryl group, such as ⁇ - naphthyl, for example, C 7 benzyl, such as phenylene Lou alkyl or ⁇ - naphth ⁇ - Nafuchirire one _ 2 alkyl group such Rumechiru such phenethyl - 1 4 Ararukiru
  • a bivaloyloxymethyl group used as an ester for oral use is used.
  • the receptor protein of the present invention 3 ⁇ 4 has a carboxyl group (or carboxylate): ⁇ , those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the receptor protein of the present invention.
  • this ester for example, the above-mentioned C-ester and the like are used.
  • the receptions evening one protein of the present invention is a polypeptide as defined above, methylcarbamoyl Onin Amino group protecting groups ⁇ (e.g., formyl group, etc. Ashiru groups such as C 2 _ 6 Arukanoiru group such Asechiru) N ij is cut and produced in vivo Daltamyl group oxidized by pyroglutamine, Substituent on side chain of amino acid in liver (eg
  • a suitable protecting group e.g., formyl group, C 2 _ 6 Arukanoiso such Asechiru ⁇ _ 6 ⁇ such Or a complex protein such as a so-called glycoprotein to which a male chain is bound.
  • receptor protein of the present invention examples include, for example, a rat receptor protein containing an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, and a human receptor represented by SEQ ID NO: 54. Proteins are used.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention may be any peptide as long as it is a partial peptide of the receptor protein of the present invention, and for example, the partial peptide of the receptor protein of the present invention. Among them, a substance exposed outside the cell and having a receptor binding activity is used.
  • a partial peptide of the receptor protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or «S3 sequence number: 54 a partial peptide of the ⁇ ⁇ -plot healing TB ⁇ region (Hydrop il ic) site). Further, a peptide partially containing a hydrophobic (hydrophobic) site can also be used. A peptide containing individual domains may be used, but a peptide containing a plurality of domains at the same time may be used.
  • the number of amino acids of the partial peptide of the receptor protein of the present invention may be at least 20 or more, preferably 50 or more, more preferably 50 or more of the amino acid sequence E constituting the receptor protein of the present invention. Peptides having at least 100 amino acids are preferred.
  • a substantially identical amino acid sequence is defined as about 50% or more, preferably ⁇ 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more with these amino acid sequences. Most preferably, the amino acid sequence has about 95% or more homology.
  • substantially the same activity means the same as disgust.
  • the measurement of the substantially same activity ttj can be performed in the same way as fiJfS.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention may have one or two At least 10 amino acids, more preferably 1 to 2 amino acids are deleted, or at least 1 or 2 amino acids are added to the amino acid sequence. -2 om, more preferably 1 to 10 amino acids, still more preferably several (1 or 2) amino acids, or one or more amino acids (preferably Ten, more preferably several (one or two) amino acids may be replaced by other amino acids.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention is: * 3 ⁇ 4 is usually a carboxyl group (one CO OH) or a carboxylate (one COO—), but C is an amide (one CONH 2 ) or an ester (one COOR) (R Indicates the consent of the above).
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention includes, as in the case of the receptor protein of the present invention prepared by Mf, a peptide having an amino group of N-methionine with a protecting group, Pyroglutamine-oxidized Gin whose side is cleaved in vivo ⁇ g, those in which the substituents on the side chains of amino acids in the liver are protected with appropriate protecting groups, or those which are so-called glycopeptides Etc. are also included.
  • a physiologically acceptable acid salt is particularly preferable.
  • Such salts include, for example, maleic acid (eg, acetic acid, phosphoric acid, odorous acid, salt with W, or organic acid (eg, acetic acid, ketone, propionic acid, fumamalic acid, Acids,, cunic acid, linco, «, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid) and the like are used.
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be prepared by the above-mentioned method for the purification of the receptor protein of human «?? L» i or from itself.
  • a transformant containing the DNA encoding the receptor protein of the invention (the host may be the same as the host of the recombinant containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention described above, etc.) ) Is prepared according to the method for preparing a transformant containing the DNA encoding the polypeptide of the present invention, and contains the DNA encoding the polypeptide of the present invention. Culture of It can also be produced by culturing according to the method. The polypeptide synthesis method described above or a method similar thereto can also be used.
  • the extract After homogenizing the fibers or cells of the human mammal, the extract is extracted with an acid or the like, and the extract is subjected to reverse phase chromatography, ion chromatography. Purification can be achieved by combining chromatography such as chromatography.
  • the partial peptide of the receptor protein of the present invention or a salt thereof can be prepared by cleaving the receptor protein of the present invention with an appropriate peptide according to the aforementioned method for synthesizing the peptide itself. can do.
  • the synthesis of the receptor protein of the present invention or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt is the same as the method for preparing the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt.
  • the polynucleotide encoding the receptor protein of the present invention may be any polynucleotide that encodes the receptor protein of the present invention; it may contain any sequence (DNA or RNA, preferably DNA). .
  • the polynucleotide is a DNA encoding the receptor protein of the present invention, RNA such as mRNA, and may be double-stranded or single-stranded.
  • ⁇ ⁇ may be a strand DNA, a strand RNA or a hybrid of DNA: RNA.
  • RNA may be a sense strand (that is, a coding strand) or an antisense strand (that is, a non-coding strand).
  • the method of the present invention can be carried out, for example, according to the method described in the known experimental medical special edition “New PCR and its application” 15 (7), 1997 or a method analogous thereto.
  • MRNA of the protein of the receptor can be quantified.
  • DNA encoding the receptor protein of the present invention examples include genomic DNA, genomic DNA library, cDNA derived from fertile cells, textile library, cDNA library derived from disliked cells, and synthetic DNA. May be different.
  • the vector to be converted into a library may be any of bacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like. Also, It can also be directly amplified by reverse transcriptase polymerase chain reaction (hereinafter abbreviated as RT-PCR method) using a total RNA or mRNA fraction prepared from the cells' tissues.
  • RT-PCR method reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • the DNA encoding the receptor protein of the present invention for example, a DNA comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 55 or Eq. Also, the @@ 5 sequence number: 38, the sequence number: 55, or the sequence represented by SEQ ID NO: 56. Any DNA that encodes a receptor protein that has substantially the same activity as the receptor protein (eg, ligand activity, sigka lff signaling activity, or somatosustin secretion regulatory activity). Is also good.
  • DNA that can hybridize with the ⁇ 15 column represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56 include, for example, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56.
  • Eight hybridizations can be performed by the method of itself or a method analogous thereto, for example, the method described in Molecular Cloning 2nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). And so on. Also, you can do this according to the method described in the ⁇ ffl manual on the shelf, which puts a library on the market. More preferably, it can be performed according to high stringency conditions.
  • the stringent conditions include, for example, a sodium concentration of about 19 to 40 mM, preferably about 19 to 2 OmM, and a temperature of about 50 to 70: preferably about 60 to 70 mM. It shows the condition of 65 "C. In particular,: ⁇ of the sodium body at about 19 mMT and about 65 ° C is most preferable.
  • a polypeptide of the present invention such as a polypeptide encoded by a DNA capable of hybridizing with the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56,
  • the amide, ester, and salt of the polypeptide of the present invention include amides, esters and salts similar to polypeptides.
  • DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 38 or the like is used as the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37.
  • the DNA encoding the receptor protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 54 is represented by SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56; Can be
  • the polynucleotide comprising a part of the; ⁇ S sequence of the DNA encoding the receptor protein of the present invention or the " ⁇ " of the thigh sequence complementary to the DNA is defined as the following part of the present invention. It suffices to include only DNA encoding the peptide, and is used to include RNA.
  • an antisense polynucleotide capable of inhibiting the replication or expression of the G protein receptor protein is cloned or determined.
  • DNA can be designed and synthesized based on S5 sequence information.
  • Such polynucleotides can hybridize with RN ⁇ of the G protein wing receptor protein, and the combined RNA: can inhibit the function, or G protein-coupled receptor G protein-coupled receptor can interact with protein-related RNA to regulate and regulate expression of Yuichi protein residue G-protein-coupled receptor
  • RNA can inhibit the function
  • G protein-coupled receptor G protein-coupled receptor can interact with protein-related RNA to regulate and regulate expression of Yuichi protein residue G-protein-coupled receptor
  • Complements selected sequence of Yuichi protein-related R ⁇ ⁇ ⁇ A specific polynucleotide and a polynucleotide capable of specifically hybridizing with G protein-associated RNA can regulate the expression of G protein and G-protein in vivo and in vitro.
  • it is useful for treating or diagnosing key diseases, etc.
  • nucleotide refers to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids, including residues.
  • residue refers to a specific sequence of nucleotides, nucleotide sequences or nucleic acids, including residues.
  • to between a nucleotide, a sequence or a nucleic acid and a peptide (protein) means that it is derived from the nucleotide (nucleic acid) sequence or its complement.
  • the DNA encoding the partial peptide may be any DNA containing the above-described sequence encoding the partial peptide of the present invention.
  • reverse transcriptase polymerase chain reaction obtained by preparing an mRNA fraction from the cells and tissues described above may be used. It may be amplified by abbreviated as RT-P CR method).
  • the DNA encoding the partial peptide of the present invention includes, for example, (1) a DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 55 or SEQ ID NO: 56. DNA with S sequence, or (2) SEQ ID NO: 38, Ban No .: 55 or ⁇ @ ⁇ 1 ⁇ No .: Salt represented by 56 3 ⁇ 4 @ 2 column and high stringent conditions And a receptor protein having substantially the same activity as the receptor protein of the present invention (eg, ligand binding activity, signaling activity, or somatosustin secretion regulating activity).
  • a partial salt of DNA that encodes a DNA that encodes the SIH sequence is used.
  • An antibody against the polypeptide, partial peptide or ester thereof or amide or salt thereof of the present invention, or the antibody against receptor protein or salt thereof, or partial peptide or amide or ester thereof of the present invention may be:
  • the antibody of the present invention can recognize an antibody against the polypeptide, the partial peptide or the ester or the amide or the salt thereof, the receptor protein or the salt thereof, or the partial peptide or the amide or the ester thereof of the present invention. Any antibody may be used, such as a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • Antibodies to the partial peptide or its amide or its ester are the polypeptide of the present invention or the polypeptide of the present invention.
  • the receptor protein as an antigen, it can be produced according to a known method for producing an antibody or antiserum.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is administered by itself or together with a carrier or ⁇ while being capable of producing an antibody by administration to a warm M protein.
  • complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability.
  • Dosing ⁇ 3 ⁇ 4 1 time Once every 2 to 6 weeks, total 2 to: L OHmg is administered.
  • the warm substance to be used include monkeys, rabbits, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep, goats, and chickens, and mice and rats are preferably used.
  • Monoclonal antibodies When producing cells, select an individual with an antibody titer from the mouse
  • monoclonal antibody-producing A hybridomas can be prepared.
  • the measurement of the antibody titer during purification can be performed, for example, by reacting the labeled polypeptide described below with ⁇ purification, and then measuring the activity of the target bound to the antibody. Fusion operation method, for example
  • the method of Keller and Milstein [Nature, 256, 495 (1975)] can be used.
  • the fusion includes, for example, polyethylene glycol (PEG) and Sendai virus, and preferably PEG is used.
  • bone marrow JM vesicles examples include bone MM vesicles of warm ifilSj products such as NS-1, P3U1, SP2 / 0, and AP-1, but P3U1 is preferably used.
  • the preferred ratio between the number of antibody-producing cells used is about 1: 1 to 20: 1).
  • ⁇ 40 preferably 30-37, for 1-10 min. Fine ⁇ integration can be performed.
  • hybridomas are immobilized on a solid phase (eg, microplate) on which polypeptide (protein) is directly or adsorbed together with a carrier. Add the culture supernatant, and then add an anti-globulin antibody (anti-mouse globulin antibody if the cell used for cell fusion is a mouse) or protein A made of radioactive substances or enzymes, and add the solid phase to the solid phase.
  • a solid phase eg, microplate
  • an anti-globulin antibody anti-mouse globulin antibody if the cell used for cell fusion is a mouse
  • protein A made of radioactive substances or enzymes
  • a method for detecting the monoclonal antibody that has been produced adding the anti-globulin antibody or protein A to a solid phase, adsorbing the culture supernatant, adding a polypeptide labeled with a radioactive substance, an enzyme, or the like. Examples include a method for detecting a monoclonal antibody on a solid phase.
  • any medium can be used as long as it can produce wild and hybridomas.
  • RPMI 1640 medium containing 1-20%, preferably 10-20% bovine whey, 1-: GIT medium containing 0% bovine whey!
  • serum-free culture medium for hybridoma culture SFM-101, Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.
  • Culture is usually 20 to 40: preferably 37.
  • the culture time is generally 5 days to 3 weeks, preferably 1 week to 2 weeks. Cultivation can usually be performed under 5% carbon dioxide.
  • the antibody titer of the hybridoma culture supernatant can be measured in the same manner as the measurement of the antibody titer in the above-described supernatant.
  • Monoclonal antibodies can be separated and purified by the method of ⁇ 0 itself, for example, the method of isolating globulins (eg, salting out method, alcohol method, isozyme method, electromigration method, ion exchanger (eg, DE AE ), The method of interest, gel filtration, a specific purification method in which only antibodies are collected using an active binding agent such as a visible solid phase or protein A or protein G, and the binding is ⁇ to obtain antibodies.
  • an active binding agent such as a visible solid phase or protein A or protein G
  • polyclonal antibody ® The polyclonal antibody of the present invention can be produced according to a method known per se or a method analogous thereto. For example, ⁇ (polypeptide) itself or a complex thereof with a carrier protein is formed, and the product is subjected to a furnace in the same manner as the monoclonal antibody method described above. The product can be obtained by collecting the substance and separating and purifying the antibody.
  • the type of the carrier protein and the mixing ratio of the carrier and the octane are different from those of the hapten cross-linked to the carrier.
  • Any antibody may be cross-linked at any ratio as long as it can be produced at an efficiency of 1% .
  • serum serum albumin, thyroglobulin, hemocyanin, etc. may be used in a weight ratio of 1 to 8 ptene.
  • a method of pulling at a rate of about 0.1 to 20 and preferably at a rate of! To 5 is used.
  • Various condensing agents can be used for force coupling between the hapten and the carrier, but glutaraldehyde, carbodiimide, maleimide active ester, active ester containing thiol group and dithioviridyl group are used.
  • the condensation product is administered to an animal itself or together with a carrier and an agent, in addition to the ability to produce antibodies.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance the antibody-producing ability upon administration.
  • the administration is usually made once every about 2 to 6 weeks, for a total of about 3 to 10 times.
  • the polyclonal antibody can be collected, preferably from blood, ascites, etc., of the product obtained by the above method.
  • Antisense DNA (hereinafter, in the description of antisense DNA, These DNAs are abbreviated as the DNA of the present invention) as those having a base sequence complementary to or substantially complementary to the DNA of the present invention, and having an action capable of suppressing the expression of the DNA. If so, any antisense DNA may be used.
  • the base sequence substantially complementary to the DNA of the present invention is, for example, a nucleotide sequence complementary to the DNA of the present invention (that is, the complement of the DNA of the present invention); ⁇ Ffi columns exhibiting a homology of 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more.
  • the salt SS2 sequence of the portion encoding the N-terminal site of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention (for example, near the start codon) About 70% or more, preferably «80% or more, more preferably ⁇ 90% or more, and most preferably ⁇ 95% 13 ⁇ 4 ⁇ with the complementary strand of The antisense DN is These antisense DNAs can be produced using a DNA synthesizer or the like.
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester, or its partial peptide or its amide or its ester or a salt thereof (hereinafter, abbreviated as the polypeptide of the present invention), and (2) the present invention.
  • Recept protein or its salt, or its partial peptide or its amide or its ester or its salt hereinafter sometimes abbreviated as the receptor protein of the present invention
  • 3 polypeptide of the present invention or its portion ⁇ DNA encoding the peptide or the receptor protein of the present invention or a partial peptide thereof hereinafter abbreviated as the DNA of the present invention
  • the polypeptide of the present invention or an amide or ester thereof, or a partial thereof hereinafter, abbreviated as the polypeptide of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention has the cell stimulating activity of the receptor protein of the present invention and the like, Abnormal or defective DNA encoding the polypeptide of the present invention, or abnormal or defective DNA encoding the receptor protein of the present invention ⁇ &, for example.
  • Abnormal or defective DNA encoding the polypeptide of the present invention, or abnormal or defective DNA encoding the receptor protein of the present invention ⁇ & for example.
  • i3 ⁇ 4lfilJ ⁇ self-sensitivity disease, all, cataract, glaucoma, acute terrier inflammation, acute myocardial infarction, sudden inflammation, acute viral encephalitis, adult respiratory distress, alcoholic Lilitis, Alheima disease, Asthma, arteriosclerosis, atopic dermatitis, bacterial pneumonia, bleeding S fracture,?
  • the polypeptide of the present invention, the receptor protein of the present invention, and the DNA of the present invention can be used as drugs, such as the above-mentioned various therapeutic / prophylactic agents.
  • polypeptide of the present invention may be used as a medicament such as a therapeutic agent for ⁇ of MACULAR EDEMA CYSTOID mottling M) and a preventive agent.
  • polypeptide of the present invention is involved in the secretory control of somatosustin (also referred to as secretory regulation; the same applies hereinafter).
  • somatosustin also referred to as secretory regulation; the same applies hereinafter.
  • Gastrin production therapeutic agents for tumors such as insulinoma and carcinoids, (2) insulin-dependent or non-dependent diabetes, or various diseases related to these diabetes, ie, diabetic complications (eg, diabetes mellitus , Diabetic nephropathy, diabetic nervous system, Dawn syndrome, orthostatic hypotension, etc.), (3) treatment of obesity, bulimia, etc. by improving hyperinsulinemia or suppressing appetite, etc. , (4) Quick-purifying inflammation, TTL extract, Teng / intestinal fistula, Hemorrhagic medullary ulcer, Digestion's ulcer, Gastritis, Gastrocytosis, Reflux: ⁇ I Flame, etc., (5) Helicobacter (I) An agent for improving various symptoms associated with H.
  • diabetes mellitus e.g, diabetes mellitus , Diabetic nephropathy, diabetic nervous system, Dawn syndrome, orthostatic hypotension, etc.
  • Treatment of obesity bulimia, etc. by improving hyperinsulinemia or suppressing appetite
  • pylori infection eg, an inhibitor of gastrin secretion increase
  • Amylase secretion inhibitor associated with extractive crane and «fi extract I ⁇ f »Prognosis of Jin
  • Diarrhea caused by abnormal motility of the tract (eg, Short bowe 1 syndrome), diarrhea caused by drugs such as cancer chemotherapy, diarrhea caused by congenital small bowel atrophy, and endocrine wisteria such as VIP 4 »
  • Diarrhea caused by AIDS diarrhea caused by AIDS, diarrhea caused by graft-versus-host reaction associated with bone transplantation, diarrhea caused by diabetes m> diarrhea caused by m> treatment
  • systemic sclerosis cure for diarrhea caused by eosinophilia
  • remedy for dumping disease ⁇ irritability ⁇ inflammation, Crohn's disease, inflammation ⁇ disease, (9) ⁇ or cancer (eg ⁇ ®, breast cancer, precancerous
  • the DNA of the present invention may be used, for example, in a patient in which the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is reduced or deleted in vivo. Then, by expressing the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in a living body, the DNA of the present invention is inserted into (mouth) cells, and the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is obtained. Transferring the cells to the patient after the expression of the present invention, or (8) administering the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention to the patient, etc.
  • the role of the polypeptide or the receptor protein of the present invention can be sufficiently or normally exerted.
  • the DNA of the present invention When the DNA of the present invention is used as the above-mentioned therapeutic / prophylactic agent, the DNA is inserted alone or inserted into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, and an adenovirus associated virus vector. Later, according to conventional means, human or a®] Powerful to administer.
  • the DNA of the present invention may be used as it is or together with a carrier recognized in a physiological substance such as an auxiliary agent for promoting ingestion, and may be converted into a conjugate using a force catheter such as a ⁇ -idrogel catheter. Can be administered.
  • ⁇ is at least 90%, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably It is preferable to reverse the product purified to 99% or more.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention can be used, for example, orally or fc or fc or elixir, elixir, microcapsule ⁇ j or the like coated with sugar as required. It can be parenterally administered in the form of a sterile solution with a pharmaceutically acceptable liquid, or as an agent.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention may be used together with a carrier, a vehicle, a vehicle, an anti-ra, an anti-, a ⁇ agent, etc., which are recognized in the physiology, and a drug which is recognized in ⁇ 3 ⁇ 4. It can be done by steeling in a single shelf g condition as required. The amount of the complement component in these transformations is to ensure that an appropriate volume in the specified range can be obtained.
  • Additives that can be miscible with ⁇ , Kabuseri! / ⁇ Etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as viscous cellulose, corn starch, gelatin Swelling agents such as alginic acid, lubricating agents such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, fragrances such as peppermint oil, cocoa oil or cellulose.
  • the disgusting type of material can additionally contain a liquid carrier, such as a fat or oil.
  • a liquid carrier such as a fat or oil.
  • Steps for dragons include the active substance in a vehicle such as water for injection, sesame oil It can be formulated in accordance with normal pharmaceutical practice such as dissolving or suspending naturally produced vegetable oils such as coconut oil and the like.
  • Aqueous liquids for tongue include, for example, physiology: ⁇ ⁇ , grape and isotonic liquids containing other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.).
  • Agent for example, alcohol (for example, ethanol, etc.), polyalcohol (for example, For example, propylene glycol, polyethylene glycol, etc.) and non-ionic surfactants (eg, Polysorbate 80 TM, HC-150) may be used in combination.
  • the oily liquid includes, for example, sesame oil and short oil, and may be used in combination with benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like as a melting aid.
  • relaxation eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer, etc.
  • soothing agents eg, benzalkonium chloride, procaine, etc.
  • stabilizers eg, human serum albumin, polyethylene glycol, etc.
  • antioxidants eg, , Benzyl alcohol, phenol, etc.
  • the prepared aim is usually filled in a suitable ampoule.
  • the vector into which the DNA of the present invention has been inserted is also prepared in the same manner as described above, and is usually used parenterally.
  • the ⁇ thus obtained is safe and sexual, it can be, for example, a human or afiL »j product (eg, rat, mouse, guinea pig, egret, bird, sheep, pig, pig, dog, cat, Dogs, monkeys, etc.).
  • a human or afiL »j product eg, rat, mouse, guinea pig, egret, bird, sheep, pig, pig, dog, cat, Dogs, monkeys, etc.
  • the dosage of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention may vary depending on the fiber disease, the administration route, the administration route, and the like.
  • the receptor protein of the present invention when the receptor protein of the present invention is orally administered, generally in an adult (as 60 kg), about 0.1 to 100 mg, preferably 0.0 to 100 mg of the polypeptide or protein per day is used.
  • the single dose of the polypeptide or protein may vary depending on the sculpture, fiber disease, etc., for example, the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention for the treatment of stroke disease.
  • Administer the evening protein to adults in the form of a drug ⁇ &, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1, of the polypeptide etc. per day It is convenient to administer by injecting about ⁇ 20 mg, more preferably about 0.1: about L Omg to the affected area. ⁇ ⁇ of other animals can also be administered in elevated amounts per 6 Okg.
  • Kaohsiung self-medullary disease, all, cataract, glaucoma, acute ⁇ 4 'terrieritis, acute myocardial infarction, acute ffii extractitis, acute Viral encephalitis, adult respiratory distress key, alcohol l ⁇ fF inflammation, Alzheimer's disease, asthma, atherosclerosis, atopic dermatitis, nocteria pneumonia, bladder fi3 ⁇ 40 u, fracture, breast cancer, bulimia, bulimia, burn Healing, childhood cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, pancreatitis, cirrhosis' cancer (colorectal / rectal cancer), ku!
  • 3-ne's disease dementia, diabetic complications, diabetic kidney Disease, diabetes Diabetes 'Horniosis, gastritis, helicopaque Yuichi. Pylori sensation, liver failure, ASfff inflammation, B fF inflammation, CSffF inflammation, hepatitis, simple herpes virus sensation, water ⁇ ' virus infection Disease, Hodgkin's disease, AIDS 'infection, human papillomavirus hypercalcemia
  • Hypercholesterolemia hyperglyceridemia, hyperlipidemia,, influenza infection, insulin-dependent diabetes mellitus (type I), staphylococcus ⁇ , mm, cancer metastasis, multiple myeloma, allergy '14 ⁇ Inflammation, nephritis, non-Hodgkin's lymphoma, non-insulin-dependent diabetes mellitus (type II), non-small cell lung cancer, liver transplantation, osteoarthritis, osteomalacia, osteopenia, osteoporosis, ovarian cancer Bone Behcet's disease , Digestive disease, peripheral vascular disease, precancerous cancer, reflux disease, renal insufficiency, rheumatoid arthritis, psychiatric ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ , Stomach cancer, systemic lupus erythematosus, -'tim, valvular heart disease, vascular disease / multiple infarction, Kuramomo healing
  • a compound or a salt thereof that keys or inhibits the function of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the tt * invention eg, Solin or husk
  • a compound that inhibits the function of the receptor protein eg, squamous elimination activity, etc.
  • a drug such as a prophylactic or therapeutic agent for MACULAR EDEMA CYST0ID .
  • polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention may secrete somatosustin. Since it is involved in regulation, a compound or a salt thereof that inhibits the function of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention (eg, Solin!
  • I, etc. or a salt thereof may be, for example, (1) ) Acromegaly, T SH «ulcer, non-secretory ( ⁇ pituitary ⁇ , ectopic ACTH (adrenoco ruticotropin), 4 «, medullary carcinoma, VI Treatment of tumors such as glucagon-induced tumors, gastrin-producing 4J » insulinomas, carcinoids, etc., (2) insulin-dependent or non-dependent diabetes, or various diseases related to these diabetes, ie, diabetes delivery (eg, Remedy for diabetes mellitus nephropathy, diabetic nephropathy, diabetic care, Dawn's disease, etc.), (3) cure of obesity, bulimia, etc.
  • diabetes delivery eg, Remedy for diabetes mellitus nephropathy, diabetic nephropathy, diabetic care, Dawn's disease, etc.
  • cure of obesity bulimia, etc.
  • Diarrhea caused by ⁇ such as therapy, diarrhea caused by sexual small S, diarrhea caused by difficult endocrine ⁇ such as VIP 4 ⁇ , diarrhea caused by AIDS, caused by graft-versus-host reaction associated with bone marrow transplant etc.
  • Diarrhea caused by diabetes diarrhea caused by diabetes, m
  • ⁇ ⁇ or cancer e.g., Jia Huo, ⁇ , breast, pre-cancer, small ws, non-small w3 ⁇ 4, ⁇ m stomach cancer, bile duct cancer, hepatosa, bladder cancer, ovarian cancer, melanoma, osteosarcoma, Chondrosarcoma, malignant brown senile awakening, # ⁇ ⁇ , mm, thoracic, renal, etc.
  • leukemia eg, leukemia of associative leukocytes' chronic lymphocytic leukemia, myelocytic leukemia, Hodgkin's disease, non Such as Hodgkin's lymphoma
  • war or other repression eg, evening moxifen, LHRH agonist, LHRH antagonist, interferon one, three and one, interleukin one and two
  • B MasterCard disease eg, glaucoma, etc.
  • Sudden ceria teratitis acute viral encephalitis, adult respiratory distress, bacterial pneumonia, severe systemic fungi « ⁇ ,, ⁇ Injury, fracture, liver failure, pneumonia, alcoholic inflammation, inflammation, B inflammation, C inflammation, AIDS sensation » human papilloma virus sensation, influenza seizure, cancer metastasis, multiple bone loss, osteomalacia , Osteoporosis, bone behcetosis, nephritis, renal failure, fil0fil disease, septic shock, hypertension lucidemia, hypercholesterolemia, hyperglyceridemia, hyperlipidemia, systemic lupus erythematosus, HittKlfil seizure, Prevention of arco flame, etc.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is used for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the function of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention.
  • Useful as a reagent Useful as a reagent.
  • the polypeptide of the present invention its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt or its polypeptide or its polypeptide or its amide or its ester or A compound or a salt thereof (hereinafter, referred to as a compound having a key function of a salt thereof, a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof (for example, Shorin! And a compound that inhibits the function of the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt (hereinafter referred to as “the agent”). , Sometimes abbreviated as inhibitors).
  • a compound or a salt thereof (hereinafter, abbreviated as a key agent) that exhibits the function of the amide or its ester or a salt thereof (for example, saccharine!
  • the compound of the present invention which inhibits the function of the receptor protein or its salt or its partial peptide or its amide or its estezole or its salt of the invention hereinafter referred to as “inhibited j”).
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt and the receptor of the present invention Yuichi protein or its salt or its partial peptide or its amide Or its ester or its salt (specifically, a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or its salt, or its partial peptide or its Amide or its ester or its ⁇ ), characterized by using the polypeptide of the present invention, its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its esteryl or its salt, or the receptor of the present invention Protein or its Or a compound or a salt thereof that exhibits the function of a partial peptide or its amide or its ester or its salt (for example, the activity of withdrawing I or the activity of regulating somatosustin secretion).
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt, or the receptor protein of the present invention or its salt or its salt Function of partial peptide or its amide or its ester or its salt (for example, A method for screening for a compound that inhibits intense activity or somatosustin-secretin regulating activity (hereinafter sometimes abbreviated as an inhibitor);
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester or a salt thereof, its partial peptide or its amide or its ester or its salt, or the receptor protein of the present invention or its salt or its partial Peptide or its amide or its ester or its salt (specifically, a protein or a salt thereof containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37, or (Ii) the polypeptide of the present invention, its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its ester;
  • the salt of the receptor protein of the present invention or its salt or its partial Or a amide thereof, an ester thereof, or a salt thereof includes a protein or a salt thereof, which contains the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37; Or its partial peptide or its amide or its ester or its and its carrier compound, the polypeptide of the present invention or its amide or
  • the receptor protein of the present invention or a salt thereof or a partial peptide or a partial peptide thereof Is a compound or a salt thereof (hereinafter sometimes abbreviated as a bulking agent) that has a key function of the amide or its ester or its salt (for example, Hoshin !! ⁇ ⁇ Polypeptide of the invention or its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt, or the receptor protein of the present invention or its salt or its partial peptide or its amide or It is intended to provide a method for screening a compound that inhibits the function of an ester or a salt thereof (for example, activity of regulating the secretion of fibrin fiber or somatosustin) and the like (hereinafter, abbreviated as " inhibition ").
  • the activity of the polypeptide of the present invention and the test compound or the activity of the polypeptide of the present invention and the test compound in The present invention is characterized in that the binding to the receptor protein of the present invention * is measured and the ratio is T.
  • the polypeptides of the present invention can be determined by the method of ⁇ 0 per se, for example, Dockray, GJ et al., Nature, 305, 328-330, 1983, Fukosumi, S., et al., Biochem. Biopys. Res. Commun., 232, 157-163, 1997, Hinuma, S., et al., Ature, 393, 272-276, 1998, Tatemoto, K., et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 251 , 471-476, 1998. and the like or a method analogous thereto.
  • the polypeptides and compounds of the present invention are measured for the receptor protein of the present invention in accordance with the method described in “Determining the ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention” described below. Can be obtained.
  • Examples of the ligated compound include peptides, proteins, non-peptide compounds, synthetic compounds, fermented liquids, fine liquids, target liquids, and animal fiber extracts, and the like. Or a known compound.
  • a sample of the polypeptide of the present invention is prepared by suspending the polypeptide of the present invention in a buffer suitable for screening.
  • the buffer includes a polypeptide of the present invention and a receptor protein of the present invention, such as a buffer of about 4 to 10 (preferably about 6 to 8), such as a buffer and a tris-1 buffer. Any buffer may be used as long as it does not inhibit the reaction.
  • the cell stimulating activity in the case of the above ( ⁇ ) is about 20% or more, preferably 30% or more, more preferably about 50% or more compared with the case of the above (i).
  • a compound that inhibits at least% can be selected as a compound that inhibits the activity of the polypeptide of the present invention, such as severe IJ activity.
  • the above-mentioned fiber compound is a compound or a salt thereof that inhibits or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention
  • the receptor protein of the present invention and the protein of the present invention The activity of inhibiting the age of a polypeptide or a partial peptide thereof with s ⁇ can be mentioned. For example if Hosoy ⁇ M. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun.
  • a compound which inhibits the binding of 3 ⁇ 4 by 10% or more can be a compound or a salt thereof that inhibits or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention.
  • the inhibitory activity is a relative value measured based on! ⁇
  • the above test compound is a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the activity of the polypeptide of the present invention. It is not necessary to judge that.
  • the screening kit of the present invention contains the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt, and its partial peptide or its amide or its ester or its salt.
  • the screening kit of the present invention is a receptor of the polypeptide of the present invention or its amide or its ester or its salt, its partial peptide or its amide or its ester or its salt, that is, the receptor of the present invention.
  • Yuichi Protein or its salt or its partial peptide or its amide or its ester or its salt (In other words, a protein containing the same or substantially the same amino acid sequence as the amino sequence represented by SEQ ID NO: 37) Or a salt thereof, or a partial peptide thereof, an amide thereof, an ester thereof, or a compound further comprising the same.
  • Examples of the screening kit of the present invention include the following.
  • Hanks' Balanced Salt Solution (Gibco) with 0.05% serum albumin (Sigma power!). It may be sterilized with a filter having a pore size of 0.45 m, and sterilized with a filter having a pore size of 4.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate at 5 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C. for 5 days in 5% C 2 and 95% air for 2 days.
  • polypeptide of the present invention or its amide or its ester, or its partial peptide or its amide or its ester is dissolved in 0.1% cisserum albumin (Sigma) -containing PBS so as to be ImM, Keep at 20 ⁇ T.
  • NSB Non-specific Binding (Non-specific Binding)
  • the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention or a salt thereof is a compound described above, for example, peptide, protein, non-peptide.
  • the salt of the compound the same as the salt of the polypeptide of the present invention, which is not preferred, can be used.
  • the age obtained by using the compound obtained by using the screening method or the screening kit of the present invention as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent can be determined according to the conventional methods.
  • a drug containing the polypeptide of the present invention that has been hated it can be used as a translator, a elixir, a elixir or a microsterile solution, a sterile solution, a ⁇ -salt, or the like.
  • the resulting stomach is sexually active in, for example, humans or animals (eg, mice, rats, puppies, higgs, bush, puppies, puppies, puppies, cats, dogs, monkeys, Etc.).
  • humans or animals eg, mice, rats, puppies, higgs, bush, puppies, puppies, puppies, cats, dogs, monkeys, Etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on its action, disease, subject to be administered, administration route, and the like.
  • a compound that functions the polypeptide of the present invention is administered orally
  • the compound is administered at a dose of about 0.1 to 0 mg, preferably 1.0 to 50 mg, more preferably 1.0 to 20 mg per day.
  • the age at which the compound is parenterally administered varies depending on the administration dose, sculpture disease and the like. (As 60 kg) ⁇ about 0.01 to 30 mg @ S of the compound per day, preferably 0.1 ⁇ 20 mgg, more preferably about 0.1 ⁇ 1 Omg @ ⁇ per day. Throw by the venom dragon It is convenient to give. In the case of other animals, it is also important to administer the equivalent amount per 60 kg.
  • a compound that inhibits the function of the polypeptide of the present invention when a compound that inhibits the function of the polypeptide of the present invention is orally administered, generally, in an adult (assuming a body weight of 60 kg), the compound is used in an amount of about 0. [Shapes 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 2 Omg are administered.
  • the single dose of the compound varies depending on the administration route, disease, and the like.
  • a compound that inhibits the function of the polypeptide of the present invention is usually administered in the form of an injection to an adult (6%).
  • the compound is administered in an amount of about 0.01 to 3 Omg per day, preferably about 0.1 to 20 mgii, more preferably about 0.1 to 10 mg. It is conveniently administered by intravenous injection. ⁇ Of other animals can also be dosed per 6 O kg.
  • an antibody against the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention specifically binds to the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention. Since it can be recognized, it can be used for the quantification of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in the test wave, particularly for quantification by the sandwich measurement method. r
  • An antibody of the present invention is competitively reacted with a liquid and a polypeptide of the present invention or a receptor protein of the present invention, and an intelligent book bound to
  • one of the antibodies is an antibody that recognizes the N-terminal of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, and the other antibody is the polypeptide or the polypeptide of the present invention.
  • the receptor of the invention is an antibody against the C-terminal of the protein.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention can be quantified using a monoclonal antibody against the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, and detection by color or the like can be performed. You can also.
  • the antibody ⁇ ⁇ may be used, and the F (ab ') 2 , Fab', or Fab fraction of the antibody liver may be used.
  • the method for quantifying the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention using the antibody of the present invention is not particularly limited, and the method for quantifying the amount (for example, polypeptide *) in a fiber sickle is not limited.
  • Examples of the method used for the measurement method using a labeling substance include radioisotope, enzymes, fluorescent substances, and substances.
  • the radioisotope for example, [ 125 I], C 131 I], ⁇ H), ["C], etc.
  • As the above enzyme those having a high specific activity are preferable.
  • Fluorescent ⁇ I substances such as fluorescamine, fluorescein isothioshi
  • Examples of the substance include luminol, a luminol derivative, reluciferin, lucigenin, etc.
  • a biotin-avidin system may be used for binding an antibody or ⁇ ⁇ .
  • the carrier include insoluble polysaccharides such as agarose, dextran, and cellulose; fine particles such as polystyrene, polyacrylamide, and silicon; and glass.
  • the liquid is reacted with the insoluble monoclonal antibody of the present invention (primary reaction), and further reacted with another labeled monoclonal antibody of the present invention (secondary reaction).
  • primary reaction the amount of the polypeptide of the present invention or the amount of the receptor protein of the present invention in the test wave can be determined.
  • the primary reaction and the secondary reaction may be performed in reverse order, may be performed simultaneously, or may be performed at staggered times.
  • the leaking agent and the method of solubilization can be the same as those of the restaurant.
  • the antibody used for the solid phase antibody or the transcribable antibody is necessarily one type, and a mixture of two or more types of antibodies is used for the purpose of improving the measurement.
  • the monoclonal antibody of the present invention used in the primary and secondary reactions may be the polypeptide of the present invention.
  • Antibodies having different sites for binding the peptide or the receptor protein of the present invention are preferably used.
  • the antibody used in the primary reaction and the secondary reaction is, for example, the age at which the antibody used in the secondary reaction recognizes the C-terminal of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention.
  • the antibody used in the reaction is preferably an antibody that recognizes the C-terminal, for example, the N-terminal.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used in a sandwich measurement system, for example, a competition method, an immunometric method, or a nephrometry.
  • S3 ⁇ 4g in the test wave and labeled i3 ⁇ 4g are allowed to react competitively with the antibody, and then the unreacted 1T source (F) and the labeled source ( ⁇ ) with the antibody!
  • the amount of labeled B / F, B, or F is measured, and the amount of boura in the test solution is quantified.
  • a soluble antibody is used as an antibody
  • For F separation use a liquid phase method using polyethylene glycol, a second antibody against an abuse, etc., or use an immobilized antibody as the first antibody, or use a soluble This is called a solid phase immobilization method using a solid phase antibody as the second antibody.
  • K and immobilized 3 ⁇ 4 in the test wave are subjected to a competitive reaction with a fixed amount of labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. After reacting with an inconsistent amount of labeled antibody, the solid phase is added to solidify the unreacted labeled antibody, and then the solid phase and the liquid phase are separated. Next, one of the phases is measured to determine the amount of catalyst in the test solution. In nephelometry, the amount of insoluble sediment generated as a result of the antibody reaction in or out of the gel is measured. The amount of thighs in the wave to be tested works, and even when the amount of sediment is small and the force cannot be obtained, laser-nephrometry that uses laser-scattering is used for the purpose.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention can be quantified with high sensitivity by using the antibody of the present invention.
  • polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is prepared using the antibody of the present invention. If the concentration of is reduced or increased by the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, for example, hypertension, autoimmune disease, dysfunction, cataract
  • Glaucoma acute ' ⁇ 4' terrier inflammation, acute myocardial infarction, acute ffil inflammation, acute viral encephalitis, adult respiratory distress, alcoholism, Alzheimer's disease, asthma, atherosclerosis, atopy's dermatitis, nocteria pneumonia , Bladder, bone fracture, breast cancer, cyperia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic prostatitis, cirrhosis, colorectal cancer (colorectal Z rectal cancer ), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic supervision, diabetic transmembrane disease, gastritis, helicopa, kuta-pylori sensation, liver failure, inflammation, BSffF inflammation, C ⁇ ffF inflammation, Hepatitis, simple virus virus, 7K sickle virus virus, Hodgkin's disease, AIDS sensation,
  • a decrease or increase in the concentration of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention was detected: ⁇ , MACULAR EDEMA CYSTOID pavement, etc., or; I * Able to diagnose when it is long.
  • the polypeptide of the present invention is If a decrease or increase in dysfunction is detected, for example, (1) macromegaly, TSH 4ffi3 ⁇ 4, non-secretory (im pituitary «, ectopic '!
  • 4ACTH (adrenocorticotropin) 4J® » Medullary cranium cancer, VI P3 ⁇ 44», Glucagon ⁇ «, Gastrin 4», Insulinoma, Carcinoid, (2) Insulin-dependent or non-dependent diabetes, or those associated with diabetes Various diseases, such as diabetic complications (eg, diabetic lateral membrane disease, diabetic nephropathy, diabetic # S ⁇ ⁇ , Dawn disease «, sexual i & filffi disease, etc.), (3) improvement of hyperinsulinemia or appetite Obesity, overmining due to suppression, etc. Various symptoms associated with H.
  • diabetic complications eg, diabetic lateral membrane disease, diabetic nephropathy, diabetic # S ⁇ ⁇ , Dawn disease «, sexual i & filffi disease, etc.
  • Amylase secretion associated with endocardial tubing (6) Amylase secretion associated with endocardial tubing, (7) Reduced intestinal absorption, increased secretion, or abnormal ⁇ -function in secretion Diarrhea (eg, Short bowe 1 disease 3 ⁇ 4), cancer caused by chemotherapy, etc.
  • diarrhea caused by diarrhea congenital small intestine bell, diarrhea caused by endocrine tumors such as VIP production, diarrhea caused by AIDS, diarrhea caused by graft reaction against host associated with bone marrow transplantation, and diabetes Diarrhea caused by blockade of the abdominal plexus, diarrhea caused by systemic sclerosis, diarrhea caused by addiction, (8) dumping ⁇ , irritability, Ifc ⁇ inflammation, Crohn's disease, inflammatory inflammatory disease, 9) Swelling or cancer (eg, instep A, breast cancer, pre-cancer, small w ⁇ , non-small «M3 ⁇ 4, iws, gastric cancer, bile duct cancer, m.
  • instep A breast cancer, pre-cancer, small w ⁇ , non-small «M3 ⁇ 4, iws, gastric cancer, bile duct cancer, m.
  • leukemia eg, basophil leukocyte leukemia, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin's disease
  • Non-Hodgkin's lymphoma etc.
  • cardiomyopathy arteriosclerosis, valvular heart disease, myocardial infarction (especially cardiac infarction after female doctor), (11) bleeding bleeding, cirrhosis, peripheral vascular disease, (12) systemic or local Diseases associated with sexual inflammation (eg, polyarthritis, rheumatoid arthritis, psoriasis, sunburn, eczema, allergies (eg, 1 breath, atopic dermatitis, allergic rhinitis, etc.)), (13) dementia ( For example, Alzheimer's disease, Alzheimer's disease ⁇ dementia, blood vessels '14 ⁇ multiple '[ ⁇ dementia, etc.), schizophrenia, epilepsy, depression, H3 ⁇ 4 anxiety, sleep, multiple sclerosis, (14) B arm Patients (eg, glaucoma, etc.), (15) Sudden '14 vacteriitis, acute viral encephalitis, adult respiratory tract disease key, bacterium pneumonia, severe whole body ' «bacterial dissociation, fiber, cage damage, fracture,
  • Hyperglyceridemia hyperlipidemia, systemic lupus erythematosus, ⁇ ' ⁇ seizures, alcohol ttff inflammation, (16) burns, wounds, alopecia, (17) chronic or sudden ugly pain (eg, surgery Pain associated with pain, inflammation, marrow pain, toothache, bone disease (eg, arthritis, rheumatism, osteofibrosis, etc.)) or the likelihood of being affected can be diagnosed.
  • the antibody of the present invention can be used to detect the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention which is present in a subject such as a fiber.
  • the DN DN of the present invention can be used, for example, by using it as a probe for humans or objects (for example, rats, mice, moriremots, egrets, birds, higgies, bush, pests, pumas, cats, dogs, monkeys, ),
  • the DNA or mRNA encoding the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention can be detected. It is useful as a diagnostic agent for mutation or decreased expression, increase of the DNA or mRNA or overexpression.
  • the above-mentioned diagnosis using DN ⁇ of the present invention can be performed, for example, by the Northern hybridization or PCR-SSCP method (Genomics, Vol. 5, pp. 874-8779 (19989). Years), Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 8th, Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America Volume, pages 276 to 277 (page 1989)).
  • the age at which the expression was reduced or overexpressed due to Northern Eighth hybridization was, for example, Kaohsiung, autologous sickle disease, all, cataract, glaucoma, acute 14 teratitis, acute Myocardial infarction, Sudden SB extraction, Acute viral encephalitis, Adult respiratory dissociation, Alcohol: Flame, Alzheimer's disease, Asthma, Atherosclerosis, Atopy '14 ⁇ Inflammation, Bacterial pneumonia, Bladder ffib ⁇ ', Fracture , Breast cancer, bulimia, bulimia, bulimia, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic tti extractitis, m, cancer (colorectal rectal cancer), Crohn's disease, Dementia, diabetic complications, diabetic nephropathy, diabetic nephropathy, diabetic sclerosis, gastritis, helicopacu Yu
  • MACULAR EDEMA CYST01D ( ⁇ ; K3 ⁇ 4) It can be diagnosed as a sickle or plaque that is not likely to cause illness.
  • the polypeptide of the present invention, the receptor protein of the present invention, and the DN ⁇ of the present invention are involved in the control of somatosustin secretion, their expression is reduced or reduced by Northern primidization.
  • TS H3 ⁇ 4 «3 ⁇ 4, non-secretory (im pituitary ⁇ , ectopic ACTH (adrenocorticotropin)) « ⁇ , medullary thyroid, VI Glucagon ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ , gastrin ⁇ 4 ⁇ , insulinoma, carcinoid
  • insulin-dependent or non-independent diabetes or associated with these diabetes
  • Various diseases such as diabetic complications (eg, diabetic membrane disease, diabetic nephropathy, diabetic # S.Dawn disease «, sexual» 1 £ disease, etc.), (3) improvement or greed of hyperinsulinemia Obesity due to suppression, bulimia, (4) sudden inflammation of the extremities, sudden inflammation of ttl,
  • Antisense DNA that can complementarily bind to the DNA of the present invention and suppress the expression of the DNA includes, for example, hyperplasia, autoimmune disease, all-cause, cataract, glaucoma, acute 14-octreteritis, acute myocardial infarction, Sudden inflammation, acute viral encephalitis, adult respiratory distress isolation, alkitis !, Alzheimer's disease, VMM, atherosclerosis, atopic inflammation, bacterial pneumonia, bladder Vu, fracture, breast cancer, bulimia, many Phagocytosis, burn healing, cervical cancer, chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic ttl extract, liver cirrhosis, cancer (colon / rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications, diabetes Diabetic nephropathy, diabetic disease, diabetes mellitus, gastritis, gastritis, Helicobacter pylori m ⁇ , hepatic insufficiency, Hachi
  • the antisense DNA capable of binding to the DNA of the present invention complementarily and suppressing the expression of the DNA is a treatment for MACULAR EDEMA CYSTOID plaques). Can be used as medicine.
  • Antisense DNAs that can be produced include, for example, (1) acromegaly, T SH3 ⁇ 44® »non-secretory am pituitary gland «, ectopic AC TH (adrenocholeticutoma) producing tumor, medullary shell »s, VI Treatment of glucagon 4j » gastrin ⁇ «, insulinoma, keratinoid, etc., (2) insulin-dependent or non-independent diabetes, or various diseases related to these diabetes, ie, diabetic complications (eg , Diabetes mellitus, 14 'membranosis, diabetic nephropathy,' ⁇ m, Dawn's ⁇ , ⁇ ⁇ & ⁇ , etc.); ⁇ , (3) obesity due to improvement of hyperinsulin
  • the above-mentioned antisense DNA When used as the above-mentioned therapeutic or prophylactic agent, it can be prepared in the same manner as the above-mentioned therapeutic and / or preventive agent containing DNA of the present invention.
  • the antisense DNA when used, the antisense DNA is inserted alone or into an appropriate vector such as a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adenovirus associated virus vector, and the like, followed by a conventional method. You can power.
  • the antisense DNA is used as it is or is combined with a physiologically acceptable carrier such as an adjuvant to promote uptake, and is then used in catheters such as e. Thus, it can be administered.
  • the antisense DNA can also be used as a diagnostic oligonucleotide probe for examining g of the DNA of the present invention in a cell and its expression status.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, includes, for example, hyperplasia, autologous disease, whole body, cataract, glaucoma, acute 4-body teratitis, Acute myocardial infarction, acute body inflammation, acute viral encephalitis, adult respiratory distress, alcoholic hepatitis, Alzheimer's disease, asthma, arteriosclerosis, atopy's dermatitis, bacterial pneumonia, bladder u, fracture, breast cancer, bulimia ' Bulimia, burn healing, child cancer, lift lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, chronic inflammation, cirrhosis, colorectal cancer (colorectal Z rectal cancer), Crohn's disease, dementia, diabetic complications Disease, diabetic nephropathy, diabetic nephropathy, diabetes mellitus, keratosis, gastritis, helicopaque ⁇ ⁇ ⁇
  • Reflux ⁇ renal insufficiency, rheumatoid arthritis, m ⁇ , illness, preeminent shock, severe whole body ttX bacillus sensation, small return cancer, mass injury, stomach cancer, systemic lupus erythematosus, hiearing female ⁇ Ffl as a drug for the treatment and prevention of diseases such as, fiber, valvular heart disease, vascular Z multiple infarction, wound healing, illness, arthritis, insufficiency of hormonal secretion, dysuria, uremia, and the like I can do it.
  • diseases such as, fiber, valvular heart disease, vascular Z multiple infarction, wound healing, illness, arthritis, insufficiency of hormonal secretion, dysuria, uremia, and the like I can do it.
  • the antibody of the present invention which has the activity of neutralizing the activity of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, is used as a medicament for the treatment and prevention of MACULAR EDEMA CYSTOID disease (flfl). Power to do. Further, since the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is involved in the control of somatosustin secretion, the action of neutralizing the activity of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is achieved.
  • Examples of the antibody of the present invention include: (1) acromegaly, ⁇ sH-producing 4J » non-secretory am pituitary bacterium, ectopic & ACTH (adrenocorticotropin) 3 ⁇ 4 ⁇ , medullary carcinoma, and VI 4 » Dal Ligon 4ffi®, Gastrin ⁇ ⁇ , Insulinoma, Carcinoid, etc., (2) Insulin-dependent or non-independent diabetes, or various diseases related to these diabetes, namely diabetes Treatment of complications (eg, diabetes ft «disease, glycemic nephropathy, mm, Dawn disease ⁇ , ®3 ⁇ « ⁇ disease) ⁇ , (3) Improvement of hyperinsulinemia or suppression of appetite Remedies for obesity, binge eating, etc.
  • complications eg, diabetes ft «disease, glycemic nephropathy, mm, Dawn disease ⁇ , ®3 ⁇ « ⁇ disease
  • Ping disease « irritable fe ⁇ inflammation, Crohn's disease, inflammation, etc.
  • Hearing or cancer eg, carcinoma, breast cancer, MMs small MS, non-small MS, non-stomach gastric cancer , Cholangiocarcinoma, mmmm, m, melanoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, malignant brown, wrn ⁇ m, m, breast, kidney, etc.
  • leukemia eg, leukemia with basophil leukocytes
  • Treatment of lymphocytic leukemia, chronic myeloid leukemia, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, etc .; the rinsing alone or in other controls eg, evening moxifen, LHRH agonist, LHRH angolinist, Can be used in combination with interferon-1 ⁇ ,] 3 and ⁇ , interleukin-1 2), do) hypertrophic cardiomyopathy, arterios
  • the therapeutic or prophylactic agent for the above-mentioned diseases containing the antibody of the present invention can be used as it is as »J or as a drug substance in an appropriate dosage form, in humans or mammals (eg, rat, rabbit, sheep, sheep, pig, pig, etc.).
  • the dosage varies depending on the administration dose, disease, symptoms, administration route, and the like.For example, when used for the treatment or prevention of adult adults with illness, the antibody of the present invention is used as a single dose. , Usually 0.
  • Omg / kg body weight preferably 0.1-1 OmgZk g body weight, more preferably 0.1-5 mg / kg body weight @g, 1-50-50 days, preferably 1 day ⁇ 3HI @ m, conveniently administered by venous vein.
  • the antibody of the present invention can be administered as such or as a drug substance.
  • the medicinal antibacterial substance used for the administration contains the above or a salt thereof and a carrier or excipient acceptable for a pharmacological paste.
  • Such compositions are provided in dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • solid or liquid dosage forms for example, solid or liquid dosage forms, tablets (including sugar-coated tablets, film-coated tablets), mi-granules, capsules (including soft capsules) Syrups, emulsions, suspensions and the like.
  • a composition contains a carrier or an excipient which is subjected to SB by the method of itself and commonly used in the field.
  • a carrier or an excipient which is subjected to SB by the method of itself and commonly used in the field.
  • lactose, starch, sucrose, magnesium stearate and the like are used as carriers and excipients for conversion.
  • parenteral products include parenteral delivery agents and the like.
  • parenteral dosage forms include intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, and intravenous injections. I do.
  • Such an orchid is itself prepared according to the method of [ ⁇ ], for example, by dissolving, suspending or emulsifying the above antibody or a salt thereof in a sterile aqueous or oily liquid commonly used for injections.
  • aqueous solution for aw for example, physiological saline, isotonic solution containing glucose and other auxiliary agents, etc.
  • suitable auxiliaries such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, , Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HC O-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)) and the like.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HC O-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castor oil)
  • oily liquid for example, sesame oil, oil, or the like is used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol, or the like may be used in combination as a leakage aid.
  • the prepared solution is usually filled in a suitable ampoule.
  • oral or parenteral pharmaceutical preparation is conveniently prepared in a dosage form in an infused position suitable for the dose of the pirates.
  • dosage unit forms include tablets, pills, Pseule, & m (ampoule), transliteration, etc.
  • Each sickle may contain other active ingredients as long as it does not cause undesired interaction with the antibody.
  • the present invention relates to a DNA encoding the exogenous polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention (hereinafter abbreviated as the exogenous DNA of the present invention) or a mutant DNA thereof (the present invention). (Abbreviated as exogenous mutant DNA).
  • Non-human mammals having * ttDNA or its mutant DNA include unfertilized eggs, eggs, spermatozoa, and cells containing protospores thereof.
  • the calcium phosphate method it can be produced by transferring the target DNA by the lipofection method, »3 ⁇ 4, microinjection method, particle gun method, DEAE-dextran method, etc.
  • the DNA of the present invention can be transferred to somatic cells, living Sgg, fibrillar cells, etc., and used for cell culture, culture and the like.
  • the DNA-transferred animal of the present invention can also be produced by fusing cells with human jra cells by the own cell fusion method.
  • Non-human mammals include, for example, red sea lions, bushes, higgins, goats, gray egrets, dogs, cats, Lumots, hamsters, mice, rats, etc. are used.
  • the ontogeny and biological cycle are relatively short in terms of the creation of disease animal model systems, and rodents, especially mice, which are easy to maraud (for example, C57BLZ6 strain, DBA Two strains, such as Be CSF i strain, BD Fi strain, B6D 2 F strain 1 , BAL BZc strain, ICR strain, etc., or rat (eg, Wistar, SD, etc.) are preferred. .
  • Examples of the “mammal” in the non-human mammal that can be expressed in a mammal include a human in addition to the above-mentioned non-human mammal.
  • DNA refers to the DNA of the present invention which has not been originally possessed by non-human mammals but is once extracted from an animal.
  • mutant DNA of the present invention examples include those in which a mutation (for example, mutation) has occurred in the original DNA sequence of the present invention; specifically, the function of a base, deletion, or separation from other donkeys. Such as DN ⁇ is used, and abnormal DNA is also included.
  • the abnormal DNA means an abnormal polypeptide of the present invention or a DNA that expresses the receptor protein of the present invention, and for example, suppresses the function of the normal polypeptide of the present invention or the function of the receptor protein of the present invention. DNA that expresses the polypeptide to be used is used.
  • * ttDNA may be derived from the same or the same mammal as the animal to be used.
  • DNAs derived from various mammals e.g., egrets, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, etc.
  • a DNA construct eg, vector, etc.
  • a mammal for example, a mouse fertilized egg
  • a DNA-transferred mammal that highly expresses the DNA of the present invention can be created.
  • Examples of the expression vector of the polypeptide of the present invention include a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis, a plasmid derived from yeast, bacteriophage such as ⁇ phage, and Moroni leukemia. Retroviruses such as disease viruses, vaccinia viruses, and animal viruses such as ⁇ ''culovirus are used. Among them, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from Bacillus subtilis or a plasmid derived from yeast are preferably used.
  • promoters that regulate the DNA expression include, but are not limited to, promoters of DNA derived from 1 virus (eg, Simian virus, cytomegalovirus, Moroni monoleukemia virus, JC virus, breast cancer virus, poliovirus, etc.), 1 Promoters derived from one product (humans, egrets, dogs, cats, guinea pigs, eight muscles, rats, mice, etc.) Endothelin, muscle creatine kinase, glial fibrillary acidic protein, glutathione S-transferase, blood / h3 ⁇ 4-derived growth factor) 3, keratin Kl, K10 and ⁇ 14, collagen type I and II, cyclic AMP-dependent protein Kinase 3 I subunit, dystrophin, »£ Resistant Alkaline Phosphatase, Atrial Natriuretic Factor, Endothelial Receptor Oral Synthase (abbreviated as Tie 2), Sodium Potassium
  • the vector preferably has a sequence that terminates transcription of the messenger RN of interest in the DN-transferring mammal (referred to as “Yuichi Minei Yuichi”). More preferably, the sequence of each DNA derived from a mammal is used. SV40 of Minan virus is used.
  • the splicing signal of each DNA, the enhancer region, a part of the intron of eukaryotic DNA, etc. are translated to the 5 'upstream of the promoter region and the promoter region for the purpose of further expressing the desired exogenous DNA. It is also possible to link between the regions or 3 'downstream of the translation region for the purpose.
  • the normal translation region of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is derived from humans or various mammals (eg, rabbits, dogs, cats, guinea pigs, hamsters, rats, mice, and the like), TO, kidney, and shellfish.
  • the prepared complementary DNA can be obtained as a source, and the abnormal male DNA in the outer male can be mutated by the above-mentioned cells or the normal polypeptide translation region obtained by the spontaneous mutagenesis method.
  • the translated region is a DNA construct that can be expressed in a transgenic animal, and is linked downstream of the promoter and optionally upstream of the transcription termination site. It can be made by ordinary DNA engineering techniques.
  • the transfer of the exogenous I4 DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage depends on the! ! It is ensured to be present in all of the census and somatic cells.
  • the foreign DNA force of the present invention can be expressed by the fact that all the progeny of the produced animal carry the exogenous DNA of the present invention in all of their lin and somatic cells. Means The progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention will have the ttDNA of the present invention in all of its cells and cells.
  • the non-human lactate Lll to which the foreign I4IE normal DNA of the present invention has been transferred is confirmed to stably transfer the foreign * ttDNA by using the following method. Can be done.
  • the transfer of the DNA of the present invention at the egg cell stage is caused by It is ensured that all somatic cells are present in excess.
  • the reversal of * ttDNA outside of the present invention in the vesicles of the animal produced after the transfer of DNA means that the foreign I4 DNA of the present invention is circulated to all of the offspring of the produced animal. Means that.
  • the progeny of this type of animal that has inherited the exogenous DNA of the present invention will have the exogenous DNA of the present invention in all of its germ and somatic cells.
  • the non-human mammal having the normal DNA has been expressed with the normal DNA of the present invention, and by acting on ⁇ of the function of the endogenous normal DNA, finally ft finally has the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention Yuichiichi It is Rikikawa Nori to elucidate diseases of hyperfunction of proteins and diseases associated with the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, and to study treatment methods for these diseases.
  • the mammal to which the normal DNA of the present invention has been transferred is capable of exhibiting the increased symptoms of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, and the polypeptide of the present invention. Further, it can also be used for a screening test for a therapeutic agent for a disease associated with the receptor protein of the present invention.
  • a non-human mammal that has #T as its extraordinary DNA of the present invention can be stably bred to the foreign I4 DNA by crossing, and can be bred and maintained as a normal animal as the DN DN-bearing animal. Furthermore, the desired foreign DNA can be incorporated into the above-described plasmid and used as a source material.
  • a DNA construct with a promoter can be prepared by a usual DNA engineering technique. Metastasis of the abnormal DNA of the present invention at the fertilized egg cell stage is ensured to be present in all m germ and somatic cells of the mammal.
  • the abnormal DNA of the present invention in the E cell of the animal after DNA transfer indicates that all the offspring of the animal produce the embryo. This means that the abnormal DNA of the present invention is contained in all cells and cells. Outside the present invention
  • the non-human mammal having the abnormal DNA of the present invention expresses the abnormal DNA of the present invention and expresses the polypeptide or tt * invention of the present invention by inhibiting the function of endogenous normal DNA. It may become functionally inactive refractory to Recept Yuichi protein, and can be transformed as a model animal for the disease. For example, using the abnormal DNA transgenic animal of the present invention to elucidate the pathophysiology of a functionally inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, and to examine a method for treating this disease. What you can do is a T ability.
  • the abnormal DNA-highly expressing animal of the present invention is characterized in that the abnormal polypeptide of the present invention in the functionally inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is used. It is a model to elucidate the function inhibition (dominant negative effect) of normal polypeptide by peptide.
  • the mammal to which the foreign abnormal DNA of the present invention has been transferred may have an increased symptom of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention, or the polypeptide of the present invention or the present invention. It can also be used for screening of therapeutic agents for functionally inactive refractory receptive proteins.
  • polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention by directly analyzing DNA or RNA in the tissue of the DNA-transferred animal of the present invention or analyzing the tissue of the polypeptide expressed by DNA. Analysis of the relationship with polypeptides that are specifically expressed or activated by proteins,
  • the mutant polypeptide of the present invention can be purified and its antibody can be produced.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention comprising a functionally inactive refractory disease of the polypeptide of the present invention or the receptor of the present invention.
  • it can contribute to the development of new treatment methods and further to the treatment of the disease:
  • each of the DNAs of the present invention was taken out from the transgenic animal of the present invention), cut into small pieces, and then obtained by using a protein such as trypsin to obtain DNA-transferred cells, culturing the cells, or systematizing the cultured cells. What you can do is a T ability.
  • a protein such as trypsin
  • the specification of the polypeptide of the present invention or the receptor protein-producing cell of the present invention, apoptosis, the relationship with differentiation or proliferation, or the signal transmission structure in them, and their abnormalities are examined.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention and an effective research material for elucidating the action thereof can be provided.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention containing a functionally inactive refractory disease of the receptor of the present invention.
  • the method for treating a DNA associated with the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention by using the D ⁇ transgenic animal of the present invention or the * ttD ⁇ expression vector of the present invention It is important to consider and develop
  • the present invention impairs the non-human threatened sleep deficiency of the DNA-activated non-human mammal of the present invention and the DNA of the present invention. That is, the present invention
  • a non-human mammal in which the DNA of the present invention has been transformed U3 ⁇ 4 embryonic stem cells U3 ⁇ 4 embryonic stem cells
  • the DNA is inactivated by the introduction of 3-galactosidase (e.g., derived from a bacterium), and the reporter remains (5 ⁇ ) is a promoter for the DNA of the present invention.
  • 3-galactosidase e.g., derived from a bacterium
  • a non-human mammal according to (6) which can be expressed by
  • the animal according to the above (7) is administered with the Sadani conjugate to promote or inhibit the promoter activity of the DNA of the present invention, which is characterized by detecting the expression of Htfe repo overnight.
  • a method for screening a compound or a salt thereof is provided.
  • the DNA-enhanced non-human mammalian U-cell K cell of the present invention is a non-human mammal capable of suppressing the expression of DNA by artificially mutating the DN of the present invention.
  • the DNA substantially reduces the activity of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in which the DNA encodes, whereby the DNA of the present invention is substantially reduced.
  • Non-human E cell hereinafter abbreviated as ES cell
  • ES cell which does not have the ability to express peptide or receptor protein of the present invention (hereinafter sometimes referred to as knockout DNA of the present invention). .
  • the method of artificially mutating the DNA of the present invention can be performed, for example, by deleting or deleting the DNA sequence or inserting or substituting another DNA by a genetic engineering technique. These mutations can, for example, shift the codon reading frame or promote
  • the knockout DNA of the present invention may be obtained by disrupting the function of the ter or exon.
  • DNA-enhanced non-human BS-L cells of the present invention include, for example, The DNA of the present invention contained in the non-human Lfj product is isolated and its exon portion is treated with neomycin-resistant ttitfe?
  • ffitfe ⁇ which is representative of hygromycin resistant ffite ⁇ , or repo ⁇ ⁇ ⁇ , which is representative of lac Z (/ 3-galactosidase, cat (chloramphenico-l-acetyltransferase3 ⁇ 4)
  • Insert a DNA sequence that disrupts exon function or terminates transcription in the intron region between exons eg, poly A I signal
  • ⁇ disable synthesis of messenger RNA.
  • a DNA strand hereinafter abbreviated as “Yuichi Getter Vector”
  • Yuichi Getter Vector which is a DNA sequence constructed so as to eventually destroy the residue, is introduced into the chromosome of the object by, for example, the homologous fiber method.
  • the knockout ES cells of the present invention are obtained by PCR using the above DNA sequence and the DNA sequence of the neighboring region other than the DNA of the present invention used in the evening getter vector as primers. be able to.
  • ES cells from which the DNA of the present invention is inactivated by the homologous recombination method or the like for example, those already established as described above may be used, and the method described in Evans and Kaufma may be used. May be newly established.
  • mouse ES cells: ⁇ currently there are 129 ES cells on the shelves, but the background of the medulla is not clear, so the genetic background is clear in the medulla ⁇ in an alternative pure line
  • C57BLZ6 mice and BDF1 mice F1 between C57BLZ6 and DBAZ2
  • C57BLZ6 mice and BDF1 mice F1 between C57BLZ6 and DBAZ2
  • the BDF1 mouse has a large number of eggs collected and the eggs are robust, and in addition to the C57B LZ6 mouse background, the ES cells obtained using this are used as a disease model.
  • a mouse When a mouse is created, it can be advantageously used to backcross C57BLZ6 mice to replace their genetic background with C57BL / 6 mice, in that it is a powerful ability.
  • ⁇ are fluffed at 3.5 days after fertilization in ⁇ , but in addition to these, eight small flat embryos are collected and cultured to the germ and used efficiently. Early embryos can be obtained.
  • any ES cell may be used, but the ES cell of Tsurugada is more convenient for creating a germline chimera. It is also desirable to discriminate between males and females as soon as possible in order to eliminate complicated culture labor.
  • a method of amplifying and detecting the fe of the sex-determining region on the ⁇ -isomer by PCR method can be cited as an example.
  • the number of ES cells required to perform the analysis was about 10 6 , but only about 1 colony of ES cells (about 50 cells) was required.
  • the primary selection of ES cells in the early stage was performed by discrimination of the fiber, which was the power of Noh. By enabling ⁇ of the vesicles in ⁇ , the initial labor was greatly reduced.
  • the first selection can be performed, for example, by confirming the chromosome by the G-banding method.
  • the number of chromosomes in ES cells obtained is preferably 100% of the normal number.
  • the viable cell line obtained in this way usually has very good growth properties, but it is easy to lose its ability to develop ontogenously, so it is light to subculture it.
  • a suitable feeder cell such as STO «M vesicle, preferably 5% CO2, 95% air or 5% « Culture at about 37 in 5% charcoal, 90% empty, etc.
  • trypsin / EDTA solution usually 0.001-0.5% trypsin / 0.1-5 mM EDTA, preferably A single cell is prepared by treatment with a 0.1% tribasin (ZlmM EDTA) and seeded on a newly prepared feeder " ⁇ cell. 3 ⁇ 4T method is taken.
  • Such subculture is usually performed every 1 to 3 days. At this time, the cells are subjected to cell culture, and when morphologically abnormal cells are found, the culture cells thereof are likely to grow.
  • ES cells can be divided into various types of cells, such as SUM muscle, visceral muscle, and myocardium, by monolayer culture up to high density under appropriate conditions, or by suspension culture until lakes are formed. It is the ability to transform ⁇ J and CM J. Evans and MR Kaufman, Nature 292, 154, 1981; G. H Mart in Proceedings of the National Academy of Sciences USA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) Vol. 78, p. 7634, 1981; C. Doetschman et al., Journal 'Ob' Embriology 'and' Ex Remental 'Morphology, Vol. 87, 27, 1985], the DNA-deficient cells of the present invention obtained by differentiating the ES cells of the present invention can be obtained by in vitro cell biology of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in vitro. Useful.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be distinguished from the positive KI product by measuring the mRNA level of the i-product using a known method and indirectly comparing the expression level. is there.
  • the non-human mammal those similar to itifS can be used.
  • the DNA-deficient non-human mammal of the present invention can be obtained, for example, by introducing the so-called evening-targeting vector into a mouse K cell or mouse egg cell as described above,
  • the present invention is achieved by causing homologous recombination to replace the DNA of the present invention on the chromosome of a mouse cell or a mouse egg cell by the homozygous D? DNA can be knocked out.
  • Cells in which the DNA of the present invention has been knocked out can be used as a targeting vector and a DNA sequence on a Southern octave hybridization analysis or evening targeting vector using a DNA sequence on or near the DNA of the present invention as a probe. It can be determined by ff by a PCR method using a DNA sequence of a nearby region other than the DNA of the present invention derived from the mouse as a primer.
  • the ⁇ using non-human mammalian cells was used to clone the activated DNA cell line of the present invention using the remaining ⁇ ⁇ homologous fibers, and the cells were placed at an appropriate time, for example, 8 hours. Careless non-human Transfer the resulting chimeric embryo to the non-human mammal pup that has been pseudopregnant. And a cell having the DNA locus of the present invention mutated into a chimeric animal.
  • all the fibers are artificially mutated from the individual obtained by combining such a chimera individual with a normal individual. It can be obtained by subjecting an individual composed of the added cells having the DNA locus of the present invention to SgiJ, for example, by judging the body color.
  • the 1 @: thus obtained is usually a heterozygous expression of the polypeptide of the present invention » and individuals with heterozygous expression of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention heterozygously. Then, from the offspring, individuals deficient in homoexpression of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention can be obtained.
  • the age of inverting the egg cell can be determined by, for example, obtaining a transgenic non-human mammal in which the evening getter is introduced into the chromosome by injecting the DNA solution into the nucleus of the egg by microinjection. Compared with these transgenic non-human mammals, they can be obtained by selecting those having a mutation in the DNA locus of the present invention by homology to the transgenic ⁇ .
  • the key in which the DNA of the present invention is knocked out in this manner is that the live ⁇ -body obtained by 3 ⁇ 4 @ ⁇ is also bred in normal breeding ⁇ after confirming that the DNA has been knocked out. I can.
  • germline venom may be followed in a conventional manner.
  • T that is, by homologating the TO-DNA to three other animals, a homozygous animal having the homologous DNA on both homologous chromosomes can be obtained.
  • the obtained homozygote animal can be obtained efficiently by keeping the animal in a normal state and a homozygote state where the homozygote is plural.
  • the fiber of the heterozygous animal is used to replace the homozygous and heterozygous animals carrying the TO-modified DNA.
  • U animal embryonic stem cells of the present invention are extremely useful for producing the non-human mammalian J cells deficient in DNA expression of the present invention.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention lacks various biological activities that can be induced by the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention. Since it can be a model of ⁇ caused by the production of the protein of Recept Yuichi protein of the invention, it is useful for investigating the cause of these and for examining the removal of wood.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention can be used for screening for a compound that can be used for treatment and / or preservation of DNA caused by DNA deficiency or damage of the present invention. That is, the present invention provides a method for administering a compound to a non-human mammal L-j deficient in expression of DNA of the present invention, which makes it difficult to measure changes in the animal. To provide a method for screening a compound or a salt thereof having a therapeutic and / or therapeutic effect on a disease caused by the disease.
  • non-human mammal deficient in expressing DNA of the present invention used in the screening method include those similar to Kamimi.
  • Test compounds include, for example, peptides, proteins, non-peptidic compounds, synthetic compounds, fermentation products, cell extracts, explants, animal thread extracts, and plasma, and these compounds are novel. It may be a compound or a known compound.
  • the non-human mammal deficient in DNA expression of the present invention is treated with a compound, compared with an untreated paired ⁇ -substance, and treated with the compound based on changes in the organs, the symptoms of ⁇ , etc. ⁇ Ml ⁇ can be calculated.
  • oral administration, intravenous ft, etc. are used as a method of treating an object with a spare compound, and ffil is selected according to the symptom of the object, the nature of the compound, etc.
  • the dose of the test compound can be selected according to the administration method, the properties of the fiber compound, and the like.
  • H. pylori infection eg, an inhibitor of gastrin secretion
  • Diarrhea due to reduced intestinal absorption, increased secretion, or abnormal gastrointestinal dysfunction eg, Shortbow 1 syndrome
  • diarrhea caused by drugs such as cancer chemotherapy, diarrhea caused by congenital small intestine atrophy, diarrhea caused by «endocrine J» such as VIP-producing tumor, diarrhea caused by AIDS, bone marrow transplantation
  • Treatments such as diarrhea caused by graft reaction against the host, diarrhea caused by diabetes, diarrhea caused by abdominal ablation, diarrhea caused by systemic sclerosis, and diarrhea caused by eosinophilia.
  • Cancer or cancer eg, carcinomatous cancer, ws, breast cancer,. Small ws, non-small m, falling ⁇ , stomach cancer, bile duct cancer, m, bladder, medulla, melanoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, malignant tan ⁇ ⁇ , Graceful, ⁇ mm.
  • leukemia e.g, leprosy leukemia leukemia ⁇ chronic lymphocytic leukemia, chronic myelogenous leukemia, Hodgkin's disease, non-Hodgkin's lymphoma, etc.
  • the Jirin may be used in conjunction with occupations or other controls (eg, Moxifen, LRH agonist, LHRH Angagonist, Interferon-1 ⁇ , 3 and r, Interleukin-12, etc.) But can, (10) vascular cardiomyopathy, arteriosclerosis, valvular heart disease, myocardial infarction (especially after cardiomyopathy), prevention of revascularization-cure «, (11) « static Healing of hemorrhage, dysfunction, peripheral vascular disease, (12) Based on the regulation of secretion of physiologically active substances (eg, substance P, evening hykinin, cytokinin, etc.) acting on the medulla system, such as systemic Or diseases associated with local inflammation (e
  • the age at which the compound was administered to the object and the blood glucose level of the object decreased by about 10% or more, preferably 30% or more, more preferably 30% or more.
  • the ⁇ compound can be selected as a compound which has a therapeutic effect on the above-mentioned diseases.
  • the compound obtained by using the screening method is a compound selected from the above-mentioned conjugates, and is caused by deficiency or damage of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention. It can be used as a medicament, such as a prophylactic agent, for treating a disease that has a therapeutic effect on the disease. Further, compounds derived from the above-mentioned screening-humiliated compounds can be used as well.
  • Salts of the compound obtained by the screening method may be an acid (eg, fiber acid, organic acid, etc.) or ⁇ ⁇ S (eg, alkali And the like, and the like, and particularly preferred are acid salts that are physiologically acceptable.
  • Such salts include, for example, salts with an anaerobic acid (eg, phosphoric acid, phosphoric acid, wisteria, etc.) or organic acids (eg, ⁇ , ⁇ , propionic acid, fumaric acid, maleic acid) Acid, succinic acid, mm., Citric acid, linco, difficult, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc.).
  • an anaerobic acid eg, phosphoric acid, phosphoric acid, wisteria, etc.
  • organic acids eg, ⁇ , ⁇ , propionic acid, fumaric acid, maleic acid
  • Acid succinic acid, mm., Citric acid, l
  • the #T pharmaceutical containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be prepared in the same manner as the knit pharmaceutical containing the polypeptide of the present invention. Since the preparations thus obtained are fg3 ⁇ 4 in water, they can be used, for example, in humans or noodles (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, sheep, pigs, dogs, dogs, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the disease, administration route, administration route and the like.
  • the compound is administered in an amount of about 0.1 to about 100 mg / day; preferably, 100 to 50 mg, more preferably 1.0 to 50 mg, and more preferably 1.0 to 20 mg.
  • the age at which the compound is administered parenterally may vary depending on whether the compound is administered in a single dose, depending on whether the compound is administered or not, and for example, the compound is usually administered to adults (as 60 kg) in the form of a thigh.
  • about 0.01 to 30 mg of the compound per day preferably 0.1 to 20 mg apart, more preferably about 0.1 to 1 mg per day, is administered by venous dragon. It is convenient to administer. ⁇ & From other animals can also be dosed at the price purchased per 60kg.
  • the present invention relates to a method for administering a promoter to a DNA of the present invention, which comprises administering a fiber compound to a non-human mammal L-DNA deficient in expressing the DNA of the present invention and detecting the expression of repo all-in-ones. It provides a method for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits it.
  • the DNA of the present invention lacking expression of the non-human DNA of the present invention includes, among the above-mentioned non-human mammals of the present invention lacking expression of the DNA, the DNA of the present invention,
  • the repo is recombined by introducing a progeny, and the repo can be expressed in the control TF of the promoter for DNA of the present invention.
  • Examples of the dagger are the same as those of Ml.
  • the same gene as tfil itself is used, and 3-galactosidase (1 acZ), soluble alkaline phosphatase gene or luciferase gene is preferable.
  • the reporter since the reporter remains the promoter of the present invention, the activity of the promoter can be detected by tracing the expression of the substance encoded by the reporter.
  • the polypeptide of the present invention when a part of the DNA region encoding the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention is substituted with a 3-galactosidase gene (1 ac ⁇ ) derived from Escherichia coli, the polypeptide of the present invention is naturally Alternatively, 3-galactosidase is expressed instead of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in a tissue expressing the receptor protein of the present invention. Therefore, for example, by staining with a reagent serving as a substrate for 3-galactosidase, such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-) 3-galactopyranoside (X-gal), it is easy to carry out the staining.
  • a reagent serving as a substrate for 3-galactosidase such as 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-) 3-galactopyranoside (X-gal
  • the expression state of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in an animal body can be observed.
  • the polypeptide of the present invention or the receptor protein-deficient mouse of the present invention or a ⁇ a3 ⁇ 4o fragment thereof is fixed with dartalaldehyde or the like, and washed with phosphorus-associated physiological diet m (PBS). After reacting for about 30 minutes to 1 hour at room temperature or around 37 at room temperature or 37 ° C, the / 3-galactosidase reaction was stopped by washing M tubes with ImM EDTAZP BSW. The coloration may be ⁇ T. Further, mRNA encoding 1acZ may be detected according to a conventional method.
  • the compound or a salt thereof obtained by using the above-mentioned screening method is a compound selected from the above-mentioned intellectual compounds, and is a compound that has a key or inhibits the promoter activity for DNA of the present invention.
  • Salts of the compound which may form the compound ⁇ obtained by the screening method include physiologically acceptable acids (eg, carboxylic acid) and thighs (eg, organic acid). Salts are used, and particularly preferred are oral salts that are physiologically acceptable. Such salts include, for example,
  • M for example, sulfuric acid, phosphoric acid, odorous acid, lime, etc.
  • organic acids for example, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, succinic acid, s «, quen
  • salts with acids, lingo, keys, benzoic acid, methanesulfonic acid, benzenesulfonic acid, etc. are used.
  • the compound or a salt thereof that promotes or inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention promotes or inhibits the expression of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention, and inhibits the function of the polypeptide or the receptor protein. Because of the ability to inhibit iSt or T, for example, high ⁇ , autologous illness, ⁇ all, cataract, glaucoma, acute ⁇ 4 Alcohol inflammation, Alzheimer's disease
  • Rheumatoid arthritis psychiatric ⁇ 3 ⁇ 4, leukemia, shock, severe systemic myelogenesis «, small cell lung cancer, injury, stomach cancer, systemic lupus erythematosus, ⁇ ⁇ 1' ⁇ «seizure, ⁇ ⁇ , valvular heart disease, It is useful as a drug for ig ⁇ treatment and prophylactic agents for diseases such as vascular multiple infarction, wound healing, arthrititis, pituitary hormone secretion deficiency, uremia, or degenerative diseases.
  • diseases such as vascular multiple infarction, wound healing, arthrititis, pituitary hormone secretion deficiency, uremia, or degenerative diseases.
  • the compound or its salt of the present invention that inhibits or inhibits the activity of a promoter for DNA is useful as a medicament such as a therapeutic agent for MACULAR EDEMA CYST0ID.
  • the compound of the present invention which inhibits the promoter activity against DNA by Fiber or T, or a salt thereof is as follows: (1) Acromegaly, TSH tumor, non-secretory (shelf ability '1 ⁇ pituitary gland, ectopic Sex AC TH.
  • diarrhea due to decreased intestinal absorption, increased secretion or abnormal gastrointestinal tract fiber eg, Shortbowe 1 disease, etc.
  • diarrhea caused by »1 such as cancer chemotherapy, diarrhea caused by congenital small intestine ⁇ , diarrhea caused by neuroendocrine tumors such as VIP production ®3 ⁇ 4
  • the medicine containing the compound or a salt thereof obtained by the screening method can be weighed in an amount of 5 g in the same manner as the medicine containing the polypeptide of the present invention or the salt thereof.
  • the verses obtained in this way are sexually sensitive, such as, for example, in humans or nursing animals (eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, hidges, bush, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.).
  • nursing animals eg, rats, mice, guinea pigs, egrets, hidges, bush, horses, cats, cats, Dogs, monkeys, etc.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the sculpture disease, the sculpture, the administration route and the like.
  • the compound is administered in an amount of about 0:!-1 O Omg per day, preferably 1.0-5 O mg, more preferably 1.0-20 mg per day.
  • the age of parenteral administration also depends on the administration of a single dose of the compound, rubber disease, etc.
  • a compound having promoter activity for DNA of the present invention is usually administered to an adult (as 60 kg) in the form of an ft ⁇ agent. It is advantageous to administer L Omggm by intravenous ftW, preferably from 0.1 to 20 mgS, more preferably from 0.1 to: L Omggm. ⁇ & Other animals are also able to administer elevated amounts per 60 kg.
  • the compound of the present invention which inhibits the promoter activity against DNA in the age of orally administering the compound of the present invention which inhibits the promoter activity against DNA, "in adults (assuming a body weight of 60 kg), the compound is reduced to about 0.1 per day. ⁇ 100 mg, preferably 1.0 ⁇ 50 mg, more preferably 1.0 ⁇ 2 Omg
  • the age of parenteral administration depends on the dose of the compound.
  • a compound that inhibits the promoter activity of the DNA of the present invention * T is usually administered to an adult (as 6 Ok) in the form of an ait agent. It is advantageous to administer the intravenous injection of 0.1 to 30 mgn, preferably 0.1 to 0.2 mg, more preferably about 0.1 to: L Omgg ⁇ . It is powerful to administer the dose per 60 kg.
  • the non-human female L-J product deficient in DNA expression of the present invention is extremely useful for screening a compound or a salt thereof which promotes or inhibits the overnight activity of the promoter for DNA of the present invention. It can greatly contribute to the investigation of the causes of various diseases caused by the insufficient expression of DNA of the present invention or the development of preventive and therapeutic agents.
  • transgenic ⁇ product DNA encoding various proteins is ligated downstream thereof, and this is transferred to the egg cell of an animal. Then, if a so-called transgenic animal (transgenic ⁇ product) is made, it will be possible to synthesize the polypeptide or protein specifically and examine its action in the living body. Furthermore, by binding an appropriate repo protein to the above promoter portion and establishing a cell line capable of expressing the same, the production of the polypeptide of the present invention or the receptor protein of the present invention in the body itself can be achieved. It can be used as a search system for low-molecular compounds that have the ability to specifically promote or inhibit the ability. WO 00/29441 jQj PCT / JP99 / 06283
  • the receptor for the polypeptide of the present invention can be identified as follows. Many of the receptors for bioactive peptides are seven-transmembrane receptors, and a number of orphan receptors with unknown ligands have been reported. Therefore, these orphan receptors are expressed in appropriate cells such as CH0 cells and HEK293 cells, and the polypeptide of the present invention is added to them to determine whether they have a cell stimulating activity to induce specific signal transduction. By examining the specificity, a specific receptor can be identified. In addition, by introducing a genomic or cDNA library into appropriate animal cells, adding a radioisotope-labeled polypeptide of the present invention thereto, and examining the binding thereof, it is possible to generate a receptor-encoding gene. it can.
  • the present invention uses the nucleus that the sequence encoding the bioactive peptide is often returned as a peptide sequence, and uses the unknown bioactive peptide or its amide or its ester or its ester.
  • the present invention also provides a method for preparing these salts, and a biologically active peptide or amide or ester thereof or a salt thereof obtained by the method.
  • sequence motif of a bioactive peptide examples include an RFG (R / K) sequence or RSG, which is a difficult sequence of the polypeptide of the present invention having an RF amide, RS amide, or RL amide structure, for example.
  • a DNA sequence capable of encoding such a short amino acid sequence is characterized by the fact that even a DNA sequence of a bioactive peptide appears by chance by a considerable amount, and such a sequence is repeated. The ability to find DNA encoding a bioactive peptide with a higher probability by searching for a sequence that does.
  • the probe include, as a peptide sequence, a DNA sequence corresponding to RFG (K / R), RSG (K / R), and RLG (K / R).
  • RFGK 5'- (C / A) G (A / C / G / T) TT (T / C) GG (A / C / G / T) AA (A / G) -3 '(SEQ ID NO: 2 0)
  • RFGR 5'- (C / A) G (A / C / G / T) TT (T / C) GG (A / C / G / T) (A / C) G (A / C / G / T ) -3 '(SEQ ID NO: 21)
  • RSGK 5'- (C / A) G (A / C / G / T) (A / T) (C / G) (A / C / G / T) GG (A / C / G / T) M (A / G) -3 '(SEQ ID NO: 22)
  • RSGR 5'-(C / A) G (A / C
  • RLGK 5'- (C / A) G (A / C / G / T) (T / C) T (A / C / T / G) GG (A / C / G / T) AA (A / G ) -3 '(SEQ ID NO: 24)
  • RLGR 5'- (C / A) G (A / C / G / T) (T / C) T (A / C / T / G) GG (A / C / G / T) (A / C) G (A / C / G / T) -3 ′ (SEQ ID NO: 25).
  • a target gene can be obtained by screening a cDNA or genomic library using the sequence motif.
  • the target mRNA can be purified using the above-described probe, as in the case of a gene trapper, and cDNA can be obtained from the mRNA.
  • the identification of a bioactive peptide having an RF amide, RS amide or RL amide structure using other sequence motifs is also possible. Can be used.
  • peptides having an RF amide, RS amide or RL amide structure have an RF amide, RS amide or RL amide structure on the C-side of the peptide, and thus include an RF amide, RS amide or RL amide structure
  • peptides with unknown RF aiide, RS amide, or RL amide structure can be converted into ⁇ .
  • most of the receptors for peptides having the RF amide, RS amide, or RL amide structure are seven-time wakeful receptors.
  • Nada or fractionated animal tissue extracts using anti-RF amide antibody, anti-RS amide antibody or ⁇ 3 ⁇ 4tRL amide antibody are added to orphan receptor-expressing cells whose ligands have not been determined, and their signal transduction is performed. By examining it, the ligand of the orphan receptor can be determined.
  • This method is also used for peptides of RF amide, RS amide or RL amide structure, as there are many peptides with common sequences other than peptides with RF amide, RS amide or RL amide structure. be able to.
  • the receptor protein of the present invention is a ligand for the receptor protein of the present invention or a salt thereof. (Agonist) It is useful as a reagent to listen to or make decisions.
  • the present invention provides a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, which comprises contacting the receptor protein of the present invention with a test compound.
  • Test compounds include known ligands (for example, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, guremin, serotonin, melatonin, neuropeptide ⁇ , opioid, purine, vasopressin, oxotocin, PACAP, secretin, glucago).
  • known ligands for example, angiotensin, bombesin, cannabinoid, cholecystokinin, guremin, serotonin, melatonin, neuropeptide ⁇ , opioid, purine, vasopressin, oxotocin, PACAP, secretin, glucago).
  • the ligand determination method of the present invention uses the receptor protein of the present invention of the present invention, or constructs an expression system for the fly receptor protein of the present invention, By using the Atsushi system, it binds to the receptor protein of the present invention and has a cell stimulating activity (eg, arachidone 3 ⁇ 4 ⁇ , acetylcholine, intracellular Ca 2+ listening, intracellular cAMP «, intracellular cGMP, inositol Compounds having activity or activity ft that activates or suppresses phagocytosis, cellular potential, phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-fos, and lowering of pH (e.g., peptides, proteins, non-peptide compounds, Synthetic compounds, fermentation products) or It is a method to determine the salt.
  • a cell stimulating activity eg, arachidone 3 ⁇ 4 ⁇ , acetylcholine, intracellular Ca 2+ listening, intracellular cAMP «, intracellular cGMP, in
  • the age of the contact of the receptor protein of the present invention with the test compound for example, the binding of the compound to the receptor protein of the present invention, the cell activity and the like are measured. "To do.
  • the present invention provides
  • the ⁇ compound was incorporated into the receptor protein of the present invention:
  • the ligand for the receptor protein of the present invention wherein the measurement of the binding of the labeled woven compound to the protein in * is a fiber.
  • the conjugation product thus obtained is transported to a cell or cell containing the receptor protein of the present invention, and the binding of the compound to the cell or cell is measured.
  • the method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention, the ligated product obtained by the above method, was expressed on a cell membrane by culturing a transformant containing DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention which comprises measuring the fi of the difficult compound to the receptor protein when the receptor compound is brought into contact with the receptor protein;
  • the activity of the protein via the receptor protein eg, arachidone ⁇ m, acetylcholine resistance, intracellular Ca 2 + Fraction, activity or regulation that promotes intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphorus production, cell membrane potential ⁇ , phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-ios, reduction of pH, etc.
  • the activity of the protein via the receptor protein eg, arachidone ⁇ m, acetylcholine resistance, intracellular Ca 2 + Fraction, activity or regulation that promotes intracellular CAMP production, intracellular cGMP production, inositol phosphorus production, cell membrane potential ⁇ , phosphorylation of intracellular proteins, activation of c-ios, reduction of pH, etc.
  • Receptor protein-mediated elimination activity when a compound is used to induce a receptor protein that has been carefully expressed by culturing a plasmid containing a DNA encoding the receptor protein of the present invention.
  • a compound for example, arachidone ⁇ !, acetylcholine fine cell, intracellular Ca 2+ awakening, intracellular c AMP generation, intracellular c GMP «, inositol-lurine spontaneous, cell voltage fluctuation, intracellular protein phosphorylation, c — Promotes activation of fos, decrease of pH, etc.
  • a method for determining a ligand for the receptor protein of the present invention Promotes activation of fos, decrease of pH, etc.
  • any receptor protein used in the ligand assay may be used as long as it contains the above-described receptor protein of the present invention.
  • Suitable receptor proteins are suitable.
  • the above-mentioned expression method is used, and it is preferable to carry out the expression by expressing the receptor protein-encoding DNA in mammalian cells or kelp cells.
  • Complementary DNA is usually used for the DNA fragment encoding the protein portion of interest, but is not necessarily limited to this.
  • a gene fragment or a synthetic DNA may be used.
  • a nuclear polyhedrosis virus belonging to a baculovirus using the DNA fragment as a host is required.
  • NPV nuclear polyhedros is virus
  • SV40-derived promoter SV40-derived promoter
  • retroviral promoter meta-mouth thionine promoter overnight
  • human heat shock promoter cytomegalovirus promoter overnight
  • cytomegalovirus promoter overnight it is preferably incorporated downstream such as the SRa promoter.
  • the quantity and quality of the expressed receptor can be determined by the method itself. For example, CNambi, P. et al., The 'Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chen), 267, 19555-19559, 1992] can be used.
  • the receptor protein of the present invention may be a receptor protein purified according to a method known per se or may contain the receptor protein. Cells or their components may be used.
  • the age and the blasts using cells containing the receptor protein of the present invention may be immobilized with daltaraldehyde, formalin, or the like.
  • the immobilization method itself can be performed according to the method of ⁇ ].
  • the cells containing the receptor protein of the present invention include host cells expressing the receptor protein of the present invention, and the main cells include fungi, kansuke, yeast, ⁇ ffl cells, and animal cells. Etc. are used.
  • fraction refers to a fraction containing a large amount of fine particles obtained by crushing cells and then obtaining the particles by the method of the present invention.
  • Cells can be crushed by crushing the cells with a Potter-Elvehjem homogenizer, Warlin Blender ⁇ Polytron (crushing by Kinematica, crushing by ultrasonic waves, and spouting cells from a narrow nozzle while applying pressure by a French press, etc.
  • the fractionation by careful centrifugal force is mainly used for careful fractionation.
  • the amount of receptions evening one protein-containing Ru cells and their in ⁇ the receptions evening over protein, 1 of the cell is equivalent or 1 0 3 - 1 0 8 loaf is' preferably, 1 0 5 ⁇ : 1 0 Preferably, there is.
  • the receptor protein fraction is preferably a natural receptor protein fraction or a fiber type receptor fraction having an activity equivalent thereto.
  • equivalent activity refers to equivalent ligand binding activity, signal ft signaling activity, and the like.
  • the ligand for the receptor protein of the present invention in order to determine the ligand for the receptor protein of the present invention, first, cells or cells containing the receptor protein of the present invention are converted into a buffer suitable for the determination method.
  • the buffer can be any buffer that does not inhibit the binding of the ligand to the receptor protein, such as phosphorus / sofa at pH 4-10 (M or preferably pH 6-8) and Trisue: 3 ⁇ 4 / sofa. May be.
  • various proteins such as surfactants such as CHAPS, Tween-80 TM (One Atlas II), digitonin, and deoxycollate, etc. Can be added to the buffer.
  • a protease inhibitor such as PMSF, leptin, E-64 (Peptide Lab ⁇ f3 ⁇ 4), and peptide kinase may be added to the protein to inhibit receptor-induced receptor binding and ligand ⁇ . it can. 0.0 lml to l Om 1 of the said receptor.
  • the reaction is performed at about 0 to 5 Ot :, preferably at 4 ° C to 37: for about 20 minutes to 24 hours, preferably at tt * sharp for 30 minutes to 3 hours.
  • ⁇ is applied to the glass and washed with the same buffer, and the radioactivity remaining in the glass is measured using a night scintillation counter or an amber counter.
  • Measure with A test compound in which the count (B-NSB) obtained by subtracting the nonspecific (NSB) from the total ( ⁇ ) exceeds 0 cpm can be selected as a ligand (agonist) for the receptor protein of the present invention.
  • the cell stimulating activity via the receptor protein (for example, arachidonic acid «, acetylcholine resistance, intracellular C a) 2+ fraction, Intracellular c AMP, Intracellular c GMP, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Activity to promote or suppress the activity of pH decrease, etc. )
  • the cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid «, acetylcholine resistance, intracellular C a) 2+ fraction, Intracellular c AMP, Intracellular c GMP, Inositol phosphate production, Cell membrane potential fluctuation, Intracellular protein phosphorylation, Activation of c-fos, Activity to promote or suppress the activity of pH decrease, etc.
  • the cell stimulating activity via the receptor protein for example, arachidonic acid «, acetylcholine resistance, intracellular C a) 2+ fraction, Intracellular c
  • a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells Before determining the ligand, use a fresh medium or an appropriate buffer that is not toxic to cells, add a fiber compound, etc., incubate for a certain period of time, and then extract the cells or collect the supernatant.
  • the quantified product is quantified according to each method. Horin! ! If it is difficult to produce a substance as an indicator of sexuality (for example, arachidonic acid) due to the ⁇ element contained in the cells, it may be possible to perform an assay by adding an obstacle j to 1 ⁇ element. . In addition, activities such as cAMP production suppression can be detected for production of cells whose target production has been increased with forskolin or the like.
  • the ligand determination kit for the receptor protein of the present invention may be a cell containing the receptor protein of the present invention, a cell containing the protein of the present invention, or a cell containing the protein of the present invention. It contains the amount of
  • Examples of the ligand determination kit of the present invention include the following.
  • CHO cells expressing the receptor protein of the present invention were subcultured on a 12-well plate in 5 ⁇ 10 5 wells, and cultured for 2 days at 37, 5% C 2 and 95% air.
  • aqueous solution Store the aqueous solution at 4 or 1-20 and dilute to L / M with the measuring buffer before use.
  • Compounds that are poorly soluble in water are dissolved in dimethylformamide, DMSO, methanol, etc.
  • ligands that can be supplied to the receptor protein of the present invention include, but are not limited to, brain, pituitary gland, and viscera.
  • Adenine (A), guanine (G) or thymine (T) Adenine (A), guanine (G) or thymine (T)
  • V adenine (A), guanine (G) or cytosine (C)
  • N adenine (A), guanine (G), cytosine (C) or thymine (T) or unknown or other; ⁇ S
  • RNA ribonucleic acid
  • mRNA messenger ribonucleic acid
  • sequence numbers in the sequence listing in the present specification indicate the following sequences.
  • SEQ ID NO: 1 shows a sequence of a salt of a DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1. [SEQ ID NO: 3]
  • Example 1 shows the nucleotide sequence of primer F1 used in Example 1 of Example 1.
  • Example 3 shows the nucleotide sequence of primer hR1 used in Example 3 of Example 1.
  • Example 1 shows the amino ⁇ SH sequence (human type) of the polypeptide of the present invention obtained in Example 3 of ⁇ .
  • FIG. 9 shows the sequence of primer bF7 used in Example 4 of the thigh.
  • Example 5 shows the: IS sequence of primer bR7 used in Example 4 of Example 1.
  • FIG. 3 shows an amino sequence ( ⁇ type) of the polypeptide of the present invention obtained in Example 4.
  • FIG. [SEQ ID NO: 15] This shows the sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 14.
  • FIG. 13 shows the nucleotide sequence of primer rLPR1 used in Example 5 of ⁇ .
  • Example 2 shows an amino sequence (rat type) of the polypeptide of the present invention obtained in Example 5 (before recloning).
  • FIG. 2 shows a donkey sequence of DNA encoding the polypeptide of the present invention having the amino ⁇ S3 sequence represented by SEQ ID NO: 18.
  • FIG. 1 shows a nucleotide sequence encoding an RFGR sequence.
  • ⁇ Circle around (2) ⁇ shows the: ⁇ S sequence of primer FF2 used in Example 6.
  • Example 13 shows the sequence of the primer mF3 used in Example 6 of Example 1.
  • 5B shows the base sequence of the primer-moF used in Example 6 of 5S.
  • Example 5 shows the sequence of primer 11 used to clone cDNA encoding rat Gs receptor protein r ⁇ T7TO22L, which was obtained in Example 7 from rat brain stem region.
  • Example 7 shows the amino TO sequence of rat G-protein co-receptor Yuichi protein rOT7T022L obtained from the rat brain stem periphery obtained in Example 7.
  • FIG. 7 shows the sequence of cDNA encoding the rat peripheral brain stem-regulated G protein co-receptor Yuichi protein rOT7T022L obtained in Example 7.
  • FIG. 7 shows the sequence of cDNA encoding the rat peripheral brain stem-regulated G protein co-receptor Yuichi protein rOT7T022L obtained in Example 7.
  • Example 7 shows the amino acid sequence of the peptide obtained in Example 7 (3) of Example 1.
  • FIG. 9 shows the amino acid sequence of the peptide obtained in Example 7 (4) of the key.
  • a peptide containing the amino acid sequence from the 101st (Ser) to the 112th (Ser) of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is encoded; the sequence is shown.
  • SEQ ID NO: 47 A peptide containing the first (Met) -112 (Ser) amino acid hidden sequence of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 is coded: ⁇ S sequence is shown. [SEQ ID NO: 47]
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of primer ratF2 used in Example 5.
  • Example 7 shows the amino acid sequence (rat type) of the polypeptide of the present invention obtained in Example 5 (recloning ⁇ ).
  • SEQ ID NO: 50 shows a donkey sequence of a DN coding for the polypeptide of the present invention having the amino acid @ 6 sequence represented by 50.
  • ⁇ ⁇ Shows the nucleotide sequence of primer 1 bFR used in SS Example 9.
  • Example 2 shows a sequence of amino ⁇ E encoding a protein (polypeptide) represented by h0T7T022 obtained in Example 11;
  • the base sequence of primer 2 used in m11 is shown.
  • the transformant Escherichia col i JM109 / PhRFl obtained in Example 2 described below has been produced by the Ministry of International Trade and Industry since April 14, 1999! Deposited with Fukui Kogyo fcT (NIBH) under the deposit number FE RM BP-6702, and deposited with the Foundation (IF ⁇ ) on March 5, 1999 under the deposit number IF016265.
  • NIBH Fukui Kogyo fcT
  • the transformant Escherichia coli DHl OB / pAK-r ⁇ T022L obtained in Example 7 of the mouth was obtained from November 2, 1998 by the Ministry of International Trade and Industry (NIBH) and a deposit number I FO 16211 as a deposit number FERM BP-6558 on October 16, 1998.
  • NIBH Ministry of International Trade and Industry
  • the transformant Escherichia coli JM109 / prLPL6 obtained in Example 5 was Ministry of International Trade and Industry on May 2nd! Deposited from 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ W ⁇ f (NIBH) as deposit number FERM BP— 6814, deposited from the foundation ⁇ f (IF ⁇ ) from June 18, 1999 Deposited under the number IF0 16291.
  • Oligo dT primer (Gibco BRL3 ⁇ 4) was added as a primer to 1 g of human fetal brain poly (A) + RNA fraction purchased from Clonetech, and Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase (Gibco BRL3 ⁇ 4) was used to form a primer.
  • c DNA was synthesized. The latter product was extracted with phenol: cloth form (1: 1), dissolved in 3C1 TE after ethanol elimination. Using the prepared cDNA 11 as type III, amplification by PCR was performed using the following two primers (F5 and F6).
  • F 5 5'-GGGCTGCACATAGAGACTTAATTTTAG-3 '(SEQ ID NO: 3)
  • F 6 5-CTAGACCACCTCTATATAACTGCCCAT-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • the anti-IS night is based on synthetic DNA primers (F5 and F6) 20pM each, 0.25mM dNTPs, Ex Taq DNA polymerase 0.51 and the buffer attached to the enzyme-51, the total reaction volume is 50X It was set to 1.
  • the cycle for the amplification was 98 cycles of 10 seconds, 63 seconds, 20 seconds, 72 V, and 40 seconds using a thermal cycler (Perkin Elmer) 40 times.
  • amplification of nested PCR was performed using the following two primers (F1 and R5) using the PCR product 11 as type II.
  • R5 5-CATGCACTTTGACTGGTTTCCAGGTAT-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • the stringency of anti-stringency was determined by using synthetic DNA primers (F1 and R5) at 20pM each, 0.25mM dNTPs, Ex Taq DNA polymerase 0.51 and the buffer 5/1 supplied with the element. did.
  • the cycle for amplification was repeated 40 times using a thermocycler (Perkin-Elma) at 98 V for 10 seconds, 6 O for 20 seconds, and 72 for 40 seconds.
  • Amplification products were confirmed by 1.2% agarose electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • Example 2 Subcloning of PCR product into plasmid vector and selection of novel bioactive peptide «clone by decoding S sequence of cDN ⁇ part
  • the reaction product after PCR performed in Male Example 1 was separated using a 1.2% agarose gel, and after confirming the amplification of the DNA fragment of the desired size, the Quigen PCR purification kit (Quiagen) was used.
  • the recovered DNA was subcloned into a plasmid vector pCR TM 2.1 according to the prescription of a TA cloning kit (Invitrogen; t).
  • This was introduced into Escherichia coli JM109 competent cell (Takara Shuzo), transformed, and clones containing the cDNA insert were selected in LB agar medium containing ampicillin, IPTG and Xga1, and only white clones were selected.
  • Escherichia coli JMl 09ZphRF1 was obtained.
  • plasmid DNA was prepared using an automatic plasmid extractor (Kurabo Industries). A portion of the prepared DNA was digested with EcoRI to confirm the size of the inserted cDNA fragment. A portion of the remaining DNA was further treated with RNase, extracted with phenol'-cloth form, and concentrated with ethanol. The reaction for determining the nucleotide sequence was carried out using a DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (AB Itt), and was decoded using a fluorescent automatic sequencer. The obtained sequence information was obtained by using DNASIS (Hitachi System Engineering, Ltd.). The determined: ⁇ SH sequence is shown in FIG.
  • hRl 5'-CAGCTTTAGGGACAGGCTCCAGGTTTC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • SJ $ 3 ⁇ 4 was determined to have 20 pM each of synthetic primers (F5 and hRl), 0.25 mM dNTPs, 0.5 ml of Ex Taq DNA polymerase and a buffer attached to the enzyme, and the total reaction volume was 50 ml.
  • the cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Perkin Elmer), and the cycle of 98 10 seconds, 65 t 20 seconds, and 1 T 20 seconds was repeated 40 times. Confirmation of the amplification product was performed by 1.2 agarose electrophoresis and ethidium bromide staining. After confirming the amplification of the PCR product, the reaction product was purified using QIA quick PCR purification Kit (Quiagen) and sequenced.
  • the reaction for sequencing is performed using the BigDye Deoxy Terminatoe Cycle Sequence Kit (ABI). Decoding was performed using a fluorescent automatic sequencer (ABI377). The obtained glove sequence information $ gf was performed using DNASIS (Hitachi System Engineering). As a result, a cDNA having a 3 '* 3 ⁇ 4 # j different from that obtained in Jongye 2 was obtained. Therefore: «The cDNA obtained in the Example was found to be a splicing variant of the cDNA obtained in Difficult Example 2.
  • the determined amino acid sequence (SEQ ID NO: 9) and the predicted amino acid sequence (SEQ ID NO: 8) are shown in FIG.
  • Pepsi-type bioactive peptide cDNA was obtained from the hypothalamus oly (A) + RNA using Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech).
  • the following four primers (bF6, bF7, bR6, bR7) are synthesized using the lower cDNA prepared according to the manual attached to Kit as ⁇ M, and combined with two types of primers, API and AP2, attached to Kit. Amplification by PCR was performed.
  • the first PCR reaction was performed using a synthetic primer (bR6 and API) for 5'-side (N-terminal region) amplification.
  • the total reaction volume of each primer was 20 pM, 0.25 mM dNTPs, 0.5 ml of Klen Taq DNA polymerase and the buffer attached to the brush, and the total reaction volume was 25 ml.
  • the cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Pakkin Elmer), 5 cycles of 98 10 seconds, 2 minutes at 72, followed by 98-10 seconds, 7 (5 cycles of TC. 2 minutes).
  • the cycle of 98/10 seconds and 68/2 minutes 30 seconds was repeated 25 times. Then, the first PCR anti-sickle was used 10 times, and 1 ml of it was inverted (bR7 and AP2). The total reaction volume was 25 ml with 20 pM of each primer, 0.25 mM dTPs, 0.5 ml of Klen Taq DNA polymerase and the buffer attached to the enzyme. Using a thermal cycler (PerkinElmer), 98 '10 seconds, 5 cycles of 2 minutes, followed by 98 10 seconds, 7 (5 cycles of TC 2 minutes, 98 "C 10 seconds The 35 cycles of 68 ⁇ 2 minutes and 30 seconds were repeated.
  • a thermal cycler PerkinElmer
  • the first PCR was performed using synthetic primers (bF6 and API). Each primer 20 pM, 0.25 m dNTPs, 0.5 ml of Klen Taq polymerase and The total buffer was 25 ml in the buffer supplied with the enzyme.
  • the cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Perkin Elmer), 98t for 10 seconds, 5 cycles of 2 minutes, followed by 98T: -10 seconds, 70t: 5 cycles of 2 minutes, 10 cycles of 98, 2 minutes and 30 seconds of 68, repeated 25 times, then 10 times the first PCR anti-J5 £ 3 ⁇ 4
  • the second PCR was carried out using 1 ml of the primer (bF7 and AP2) with each primer (20 pM each primer, 0.5 ml of 0, 25 mM dNTPs, 0.5 ml of Klen Taq DNA polymerase and the buffer supplied with the enzyme).
  • the total reaction volume was 25 ml, and the cycle for amplification was performed using a thermocycler (Perkin Elmer). '10 seconds, 72 X: ⁇ 5 cycles of 2 minutes, followed by 98 ⁇ 10 seconds, 7 (TC ⁇ 5 cycles of 2 minutes, 98 ⁇ 10 seconds, 68 ⁇ ⁇ 2 minutes 30 seconds
  • the amplification products on the 5'-side and 3'-side were confirmed by 1.2% agarose electrophoresis and ethidium bromide staining.
  • Purification was performed using A quick PCR purification kit (Quiagen), and the determination was performed using the Big Dye Deoxy Terminator Cycle Sequence Kit (ABI) and the fluorescence method was used. Decoding was performed using an automatic Sequencer (ABI377).
  • Amplification was performed using Amplicon Kit (Clontech). Using the rat brain cDNA prepared according to the manual of Kit size as type II, the following two primers
  • the first PCR reaction was performed using rLPRl and a primer set of API.
  • the total reaction volume was 25 ml with 200 pM of each primer, 0.25 ml of each lmMdNTP, 0.25 ml of Klen Taq DNA polymerase and a buffer attached to the enzyme.
  • the cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Perkin Elmer), five cycles of 98 ⁇ 10 seconds and 72 ⁇ 2 minutes, followed by 98 ⁇ 10 seconds and 7 (TC.
  • the cycle was repeated 98 times, 10 seconds, 68 minutes, and 30 seconds 25 times, and then the first PCR reaction was performed in the form of type II, the first set of primers, and the same procedure was repeated.
  • the cycle for amplification was 98, 10 seconds, 5 cycles of 1T, 2 minutes, followed by 5 cycles of 98, 10 seconds, 70, 2 minutes, 98
  • the cycle of 10 seconds (68 ⁇ 2 minutes 30 seconds) was repeated 38 times.
  • the first PCR reaction was performed using rLPFl and a primer set of API for amplification on the 3 'side (C-terminal region).
  • the anti-J5t3 ⁇ 4 « was the same as the age of amplification on the 5, side (N-terminal region).
  • the cycle for amplification was 98 * C for 10 seconds and 72 times for 2 minutes 5 times, followed by 98 times for 10 seconds and 7 times (TC for 5 times 2 minute cycles and 98 times for 10 times.
  • the cycle of 65 seconds, 65 seconds, and 2 minutes was repeated 25 times, and then the second PCR was performed using rLPFl and the AP2 primer with the first PCR reaction mixture as type II.
  • the cycle for amplification was performed using a thermal cycler (Perkin Elmer) at 98 cycles of 10 seconds and 2 minutes 5 times, followed by 98 V, 10 seconds and 7 cycles. (5 cycles of T ⁇ 2 minutes, 98 ⁇ 10 seconds, 65 ° C ⁇ 20 seconds, 1TC ⁇ 2 minutes were repeated 38 times. Confirmation of amplification products on the 5 'and 3' sides was 1 Performed by 2% agarose electrophoresis and ethidium bromide staining The PCR product band was purified using QIA quick Gel Extraction Kit (Quiagen) and sequenced. The salt ⁇ @ ⁇ sequence was determined in the same manner as in Sickle Example 3. The determined nucleotide sequence (SEQ ID NO: 19) and the predicted amino acid sequence (SEQ ID NO: 18) are shown in FIG. Furthermore, based on this sequence, two primers were placed around the start codon and stop codon.
  • ratF2 5'-AATGGAAATTATTTCATCAAAGCGATTCAT-3 '(SEQ ID NO: 48)
  • ratR 5'-CACCTATACTGACAGGAATGATGGCTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 49)
  • the PCR reaction was repeated, and this anti-j ⁇ solution was used as ⁇ , and the PCR reaction was repeated 38 times at 98 ° C for 10 seconds, 68 t-1 minute, and a KR product of about 690 bp was obtained.
  • mice-type physiologically active peptide cDNA from mouse brain poly (A) + RNA
  • cDNA was synthesized with SuperScriptll RNase H-reverse transcriptase (GIBC0 BRL) at 42 for 1 hour. With this as the prime
  • rR4 5'-TTCTCCCAAACCTTTGGGGCAGGTT-3 '(SEQ ID NO: 27)
  • a PCR reaction was carried out by repeating a cycle of 98 ° C. for 10 seconds, 5620 seconds, and 1TC 25 seconds 39 times. Further, using the same set of primers, a PCR reaction was repeated 25 times with a cycle of 98 10 seconds, 60 20 seconds, and 25 seconds at 72, and the increased by-products were detected by ⁇ agarose movement and ethidium bromide staining.
  • the band was purified using the QIA quick Gel Extraction Kit (Quiagen), and the nucleotide sequence was determined in the same manner as in Example 3.
  • mouse brain poly (A) was obtained using the Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) in the same manner as in Example 5.
  • CDNA was synthesized from 1 ag of + RNA, and the resultant was designated as ⁇ type.
  • the first PCR reaction was performed using mR1 and an API primer set.
  • the first PCR reaction was performed with mFl and an API primer set.
  • Each primer was 200 pM, each 0.1 lmMdNTP, 0.25 ml of Klen Taq polymerase, and the buffer attached to the element was 25 ml.
  • the cycle for amplification is 98 at 10 seconds, 5 cycles of 2 minutes at n ° C, followed by 981: 10 seconds, 7 (5 times of TC 2 minutes, 98 10 seconds, 68 2 minutes 30 seconds
  • the 25th cycle was repeated 25 times, and then the second PCR was performed using the first PCR reaction as the primer.
  • the 5'-side amplification was performed using the same primer set as the first-time amplification, and the 3'-side amplification 3 ⁇ 4m F3 Using an API primer set and the same anti-JiM ⁇ as in the first PCR, the reaction was prepared 5 times at 98t for 10 seconds, 11 ° C for 2 minutes, followed by 98:10 seconds, 70 2
  • the cycle of 5 minutes was repeated 5 times, the cycle of 98 10 seconds, 68 2 minutes and 30 seconds was repeated 38 times.
  • PCR was performed using cDNA synthesized from mouse brain poly (A) + RNA with SuperScripU I RNase H-reverse transcriptase as shown above, and a fragment containing the mouse-type bioactive peptide full-length cDNA was obtained. Amplified. Using KlenTaq DNA polymerase (Clontech), the reaction was repeated 35 cycles of 98 seconds, 10 seconds, 5620 seconds, and 72T: 15 seconds. Approximately 600 bp by-product was detected by 2 agarose electrophoresis and ethidium bromide staining, and the band was identified by QIA quick Gel.
  • FIG. 7 shows the sequence (SEQ ID NO: 34) determined by expanding the nucleotide sequence in the same manner as in Male Example 3, and the amino acid sequence (SEQ ID NO: 33) to be subjected to IJI.
  • the rat brainstem peripheral cDNA was designated as type III, and a PCR reaction was performed using two primers, Primer 1 (SEQ ID NO: 35) and Primer 1 (SEQ ID NO: 36).
  • the composition of the reaction solution used in the reaction was 1/10 of the above-mentioned cDNA as type II, and the amount of Advantage cDNA Po 1 ymerase Mi (CLONTECH3 ⁇ 4) 1Z50 was used, and primer 1 (SH ⁇ IJ number: 35) and Primer 2 (SEQ ID NO: 36) were converted to 0.2 M each, dNTPs
  • the reaction product after the PCR reaction was subcloned into a plasmid vector PCR2.1 (Invitrogen II) according to the prescription of a TA cloning kit (Invitrogen II). This was introduced into the DH5 strain, and clones having cDNA were selected on LB agar medium containing ampicillin. After arranging the individual clones, the cDNA encoding the novel G protein The sequence (SEQ ID NO: 38) was obtained.
  • a novel G-protein-containing receptor protein containing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 37) derived from this cDNA was named r ⁇ T7T022L.
  • Plasmid p AK— r O into which cDNA (SEQ ID NO: 38) encoding G protein-coupled receptor protein 1 rOT7T022L derived from the rat brain stem perimeter of the present invention is subcloned T022L was introduced into Escherichia coli DH10B according to the method of the present invention to obtain a transformant: Escherichia coli DH10BZpAK—r ⁇ T022L.
  • a DNA-ribosome complex was formed using a ribosome-based transfection kit (Gene Transfer-1, Nippon Gene: fc).
  • the medium was replaced with fresh one, to which a complex of DNA 'ribosome was added and incubated overnight.
  • the medium was replaced with a medium, and the cells were further cultured for one day.
  • the medium was replaced with the medium of the trait and selection of ffl, and the cells were cultured for two days.
  • the cells in the petri dish were collected by trypsin-EDTA treatment, and recultured with a key having a low cell density, thereby increasing the ratio of transformants.
  • a clone of the cell line CH ⁇ 1 rOT7T022L that stably expressed rOT7T022L was obtained.
  • the resin was treated with 50% TFA / DCM, the Boc group was released, the amino group was released, and neutralized with DIEA.The next amino acid, Boc-Arg (Tos), was added to this amino group in HOBt. After the completion of the reaction was confirmed by examining the presence or absence of unreacted amino groups with ninhydrin test, Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Ala, Boc-Phe , Boc-Ser (Bzl)> Boc-His (Bom), Boc-Pro and Bodet were sequentially condensed, and the amino acids of all sequences were introduced and the resin was treated with 50% TFA / DCM to remove the Boc group on the resin.
  • the crude peptide was then dissolved in 1.5 ml of 5% thioglycolic acid / 50% acetic acid and kept for 50:12 hours, and the Met oxidized peptide was retained. After that, place on a reverse phase column packed with LiChroprep (trade name) RP-18 (ME RCK Ne ⁇ S) and perform gradient elution with a 33% aqueous solution of acetonitrile containing 0.1% TFA water and 0.1% TFA. The fractions eluted in acetonitrile 27% malted barley were collected and frozen to obtain 26 mg of a white powder.
  • LiChroprep trade name
  • RP-18 ME RCK Ne ⁇ S
  • Boc-Phe, Boc-Arg (Tos), Boc-Gln, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Pro, and Boc-Val were sequentially condensed in the same manner as in Example 7 (3). Then, 0.43 g of Boc-Vat Pro-Asn-Leu-Pro-Gin-Arg (Tos) -Phe-pMBHA-resin was obtained. Similarly, 0.22 g of this resin was treated with 3 ⁇ 4ffc7j ⁇ primed and purified by column chromatography to obtain 46 mg of the desired product as a white powder.
  • Solution A 5% acetonitrile water containing 0. ⁇ % TFA
  • Use solution B 55% acetonitrile water containing 0.1% TFA
  • Boc-Ser (Bzl), Boc-Arg (Tos), Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Ala, Boc-Thr (Bzl), Boc-Ala, Boc-Gly, Boc- Ala, Boc-Ser (Bzl) are sequentially condensed, and Boc-Ser (Bzl) -Ala ⁇ Gly-Ala-Thr (Bzl) -Ala-Asn-Leu-Pro-Leu-Arg (Tos) -Ser (Bzl) -pMBHA-res in 0.62g was obtained. Similarly, 0.23 g of this resin was subjected to elementary treatment and purified by column chromatography to obtain 71 mg of the target substance as a white powder.
  • the ⁇ 7 ⁇ 022 L receptor-expressing CHO cells obtained in Example 7 (2) described above were leaked into a cytosensor capsule at a density of 2.7 ⁇ 10 ⁇ cells / capsule, and cultured overnight. We attached to one station.
  • a medium for atsey (Low buffered RPMI1640 medium containing 0.1% serum albumin) set in the flow path of the site sensor is supplied to the cycle cell with the pump ON (80 seconds) and the pump OFF (40 seconds).
  • the acidification rate was calculated as the rate of fine change for 30 seconds from 8 seconds after the pump was stopped for each cycle. The time course of the acidification rate was monitored, and the cells were exposed to each peptide for 7 minutes and 2 seconds by switching when the value became stable.
  • the ⁇ 7 ⁇ 022L-expressing CH ⁇ cells showed the peptide MPHSFANLPLRFamide (sequence No. 39) and a strong dose-dependent response to the peptide VPNL PQRF amide (SEQ ID NO: 40) (FIG. 8).
  • the reaction product after PCR performed in Difficult Example 3 above was separated using a 1.2% agarose gel, and after confirming amplification of a DNA fragment of the desired size, using the Quigen PCR purification kit (Quiagen). DNA was recovered. The recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR TM 2.1 according to the instructions of the TA Cloning Kit (Invitrogen Gene). This was introduced into Escherichia coli JM109 competent cell (Takara Shuzo), transformed, and clones having cDNA inserts were selected on LB agar medium containing ampicillin, IPTG and X-ga1, and only white clones were selected. Was separated using a sterile toothpick.
  • plasmid DNA was prepared using an automatic plasmid extractor (Kurabo). A portion of the prepared DNA was digested with EcoRI to confirm the size of the inserted cDNA fragment. The remaining DNA was further treated with RNase, extracted with phenol'-cloth and extracted with ethanol. The reaction for determining the sequence was performed using the DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (AB I3 ⁇ 4). The sequence was read using a fluorescent automatic sequencer, and the recombinant Escherichia coli JM109 / phRF 2 Preparation of a transformant that converts m 9 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ peptide CDNA C
  • the reaction was determined by using synthetic primers (bFF and bFR) of 20 pM each, 0.25 mM dNTPs, 0.5 ml of Ex Taq DNA polymerase and a buffer attached to the enzyme, and the total reaction volume was 50 ml.
  • the cycle for amplification is one cycle cycle.
  • the cycle of 98t for 10 seconds, 65t for 20 seconds, and 72 ⁇ 20 seconds was repeated 40 times using a KinElma. Amplification products were confirmed by 1.2-agarose electrophoresis and staining with tidium bromide.
  • the reaction product after the PCR performed in Example 3 was separated using a 1.2% agarose gel, and after confirming the amplification of the DNA fragment of the desired size, using the Quigen PCR purification kit (Quiagen). To recover the DNA.
  • the recovered DNA was subcloned into the plasmid vector pCR TM 2.1 according to the recipe of TA Cloning Kit (Invitrogen: t). After introducing this into Escherichia coli J Ml09 competent cell (Taohan g) and transfecting it, a clone having the cDNA insert was selected on LB agar medium containing ampicillin, IPTG and Xg a1, and it became white.
  • the reaction for determining the IE sequence was performed using the DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (AB I3 ⁇ 4), decoded using a fluorescent automatic sequencer, and transformed into Escherichia coli JM 109 pb RF Got two. ⁇ 7 ⁇ 022 L (SEQ ID NO: 37) expression of MPHSFANLPLRFami de (SEQ ID NO: 39) and the peptide VPNLPQRFamide (SEQ ID NO: 40), which inhibit c-AMP production in CHO cells
  • Example 7 Peptide MPHSFANLPLRFamide synthesized in (3) and (4) (SEQ ID NO: 39) VP LPQRFamide (SEQ ID NO: 40) was confirmed to be particularly anti-iST against the ifi rOT7T022L receptor in the experiment using the site sensor of Example 7 (6). Next, cAMP production inhibitory activity of the above-mentioned peptide on rOT7T022L-expressing CH0 cells was measured.
  • the rOT7T022L-expressing CH0 cells obtained in Male Example 7 (2) were wound around a 24-wel plate at 1.0 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured at 37 ° C. for 2 days.
  • the cells were washed with a buffer obtained by adding 0.05SS BSA and 0.2 mM IBMX to Hank's buffer (HBSS), and then left at 37 ° C. for 30 minutes in the same buffer. Thirty minutes later, the cells were incubated at 37 ° C. for 30 minutes at 37 ° C. for 30 minutes at the same time as in Atsushi buffer containing Forskolin 10 ′′ 6 M added to the above buffer.
  • HBSS Hank's buffer
  • the cAMP concentration in the cells of each well was determined according to the method of cAMP EIA Kit (Amershamne: fc).
  • the peptides MPHSFANLPLRFamide (SEQ ID NO: 39) and VPNLPQRFamide (SEQ ID NO: 40) exhibited a cAMP inhibitory effect on r0T7T022L receptor-expressing CH0 cells, and their I values were 0.5 nM and 0.7, respectively. It showed a strong effect at very low separation of nM. mi ⁇ Cloning and nucleotide sequence determination of cDNA encoding human G protein 3 ⁇ 4 ⁇ receptor protein
  • the human lower cDNA (CL0NTECH) is designated as ⁇ , and two primers,
  • Primer 1 5'- GTCGACATGG AGGGGGAGCC CTCCCAGCCT C-3 '(SEQ ID NO: 57) and Primer 2: 5'- ACTAGTTCAG ATATCCCAGG CTGGAATGG-3' (SEQ ID NO: 58).
  • primer 1 SEQ ID NO: 57
  • primer One 2 SEQ ID NO: 58
  • cDNA sequences (SEQ ID NOs: 55 and 56) encoding the novel G protein co-receptor protein were obtained. Although these two types of sequences are identical in the 597th sequence, the derived amino acid sequence is the same (SEQ ID NO: 57), and a novel G protein containing this amino acid ⁇ SH sequence The protein was named hOT7T022.
  • Two types of transformants were used for Escherichia coli DH5aI pCR2.l-hOT022T (containing the cDNA represented by SEQ ID NO: 55), and (Escherichia coli) DH5 / pCR2.
  • l-hOT022G (including the cDNA represented by SEQ ID NO: 56)
  • the polypeptide, the receptor protein and the like of the present invention have iMfflssij properties, for example, and can be used as a therapeutic agent or the like. Further, the polypeptide or receptor protein of the present invention is useful as a reagent for screening a compound or a salt thereof that promotes or inhibits the activity of the polypeptide or receptor protein of the present invention. Compounds obtained by screening are expected as »prevention of disease ⁇ . Furthermore, since the antibody against the polypeptide or receptor protein of the present invention can specifically recognize the polypeptide or receptor protein of the present invention, the polypeptide or the receptor of the present invention in the test wave can be used. It can be used for quantification of protein.

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Description

明 細 書 新規 G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質、 その D N Aおよびそのリ ¾fンド 漏分野 本発明は新規ポリペプチド（本明細書においては、新規生理活性ポリペプチドと称す る場合もある。 ） 、 その部分ペプチド、 それらをコードする D NA、 および該ポリぺプ チドをリガンドとして認識する受容体蛋白質、その部分ペプチド、それらをコードする D NAなどに関する。 特に、 R F amide様構造を有することを特徴とする新規ポリぺプ チドおよびその部分ペプチドなどに関する。 背景腿
ペプチドは代謝、 成長、 生殖、 ^ m, 精 #s動、 生体 ιτ御など生体の機能を調節す るための肝として重要な ¾f!lを担っている。 これらのぺプチド〖湖藤上の特異的な受容 体に結合することによりその情報を細胞に伝える。 これまでこのような生理活性ペプチドの 多くは、 その生理活性に基づいて雄抽出物等から種されその構造が決定されてきた。 ま た： ftifiでは受容体を禾佣して繊抽出物等から生理活性べプチドを ることもなされる ようになってきた。
一方、 のゲノムや cDNAの配^)†の急 な iiSにより、 1»な DNA情報が入手可能 になった。 これらの DNAの中にはこれまで未知であった生理活性ペプチドをコードするもの が含まれているものと推定される。 しかし生理活性ペプチドは非常に短いアミノ β列しか 持たないも'のが多く、 ゲノム DNA配列や Expressed Sequence Tag (EST)から、 の生 S¾ 性ペプチドと一 ^似した配列あるいは共通のモチーフを有する未知の生理活性ペプチドを 探そうとしても、 した配列は生理活性べプチドとは全く無関係な蛋白の遺 非翻訳 領域の DNA配列中にも頻繁に見出されるため、 それらの中からどれが本当の生理活性べプチ ドであるかを確定することは非常に困難であった。 生理活性ペプチドの 1種である FMRFamide は二枚貝のビノスヮスガレイの神経節 より初めて単離、 構造決定されたペプチドである （Price D. A. & Greenberg, M. J. , Science, 197, 670-671, 1977) 。 その後、 C末端に RFamide 構造を持つ ぺプチドやそれに類似の構造を持つ.ぺプチドが無脊椎動物で多くの種に広く 分布することが分かってきた。 特にセンチユウにおいては多くの RFamide構造 を有するペプチドが存在していることが報告されており、 しかもそれらの多く は一つの遺伝子上に複数個が連続して乗っていることが知られている （ Nelson, L. S. , et al. , Molecular Brain Research 58, 103-111, 1998) 。
一方、 脊椎動物において RFamide構造を有する FMRFamide様のぺプチドとし ては、 鶏の脳から LPLRFamide が単離同定されているが、 その遺伝子構造は未 だに明らかにされていない (Dockray, G. J. et al. , ature, 305, 328-330, 1983 ) 。 また魚類では最近 RFamide構造を有するペプチドとして C-RFaが報告され ている。 哺乳動物における RFamide構造を有するペプチドとしてはゥシから精 製単離された 2種のペプチド （Yang, H. - Y. T. , et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7757-7761, 1985) とそれに対応すると考えられるヒト cDNA から同 定された neuropeptide SF(NSF)および neuropeptide AF(NAF)がある。 また最 近我々は RFamide 構造を有するヒ ト、 ゥシ、 ラッ ト Prolactin— releasing peptide (PrRP) (Hinuma, S. , et al. , ature, 393, 272-276, 1998) を同定 している。
FMRFamide ペプチドの生理活性に関してはさまざまな報告がある。 例えば FMRFamide の作用としては、 心臓拍動の促進や抑制、 各種歯舌筋や内臓筋、 各 種牽引筋の収縮や弛緩、 さらには神経細胞の過分極や脱分極等が知られている 。 また PrRPに関してはプロラクチン放出促進活性が、 また LPLRFamideに関し ても神経細胞の刺激効果や、 血圧上昇作用等が報告されている。
以上のように RFamide構造を持つぺプチドに関しては多くの重要な生理作用が報告されて いる。 しかし NSF、 NAF、 PrRP以外に哺¾¾物で RFamideあるいはそれに類似する構造を有 するペプチドが ¾| "るかどうかは全く知られていない。
一方、 多くのホルモンゃ擺 iSi物質などの生理活性物質は、 細謹に ί¾Τる特異的な レセプ夕一蛋白質を通じて生体の機能を調節している。 これらのレセプター蛋白質のうち多 くは共役している guanine nucleot ide- binding protein (以下、 G蛋白質と略称する場合が ある） の活性化を通じて細胞内のシグナル β¾を行ない、 また 7個の 通領域を る共 通した構造をもっていることから、 G蛋白質 ¾¾¾レセプ夕一蛋白質あるいは 7回 レセプ夕一蛋白質 （7 TMR) と総称される。
G蛋白質 レセプ夕一蛋白質は生体の細胞や βの各機肯 胞表面に し、 それら 細胞や臓器の機能を調節する 子、 例えばホルモン、 擺 物質および生理活性物質等の 標的として生理的に重要な役割を担っている。 レセプ夕一は生理活性物質との結合を介して シグナリレを細胞内に 31し、 このシグナルにより細胞の 抑制といった種々の SiKか 起される。
各 @4体の細胞や の内の観な機能を調節する物質と、 その特励レセプ夕一蛋白質 、 特には G蛋白質 ¾¾¾レセプ夕一蛋白質との関係を明らかにすることは、 各 体の細胞 ゃ薩の機能を解明し、 それら機能と密接に関連した医薬品開発に非常に重要な手段を提供 することとなる。
例えば、 生体の種々の器官では、 多くのホルモン、 ホルモン »質、 擺 β 1物質あるい は生理活性物質による調節のもとで生理的な機能の調節が行なわれている。 特に、 生理活性 物質は生体内の様々な a¾iに し、 それぞれに対 JiTTるレセプ夕一蛋白質を通してその生 理機能の調節を行っている。 生体内に〖妹だ未知のホルモンゃ擺 物質その他の生理活 性物質も多く、 それらのレセプ夕一蛋白質の構造に関しても、 これまで報告されていないも のが多い。 さらに、 既知のレセプター蛋白質においてもサブタイプが するかどうかにつ いても分かっていないものが多い。
生体における複雑な機能を調節する物質と、 その特異的レセプター蛋白質との関係を明ら かにすることは、 医薬品開発に非常に重要な手段である。 また、 レセプ夕一蛋白質に対する ァゴニスト、 アン夕ゴニストを効率よくスクリーニングし、 医薬品を開発するためには、 生 体内で発現しているレセプ夕一蛋白質の遺 の機能を解明し、 それらを適当な発現系で発 現させることが必 であつた。
近年、 生体内で発現している遺 を する手段として、 c DNAの配列をランダムに 解析する研究が活発に行なわれており、 このようにして得られた c DNAの断片配列が Expressed Sequence Tag (E S T) としてデータベースに登録され、 公開されている。 しか し、 多くの E S T«IH列情報のみであり、 その機能を推 ¾Tることは困難である。
そこで、 の RFamide様構造を持つポリペプチド （ペプチド）、 また の G蛋白質 ¾¾¾レセプ夕一蛋白質を見出し、 それらを禾拥した新たな生理活性物質を含有してなる疾 患の予防 ·治療 ·診断剤の開発が望まれていた。 発明の開示
本発明者らは、 上記の綱を解決するために 意職を重ねた結果、 E S T等の配列情報 を基にプライマ一を作製し、 ヒト胎讓 poly(A) +RNAを^ とする RT— P CRにより、 新規な «配列を る c DNAをクローニングすることに β ^力した。 そして、 本発明者ら は、 得られた c DNAにコードされるポリペプチドが有用な C*i¾^L P L R F amide様 、 L P L R S amide様、 L PQ R F amide様または L P L RL amide様のペプチドであ ることを見出した。
また、 本発明者らは、 degenerated PCR法によって作成した E S T情報に基づいて、 ラッ ト脳幹周辺部およびヒト視床下部由来の新規な G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコ一ドす る c DNAを種し、 その全驢配列を籠することに した。 そして、 この ¾S配列を アミノ麵列に麵したところ、 第 1〜第 7膽通領域が ¾τΚ性プロット上 認され、 こ れらの c DNAにコードされる蛋白質が 7回 ,通型の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質で あることを確認、した。
さらに、 本発明者らは、 貌纖討を重ね、 上記 R F ami de様ポリぺプチド等が上記 G蛋白 質共役型レセプ夕一蛋白質に対してリガンド活性を有することを見出した。
これらの知見に基づレゝて、 さらに検討を重ねた結果、 本発明を ¾ ^るに至つた。 すなわち、 本発明は、
(1) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしく 質的に同一のアミノ^ ΙΞ列を 含^ Tることを赚とするポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、
(2) 実質的に同一のアミノ酸配列が 列番号： 8、 配列番号： 14、 配列番号： 18、 配 列番号： 33また «@Ξ列番号： 50で表されるァミノ 列である上記 (1) 記載のポリべ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(3) 上記 （1) 記載のポリペプチドの部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩、
(4) 配列番号： 1の第 81番目 （Met) ないし第 92番目 （Phe) のアミノ酸残基を含有し てなる上記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその
(5) 配列番号： 1の第 101番目 （Ser) ないし第 112番目 （Ser) のアミノ酸 «を含 有してなる上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたは その塩、
(6) 配列番号： 1の第 124番目 （Val) ないし第 131番目 （Phe) のアミノ酸魁を含 有してなる上記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは その塩、
(7) 上記 （1) 記載のポリペプチドの部分ペプチドのアミドまたはその塩、
(8) 上記 (1) 記載のポリペプチドをコードする驢配列を^ Tる DNAを含 る DN A、
(9) 配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 15、 配列番号： 19、 配列番号： 34ま た «@Ξ列番号： 51で表される驢配列を； る上記 (8) 記載の DNA、
(10) 上記 (3) 記載の部分ペプチドをコードする DNAを含 る DNA、
(11) 配列番号： 2で表される 配列の第 241番目ないし第 276番目の を含有 してなる上記 (10) 記載の DNA、 (12) 配列番号： 2で表される ¾S配列の第 301番目ないし第 336番目の ¾Sを含有 してなる上記 （10) 記載の DNA、
(13) 配列番号： 2で表される^ IB列の第 370番目ないし第 393番目の を含有 してなる上記 (10) 記載の DNA、
(14) 上記 (8) また 記 (10) 記載の DN Aを含^ Tる繊えべクタ一、
(15) 上記 （14) 記載の えベクターで形質転換された形 S«
(16) 上記 (15) 記載の形質転換体を培養し、 上記 (1) 記載のポリペプチドまたは上 記 （3) 記載の部分ペプチドを生成 しめることを とする上記 (1)記載のポリ ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 また tt_h記 (3) 記載の 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の ¾ϋ法、
(17) 上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまた はその塩に対する抗体、
(18) 上記 （8) もしく 記 （10) 言 S«の DNAまた 記 （17) 記載の抗体を含 有してなる診断薬、
(19) 上記 （8) また 記 （10) 記載の DN Aに相補的または実質的に相補的な塩基 配列を有し、 該 DN Aの発現を抑制し得る作用を ^"するアンチセンス DNA、
( 20 ) 上記 （ 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 または上記 (3)記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩を含有してなる剤、
(21) 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩を含有してなる医薬、
( 22 ) 上記 （ 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩を用いることを ^とする上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステルまたはその塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リーニング方法、
( 2 3) 上記 （1 ) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステリレまたはそ の塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩、 およ ϋ¾列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ^ Ε列を含 #Τる蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステルまたはその塩を用いることを難とする上記 （2 2) 記載のスクリー二 ング方法、
( 2 4 ) 上記 （ 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 または上記 ( 3) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩を含有してなる上記 ( 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩、 また 記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩の活性を «または阻 *Τる化合物またはその塩のスクリ一ニング 用キッ卜、
( 2 5 ) 上記 （ 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 また 記 ( 3 ) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩、 およ ϋ¾Ξ列番号： 3 7で表されるアミノ^ Ξ列と同一もしくは実質的に同一のァ ミノ^ Ξ列を含^ fるする蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩を含有してなる上記 (2 4) 記載のスクリーニング用 キット、
(2 6) 上記 （2 2 ) 記載のスクリーニング方法または上記 （2 4) 記載のスクリーニング 用キットを用レて得られる上記 ( 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 上記 （ 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩の活性を腿または阻 ¾Tる化合物またはその塩、
(2 7) 上記 ( 2 2 ) 記載のスクリーニング方法または上記 (2 4) 記載のスクリーニング 用キットを用いて得られる上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 また 記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩の活性を碰または阻 ¾fる化合物またはその塩を含有してなる (28) 配列番号： 37で表わされるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含 ることを とする蛋白質またはその塩、
(29)配列番号： 37で表わされるアミノ«列と実質的に同一のアミノ酸配列が 号： 54で表されるアミノ^ H列である上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、
( 30 ) 上記 （ 28 ) 記載の蛋白質の部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステ ルまたはその塩、
(31) 上記 （28) 記載の蛋白質または上記 （30) 記載の部分ペプチドをコードする塩 SSB列を^ tる D N Aを含 る D N A、
(32) 配列番号： 38、 配列番号： 55または配列番号： 56で表される塩基配列を る上記 （31) 記載の DNA、
(33) 上記 （31) 記載の DN Aを含 Tる糸農えベクタ一、
(34) 上記 （33) 記載の えベクターで形質転換させた形質転換体、
(35) 上記 （34) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （28) 記載の蛋白質または上記 ( 30)記載の部分ペプチドを ω·^<ϋしめることを,とする上記 （28) 記載の蛋白 質またはその塩、 または上記 （30) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩の Sig法、
(36) 上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、 また 記 (30) 記載の部分ペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体、
(37) 上記 (31) 記載の DNAまたは上記 (36) 記載の抗体を含有してなる診断薬、
(38) 上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、 または上記 (30) 記載の部分ペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることにより得られる上記 ( 28) 記載の蛋白質またはその塩に対するリガンド、 (39) 上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、 または上記 （30) 記載の部分ペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とする上記 (2 8) 記載の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決 法、
(40) 上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、 または上記 (30) 記載の部分ペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とするリガンド と上記 (28) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のス クリーニング方法、
(41) 上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、 または上記 （30) 記載の部分ペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含有することを [とするリガン ドと上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩の スクリーニング用キット、
(42) 上記 (40) 記載のスクリーニング方法または上記 (41) 記載のスクリーニング 用キットを用いて得られる、 リガンドと上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩、
( 43 ) 上記 （ 40 ) 記載のスクリ一ニング方法または上記 （41) 記載のスクリ一ニング 用キットを用いて得られる、 リガンドと上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩との結合性 を変化させる化合物またはその塩を含有してなる医薬、 および
(44) 上記 (36) 記載の抗体を用いることを特徴とする上記 （28) 記載の蛋白質また はその塩の定動法などに関する。
さらには、 本発明は、
(45) 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番号 ： 1で表されるァミノ m@B列と約 70%以上、 好ましく〖お勺 80%以上、 より好ましく〖 90 %以上、 さらに好ましく〖お勺 95 %以上の相同性を るァミノ薩列である上記 （ 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(46) 配列番号： 1で表されるアミノ醒列と実質的に同一のアミノ隱列が、 OS列番 号： 1、 配列番号： 8、 配列番号： 14、 配列番号： 18、 配列番号： 33また 列番号 ： 50で表されるアミノ薩列中の：！〜 20個 （好ましくは 1〜15個、 さらに好ましくは 1〜5個、 より好ましくは、 ：!〜 3個） のアミノ酸が欠失したアミノ«列、 列番号： 1、 配列番号： 8、 配列番号： 14、 配列番号： 18、 配列番号： 33また《@B列番号： 5 0で表されるアミノ薩列に：！〜 20個 ましくは 1〜15個、 さらに好ましくは 1〜5 個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ^^働口したアミノ醒列、 列番号： 1、 配 列番号： 8、 配列番号： 14、 配列番号： 18、 配列番号： 33また ¾S5列番号： 50で表 されるアミノ酸配列に 1〜20個 （好ましくは 1〜15個、 さらに好ましくは 1〜5個、 よ り好ましくは、 1〜 3個） のァミノ酸が挿入されたァミノ 列、 d配列番号： 1、 配列番 号： 8、 配列番号： 14、 配列番号： 18、 配列番号： 33また《@B列番号： 50で表され るァミノ ¾@2列中の:!〜 20個以上 «ifましくは 1〜15個、 さらに好ましくは 1〜5個以 上、 より好ましくは、 ：!〜 3個以上） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ舰列 、 または (D^れらを組み合わせたアミノ^ @5列である上記 (1)記載のポリペプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(47) 上記 (8) または （10) 記載の DNAをコードする驢配列とハイストリンジェ ン卜な条件下でハイブリダィズする塩基配列を する DNAを含有する DNA、
(48) 上記 （47) 記載の DNAを含; る えべクタ一、
(49) 上記 （48) 記載の,えべクタ一で形質転換された形質転換体、
(50) 上記 （49) 記載の形質転換体を培養し、 上記 （47) 記載の DN Aにコードされ るポリペプチドを^ しめ、 これを採取することを難とする上記 (47) 記載の DNAでコードされるポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 の 法、
(51) 上記 （50) 記載の赌法で織される、 上記 (47) 記載の DNAでコードされ るポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(52) 配列番号： 37で表されるアミノ隱列と実質的に同一のアミノ酸配列が、 配列番 号： 37で表されるアミノ麵列と約 50%以上、 好ましくは約 70%以上、 より好ましく 80 %以上、 さらに好ましくは約 90 %以上、 最も好ましく〖お勺 95 %以上の相同性を ¾ るァミノ 列である上記 （28) 記載の蛋白質またはその塩、
(53) 配列番号： 37で表されるアミノ^ @5列と実質的に同一のアミノ隱列が、 （US列 番号： 37で表されるアミノ酸配列中の:！〜 20個 （好ましくは 1〜： L 5偭、 さらに好まし くは 1〜5個、 より好ましくは、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、 ©SB列番 号： 37で表されるアミノ酸配列に 1~20個 （^ましくは 1〜15個、 さらに好ましくは 1〜 5個、 より好ましくは、 1〜 3個） のァミノ酸が ¾口したアミノ赚列、 ©SB列番号： 37で表されるアミノ隱列中の：!〜 20個以上 （^ましくは 1〜15個、 さらに好ましく は 1〜5個以上、 より好ましくは、 1〜3個以上） のアミノ酸が他のアミノ酸て督換された ァミノ酸配列、 または れらを組み合わせたァミノ酸配列である上記 （28) 記載の蛋白 質またはその塩、
(54) 上記 （31) 記載の DN Αをコードする;^配列とハイストリンジェントな条件下 で八ィプリダイス 'する;^配列を有する DNAを含有する DNA、
(55) 上記 （54) 記載の DN Aを含; Π"る えベクター、
(56) 上記 （55) 記載の えベクターで形 ¾S された形質転換体、
(57) 上記 （56) 記載の形質転換体を培養し、 上記 (54) 記載の DNAにコードされ るポリペプチドを し、 しめ、 これを採取することを難とする上記 (54) 記載 の DN Aでコ一ドされるポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩の 法、
(58) 上記 (57) 記載の難法で^ 1される、 上記 (54) 記載の DNAでコードされ るポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、
(59) ( i ) 上記 （ 1 ) 記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩、 また〖ま上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩にその受容体を機させた と、 (ii) 上記 (1) 記載のポリペプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 (3) 記載の部分べプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩にその受容 よび観化合物を 觀させた における、 上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその塩、 または上記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩の活性を測定し、 比^ることを難とする上記 (22) 記載の スクリーニング方法、
(60) 受容体が 列番号： 37で表されるアミノ薩列と同一または実質的に同一のアミ ノ E列を含有してなる蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩である上記 （59) 記載のスクリ一ニング方法、
(61) 上記 （22) 記載のスクリーニング方法または上記 (24) 記載のスクリーニング 用キットを用いて得られる、 上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩、 また 記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしく はそのエステルまたはその塩の活性を βする化合物またはその塩を含有してなる医薬、
(62) 上記 （22) 記載のスクリーニング方法または上記 (24) 記載のスクリーニング 用キットを用いて得られる、 上記 （1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩、 また 記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩の活性を阻 ¾fる化合物またはその塩を含有してなる医薬、 (63) 上記 （17) 記載の抗体と、 謹液およ 0 ^識化された上記 (1) 記載のポリぺプ チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分 ぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩とを競合的に反応させ、 該 抗体に結合した標識化された上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩、 また tt±記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステリレまたはその塩の割合を測定することを； ^とする被検波中の上記 (1) 記載 のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 ( 3 ) 記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩の定量法、
(64) 被検液と担体上に不溶化した上記 （17) 記載の抗 #¾ょ«識化された上記 (1
7) 記載の抗体とを同時あるいは 铳的に反応させたのち、 不溶化担体上の標識剤の活性を »Τることを とする被検液中の上記 (1) 記載のポリペプチドもしくはそのアミドも しくはそのエステリレまたはその塩、 または上記 (3) 記載の部分ペプチドもしくはそのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩の定量法、
( 6 5) 上記 （3 6 ) 記載の抗体と、 被検波およ 化された上記 (2 8) 記載の蛋白質 またはその塩、 または上記 （3 0 ) 記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのェ ステルまたはその塩とを競合的に反応させ、 体に結合した 化された上記 （2 8) 記 載の蛋白質またはその塩、 または上記 （3 0) 記載の部分べプチドもしくはそのァミドもし くはそのエステルまたはその塩の割合を測定することを 15 [とする被検波中の上記 （2 8) 記載の蛋白質またはその塩、 上記 （ 3 0 ) 記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしくは そのエステルまたはその塩の定量法、 および
(6 6) 被検波と担体上に不溶化した上記 ( 3 6 ) 記載の抗 よ 化された上記 ( 3 6) 記載の抗体とを同時あるい «¾ 的に反応させたのち、 不溶化担体上の 111 ^の活性を 測定することを特徴とする被検波中の上記 （2 8 ) 記載のポリペプチドもしくはそのアミド もしくはそのエステルまたはその塩、 または上記 （3 0) 記載の部分ペプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の定量法などを する。 図面の簡単な説明
図 1は難例 2で得られた本発明のポリぺプチド （ヒト型） をコ一ドする D N Aの 配 列おょぴ該塩基配列から推定されるァミノ «列を示す。
図 2は本発明のポリぺプチドの疎水性プロットを示す図を示す。
図 3は «例 3で得られた本発明のポリぺプチド （ヒト型） をコ一ドする D N Aの 配 列およぴ該塩 SE列から されるアミノ麵列を示す。
図 4は ¾|例 4で得られた本発明のポリペプチド （ゥシ型） をコードする DNAの 配 列および孩塩基配列から されるアミノ^ IB列を示す。
図 5は ¾|例 5で得られた本発明のポリペプチド （ラット型） をコ一ドする DNAの塩基 配列および！ 配列から推定されるアミノ 列を示す。
図 6は 例 3、 4、 5で得られた本発明のポリペプチドのァミノ miH列の比較を示す。 図 7は 例 6で得られた本発明のポリペプチド （マウス のァミノ 列および孩ポ リぺプチドをコ一ドする D N Aの塩基配列を示す。
図 8は実施例 7で行われたサイトセンサ一による ΓΟΤ7Τ022 L受容体発現 CHO細胞に対 するペプチドの反応性を示す図を示す。 図中、 #—#«MPHSFANLPLRFami d e (配列番号： 39) 、 △—△は VPNLPQRFami de (配列番号： 40) を示す。 図 9は 例 10で行われた MPHSFA LPLRFamide (配列番号： 39) 、 VPNLPQRFami de (配 列番号： 40) の rOT7T022L発現 CH0細胞に対する cAMP産生抑制活性を示す図を示す。 図 中、 口—口は MPHSFANLPLRFamide (配列番号： 39) 、 譬―秦は VPNLPQRFami de (配列番号 ： 40) を示す。 発明を実施するための最良の形態
本発明の配列番号： 1で表わされるァミノ mss列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を るポリペプチド （以下、 本発明のポリペプチドと ¾τΤる） は、 ヒトゃ «ί¾物 ( 例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ニヮトリ、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど
) の細胞 （例えば、 m .脚胞、 删胞、 ,グリア細胞、 n蘭細胞、 體 細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲル八ンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮細胞、 m 胞、 mm ,翻胞、 脂雌胞、 ^ m . (例、 マクロファージ、 τ細胞、 Β細胞、 ナチ ュラルキラ一細胞、 肥'翻胞、 好中球、 好; ^SJ求、 好酸球、 、 巨核球、 滑麵胞、 軟 骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 孚 胞、 ra胞もしくは間翻胞、 またはこれら 細胞の前細胞、 幹細胞もしくは癌細胞など） もしくはそれらの細胞力 arるあらゆる組 織、 例えば、 脳、 脳の各 (例、 網膜、 嗅球、 w , ^s m .海馬、 撤、 嫌下 部、 «皮質、 延髄、 小脳） 、 籠、 下垂体、 胃、 諷 腎臓、 纖、 生藤、 甲赚、 胆 のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 i (例、 、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 顏 、 ¾τ腺、 末梢血、 m.睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など、 また〖 球 系の細胞もしくはその培^ ffl胞 （例えば、 MEL, Ml, CTLL-2, HT— 2， WEH 1—3， HL-60, JOSK—l, K562, ML- 1, M〇LT_3， MOLT— 4, MOLT— 10， CCRF-CEM, TALL— 1， Jurka t, CCRT—HSB— 2 ， KE-37, SKW - 3， HUT— 78， HUT - 102, H9， U937, THP-1 ， HEL， JK- 1, CMK, KO-812, MEG—01など） に由来するポリペプチド であってもよく、 合成ポリペプチドであってもよい。
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ麵列としては、 配列番 号： 1で表わされるアミノ酸配列と約 70%以上、 好ましくは約 80%以上、 より好ましく im 90 %以上、 さらに好ましく «勺 95 %以上の相同性を るアミノ酸配列などがあげ られる。
特に、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、 配列番号： 1で表わされるァミノ麵列の第 22〜180番目のアミノ酸配列を^ Tるアミ ノ ¾15列などがあげられる。
本発明の配列番号： 1で表わされるアミノ 列と実質的に同一のアミノ^ E列を る ポリペプチドとしては、 例えば、 嫌 Sの配列番号： 1で表わされるアミノ隱列と実質的に 同一のアミノ薩列 （例えば、 配列番号： 8、 配列番号： 14、 配列番号： 18、 配列番号 ： 33また¾@2列番号： 50で表されるアミノ酸配列など） を有し、 ΙΞ ^番号： 1で表わさ れるアミノ ®B列を^ るポリぺプチドと実質的に同質の活性を るポリぺプチドなどが 好ましい。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 本発明のポリペプチドの受容体 （具体的には、 配 潘号： 37で表されるアミノ醜列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 ることを ^とする蛋白質またはその を発現する細胞に添力 PTることにより発現する細 !§¾激活性 ( (以下単に細麟 !J艇性とする） 、 例えばァラキドン^ »、 アセチルコリン 難、 細胞内 Ca2+難、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP 、 イノシト一ルリン β生、 細 電位変動、 細胞内蛋白質の燐酸化、 C-fosの活性化、 細胞外 pHの変動など） またはソマ トス夕チン分泌調節活性などがあげられる。
実質的に同質とは、 それらの活性が性質的に （例、 生理化 に、 または薬理学的に） 同 質であることを示す。 従って、 細跡 !1«性またはソマトス夕チン分泌調節活性などの活性 が同等 （例、 約 0. ：！〜 100倍、 好ましくは約 0. 5〜10倍、 より好ましくは 0. 5〜 2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の雖、 ポリペプチドの肝量などの量的要 素は異なっていてもよい。
細跡«艇性などの測定は、 自体^]の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 後 述するスクリ一二ング方法に従って測定することができる。
また、 本発明のポリペプチドとしては、 例えば、 0»列番号： 1、 配列番号： 8、 配 墦 号： 1 4、 配列番号： 1 8、 配列番号： 3 3または配列番号： 5 0で表わされるァミノ ^SB 列中の 1〜2 0個 （ ましくは、 1〜1 5個、 さらに好ましくは、 1〜5個、 より好ましく は、 1〜3個） のアミノ酸が欠失したアミノ薩列、 ®@Ξ列番号： 1、 配列番号： 8、 配列 番号： 1 4、 配列番号： 1 8、 配列番号： 3 3また ¾@2列番号： 5 0で表わされるアミノ酸 配列に：!〜 2 0個 （好ましくは、 1〜1 5個、 さらに好ましくは、 1〜5個、 より好ましく は、 1〜3個） のアミノ酸が ¾口したァミノ 列、 CUE列番号： 1、 配列番号： 8、 配列 番号： 1 4、 配列番号： 1 8、 配列番号： 3 3また ¾@2列番号： 5 0で表わされるアミノ酸 配列に:!〜 2 0個 （^ましくは、 1 ~ 1 5個、 さらに好ましくは、 ：!〜 5個、 より好ましく は、 1 ~ 3個） のアミノ酸が挿入されたアミノ薩列、 列番号： 1、 配列番号： 8、 配 播号： 1 4、 配列番号： 1 8、 配列番号： 3 3また《13列番号： 5 0で表わされるアミノ 麵列中の 1〜 2 0個 （好ましくは、 ：!〜 1 5個、 さらに好ましくは、 1〜5個、 より好ま しくは、 1〜3個） のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたァミノ ^列、 または © ^れら を組み合わせたアミノ m@B列を含^ Tるポリぺプチドなどのいわゆるムテインも含まれる。 上記のようにアミノ酸配列が挿入、 欠失または置換されている:！^、 その挿入、 欠失また は置換の位置としては、 特に！ ^されない。
配列番号： 1で表わされるアミノ 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 るポリべ プチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一 のアミノ^ ΙΞ列を含 るポリペプチド、 配列番号： 1 4で表わされるァミノ 列と実質 的に同一のアミノ隱列を含^ Tるポリペプチド、 配列番号： 1 8で表わされるアミノ酸配 列と実質的に同一のアミノ酸配列を含 るポリペプチド、 配列番号： 3 3で表わされるァ ミノ^ SH列と実質的に同一のァミノ ¾¾2列を含 るポリペプチド、 配列番号： 5 0で表わ されるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ 列を含 るポリぺプチドなどがあげられ る。
本明細書におけるポリペプチドは、 ペプチド標記の慣例に従って ^¾が (アミノ末 端） 、 «^c*¾ (カルボキシル である。 配列番号： 1で表わされるアミノ麵列 を含 るポリペプチドをはじめとする、 本発明のポリペプチドは、 じ*¾が通常カルボキ シル基 (- COOH) またはカルボキシレート（一COO—)であるが、 C末端がアミド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロ ピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシ ルなどの C 3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C6_127リール 基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエニル一 _2アルキル基もしくは α—ナフチ ルメチルなどの α—ナフチル— _2アルキル基などの C 7_147ラルキル基のほか、 経口用 エステルとして翻されるビバロイルォキシメチル基などが用いられる。
本発明のポリペプチドが C¾¾! にカルボキシル基 ほたはカルボキシレート） を有し ている^、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のポリべ プチドに含まれる。 この ¾ ^のエステルとしては、 例えば上記した のエステルなどが 用いられる。
さらに、 本発明のポリペプチドには、 N末端のアミノ^ S (例、 メチォニン残基） のァ ミノ基が保護基（例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの _6アルカノィルなどの 6ァ シル基など） で髓されているもの、 生体内で切断されて^ Tる のグルタミン ¾S がピログルタミン酸化したもの、 肝内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば一 OH、 - S H、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インド一ル基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例え ば、 ホルミル基、 ァセチル基などの _6アルカノィル基などの _6ァシル基など） で髓 されているもの、 あるいは «が結合したいわゆる糖タンパク質などの複合タンパク質など も含まれる。
本発明のポリペプチドの具体例としては、 例えば、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配 列を有するヒト由来のポリペプチド （図 1 ) 、 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列を有 するヒト由来のポリペプチド （図 3) 、 配列番号： 1 4で表わされるァミノ ffi列を る ゥシ由来のポリペプチド （図 4) 、 配列番号： 1 8で表わされるァミノ m@H列を^ Tるラッ ト由来のポリペプチド （図 5) 、 配列番号： 3 3で表わされるァミノ 列を "るマウス 由来のポリペプチド （図 7) 、 配列番号'： 5 0で表わされるアミノ隱列を るラット由 来のポリぺプチドなどが用いられる。
また、 本発明のポリペプチドは下記の部分ペプチドの前駆体であってもよく、 この場合に は、 必ずしも下記の部分ペプチドの^ Tる活性 （例、 細麟!!麵性など） を "る艘はな い。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドとしては、 嫌己した本発明のポリペプチドの部分べ プチドであって、 好ましくは、 本発明のポリペプチドの部分ペプチドの受容体 （具体的には 、 配列番号： 3 7で表されるァミノ β列と同一もしくは実質的に同一のアミノ^ H列を含 Wすることを特徴とする蛋白質またはその を発現する細胞に添力 ΙΓすることにより発現す る細麟 !1麵性 ( (以下単に細！^!!艇性とする） 、 例え〖ίΤラキドン β¾Ι、 ァセチルコ リン遊離、 細胞内 Ca2+e、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシ卜一ルリン酸産生 、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質の燐酸化、 C-fosの活性化、 細胞外 pHの変動など） または ソマトス夕チン分泌調節活性などを有するものであればレゝかなるものでもよい。
本発明のポリペプチドの部分ペプチドとして好ましくは、 R F amide, R S amideまたは R L amide構造を有するぺプチドが好ましい。
R F amide構造とは、 ペプチドの C末端が Argi nine (アルギニン） -Phenylal nine (フエ 二ルァラニン） -M2構造になっていることをいい、 R S amide構造とは、 ペプチドの が Arginine (アルギニン） -Serine (セリン） - H2構造になっていることをいい、 RL amide 構造とは、 ペプチドの C«が Arginine (アルギニン） -Leucine (ロイシン） - NH2構造にな つていることを意味する。 .
これらペプチドの中でも、 例えば、
① 配列番号： 1で表わされるアミノ麵列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1 0 1番目 （Ser) 〜1 1 2番目 （Ser) 、 第 1 2 4番目 （Val) 〜1 3 1番目 （Phe) 、 第 1 番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1番目 （Met) 〜1 1 2番目 （Ser) または第 1番目 （ Met) 〜1 3 1番目 （Phe) のアミノ酸配列を含 ¾ るペプチド、
② 配列番号： 8で表わされるアミノ酸配列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1 0 1番目 （Ser) 〜1 1 2番目 （Ser) 、 第 1 2 4番目 （Val) 〜： L 3 1番目 （Phe) 、 第 1 番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1番目 （Met) 〜1 1 2番目 （Ser) または第 1番目 （ Met) 〜1 3 1番目 （Phe) のアミノ酸配列を含 るペプチド、
③ 配列番号： 1 4で表わされるアミノ麵列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1 2 4番目 （Val) 〜： L 3 1番目 （Phe) 、 第 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) または第 1番目 （Met) 〜1 3 1番目 （Phe) のアミノ酸配列を含 るペプチド、
④ 配列番号： 3 3で表わされるァミノ miB列の第 8 4番目 （Pro) 〜第 9 4番目 （Phe) の アミノ ¾@5列を含 るべプチド、
⑤ 配列番号： 5 0で表わされるアミノ^ Ξ列の第 8 4番目 （Pro) 〜第 9 4番目 （Phe) の アミノ隱列を含 るペプチド、 などが好ましい例としてあげられる。
特にこれらのペプチドのアミド体が好ましい。
具体的に 列番号： 1で表わされるアミノ麵列の第 8 1番目（Met)〜第 9 2番目（Phe ) のアミノ酸配列で表されるペプチドの C«がアミド化された （_ C ONH2) ペプチド (配列番号： 3 9 ) 、 配列番号： 1で表わされるァミノ 列の第 1 0 1番目 （Ser)〜1 1 2番目 （Ser) のアミノ酸配列で表されるペプチドの C*¾0アミド化された (- CONH2 ) ぺプチド （配列番号： 4 1 ) およ D¾H列番号： 1で表わされるアミノ麵列の第 1 2 4番 目 （Val) 〜： L 3 1番目 （Phe) のアミノ^ H列で表されるペプチドの C ^がアミド化され た （― C〇NH2) ペプチド （配列番号： 4 0) などがあげられる。
また、 本発明の部分ペプチドは、 そのアミノ酸配列中の 1〜 5個 （好ましくは、 1〜3涸 のアミノ酸が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1〜5個 （好ましくは、 1〜3個） のァ ミノ酸が働口し、 または、 そのアミノ ¾15列に:!〜 5個 （好ましくは、 1〜 3個のアミノ酸 が挿入され、 または、 そのアミノ酸配列中の 1〜 5個 （^ましくは、 1〜 3個のアミノ酸が 他のアミノ酸で置換されたァミノ酸配列を含有していてもよく、 それらを組み合わせたァミ ノ^ E列を含有していてもよい。
また、 本発明の部分ペプチドは C末端が通常カルボキシル基 (- COOH) またはカルボ キシレート （一 C〇0一） であるが、 前記した本発明のポリペプチドのごとく、 C末端がァ ミド （一 CONH2) またはエステル （一COOR) (Rは上記と同意義を示す） であって もよい。 なかでも、 C末端がアミド （一 CONH2) であるものが好ましい。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 嫌己した本発明のポリペプチドと同様に、 N«の アミノ酸 ¾S (例、 メチォニン ¾S) のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N職 «が 生体内で切断され生成したグルタミン難がピログルタミン酸化したもの、 肝内のアミノ 酸の側鎖上の置換基が適当な髓基で保護されているもの、 あるい《H鎖が結合したいわゆ る糖べプチドなどの複合べプチドなども含まれる。
また、 本発明の部分ペプチドは抗体作成のための S!源として用いることができるので、 必 ずしも細胞刺激活性またはソマトス夕チン分泌調節活性などを有する必要はない。
本発明のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその部分べプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルの塩としては、 生理 に許容される酸 （例、 無 謹、 有鍾） ゃ驢 （例、 アルカリ金属:^) などとの塩が用いられ、 とりわけ生理糊に 許容される酸働口塩が好ましい。 このような塩としては、 例えば、 議酸 （例えば、 、 リン酸、 は素酸、 麵 との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸
、 フマリ!^、 マレイン酸、 コ /ヽク酸、 m , クェン酸、 リンゴ酸、 «、 安息香酸、 メタ ンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のポリペプチドまたはその塩は、 前述したヒトゃ& 物の細胞また〖お慮から自 体公知のポリぺプチドの精製方法によって製造することもできるし、 後述するポリぺプチド をコードする D N Aを含有-する形質^体を培養することによつても Kitすることが きる 。 また、 後述のペプチド合成法に準じて製造することもできる。
ヒトゃ哺乳動物の組織または細胞から製造する場合、 ヒトゃ哺¾¾物の組織または細胞を ホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン クロマトグラフィ一などのクロマトグラフィ一を組み合わせることにより精製 する ことができる。
本発明のポリペプチド、 部分ペプチド、 もしくはそれらの塩、 またはそれらのアミド体の 合成には、 通飾販のポリペプチド合劇樹脂を用いることができる。 そのような樹脂とし ては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 ァ ミノメチル樹脂、 4—ベンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4一メチルベンズヒドリル ァミン樹脂、 P AM樹脂、 4—ヒドロキシメチルメチルフエニルァセトアミドメチル樹脂、 ポリアクリルアミド樹脂、 4一 （2' , 4' -ジメトキシフエ二ル一ヒドロキシメチル） フエノキ シ樹脂、 4 - (2' , 4' -ジメトキシフエ二ルー Finocアミノエチル） フエノキシ樹脂などをあげ ることが きる。 このような樹脂を用い、 ひ一ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミ ノ酸を、 目的とするポリペプチドの配列通りに、 自体 の各麵合方法に従い、 樹脂上で 縮合させる。 反応の最後に樹脂からポリぺプチドを切り出すと同時に各種保護基を^ ¾し、 さらに高^ 中で 内ジスルフイド 形 βΚΚ応を し、 目的のポリペプチド、 部 分べプチドまたはそれらのアミド体を取 ί辱する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 ポリペプチド合成に删できる各麵性化試薬 を用いることが きるが、特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド類としては、 DCC 、 Ν, Ν' -ジイソプロピルカルポジイミド、 Ν -ェチ !/" Ν' - (3-ジメチルァミノプロリル） カルボ ジイミドなどが用いられる。 これらによる活性化にはラセミ il^J制添加剤 （例えば、 HOBt, HOOBt)とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添力 Ofるかまたは、 文碰無冰物または ΗΟΒί ェ ステルあるいは HOOBtエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂 に添力 ITすることが^きる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる讓としては、 ポリペプチド縮合反応 に使用しうることが知られている賺から1^51択されうる。 例えば、 N, N—ジメチルホ ルムアミド， N， N—ジメチルァセトアミド， N—メチルピロリドンなどの酸アミド類、 塩 化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン ィ TK素類、 トリフルォロエタノールなどのァ ルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、 ピリジン， ジォキサン， テトラ ヒドロフランなどのエーテル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢 酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの蓮の混合物などが用いられる。 反応 はポリぺプチド！ ½形 応に され得ることが知られている範囲から 択 され 通常約一 2 0 〜 5 0での範囲から 択される。 活性化されたアミノ酸誘導体は 通常 1. 5〜4ί¾1¾で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合力坏十分 な には保護基の脱離を行なうことなく縮合 を繰り返すことにより十分な縮合を行な うことができる。 反応を繰り返しても十分 合が得られないときには、 無冰酢酸またはァ セチルイミダゾ一ルを用いて未反応アミノ酸をァセチル化することによって、 後の反応に影 響を与えないようにすることができる。
原料のァミノ基の保護基としては、例えば、 Z、 Boc、 t—ペンチルォキシカルボニル、ィ ソボルニルォキシカルボニル、 4—メトキシベンジルォキシカルボニル、 C卜 Z、 Br- Z、 ァダ マンチルォキシカルボニル、 トリフルォロアセチル、 フタロイル、 ホルミル、 2—ニトロフ ェニルスルフエ二ル、 ジフエニルホスフイノチオイル、 Fmocなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 工チル、 プロピル、 プチル、 tーブチル、 シクロペンチル、 シクロへキシル、 シクロへプチル、 シクロォクチル 、 2—ァダマンチルなどの纖状、 分枝状もしくは環状アルキルエステルイ ϋ 、 ァラルキル エステル化 （例えば、 ベンジルエステル、 4—ニトロべンジルエステル、 4ーメトキシベン ジルエステル、 4—クロ口べンジルエステル、 ベンズヒドリルエステル ) 、 フエナシルェ ステル化、 ベンジルォキシカルボニルヒドラジド化、 t—ブトキシカルボニルヒドラジド化 、 トリチルヒドラジド化などによって保護することが きる。
セリンの 基は、 例えば、 エステル化またはエーテル化によって纏すること力 きる
。 このエステル化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの纖 （C ^eアルカノィ ル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルボ二ル基、 エトキシカルポニル 基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロピラニル基、 t-ブチル基などである。
チロシンのフエノー JH47]酸基の保護基としては、 例えば、 BzK ClrBzK 2—ニトロべ ンジル、 Br - Z、 t—ブチルなど力用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、 Tos、 4-メトキシ -2, 3， 6-トリメチ ルベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチル、 Bum, Boc、 Trt、 Fmocなどが用いられ る。
原料の力ルポキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対 ϋί Τる酸無水物、 アジド 、 活性エステル 〔アルコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2, 4, 5—トリクロロフエノ ール、 2， 4 -ジニトロフエノール、 シァノメチルアルコール、 パラニトロフエノール、 Η0 Β、 Ν -ヒドロキシスクシミド、 Ν-ヒドロキシフ夕ルイミド、 Η0ΒΟ とのエステル〕 などが用いら れる。 原料のァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対 ίδΤるリン酸アミドが用い られる。
保護基の^ ¾讓）方法としては、例えば、 P d—黒あるいは P d-炭素などの匪の存 在下での水線流中での ¾ S^、 また、 無水フツイ 素、 メタンスルホン酸、 トリフル ォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ齚酸あるいはこれらの混合液などによる,理ゃ、 ジ イソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる;^ a 理、 また液体アンモニア中ナトリウムによる ¾なども用いられる。 上記酸処理にょる醒 は、 ""^に約— 2 0 〜 4 0での で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァ ニソール、 フエノーレ、 チオア二ソール、 メタクレゾ一レ、 パラクレゾール、 ジメチルスル フイド、 1, 4 -ブタンジチオール、 1, 2-エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加 カ^ "効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる 2, 4-ジニトロフエ ニル基はチオフエノ一ル処理により され トリブトファンのインドール保護基として用 いられるホルミル基は上記の 1, 2 -エタンジチオール、 1, 4 -ブタンジチオールなどの 下の 理による脱保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処 理によっても除去される。
料の反応に関与すべきでない官能基の保護ならびに保護基、 およびその保護基の腿、 反応に関与する官能基の活性化などは么 の基または^ 0の手段から M択しうる。 本発明のポリペプチドもしくは部分ペプチドのアミド体を得る別の方法としては、 例えば 、 まず、 カルポキシ ¾アミノ酸の α—カルボキシル基をアミド化して保護した後、 ァミノ 纖 ijにペプチド （ポリペプチド） 鎖を所望の鎖長まで延ばした後、 該ペプチド鎖の の α—アミノ基の保護基のみを除いたポリぺプチドと C«のカルボキシル基の保護基のみを したポリぺプチドとを製造し、 この両ポリぺプチドを上記したような混合溶媒中で縮合 させる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得られた保護ポリべプチ ドを精製した後、 上記方法によりすベての保護基を！^し、 所望の粗ポリペプチドを得るこ とが きる。 この粗ポリペプチド の各種精製手段を駆使して精製し、 主翻分を雜 «することで所望のポリぺプチドもしくは部分べプチドのアミド体を得ることができる。 本発明のポリペプチドもしくは部分ペプチドのエステル体を得るには、 例えば、 カルボキ シ アミノ酸の α—カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合しアミノ酸エステルとし た後、 ポリペプチドのアミド体と同様にして、 所望のポリペプチドもしくは部分ペプチドの エステル体を得ること力 きる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、 自体 のペプチドの合成法に従って、 あるいは 本発明のボリぺプチドを適当なぺプチダーゼで切断することによつて製造することか きる 。 ペプチドの合成法としては、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれによっても良い。 すなわち、 本発明の部分べプチドを構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と歹餘部分と を縮合させ、 生成物が保護基を有する場合は保護基を»することにより目的のぺプチドを ®gすることが きる。 么^!の縮合方法や保護基の扁としては、 例えば、 以下 (¾®~(Dに 言 された方法があげられる。
① M Bodanszky および ん Ondet t K ペプチド ·シンセシス （Pept ide Synthesis), Interscience Publ ishers, New York (1966年）
② Schroederおよび Luebke、 ザ ·ペプチド（The Pept ide), Academic Press, New York (1965 年）
®m屋信夫他、 ペプチド合成の »と ， 丸善 (株） （1975年）
島治明およ 原俊平、 生化^ ¾講座 1、 タンパク質の化学 IV、 205、 （1977年） 敏島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店 また、 反応後 常の精製法、 例えば、 ^«¾出'蒸留'カラムクロマトグラフィー '液 体クロマトグラフィー ·再結晶などを組み合わせて本発明の部分ペプチドを精製^ ITるこ とができる。 上記方法で得られる部分ペプチドが難体である は、 の方法あるいは それに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、 逆に塩で得られた齢は、 公知の方法あるいはそれに準じる方法によって 体または他の塩に変換することが、できる 本発明のポリぺプチドをコ一ドする DN Aとしては、 前述した本発明のポリぺプチドをコ ードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DN A、 ゲノム DNAライブラリ一、 嫌己した細胞 '繊由来の c DNA、 tiifSした細胞'繊 由来の c DNAライブラリー、 合成 DN Aのいずれでもよい。
ライブラリーに麵するベクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファ 一ジミドなどいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より total RNAまたは m RN A画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (以下、 RT-P CR法と略称する） によって増幅することもできる。
本発明のポリペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配列番号： 3 4また ¾15列番号： 5 1で表わされる 塩 SSH列を含 る DNA、 また《SH列番号： 2、 配列番号.' 9、 配列番号： 1 5、 配列番 号： 1 9、 配列番号： 3 4また《@2列番号： 5 1で表わされる 配列とハイストリンジェ ントな条件下でハイブリダィズする^ @Ξ列を有し、 本発明のポリペプチドと実質的に同質 の活性 （例、 細胞刺激活性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を有するポリペプチド をコードする DNAなどであれば何れのものでもよい。
配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配列番号： 3 4または 配列番号： 5 1で表わされる驢配列とハイストリンジェン卜な条件下でハイプリダイズで きる DNAとしては、 例えば、 それぞ ' @Η列番号： 2で表わされる;^配列と約 7 0 %以上 、 好ましく tt勺 8 0 %以上、 より好ましく〖銷 9 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 5 %以上 の相同性を る；^ S配列を含 る D N Aなどが用いられる。 八イブリダィゼ——ンヨンは、 自体^ Πの方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキ ユラ一 ·クロ一ニンク (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうこと力 きる。 また、 市販のライブラ リ一を麵する齢、 尉寸の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好 ましくは、 八イス卜リンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件とは、 例えば、 ナトリゥム謎が約 1 9 -4 0 mM、 好まし くは糸勺 1 9〜2 OmMで、 温度が約 5 0〜7 0 、 好ましくは約 6 0〜6 5 の条件を示す 。 特に、 ナトリゥム が約 1 9 mMで が約 6 5 :の が最も好ましい。
より具体的には、 配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を るポリペプチドをコード する DNAとしては、 配列番号： 2で表わされる塩基配列を有する DNAなどが用いられる 。 また、 配列番号： 8で表わされるアミノ薩列を fるポリペプチドをコードする DNA としては、 配?!墦号： 9で表わされる 配列を る DN Aなどが用いられ 配列番号： 1 4で表わされるァミノ ¾@2列を ¾Tるポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番 号： 1 5で表わされる驢配列を る DN Αなどが用いられ 配雨号： 1 8で表わされ るアミノ麵列を るポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 1 9で表わ される驢配列を る DN Aなどが用いられ 配列番号： 3 3で表わされるアミノ麵列 を るポリペプチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 3 4で表わされる «配列 を ¾ る DNAなどが用いられ 配列番号： 5 0で表わされるァミノ ¾gH列を るポリべ プチドをコードする DNAとしては、 配列番号： 5 1で表わされる ¾¾SH列を る DNA などが用いられる。
本発明の部分べプチドをコ一ドする DNAとしては、 前述した本発明の部分べプチドをコ ードする;^ IB列を含有するものであればいかなるものであってもよい。 また、 ゲノム DN A、 ゲノム DNAライブラリー、 嫌 Sした細胞 '繊由来の c DNA、 嫌己した細胞'繊 由来の c DNAライブラリ一、 合成 DN Aのいずれでもよい。
本発明の部分ペプチドをコードする DNAとしては、 例えば、 配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配列番号： 3 4または配列番号： 5 1で表わされる 塩基配列を有する DNAの部分塩基配列を有する DNA、 または配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配列番号： 3 4また《ΙΞ列番号： 5 1で表わされる 塩基配列と八ィストリンジェン卜な条件下で八ィプリダイズする塩基配列を有し、 本発明の ポリぺプチドと実質的に同質の活性を有するポリぺプチドをコ一ドする D N Aの部分 i¾SE 列を る DNAなどが用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配»号.' 3 4または 配列番号： 5 1で表わされる «配列とハイブリダィ きる DNAは、 嫌己と同意義を示 す。
ハイブリダィゼ一ションの方法およびハイストリンジェントな条件は嫌己と同様のものが 用いられる。
配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配列番号： 3 4または 配列番号： 5 1で表わされる：^ S配列とハイブリダィズできる DNAでコードされるポリべ プチドは後述の本発明のポリぺプチドの製造法と同様にして^ tすること力 き、 該ポリぺ プチドのアミド、 エステル、 塩は ± の本発明のポリペプチドのアミド、 エステル、 塩と同 様のものなどがあげられる。
また、 本発明の部分べプチドをコ一ドする DNAとしてより具体的には、
① 配列番号： 1で表わされるアミノ麵列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1 0 1番目 （Ser)〜1 1 2番目 （Ser) 、 第 1 2 4番目 （Val)〜1 3 1番目 （Phe) 、 第 1 番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1番目 （Met)〜1 1 2番目 （Ser) または第 1番目 （ Met)〜1 3 1番目 （Phe) のアミノ隱列を含 るペプチドをコードする; 列を る DNAを含^ Tる DNA、 またはこれらと八ィストリンジェントな条件下で八イブリダィ ズする 配列を る D N Aを含 る D N A、
② 配列番号： 8で表わされるアミノ薩列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1 0 1番目 （Ser)〜1 1 2番目 （Ser) 、 第 1 2 4番目 （Val)〜1 3 1番目 （Phe) 、 第 1 番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1番目 （Met)〜1 1 2番目 （Ser) または第 1番目 （ Met)〜1 3 1番目 （Phe) のアミノ酸配列を含 るペプチドをコードする驢配列を る DNAを含有する DNA、 またはこれらとハイストリンジェン卜な条件下で八イブリダィ ズ、する;^ S配列を^ Tる D N Aを含 る D N A、
③ 配列番号： 1 4で表わされるアミノ酸配列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) 、 第 1 2 4番目 （Val)〜1 3 1番目 （Phe) 、 第 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) または第 1番目 （Met)〜1 3 1番目 （Phe) のアミノ隱列を含 るペプチドをコードする腿配 列を ¾ る DNAを含 る DNA、 またはこれらとハイストリンジェントな条件下でハイ プリダイズする塩基配列を有する DN Aを含有-する DNA、
④ 配列番号： 3 3で表わされるアミノ酸配列の第 8 4番目 （Pro) 〜第 9 4番目 （Phe) の アミノ酸配列を含 るべプチドをコ一ドする驢配列を "る DNAを含 ¾ る DNA、 またはこれらと八イストリンジェン卜な条件下で八イブリダィズする «15列を る DN Aを含 る DNA、
⑤ 配列番号： 5 0で表わされるアミノ^ S3列の第 8 4番目 （Pro) 〜第 9 4番目 （Phe) の アミノ麵列を含 ¾ るべプチドをコ一ドする驢配列を ¾Τる DNAを含 # る DNA、 またはこれらとハイストリンジェントな条件下で八ィプリダイズする：^ ¾配列を る DN Aを含 る DNA、
などがあげられる。
配列番号： 1で表わされるアミノ麵列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) のアミ ノ 列を含^ Tるべプチドをコ一ドする ¾S@B列を ¾fる DNAを含 ¾ る DNAとして は、 配列番号： 4 2で表される¾iΞ列をW るDNA (配列番号： 2で表される: »|5列 の第 2 4 1番目ないし第 2 7 6番目の驢を る DNA) を含^ る DNA、
配列番号： 1で表わされるアミノ薩列の第 1 0 1番目 （Ser)〜1 1 2番目 （Ser) のァ ミノ ¾@H列を含有するべプチドをコ一ドする iiSSH列を Wする DNAを含有する DNAとし ては、 配列番号： 4 3で表される驢配列を る DN A (配列番号： 2で表される 配 列の第 3 0 1番目ないし第 3 3 6番目の塩基を る DNA) を含^る DNA、
配列番号： 1で表わされるアミノ隱列の第 1 2 4番目 （Val)〜1 3 1番目 （Phe) のァ ミノ隱列を含^ Tるべプチドをコ一ドする；^ S配列を る DNAを含 る DNAとし ては、 配列番号： 4 4で表される；røB列を TるDNA (配列番号： 2で表される; ¾@Ξ 列の第 3 7 0番目ないし第 3 9 3番目の塩基を る DNA) を含 る DNA、
配列番号： 1で表わされるアミノ麵列の第 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) のァミノ 隨列を含^ ΓΤるペプチドをコードする塩 SIB列を る DN Aを含^ Tる DNAとしては 、 配列番号： 4 5で表される塩基配列を する DN A (配列番号： 2で表される^ IB列の 第 1番目ないし第 2 7 6番目の;^ Sを る DNA) を含 る DNA、
配列番号： 1で表わされるアミノ隱列の、 第 1番目 （Met) 〜1 1 2番目 （Ser) のアミ ノ酸配列を含 るべプチドをコ一ドする;^ »列を る D N Aを含^ ΓΤる D N Aとして は、 配列番号： 4 6で表される塩基配列を有-する DN A (配列番号： 2で表される塩基配列 の第 1番目ないし第 3 3 6番目の塩基を ¾Tる DNA) を含 る DNA、 および
配列番号： 1で表わされるアミノ舰列の、 第 1番目 （Met) 〜1 3 1番目 （Phe) のアミ ノ薩列を含^るぺプチドをコ一ドする^ IS列を る D N Aを含 ¾Tる D Ν Αとして は、 配列番号： 4 7で表される;»配列を TるDNA (配列番号： 2で表される;^ ¾S5列 の第 1番目ないし第 3 9 3番目の ¾Sを ¾ る DNA) を含 #Tる DN Aなどがあげられる 。
本発明のポリぺプチドもしくはその部分べプチド、 後述の本発明のレセプ夕一蛋白質もし くはその部分べプチドおよびこれらの蛋白質またはべプチドをコ一ドする DNAは、 自体公 知の方法で標識化されていてもよぐ 具体的にはアイソトープラベル化されたもの、 ； ^標 識されたもの （例えば、 フルォレセインなどによる蛍光標識 、 ピオチン化されたものまた 〖塘素標識されたものなどがあげられる。
本発明のポリペプチドまたは部分ペプチド （以下、 これらポリペプチド等をコードする D NAのクローニングおよぴ究現の説明においては、 これらポリべプチド等を単に本発明のポ リぺプチドと略記する場合がある） を にコードする DN Aのクローニングの手段として は、 本発明のポリぺプチドの部分驢配列を る合成 DN Aプライマーを用いて自体^ Π の P C R法によって増幅するか、 または適当なベクターに組み込んだ DN Aを本発明のポリ ペプチドの "^あるいは 域をコードする DNA断片もしくは合成 DNAを用いて ¾し たものとのハイブリダィゼーションによって選別すること力 ?きる。 ハイブリダィゼーショ ンの方法は、例えば、 モレキュラー ·クロ一ニング（Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことが きる。 また、 市販のライブラリ一を麵する齢、 腐寸の翻説明書に記載の方法に従って 行なうことができる。
。 八の塩¾¾列の変換は、 のキッ卜、例えば、 MutanTM-G (宝 (株） )、 MutanTM-K (宝酒造 （株） ) などを用いて、 Guppedduplex法や Kimkel法などの自体公知の方法あるい はそれらに準じる方法に従って行なうことが、できる。
クローン化されたポリペプチドをコードする DNAは目的によりそのまま、 または所望に より制 P鹏素で消化したり、 リンカ一を 口したりして^ fflすることができる。 該 DNAは その 5' 5»』に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3' « には翻!^終止コド ンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの翻訳開始コドンや翻 謹止コドンは、 適当な合成 DN Aアダプタ一を用いて働 ΙΓΤることもできる。
本発明のポリペプチドの発現ベクターは、 例えば、 （ィ） 本発明のポリペプチドをコード する DNAから目的とする DNA断片を切り出し、 （口） 該 DN Α断片を適当な発現べクタ 一中のプロモーターの下流に連結することにより製造すること力 ?きる。
ベクターとしては、 菌由来のプラスミド （例、 pBR322, pBR325, pUC 12， pUCl 3) 、 枯 由来のプラスミド （例、 pUBl l O, pTP5， pCl 94 ) 、 酵母由来プラスミド （例、 pSHl 9, pSHl 5) 、 λファージなどのバクテリオフ ァ一ジ、 レトロウイルス， ワクシニアウィルス， バキュロウィルスなどの動物ウィルスなど の他、 pAl— 11、 pXTl、 pRc/CMV, pRc/RSV、 cDNAI/Ne o などが用いられる。
本発明で用いられるプロモーターとしては、 遺 βϊの発現に用いる宿主に対応して適切な プロモー夕一であればいかなるものでもよい。 例えば、 動物細胞を宿主として用いる ¾ ^は 、 SRaプロモーター、 SV40プロモーター、 H I V · LTRプロモータ一、 CMVプロ モー夕一、 H S V-TKプロモー夕一などがあげられる。 これらのうち、 CMV (サイトメガロウィルス） プロモ一夕一、 SRaプロモ一夕一など を用いるのが好ましい。 宿主がェシエリヒア属菌である齢は、 t rpプロモー夕一、 l a cプロモーター、 r e c Aプロモー夕一、 λ P Lプロモ一夕一、 1 ρ ρプロモ一夕一、 Τ 7 プロモータ一などが、 宿主がバチルス属菌である場合は、 SP01プロモータ一、 SPO2 プロモー夕一、 penPプロモーターなど、 宿主カ聰母である齢は、 PH05プロモータ ―、 PGKプロモーター、 GAPプロモータ一、 ADHプロモーターなどが好ましい。 宿主 が昆細胞である ¾^は、 ポリへドリンプロモーター、 P 10プロモー夕一などが好ましい
発現ベクターには、 以上の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシングシグナル、 ポ UA ¾nシグナル、 選択マーカ一、 SV40複製オリジン （以下、 SV40or iと略 ¾τΤ る場合がある） などを含有しているものを用いることができる。 選択マ一カーとしては、 例 えば、 ジヒドロ 酵素 （以下、 dh f rと略 ¾τΤる場合がある） 遺 » 〔メソトレキ セート （Μτχ) m 、 アンピシリン而 iffite? (以下、 Amp1 "と略称する場合がある
) 、 ネオマイシン耐 ffitfe^ (以下、 Neo Γと略TTる がある、 G418iftt) 等が あげられる。 特に、 dh f r遺 欠損チャイニーズハムスター細胞を用いて dh f r遺伝 子を選択マ一力一として使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によっても選 択できる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列を、 本発明のポリペプチドの N端末側に 働 ΠΤる。 宿主がェシエリヒア属菌である は、 Pho A ·シグナル配列、 Omp A ·シグナ リ l^SH列などが、 宿主がバチルス属菌である は、 α—アミラーゼ.シグナル配列、 サブチ リシン.シグナル配列などが、 宿主カ獬母である齢は、 MFa .シグナリ«列、 SUC 2 'シグナル配列など、 宿主が 物細胞である場合には、 インシュリン.シグナル配列、 a- インタ一フエロン ·シグナル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ利用できる。 このようにして構築された本発明のポリぺプチドをコードする D N Aを含#1~るべクター を用いて、 形質転換体を製造することができる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 ノ チルス属菌、 酵母、 M ^細胞、 昆虫、 動物 細胞などが用いられる。
ェシエリヒア属菌の具体例としては、 例えば、 ェシエリヒア'コリ （Escherichia coli) Kl 2 · DH1 〔プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シィズ ·ォブ ·ザ'ユーエスエー （Pro Natl. Acad. Sci. USA) ， 60巻， 160(1 968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック ·ァシッズ ·リサーチ， （Nucleic Acids Research ) , 9巻， 309 (1981)〕 ， JA221 〔ジャーナル ·ォブ 'モレキュラー'ゾイォロ ジ— (Journal of Molecular Biology) 〕 ， 120巻， 517 (1978)] , ΗΒ 101 C ジャーナル'ォブ ·モレキュラー 'バイオロジー， 41巻， 459(1969)〕 ， C600 〔ジエネティックス （Genetics) ， 39巻， 440(1954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 ノ'チルス ·サブチルス (Bacillus subtil is) MI 114 〔ジーン， 24卷， 255(1983)〕 ， 207-21 〔ジャーナル ·ォブ'ノィオケミス トリ一 （Journal of Biochemistry) ， 95巻， 87(1984)〕 などカ佣いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) A
H22, AH22R—， NA87-11A, DKD-5D, 20B— 12、 シゾサッカロマ イセス ボンべ（ScMzosaccharomycespombe) NCYC 1913, NCYC2036, ピキ ァ パストリス （Pichia pastoris) KM 71など力用いられる。
昆細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの齢は、 夜盗蛾の幼虫由来株ィ！ ^胞
(Spodoptera frugiperda cell； S fM ) 、 Trichoplusia niの中腸由来の MG1細胞、
Trichoplusia ni の卵由来の High Five™細胞、 Mamestra brassicae 由来の細胞または Estigmena acre 由来の細胞などが用いられる。 ウィルスが BmNP Vの場合は、 蚕由来株 im (Bombyx mori 細胞； BmN» などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例え ば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J.Lら、 イン'ヴィポ （
In Vivo) , 13, 213-217, (1977)) など力用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー （Nature) , 315巻， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サ 胞 COS— 7, Vero, チャイニーズハムスター細胞 C HO (以下、 CH〇細胞と略記） ， dh f r遺 β?欠損チャイニーズ八ムス夕一細胞 CHO
(以下、 CHO (dh f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス At T— 20， マウス ミエ口一マ細胞， ラット GH3， ヒト FL細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌を形質転換するには、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナ ル ·アカデミー ·ォブ ·サイェンジィズ 'ォブ 'ザ'ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA) , 69巻， 2110 (1972)やジーン （Gene) ， 17巻， 107(1982)など に記載の方法に従って行なうことができる。
バチルス属菌を形質 ¾mするには、 例えば、 モレキュラー 'アンド ·ジェネラル ·ジエネ ティックス （Molecular & General Genetics) , 168巻， 111 (1979)などに記載の 方法に従って行なうこと力 きる。
酵母を形質転換するには、 例えば、 メソッズ 'イン ·ェンザィモロジ一 （Methods in
Enzy ology) , 194卷， 182— 187 (1991) 、 プロシージングズ.ォブ ·ザ ·ナ ショナル 'アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ ·ォブ 'ザ*ュ一エスェ一（Proc. Natl. Acad.
Sci. USA) , 75巻， 1929(1978) などに記載の方法に従って行なうことが き る。
昆虫細胞または昆虫を形質転換するには、 例えば、 バイオ Zテクノロジー （ Bio/Technology, 6, 47-55(1988)) などに記載の方法に従って行なうことが きる。
動物細胞を形 するには、 例えば、 細 学別冊 8 新細 プロトコール. 263-267 (1995) (秀潤観行） 、 ヴィロロジー （Virology) , 52巻， 456( 1973)に記載の方法に従って行なうこと力 きる。
このようにして、 ポリペプチドをコードする DN Aを含 ¾ る発現ベクターで形質繊さ れた形質転換体を得ることが きる。
宿主がェシエリヒア属菌、 バチルス属菌である形質転換体を培養する際、 培養に翻され る培地としては液僻地が適当であり、 その中には該形質転換体の生育に機な炭素源、 窒 素源、 無機物その他が含有せしめられる。 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキスト リン、 可溶 ¾»、 ショ糖など、 ¾ ^源としては、 例えば、 アンモニゥム賴、 m^m, コーンスチープ ·リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液など の纖または有機物質、 無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン酸： ΐτ素ナトリウ ム、 塩化マグネシウムなどがあげられる。 また、 酵母、 ビタミン類、 生: ¾Si因子などを添 加してもよい。 培地の pHtt勺 5〜8力壁ましい。
ェシヱリヒア属菌を培養する際の培地としては、 例えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラ一 （Mi l ler) ， ジャーナル'ォブ'ェクスペリメンッ 'イン 'モレキュラー •ジェネティックス (Journal of Experiments in Molecular Genet ics) ， 4 3 1—4 3 3 ， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1 9 7 2〕 が好ましい。 ここに艘によりプ 口モーターを効率よく勵 るために、 例えば、 3 /3—インドリルァクリル酸のような翻 を加えることができる。
宿主がェシェリヒァ属菌の場合、 培養ま通常約 1 5 -4 3 で約 3〜 2 4時間行ない、 必 要により、 通気や ί¾半を加えることもできる。
宿主がバチルス属菌の場合、 培養【¾§常約 3 0〜 4 0でで約 6〜 2 4時間行ない、 に より や勝を加えることもできる。
宿主が 母である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 バークホールダ一 (
Burkholder) 最小培地 [Bost ian, K. L. ら、 プロシージングズ 'ォブ ·ザ ·ナショナル'ァ 力デミ一'ォブ'サイェンシィズ 'ォブ 'ザ 'ュ一エスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. U S
A) ， 7 7巻， 4 5 0 5 ( 1 9 8 0)〕 や 0. 5 %カザミノ酸を含 る S D培地 〔Bi tter, G.
A. ら、 プロシージングズ ·ォブ *ザ*ナショナル 'アカデミー ·ォブ ·サイェンシィズ 'ォ ブ ·ザ ·ユーエスェ一 (Proc. Nat l. Acad. Sci. U SA) , 8 1卷， 5 3 3 0 ( 1 9 8 4)
) があげられる。 培地の p Hiお勺 5〜 8に調 るのが好ましい。 培養〖¾1常約 2 0 〜 3
5でで約 2 4〜 7 2時間行ない、 必要に応じて通気ゃ撤半を加える。
宿主が昆 胞また 虫である形質転換体を培養する際、培地としては、 Grace' s Insect
Medium (Grace, T. C. C. ,ネイチヤー (Nature) , 195, 788(1962) ) に非 ΙΜ匕した 1 0 %ゥシ血 ？靜の添加物を ¾ 3口えたものなどが用いられる。 培地の p Hは約 6. 2〜6. 4に調 るのが好ましい。 培養¾1常約 2 7 °Cで約 3〜 5日間行ない、 必 に応じて通気や辦を加 える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、 培地としては、 例えば、 約 5〜20%の 胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science)， 122巻， 501(1952)〕 ， D MEM培地〔ヴイロロジー （Virology)， 8巻， 396 (1959)〕 ， RPMI 1640培 地〔ジャーナル ·ォブ 'ザ ·アメリカン ·メディカル 'アソシエーション（The Journal of the American Medical Association) 199巻， 519(1967)〕 ， 199培地 〔プロシ一ジ ング ·ォブ ·ザ ·ソサイエティ ·フォー ·ザ ·バイオロジカル ·メディスン （Proceeding of the Society for the Biological Medicine)， 73巻， 1 (1950)〕 などが用いられる。 p Hは約 6〜 8であるのが好ましい。 培養は通常約 30 〜 40 X：で約 15-60時間行な い、 必要に応じて通気ゃ»を加える。
以上のようにして、 形質転換体の細 «などに本発明のポリぺプチドを生成せしめること 力 さる。
上記培養物から本発明のポリペプチドを分 製するには、 例えば、 下記の方法により行 なうことが、できる。
本発明のポリペプチドを培養菌体あるい〖細胞から抽出するに際しては、 培養後、 の 方法 ¾体あるい〖細胞を集め、 これを適当な緩衝液に βし、 超音波、 リゾチームおよび ノまたは凍結融解などによつて菌体あるいは細胞を破壊したのち、 遠心分離やろ過によりポ リぺプチドの «出液を得る方法などが MMいられる。 緩衝液の中に尿 ^驢グァニジ ンなどの蛋白質変性剤や、 トリトン X— 100 TMなどの界面活性剤が含まれていてもよい 。 培鎌中にポリペプチドが分泌される には、 培難了後、 それ自体么 の方法 ¾体 あるい〖湖胞と上清とを分離し、 上清を集める。
このようにして得られた培養上清、 あるいは抽出液中に含まれるポリペプチドの精製は、 自体么^ aの分離'精製法を脑且み合わせて行なうこと力 ?きる。 これらの么 の分離、 精 製法としては、 塩 溶 などの溶解度を禾拥する方法、 透析法、 Ρ勝ろ過法、 ゲル ろ過法、 および SDS—ポリアクリルアミドゲル電気泳難などの主として肝量の差を利 用する方法、 イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を禾 U用する方法、 ァフィ二ティ —クロマトグラフィーなどの特異的親和性を禾 Ij用する方法、 逆相高速液体クロマトグラフィ 一などの ¾7K性の差を禾拥する方法、 等鼇 電気泳動法などの等亀 の差を禾拥する方法な どが用いられる。
かくして得られるポリぺプチドが醒体で得られた場合には、 自体 の方法あるいはそ れに準じる方法によって塩に変換することができ、 逆に塩で得られた場合には自体^ Πの方 法あるいはそれに準じる方法により、 «体または他の塩に変換すること力 ?きる。
なお、 え体が 生するポリペプチドを、 精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を 作用させることにより、 任意に修飾を加えたり、 ポリペプチドを部分的に除去することもで きる。 蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリブシン、 アルギニルエンドべ プチダ一ゼ、 プロテインキナーゼ、 グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして生成する本発明のポリペプチドまたはその塩の存在または活性は、 標識したリガ ンドとの結合実験および特異抗体を用いたェンザィムィムノアッセィなどにより測定するこ と力 さる。
本発明のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分 ぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の受容体 （以下、 レセプタ 一蛋白質と略記する齢がある） として具働には、 例えば、 麵番号： 3 7で表わされる アミノ^ S列と同一もしくは実質的に同一のアミノ 列を含有するレセプ夕一蛋白質など があげられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 例えば、 ヒトゃ哺 ¾ί¾物 （例えば、 モルモット、 ラット、 マウス、 ゥサギ、 ブ夕、 ヒッジ、 ゥシ、 サルなど） のあらゆる細胞 （例えば、 翻胞、 觀 細胞、 グリア細胞、 膝臓) 3細胞、 骨 «a胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮 細胞、 上細胞、 内細胞、 m , mm , 麵胞、 脂肪細胞、 mm (例、 マ クロファ一ジ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥'翻胞、 好中球、 好塩 Si求、 好 酸球、 戦） 、 巨核球、 滑翻胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨棚胞、 破骨細胞、 孚瞧胞、 ff 細胞もしくは間 胞、 またはこれら細胞の前 細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など） や血 球系の細胞、 またはそれらの細胞が るあらゆる麵、 例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嚇、 m . m $, 海馬、 赚、 赚下部、 視床下核、 «皮質、 延髄、 小脳、 後 頭葉、 前 »、 側麟、 被殻、 尾状核、 脳染、 黒質） 、 麵、 下垂 胃、 滕臓、 腎臓、 肝 臓、 生藤、 甲 «、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 ^m, 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 雌、 ¾τ腺、 末梢血、 末梢血球、 前 、 睾丸、 精巣、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など （特に、 »脳の各 に由来する蛋白質であってもよく、 また合成蛋白質であってもよい。
配列番号： 3 7で表わされるアミノ隱列と実質的に同一のァミノ ¾S5列としては、 例え ば、 配列番号： 3 7で表わされるァミノ ¾S列と約 5 0 %以上、 好ましく〖お勺 7 0 %以上、 より好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましく «勺 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以 上の相同性を^ Tるァミノ酸配列など力 げられる。
本発明の配列番号： 3 7で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のァミノ ¾ΙΞ列を含有 する蛋白質としては、 例えば、 配列番号： 3 7で表わされるァミノ β列と実質的に同一の ァミノ 列を有し、 配 潘号： 3 7で表わされるァミノ m@H列と実質的に同質の活性を有 する蛋白質などが好ましく、 具働には、 配^!播号： 5 4で表されるァミノ麵列を含#1" る蛋白質などがあげられる。
実質的に同質の活性としては、 例えば、 リガンド結合活性、 シグナヅレ情報伝達作用または ソマトス夕チン分泌調節活性などカ举げられる。 実質的に同質とは、 それらの活性が體的 に同質であることを示す。 したがって、 リガンド結合活性、 シグナ JHf¾e¾作用またはソ マトス夕チン分泌調節活性などの活性が同等 （例、 約 0. 0 1〜： 1 0 0倍、 好ましく〖お勺 0 , 5〜2 0倍、 より好ましく tt ¾0. 5〜2倍） であることが好ましいが、 これらの活性の ^や蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい。
リガンド結合活性、 シグナレ If報伝達作用またはソマトス夕チン分泌調節活性などの活性 の測定は、 自体么 の方法に準じて行なうことができるが、 例えば、 鍵するリガンドの決 ^法ゃスクリ一二ング方法に従つて測^すること力できる。
また、 本発明のレセプター蛋白質としては、 ®SH列番号： 3 7または配列番号： 5 4で表 わされるアミノ薩列中の 1または 2個以上 （^ましくは、 ：！〜 3 0個^、 より好ましく は 1〜： L さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のアミノ酸が欠失したァミノ 隱列、 （Dffi列番号： 3 7または配列番号： 5 4で表わされるアミノ ^SS列に 1または 2個 以上 （好ましくは、 1〜3 0個 、 より好ましくは 1〜1 0個雖、 さらに好ましくは数 個 （1または 2個） ) のアミノ酸が働口したアミノ酸配列、 （H2列番号： 3 7また Wffi列番 号： 5 4で表わされるアミノ^ H列中の 1または 2個以上 （$?ましくは、 1〜3 0個^、 より好ましくは 1〜： L 0個 igm、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のアミノ酸が他 のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または φ^"れらを組み合わせたアミノ^ S列を含有 する蛋白質なども用いられる。
本明細書におけるレセプ夕一蛋白質は、 ペプチド標記の慣例に従って左端が Ν¾ (アミ ノ«) 、 が (カルポキシル である。 配列番号： 3 7で表わされるァミノ 隱列を含 るレセプ夕一蛋白質をはじめとする、 本発明のレセプ夕一蛋白質は、 c^m が通常カルボキシル基 (- COOH) またはカルボキシレート（一C〇O—) であるが、 C末 端がアミド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) であってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチレ、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロ ピルもしくは n—ブチルなどの アルキル基、 例えば、 シクロペンチル、 シクロへキシ ルなどの C 3_8シクロアルキル基、 例えば、 フエニル、 α—ナフチルなどの C 6_1 27リール 基、 例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二ルー アルキル基もしくは α—ナフチ ルメチルなどの α—ナフチリレ一 _2アルキル基などの C 7— 1 4ァラルキル基のほか、 経口用 エステルとして TOされるビバロイルォキシメチル基などが用レ られる。
本発明のレセプ夕一蛋白質が。¾ に力ルポキシル基 （またはカルボキシレート） を 有している：^、 カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明のレ セプ夕一蛋白質に含まれる。 この のエステルとしては、 例えば上記した C«のエステ ルなどが用いられる。
さらに、 本発明のレセプ夕一蛋白質には、 上記したポリペプチドにおいて、 のメチ ォニン歹錢のァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2_6アルカノィル 基などの ァシル基など） で保護されているもの、 N ijが生体内で切断され生成した ダルタミル基がピログルタミン酸化したもの、 肝内のアミノ酸の側鎖上の置換基 （例えば
、 —OH、 — C〇OH、 アミノ基、 イミダゾ一ル基、 インドール基、 グァニジノ基など） が 適当な保護基（例えば、 ホルミル基、 ァセチルなどの C 2_6アルカノイソ! ^などの _6ァシ ル基など） で保護されているもの、 あるい〖雄鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋 白質なども含まれる。
本発明のレセプタ一蛋白質の具体例としては、 例えば、 配列番号： 3 7で表わされるアミ ノ酸配列を含有するラット由来のレセプ夕一蛋白質、 配列番号： 5 4で表されるヒト由来の レセプター蛋白質などが用レ られる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の部分べプチドとしては、 鎌己した本発明のレセプター蛋白質 の部分ペプチドであれば何れのものであってもよ 1 が、 例えば、 本発明のレセプ夕一蛋白質 肝のうち、 細讓の外に露出している雜であって、 レセプター結合活性を ¾ るものな どが用いられる。
具体的には、 配列番号： 3 7また «S3列番号： 5 4で表わされるアミノ^ Ξ列を るレ セプ夕一蛋白質の部分ペプチドとしては、 ¾τ性プロット癒におい T B舰領域 性 (Hydrop i l ic) 部位） であると分析された部分を含むペプチドである。 また、 疎水性 ( Hydrophobic)部位を一部に含むペプチドも同様に用いることができる。個々のドメインを個 別に含むぺプチドも用い得るが、 複数のドメインを同時に含む部分のぺプチドでも良い。 本発明のレセプター蛋白質の部分べプチドのアミノ酸の数は、 前記した本発明のレセプ夕 一蛋白質の構成アミノ^ E列のうち少なくとも 2 0個以上、 好ましくは 5 0個以上、 より好 ましくは 1 0 0個以上のアミノ隱列を るペプチドなどが好ましい。
実質的に同一のアミノ酸配列とは、 これらアミノ^ Ξ列と約 5 0 %以上、 好ましく《*¾7 0 %以上、 より好ましく〖¾勺 8 0 %以上、 さらに好ましく〖お勺 9 0 %以上、 最も好ましくは 約 9 5 %以上の相同性を るアミノ^ Ξ列を示す。
ここで、 「実質的に同質の活 とは、 嫌己と同意義を示す。 「実質的に同質の活 ttj の 測定は fiJfSと同様に行なうこと力できる。
また、 本発明のレセプター蛋白質の部分ペプチドは、 上記アミノ酸配列中の 1または 2個 以上 （^ましくは、 ；!〜 1 0個 、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ) のアミノ酸 が欠失し、 または、 そのアミノ酸配列に 1または 2個以上 ?ましくは、 1 - 2 om , より好ましくは 1〜1 0個 、 さらに好ましくは数個 （1または 2個） ） のアミノ酸が付 加し、 または、 そのアミノ酸配列中の 1または 2個以上 （好ましくは、 1〜1 0個 、 よ り好ましくは数個 （1または 2個） 、 ) のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されていてもよい また、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチドは。*¾が通常カルボキシル基 （一 CO OH) またはカルポキシレート （一 COO— ) であるが、 前記した本発明のポリペプチドの ごとく、 C がアミド （一 CONH2) またはエステル （一 COOR) (Rは上記と同意 義を示す） であってもよい。
さらに、 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分ペプチドには、 Mf己した本発明のレセプ夕ー蛋 白質と同様に、 N«のメチォニン魁のアミノ基が保護基で髓されているもの、 N端側 が生体内で切断され^ gした Ginがピログルタミン酸化したもの、 肝内のアミノ酸の側鎖 上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるい が したいわゆる糖ぺプ チドなどの複合べプチドなども含まれる。
本発明のレセプター蛋白質またはその部分べプチドの塩としては、 とりわけ生理学的に許 容される酸 ¾ロ塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば雄酸 （例えば、 職、 リン酸 、 臭ィは素酸、 W との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 キ¾、 プロピオン酸、 フマ マレイン酸、 コ八ク酸、 , クェン酸、 リンコ 、 «、 安息香酸、 メタンスレ ホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩は、 前述したヒトゃ «?L»i物の細胞また か ら自体^ πのレセプ夕一蛋白質の精 法によつて することもできるし、 »する本発 明のレセプター蛋白質をコ一ドする DN Aを含有する形質転換体 （宿主は前述の本発明のポ リベプチドをコ一ドする DN Aを含 る形 ©¾換体の宿主と同様のものなどが用いられる 。 ） を前述の本発明のポリペプチドをコードする DNAを含有する形質転換体の作製方法に 準じて作製し、 前述の本発明のポリペプチドをコードする DNAを含; TTる形質繊体の培 法に準じて培養することによつても製造することができる。 また、 前述のポリペプチド 合成法またはこれに準じて^ iすることもできる。
ヒトゃ哺 物の纏また〖細胞から難する齢、 ヒトゃ哺 ¾»J物の繊または細胞を ホモジナイズした後、 酸などで抽出を行ない、 該抽出液を逆相クロマトグラフィー、 イオン ク口マトグラフィーなどのクロマトダラフィ一を組み合わせることにより精製 «する ことができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質の部分べプチドまたはその塩は、 前述の自体^ Πのべプチドの 合成法に従って、 あるい 発明のレセプ夕一蛋白質を適当なぺプチダ一ゼで切断すること によって S することが、できる。
本発明のレセプター蛋白質またはその塩、 その部分べプチドもしくはそのァミドもしくは そのエステルまたはその塩の合成は の本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩における合 法と同様の方法により合成することができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドするポリヌクレオチドとしては、 本発明のレセプター 蛋白質をコードする; 列 （DNAまたは RNA、 好ましくは DNA) を含有するもので あればいかなるものであってもよい。 該ポリヌクレオチドとしては、 本発明のレセプタ一蛋 白質をコードする DNA、 mRNA等の RNAであり、 二本鎖であっても、 一本鎖であって もよい。 Ζ φ:鎖の は、 鎖 DNA、 鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイブリツ ドでもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード であっても、 アンチセンス鎖 （ 即ち、 非コード鎩 であってもよい。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドするポリヌクレオチドを用いて、 例えば、 公知の実験 医学増刊 「新 P C Rとその応用」 15 (7)、 1997記載の方法またはそれに準じた方法により、 本発明のレセプ夕一蛋白質の mRNAを定量することが きる。
本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aとしては、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAラ イブラリー、 婦己した細胞'繊由来の c DNA、 嫌己した細胞'繊由来の c DNAライ ブラリ一、 合成 DNAのレずれでもよい。 ライブラリ一に翻するべクタ一は、 バクテリオ ファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージミドなどいずれであってもよい。 また、 前記し た細胞'組織より total RNAまたは mRNA画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT— P C R法と略称する） によって増 幅することもできる。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DN Aとしては、 例えば、 配列番号 : 3 8、 配列番号： 5 5また〖滅列番号： 5 6で表わされる塩基配列を含 る DNA、 ま た《@5列番号： 3 8、 配列番号： 5 5または配列番号： 5 6で表わされる^ ΙΞ列と八イス トリンジェン卜な条件下で八イブリダイズする ¾S配列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質 と実質的に同質の活性 （例、 リガンド 活性、 シグカ l ff報鍵作用またはソマトス夕チ ン分泌調節活性など） を有するレセプター蛋白質をコ一ドする DNAであれば何れのもので もよい。
配列番号： 3 8、 配列番号： 5 5または配列番号： 5 6で表わされる ^15列とハイプリ ダイズできる DNAとしては、 例えば、 配列番号： 3 8、 配列番号： 5 5または配列番号： 5 6で表わされる 列と約 7 0 %以上、 好ましく〖お勺 8 0 %以上、 より好ましく 9 0 %以上、 最も好ましくは約 9 5 %以上の相同性を有する塩基配列を含有する DNAなどが 用いられる。
八イブリダィゼ一シヨンは、 自体 の方法あるいはそれに準じる方法、 例えば、 モレキ ユラ一 ·クロ一ニンク (Molecular Cloning) 2 nd (J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行なうことができる。 また、 市販のライブラ リーを棚する 、 謝の^ ffl説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 より好 ましくは、 ハイストリンジェントな条件に従って行なうことが きる。
¾Λィストリンジェン卜な条件とは、 例えば、 ナトリゥム濃度が約 1 9 -4 0 mM、 好ま しくは約 1 9〜2 OmMで、 温度が約 5 0〜7 0 ：、 好ましくは約 6 0〜6 5"Cの条件を示 す。 特に、 ナトリゥム體が約 1 9 mMT が約 6 5 °Cの:^が最も好ましい。
配列番号： 3 8、 配列番号： 5 5または配列番号： 5 6で表わされる塩基配列とハイプリ ダイズできる D N Aでコードされるポリぺプチド〖ま の本発明のポリぺプチドの製造法と 同様にして することができ、 該ポリペプチドのアミド、 エステル、 塩«± ^の本発明の ポリペプチドのアミド、 エステル、 塩と同様のものなどがあげられる。
より具体的には、 配列番号： 3 7で表わされるァミノ 列を含 るレセプ夕一蛋白質 をコードする DNAとしては、 配列番号： 3 8で表わされる塩基配列を^る DN Aなどが 用いられ、 配列番号： 5 4で表わされるアミノ酸配列を含 るレセプ夕一蛋白質をコード する DN Aとしては、 配列番号： 5 5または配列番号： 5 6で表わされる; ¾配列を有する DN Aなどカ佣いられる。
本発明のレセプター蛋白質をコ一ドする DN Aの;^ S配列の一部、 または該 DNAと相補 的な腿配列の" ^を含有してなるポリヌクレオチドとは、 下記の本発明の部分べプチドを コードする DNAを包含するだけで〖 よく、 RNAをも包含する意味で用いられる。
本発明に従えば、 G蛋白質 レセプ夕一蛋白質遺 の複製又は発現を阻 ること のできるアンチセンス ·ポリヌクレオチド （核酸） を、 クローン化したあるいは決定された G蛋白質 レセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNAの: ¾S5列情報に基づき設計し、 合成 しうる。 そうしたポリヌクレオチド （核酷 は、 G蛋白質 翅レセプター蛋白質遺 の RN Αとハイプリダイズすることが き、 該 R N Aの合^:は機能を阻 I ることが きる か、 あるいは G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質関連 RNAとの相互作用を介して G蛋白質共 役型レセプ夕一蛋白質遺 の発現を調節 ·制御することができる。 G蛋白質共役型レセプ 夕一蛋白質関連 R Ν Αの選択された配列に相補的なポリヌクレオチド、 及び G蛋白質共 « レセプ夕一蛋白質関連 R N Aと特異的にハイプリダイズすることができるポリヌクレオチド は、 生体内及び生体外で G蛋白質 ¾ レセプ夕一蛋白質遺 の発現を調節 .制御するの に有用であり、 また鍵の疾患などの治療又は診断に有用である。 用語 「対 ίίΤΤる」 とは、 遺^を含めたヌクレオチド、 塩基配列又は核酸の特定の配列に相同性を有するあるいは相 補的であることを意味する。 ヌクレオチド、 配列又は核酸とペプチド （蛋白質） との間 で 「対 る」 とは、 ヌクレオチド （核酸） の配列又はその相補体から誘導される指令にあ るペプチド （蛋白質） のアミノ酸を通 旨している。 G蛋白質共 ί煙レセプ夕一蛋白質遺伝 子の 5 ' 端ヘアピンリトプ、 5 ' 端 6 -べ一スペア ·リピート、 5 ' 端非翻訳領域、 ポリべ プチド翻訳開始コドン、 蛋白質コード領域、 OR F翻訳開始コドン、 3， 端非翻訳領域、 3 ' 端パリンドローム領域、 及び 3 ' 端ヘアピン "プは好ましい 領域として選択しうる が、 G蛋白質共 レセプ夕一蛋白質遺 内の如何なる領域も文豫として選択しうる。 本発明のレセプ夕一蛋白質の部分べプチドをコ一ドする DNAとしては、 前述した本発明 の部分べプチドをコ一ドする 配列を含有するものであればいかなるものであってもよい 。 また、 ゲノム DNA、 ゲノム DNAライブラリ一、 ttflSした細胞'繊由来の c DNA、 嫌己した細胞 ·組織由来の c DNAライブラリー、 合成 DNAのいずれでもよい。 ライブラ リーに使用するべクタ一は、 バクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファ一ジミドな どいずれであってもよい。 また、 前記した細胞 ·組織より mRN A画分を調製したものを用 いて直接 Reverse Transcriptase Polymerase Chain React ion (以下、 RT-P C R法と略称 する） によって増幅することもできる。
具体的には、 本発明の部分ペプチドをコードする DN Aとしては、 例えば、 ( 1 ) 配列番 号： 3 8、 配列番号： 5 5または配列番号： 5 6で表わされる塩基配列を有する DN Aの部 分; S配列を る DNA、 または （2) 配列番号： 3 8、 潘号： 5 5また《@^1墦号 ： 5 6で表わされる塩 ¾@2列とハイストリンジェントな条件下でハイプリダイズする ίΙ¾ΙΒ 列を有し、 本発明のレセプ夕一蛋白質と実質的に同質の活性 （例、 リガンド結合活性、 シグ ナル膺報伝達作用またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を有するレセプター蛋白質をコ ードする D N Aの部分塩 SIH列を Tる D N Aなどが用いられる。
本発明のポリペプチド、 部分ペプチドまたはそれらのエステルもしくはそれらのアミドま たはそれらの塩に対する抗体また 発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 またはその 部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルに対する抗体は、 本発明のポリぺプ チド、 部分ペプチドまたはそれらのエステルもしくはそれらのアミドまたはそれらの塩また 発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのァミド もしくはそのエステルに対する抗体を認識し得る抗体であれば、 ポリクローナル抗体、 モノ ク口一ナル抗体の何れであつてもよい。
本発明のポリペプチド、 部分ペプチドまたはそれらのエステルもしくはそれらのアミドま たはそれらの塩に対する抗体または本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩、 またはその 部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルに対する抗体 （以下、 抗体の説明に おいては、 これらを単に本発明のレセプ夕一蛋白質と略記する がある） は、 本発明のポ リぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質を抗原として用い、 自体公知の抗体または抗血 清の製造法に従つて製造することができる。
〔モノクローナル抗体の作
(a) モノクロナ一ル抗体産 細胞の作製
本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質は、 温 M¾物に対して投与により 抗体産生が 能な にそれ自体あるいは担体、 ^^とともに投与される。 投与に際して 抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバン卜や不完全フロイントアジュバントを 投与してもよい。 投与〖¾1常 2〜6週毎に 1回ずつ、 計 2〜： L OHmg行われる。 用いられ る温 物としては、 例えば、 サル、 ゥサギ、 ィヌ、 モルモット、 マウス、 ラッ卜、 ヒッジ 、 ャギ、 ニヮトリがあげられるが、 マウスおよびラットが好ましく用いられる。
モノクローナル抗体; &細胞の作製に際しては、 で赚された »«j物、 例えばマウ スから抗体価の認められた個体を選択し最終^ ¾の 2〜 5日後に M またはリンパ節を採取 し、 それらに含まれる抗体産生細胞を同種または異 «I物の骨髄腫細胞と融合させることに より、 モノクロ一ナル抗体産^ Aイブリドーマを調製することが きる。 脑清中の抗体価 の測定は、 例えば、 後記の標識化ポリペプチドと δ¾清とを反応させたのち、 抗体に結合し た標議の活性を測 ¾τることにより行なうことができる。 融合操作 の方法、 例えば
、 ケ一ラーとミルスタインの方法 〔ネィチヤ一 （Nature)、 256、 495 (1975)] に従い ることができる。 融合 としては、 例えば、 ポリエチレングリコール （PEG) やセン ダイウィルスなどがあげられるが、 好ましくは P EGが用いられる。
骨髄 JM胞としては、 例えば、 NS— 1、 P3U1、 SP2/0、 AP— 1などの温 ifilSj 物の骨 MM胞があげられるが、 P3U1が好ましく用いられる。 用いられる抗体産 細胞 (iWffll® 数と骨髄腫細胞数との好ましい比率は 1 ： 1〜20： 1程度であり、 PEG ( 好ましくは PEG1000〜PEG6000) 力 10〜80%g¾の で添加され、 20 〜40 、 好ましくは 30〜37でで 1〜10分間インキュベートすることにより効率よく 細 β合を実施できる。
モノク口一ナル抗体産^ /、ィプリドーマのスクリ一ニングには種々の方法が できるが 、 例えば、 ポリペプチド （蛋白質） 觀を直接あるいは担体とともに吸着させた固相 （例、 マイクロプレート） にハイプリドーマ培養上清を添加し、 次に放射性物質や酵素などで した抗 グロブリン抗体 （細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、 抗マウス グロ プリン抗体が用いられる） またはプロティン Aを加え、 固相に^^したモノク口一ナル抗体 を検出する方法、 抗繊グロブリン抗体またはプロテイン Aを吸着させた固相に八イブリド —マ培養上清を添加し、 放射性物質や酵素などで標識したポリペプチドを加え、 固相に したモノク口一ナル抗体を検出する方法などがあげられる。
モノ
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自体^！あるいはそれに準じる方法に従って行なうことが できる。 通常 HAT (ヒポキサンチン、 アミノプテリン、 チミジン） を添加した動物 培地で行なうこと力 ?きる。 および Sffl培地としては、 ノ、イブリドーマが生 きる ものならばどのような培地を用いても良い。 例えば、 1 - 2 0 %, 好ましくは 1 0〜2 0 % の牛胎 清を含む RPM I 1 6 4 0培地、 1〜： L 0 %の牛胎! 清を含む G I T培地（和 «薬工業 （株） ) あるい イブリドーマ培養用無血清培地 (S FM- 1 0 1、 日水製薬 (株） ) などを用いることが きる。 培養 は、 通常 2 0〜4 0 ：、 好ましく〖雄 3 7 である。 培養時間は、 通常 5日〜 3週間、 好ましくは 1週間〜 2週間である。 培養は、 通常 5 %炭酸ガス下で行なうことが きる。 ハイブリド一マ培養上清の抗体価は、 上記の脑清 中の抗体価の測定と同様にして測定できる。
(b) モノクロナ一ル抗体の精製
モノクローナル抗体の分離精製は、 自体 ^0の方法、 例えば、 滅グロブリンの分嶋製 法 〔例、 塩析法、 アルコール 法、 等亀、 法、 電 m¾動法、 イオン交換体 （例、 D E AE) による 法、 趣 去、 ゲルろ過法、 観結合固相あるいはプロテイン Aあるい はプロティン Gなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、 結合を βさせて抗体を得る特 精製法〕 に従って行なうことができる。
〔ポリクローナル抗体の作 ® 本発明のポリクローナル抗体は、 それ自体公知あるいはそれに準じる方法に従って製造す ることができる。 例えば、 ^ (ポリペプチド羅） 自体、 あるいはそれとキャリアー 蛋白質との複合体をつくり、 上記のモノクローナル抗体の 法と同様に 物に爐を 行ない、 該^ ®ι物から本発明のポリペプチドに対する抗体含有物を採取して、 抗体の分離 精製を行なうことにより ® することができる。
物を免疫するために用いられる免 ¾ϋΐ原とキャリア一蛋白質との複合体に関し、 キ ャリァー蛋白質の種類およびキヤリァ一と八プテンとの混合比は、 キヤリァ一に架橋させて 赚したハプテンに対して抗体が ¾1率良くできれば、 どの様なものをどの様な比率で架橋さ せてもよいが、 例えば、 ゥシ血清アルブミンゃゥシサイログロブリン、 へモシァニン等を重 量比で八プテン 1に対し、 約 0. 1〜 2 0、 好ましく 勺;!〜 5の割合で力プルさせる方法 が用いられる。
また、 ハプテンとキャリアーの力プリングには、 種々の縮合剤を用いることができるが、 グルタルアルデヒドやカルポジイミド、 マレイミド活性エステル、 チオール基、 ジチオビリ ジル基を含 る活性エステル試磐が用いられる。
縮合生成物は、 動物に対して、 抗体産生力河能な «にそれ自体あるいは担体、 i 剤とともに投与される。 投与に際して抗体産生能を高めるため、 完全フロイントアジュバン トゃ不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。 投与は、 通常約 2〜6週毎に 1回ず つ、 計約 3〜 1 0回麵亍なわれる。
ポリクロ一ナル抗体は、 上記の方法で された »»J物の血液、 腹水など、 好ましくは 血 ゝら採取することができる。
她清中のポリク口一ナル抗体価の測定は、 上記の抛清中の抗体価の測定と同様にして 測 きる。 ポリクロ一ナル抗体の分離精製は、 上記のモノクローナル抗体の分離精製と同 様の:^グロプリンの分離精製法に従って行なうことができる。
本発明のポリぺプチドまたはその部分べプチドをコ一ドする D N Aまたは本発明のレセプ ター蛋白質またはその部分べプチドをコ一ドする DN Aに相補的な、 または実質的に相補的 な塩基配列を有するアンチセンス DNA (以下、 アンチセンス DNAの説明においては、 こ れらの DNAを本発明の DNAと略記する） としては、 本発明の DNAに相補的な、 または 実質的に相補的な塩基配列を有し、 該 DNAの発現を抑制し得る作用を有するものであれば 、 いずれのアンチセンス DN Aであってもよい。
本発明の DNAに実質的に相補的な塩基配列とは、 例えば、 本発明の DNAに相補的な塩 基配列 （すなわち、 本発明の DNAの相補 ) の全驢配列あるいは部分； ^配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 より好ましく〖銷 9 0 %以上、 最も好ましく〖お勺 9 5 % 以上の相同性を^ tる ^ffi列などがあげられる。 特に、 本発明の DNAの相補鎖の全 ¾S 配列うち、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の N末端部位をコ一ドす る部分の塩 SS2列 （例えば、 開始コドン付近の驢配列など） の相補鎖と約 7 0 %以上、 好 ましく «I勺 8 0 %以上、 より好ましくは钓 9 0 %以上、 最も好ましく ίお勺 9 5 %1¾±の相同 性を有するアンチセンス DN Αが である。 これらのアンチセンス DNAは、 の DN A合成装置などを用いて製造することができる。
以下に、 ①本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル、 またはその 部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそれらの塩 （以下、 本発明の ポリペプチドと略記する がある） 、 ②本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩、 または その部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 （以下、 本発明の レセプ夕一蛋白質と略記する場合がある） 、 ③本発明のポリぺプチドもしくはその部分ぺプ チドまた 発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその部分ペプチドをコードする DNA (以下 、 本発明の DNAと略記する齢がある） 、 本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステル、 またはその部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまた はその塩、 また 発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩またはその部分べプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルに対する抗体 （以下、 本発明の抗体と略記する があ る） 、 およびアンチセンス DN Aの用途を説明する。
( 1 ) 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質が関与する各種疾病の治療 · . 予防剤
本発明のポリぺプチドは本発明のレセプ夕一蛋白質の細胞刺激活性などを有してレゝるので 、 本発明のポリペプチドをコ一ドする DNAに異常があったり、 欠損している場合、 または 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAに異常があったり、 欠損している ^&、 例え ば、 i¾lfilJ±, 自己敏疾患、 全、 白内障、 緑内障、 急 クテリア藤炎， 急性心筋梗 塞， 急倒萃炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸碰症婦， アルコ—リ隱炎， アルッハイマ —病， 喘息， 動脈硬化， アトピー性皮膚炎， バクテリア肺炎， 膀動 Sん 骨折， ？しがん， 過 食症， 多艇， 火傷治癒， 子 部がん， '酶リンパ性白血病， 慢性髓性白血病， m 炎， 肝硬変， がん （結腸 Z直腸がん） ， クローン病， 痴呆， 糖尿病性合併症， 糖尿病性 腎症， 糖尿病性纏隨， 糖尿病'隨膜症， 胃炎， へリコパクター 'ピロリ感赚， 肝不全 ， A¾F炎， BMfff炎， C¾fF炎， 肝炎， 単純へルぺスウィルス感離， 7K麟状赫ウイ ルス感 ¾g， ホジキン病， エイズ感»， ヒトパピ口一マウイリレス感 «, 高カルシウム血 症， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， 感赚， インフルエンザ感赚 , インシュリン依存性糖尿病 （I型） ， MSブドウ状球菌感 ， 悪 黒 feM, がん転移 ， 多発性骨 flffl, アレルギー性鼻炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシュリン 依存性 糖尿病 （II 型） ， 非小細 »がん， H»植， 骨関節炎， 骨軟化症， 少症， 骨 ffl ^症， 卵巣がん， 骨ベーチェット病， 消化性潰瘍， 末梢血管疾患， 前 がん， 逆流性:^！炎， 腎 不全， リウマチ関節炎， 精神分 «， «症， ¾J&症ショック， 重^:身 tt¾菌感 小 細豳市がん， 誦損傷， 胃がん， 全身性エリテマト一サス， ~¾Ι4 ^ώΐ発作， % , 心弁 膜症， 血管性 Z多発梗翻呆， 創傷治癒， 症， 関節炎、 下垂体ホルモン分 全、 繊 、 尿離、 または »¾戯患等の種々の麵が発症する可能性カ缟い。 従って、 本発明 のポリペプチド、 本発明のレセプター蛋白質および本発明の DN Aは、 例えば、 上記の種々 の の治療 ·予防剤などの医薬として^ fflすることができる。
また、本発明のポリぺプチド、本発明のレセプ夕一蛋白質および本発明の D N Aは MACULAR EDEMA CYSTOID 斑浮 M) の^^の治療 .予防剤などの医薬として^ fflすることが さる。
さらに、 本発明のポリペプチド、 本発明のレセプ夕一蛋白質および本発明の DN Aはソマ トス夕チンの分泌制御 （分泌調節ともいう。 以下同じ。 ) に関与しているため、 例えば、 ( l)先端巨大症、 TSH産 4®瘍、 非分泌性 am 下垂体腫瘍、 異所性 ACTH (ァ ドレノコルチコトロピン） 産 瘍、 髄様甲權癌、 V I P産膽瘍、 グルカゴン産^！ 、 ガストリン産生 、 インスリノ一マ、 カルチノイドなどの腫瘍の治療薬、 （2)インス リン依存性または非依存性糖尿病、 あるいはこれら糖尿病に関連した種々の疾患、 すなわち 糖尿病合併症 （例、 糖尿病 ' 膜症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性神経轄、 ドーン症羅、 起 立性低血圧症など） の治療薬、 (3) 高インスリン血症の改善または食欲の抑制などによる 肥満、 過食症などの治 β、 （4)急購炎、 慢 ttl萃炎、 滕臓 ·腸フィステル、 出血髓瘍 、 消化'隨瘍、 胃炎、 胃麵多症、 逆流性:^ I炎などの治麟、 (5) ヘリコバクタ一 ピ ロリ菌感染に伴う様々な症状の改善剤 （例、 ガストリン分泌昂進の抑制剤など） 、 (6) 内 ¾« 5萃管鶴に伴うアミラーゼの分泌抑制剤、 さらに《fi萃 I ^f»の予後治麟、 ( 7)小腸の吸収能低下、 分泌昂進または消化管の運動能異常に起因する下痢 （例、 Shor t bowe 1症候群など） 、 癌化学療法などの薬物に起因する下痢、 先天性小腸萎縮に起 因する下痢、 V I P産 4»などの擺内分泌藤に起因する下痢、 A IDSに起因する下 痢、 骨難植などに伴う対宿主移植片反応に起因する下痢、 糖尿病に起因する下瘌、 m > 経 ¾断に起因する下痢、 全身性硬化症に起因する下痢、 好酸球増加症に起因する下痢など の治 、 (8) ダンピング症^^、 過敏性^炎、 クローン病、 炎症 β疾患などの治療 薬、 （9)鹏または癌 （例、 甲灘癌、 ； «®、 乳癌、 前 癌、 小細 »«、 非小細胞 薩、 m,胃癌、 胆管癌、 肝赚、 膀赚、 卵^ s、 メラノ一マ、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 悪性褐色钿麵、 » ^細謹、 m,胸臓、 腎麵など） 、 白血病 （例、 好^ &白 血球の白血病 ·慢性リンパ性白血病、 慢性骨髄' 白血病、 ホジキン病、 非ホジキン性リンパ 腫など） などの治纏；該治麟は、 戦または他の制翻 （例、 夕モキシフェン、 LHR Hァゴニス卜、 LHRHアン夕ゴニスト、 インターフェロン一ひ、 3およびァ、 インタ一口 ィキン一 2など） と併用して用いることができる、 （10) 肥大性心筋症、 動脈硬化症、 心 弁膜症、 心筋梗塞 （特に、
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、 再血管形成の予防 ·治療 薬、 （11) 食道静脈癌出血、 肝硬変、 末梢血管疾患の治療薬、 （12) 免疫系に作用する 生理活性物質 （例、 サブスタンス P、 夕ヒキニン、 サイト力インなど） の分泌の調節作用に 基づき、 例えば、 全身性または局所性の炎症に伴う疾患 （例、 多発'隨脈炎、 リュウマ 5¾ 関節炎、 乾せん、 日焼け、 湿疹、 アレルギー （例、 喘息、 アトピー做膚炎、 アレルギ H4 鼻炎など） など） の治纏、 （1 3) 神経調節因子の産生.分泌に影響を及ぼすことから、 例えば、 痴呆症 （例、 アルツハイマー病、 アルツハイマー型老年期痴呆、 血管性'多発性痴 呆など） 、 精神分 、 てんかん、 うつ病、 ~«不安轄、 睡眠轄、 多発性硬化症などの 治麟、 （1 4) 0g^¾ (例、 緑内障など） などの治纏、 ( 1 5) 急 ttAクテリア體炎 、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸■症鍵、 ノ^テリア肺炎、 離全身性真菌感難、 繊 、 ■損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコーリ 炎、 A靈炎、 B 炎、 C藤炎、 A I D S感離、 ヒトパピ口一マウイリレス感離、 インフルエンザ感 、 癌転移、 多発性骨 MM, 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨ベーチェット症、 腎炎、 腎不全、 症、 症ショッ ク、 高カルシウム血症、 高コレステロール血症、 高グリセリド血症、 高脂血症、 全身性エリ テマトーサス、 一過 ttli l発作、 アルコ一レ 炎などの予防'治療薬として有用であり 、 （1 6) Ιβ^植、 火傷、 創傷、 脱毛症などの治癒などにも用いられ、 ( 1 7) 纖ある いは急髓痛 （例、 m , 炎症髓痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ、 骨難 症など） ) にともなう疼痛） の抑制 ·織口など、 @Mとしても有用である。
本発明の D N Aは、 例えば、 生体内において本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ 夕一蛋白質が減少あるいは欠損している患者がいる に、 （ィ） 本発明の DNAを蔽¾者 に投与し、 生体内で本発明のポリぺプチドまた 発明のレセプター蛋白質を発現させるこ とによって、 （口） 細胞に本発明の DN Aを挿入し、 本発明のポリペプチドまた〖鉢発明の レセプタ一蛋白質を発現させた後に、 麵胞を患者に移 ることによって、 または （八） 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質を該患者に投与することなどによつ て、 該患者における本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の役割を十分に 、 あるいは正常に発揮させることができる。
本発明の DNAを上記の治療 ·予防剤として使用する場合は、 該 DN Aを単独あるいはレ トロウィルスベクター、 アデノウイルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテッドウィル スベクターなどの適当なベクタ一に挿入した後、 常套手段に従って、 ヒトまたは a®]物に 投与すること力 きる。 本発明の DN Aは、 そのままで、 あるいは摂取促進のための補助剤 などの生理物に認められる担体とともに辦 J化し、 遺 β«ゃ八ィドロゲルカテーテルの ような力テ一テルによつて投与できる。
本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質を上記の治療 ·予防剤として使用 する^は、 少なくとも 9 0 %、 好ましくは 9 5 %以上、 より好ましくは 9 8 %以上、 さら に好ましくは 9 9 %以上に精製されたものを翻するのが好ましい。
本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質は、 例えば、 必要に応じて糖衣を 施した翻、 力プセリ 、 エリキシ^^ マイクロカプセ^^ jなどとして経口的に、 あるい fc もしくはそ の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 また などの 剤の形で非経口的に TOできる。 例えば、 本発明のポリペプチドまた〖鉢発明のレセプ夕一 蛋白質を生理^ wに認められる担体、 u 賦形剤、 べヒクル、 防 ra、 安 、 ^剤 などとともに ~¾に認められた讓雄に要求される単棚 g¾態で鋼することによって することができる。 これら翻における補成分量は された範囲の適当な容量が得 られるようにするものである。
義、 カブセリ! /^などに混和することが" きる添加剤としては、 例えば、 ゼラチン、 コー ンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのような結合剤、 吉晶性セルロースのような賦形剤 、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸マグネシウム のような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘 *¾、ペパーミント、 ァカモノ 油またはチェリ一のような香糊などが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである齢に は、 嫌己タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含^ ることが きる。 龍のため の無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰子油などのような天然 産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができ る。
酣用の水性液としては、 例えば、 生理:^ κ、 ブドウ その他の補助薬を含む等張液 (例えば、 D—ソルビトール、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などがあげられ、 適当な溶編助剤、 例えば、 アルコール （例えば、 エタノールなど） 、 ポリアルコール （例 えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコールなど） 、 非イオン性界面活'隨 （例 えば、 ポリソルべ一ト 8 0 ™、 HC〇一 5 0など） などと併用してもよい。 油性液としては 、 例えば、 ゴマ油、 短油などがあげられ 溶鍾助剤として安息香酸ベンジル、 ベンジル アルコールなどと併用してもよい。 また、 緩翻 （例えば、 リン酸疆衝液、 酢酸ナトリウ ム緩衝液など） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 麵プロカインなど） 、 安定 剤 （例えば、 ヒト血清アルブミン、 ポリエチレングリコールなど） 、 (例えば、 ベン ジルアルコール、 フヱノールなど） 、 酸化防 などと配合してもよい。 調製された aim は、 通常、 適当なアンプルに充填される。
本発明の DNAが挿入されたべクタ一も上記と同様に製剤ィヒされ 通常、 非経口的に使用 される。
このようにして得られる■は、 安全で «性であるので、 例えば、 ヒトまたは afiL»j物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ 、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することができる。
本発明のポリペプチドまた〖鉢発明のレセプ夕一蛋白質の投与量は、 纖疾患、 投与舰 、 投与ルートなどにより差異はあるが、 例えば、 « ^患の治療目的で本発明のポリべプチ ドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質を経口投与する場合、 一般的に成人 （6 0 k gとして） においては、一日につき該ポリペプチドまたは蛋白質を約 0. l mg〜l 0 0mg、好ましく . 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 0mg投与する。 非経口的に投与する は、 該ポリペプチドまたは蛋白質の 1回投与量は投与雕、 纖疾患などによっても異 なるが、 例えば、 撫疾患の治療目的で本発明のポリペプチドまた〖鉢発明のレセプ夕一蛋 白質を ¾l剤の形で成人 （体重 6 0 k gとして） に投与する^ &、 一日につき該ポリべプチ ド等を約 0. 0 1〜3 0mg程度、 好ましくは約 0. l〜2 0mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omg程度を患部に注射することにより投与するのが好都合である。 他の動物の ¾ ^も、 6 O k g当たりに騰した量を投与することができる。
(2 ) 館に対する医薬 «化合物のスクリーニング
本発明のポリぺプチドまた〖ま本発明のレセプ夕一蛋白質に対する細胞刺激活性などを有す るため、 本発明のポリペプチドまた 発明のレセプ夕一蛋白質の機能 （例、 細麟 性 など） を腿または阻針る化合物またはその塩 （本発明のポリペプチドと本発明のレセプ 夕一蛋白質との結合性を変化させる化合物またはその塩ともいう。 以下同じ。 ) は、 例えば 、 高雄、 自己髓疾患、 全、 白内障、 緑内障、 急 Ι4 'クテリア體炎， 急性心筋梗塞 ， 急 ffii萃炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸碰症鍵， アルコール l±fF炎， アルツハイマー 病， 喘息， 動脈硬化， アトピ一'敝膚炎， ノ クテリア肺炎， 膀 fi¾0 u， 骨折， 乳がん， 過食 症， 多食症， 火傷治癒， 子 部がん， 慢性リンパ性白血病， 慢性骨髄性白血病， 慢體炎 , 肝硬変' がん （結腸/直腸がん） ， ク! 3—ン病， 痴呆， 糖尿病性合併症， 糖尿病性腎 症， 糖尿病性擁轄， 糖尿病 '園膜症， 胃炎， へリコパク夕一.ピロリ感赚， 肝不全， ASfff炎， B fF炎， CSffF炎， 肝炎， 単純へルぺスウィルス感», 水^^状' ·ウィル ス感染症， ホジキン病， エイズ'感染症， ヒトパピローマウィルス感 高カルシウム血症
， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， , インフルエンザ感染症， インシュリン依存性糖尿病 （I型） ， ブドウ状球菌^^， m m, がん転移， 多発性骨髄腫， アレルギー '14^炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシュリン非依存性糖 尿病 （II型） ， 非小細胞肺がん， 臓 植， 骨関節炎， 骨軟化症， 骨減少症， 骨粗鬆症， 卵 巣がん 骨ベーチェット病， 消化 '«瘍， 末梢血管疾患， 前 がん， 逆流 炎， 腎不 全， リウマチ関節炎， 精神^ «， 馳症， 脑症ショック， 重症全身髓菌感雖， 小細 膽がん， 麵損傷， 胃がん 全身性エリテマト—サス， - 't i m, 心弁膜 症， 血管 ¾ /多発梗«呆， 倉鴨治癒， 不眠症， 関節炎、 下垂体ホルモン分泌不全、 尿毒症、 または 1¾1¾成疾患、等の疾病の治療 .予防剤などの医薬として使用できる。
また、 本発明のポリペプチドまた tt*発明のレセプ夕一蛋白質の機能 （例、 細麟 «艇性 など） を鍵または阻 る化合物またはその塩 （好ましくは、 本発明のポリペプチドまた 【鉢発明のレセプ夕一蛋白質の機能 （例、 細辦撤活性など） を阻針る化合物またはその は MACULAR EDEMA CYST0ID (菌觀斑浮 J ) の舗の治療'予防剤などの医薬として 翻することができる。
さらに、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質はソマトス夕チンの分泌 制御に関与しているため、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の機能 ( 例、 細麟！ I激活性など） を腿または阻 ¾Tる化合物またはその塩は、 例えば、 （1 ) 先端 巨大症、 T SH産 «瘍、 非分泌性 （ ^能 下垂体 β、 異所性 ACTH (ァドレノコ ルチコトロピン） 産 4«、 髄様甲赚癌、 V I
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グルカゴン産通瘍、 ガスト リン産 4J»、 インスリノーマ、 カルチノイドなどの腫瘍の治纏、 (2) インスリン依存 性または非依存性糖尿病、 あるいはこれら糖尿病に関連した種々の疾患、 すなわち糖尿病合 搬 （例、 糖尿病隨膜症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性撫轄、 ドーン症■ 性馳 圧症など） の治療薬、 ( 3) 高インスリン血症の改善または食欲の抑制などによる肥満、 過 食症などの治纏、 （4) 急 ffii萃炎、 慢 ttl萃炎、 塍臓.腸フィステル、 出血性潰瘍、 消化性 潰瘍、 胃炎、 胃 ^^症、 逆流性:^！炎などの治麟、 ( 5) へリコパク夕一 ·ピロリ菌感 染に伴う様々な症状の改善剤 （例、 ガストリン分泌昂進の抑制剤など） 、 (6) mmM 勝管 it ^に伴うアミラーゼの分泌抑制剤、 さらに《I萃 禾 の予後治藤、 (7 ) 小腸 の吸収能低下、 分泌昂進または消 の »t異常に起因する下痢 （例、 S h o r t b o we 1症^^など） 、 癌化学療法などの麵に起因する下痢、 性小^ Sに起因する下 痢、 V I P産 4βなどの難内分泌鹏に起因する下痢、 A I D Sに起因する下痢、 骨髄 移植などに伴う対宿主移植片反応に起因する下痢、 糖尿病に起因する下痢、 m
に起因する下痢、 全身性硬化症に起因する下痢、 好酸球増加症に起因する下痢などの治療薬
、 ( 8) ダンピング症候群、 過敏' 炎、 クローン病、 炎症性腸疾患などの治 、 ( 9
) 鹏または癌 （例、 甲霍癌、 ^ , 乳癌、 前 癌、 小細 ws、 非小細 w¾、 塍 m 胃癌、 胆管癌、 肝薩、 膀胱癌、 卵巣癌、 メラノ一マ、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 悪性褐色 細醒、 # ^細麵、 mm , 胸應、 腎隨など） 、 白血病 （例、 好驢性白血球の白 血病'慢性リンパ性白血病、 搬骨髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン リンパ腫など） などの治麟；該治鶴は、 戦または他の制翻 （例、 夕モキシフェン、 LHRHァゴニ スト、 LHRHアンタゴニスト、 インターフェロン一ひ、 3およびァ、 インタ一ロイキン一 2など） と併用して用いることが、できる、 （1 0 ) 肥大性心筋症、 動脈硬化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 ¾¾ϋ¾Κ»謹後の心解梗塞） 、 再血管形成の予防 ·治療薬、 ( 1 1 ) ： ft i静脈癌出血、 肝 «、 末梢血管疾患の治麟、 ( 1 2) 系に作用する生理活性 物質 （例、 サブスタンス？、 夕ヒキニン、 サイト力インなど） の分泌の調節作用に基づき、 例えば、 全身性または局所性の炎症に伴う疾患 （例、 多発'隨脈炎、 リュウマチ性関節炎、 乾せん、 日焼け、 赚、 アレルギー （例、 喘息、 アトピー'敝膚炎、 アレルギー性鼻炎など ) など） の治麟、 ( 1 3) 擺調節因子の産生 ·分泌に影響を及ぼすことから、 例えば、 痴呆症 （例、 アルツハイマー病、 アルッハイマ一型老棚痴呆、 血管性'多発 呆など）
、 wj &, てんかん、 うつ病、 - ^m , 睡眠 iw、 多発'性硬化症などの治^ m、
( 1 4) B嫉患 （例、 緑内障など） などの治麟、 ( 1 5 ) 急 クテリア醒炎、 急性ゥ ィルス脳炎、 成人呼吸碰症難、 バクテリア肺炎、 重症全身性真菌 «^、 , 麵損 傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコール隨炎、 炎、 B薩炎、 C藤炎、 A I D S感 »、 ヒトパピ口一マウィルス感赚、 インフルエンザ感離、 癌転移、 多発性骨醒、 骨 軟化症、 骨粗しょう症、 骨ベーチェット症、 腎炎、 腎不全、 ¾0fil症、 敗血症ショック、 高力 ルシゥム血症、 高コレステロール血症、 高グリセリド血症、 高脂血症、 全身性エリテマト一 サス、 HittKlfil発作、 アルコ 炎などの予防 ·治棘とし T^r用であり、 （1 6 ) mm^ , 火傷、 創傷、 脱毛症などの治癒などにも用いられ （ι 7 ) 慢性あるいは急性 (例、 術辦痛、 炎症艇痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ、 骨 症など） にともなう疼痛） の抑制，緩和など、 としても有用である。
従つて、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプタ一蛋白質は、 本発明のポリぺプチ ドまたは本発明のレセプター蛋白質の機能を促進または阻害する化合物またはその塩のスク リ一ニングのための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その 部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを と する本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部 分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能 （例えば、 細麟! 1 艇性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を鍵する化合物もしくはその塩 （以下、 碰剤と略記する がある） 、 また〖林発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の機能を阻 る化合物 （以下、 阻害剤と略記する場合がある） のスクリ一ニン グ方法を提供し、 また、
( 2 ) 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのァミ ドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを とする本発明のレセプ夕一蛋白質 もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはそ の塩の機能 （例えば、 細赫！!麵性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を碰する化 合物もしくはその塩 （以下、 鍵剤と略記する がある） 、 また〖鉢発明のレセプ夕ー蛋 白質もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステゾレまた はその塩の機能を阻 ¾Tる化合物 （以下、 阻豁 jと略記する齢がある） のスクリーニング 方法を提供し、 より具体的には、 例えば、
( 3 ) 本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その 部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩および本発明のレセプ 夕一蛋白質もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステ ルまたはその塩 （具体的には、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくは そのアミドもしくはそのエステルまたはその^) を用いることを特徴とする本発明のポリべ プチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしくは そのアミドもしくはそのエステリレまたはその塩、 または本発明のレセプター蛋白質もしくは その塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩の機 能 （例えば、 細献 I撤活性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を碰する化合物もし くはその塩 （以下、 と略記する齢がある） 、 また〖鉢発明のポリペプチドもしくは その了ミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしくはそのァミドもし くはそのエステルまたはその塩、 または本発明のレセプター蛋白質もしくはその塩またはそ の部分ペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能 （例えば、 細 激活性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を阻 る化合物 （以下、 阻害剤と略 記する場合がある） のスクリーニング方法を提供し、
(3) (i) 本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に本発明のレセプ 夕一蛋白質もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩 （具体的には、 配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と同一もしく〖 質 的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくは そのァミドもしくはそのエステルまたはその を させた と、 （i i) 本発明のポリ ぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしく はそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に本発明のレセプ夕一蛋白質もしくはその 塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩 (m ) には、 配列番号： 3 7で表されるアミノ薩列と同一もしくは実質的に同一のアミノ^ @Ξ列 を含 # る蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのアミドもしくはその エステルまたはその および搬化合物を機させた齢における、 本発明のポリべプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩の活性を測定し、 比 ¾τることを體とする本発 明のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または本発明のレセプ夕一蛋白 質もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたは その塩の機能 （例えば、 細麟！!麵性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を鍵する 化合物もしくはその塩 （以下、 纏剤と略記する場合がある） 、 また〖鉢発明のポリべプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分べプチドもしくはその アミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または本発明のレセプター蛋白質もしくはその 塩またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩の機能 ( 例えば、 細麟纖活性またはソマトス夕チン分泌調節活性など） を阻 fる化合物 （以下、 阻翻と略記する^ &がある） のスクリーニング方法などを提供する。 具体的には、 上記スクリーニング方法においては、 例えば、 (i) と （ii) の におけ る、 本発明のポリぺプチドおよび試験化合物の細«臌活性また 発明のポリぺプチドぉ よび試験化合物の本発明のレセプ夕一蛋白質に対する結^ *などを測定して、 比 ¾Tること を特徴とするものである。
本発明のポリペプチドの細 性などは、 自体 ^0の方法、例えば、 Dockray, G. J. et al. , Nature , 305, 328-330, 1983, Fukosumi, S. , et al. , Biochem. Biop ys. Res. Commun. , 232, 157-163, 1997, Hinuma, S. , et al. , ature, 393, 272-276, 1998， Tatemoto, K. , et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. , 251, 471-476, 1998.などに記載の方法あるいはそれに準じる方法などに従って測 ¾Tることができる。 本発明のポリぺプチドおよび 化合物の本発明のレセプ夕一蛋白質に対する ま、 後述の 「本発明のレセプター蛋白質に対するリガンド （ァゴ二スト） の決定」 に記載した方 法に準じて測 ¾Tることが きる。
画匕合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵^ ¾物、 細隱出液、 植雖出液、 動物繊抽出液などがあげられ、 これら化合物 ί謝 規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
上記のスクリーニング方法を実施するには、 本発明のポリペプチドを、 スクリーニングに 適したバッファ一に懸濁することにより本発明のポリぺプチドの標品を調製する。 バッファ 一には、 ρΗ約 4〜： 10 ( ましくは、 ρΗ約 6〜8) のリン ¾ 'ッファ一、 トリス一; Μ バッファーなどの、 本発明のポリぺプチドと本発明のレセプター蛋白質との反応を阻害しな いバッファ一であればいずれでもよい。
例えば、 上記 (ii) の における細赚 !J激活性などが上記 (i) の場合に比べて、 約 2 0 好ましくは 30 %以上、 より好ましく〖¾勺 50 %以±±昇させる試験化合物を本 発明のポリペプチドの細麟！!激活性などを is る化合物として、 一方、 上記 (ϋ)の場合 における細胞刺激活性などが上記 (i) の場合に比べて、 約 20%以上、 好ましくは 30% 以上、 より好ましくは約 50 %以上阻害する 化合物を本発明のポリぺプチドの細 «IJ激 活性などを阻針る化合物として選択することができる。 また、 これらの試験を行う前に、 後述の 「本発明のレセプター蛋白質に対するリガンド （ ァゴニスト） の決定」 に記載した の方法またはそれに準じた方法により試験を行い、 化合物が本発明のレセプター蛋白質に^することを確認することが好ましい。
さらに、 上記の纖化合物が本発明のポリぺプチドの活性を碰または阻針る化合物ま たはその塩であることを判断する一つの指標としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質と本発明 のポリペプチドまたはその部分ペプチドの s ^との齢を阻 る活性があげられる。 例 えば Hosoy^ M. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 194 (1) , 133-143, 1993に記載 されているような結合識系において、 1 X 10— 2M以下の難で標 ¾の結合を 10%以上阻 *Tる識化合物〖鉢発明のポリペプチドの活性を碰または阻^ Tる化合物またはその塩 である可能性が いと考えられる。 但し、 阻害活性は標 »の!^をもとに測定した相 対的な値であるため、 上記の試験化合物が本発明のポリぺプチドの活性を促進または阻害す る化合物またはその塩であることを判断する上で必須で〖おない。
本発明のスクリ一ニング用キットは、 本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩、 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたは その塩を含有するものである。 本発明のスクリ一ニング用キットは本発明のポリぺプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その部分ペプチドもしくはそのアミ ドもしくはそのエステルまたはその塩の受容体、 即ち、 本発明のレセプ夕一蛋白質もしくは その塩またはその部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩 （具 には、 配列番号： 3 7で表されるァミノ 列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含有する蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのァミドもしくは そのエステルまたはその をさらに含 るものが好ましい。
本発明のスクリーニング用キッ卜の例としては、 次のもの力 げられる。
1 . スクリーニング用!^
ΦΜ啶用緩衝液およ 先浄用緩衝液
Hanks' Balanced Sal t Solut i on (ギブコ¾¾) に、 0. 0 5 %のゥシ血清アルブミン （シ グマ を力!]えたもの。 孔径 0.45 mのフィルタ一で ¾i滅菌し、 4 で保^ fる力 あるいは用 «製しても 良い。
②レセプ夕ー標品
本発明のレセプ夕一蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5X105個/ 穴で継代し、 37で、 5%C〇2、 95%a i rで 2日 f 培養したもの。
@^識リガンド
市販の 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで議した本発明のポリペプチドも しくはそのアミドもしくはそのエステル、 またはその部分ぺプチドもしくはそのアミドもし くはそのエステリレの水溶液の状態のものを 4nCあるいは一 20 にて保存し、 用時に測定用 緩衝液にて 1 UL Mに希釈する。
④リガンド標準液
本発明のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル、 またはその部分べプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルを 0 · 1 %ゥシ血清アルブミン（シグマ■を 含む PBSで ImMとなるように溶解し、 —20でで保^ Tる。
2. 測定法
① 12穴 翻プレートにて培養した本発明のレセプ夕一蛋白質発現 CH〇細胞を、 測 定用緩衝液 1 m Iで 2回洗浄した後、 490 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
② 10一3〜 10—10Mの試験化合物溶液を 5 a 1加えた後、 標識リガンドを 5 ;ί 1加え、 室 温にて 1時間反応させる。 異的結合量を知るためには試験化合物の代わりに 10— 3Μの リガンドを 5 1加えておく。
③反赚を瞧し、 1mlの洗浄用緩衝 ¾ 3回洗浄する。 細胞に齢した標識リガンドを 0.2Ν NaOH—l%SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 Α (和光純薬 と 混合する。
(^体シンチレ一シヨンカウン夕一（ベックマン を用いて放射括性を測定し、 Percent Maximum Binding (PMB) を次の式 〔数 1〕 で求める。
〔数 1〕 PMB= [ (B-NSB) / (B。一 NSB) ] X 100
PMB： Percent Maximum Binding
B ：検体を加えた時の値
NSB： Non-specific Binding ( 異的結^ S) 本発明のスクリ一ニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られる化合物また はその塩は、 上記した識化合物、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合 成化合物、 発酵 物、 細胞抽出液、 植 l¾出液、 動物雄抽出液、 βなどから選ばれた 化合物であり、 本発明のポリペプチドの機能 （例、 細麟離性またはソマトス夕チン分泌 調節活性など） を碰または阻針る化合物である。
該化合物の塩としては、 嫌 Sした本発明のポリぺプチドの塩と同様のものが用いられる。 本発明のスクリーニング方法またはスクリ一ニング用キットを用いて得られる化合物を上 述の治療'予防剤として ^する齢、 常套手段に従って ることが きる。 例えば、 嫌己した本発明のポリペプチドを含 る医薬と同様にして、 翻、 力プセ 、 エリキシ マイクロ力プセリ 、 無菌性溶液、 β薩などとすることができる。
このようにして得られる讓は で «性であるので、 例えば、 ヒトまたは ¾動物 ( 例えば、 マウス、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） に対して投与することが きる。
該化合物またはその塩の投与量は、 その作用、 媳疾患、 投与対象、 投与ルートなどによ り差異はあるが、 例えば、 本発明のポリペプチドの機能を鍵する化合物を経口投与する場 合、 ^^的に成人（体重 6 Okgとして） においては、 一日につき該化合物を約 0.1〜： L0 0mg、 好ましく《勺 1. 0〜50mg、 より好ましく 勺 1. 0~20mg投与する。 非 経口的に投与する齢は、 該化合物の 1回投与量は投与贿、 雕疾患などによっても異な るが、 例えば、 本発明のポリペプチドの機能を謹する化合物を膝剤の形で通常成人 (6 0 kgとして） に投与する^、 一日につき該化合物を約 0. 01~30mg@S、 好まし く «勺 0. l〜20mgg¾、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg@ ^を静脈龍により投 与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに換算した量を投与すること 力 さる。
一方、 本発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物を経口投与する場合、 一般的に成人 (体重 6 0 k gとして）においては、一日につき該化合物を約 0. ：!〜 1 0 0mg、好ましく 【お勺 1. 0〜5 0mg、 より好ましくは約 1. 0〜2 Omg投与する。 非経口的に投与する は、 該化合物の 1回投与量は投与舰、 通疾患などによっても異なるが、 例えば、 本 発明のポリペプチドの機能を阻害する化合物を注射剤の形で通常成人 （6 0 k gとして） に 投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜3 Omg程度、 好ましくは約 0. 1〜2 0 m gii¾、 より好ましくは約 0. 1〜： 1 0 m g を静脈注射により投与するのが好都合 である。 他の動物の^も、 6 O k g当たりに娜した量を投与することができる。
(3) 本発明のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 その 部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 および本発明のレセ プ夕一蛋白質もしくはその塩またはその部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テルまたはその塩の定量
本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質に対する抗体 （以下、 本発明の抗 体と略記する^ 8rがある） は、 本発明のポリペプチドまた 発明のレセプ夕一蛋白質を特 異的に認識することができるので、 被検波中の本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ 夕一蛋白質の定量、 特にサンドィツチ 測定法による定量などに使用することが、できる。 r¾わち、 本発明は、
( i ) 本発明の抗体と、 «液およ «識化された本発明のポリペプチドまた 発明のレ セプ夕一蛋白質とを競合的に反応させ、 |¾¾体に結合した 識化された本発明のポリべプチ ドまた 発明のレセプター蛋白質の割合を測 ることを «とする被検波中の本発明の ポリぺプチドまた (ま本発明のレセプター蛋白質の定量法、 および
(i i) 被検波と担体上に不溶化した本発明の抗体おょ 識化された本発明の別の抗体とを 同時あるいは ¾ή勺に反応させたのち、 不溶化担体上の標諳 の活性を測定することを特徴 とする被検波中の本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の定量法を提供す る。
上記 (i i) の定量法においては、 一方の抗体が本発明のポリペプチドまたは本発明のレセ プター蛋白質の N端部を認識する抗体で、 他方の抗体が本発明のポリぺプチドまた ίま本発明 のレセプ夕—蛋白質の C端部に反 る抗体であること力壁ましい。 また、 本発明のポリペプチドまた【鉢発明のレセプター蛋白質に対するモノクロ一ナル抗 体を用いて本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の定量を行うことが き るほか、 色等による検出を行なうこともできる。 これらの目的には、 抗体^ ^のも のを用いてもよく、 また、 抗体肝の F ( a b' ) 2、 F a b'、 あるいは F a b画分を用いて ちょい。
本発明の抗体を用いる本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の定量法は 、 特に制限されるべきものではなく、 纖 ij鎌中の ί¾Ι量（例えば、 ポリペプチド *) に対 応した抗体、 舰もしく〖¾¾体— ί¾Ε複合体の量を化学的または物理的手段により検出し、 これを既知量の抗原を含む標準液を用いて した標準曲線より算出する測定法であれば、 いずれの測定法を用いてもよい。 例えば、 ネフロメトリ一、 競合法、 ィムノメトリック法お よびサンドイッチ法が に用いられるが、 感度、 特異性の点で、 るサンドイッチ法 を用いるのが特に好ましい。
標識物質を用いる測定法に用いられる としては、 例えば、 放射性同^ ΰ素、 酵素、 蛍光物質、 ¾¾¾質などが用いられる。 放射性同^ ΰ素としては、 例えば、 〔125 I〕 、 C131 I〕 、 ^H) , 〔" C〕 などが用いられる。 上記酵素としては、 安 ¾ 比活性の大きなもの が好ましく、 例えば、 ]3—ガラクトシダーゼ、 /3—ダルコシダーゼ、 アルカリフォスファタ —ゼ、 パーォキシダ一ゼ、 リンコ W?J<素酵素などが用いられる。 蛍 «I質としては、 例え ば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 物質と しては、 例えば、 ルミノール、 ルミノール誘導体、 リレシフェリン、 ルシゲニンなどが用いら れる。 さらに、 抗体あるいは とϋ ^との結合にピオチン一アビジン系を用いることも できる。
抗原あるいは抗体の不溶化に当っては、 物理吸着を用いてもよく、 また通常ポリペプチド あるいは酵素等を不溶化、 固定化するのに用いられる化学結合を用いる方法でもよい。 担体 としては、 ァガロース、 デキストラン、 セルロースなどの不溶性多糖類、 ポリスチレン、 ポ リアクリルアミド、 シリコン等の合細旨、 あるいはガラス等があげられる。
サンドィツチ法においては不溶化した本発明のモノク口一ナル抗体に繊液を反応させ （ 1次反応） 、 さらに標識化した別の本発明のモノクローナル抗体を反応させ （2次反応） た のち、 不溶化担体上の標識剤の活性を測定することにより被検波中の本発明のポリぺプチド 量または本発明のレセプ夕一蛋白質量を定量することが、できる。 1次反応と 2次反応は逆の mこ行っても、 また、 同時に行なってもよいし時間をずらして行なってもよい。 漏化剤 およ t 溶化の方法は廳己のそれらに準じることができる。 また、 サンドイッチ法による免 疫測定法において、 固相用抗体あるいは標翻抗体に用いられる抗体は必ずしも 1種類であ る はなぐ 測越度を向上させる等の目的で 2種類以上の抗体の混合物を用いてもよい 本発明のサンドィッチ法による本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の 測定法においては、 1 応と 2次反応に用いられる本発明のモノクローナル抗体は、 本発 明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の結合する部位が相異なる抗体が好まし く用いられる。 T¾わち、 1次反応および 2次反応に用いられる抗体は、 例えば、 2 応 で用いられる抗体が、 本発明のポリべプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の C端部を認 る齢、 1 応で用いられる抗体は、 好ましくは C端部 、 例えば N端部を認識す る抗体が用いられる。
本発明のモノクローナル抗体をサンドイッチ法 の測定システム、 例えば、 競合法、 ィ ムノメトリツク法あるいはネフロメトリ一などに用いることが きる。
競合法では、 被検波中の S¾gと標識 i¾gとを抗体に対して競合的に反応させたのち、 未反 応の 1T識 源 (F) と、 抗体と!^した標識お源 (Β) とを分離し （B/F分 ® 、 B， Fい ずれかの標識量を測定し、 被検液中の坊原量を定量する。 本反応法には、 抗体として可溶性 抗体を用い、 B/F分離をポリエチレングリコール、 嫌 体に対する第 2抗体などを用い る液相法、 および、 第 1抗体として固相化抗体を用いるか、 あるいは、 第 1抗体は可溶性の ものを用 第 2抗体として固相ィ a¾体を用いる固相化法とカ佣いられる。
ィムノメトリック法では、 被検波中の K と固相化 ¾ とを一定量の標識化抗体に対して 競合反応させた後固相と液相を分 るか、 あるいは、 被検波中の聽と翻量の標識ィ!^ 体とを反応させ、 次に固相化*¾ を加え未反応の標識化抗体を固相に させたのち、 固相 と液相を分 ¾Τる。 次に、 いずれかの相の標 を測定し被検液中の觸量を定量する。 また、 ネフロメトリ一では、 ゲル内あるいは離中で観抗体反応の結果生じた不溶性の 沈降物の量を測 ¾τる。 被検波中の腿量が働、であり、 少量の沈降物し力得られない齢 にもレーザ一の散乱を利用するレーザ一ネフロメトリーなどが に用いられる。
これら個々の赚学的測定法を本発明の定 法に翻するにあたっては、 特別の条件、 操作等の設定は必要とされない。 それぞれの方法における通常の条件、 操作法に当業者の通 常の擴的随を加えて本発明のポリペプチドの測定系を構築すればよい。 これらの な赚手段の詳細については、 総説、 纏などを参照することができる。
例えば、 入江 「ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 咖 4 9年発行） 、 入江 - M 「続ラジオィムノアツセィ〕 （講談社、 昭和 5 4年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素免疫測定法 」 （医学書院、 昭和 5 3年発行） 、 石川栄治ら編 「酵素髓測定法」 （第 (医 院 、 昭和 5 7年発行） 、 石川難ら編 「酵素滅測定法」 （第 3 ¾) (医 院、 昭和 6 2年 発行）、 rMethods in ENZYMOLOGYj Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Part A)) , 同書 Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Part B))、 同書 Vol. 74 (Immunochemical Techniques (Part 0)、 同書 Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Part D:Selected Immunoassays)) , 同書 Vol. 92 (Immunochemical Techniques (Part E: Monoclonal Ant ibodies and General Immunoassay Methods)) , 同書 Vol. 121 (Immunochemical Techniques (Part I :Hybridoma Technology and Monoclonal Ant ibodies)) (以上、 アカデミックプレス社発行)などを参照す ることができる。
以上のようにして、 本発明の抗体を用いることによって、 本発明のポリペプチドまたは本 発明のレセプ夕一蛋白質を感度良く定量することができる。
さらには、 本発明の抗体を用いて本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質 の濃度を定量することによつて、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の の減少または増加力 ¾出された場合、 例えば、 高血圧、 自己免疫疾患、 、不全、 白内障
、 緑内障、 急 'Ι4 'クテリア醒炎， 急性心筋梗塞， 急 ffil萃炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸 碰症漏， アルコール 炎， アルツハイマー病， 喘息， 動脈硬化， アトピー'敝膚炎， ノ クテリア肺炎， 膀 ん， 骨折， 乳がん， 過餘， 多食症， 火傷治癒， 子宮頸部がん， 慢 性リンパ性白血病， 慢性骨髄性白血病， 慢性勝炎， 肝硬変， 大腸がん （結腸 Z直腸がん） ， クローン病， 痴呆， 糖尿病性合併症， 糖尿病性腎症， 糖尿病性纏轄， 糖尿病翻膜症， 胃炎， ヘリコパ、クタ一 ·ピロリ感 ， 肝不全， 炎， BSffF炎， C^ffF炎， 肝炎， 単 純へルぺスウィルス感艇， 7K鎌状赫ウィルス感¾¾ ホジキン病， エイズ感躯， ヒ 卜パピ口一マウィルス感染症， 高カルシウム血症， 高コレステロール血症， 高グリセリド血 症， 高脂血症， ^, インフルエンザ感嫉， インシュリン依存 14糖尿病 （I ) , 麵 性ブドウ状球菌感無， 悪 黒舰 がん転移， 多発性骨灘， アレルギー性鼻炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシュリン μ依存性糖尿病 （Π型） ， 非小細 がん， m^ ， 骨関節炎， 骨軟化症' 髓少症， 骨繊症， 卵巣がん， 骨ベーチェット病， i m, 末梢血管疾患， 前 がん， 逆流性錢炎， 腎不全， リウマチ関節炎， w^m , a . ， 症ショック， 重症全身性真菌感 小細 «がん， 損傷， 胃が、ん， 全身性エリ テマトーサス， H 籠 «発作， 繊' 心弁膜症， 血管 多発梗塞痴呆， 創傷治癒， 不 B民症， 関節炎、 下 ホルモン分泌不全、 m , 尿 «、 または 患等の であ る、 または将 患する可能性が いと餘浙することができる。
また、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の濃度の減少または増加が 検出された:^、 MACULAR EDEMA CYSTOID 斑浮 ffi) 等の舗である、 または; I *罹 患する可能性が¾いと診断すること力できる。
さらに、 本発明のポリペプチド、 本発明のレセプ夕一蛋白質および本発明の DN Aはソマ トス夕チンの分泌制御に関与しているため、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕 —蛋白質の難の減少または増加が検出された場合、 例えば、 ( 1 ) 巨大症、 T S H産 4ffi¾、 非分泌性 (im 下垂体 «、 異所'! 4ACTH (アドレノコルチコトロピン） 産 4J®»、 髄様甲鶴癌、 V I P¾4», グルカゴン産^ «、 ガストリン産 4»、 ィ ンスリノーマ、 カルチノィド、 （ 2 ) インスリン依存性または非依存性糖尿病、 あるいはこ れら糖尿病に関連した種々の疾患、 すなわち糖尿病合併症 （例、 糖尿病側膜症、 糖尿病性 腎症、 糖尿病性 #S^§、 ドーン症«、 性 i&filffi症など） 、 (3) 高インスリン血症 の改善または食欲の抑制などによる肥満、 過鉱 (4) 急 ttfl萃炎、 議萃炎、 滕臓 '腸フ イステル、 出血性潰瘍、 消化性潰瘍、 胃炎、 胃 多症、 逆流性: feil炎、 (5) へリコパク タ一 .ピロリ菌感染に伴う様々な症状、 (6) 内 ίΙ Κ 萃管造影に伴うアミラーゼの分泌 翻、 (7) 小腸の吸収能低下、 分泌昂進または消ィ の β能異常に起因する下痢 （例、 Shor t bowe 1症 ¾など） 、 癌化学療法などの に起因する下痢、 先天性小腸 鐘に起因する下痢、 V I P産^ «などの擁内分泌腫瘍に起因する下痢、 A IDSに起 因する下痢、 骨髄移植などに伴う対宿主移植片反応に起因する下痢、 糖尿病に起因する下痢 、 腹腔 叢遮断に起因する下痢、 全身性硬化症に起因する下痢、 好 加症に起因する 下痢、 (8) ダンピング症 β、 過敏' Ifc^炎、 クローン病、 炎症 ffiK患、 (9)腫寡ま たは癌 （例、 甲 «¾、 ,乳癌、 前 癌、 小細 w^、 非小 «M¾、 iws,胃 癌、 胆管癌、 m .膀鹏、 卵巣癌、 メラノ一マ、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 悪性褐色钿繊、 ^細顏、 m ,胸應、 腎赚など） 、 白血病 （例、 好塩基性白血球の白血病 ·慢 性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン性リンパ腫など） 、 （10
) ΒΕΛ性心筋症、 動脈硬化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 敲麟議應雌後の心解 梗塞） 、 （11) 静 出血、 肝硬変、 末梢血管疾患、 (12) 全身性または局所性の 炎症に伴う疾患 （例、 多 脈炎、 リュウマチ性関節炎、 乾せん、 日焼け、 湿疹、 アレル ギー （例、 1¾息、 アトピー做膚炎、 アレルギー性鼻炎など） など） 、 (13)痴呆症 （例 、 アルツハイマー病、 アルツハイマー型老^^痴呆、 血管' 14 ·多発' [^呆など） 、 精神分裂 症、 てんかん、 うつ病、 H¾不安轄、 睡眠轄、 多発性硬化症、 (14) B腕患 （例、 緑 内障など） 、 （15)急' 14Λクテリア體炎、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸碰症鍵、 バ クテリア肺炎、 重症全身 '«菌感離、 繊、 籠損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコール ffiff炎、 A隱炎、 B隱炎、 C藤炎、 A IDS感赚、 ヒトパピローマウィルス感離 、 インフルエンザ感染症、 癌転移、 多発性骨髄腫、 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨べ一チエツ 卜症、 腎炎、 腎不全、 敗血症、 敗血症ショック、 高カルシウム血症、 高コレステロール血症
、 高グリセリド血症、 高脂血症、 全身性エリテマトーサス、 Ι' ιΙώι発作、 アルコール ttff炎、 ( 1 6 ) 火傷、 創傷、 脱毛症、 ( 1 7 ) 慢性あるいは急'醜痛 （例、 術讓痛、 炎 症髓痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ、 骨繊症など） ) にともなう疼痛） 等の である、 または 患する可能性が ι¾いと診断することができる。
また、 本発明の抗体は、 繊などの被検体中に ¾τる本発明のポリペプチドまた 発明のレセプ夕一蛋白質を検出するために麵することが きる。 また、 本発明のボリ ぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質を精製するために使用する抗体力ラムの作製、 精 製時の各分画中の本発明のポリぺプチドまた〖ま本発明のレセプ夕一蛋白質の検出、 被検細胞 内における本発明のポリぺプチドの挙動の分析などのために使用することが きる。
(4) 遺 診断剤
本発明の DN Αは、 例えば、 プローブとして使用することにより、 ヒトまたは 物 ( 例えば、 ラット、 マウス、 モリレモット、 ゥサギ、 トリ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 など） における本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一 ドする DNAまた «mRNAの異常 （遺^?異常） を検出することが きるので、 例えば、 該 DNAまたは mRNAの損傷、 突然変異あるいは発現低下や、 該 DNAまたは mRNAの 増加あるいは発現過多などの遺 診断剤として有用である。
本発明の DN Αを用いる上記の遺 診断は、 例えば、 自体 のノーザンハイブリダィ ゼーシヨンや P C R— S S C P法 （ゲノミックス （Genomics) , 第 5巻， 8 7 4〜8 7 9頁 ( 1 9 8 9年） 、 プロシ一ジングズ ·ォブ ·ザ ·ナショナル ·アカデミー ·ォブ ·サイェン シィズ ·ォブ ·ュ一エスェ一 (Proceedings of the Nat ional Academy of Sciences of the Uni ted States of America) ， 第 8 6巻， 2 7 6 6〜 2 7 7 0頁 （ 1 9 8 9年） ） などによ り すること力 できる。
例えば、 ノーザン八イブリダィゼーションにより発現低下または過多カ堠出された齢は 、 例えば、 高雄、 自己鎌疾患、 全、 白内障、 緑内障、 急 14Λクテリア體炎， 急性 心筋梗塞， 急 SB萃炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸舰症 ί離， アルコール隨：炎， アルッ ハイマ一病， 喘息， 動脈硬化， アトピー' 14 ^炎， バクテリア肺炎， 膀 ffib^'ん， 骨折， 乳が ん， 過食症， 多食症， 火傷治癒， 子 部がん， 慢性リンパ性白血病， 慢性骨髄性白血病， 慢 tti萃炎， m , がん （結腸 z直腸がん） ， クローン病， 痴呆， 糖尿病性合併症， 糖 尿病性腎症， 糖尿病性擺轄， 糖尿病' 膜症， 胃炎， へリコパク夕一'ピロリ感 ¾fe 肝不全， A藤炎， B隱炎， c藤炎， 肝炎， 単純へルぺスウィルス感難， ? 疹ウィルス感染症， ホジキン病， エイズ感染症， ヒトパピローマウィルス感染症， 高カルシ ゥム血症， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， 感染症， インフルエンザ 感艇， インシュリン依存性糖尿病 （I型） ， 性ブドウ状球菌感赚， 悪 tt feffi, が ん転移， 多発性骨醒， アレルギー [4鼻炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシュリン非 依存性糖尿病 （II型） ， 非小細霧がん， m^ , 骨関節炎， 骨軟化症， 骨減少症， 骨粗 鬆症， 卵巣がん， 骨ペーチエツト病， 消化性潰瘍， 末梢血管疾患， 前 ϊεϋがん， 逆流性^! 炎， 腎不全, リウマチ関節炎， 精神 ^¾， 藤症， 随症ショック， 重症全身 菌感染 症， 小細磨がん， 籠損傷， 胃がん 全身性エリテマトーサス， 麵馳発作， 雄 ' 心弁膜症， 血管性,多発梗塞痴呆， 創傷治癒， 不随， 関節炎、 下垂体ホルモン分 全 、 瀕尿、 尿毒症、 または神 変成疾患等である可能性が いまたは将 患する可能性が 1¾ いと診断することが きる。
また、 ノーザンハイプリダイゼーションにより発現低下または過多が検出された場合、
MACULAR EDEMA CYST01D (麵； K¾斑浮膨 等の鎌である、 または嫌 ¾患する可能性が いと診断することが^きる。
さらに、 本発明のポリペプチド、 本発明のレセプ夕一蛋白質および本発明の DN Αはソマ トス夕チンの分泌制御に関与しているため、 ノーザン八ィプリダイゼーションにより発現低 下また《1多が検出された場合、 例えば、 ( 1 ) 先端巨大症、 T S H¾«¾, 非分泌性 ( im 下垂体 β、 異所性 ACTH (アドレノコルチコトロピン） 産 «ι、 髄様甲状 薩、 V I
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グルカゴン産^ ¾©、 ガストリン Ε4β、 インスリノーマ、 カル チノイド、 ( 2) インスリン依存性または非依存性糖尿病、 あるいはこれら糖尿病に関連し た種々の疾患、 すなわち糖尿病合併症 （例、 糖尿病 膜症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性 #S .ドーン症«、 性 »1£症など） 、 (3) 高インスリン血症の改善または 欲の 抑制などによる肥満、 過食症、 （4) 急倒萃炎、 慢 ttl萃炎、 勝臓 '腸フィステル、 出血性潰 瘍、 消化性潰瘍、 胃炎、 胃^!多症、 逆流性: ftil^、 (5) へリコパク夕一 ·ピロリ菌感染 に伴う様々な症状、 (6) 内視 «II萃管鶴に伴うアミラーゼの分泌翻、 (7) 小腸の 吸収能低下、 分泌昂進または消化管の »能異常に起因する下痢 Shor t bow e 1症鍵など） 、 癌化学療法などの麵に起因する下痢、 先天性小 に起因する下痢 、 V I P産生薩などの塑内分泌 に起因する下痢、 A IDSに起因する下痢、 骨 植などに伴う対宿主移植片反応に起因する下痢、 糖尿病に起因する下痢、 HJ»S«ii断に 起因する下痢、 全身性硬化症に起因する下痢、 好酸 ¾^加症に起因する下痢、 (8) ダンピ ング症 、 過敏 炎、 クローン病、 炎症 ¾l疾患、 (9)鹏または癌 （例、 甲麵 癌、 ^m ,乳癌、 前 癌、 小細 M¾、 非小細 »¾、 嬅瞧、 胃癌、 胆鶴、 ffB ^ 、 膀鼠 卵巣癌、 メラノ一マ、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 悪性褐 ^ β、 m m m, mm 瘍、 胸膽、 ™§など） 、 白血病 （例、 好驢性白血球の白細 '體リンパ性白雌、 纖骨髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン性リンパ腫など） 、 (10)默性心筋症、 動 脈硬化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 画廳 後の心簾塞） 、 （11) 食 道静纏出血、 肝艘、 末梢血管疾患、 （12) 全身性または局所性の炎症に伴う疾患（例
、 多発麵脈炎、 リュウマ 5¾関節炎、 乾せん、 日焼け、 湿疹、 アレルギー （例、 喘息、 ァ トビ一' &¾t炎、 アレルギー性鼻炎など） など） 、 （13) 痴呆症 （例、 アルツハイマー病 、 アルッ八イマ一型老年期痴呆、 血管性'多発性痴呆など） 、 精神分裂症、 てんかん、 うつ 病、 不安韃、 m ,多発性硬化症、 α 4) g嫉患（例、 緑内障など） 、 5 ) 急 クテリア體炎、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸碰症婦、 バクテリア肺炎、 重症 全身性真菌感難、 誦損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコ H4fF炎、 A画炎、 B型肝炎、 C型肝炎、 A IDS感染症、 ヒトパピローマウィルス感染症、 インフルエンザ感 雖、 癌転移、 多通骨醒、 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨ベーチェット症、 腎炎、 腎不全 、 敗血症、 敗血症ショック、 高カルシウム血症、 高コレステロール血症、 高グリセリド血症 、 高脂血症、 全身性エリテマト—サス、 H '圆^ ώι発作、 アルコ―リ H4fF炎、 ( 1 6) 火 傷、 創傷、 脱毛症、 ( 1 7) 慢性あるいは急髓痛 （例、 術鶴痛、 炎症髓痛、 歯痛、 骨 魏 (例、 関節炎、 リウマチ、 骨継症など） にともなう疼痛） 等の^ ある、 または将 来 ¾患する可能性が いと診断することができる。
( 5) アンチセンス DNAを含有 る医薬
本発明の D N Aに相補的に結合し、 該 D N Aの発現を抑制すること力 きるァンチセンス DNAは、 例えば、 高舰、 自己免疫疾患、 全、 白内障、 緑内障、 急 14Λクテリア體 炎， 急性心筋梗塞， 急隨炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸 ί£ϋ症 ί離， アルコ ! 炎 , アルツハイマー病， VMM, 動脈硬化， アトピー性颇炎， バクテリア肺炎， 膀動 Vu， 骨 折， 乳がん， 過食症， 多食症， 火傷治癒， 子 部がん， 慢性リンパ性白血病， 慢性骨髄性 白血病， 慢 ttl萃炎， 肝硬変， がん （結腸/直腸がん） ， クローン病， 痴呆， 糖尿病性合 併症， 糖尿病性腎症， 糖尿病性擺轄， 糖尿病'國膜症， 胃炎， ヘリコバクタ一.ピロリ m^, 肝不全， 八隱炎， B藤炎， C藤炎， 肝炎， 職へルぺスウィルス感離， 水 鶴状赫ウィルス感雑， ホジキン病， エイス'感艇， ヒトパピ口一マウィルス感¾& 高カルシウム血症， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， 感染症， インフ ルェンザ感赚， インシュリン依存性糖尿病 （I型） ， »性ブドウ状球菌感¾¾, 悪 黒 feffl, がん転移， 多発 14骨髄腫， アレルギー性鼻炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシ ユリン非依存性糖尿病 （II型） ， 非小細麵がん m ^ , 骨関節炎， 骨軟化症， 骨減少 症， 骨繊症， 卵巣がん， 骨ベーチェット病， 消化性潰瘍， 末梢血管疾患， 前翅がん， 逆 流性: i , 腎不全， リウマチ関節炎， 精神^ & 症， ½ώι症ショック， 重症全身性 真菌感誠， 小細麟がん， 籠損傷， 胃がん 全身性エリテマトーサス， -^m ^ 作， m , 心弁膜症， 血管 'κκ多発梗翻呆， 創傷治癒， 不眠症， 関節炎、 下垂体ホルモン 分泌不全、 m , 尿 ¾¾、 または ^変成疾患等の^^の治療.予防剤として使用すること が きる。
また、 本発明の DNAに相補的に結合し、 該 DN Aの発現を抑制すること力 きるアンチ センス DNAは MACULAR EDEMA CYSTOID 斑浮 ) の疾病の治療.予防剤などの医 薬として することができる。
さらに、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質はソマトス夕チンの分泌 制御に関与しているため、 本発明の DNAに相補的に結合し、 該 DNAの発現を抑制するこ とができるアンチセンス DNAは、 例えば、 ( 1 ) 先端巨大症、 T SH¾4®» 非分泌性 am 下垂体 «、 異所性 AC TH (ァドレノコレチコ卜口ピン） 産生腫塞、 髄様甲 »s、 V I
Figure imgf000075_0001
グルカゴン産 4j»、 ガストリン産^ «、 インスリノーマ、 力 ルチノイドなどの,の治?^、 （2 ) インスリン依存性または非依存性糖尿病、 あるいは これら糖尿病に関連した種々の疾患、 すなわち糖尿病合併症 （例、 糖尿病' 14^膜症、 糖尿病 性腎症、 '\ m, ドーン症 β、 ^性 ί&ωϊ症など） の治;^、 （3) 高イン スリン血症の改善または 欲の抑制などによる肥満、 過食症などの治藤、 （4) 急隱炎 、 譲萃炎、 塍臓 '腸フィステル、 出血性潰瘍、 消化性潰瘍、 胃炎、 胃 多症、 逆流性食 避などの治纏、 ( 5) ヘリコバクタ一'ピロリ菌感染に伴う様々な症状の改善剤 （例、 ガストリン分泌昂進の抑制剤など） 、 (6) 内S MI萃管造影に伴うアミラーゼの分泌抑 制剤、 さらに ^の予後治纏、 ( 7) 小腸の吸収能低下、 分泌昂進または消化 管の麵能異常に起因する下痢 （例、 S h o r t b owe 1症辦など） 、 癌化学維な どの^!に起因する下痢、 先天性小腸 ¾ϋに起因する下 V I P¾4JB¾などの^内分 泌«に起因する下痢、 A I D Sに起因する下瘌、 骨髄移植などに伴う対宿主移植片反応に 起因する下痢、 糖尿病に起因する下痢、 断に起因する下痢、 全身性硬化症に起 因する下痢、 好酸 ¾1加症に起因する下痢などの治;^、 (8) ダンピング症 β、 過敏性 炎、 クローン病、 炎症 «疾患などの治麟、 ( 9) 鹏または癌 （例、 甲赚癌、 大 纖、 ？し癌、 前 癌、 小細 »¾、 非小細請癌、 勝隱、 胃癌、 胆管癌、™s、 膀胱 癌、 卵鶴、 メラノーマ、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 悪性褐色钿艇、 w mm, 脳顧、 胸 醒、 腎瞧など） 、 白血病 （例、 好塩基性白血球の白血病 ·慢性リンパ性白血病、 '隱骨 髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン性リンパ腫など） などの治療薬；該治療薬は、 単独ま たは他の制 (例、 夕モキシフェン、 LHRHァゴニス卜、 LHRHアン夕ゴニスト、 ィ ンターフェロン一 α、 ）3およびァ、 イン夕一ロイキン一 2など） と併用して用いることがで きる、 （1 0) 肥大性心筋症、 動脈硬化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 経«^誦應 βΤ術後の心簾塞） 、 再血管形成の予防'治麟、 （1 1 ) ： il静謹出血、 肝 、末梢 血管疾患の治麟、 ( 1 2) 髓系に作用する生理活性物質 （例、 サブスタンス P、 夕ヒキ ニン、 サイト力インなど） の分泌の調節作用に基づき、 例えば、 全身性または局所性の炎症 に伴う疾患 （例、 多発'隨脈炎、 リュウマ 5¾関節炎、 乾せん、 日焼け、 湿疹、 アレルギー (例、 喘息、 アトピー 炎、 アレルギー性鼻炎など） など） の治纏、 （1 3) 欄調 節因子の産生 '分泌に影響を及ぼすことから、 例えば、 痴呆症 （例、 アルツハイマー病、 ァ ルツハイマ一型老^^痴呆、 血管性 ·多^ 呆など） 、 精神分 S¾、 てんかん、 うつ病、 H¾不安轄、 睡眠 P轄、 多発性硬化症などの治麟、 ( 1 4) i¾¾¾ (例、 緑内障など） などの治療薬、 （1 5 ) 急 ½ クテリア髄膜炎、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸促迫症候群、 バクテリア肺炎、 重症全身體菌感雖、 繊、 誦損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコー ゾ 炎、 A隱炎、 B藤炎、 C藤炎、 A I D S感 、 ヒトパピローマウィルス感染 症、 インフルエンザ感離、 蔽移、 多発性骨醒、 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨べ一チェ ット症、 腎炎、 腎不全、 症、 麵症ショック、 高カルシウム血症、 高コレステロール血 症、 高グリセリド血症、 高脂血症、 全身性エリテマトーサス、 発作、 アルコ一 JUST炎などの予防'治療薬として有用であり、 （1 6) 臓灘植、 火傷、 創傷、 脱毛症な どの治癒などにも用いられ a 7) HI性あるいは急 '[^痛 （例、 . 炎症'随痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ、 骨 症など） にともなう疼痛） の抑制. »など 、 ^^としても有用である。
上記アンチセンス DNAを上記の治療'予防剤として使用する場合、 前記した本発明の D NAを含 「する各 @¾有の治療 ·予防剤と同様にして ¾Τすることができる。
例えば、 該アンチセンス DNAを用いる場合、 該アンチセンス DN Aを単独あるいはレト ロウィルスべクタ一、 アデノウイルスベクタ一、 アデノウイルスァソシエーテッドウィルス ベクターなどの適当なベクターに挿入した後、 常套手段に従って ること力できる。 該 アンチセンス DNAは、 そのままで、 あるいは摂取促進のために補助剤などの生理学的に認 められる担体とともに 化し、 遺 e«ゃ八ィドロゲルカテーテルのようなカテーテルに よって投与できる。
さらに、 該アンチセンス DNAは、 細胞における本発明の DNAの gやその発現 状況を調べるための診断用オリゴヌクレオチドプローブとして使用することもできる。
(6) 本発明の抗体を含 る医薬
本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の活性を中和する作用を有する本 発明の抗体は、 例えば、 高舰、 自己赚疾患、 全、 白内障、 緑内障、 急 Ι4Λクテリア 體炎， 急性心筋梗塞， 急體炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸碰症觸， アルコ一 肝炎， アルツハイマー病， 喘息， 動脈硬化， アトピー'賊膚炎， バクテリア肺炎， 膀動 u , 骨折， 乳がん， 過食症' 多食症， 火傷治癒， 子^部がん， liftリンパ性白血病， 慢性骨 髄性白血病， 慢倒萃炎， 肝硬変， 大腸がん （結腸 Z直腸がん） ， クローン病， 痴呆， 糖尿病 性合併症， 糖尿病性腎症， 糖尿病性擺轄， 糖尿病'麵膜症， 胃炎， へリコパク夕一.ピ 口リ感赋 肝不全， ASffF炎， B藤炎， C疆炎， 肝炎， 職へルぺスウィルス感^! ， 水鎌状赫ウィルス感聽， ホジキン病， エイズ感離， ヒトパピ口一マウィルス感染 症， 高カルシウム «， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， 感¾& ィ ンフルェンザ感染症， インシュリン依存性糖尿病 （I型） ， 侵 ブドウ状球菌感染症， 悪 ffi^m がん転移， 多発性骨籠， アレルギー 炎， 腎炎， 非ホジキン！ 4リンパ腫， ィ ンシュリン非依存性糖尿病 （I I型） ， 非小細胞肺がん， 臓 植， 骨関節炎， 骨軟化症， 骨 減少症， 骨 ffi^症， 卵巣がん， 骨ベーチェット病， 消化性潰瘍， 末梢血管疾患， 前 3ΪΙ¾^ん
， 逆流性^ ， 腎不全， リウマチ関節炎， m ^, 症， 馳症ショック， 重症全 身 ttX菌感嫉， 小細歸がん， 纏損傷， 胃がん， 全身性エリテマト一サス， Hi聽虚 雌作， 繊， 心弁膜症， 血管性 Z多発梗麵呆， 創傷治癒， 症， 関節炎、 下 ホル モン分泌不全、 瀕尿、 尿毒症、 または 等の疾病の治療 ·予防剤などの医薬とし て^ fflすることが^?きる。
また、 本発明のポリぺプチドまた〖ま本発明のレセプター蛋白質の活性を中和する作用を有 する本発明の抗体は MACULAR EDEMA CYSTOID 斑浮 ffl) の疾病の治療.予防剤など の医薬として™すること力 きる。 さらに、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質はソマトス夕チンの分泌 制御に関与しているため、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の活性を 中和する作用を る本発明の抗体は、 例えば、 (1)先端巨大症、 τsH産4J»、 非分 泌性 am 下垂体菌、 異所 &ACTH (アドレノコルチコトロピン） ¾β、 髄 様甲«癌、 V I Ρ産 4»、 ダル力ゴン産 4ffi®、 ガストリン産^ ¾、 ィンスリノーマ 、 カルチノイドなどの腫瘍の治纏、 (2) インスリン依存性または非依存性糖尿病、 ある はこれら糖尿病に関連した種々の疾患、 すなわち糖尿病合併症 （例、 糖尿病 ft«症、 糖 尿病性腎症、 m m , ドーン症^^、 ®3ϊ性 «ιι症など） の治 β、 （3) 高 ィンスリン血症の改善または食欲の抑制などによる肥満、 過食症などの治療薬、 ( 4 ) 急性 fl萃炎、 慢 ttii萃炎、 s萃臓 ·腸フィステル、 出血性潰瘍、 消化髓瘍、 胃炎、 胃 mm多症、 逆流 性食道炎などの治療薬、 (5) ヘリコバクタ一'ピロリ菌感染に伴う様々な症状の改善剤 ( 例、 ガストリン分泌昂進の抑制剤など） 、 (6) 内 ί!»3ΙΙ萃管鶴に伴うアミラーゼの分 泌柳制剤、 さらに《 WfW了の予後治纏、 (7) 小腸の吸収能低下、 分泌昂進または 消 il^tの翻能異常に起因する下痢 （例、 Shor t bowe 1症爾など） 、 癌化学療 法などの,に起因する下痢、 先天性小腸 に起因する下痢、 VIP産生 などの « 内分泌 «に起因する下痢、 A IDSに起因する下痢、 骨»植などに伴う対宿主移植片反 応に起因する下痢、 糖尿病に起因する下痢、 酸撫 断に起因する下痢、 全身性硬化症 に起因する下痢、 請¾ ^加症に起因する下痢などの治麟、 (8) ダンピング症«、 過 敏 fe^炎、 クローン病、 炎症 患などの治麟、 (9) 聽または癌 （例、 甲嫌癌 、 ,乳癌、 MMs 小細 MS、 非小細»¾、 降■ 胃癌、 胆管癌、 mm mm, m,メラノーマ、 骨肉腫、 軟骨肉腫、 悪性褐色細謹、 w rn^m, m 、 胸麵、 腎瞧など） 、 白血病 （例、 好塩基性白血球の白血病 ·'隱リンパ性白血病、 慢 性骨髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン性リンパ腫など） などの治鶴；該治麟は、 単 独または他の制纏 （例、 夕モキシフェン、 LHRHァゴニスト、 LHRHアン夕ゴニスト 、 インターフェロン一 α、 ]3およびァ、 インターロイキン一 2など） と併用して用いること が きる、 do)肥大性心筋症、 動脈硬化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 m ] 後の心鍵塞） 、 再血管形成の予防'治纏、 （1 1 ) 錢静謹出血、 肝硬変、 末梢血管疾患の治療薬、 （1 2) 免疫系に作用する生理活性物質 （例、 サブスタンス？、 夕 ヒキニン、 サイト力インなど） の分泌の調節作用に基づき、 例えば、 全身性または局所性の 炎症に伴う疾患 （例、 多発'隱脈炎、 リュウマ 5¾関節炎、 乾せん、 日焼け、 灘、 アレル ギー （例、 喘息、 アトピー' 膚炎、 アレルギー性鼻炎など） など） の治 、 （1 3) 神 経調節因子の産生 '分泌に影響を及ぼすことから、 例えば、 痴呆症 （例、 アルツハイマー病 、 アルツハイマー型老糊痴呆、 血管性.多発髓呆など） 、 精神^ «、 てんかん、 うつ 病、 H¾不安轄、 m mm, 多発性硬化症などの治麟、 （1 4) 8嫉患 （例、 緑内^ ¾ ど） などの治療薬、 （1 5 ) 急¾/ クテリア髄膜炎、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸促迫症候 群、 バクテリア肺炎、 重症全身性真菌感離、 繊、 舗損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アル コ一リレ fflff炎、 A^ff 炎、 BMffF炎、 C»炎、 A I D S感 、 ヒトパピローマウィルス 感離、 インフルエンザ感嫉、 «移、 多発性骨灘、 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨べ一 チェット症、 腎炎、 腎不全、 症、 症ショック、 高カルシウム血症、 高コレステロ一 ル血症、 高グリセリド血症、 高脂血症、 全身性エリテマトーサス、 発作、 アル コール 炎などの予防 '治纏として有用であり、 （1 6) 植、 火傷、 創傷、 脱毛 症などの治癒などにも用いられ、 （1 7) 慢性あるいは急i ^痛 （例、 術後 ¾¾、 ^ 痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ、 骨繊症など） にともなう の抑制 · » など、 ^^としても有用である。
本発明の抗体を含有する上記疾患の治療 ·予防剤は、 そのまま »Jとして、 または適当な 剤型の医薬誠物として、 ヒトまたは哺¾¾物 （例、 ラット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ
、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して経口的または非経口的に投与することが きる。 投与量 は、 投与嫩、 赚疾患、 症状、 投与ルートなどによっても異なるが、 例えば、 成人の擺 疾 ma者の治療'予防のために使用する場合には、 本発明の抗体を 1回量として、 通常 0.
0 1〜2 Omg/k g体重雖、好ましくは 0. 1〜1 OmgZk g体重 、さらに好まし くは 0. l〜5mg/k g体重 @gを、 1日 1 ~ 50^、好ましくは 1日 l〜3HI@m、静 脈 により投与するのが好都合である。 他の非経口投与および経口投与の^もこれに準 ずる量を投与することができる。 症状が特に重い には、 その症状に応じて増量してもよ い。
本発明の抗体は、 それ自体また〖¾1当な医薬糸滅物として投与することができる。 上記投 与に用いられる医薬滅物は、 上記またはその塩と薬理糊に許容され得る担体、 も しくは賦形剤とを含むものである。 かかる組成物は、 経口または非経口投与に適する剤形と して提供される。
すなわち、 例えば、 経口投与のための诚物としては、 固体または液体の剤形、 具脑に は錠剤 （糖衣錠、 フィルムコーティング錠を含む） 、 mi 顆粒剤、 カプセル剤 （ソ フトカプセル剤を含む） 、 シロップ剤、 乳剤、 懸獨剤などがあげられる。 かかる組成物は自 体^]の方法によって SBされ 麵分野において通常用いられる担体、 もしくは賦 形剤を含 ¾ るものである。 例えば、 翻用の担体、 賦形剤としては、 乳糖、 でんぷん、 蔗 糖、 ステアリン酸マグネシウムなどが用いられる。
非経口投与のための誠物としては、 例えば、 渡剤、 などが用いられ 謝剤は静 脈注射剤、 皮下注射剤、 皮内注射剤、 筋肉注射剤、 点滴注射剤などの剤形を包含する。 かか る蘭剤は、 自体么^]の方法に従って、 例えば、 上記抗体またはその塩を通常注射剤に用い られる無菌の水性もしくは油性液に溶解、 懸獨または乳化することによつて調製する。 aw 用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが 用いられ、 適当な溶膽助剤、 例えば、 アルコール （例、 エタノール） 、 ポリアルコール （ 例、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール） 、 非イオン界面活'鬧 〔例、 ポリソ ルベート 8 0、 HC O- 5 0 (polyoxyethylene ( 5 0 mol) adduct of hydrogenated castor oi l) 〕 などと併用してもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油、 油などが用いられ、 溶漏助剤として安息麵ベンジル、 ベンジルアルコールなどを併用してもよい。 調製され た麵液は、 通常、 適当なアンプルに充填される。 直腸投与に用いられる鋼は、 上記抗体 またはその塩を通常の^ 基剤に混合することによって調製される。
上記の経口用または非経口用医薬誠物は、 活賊分の投与量に適合するような投酵位 の剤形に調製されることが好都合である。 かかる投薬単位の剤形としては、 錠剤、 丸剤、 力 プセル剤、 &m (アンプル） 、 翻などが例示され それぞれの投 読形当たり通常
5〜5 0 0mg、 とりわけ ftlt剤では 5〜： 1 0 0mg、 その他の剤形では 1 0〜2 5 Omg の上記抗体力含有されていることが好ましい。
なお鎌 Sした各«物は、 上記抗体との配合により好ましくない相互作用を生じない限り 他の活性成分を含有してもよい。
( 7) DNA転移動物
本発明は、 外来性の本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNA (以下、 本発明の外来性 DN Aと略記する） またはその変異 DN A (本発明の外来性 変異 DNAと略記する場合がある） を る非ヒ卜哺 物を提供する。
すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の外来性 DN Aまたはその変異 DN Aを有する非ヒト哺乳動物、
(2) 非ヒト哺？ Li¾物がゲッ歯動物である第 （1 )記載の動物，
(3) ゲッ歯動物がマウスまたはラットである第 （2) 記載の動物、 および
(4) 本発明の外 ¾½DNAまたはその変異 DNAを含有し、 物において発現しうる 組換えべクタ一を提供するものである。
本発明の外 *ttDNAまたはその変異 DNAを有する非ヒト哺¾¾物 （以下、 本発明の D NA転移動物と略記する） は、 未受精卵、 卵、 精子およびその始翻胞を含む ¾¾胞 などに対して、 好ましくは、 非ヒト哺? U¾物の発生における胚発生の段階 （さらに好ましく は、 単細胞または 卵細胞の段階でかっ^^に 8細扁以前） に、 リン酸カルシウム法、 €^A°ルス法、 リポフエクシヨン法、 »¾、 マイクロインジェクション法、 パ一ティクル ガン法、 D EAE—デキストラン法などにより目的とする DNAを転移することによって作 出することが きる。 また、 該 DNA転移方法により、 体細胞、 生体の S gg、 糸應細胞など に目的とする本発明の外 *½DNAを転移し、 細胞培養、 養などに利用することもで き、 さらに、 これら細胞を の jra細胞と自体 の細胞融合法により融合させることに より本発明の D N A転移動物を作出することもできる。
非ヒト哺 物としては、 例えば、 ゥシ、 ブ夕、 ヒッジ、 ャギ、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モ ルモット、 ハムスター、 マウス、 ラットなどが用いられる。 なかでも、 病体動物モデル系の 作成の面から個体発生および生物サイクルが比翻短く、 また、 匪が容易なゲッ歯動物、 とりわけマウス （例えば、 純系として、 C 5 7 B LZ 6系統， D BA 2系統など、 系と して、 B e C S F i系統， BD F i系統， B 6 D 2 F 1系統， BAL BZc系統， I C R系統 など） またはラット （例えば、 W i s t a r , S Dなど） などが好ましい。
哺¾1¾物において発現しうる «ぇベクターにおける 「哺乳動物」 としては、 上記の非ヒ ト哺 物の他にヒトなどがあげられる。
本発明の外 *½DNAとは、 非ヒト哺 物が本来有している本発明の DNAではなく、 いったん 物から聰 ·抽出された本発明の DNAをいう。
本発明の変異 DNAとしては、 元の本発明の DN Aの; 列に変異 （例えば、 突然変異 など） が生じたもの、 具体的には、 塩基の働 Π、 欠損、 他の驢への離などが生じた DN Αなどが用いられ、 また、 異常 DN Aも含まれる。
該異常 D N Aとしては、 異常な本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質を 発現させる DNAを意味し、 例えば、 正常な本発明のポリペプチドまた 発明のレセプ夕 一蛋白質の機能を抑制するポリべプチドを発現させる DNAなどが用いられる。
本発明の外 *ttDNAは、 ¾ ^とする動物と同種あるいは のどちらの哺 ¾!¾物由来の ものであってもよい。 本発明の DN Aを対象動物に転移させるにあたっては、 該 DNAを動 物細胞で発現させうるプロモーターの下流に結合した DN Aコンストラクトとして用いるの が"^に有利である。 例えば、 本発明のヒト DN Aを転移させる^ &、 これと相同性が Ί¾い 本発明の DN Αを有する各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムス ター、 ラット、 マウスなど） 由来の DN Aを発現させうる各種プロモー夕一の下流に、 本発 明のヒト DNAを結合した DNAコンストラクト （例、 ベクターなど） を 像哺乳動物の受 精卵、 例えば、 マウス受精卵へマイクロインジェクションすることによつて本発明の D N A を高発現する DNA転移哺乳動物を作出することができる。
本発明のポリペプチドの発現べクタ一としては、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来の プラスミド、 酵母由来のプラスミド、 λファ一ジなどのバクテリオファージ、 モロニ一白血 病ウィルスなどのレトロウイルス、 ワクシニアウィルスまた «Α'キュロウィルスなどの動物 ウィルスなどが用いられる。 なかでも、 大腸菌由来のプラスミド、 枯草菌由来のプラスミド または酵母由来のプラスミドなどが好ましく用いられる。
上記の DNA発現調節を行なうプロモーターとしては、 例えば、 ①ゥィルス （例、 シミア ンウィルス、 サイトメガロウィルス、 モロニ一白血病ウィルス、 J Cウィルス、 乳癌ウィル ス、 ポリオウイルスなど） に由来する DNAのプロモーター、 （1洛¾«¾»1物 （ヒト、 ゥサ ギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 八ムスター、 ラット、 マウスなど） 由来のプロモータ一、 例 えば、 アルブミン、 インスリン I I、 ゥロプラキン I I、 エラスターゼ、 エリスロポエチン 、 エンドセリン、 筋クレアチンキナーゼ、 グリア線維性酸性タンパク質、 グルタチオン S— トランスフェラ一ゼ、 血 /h¾由来成長因子) 3、 ケラチン Kl， K10および Κ14、 コラ一 ゲン I型および I I型、 サイクリック AMP依存タンパク質キナーゼ 3 Iサブユニット、 ジ ス卜ロフィン、 酒 »£抗性アルカリフォスファターゼ、 心房ナトリウム利尿性因子、 内皮 レセプターチ口シンキナーゼ （ー役に T i e 2と略される） 、 ナトリウムカリウムアデノシ ン 3リン酸化酵素 （Na， K-ATPa s e) 、 ニューロフィラメント 、 メタ口チォネ イン Iおよび I IA、 メタ口プロティナ一ゼ 1繊インヒビ夕一、 MHCクラス ΙίΐΙ^ (Η -2L) 、 H— r a s、 レニン、 ド一パミン /3—水酸化酵素、 甲灘ペルォキシダ一ゼ（T PO) 、 ポリペプチド艇長因子 1 (EF- 1 ) 、 β了クチン、 αおよび3ミオシン重 鎖、 ミオシン讓 1および 2、 ミエリン纏タンパク質、 チログロブリン、 Thy— 1、 免 疫グロブリン、 H鎖可変部 (VNP) 、 血清アミロイド Pコンポーネント、 ミオグロビン、 トロポニン C、 平滑筋 αァクチン、 プレプロエンケフアリン Α、 バソプレシンなどのプロモ —タ一などが用いられる。 なかでも、 全身で高発現することが 能なサイトメガロウィルス プロモーター、 ヒトポリペプチド鎖延長因子 1 a (EF- 1 ) のプロモータ一、 ヒトおよ びニヮトリ /3ァクチンプロモー夕一などが 1 ¾である。
上記ベクターは、 DN Α転移哺¾¾物において目的とするメッセンジャー RN Αの転写を 終 1STる配列 （ 投に夕一ミネ夕一と呼ばれる） を有していることが好ましく、 例えば、 ゥ ィルス由来およ ¾種哺乳動物由来の各 DNAの配列を用いること力 き、 好ましくは、 シ ミァンウイルスの S V 4 0夕一ミネタ一などが用いられる。
その他、 目的とする外来性 DN Aをさらに高発現させる目的で各 DNAのスプライシング シグナル、 ェンハンサー領域、 真核 DN Aのィントロンの一部などをプロモータ一領域の 5 '上流、 プロモー夕一領域と翻訳領域間あるいは翻訳領域の 3 '下流 に連結することも目 的により可能である。
正常な本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の翻訳領域は、 ヒトまたは 各種哺乳動物 （例えば、 ゥサギ、 ィヌ、 ネコ、 モルモット、 ハムスター、 ラット、 マウスな ど） 由来の TO, 腎臓、 甲 Wffl胞、 ^ Ι^δ胞由来 DNAおよび市販の各種ゲノム DNA ライブラリーよりゲノム DNAの全てあるいは"^として、 また Wffl 、 腎臓、 甲； t>MB胞 、 纖芽細胞由来 RN Aより の方法により調製された相補 DN Aを 料として取得する ことカ出来る。 また、 外雄の異常 DN Aは、 上記の細胞また より得られた正常なポ リぺプチドの翻訳領域を点 然変異誘発法により変異した翻訳領域を f¾することが きる 該翻訳領域は転移動物において発現しうる D N Aコンストラクトとして、 前記のプロモ一 夕一の下流および所望により転写終結部位の上流に連結させる通常の DN A工学的手法によ り作製することが ^きる。
受精卵細胞段階における本発明の外来 I4DNAの転移は、 対象哺乳動物の！！錢細胞および 体細胞のすべてに存在するように確保される。 D N A転移後の作出動物の胚^ H胞において 、 本発明の外来 DNA力 ¾ETることは、 作出動物の後代がすべて、 その麟細胞および 体細胞のすべてに本発明の外来性 DN Aを することを意味する。 本発明の外来性 DNA を受け継レゝだこの種の動物の子孫はその Ε¾胞およ »細胞のすべてに本発明の外 ¾ttD NAを^ Tる。
本発明の外来 I4IE常 DNAを転移させた非ヒト哺孚 Lll物は、 により外 *ttDNAを安 定に麟することを確認して、 該 D N A保有動物として通常の飼育難で継麵 Tること が出来る。
¾ 卵細胞段階における本発明の外 D N Aの転移は、 »哺¾»物の 細胞および 体細胞の全てに過剰に存在するように確保される。 DN A転移後の作出動物の 胞にお て本発明の外 *ttD N Aが翻に ることは、 作出動物の子孫 全てその ¾¾胞お ょ»細胞の全てに本発明の外来 I4DNAを翻に ることを意味する。 本発明の外来性 DNAを受け継いだこの種の動物の子孫はその胚 胞および体細胞の全てに本発明の外来 性 DNAを; Μに ¾ る。
導入 D Ν Αを相同染色体の両方に持つホモザィゴート動物を取得し、 この雌雄の動物を交 配することによりすべての子孫が該 D N Aを過剰に # "るように 代することが、できる 本発明の正常 DNAを る非ヒト哺 物は、 本発明の正常 DNA力 発現させられて おり、 内在性の正常 D N Aの機能を βすることにより ft終的に本発明のポリぺプチドまた 発明のレセプター蛋白質の機能雄症を発症することがあり、 そ CD«モデル動物とし て利用することが^?きる。 例えば、 本発明の正常 DN A転移動物を用いて、 本発明のポリべ プチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の機能亢進症や、 本発明のポリぺプチドまたは本発 明のレセプター蛋白質が関連する疾患の病 の解明およびこれらの疾患の治療方法の検 討を行なうこと力河能である。
また、 本発明の外 ¾ΪΕ常 DN Aを転移させた哺乳動物は、 誦した本発明のポリべプチ ドまた 発明のレセプター蛋白質の増加症状を^ Τること力ゝら、 本発明のポリぺプチドま たは本発明のレセプ夕一蛋白質に関連する疾患に対する治療薬のスクリーニング試験にも利 用可能である。
一方、 本発明の外 異常 DNAを #Tる非ヒト哺 ¾ί¾物は、 交配により外来 I4DNAを 安定に! することを確認して該 DN Α保有動物として通常の飼育 継^IWすること が出来る。 さらに、 目的とする外来 DNAを前述のプラスミドに組み込んで原科として用い ることができる。 プロモーターとの DNAコンストラクトは、 通常の DNA工学的手法によ つて作製することができる。 受精卵細胞段階における本発明の異常 DN Aの転移は、 m 乳動物の胚芽細胞および体細胞の全てに存在するように確保される。 DNA転移後の作出動 物の E¾胞において本発明の異常 DNAが ¾Tることは、 作出動物の子孫が全てその胚 細胞おょ«細胞の全てに本発明の異常 DNAを; ることを意味する。 本発明の外
D N Aを受け継 この種の動物の子孫は、 その麟細胞およ 細胞の全てに本発明の異 常 DNAを^ Tる。 導入 DN Aを相同染色体の両方に持つホモザィゴ一ト動物を取得し、 こ の !«¾の動物を することによりすべての子孫が該 D N Aを るように繁»代するこ とができる。
本発明の異常 DNAを る非ヒト哺 物は、 本発明の異常 DNAが 発現させられて おり、 内在性の正常 D N Aの機能を阻害することにより 的に本発明のポリぺプチドまた tt*発明のレセプ夕一蛋白質の機能不活性型不応症となることがあり、 その病態モデル動物 として禾翻することができる。 例えば、 本発明の異常 DN A転移動物を用いて、 本発明のポ リぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不活性型不応症の病態 の解明および この疾患を治 »法の検討を行なうことが^ T能である。
また、 具体的な利用可能性としては、 本発明の異常 DN A高発現動物は、 本発明のポリべ プチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の機能不活性型不応症における本発明の異常ポリぺ プチドによる正常ポリペプチドの機能阻害 (dominant negat ive作用） を解明するモデルと なる。
また、 本発明の外来異常 DNAを転移させた哺乳動物は、 藤した本発明のポリペプチド または本発明のレセプ夕一蛋白質の増加症状を有すること力ゝら、 本発明のポリぺプチドまた 発明のレセプ夕一蛋白質の機能不活性型不応症に対する治療薬スクリ一ニング試験にも 禾 IJ用可能である。
また、 上記 2種類の本発明の DN A転移動物のその他の利用可能性として、 例えば、
0¾^¾養のための細胞源としての使用、
②本発明の DNA転移動物の組織中の DNAもしくは RNAを直接分析するか、 または DN Aにより発現されたポリぺプチド組織を分析することによる、 本発明のポリぺプチドまたは 本発明のレセプ夕一蛋白質により特異的に発現あるいは活性化するポリぺプチドとの関連性 についての解析、
③ DNAを： る繊の細胞を標準 »S養謹により培養し、 これらを義して、 に 培養困難な βからの細胞の機能の W¾、
④上 記載の細胞を用いることによる細胞の機能を高めるような薬剤のスクリ一ニング、 および
⑤本発明の変異ポリぺプチドを職精製およびその抗体作製などカ えられる。
さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ 夕一蛋白質の機能不活性型不応症などを含む、 本発明のポリぺプチドまた ίま本発明のレセプ 夕一蛋白質に関連する疾患の臨床症状を調べること力 き、 また、 本発明のポリペプチドま たは本発明のレセプ夕一蛋白質に関連する疾患モデルの各臓器におけるより詳細な病理学的 所見が得られ、 新しい治療方法の開発、 さらには、 該疾患による:^ & 患の W¾およ ϋ¾ 療に貢献することができる。
また、 本発明の DN Α転移動物から各)] を取り出し、 細切後、 トリプシンなどのタンパ ク質^^素により、 薩した DNA転移細胞の取得、 その培養またはその培鑒細胞の系統 化を行なうことが^ T能である。 さらに、 本発明のポリペプチドまた 発明のレセプター蛋 白質産生細胞の特定化、 アポト一シス、 分化あるいは増殖との関連性、 またはそれらにおけ るシグナル伝 »構を調べ、 それらの異常を調べることなどが き、 本発明のポリペプチド または本発明のレセプター蛋白質およびその作用解明のための有効な研究材料となる。 さらに、 本発明の DN A転移動物を用いて、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプ 夕一蛋白質の機能不活性型不応症を含む、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプター 蛋白質に関連する疾患の治麟の開発を行なうために、 ±3ίの猶法および定量法などを用 いて、 摘で舰な該疾患治麟のスクリーニング法を提供すること力河能となる。 また、 本発明の D Ν Α転移動物また〖林発明の外 *ttD Ν Α発現べクターを用 ゝて、 本発明のポリ ぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質が関連する疾患の D N A治療法を検討、 開発する ことが ^能である。
(8) ノックアウト動物
本発明は、 本発明の DNA力^ ¾性化された非ヒト哺 ¾«j物 胞および本発明の DN A発現不全非ヒト嚇睡を獄する。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) 本発明の DNAが^ ¾性化された非ヒト哺？ U¾物胚幹細胞、
( 2 ) 該 DN Αがレポーター遺^ (例、 ： 菌由来の /3—ガラクトシダーゼ遺 β ) を導 入することにより ¾性化された第 （1 ) 項記載の胚幹細胞、
( 3) ネオマイシン耐性である第 ( 1 ) 項記載の胚幹細胞、
(4) 非ヒト哺学 U¾物がゲッ歯動物である第 （1 ) 項記載の赌細胞、
( 5) ゲッ歯動物がマウスである第 （4) 項記載の胚幹細胞、
(6) 本発明の DNAが^ ¾性化された該 DNA発現不全非ヒト哺 ¾1¾物、
( 7 ) 該 DNAがレポ一夕 (例、 ^菌由来の) 3—ガラクトシダーゼ を導 入することにより不活性化され 該レポーター遺 {5 ^が本発明の DNAに対するプロモータ
—の制 で発現しうる第 ( 6) 項記載の非ヒト哺涵物、
( 8) 非ヒト哺乳動物がゲッ歯動物である第 （6) 項記載の非ヒト 物、
( 9) ゲッ歯動物がマウスである第 （8) 項記載の非ヒト iffiHSl物、 および
( 1 0) 第 （7) 項記載の動物に、 薩匕合物を投与し、 レポ一夕 Htfe の発現を検出す ることを特徴とする本発明の DN Aに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物 またはその塩のスクリ一二ング方法を提供する。
本発明の DNA力 性化された非ヒト哺? U¾物 K 細胞とは、 該非ヒト哺乳動物力 W る本発明の DN Αに人為的に変異を加えることにより、 DN Aの発現能を抑制するか、 もし くは該 D N Aがコ一ドしている本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の活 性を実質的に喪失させることにより、 DN Aが実質的に本発明のポリペプチドのまたは本発 明のレセプ夕一蛋白質発現能を有さない （以下、 本発明のノックアウト DNAと $Τすること がある） 非ヒト 物の E 細胞 （以下、 E S細胞と略記する） をいう。
非ヒト哺乳動物としては、 嫌己と同様のものが用いられる。
本発明の DN Aに人為的に変異を加える方法としては、 例えば、 遺伝子工学的手法により 該 DN A配列の 又は の削除、 他 DN Aを挿入または置換させることによって行なう ことができる。 これらの変異により、 例えば、 コドンの読み取り枠をずらしたり、 プロモ一 ターあるいはェキソンの機能を破壊することにより本発明のノックアウト D N Aを すれ ばよい。
本発明の DNA力 ¾性化された非ヒト BS?L»物勝細胞 （以下、 本発明の DNA¾性 化 E S細胞また ¾φ発明のノックアウト E S細胞と略記する） の具体例としては、 例えば、 目的とする非ヒ卜哺? Lfj物が有する本発明の DNAを単離し、 そのェキソン部分にネオマイ シン耐 ttitfe？、 ハイグロマイシン耐 ffite^を代表とする^ «ffitfe^、 あるいは l a c Z (/3—ガラクトシダーゼ 、 ca t (クロラムフエニコ一ルァセチルトランスフ ェラーゼ¾ ) を代表とするレポ一夕 Ηΐβ^等を挿入することによりェキソンの機能を 破壊するか、 あるいはェキソン間のィントロン部分に遣 の転写を終結させる DN Α配列 (例えば、 poly A ¾Iシグナルなど） を揷入し、 ^：なメッセンジャー RNAを合成できな くすることによって、 結果的に遺 ί5ΐを破壊するように構築した DNA配列を^ Tる DNA 鎖 （以下、 夕一ゲッティングベクターと略記する） を、 例えば相同纖ぇ法により 物の 染色体に導入し、 得られた E S細胞について本発明の DNA上あるいはその近傍の DNA配 列をプローブとした サ'ン八イブリダィゼーション解析あるいはターゲッティングベクタ一 上の DN A配列と夕一ゲッティングベクター に使用した本発明の DN A以外の近傍領域 の DNA配列をプライマ一とした PCR法により し、 本発明のノックアウト ES細胞を S¾【Jすることにより得ることができる。
また、 相同組換え法等により本発明の DNAを不活化させる元の ES細胞としては、 例え ば、 前述のような既に樹立されたものを用いてもよく、 また Evansと Kauf maの方法に 準じて新しく樹立したものでもよい。 例えば、 マウスの ES細胞の:^、 現在、 的には 129系の ES細胞が棚されているが、 髓 背景がはっきりしていないので、 これに 代わる純系で髓 ¾に遺伝的背景が明らかな E S細胞を取得するなどの目的で例えば、 C 57BLZ6マウスや C57BLZ6の採卵数の少なさを DBAZ2との により改善し た BDF1マウス （C57BLZ6と DBAZ2との F 1) を用いて樹立したものなども良 好に用いうる。 BDF1マウスは、 採卵数が多く、 かつ、 卵が丈夫であるという禾点に加え て、 C 57 B LZ 6マウスを背景に持つので、 これを用いて得られた E S細胞は病態モデル マウスを作出したとき、 C 57BLZ6マウスとバッククロスすることでその遺伝的背景を C57BL/6マウスに代えること力河能である点で有利に用い得る。
また、 ES細胞を樹立する 、 ^^には受精後 3.5日目の E«を^ fflするが、、 これ以 外に 8細扁胚を採卵し胚鍾まで培養して用いることにより効率よく多数の初期胚を取得 することができる。
また、 瞧いずれの ES細胞を用いてもよいが、 通灘の ES細胞の方が生殖系列キメラ を作出するのに都合が良い。 また、 煩雑な培養の手間を肖 ij滅するためにもできるだけ早く雌 雄の判別を行なうことが望ましい。
E S細胞の纖の判 法としては、 例えば、 P C R法により Υ¾β体上の性決定領域の 遺 fe を増幅、 検出する方法が、 その 1例としてあげることが きる。 この方法を删すれ ば、 縣、 麵分析をするのに約 106個の細胞数を要していたのに対して、 1コロニー程 度の ES細胞数 （約 50個） で済むので、 培養初期における ES細胞の第一次セレクション を纖の判別で行なうこと力河能であり、 ^^に擁胞の ¾を可能にしたことにより 初期の手間は大幅に肖 U減できる。
また、 第 セレクションとしては、 例えば、 G—バンデイング法による染色體の確認 等により行うことが きる。 得られる E S細胞の染色体数は正常数の 100 %が望ましいが
、 樹立の際の物理的操作等の関係上困難な: ^は、 ES細胞の遺 β?をノックアウトした後
、 正常細胞 （例えば、 マウスでは染色体数が 2 n = 40である細 ® に再びクローニングす ることが望ましい。
このようにして得られた勝細胞株は、 通常その増殖性は大変良いが、 個体発生できる能 力を失いやすいので、 く継代培養することが輕である。 例えば、 STO«M胞 のような適当なフィーダ一細胞上で L IF (1— 10000 U/ml) ¾E下に炭酸ガス培養器 内 ましくは、 5%炭酸ガス、 95%空気または5%«、 5%炭 ス、 90%空 で約 37 で培養するなどの方法で培養し、 継代時には、 例えば、 トリプシン/ EDTA溶 液（通常 0.001-0.5%トリプシン/ 0. 1— 5mM EDTA,好ましく【お勺 0.1%ト リブシン ZlmM EDTA)処理により単細胞化し、新たに用意したフィーダ" ^胞上に播 ¾Tる方法などがとられる。 このような継代は、 通常 1—3日毎に行なうが、 この際に細胞 の を行い、 形態的に異常な細胞が見受けられた はその培 細胞は¾¾することが Ή まれる。
E S細胞は、 適当な条件により、 高密度に至るまで単層培養するか、 また〖湖 を形 成するまで浮遊培養することにより、 SUM筋、 内臓筋、 心筋などの種々のタイプの細胞に分 化させることが^ J能であり CM J. Evans及び M R Kaufman, ネイチヤー （Nature) 第 292 巻、 154頁、 1981年； G. H Mart in プロシーディングス ·ォブ ·ナショナル ·アカデミー •ォブ ·サイエンス ·ユーエスェ一 (Proc. Nat l. Acad. Sci. U. S. A. ) 第 78卷、 7634頁、 1981年； C. Doetschman ら、 ジャーナル'ォブ'ェンブリオロジー 'アンド .ェクスぺ リメンタル 'モルフォロジ一、 第 87巻、 27頁、 1985年〕 、 本発明の E S細胞を分化させて 得られる本発明の DN A発現不全細胞は、 ィンビトロにおける本発明のポリペプチドまたは 本発明のレセプ夕一蛋白質の細胞生物学^討において有用である。
本発明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物は、 i¾物の mRNA量を公知方法を用いて測定 して間接的にその発現量を比 することにより、 正 KI物と区別することか^!能である。 該非ヒト哺 物としては、 itifSと同様のものが用いられる。
本発明の DN A発現不全非ヒト哺涵物は、 例えば、 前述のようにして謂した夕ーゲッ ティングベクタ一をマウス K 細胞またはマウス卵細胞に導入し、 導入により夕ーゲッティ ングベクタ一の本発明の D Ν Αが 性 ί匕された D Ν Α配列が'遺 β?相同 «えにより、 マ ウス 細胞またはマウス卵細胞の染色体上の本発明の D N Aと入れ換わる相同組換えをさ せることにより、 本発明の DNAをノックアウトさせることが きる。
本発明の D N Aがノックアウトされた細胞は、 本発明の D N A上またはその近傍の D N A 配列をプローブとしたサザン八イブリダィゼーション解析または夕ーゲッティングベクター 上の DNA配列と、 ターゲッティングベクタ一に使用したマウス由来の本発明の DNA以外 の近^ 域の D N A配列とをプライマ一とした P C R法による ffで判 ることができる 。 非ヒト哺 ¾1¾物麟細胞を用いた^^は、 遺 β÷相同繊えにより、 本発明の DNAカ坏 活性化された細胞株をクロ一ニングし、 その細胞を適当な時期、 例えば、 8細謹の非ヒト 哺¾¾物胚また に ¾λし、 作製したキメラ胚を偽妊娠させた該非ヒト哺 物の子 宮に移 ¾ "る。 作出された動物《ΙΕ常な本発明の DNA座をもつ細胞と人為的に変異した本 発明の DN A座をもつ細胞との両者から構成されるキメラ動物である。
該キメラ動物の生殖細胞の一部が 異した本発明の DNA座をもつ場合、 このようなキメ ラ個体と正常個体を することにより得られた個«より、 全ての繊が人為的に変異を 加えた本発明の DN A座をもつ細胞で構成された個体を、 例えば、 コ一トカラ一の判定等に より SgiJすることにより得られる。 このようにして得られた 1@ ：は、 通常、 本発明のポリべ プチドのヘテロ発現不全 »であり、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白 質のへテロ発現不全個体同志を ¾@Hし、 それらの産仔から本発明のポリべプチドまた 発 明のレセプ夕一蛋白質のホモ発現不全個体を得ることが きる。
卵細胞を翻する齢は、 例えば、 卵細胞核内にマイクロインジェクション法で DN A溶 液を ¾λすることにより夕一ゲッティングべク夕一を染色体内に導入したトランスジェニッ ク非ヒト哺 物を得ることが き、 これらのトランスジエニック非ヒト哺 ¾ί¾物に比べて 、 遣 β?相同 えにより本発明の DNA座に変異のあるものを選択することにより得られ る。
このようにして本発明の DNAがノックァゥトされている鍵は、 ¾@Ξにより得られた動 β体も該 DNAがノックァゥトされていることを確認して通常の飼育^^で飼 代を行 なうことができる。
さらに、 生殖系列の取 ょび膽についても常法に従えばよい。 T¾わち、 該; TO化 D NAの保 る «の動物を 3¾することにより、 該^ ¾化 DNAを相同染色体の両方に持 つホモザィゴ一ト動物を取得しうる。 得られたホモザィゴート動物は、 物に対して、 正常個体 1， ホモザィゴート複数になるような t態で飼貧することにより効率的に得ること が きる。 ヘテロザィゴ一ト動物の纖を することにより、 該 TO化 DNAを るホ モザィゴ一トおよびへテロザィゴート動物を 代する。
本発明の DNA力 ¾性化された非ヒト Of?U¾物胚幹細胞は、 本発明の DNA発現不全非 ヒト哺 ¾«J物を作出する上で、 非常に有用である。 また、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺 物は、 本発明のポリペプチドまた〖»発明の レセプ夕一蛋白質により誘導され得る種々の生物活性を欠失するため、 本発明のポリぺプチ ドまた 発明のレセプ夕一蛋白質の生 ¾¾性の^ ¾性化を原因とする^^のモデルとなり 得るので、 これらの の原因究明及 Ό¾薪去の検討に有用である。
(8 a) 本発明の DNAの欠損や損傷などに起因する疾病に対して治療 ·予防効果を有する 化合物のスクリーニング方法
本発明の DNA発現不全非ヒト哺 ¾ί¾物は、 本発明の DN Aの欠損や損傷などに起因する 鋪に対して治療 ·予隱果を る化合物のスクリーニングに用いることが きる。 すなわち、 本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺学 L»j物に 化合物を投与し、 該 動物の変化を瞧'測 ることを難とする、 本発明の DNAの欠損や損傷などに起因す る疾病に対して治療 ·予 カ果を有する化合物またはその塩のスクリーニング方法を提供す る。
該スクリ一ニング方法において用いられる本発明の DNA発現不全非ヒト哺 物として は、 鎌己と同様のものがあげられる。
試験化合物としては、 例えば、 ペプチド、 タンパク、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵^ ¾物、 細胞抽出液、 植棚出液、 動物糸職抽出液、 血漿などがあげられ これら化合 物は新規な化合物であってもよいし、 公知の化合物であってもよい。
具体的には、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺 物を、 化合物で処理し、 無処理の 対 β物と比較し、 1¾¾物の各器官、 ^^の症状などの変化を として 化合物 の治療 ·予 β¾¾果を Ml ^することができる。
物を賺化合物で処理する方法としては、 例えば、 経口投与、 静脈 ft などが用い られ 物の症状、 薩匕合物の性質などにあわせて ffil択す
ることができる。 また、 試験化合物の投与量は、 投与方法、 纖化合物の性質などにあわせ て 択すること力 きる。
例えば、 高 ώϋΞ、 自己赚疾患、 全、 白内障、 緑内障、 急 ttnクテリア赚炎， 急性 心筋梗塞， 急倒萃炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸碰症麵， アルコール隨炎， ァルツ ハイマ一病， 喘息， 動脈硬化， アトピー 炎， ノ クテリア肺炎， 膀 ん， 骨折， 乳が ん， 過食症， 多嫉， 火傷治癒， 子宮頸部がん， 慢性リンパ性白血病， 慢性骨髄性白血病， 萃炎， 肝硬変， がん （結腸 Ζ直腸がん） ， クローン病， 痴呆， 糖尿病性合併症， 糖 尿病性腎症， .m mm, 糖尿病 膜症， 胃炎， ヘリコバクタ一'ピロリ感 ¾¾， 肝不全， AsiF炎， 炎， c¾fF炎， 肝炎， 単純へルぺスウィルス感 ¾¾， 7 mm 疹ウィルス感¾& ホジキン病， エイズ感赚， ヒトパピローマウィルス感¾& 高カルシ ゥム血症， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， 感染症， インフルエンザ 感¾¾, インシュリン依存性糖尿病 （I型） ， »性ブドウ状球菌感 ¾¾， 悪 ffi fim, が ん転移， 多発性骨醒， アレルギー性鼻炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシュリン非 依存性糖尿病 （I I型） ， 非小細 »がん， m ^ , 骨関節炎， 骨軟化症， 骨減少症， 骨粗 鬆症， 卵巣がん， 骨ベーチェット病， 消化性潰瘍， 末梢血管疾患， 前 idiがん， 逆流性^! 炎， 腎不全， リウマチ関節炎， 精神分 ， «症， 馳症ショック， 重症全身性真菌感染 症， 小細賺がん， 麵損傷， 胃がん， 全身性エリテマト一サス， -- m st ^, 繊 ' 膜症， 血管 ¾ /多発梗麵呆， 創傷治癒， 跪 関節炎、 下雖ホルモン分泌不全 、 瀕尿、 尿毒症、 または 等に対して治療'予防効果を有する化合物、 または
MACULAR EDEMA CYSTOID (¾S機斑浮 B) に対して治療.予 果を る化合物、 さら には、
( 1 ) 先端巨大症、 T SH産 4β、 非分泌性 翻能 下垂体腫瘍、 異所性 ACTH ( アドレノコルチコトロピン）
Figure imgf000094_0001
グルカゴン産 瘍、 ガストリン産 4J»S、 インスリノーマ、 カルチノイドなどの藤の治纏、 ( 2) イン スリン依存性または非依存性糖尿病、 あるいはこれら糖尿病に関連した種々の疾€、 T¾わ ち糖尿病合併症 （例、 糖尿病 14«症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性痛 1»、 ド―ン症婦、 性低 ifilffi症など） の治療薬、 ( 3) 高インスリン血症の改善または食欲の抑制などによ る肥満、 過食症などの治麟、 （4) 急 ffl!萃炎、 慢 ¾|萃炎、 膝臓.腸フィステル、 出血體 瘍、 消化性潰瘍、 胃炎、 胃翻多症、 逆流性鍾炎などの治麟、 ( 5) へリコパク夕一' ピロリ菌感染に伴う様々な症状の改善剤 （例、 ガストリン分泌昂進の抑制剤など） 、 (6) 内 萃管造影に伴うァミラ一ゼの分泌 制剤、 さらには M^f Wの予後治^^ ( 7 ) 小腸の吸収能低下、 分泌昂進または消化管の翻能異常に起因する下痢 （例、 S h o r t b owe 1症候群など） 、 癌化学療法などの薬物に起因する下痢、 先天性小腸萎縮に 起因する下痢、 V I P産生腫瘍などの «内分泌 J»に起因する下痢、 A I D Sに起因する 下痢、 骨髄移植などに伴う対宿主移植片反応に起因する下痢、 糖尿病に起因する下痢、 腹腔 断に起因する下痢、 全身性硬化症に起因する下痢、 好酸球増加症に起因する下痢な どの治 «、 (8) ダンピング症»、 過敏 feyi炎、 クローン病、 炎症 "»疾患などの治 纏、 (9)鹏または癌（例、 甲嫌癌、 ws、 乳癌、 . 小細 ws、 非小細 m, 降赚、 胃癌、 胆管癌、 m 、 膀腿、 卵髓、 メラノーマ、 骨肉腫、 軟骨肉腫 、 悪性褐色钿麵、 謹、 ^mm. 胸顧、 腎麵など） 、 白血病 （例、 好驢性 白血球の白血病 ·慢性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン性リン パ腫など） などの治麟；該治麟は、 職または他の制細（例、 夕モキシフェン、 LH RHァゴニスト、 LHRHアン夕ゴニスト、 インタ一フエロン一 α、 ；3および r、 インタ一 ロイキン一 2など） と併用して用いることが、できる、 （1 0) 性心筋症、 動脈硬化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 讓應 後の心籠塞） 、 再血管形成の予防 -治 «、 （1 1 ) «静瞧出血、 変、 末梢血管 患の治麟、 ( 1 2) 髓系に作用す る生理活性物質 （例、 サブスタンス P、 夕ヒキニン、 サイト力インなど） の分泌の調節作用 に基づき、 例えば、 全身性または局所性の炎症に伴う疾患 （例、 多発'醜験、 リュウマチ 性関節炎、 乾せん、 日焼け、 赚、 アレルギー （例、 喘息、 アトピー驗膚炎、 アレルギー 性鼻炎など） など） の治麟、 ( 1 3 ) 纖調節因子の産生 '分泌に を及ぼすことから 、 例えば、 痴呆症 （例、 アルツハイマー病、 アルツハイマー型老^^痴呆、 血管性'多発性 痴呆など） 、 精神分 s¾g、 てんかん、 うつ病、 不安 、 mm . 多発性硬化症など の治纏、 (14) (例、 緑内障など） などの治藤、 (1 5)急 a クテリア體 炎、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸舰症 ί辦、 ノ クテリア肺炎、 重症全身性真菌感 、 結 核、 舗損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコ―リ 炎、 Α騰炎、 B藤炎、 C藤炎、 A I D S感 、 ヒトパピ口一マウィルス感»、 インフルエンザ感赚、 蔽移、 多発性 骨醒、 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨べ一チェット症、 腎炎、 腎不全、 麵症、 麵症ショ ック、 高カルシウム血症、 高コレステロール血症、 高グリセリド血症、 高脂血症、 全身性ェ リテマトーサス、 一過 Wl lfil発作、 アルコール性肝炎などの予防'治療薬として有用であ り、 （1 6) m ^ . 火傷、 創傷、 脱毛症などの治癒などにも用いられ、 （ι 7) 撤ぁ るい 急' 痛 （例、 , 炎症倾痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ、 骨粗 鬆症など） にともなう の抑制 ·織口など、 ^^等をスクリーニングする齢、 本発 明の DNA発現不全非ヒト哺乳動物に,荷処置を行ない、 糖負荷処置前または処置後に試 験化合物を投与し、 藤物の血糖値およ 化などを経霸に根 y^ る。
該スクリーニング方法において、 物に識化合物を投与した齢、 物の血 糖値が約 1 0 %以上、 好ましく 勺 3 0 より好ましく ¾勺 5 0 %以上低下した ¾^
、 ^^化合物を上記の疾患に対して治療 ·予 Mi果を る化合物として選択することが できる。
該スクリーニング方法を用いて得られる化合物は、 上記した麵匕合物から選ばれた化合 物であり、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の欠損や損傷などによつ て引き起こされる疾患に対して治療 ·予 1¾¾果を るので、 ¾^患に対する で ^性 な治療'予防剤などの医薬として することができる。 さらに、 上記スクリーニング 辱 られた化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリーニング方法で得られた化合物《 ^を形成していてもよぐ 該化合物の塩として は、 生理^ ¾に許容される酸 （例、 纖酸、 有機酸など） や ¾S (例、 アルカリ^ など） などとの塩が用いられ、 とりわけ生理^に許容される酸働 Π塩が好ましい。 この様な塩と しては、 例えば、 嫌酸 （例えば、 Ά リン酸、 は素酸、 藤など） との塩、 あるい は有機酸 （例えば、 赚、 キ 、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 mm. 、 クェン酸、 リンコ 、 難、 安息碰、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） と の塩など力 s用いられる。
該スクリーニング方法で得られた化合物またはその塩を含 #Tる医薬は、 編己した本発明 のポリぺプチドを含 する医薬と同様にして ® すること力 ?きる。 このようにして得られる製剤は、 娃で fg¾性であるので、 例えば、 ヒトまたは哺孚 L«j物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ 、 サルなど） に対して投与することができる。
該化合物またはその塩の投与量は、 文橡疾患、 投与舰、 投与ルートなどにより差異はあ るが、 例えば、 該化合物を経口投与する齢、 的に成人 （体重 6 0 k gとして） におい ては、一日につき該化合物を約 0. 1〜； L 0 0 mg、好ましく【お勺 1 . 0〜5 0mg、 より好 ましく〖お勺 1 . 0〜2 0 mg投与する。 非経口的に投与する齢は、 該化合物の 1回投与量 は投与嫌、 文橡疾患などによっても異なるが、 例えば、 該化合物を腿剤の形で通常成人 ( 6 0 k gとして） に投与する場合、 一日につき該化合物を約 0. 0 1 ~ 3 0 mg程度、 好 ましく〖¾勺 0. l〜2 0mg離、 より好ましくは約 0. 1〜1 Omg雖を静脈龍によ り投与するのが好都合である。 他の動物の^ &も、 6 0 k g当たりに購した量を投与する ことができる。
( 8 b) 本発明の DNAに対するプロモーターの活性を碰または阻 #Tる化合物をスクリ —ニング方法
本発明は、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺学 L»物に、 纖化合物を投与し、 レポ一夕一 遣 ί&ΐの発現を検出することを とする本発明の DNAに対するプロモータ一の活性を促 進または阻 ¾Τる化合物またはその塩のスクリ一ニング方法を提供する。
上記スクリーニング方法において、 本発明の DN Α発現不全非ヒト嚼 L»物としては、 前 記した本発明の DNA発現不全非ヒト哺 ¾¾]物の中でも、 本発明の DN Aがレポ一夕一遺伝 子を導入することにより ¾性化され 該レポ一夕一遺 が本発明の DN Aに対するプロ モーターの制御 TFで発現しうるものか'用いられる。
匕合物としては、 Ml己と同様のものがあげられる。
レポ一夕一遺伝子としては、 tfil己と同様のものが用いられ 3—ガラクトシダーゼ ¾ί¾Τ ( 1 a c Z) 、 可溶性アルカリフォスファタ一ゼ¾伝子またはルシフェラーゼ遺 などが 好適である。
本発明の DN Αをレポ一夕一遺^ Fで置換された本発明の D Ν Α発現不全非ヒ卜哺¾»物 では、 レポーター遺 が本発明の DNAに対するプロモータ一の¾5 ^こ ί¾~Τるので、 レポーター遺 がコードする物質の発現をトレースすることにより、 プロモータ一の活性 を検出することができる。
例えば、 本発明のポリべプチドまたは本発明のレセプター蛋白質をコードする DNA領域 の一部を大腸菌由来の3—ガラクトシダーゼ 伝子 （ 1 a c Ζ) で置換している場合、 本来 、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の発現する組織で、 本発明のポリ ぺプチドまたは本発明のレセプター蛋白質の代わりに3—ガラクトシダーゼが発現する。 従 つて、 例えば、 5—ブロモ一4一クロロー 3—インドリル _ )3—ガラクトピラノシド （X— g a l ) のような ]3—ガラクトシダーゼの基質となる試薬を用いて染色することにより、 簡 便に本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の動物生体内における発現状態 を観察することができる。 具体的には、 本発明のポリペプチドまたは本発明のレセプター蛋 白質欠損マウスまたはその^ a¾o片をダルタルアルデヒドなどで固定し、 リン隨衝生理食 m (P B S) で洗浄後、 X- g a 1を含む染色 ITC、 室温または 3 7で付近で、 約 3 0分 ないし 1時間反応させた後、 M 本を I mM EDTAZP B SW 洗浄することによ つて、 /3 -ガラクトシダ一ゼ反応を停止させ、 呈色を^ Tればよい。 また、 常法に従い、 1 a c Zをコードする mRNAを検出してもよい。
上記スクリーニング方法を用いて得られる化合物またはその塩は、 上記した識化合物か ら選ばれた化合物であり、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を鍵または阻 ¾Tる 化合物である。
該スクリーニング方法で得られた化合物〖 を形成していてもよぐ 該化合物の塩として は、 生理学的に許容される酸 （例、 道酸など） や腿 （例、 有機酸など） などとの塩が用 いられ、 とりわけ生理^ ¾に許容される酸 ¾口塩が好ましい。 この様な塩としては、 例えば
、 m (例えば、 麵、 リン酸、 臭 ίは素酸、 鍾など） との塩、 あるいは有機酸 （例え ば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コハク酸、 s«、 クェン酸、 リ ンゴ 、 鍵、 安息碰、 メタンスルホン酸、 ベンゼンスルホン酸など） との塩などが用い られる。 本発明の DNAに対するプロモーター活性を促進または阻害する化合物またはその塩は、 本発明のポリべプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質の発現を促進または阻害し、 該ポリ ぺプチドまたはレセプター蛋白質の機能を iStまたは阻 Tること力できるので、 例えば、 高舰、 自己赚疾患、 ^^全、 白内障、 緑内障、 急 Ι4 クテリア藤炎， 急性心筋梗塞， 急鹏炎， 急性ウィルス脳炎， 成人呼吸 症丽， アルコール賺炎， アルツハイマー病
， 喘息， 動脈硬化， アトピー性皮膚炎， ノ クテリア肺炎，
Figure imgf000099_0001
骨折， 乳がん， ， 多食症， 火傷治癒， 子宮頸部がん， 慢性リンパ性白血病， 慢性骨髄性白血病， 慢 ffl萃炎， 麵変， がん （結腸 z直腸がん）， クローン病， 痴呆， 糖尿病性合併症， 糖尿病性腎症 , 糖尿病性籠 β， 糖尿病'隨膜症， 胃炎， へリコパクター 'ピロリ感離， 肝不全， A 藤炎， Β»炎， c»炎， 肝炎， 単純へルぺスウィルス感 ¾¾， 水鎌状 »ウィルス 感染症， ホジキン病， エイズ感染症， ヒトパピローマウィルス感染症， 高カルシウム血症， 高コレステロール血症， 高グリセリド血症， 高脂血症， 感赚， インフルエンザ感離， ィ ンシュリン依存性糖尿病 （I型） ， 纖性ブドウ状球菌感難， , がん転移， 多 骨 β, アレルギー性鼻炎， 腎炎， 非ホジキン性リンパ腫， インシュリン非依存性糖尿 病 （I I型） ， 非小細誰がん， mm^ , 骨関節炎， 骨軟化症， 骨減少症， 骨繊症， 卵巣 がん， 骨ベーチェット病， 消化性潰瘍， 末梢血管疾患， 前 がん， 逆流性:^！炎， 腎不全
， リウマチ関節炎， 精神 ^¾， 馳症， 症ショック， 重症全身髓菌感 «， 小細胞 肺がん， 損傷， 胃がん， 全身性エリテマト一サス， ·Η1'Ι«»発作， ι^, 心弁膜症 ， 血管性 z多発梗 呆， 創傷治癒， 不 関節炎、 下垂体ホルモン分泌不全、 , 尿 毒症、 または神 «成疾患等の疾病に対する で ig§性な治療 .予防剤などの医薬として 有用である。
また、 本発明の DN Aに対するプロモーター活性を鐘または阻 "る化合物またはその 塩は、 MACULAR EDEMA CYST0ID (纖職斑浮 ® に対する で請性な治療.予防剤など の医薬として有用である。
さらに、 本発明の DN Aに対するプロモータ一活性を纖または阻 Tる化合物またはその 塩は、 ( 1 ) 先端巨大症、 T S H産继瘍、 非分泌性 （棚能 '1© 下垂体鹏、 異所性 AC TH. (アドレノコルチコトロピン） 産 瘍、 髄様甲状腺癌、 V I P¾4J» グルカゴン 産生 «、 ガス卜リン産生 «、 インスリノ一マ、 カルチノイドなどの腫塞の治療薬、 (2 ) インスリン依存性または非依存性糖尿病、 あるいはこれら糖尿病に関連した種々の疾患、 すなわち糖尿病合併症 （例、 糖尿病翻膜症、 糖尿病性腎症、 糖尿病性擺隨、 ドーン症 候群、 性低 ώϋ£症など） の治療薬、 ( 3) 高インスリン血症の改善または食欲の抑制な どによる肥満、 過食症などの治纏、 （4) 急 ¾3萃炎、 慢' 14B萃炎、 膝臓 '腸フィステル、 出 血髓瘍、 消化髓瘍、 胃炎、 胃麵多症、 逆流性:^ I炎などの治麟、 ( 5) へリコパク 夕一 ·ピロリ菌感染に伴う様々な症状の改善剤 （例、 ガストリン分泌昂進の抑制剤など） 、 (6) 内 ¾ BSI 管 に伴うアミラーゼの分泌抑制剤、 さらに〖¾?H ^f Wiの予後治 纏、 ( 7) 小腸の吸収能低下、 分泌昂進または消化管の纖能異常に起因する下痢 （例、 S h o r t b owe 1症 «など） 、 癌化学療法などの »1に起因する下痢、 先天性小腸 ■に起因する下痢、 V I P産生 ®¾|などの神経内分泌腫瘍に起因する下痢、 A I D Sに起 因する下痴、 骨 »植などに伴う^ it主移植片 に起因する下痴、 糖尿病に起因する下荆 、 断に起因する下痢、 全身性硬化症に起因する下痢、 加症に起因する 下痢などの治療薬、 (8) ダンピング症 、 過敏性大腸炎、 クローン病、 炎症 141疾¾な どの治 、 o)
Figure imgf000100_0001
非小細 ws、 s萃隨、 胃癌、 胆管癌、 m , 膀舰、 卵巣癌、 メラノ一マ、 骨肉腫、 軟 骨肉腫、 悪性褐色細謹、 wrnm^rn, m, 胸疆、 腎 i^sなど） 、 白血病 （例、 好 性白血球の白血病 ·慢性リンパ性白血病、 慢性骨髄性白血病、 ホジキン病、 非ホジキン 性リンパ腫など） などの治麟；該治藤は、 職または他の制翻 （例、 夕モキシフェン
、 LHRHァゴニスト、 LHRHアン夕ゴニスト、 インターフェロン一 a、 i3およびァ、 ィ ンターロイキン一 2など） と併用して用いることができる、 （1 0 ) 肥大性 、筋症、 動脈硬 化症、 心弁膜症、 心筋梗塞 （特に、 脈形 術後の心簾塞） 、 再血管形成の予 防'治療薬、 （1 1 ) 食道静脈癌出血、 肝硬変、 末梢血管疾患の治療薬、 ( 1 2 ) 免疫系に 作用する生理活性物質 （例、 サブスタンス Ρ、 夕ヒキニン、 サイト力インなど） の分泌の調 節作用に基づき、 例えば、 全身性または局所性の炎症に伴う疾患 （例、 多発性動脈炎、 リュ ゥマ 関節炎、 乾せん、 日焼け、 酵、 アレルギー （例、 喘息、 アトピー'敝膚炎、 ァレ ルギー性鼻炎など） など） の治麟、 （1 3 ) 撫調節因子の産生 ·分泌に影響を及ぼすこ と力ら、 例えば、 痴呆症 （例、 アルツハイマー病、 アルツハイマー型老棚痴呆、 血管性- 多発'議呆など） 、 精神分 «、 てんかん、 うつ病、 ~ ^不安轄、 m m, 多発性硬化 症などの治藤、 ( 1 4) (例、 緑内障など） などの治驗、 ( 1 5) 急' Ι4Λクテリ ァ醒炎、 急性ウィルス脳炎、 成人呼吸碰症爾、 バクテリア肺炎、 重症全身 'ΙίΛ菌感染 症、 離、 舗損傷、 骨折、 肝不全、 肺炎、 アルコール隱炎、 Α酶炎、 B藤炎、 c型 肝炎、 A I D S感雖、 ヒトパピローマウィルス感離、 インフルエンザ感 ¾¾、 繊移、 多発性骨 J 、 骨軟化症、 骨粗しょう症、 骨ベーチェット症、 腎炎、 腎不全、 ¾0&L症、 ½ifil 症ショック、 高カルシウム血症、 高コレステロール血症、 高グリセリド血症、 髙脂血症、 全 身性ェリテマトーサス、 一過性脳) l発作、 アルコール性肝炎などの予防 ·治療薬として有 用であり、 （1 6) 植、 火傷、 創傷、 脱毛症などの治癒などにも用いられ （1 7) 徹あるいは急 (例、 術麟痛、 炎症髓痛、 歯痛、 骨疾患 （例、 関節炎、 リウマチ 、 骨 »症など） にともなう疼痛） の抑制 · »など、 ^^等の赫に対する で ίδ* 性な治療'予防剤などの医薬として有用である。 さらに、 上記スクリーニングで得られた 化合物から誘導される化合物も同様に用いることができる。
該スクリ一二ング方法で得られた化合物またはその塩を含 る医薬は、 編己した本発明 のポリぺプチドまたはその塩を含^"る医薬と同様にして ¾5gすることができる。
このようにして得られる誦は、 で «性であるので、 例えば、 ヒトまたは哺? L«j物 (例えば、 ラット、 マウス、 モルモット、 ゥサギ、 ヒッジ、 ブ夕、 ゥシ、 ゥマ、 ネコ、 ィヌ 、 サルなど） に対して投与すること力できる。
該化合物またはその塩の投与量は、 雕疾患、 投与雕、 投与ルートなどにより差異はあ るが、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモータ一活性を鍵する化合物を経口投与する &、 的に成人（体重 6 O k gとして） においては、一日につき該化合物を約 0. ：!〜 1 O Omg、 好ましく ίお勺 1. 0〜5 Omg、 より好ましく ίお勺 1. 0〜2 0mg投与する。 非経口的に投与する齢は、 該化合物の 1回投与量 与通、 橡疾患などによっても異 なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモーター活性を碰する化合物を ft^剤の形 で通常成人 （ 6 0 k gとして） に投与する 、 一日につき該化合物を約 0 · 0 1〜 3 0 m g驗、 好ましく【お勺 0. l ~ 2 0mgS¾、 より好ましくは钓 0. 1〜： L Omggmを静 脈 ftWにより投与するのが好都合である。 他の動物の^ &も、 6 0 k g当たりに騰した量 を投与すること力 さる。
一方、 例えば、 本発明の DN Aに対するプロモータ一活性を阻針る化合物を経口投与す る齢、 "^的に成人（体重 6 0 k gとして） においては、一日につき該化合物を約 0. 1〜 1 0 0mg、 好ましくお勺 1. 0〜5 0mg、 より好ましく «勺 1. 0〜2 Omg投与する 。 非経口的に投与する齢は、 該化合物の 1回投与量は投与媳、 舰疾患などによっても 異なるが、 例えば、 本発明の DNAに対するプロモー夕一活性を阻 *Tる化合物を ait剤の 形で通常成人 （6 O k として） に投与する 、 一日につき該化合物を約 0. 0 1〜3 0 mgn . 好ましく《勺 0. ：!〜 2 Omg驗、 より好ましくは約 0. 1〜： L Omgg^を 静脈注射により投与するのが好都合である。 他の動物の場合も、 6 0 k g当たりに麟した 量を投与すること力 きる。
このように、 本発明の DNA発現不全非ヒト哺? L»J物は、 本発明の DN Aに対するプロモ 一夕一の活性を促進または阻害する化合物またはその塩をスクリ一ニングする上で極めて有 用であり、 本発明の DN A発現不全に起因する各種疾患の原因究明または予防 ·治療薬の開 発に大きく貢献することができる。
また、 本発明のポリぺプチドまたは本発明のレセプ夕一蛋白質のプロモーター領域を含有 する DNAを使って、 その下流に種々のタンパクをコードする遺^?を連結し、 これを動物 の卵細胞に ¾λしていわゆるトランスジエニック動物 （遺 移 λ¾物） を作 れば、 特 異的にそのポリぺプチドまたは蛋白質を合成させ、 その生体での作用を検討することも可能 となる。 さらに上記プロモーター部分に適当なレポ一夕遺 を結合させ、 これが発現する ような細胞株を樹立すれば、 本発明のポリぺプチドまた〖鉢発明のレセプ夕一蛋白質そのも のの体内での産生能力を特異的に促進もしく〖ま抑制する作用を持つ低^?化合物の探索系と して使用できる。 WO 00/29441 jQj PCT/JP99/06283
(9) 発明のポリペプチドに対する受容体の同定
本発明のポリぺプチドに対する受容体は次のようにして同定すること力^きる。 生理活性 ぺプチドの受容体の多くは 7回膜貫通型受容体であり、 現在リガンドが未知の多くのォ一フ アン受容体が報告されている。 従って、 これらのォーファン受容体を CH0細胞や HEK293細 胞など適当な細胞に発現させてそれらに本発明のポリペプチドを加えて、 特異的なシグナル 伝達を誘導するような細胞刺激活性を有するかどうかを調べることにより特異的な受容体を 同定することが きる。 またゲノムあるいは cDNA ライブラリーを適当な動物細胞に導入し てそれにラジオアイソトープを標識した本発明のポリぺプチドを加えてその結合を調べるこ とにより、 受容体をコードする遺 »を ·することができる。
さらに本発明は、 生理活性べプチドをコ一ドする遺 はしばしばぺプチドの配列モチー フカ镞り返されるという髓を禾 ϋ用して、 未知の生理活性ペプチドまたはそのアミドもしく はそのエステルまたはそれらの塩を同 ¾fる方法、 および! ^法によって得られた生理活性 ぺプチドまたはそのァミドもしくはそのエステルまたはそれらの塩なども提供する。
生理活性べプチドの る配列モチーフとして、具体的には、例えば R F amide, R S amide 、または RL amide構造を る本発明のポリべプチドの難的な配列である RFG(R/K)配列 または RSG(R/K)配列または RLG(R/K)配列または該アミノ酸配列をコードする塩基配列など があげられる。 このような短いアミノ醒列をコ一ドしうる DNA配列は生理活性べプチドの DNA配列 でも偶然的にかなりの で出現してくる力、 このような配列が り返してレ ることを特徴とする配列を探すことによりより高い確率で生理活性ペプチドをコードする DNAを見出すこと力 ?きる。
より具体的には、 RFG (R/K)配列または RSG (R/K)配列または RLG (K/R)配列または該ァミノ 列を含 る配列およびそれををコ一ドする：^配列を含^ る配列をプローブとして データベースの をすることにより目的とする遺 を取得することが Tきる。 該プロー ブとしては、 例えば、 ペプチドの配列として RFG(K/R)、 RSG (K/R)、 RLG (K/R)に対応する DNA の配列として、
RFGK: 5'- (C/A) G (A/C/G/T) TT (T/C) GG (A/C/G/T) AA (A/G) -3' (配列番号： 2 0) RFGR: 5'- (C/A) G (A/C/G/T) TT (T/C) GG (A/C/G/T) (A/C) G (A/C/G/T) -3' (配列番号： 21) RSGK: 5'- (C/A) G (A/C/G/T) (A/T) (C/G) (A/C/G/T) GG (A/C/G/T) M(A/G)- 3' (配列番号： 22) RSGR: 5'- (C/A) G (A/C/G/T) (A/T) (C/G) (A/C/G/T) GG (A/C/G/T) (A/C) G (A/C/G/T) -3' (配列番号： 23)
RLGK： 5'- (C/A) G (A/C/G/T) (T/C) T (A/C/T/G) GG (A/C/G/T) AA (A/G) -3' (配列番号： 24)
RLGR: 5'- (C/A) G (A/C/G/T) (T/C) T (A/C/T/G) GG (A/C/G/T) (A/C) G (A/C/G/T) -3' (配列番号： 2 5) などがあげられる。
さらに、 該配列モチーフを用いて cDNAあるいはゲノムライブラリーをスクリーニングす ることにより目的とする遺伝チを取得することもできる。 またジーントラッパ一のように上 記プローブを使つて目的の遺 の mR Aを精製し、 その mRNAから cDNAを取得することも できる。 さらに他の配列モチーフ （繰り返して遺 »にコードされているアミノ薩列また は該ァミノ薩列をコードする 配列など） を用いて RF amide、 RS amideまたは RL amide構造 の生理活性ペプチドの同定にも使うことが きる。
さらに RF amide、 RS amideまたは RL amide構造を ¾ るペプチドはペプチドの C 側に RF amide、 RS amideまたは RL amide構造の共通構造を有しているので、 RF amide 、 RS amideまたは RL amide構造を含む抗体を使って、 未知の RF aiide、 RS amideま たは RL amide構造を有するペプチドを^^すること力河能である。 また、 RF amide、 R S amideまたは RL amide構造を るペプチドの受容体の多くは 7回隨醒受容体であ る。 従って、 抗 RF amide抗体、 抗 RS amide抗体また〖¾tRL amide抗体を使って灘ぁ るいは分画した動物組織抽出物をリガンドが決定していないォーファン受容体発現細胞に加 えて、 そのシグナル伝達を調べることにより、 ォ一ファン受容体のリガンドを決定すること が きる。 RF amide、. RS amideまたは RL amide構造を有するペプチド以外にも共通配 列を有するペプチドは数多く存在するので、 この方法は RF amide、 RS amideまたは RL amide構造を るべプチド のべプチドにも使うことができる。
(10) 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴニス卜） の決定
本発明のレセプ夕一蛋白質は、 本発明のレセプ夕一蛋白質またはその塩に対するリガンド (ァゴニスト） を聽し、 または決 ¾Tるための試薬として有用である。
すなわち、 本発明は、 本発明のレセプ夕一蛋白質と、 試験化合物とを接触させることを特 徴とする本発明のレセプター蛋白質に対するリガンドの決 法を撒する。
試験化合物としては、 公知のリガンド （例えば、 アンギオテンシン、 ボンべシン、 力ナビ ノイド、 コレシストキニン、 グレ夕ミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニューロペプチド Υ、 ォピオイド、 プリン、 バソプレツシン、 ォキシトシン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴ ン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VIP (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポ リペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGR P (カルシトニンジーンリレ一ティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン 、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 ひおよび /3—ケモカ イン （chemokine) (例えば、 IL— 8、 GROひ、 GRO^, GR〇ァ、 NAP— 2、 EN A— 78、 PF4、 IP10、 GCP— 2、 MCP— 1、 HC14、 MCP— 3、 I一 30 9、 MI P 1 a, MI P— 1)3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン 、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ夕イドまたはガラ ニンなど） の他に、 例えば、 ヒトまたは哺学 Li¾物 （例えば、 マウス、 ラット、 ブ夕、 ゥシ、 ヒッジ、 サルなど） の 出物、 細胞培養上清などが用いられる。 例えば、 識職抽出物 、 細胞培養上清などを本発明のレセプ夕一蛋白質に添加し、 細麟艇性などを測定しなが ら分画し、 に単一のリガンドを得ることができる。
具体的には、 本発明のリガンド決定方法は、 本発明の本発明のレセプ夕一蛋白質を用いる か、 また え型レセプ夕一蛋白質の発現系を構築し、 M¾現系を用いたレセプ夕一 アツセィ系を用いることによって、 本発明のレセプ夕一蛋白質に結合して細胞刺激活性 （例 えば、 ァラキドン ¾β、 アセチルコリン薩、 細胞内 Ca2+聽、 細胞内 cAMP«、 細胞内 cGMP 、 イノシト一ルリン随生、 細謹電位麵、 細胞内蛋白質のリン酸化 、 c— f os活性化、 pHの低下などを する活性または抑制する活 ft) を有する化合物 (例えば、 ペプチド、 蛋白質、 非ペプチド性化合物、 合成化合物、 発酵 4¾物など） または その塩を決 る方法である。
本発明のリガンド決定方法においては、 本発明のレセプター蛋白質と試験化合物とを接触 させた齢の、 例えば、 該本発明のレセプ夕一蛋白質に対する 化合物の結^ »、 細胞 朿 ι 活性などを測 ¾ "することを とする。
より具体的には、 本発明は、
¾した ^化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質に擁させた:^における、 標識した 織化合物の該蛋白質に対する結^ *を測 ることを纖とする本発明のレセプ夕一蛋白 質に対するリガンドの決 法、
した 匕合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含 る細胞または 胞の «分 に搬させた における、 した麵化合物の讓胞または ¾β分に対する結^ *を 測定することを特徴とする本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決定方法、 @¾した隨匕合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコ一ドする DNAを含 る形質転 換体を培養することによって細胞膜上に発現したレセプター蛋白質に接触させた場合におけ る、 した難化合物の該レセプター蛋白質に対する^ fiを測定しすることを赚とす る本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決定方法、
@¾化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含貧する細胞に接触させた場合における、 レ セプタ一蛋白質を介した細赫嗷活性 （例えば、 ァラキドン^ m、 アセチルコリン難、 細胞内 C a 2 +画、 細胞内 C AM P生成、 細胞内 c GMP生成、 イノシトールリン 生、 細胞膜電位 β、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— i o sの活性化、 p Hの低下などを促進す る活性また 制する活性など） を測 ることを,とする本発明のレセプ夕一蛋白質に 対するリガンドの決定方法、 および
化合物を、 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNAを含 る形質 体を培 養することによつ 謹上に発現したレセプ夕一蛋白質に機させた における、 レセ プター蛋白質を介する細鹏撤活性 （例えば、 ァラキドン^!、 アセチルコリン細、 細 胞内 C a 2+醒、 細胞内 c AMP生成、 細胞内 c GMP«、 イノシト一ルリン随生、 細 «電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c— f o sの活性化、 p Hの低下などを促進する 活性または抑制する活性など） を測 ることを [とする本発明のレセプター蛋白質に対 するリガンドの決定方法を提供する。
特に、 上言 の纖を行ない、 纖化合物が本発明のレセプ夕一蛋白質に するこ とを確認した後に、 上言 の試験を行なうことが好ましい。
まず、 リガンド決 法に用いるレセプ夕一蛋白質としては、 上記した本発明のレセプ夕 一蛋白質を含 るものであれば何れのものであってもよレが、 動物細胞を用レて大觀現 させたレセプター蛋白質が適している。
本発明のレセプ夕一蛋白質を製造するには、 前述の発現方法が用いられるが、 該レセプ夕 —蛋白質をコ一ドする DN Aを哺乳動物細胞や昆 細胞で発現することにより行なうことが 好ましい。 目的とする蛋白質部分をコードする D N A断片には、 通常、 相補 D NAが用いら れるが、 必ずしもこれに制約されるものではない。 例えば、 遺伝子断片や合成 DN Aを用い てもよい。 本発明のレセプ夕一蛋白質をコードする DNA断片を宿 物細胞に導入し、 そ れらを効率よく発現させるためには、 該 DNA断片を ¾を宿主とするバキュロウィルスに 属する核多角体病ウィルス （nuclear polyhedros is vi rus； N P V) のポリヘドリンプロモ 一夕一、 S V 4 0由来のプロモーター、 レトロウイルスのプロモーター、 メタ口チォネイン プロモ一夕一、 ヒトヒートショックプロモータ一、 サイトメガロウィルスプロモ一夕一、 S R aプロモーターなどの下流に組み込むのが好ましい。 発現したレセプターの量と質の はそれ自体^ Πの方法で行うことができる。 例えば、 CNambi, P. ら、 ザ 'ジャーナル •ォブ'バイオロジカル ·ケミストリ一 (J. Biol. Chen )，267巻, 19555〜19559頁, 1992 年〕 に記載の方法に従って行うこと力 きる。
したがって、 本発明のリガンド決 法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含 ¾ る ものとしては、 それ自体公知の方法に従って精製したレセプター蛋白質であってもよいし、 該レセプ夕ー蛋白質を含有する細胞またはその細胞 分を用いてもよい。
本発明のリガンド決定方法において、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞を用いる 齢、 翻胞をダルタルアルデヒド、 ホルマリンなどで固定化してもよい。 固定化方法はそ れ自体^]の方法に従って行なうことができる。 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞としては、 本発明のレセプ夕一蛋白質を発現し た宿細胞をいうが、 縮主細胞としては、 菌、 枯輔、 酵母、 ^ffl胞、 動物細胞な どが用いられる。
細 分としては、 細胞を破砕した後、 それ自体么^ 0の方法で得られる細«が多く含 まれる画分のことをいう。細胞の破砕方法としては、 Potter— Elvehjem型ホモジナイザーで 細胞を押し潰す方法、 ワーリンダブレンダーゃポリトロン （Kinemat ica社 による破砕、 超音波による破砕、 フレンチプレスなどで加圧しながら細胞を細いノズルから噴出させるこ とによる破砕などカ举げられる。 細謹の分画には、 分画遠心分難や密度勾隨心分 ϋ¾ などの遠心力による分画法が主として用いられる。 例えば、 細胞破謹を麵 ( 5 0 0 r p m~ 3 0 0 0 r pm) で鹏間 （通常、 約 1分〜 1 0分） 遠心し、 上清をさらに高速 ( 1 5 0 0 0 r pm〜3 0 0 0 0 r pm) で通常 3 0分〜 2時間遠心し、 得られる »を麵分と する。 該 分中には、 発現したレセプター蛋白質と細胞由来のリン^ «や膜蛋白質などの 分が多く含まれる。
該レセプ夕ー蛋白質を含 る細胞やその麵分中のレセプ夕一蛋白質の量は、 1細胞当 たり 1 0 3〜 1 08斤であるのが'好ましく、 1 0 5〜： 1 0 であるのが好適である。 なお 、 発現量が多いほど 分当たりのリガンド結合活性 （比活 カ墙くなり、 高感度なスク リーニング系の構築力河能になるばかりでなく、 同一ロッ卜で大量の試料を測定できるよう になる。
本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドを決 ¾Τる上記 ( ΧΙ Η)の方法を ¾Τるた めには、 適当なレセプ夕一蛋白質画分と、 標識した 化合物が必要である。
レセプ夕一蛋白質画分としては、 天然型のレセプター蛋白質画分か、 またはそれと同等の 活性を る纖ぇ型レセプター画分などが望ましい。 ここで、 同等の活性とは、 同等のリ ガンド結合活性、 シグナル ft報伝達作用などを示す。
標識した! ^化合物としては、 〔3H〕、 〔125 I〕 、 〔14C〕、 〔35 S〕 などで標識した アンギオテンシン、 ボンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 グルタミン、 セロトニ ン、 メラトニン、 ニューロペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 ノ ノプレツシン、 ォキシトシ ン、 PACAP、 セクレチン、 グルカゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス 夕チン、 GHRH、 CRF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VIP ひ ノアクティブ インテ スティナル アンド リイテッド ポリペプチド） 、 ソマトスタチン、 ドーパミン、 モチリ ン、 アミリン、 ブラジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パンクレアスタチン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン 、 アドレナリン、 αおよび /3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 IL一 8、 GR〇a、 G RO)3、 GRO了、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 IP10、 GCP— 2、 MCP- 1、 HC14、 MCP - 3、 1—309、 ΜΙΡ1α、 MIP - 1/3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレ ァティックポリべプ夕ィドまたはガラニンなどが ¾1である。
具体的には、 本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドの決 法を行なうには、 まず 本発明のレセプター蛋白質を含有する細胞また 細胞の自分を、 決定方法に適したバッフ ァ一に麵することによりレセプ夕一標品を調製する。 ノ ッファーには、 pH4〜10 (M ましくは pH6〜8) のリン^/ ソファー、 トリスー: ¾ / ソファ一などのリガンドとレセ プ夕ー蛋白質との結合を阻害しないバッファ一であればいずれでもよい。 また、 非特異的結 合を低減させる目的で、 CHAPS, Tween— 80™ ( 一アトラス ¾) 、 ジギトニ ン、 デォキシコレ一トなどの界面活' l^jゃゥシ血清アルブミンゃゼラチンなどの各種蛋白質 をバッファ一に加えることもできる。 さらに、 プロテアーゼによるリセプ夕一やリガンドの ^^を抑える目的で PMSF、 ロイぺプチン、 E— 64 (ペプチド研^ f¾) 、 ぺプス夕チ ンなどのプロテア一ゼ阻害剤を添 ttTすることもできる。 0.0 lml〜l Om 1 の該レセプ 夕一謹に、 一 (5000 c ρπ！〜 500000 c pm) の 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14 C〕 、 〔35S〕 などで した纖化合物を赌させる。 非特異的結^ * (NSB) を知る ために ±»Jの未標識の纖化合物を加えた反応チューブも用意する。 反応は約 0でから 5 Ot：、 望ましく 勺 4°Cから 37 :で、 約 20分から 24時間、 望ましく tt*勺 30分から 3 時間行なう。 反応後、 ガラス赚« ^で βし、 魔の同バッファーで洗浄した後、 ガラ ス に残存する放射活'性を?夜体シンチレーションカウンターあるいはァ一カウンター で計測する。 全結 (Β) から非特異的 (N S B) を引いたカウント （B— N S B ) が 0 c pmを越える試験化合物を本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンド （ァゴニス 卜） として選択することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質に対するリガンドを決定する上記の @^ Dの方法を ¾Sするた めには、 該レセプター蛋白質を介する細胞刺激活性 （例えば、 ァラキドン酸 «、 ァセチル コリン難、 細胞内 C a 2+画、 細胞内 c AMP 、 細胞内 c GMP 、 イノシトール リン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c一 f o sの活性化、 pHの低下 などを促進する活性または抑制する活性など） を の方法または市販の測定用キットを用 いて測 ¾Tることができる。 具体的には、 まず、 レセプ夕一蛋白質を含 ¾ る細胞をマルチ ゥエルプレート等に培養する。 リガンド決定を行なうにあたっては前もって新鮮な培地ある いは細胞に毒性を示さな 適当なバッファ一に し、 纖化合物などを添加して一定時間 インキュベートした後、 細胞を抽出あるいは上清液を回収して、 した産物をそれぞれの 方法に従って定量する。 細麟！！麵性の指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生 成が、 細胞が含 る^^素によって縦困難な は、 1¾ ^素に対する阻豁 jを添 加してアツセィを行なってもよい。 また、 c AMP産生抑制などの活性については、 フオル スコリンなどで細胞の 的産生量を増大させておいた細胞に対する m«制作用として検 出することができる。
本発明のレセプ夕一蛋白質に!^するリガンド決 キットは、 本発明のレセプ夕一蛋白 質、 本発明のレセプ夕一蛋白質を含有する細胞、 または本発明のレセプ夕一蛋白質を含有す る細胞の 分などを含有するものである。
本発明のリガンド決定用キッ卜の例としては、 次のもの力 げられる。
1. リガンド決定用試薬
細定用緩衝液およ 先浄用緩衝液
Hanks' Balanced Sal t Solut ion (ギブコ社製） に、 0. 0 5 %のゥシ血清アルブミン （シ グマ社 を加えたもの。
孔径 0. 4 5 mのフィル夕一で 滅菌し、 4でで保 Tるか、あるいは用時調製しても 良い。
② G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質標品
本発明のレセプター蛋白質を発現させた CHO細胞を、 12穴プレートに 5 X 105個 穴で継代し、 37で、 5%C〇2、 95 %a i rで 2日間培養したもの。
識試験化合物
市販の 〔3H〕 、 〔125I〕 、 〔14C〕 、 〔35S〕 などで標識した化合物、 または適当な方 法で標識化したもの
水溶液の状態のものを 4 あるいは一 20でにて保存し、 用時に測定用緩衝液にて; L / M に希釈する。 水に難溶性を示 ¾ ^化合物については、 ジメチルホルムアミド、 DMSO、 メタノール等に溶解する。
④隱麵匕合物
標識化合物と同じものを 100〜： L 000倍濃い に調製する。
2. 測定法
① 12穴 養用プレートにて培養した本発明のレセプター蛋白質発現 CHO細胞を、 測 定用緩衝液 1 m 1で 2回洗浄した後、 490^ 1の測定用緩衝液を各穴に加える。
(DSIi^化合物を5 X 1加え、 室温にて 1時間反応させる。 異的結合量を知るために は 識試験化合物を 5 1加えておく。
③反碰を Iteし、 1mlの洗浄用緩衝液で 3回洗浄する。 細胞に結合した標識試験化合物 を 0.2N Na〇H—l%SDSで溶解し、 4m 1の液体シンチレ一夕一 A (和光純薬 と混合する。 .
@¾体シンチレ一シヨンカウンタ一 （ベックマン を用いて放射活性を測定する。 本発明のレセプ夕一蛋白質に給することができるリガンドとしては、 例えば、 脳、 下垂 体、 勝臓などに特異的に "る物質などカ げられ、 具体的には、 アンギオテンシン、 ポ ンべシン、 カナピノイド、 コレシストキニン、 ク レ夕ミン、 セロトニン、 メラトニン、 ニュ 一口ペプチド Y、 ォピオイド、 プリン、 ノ ノブレツシン、 ォキシトシス PACAP、 セク レチン、 ダル力ゴン、 カルシトニン、 アドレノメジュリン、 ソマトス夕チン、 GHRH、 C RF、 ACTH、 GRP、 PTH、 VIP (バソアクティブ インテスティナル アンド リレイテッド ポリペプチド） 、 ソマトス夕チン、 ドーパミン、 モチリン、 アミリン、 ブラ ジキニン、 CGRP (カルシトニンジーンリレーティッドペプチド） 、 ロイコトリェン、 パ ンクレアス夕チン、 プロスタグランジン、 トロンボキサン、 アデノシン、 アドレナリン、 α および i3—ケモカイン （chemokine) (例えば、 IL— 8、 GR〇a、 GRO)3, GROァ、 NAP— 2、 ENA— 78、 PF4、 I P 10、 GCP - 2、 MCP— 1、 HC14、 MC P— 3、 1 -309、 MI PIひ、 MI P— 1)3、 RANTESなど） 、 エンドセリン、 ェ ンテロガストリン、 ヒスタミン、 ニューロテンシン、 TRH、 パンクレアティックポリぺプ 夕イド、 ガラニンなどが用いられる。
本明細書および丽において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する齢、 IUPAC- I UB Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野における慣 用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またアミノ酸に関し光学異性体があり得る は、 特に明示しなければ L体を示すものとする。
DNA デォキシリ： «酸
cDNA 相補的デォキシリ: «酸
A アデニン
T チミン
G グァニン
C シ卜シン
I イノシン
R アデニン （A) またはグァニン （G)
Y チミン （T) またはシトシン （C)
M アデニン （A) またはシトシン （C)
K グァニン （G) またはチミン （T)
S グァニン （G) またはシトシン （C)
w アデニン （A) またはチミン （T) B ：グァニン （G) 、 グァニン （G) またはチミン （T)
D ：アデニン （A) 、 グァニン （G) またはチミン （T)
V ：ァデニン （A) 、 グァニン （G) またはシトシン （C)
N ：ァデニン （A) 、 グァニン （G) 、 シトシン （C) もしくは チミン （T) または不明もしくは他の；^ S
RNA ：リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリボ核酸
dATP ：デォキシアデノシン三リン酸
dTTP ：デォキシチミジン三リン酸
d GTP ：デォキシグアノシン三リン酸
dCTP ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四 @^
SDS ： ドデシル«ナトリウム
BHA：ベンズヒドリルァミン
pMBHA： p—メチルベンズヒドリルァミン
Tos ： p—トルエンスルフォニル
B z 1 ：ベンジル
Bom:ベンジルォキシメチル
Boc： t一ブチルォキシカルボニル
DCM：ジクロロメタン
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリァゾール
DCC： N、 N'—ジシクロへキシルカルポジイミド
TFA： トリフルォロ隱
D I E A：ジイソプロピルェチルァミン
G 1 y ：ダリシン Al a ：ァラニン
Va 1 ：バリン
Leu ：ロイシン
I 1 e ：イソロイシン
Se r ：セリン
Th r ：スレ才ニン
Cy s ：システィン
Me t ：メチ才ニン
G 1 u ：グルタミン酸
Asp ：ァス /、°ラギン酸
Ly s
Ar g ：アルギニン
H i s ：ヒスチジン
Phe ：フエ二ルァラニン
Ty r ：チロシン
Trp ： 卜リブ卜ファン
Pro ：プロリン
As n ：ァスパラギン
G 1 n ：グルタミン
pG 1 u ：ピログリレ夕ミン酸
本願明細書の配列表の配列番号は、 以下の配列を示す。
〔配列番号： 1〕
腿の実施例 1で得られた本発明のポリぺプチドのアミノ酸配列 （ヒト型） を示す。 〔配列番号： 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列を ¾ る本発明のポリぺプチドをコ一ドする DN Αの塩 ¾@Ξ列を示す。 〔配列番号： 3〕
の 例 1で用いられるプライマ一 F 5の塩基配列を示す。
〔配列番号： 4〕
»の¾ ^例 1で用いられるプライマ一 F 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 5〕
の実施例 1で用いられるプライマー F 1の塩基配列を示す。
画番号： 6〕
の実施例 1で用いられるプライマー R 5の塩基配列を示す。
園番号： 7)
の実施例 3で用いられるプライマ一 h R 1の塩基配列を示す。
糊番号： 8〕
^^の実施例 3で得られた本発明のポリペプチドのアミノ^ SH列 （ヒト型） を示す。
CSH列番号： 9〕
配列番号： 8で表わされるァミノ miH列を ¾ る本発明のポリペプチドをコードする DN Αの:^配列を示す。
翻番号： 1 0〕
«の実施例 4で用いられるプライマー b F 6の；^配列を示す。
画番号： 1 1〕
腿の実施例 4で用いられるプライマ一 b F 7の 配列を示す。
〔配列番号： 1 2]
鍵の 例 4で用いられるプライマー b R 6の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 3〕
の実施例 4で用いられるプライマー b R 7の: IS配列を示す。
■番号： 1 4〕
«の実施例 4で得られた本発明のポリペプチドのァミノ 列 （ゥシ型） を示す。 〔配列番号： 1 5〕 配列番号： 1 4で表わされるァミノ 列を る本発明のポリペプチドをコードする D NAの 配列を示す。
〔配列番号： 1 6〕
^^の 例 5で用いられるプライマ一 r L P R 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 7〕
の «例 5で用いられるプライマ一 r L P F 1の塩基配列を示す。
〔配列番号： 1 8〕
の実施例 5で得られた本発明のポリペプチドのァミノ 列 （ラット型） を示す （リク ローニング前） 。
〔配列番号： 1 9〕
配列番号： 1 8で表わされるアミノ^ S3列を る本発明のポリペプチドをコードする DN Aの驢配列を示す。
〔配列番号： 2 0〕
R F GK配列をコードする 配列を示す。
〔配列番号： 2 1〕
RF G R配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 2〕
R S GK配列をコ一ドする 配列を示す。
〔配列番号： 2 3〕
R S GR配列をコードする塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 4]
R L GK配列をコ一ドする塩基配列を示す。
翻番号： 2 5]
RL G R配列をコ一ドする塩基配列を示す。
〔麵番号： 2 6〕
の ¾例 6で用いられるプライマ一 FF2の:^ S配列を示す。 l ib
〔配列番号： 2 7〕
»の実施例 6で用いられるプライマ一 rR4の塩基配列を示す。
〔配列番号： 2 8〕
^^の実施例 6で用いられるプライマ一 mF 1の 配列を示す。
〔配列番号： 2 9〕
の実施例 6で用いられるプライマー mF 3の^ ¾配列を示す。
〔配列番号： 3 0〕
の«例 6で用いられるプライマー mR 1の^ S配列を示す。
〔配列番号： 3 1〕
の ¾5S例 6で用いられるプライマ一 moFの塩基配列を示す。
〔配列番号： 3 2)
m 6で用いられるプライマー moRの: ¾配列を示す。
〔配列番号： 3 3〕
^¾の¾例 6で得られた本発明のポリペプチドのアミノ^ Ξ列 （マウス型） を示す。 〔配列番号： 3 4〕
配列番号： 3 3で表わされるアミノ酸配列を る本発明のポリぺプチドをコ一ドする DN Aの驢配列を示す。
〔配列番号： 3 5]
の実施例 7で得られたラット脳幹周辺部由 規 G蛋白質 レセプター蛋白質 r 〇T 7 T O 2 2 Lをコードする c DN Aをクロ一ニングするために使用したプライマ一 1の 配列を示す。
〔配列番号： 3 6〕
鍵の 例 7で得られたラット脳幹周辺部由 ^ff規 G蛋白質共 ί煙レセプ夕一蛋白質 r OT 7 T 0 2 2 Lをコードする c DNAをクローニングするために使用したプライマ一 2の «配列を示す。
〔配列番号： 3 7〕 WO 00/29441 j j g PCT/JP99/06283
«の実施例 7で得られたラット脳幹周辺部由 ¾f規 G蛋白質共 ¾ レセプ夕一蛋白質 r OT 7 T 0 2 2 Lのァミノ TO列を示す。
〔配列番号： 3 8〕
の実施例 7で得られたラット脳幹周辺部由 規 G蛋白質共 ¾レセプ夕一蛋白質 r OT 7 T 0 2 2 Lをコードする c DN Aの 配列を示す。
〔配列番号： 3 9〕
の実施例 7 ( 3) で得られたペプチドのアミノ^ Ξ列を示す。
〔配列番号： 4 0〕
鍵の実施例 7 (4) で得られたペプチドのアミノ麵列を示す。
〔配列番号： 4 1〕
^^の実施例 7 ( 5) で得られたペプチドのアミノ¾@5列を示す。
〔配列番号： 4 2〕
配列番号： 1で表わされるアミノ薩列の第 8 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) のアミ ノ mS2列を含 るべプチドをコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 4 3〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1 0 1番目 （Ser) 〜1 1 2番目 （Ser) のァ ミノ酸配列を含^ るべプチドをコ一ドする;^配列を示す。
〔配列番号： 4 4〕
配列番号： 1で表わされるアミノ難列の第 1 2 4番目 （Val) 〜： L 3 1番目 （Phe) のァ ミノ酸配列を含 ¾ るべプチドをコ一ドする；^ S配列を示す。
ffi列番号： 4 5〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の第 1番目 （Met) 〜第 9 2番目 （Phe) のァミノ ,列を含有するべプチドをコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 4 63
配列番号： 1で表わされるアミノ薩列の、 第 1番目 （Met) 〜1 1 2番目 （Ser) のアミ ノ匿列を含 るべプチドをコ一ドする：^ S配列を示す。 〔配列番号： 4 7〕
配列番号： 1で表わされるアミノ酸配列の、 第 1番目 （Met) 〜； L 3 1番目 （Phe) のアミ ノ酸配列を含 るべプチドをコ一ドする塩基配列を示す。
〔配列番号： 4 8〕
実施例 5で用いられたプライマー ratF2の塩基配列を示す。
〔配列番号： 4 9〕
^例 5で用いられたプライマー ratRの;^ S配列を示す。
〔配列番号： 5 0〕
«の実施例 5で得られた本発明のポリペプチドのアミノ酸配列 （ラット型） を示す （リ クローニング^) 。
〔配列番号： 5 1〕
配列番号： 5 0で表わされるアミノ¾@6列を ¾ る本発明のポリぺプチドをコ一ドする DN Αの驢配列を示す。
ffi列番号： 5 2〕
実施例 9で用いられたプライマ一 bFFの: »ΙΞ列を示す。
〔配列番号： 5 3〕
¾SS例 9で用いられたプライマ一 bFRの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5 4]
例 1 1で得られた h 0T7T022で表されるタンパク質 （ポリペプチド） をコードするァ ミノ^ E列を示す。
〔配列番号： 5 5〕
配列番号： 5 4で表されるアミノ酸配列を有する h 0T7T022で表されるタンパク質 （ポリ ペプチド） をコードする DNAの塩基配列を示す。
〔配列番号： 5 6〕
配列番号： 5 4で表されるアミノ酸配列を有する h OT7T022で表されるタンパク質 （ポリ ペプチド） をコードする DN Aの塩基配列を示す。 WO 00/29441 jjg PCT/JP99/06283
〔配列番号： 57〕
実施例 11で用いられたプライマ一 1の 配列を示す。
〔配列番号： 58〕
m 11で用いられたプライマー 2の塩基配列を示す。
後述の実施例 2で得られた形質転換体 Escherichia col i JM109/P hRFl は、 1999年 4月 14日から通商産業省工業腿！ ¾命工学工業 fcT術 (NIBH) に寄託番号 FE RM BP— 6702として、 財団法人発 ( I F〇） に 1999年 3月 5日から寄託番 号 IF016265として寄託されている。
銜 の実施例 7で得られた形質転換体ェシェリヒア コリ （Escher i chiacoli)DHl OB /pAK- r〇T022Lは、 1998年 11月 2日から通商産業省 ΙΠ¾Τ術院生命工学ェ
Figure imgf000120_0001
(NIBH)に寄託番号 FERM BP— 6558として、 1998年 10月 1 6日から財団法人 · ^m (I FO)に寄託番号 I FO 16211として寄託されてい る。
¾¾Eの 例 9で得られた形質,体 Escherichia coli JM109/pbRF2は、 1999年 8 月 2日から通赫業省ェ 院生命工学工 (N I BH) に寄託番号 FERM BP— 6811として、財団法人発^ ί¾^(Ι FO)に 1999年 6月 18日力ら寄託番号 IF0 16288として寄託されている。
»の実施例 8で得られた形質^^体 Escherichia coli JM109/phRF2は、 1999年 8 月 2日から通商産業省ェ 術1¾命工学: d術 (NIBH) に寄託番号 FERM BP— 6812として、財団法人発 I F〇）に 1999年 6月 18日力ら寄託番号 IF0 16289として寄託されている。 '
»の実施例 6で得られた形質転換体 Escherichia coli JM109/pmLP4は、 1999年 8 月 2日から通商産業省ェ»術院生命工学工業 (NIBH) に寄託番号 FERM BP— 6813として、財団法人発^ I FO)に 1999年 6月 18日力 寄託番号 IF0 16290として寄託されている。
»の 例 5で得られた形質転換体 Escherichia coli JM109/prLPL6は、 1999年 8 月 2日から通商産業省ェ縦術! ¾命工学工^ ¾W^f (NIBH) に寄託番号 FERM BP— 6814として、財団法人発^^ f(I F〇）に 1999年 6月 18日から寄託番号 IF0 16291として寄託されている。
«の実施例 11で得られた形質転換体 Escherichia coli DH5 I pCR2. l-hOT022Tは 、 1999年 11月 8日から通 業省工業 術院生命工学工業 (NIBH) に 寄託番号 FERM BP— 6930として、 財団法人発^^ (I FO) に 1999年 10月 27日力ら寄託番号 IFO 16330として寄託されている。
後述の 例 11で 1辱られた形質転換体 Escherichia coli DH5 I pCR2. l-hOT022Gは 、 1999年 11月 8日から通 β業省工業鎌 命工学工業 (NIBH) に 寄託番号 FERM BP— 6931として、 財団法人発 (I FO) に 1999年 10月 27日力ら寄託番号 IFO 16331として寄託されている。 鐘例
以下に、 難例を挙げて本発明をさらに具働に説明するが、 本発明はそれに! ^される ものではない。 なお、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュラー 'クロ一ニング （ Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 謹例 1 ヒト胎 5¾ poly(A)+RNA画分からの cDNAの合成と RT— PCR法による 生理活性べプチド c D N Aの増幅
クローンテック社より購入したヒト胎児脳 poly(A)+RNA画分 1 gにプライマーとして Oligo dTプライマー （Gibco BRL¾) を加え、 モロニイマウス白血病ウィルスの逆転写 酵素 (Gibco BRL¾) により、 酣パッファーを用いて c DNAを合成した。 後の産 物はフエノール：クロ口ホルム （1 : 1) で抽出し、 エタノ一ル腹を行った後、 3C 1 の TEに溶解した。 調製した cDNA 1 1を铸型として、 次の 2つのプライマー （F 5 および F6) を用いて、 PCRによる増幅を行った。
F 5： 5'-GGGCTGCACATAGAGACTTAATTTTAG-3' (配列番号： 3) F 6 ： 5-CTAGACCACCTCTATATAACTGCCCAT-3' (配列番号： 4)
反 IS夜の糸誠は、 合成 DNAプライマー （F5および F6) 各 20pM、 0. 25mM dNTPs、 Ex Taq DNA polymerase 0. 5 1および酵素に付属のバッファ— 5 1で、 総反応溶液量は 50 X 1とした。 増幅のためのサイクルはサ一マルサイクラ一 （ パーキン ·エルマ一） を用い 98で · 10秒、 63 · 20秒、 72V · 40秒のサイクル を 40回繰り返した。
さらにその PC R産物の 1 1を铸型として次の 2つのプライマ一 （F1および R5) を 用いて、 nested PC Rによる増幅を行った。
F 1 ： 5'-GCACATAGAGACTTAATTTTAGATTTAGAC-3' (配列番号： 5)
R 5： 5-CATGCACTTTGACTGGTTTCCAGGTAT-3' (配列番号： 6)
反厳の糸滅は、 合成 DNAプライマ一 （F1および R5) 各 20pM、 0. 25mM dNTPs、 Ex Taq DNA polymerase 0. 5 1および 素に付属のバッファー 5 / 1で、 総反応溶 は 50 1とした。 増幅のためのサイクルはサ一マルサイクラ一 （ パーキン ·エルマ一 ¾) を用い 98V · 10秒、 6 O · 20秒、 72で · 40秒のサイク ルを 40回繰り返した。 増幅産物の確認は 1. 2 %ァガロース電気泳動およびェチジゥムプ ロミド染色によって行った。 β例 2 PCR産物のプラスミドベクターへのサブクローニングぉよび禅入 cDN Α部分 の ¾S配列の解読による新規生理活性べプチド«クローンの選択
雄例 1で行った PC R後の反応産物は 1. 2%のァガロースゲルを用いて分離し、 目的 とする大きさの DN A断片の増幅を確認した後、 Quigen P CR purification kit (Quiagen ) を用いて DNAを回収した。 TAクローニングキット （インビトロゲンネ; t) の処方に従い 、 回収した DNAをプラスミドベクター pCR™2.1へサブクローニングした。 これを大腸 菌 JM109 competent cell (宝酒造） に導入して形質転換したのち、 cDNA挿入断片を 持つクローンをアンピシリン、 I PTGおよび X— g a 1を含む LB寒天培地中で選択し、 白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離し、 形質転換体ェシエリヒア コ リ （Escherichia coli) JMl 09ZphRF 1を得た。
個々のクローンをアンピシリンを含む LB培地で一晩培養し、 自動プラスミド抽出装置 ( クラボウ） を用いてプラスミド DNAを調製した。 調製した DNAの一部を用いて Ec oR Iによる切断を行い、 挿入されている cDN A断片の大きさを確認した。 残りの DNAの一 部をさらに RNa s e処理、 フエノール'クロ口ホルム抽出し、 エタノール によって濃 縮した。 塩基配列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (AB Itt) を用いて行い、 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読した。 得られた 配列の情報 は、 DNAS I S (日立システムエンジニアリングネ: を用いて行った。 決定した: ^SH列 を図 1に示した。
決定した塩基配列を図 1をもとにホモ口ジー^ ¾と配列の^ fを行った結果、 形質転換体 E. coli JMl 09/phRF 1の保 るプラスミドに挿入された c DN A断片は、新融 理活性べプチドをコ一ドすることが分かった。 3 ヒ卜胎児脳 cDNAからの生理活性ペプチド cDNAのスプライシングバリアン卜の取 得
^例 1で作製したヒト胎児脳 cDNAl mlを铸型として、 次の二つのプライマー （F5、 hRl ) を用いて PCRによる増幅を行った。
F5： 5'-GGGCTGCACATAGAGACTTAATTTTAG-3' (配列番号： 3)
hRl： 5'-CAGCTTTAGGGACAGGCTCCAGGTTTC-3' (配列番号： 7)
SJ$¾の糸滅は合成プライマ一 （F5および hRl) 各 20 pM、 0.25 mM dNTPs, Ex Taq DNA polymerase 0.5 mlおよび酵素に付属のバッファ一で総反 液量は 50 mlとした。 増幅のた めのサイクルはサ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一） を用い、 98 10秒、 65t 20 秒、 1T · 20秒のサイクルを 40回くりかえした。 増幅産物の確認は 1.2 ァガロース電気泳 動およびェチジゥムブロミド染色によって行った。 PCR産物の増幅を確認した後、 反応産物 を QIA quick PCR purification Kit (Quiagen) を用いて精製し、 配列決定を行った。 塩某 配列決定のための反応は BigDye Deoxy Terminatoe Cycle Sequence Kit (ABI) を用いて行 い、蛍光式自動 Sequencer (ABI377)を用いて解読した。得られた腿配列の情 $g fは DNASIS (日立システムエンジニアリング） を用いて行った。 その結果、 鍾例 2で得られた cDNA と 3'*¾#jが異なる cDNAが得られた。 したがって: «施例で得られた cDNAは、 難例 2で 得られた cDNAのスプライシングバリアントである事が分かった。 決定した驢配列 （配列 番号： 9 ) と予測されるアミノ酸の配列 （配列番号： 8) を図 3に示す。
¾SS例 4 ゥシ視床下部 poly(A)+RNAからの生理活性ぺプチド cDNAの取得
ゥシ視床下部 oly(A)+RNAからのゥシ型生理活性ペプチド cDNAの取得は Marathon cDNA Ampl i ficat ion Ki t (Clontech) を用いて行った。 Ki tに添付のマニュアルにしたがって作製 した 下部 cDNAを^ Mとして、 次の 4つのプライマ一 （bF6、 bF7、 bR6、 bR7) を合成 し、 Ki t添付の API, AP2の二種類のプライマーと組み合わせて PCRによる増幅を行った。
bF6： 5'-GCCTAGAGGAGATCTAGGCTGGGAGGA-3' (配列番号： 1 0)
bF7： 5'-GGGAGGAACATGGAAGAAGAAAGGAGC-3' (配列番号： 1 1 )
bR6： 5'-GATGGTGAATGCATGGACTGCTGGAGC-3' (配列番号： 1 2)
bR7： 5'-TTCCTCCCAAATCTCAGTGGCAGGTTG-3' (配列番号： 1 3)
5'側 （N末領¾) の増幅のために、 まず一回目の PCR反応を合成プライマ一 （bR6と API) を用いて行った。 各プライマ一 20pMと 0. 25mMdNTPs, Klen Taq DNA polymerase 0. 5mlおよ び磨素に付属のバッファーで総反 液量は 25ml とした。 増幅のためのサイクルはサーマル サイクラ一（パ一キンエルマ一） を用い、 98 10秒、 72で 2分のサイクルを 5回、続いて 98 - 10秒、 7(TC . 2分のサイクルを 5回、 98 · 10秒、 68 · 2分 30秒のサイクルを 25 回くりかえした。 次にその一回目の PCR反鎌を 10倍に職し、 その 1 mlを翻にして （ bR7と AP2) プライマ一にて二回目の PCRを行った。 各プライマー 20pMと 0. 25mM d TPs、 Klen Taq DNA polymerase 0. 5mlおよび酵素に付属のバッファ一で総反応液量は 25mlとした 。 増幅のためのサイクルはサーマルサイクラ一 （パーキンエルマ一） を用い、 98 ' 10秒、 · 2分のサイクルを 5回、 続いて 98 · 10秒、 7(TC · 2分のサイクルを 5回、 98"C · 10 秒、 68 · 2分 30秒のサイクルを 35回くりかえした。 3'側 （C末領 の増幅のために、 まず一回目の PCR反応を合成プライマ一 （bF6と API) を用いて行った。 各プライマー 20pMと 0. 25m dNTPs、 Klen Taq polymerase 0. 5mlおよび 酵素に付属のバッファ一で総反 J¾鍾は 25ml とした。 増幅のためのサイクルはサーマルサ イクラ一（パーキンエルマ一） を用い、 98t 10秒、 ' 2分のサイクルを 5回、 続いて 98T: - 10秒、 70t: · 2分のサイクルを 5回、 98で · 10秒、 68で · 2分 30秒のサイクルを 25 回くりかえした。 次にその一回目の PCR反 J5£¾を 10倍に^ し、 その 1 mlを画にして （ bF7と AP2)プライマ一にて二回目の PCRを行った。各プライマ一 20pMと 0， 25mMdNTPs, Klen Taq DNA polymerase 0. 5mlおよび酵素に付属のバッファーで総反応液量は 25mlとした。 増 幅のためのサイクルはサ一マルサイクラ一 （パーキンエルマ一） を用い、 98 ' 10秒、 72 X： · 2分のサイクルを 5回、 続いて 98 · 10秒、 7(TC · 2分のサイクルを 5回、 98で · 10 秒、 68^ · 2分 30秒のサイクルを 35回くりかえした。 5'側、 3'側それぞれの増幅産物の確認 は 1. 2%ァガロース 泳動およびェチジゥムブロミド染色によって行った。 PCR産物の増幅 を確認した後、 反応産物を QI A quick PCR puri f icat ion Ki t (Quiagen) を用いて精製し、 決定を行った。 ¾ΙΞ列決定のための反応は Big Dye Deoxy Terminator Cyc le Sequence Ki t (ABI) を用いて行い、 蛍光式自動 Sequencer (ABI377) を用いて解読した。
得られた：^ S配列の情¾»は DNASIS (日立システムエンジニアリング） を用いて行った 決定した塩 列 （配列番号： 1 5 ) と予測されるアミノ酸の配列 （配列番号： 1 4) を 図 4に示す。 ¾1例 5 ラット脳 poly (ATRNAからの生理活性べプチド cDNAの取得
ラット脳 poly (A)¾ Aからのラット型生理活性ペプチド cDNA の取得は Marathon cDNA
Ampl i f icat ion Ki t (Clontech) を用いて行った。 Ki tに 寸のマニュアルにしたがって作 製したラット脳 cDNAを铸型として、 次の 2つのプライマー
rLPRl： 5 '-CCCTGGGGCTTCTTCTGTCTTCTATGT- 3 ' (配列番号： 1 6 )
rLPFl： 5'-AGCGATTCATTTTATTGACTTTAGCA-3' (配列番号： 1 7 )
を合成し、 Ki t謝の API, AP2の二種類のプライマーと組み合わせて PCRによる増幅を行つ た。
5'側 （N末領¾) の増幅のために、 まず一回目の PCR反応を rLPRl と APIのプライマーセ ットを用いて行った。 各プライマ一 200pMと各 0. lmMdNTP、 Klen Taq DNA olymerase 0. 25ml および酵素に付属のバッファ一で総反応液量は 25ml とした。 増幅のためのサイクルはサー マルサイクラ一 （パーキンエルマ一） を用い、 98 · 10秒、 72 · 2分のサイクルを 5回、 続いて 98で · 10秒、 7(TC . 2分のサイクルを 5回、 98 · 10秒、 68 · 2分 30秒のサイク ルを 25回くりかえした。 次にその一回目の PCR反応液を铸型にして一回目のプライマーセ ット、 同様の反 にて二回目の PCRを行った。 増幅のためのサイクルは、 98で · 10秒 、 1T · 2分のサイクルを 5回、 続いて 98 · 10秒、 70で · 2分のサイクルを 5回、 98 · 10秒、 （68 · 2分 3 0秒） のサイクルを 38回くりかえした。
3'側 （C末領¾) の増幅のために、 まず一回目の PCR反応を rLPFl と APIのプライマ一セ ットを用いて行った。 反 J5t¾«は 5，側 （N末領¾) の増幅の齢と同様とした。 増幅のた めのサイクルは、 98*C · 10秒、 72で · 2分のサイクルを 5回、 続いて 98で · 10秒、 7(TC · 2 分のサイクルを 5回、 98で · 10秒、 65 · 20秒、 ΊΤΟ · 2分のサイクルを 25回くりかえし た。次にその一回目の PCR反応液を铸型にして rLPFlと AP2プライマーにて二回目の PCRを 行った。 反 は一回目の PCRと同様とした。 増幅のためのサイクルはサーマルサイク ラー （パーキンエルマ一） を用い、 98で · 10秒、 · 2分のサイクルを 5回、 続いて 98 V, · 10秒、 7(T · 2分のサイクルを 5回、 98 · 10秒、 65°C · 20秒、 1TC · 2分のサイクル を 38回くりかえした。 5'側、 3'側それぞれの増幅産物の確認は 1. 2%ァガロース電気泳動およ びェチジゥムブロミド染色によって行った。 PCR産物バンドを QIA quick Gel Extract ion Ki t (Quiagen) を用いて精製し、 配列決定を行った。 塩 ¾@Ξ列決定は鎌例 3 と同様の方法で 行った。 決定した塩基配列 （配列番号： 1 9 ) と予測されるアミノ酸の配列 （配列番号： 1 8 ) を図 5に示す。 さらにこの配列をもとに、 開始コドンと終止コドンの周辺に 2本のブラ イマ一
ratF2： 5'-AATGGAAATTATTTCATCAAAGCGATTCAT- 3' (配列番号： 4 8 )
ratR： 5'-CACCTATACTGACAGGAATGATGGCTCTCC-3' (配列番号： 4 9 ) を合成した。 ラット視床下部 poly(A)+RNAより層 reverse transferase (宝酒 と random 9 mer (宝酒 を用いて合成した cD を铸型として 98°C · 10秒、 68で · 40秒のサイク ルを 33回くりかえす PC R反応を行った。 さらにこの反 j ^液を^ として 98°C · 10秒、 6 8t - 1分のサイクルを 38回くりかえす PC R反応を行い、 約 690 bpの KR産物を得た 。 これを TA cloning Kit (Invitrogen) のマニュアルにしたがってクローニングベクタ一 PCR2.1 T0P0へ導入、 大腸菌 JM109に導入して形質転換体 E. coli JM109/prLPL6を得 た。 実施例 3と同様の方法で ¾配列を決定し （配列番号： 51) 、 アミノ酸配列 （配列番 号： 50) を予視 ijした。 実施例 6 マウス脳 poly (AVRNAからの Marathon PCR法によるマウス型生理活性ペプチド cDNAの取得と配列確認
マウス脳 poly (A)+RNAからマウス型生理活性ペプチド cDNAを取得するため、まずマウス脳 poly(A)+RNA 1 を oligo d(T) primer 2.5 pmoK宝酒 i©、 0.5 mM dNTPs, 10 mM DTT存 在下で、 SuperScriptll RNase H-逆転写酵素 （GIBC0 BRL) により、 42で、 1時間の反応 で c DNAを合成した。 これを として、 プライマ一
FF2： 5 '-GACTTAATTTTAGATTTAGACAAAATGGAA- 3 ' (配列番号： 26)
rR4： 5'- TTCTCCCAAACCTTTGGGGCAGGTT-3' (配列番号： 27)
および、 KlenTaq DNA polymerase (Clontech) を用いて、 98°C 10秒、 56 20秒、 1TC 25 秒のサイクルを 39回くりかえす PC R反応を行った。 さらに同じプライマ一セットを用い て 98 10秒、 60 20秒、 72で 25秒のサイクルを 25回くりかえす P C R反応を行い 、増副産物を ^ァガロース 動およびェチジゥムブロミド染色によって検出して、その バンドを QIA quick Gel Extraction Kit (Quiagen) を用いて精製、 実施例 3と同様の方法 で塩基配列を決定した。得られたマウス型生理活性べプチド c DNA断片の 5'および 3'側の配 列を取得するため、 実施例 5と同様に、 Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) を 用いてマウス脳 poly (A) +RNA 1 a gから c DNAを合成し、 銬型とした。 次の 3つのプライマ m Fl： 5 '-ACAGCAAAGMGGTGACGGAAAATACTC- 3 ' (配列番号： 2 8 )
m F3： 5 '-ATAGATGAGAAAAGAAGCCCCGCAGCAC- 3 ' (配列番号： 2 9 )
m Rl： 5 -GTGCTGCGGGGCTTCTTTTCTCATCTAT- 3 ' (配列番号： 3 0 )
を合成し、 ki t付属の APIプライマーと組み合わせて PCRを行った。
5'側 ( 末領¾) の増幅のために、 まず一回目の PCR反応を m R1と APIのプライマーセッ トを用いて行った。 3'側 （C末領¾) の増幅のためには、 一回目の PCR反応を m Flと APIの プライマーセットで行った。 各プライマ一 200pM と各 0. lmMdNTP、 Klen Taq polymerase 0. 25mlおよび 素に付属のバッファ一«反 は 25ml とした。 増幅のためのサイクル は 98で 10秒、 n°C 2分のサイクルを 5回、 続いて 981： 10秒、 7(TC 2分のサイ ルを 5 回、 98 10秒、 68 2分 30秒のサイクルを 25回くりかえした。次にその一回目の PCR反 ^を,にして二回目の PCRを行った。 5'側の増幅は一回目と同様のプライマーセット、 3'側の増幅 ¾m F3と APIプライマ一セットを用い、 一回目の PCRと同様の反 JiM ^で反 碰を調製した。 は 98t 10秒、 11°C 2分のサイクルを 5回、 続いて 98 : 10秒、 70 2分のサイクルを 5回、 98 10秒、 68 2分 3 0秒のサイクルを 38回くりかえした 。
5'側、 3'側それぞれの増幅産物の確認は 1. 2¾ァガロース電気泳動およびェチジゥムブロミ ド染色によって行った。 PCR産物のバンドを QIA quick Gel Extract ion Ki t (Quiagen) を 用いて精製し、 配列決定を行った。 驢配列決定は実施例 3と同様の方法で行った。
さらに得られた配列をもとに 1つのプライマ一
moF： 5 '-TTTAGACTTAGACGAAATGGA- 3 ' (配列番号： 3 1 )
moR : 5 '-GCTCCGTAGCCTCTTGAAGTC- 3 ' (配列番号： 3 2 )
を合成し、 先に示した、 マウス脳 poly (A)+RNAより SuperScripU I RNase H-逆転写酵素で 合成した c DNAを麵として PCRを行い、 マウス型生理活性べプチド全長 cDNAを含む断片 を増幅した。 反応は KlenTaq DNA polymerase (Clontech) を用いて、 98で 10秒、 56 20 秒、 72T: 15秒のサイクルを 35回くりかえした。 約 6 0 0 b pの増副産物を 2 ァガロース 電気泳動およびェチジゥムブロミド染色によって検出し、 そのバンドを QIA quick Gel Extraction Kit (Quiagen) を用いて精製、 クローニングベクタ一 pCR2.1— TOPO (TOPO TA cloning kit、 Invitrogen)へサブクロ一ニング、 ±ϋ菌 JM109 入し、形質繊体 E. coli JM109/pmLP4を得た。 雄例 3と同様の方法で塩基配列を膨し、 決定した 配列 （配列 番号： 34) と予根 IJされるァミノ 列 （配列番号： 33) を図 7に示す。 鎌例 7
(1) ラット脳幹周辺部の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質をコードする cDNAのクロー ニングと 配列の決定
ラット脳幹周辺部 cDNAを铸型とし、 2個のプライマー、 プライマー 1 (配列番号： 3 5) およびプライマ一 2 (配列番号： 36) を用いて PC R反応を行った。 該反応における 反応液の組成は上記 cDNAの 10分の 1量を铸型として使用し、 Advan t age c DNA Po 1 yme r as e Mi (CLONTECH¾) 1Z50量、 プライマ一 1 ( SH^IJ番号： 35) およびプライマ一 2 (配列番号： 36) を 各 0. 2 M、 dNTPs
200 M、 およ 素に腐寸のバッファ一を加え、 5 C 1の とした。 PCR反応は 、① 94 2分の後、② 94で' 30秒、 Ί 2°C ' 2分のサイクリレを 3回、③ 94で ·
30秒、 68で · 2分のサイクルを 3回、④ 94で · 30秒、 64 · 30秒、 68 2分 のサイクルを 30回繰り返し、⑤最後に 68X · 8分の伸長反応を行った。該 PC R反応後 の反応産物を TAクローニングキット（ I n V i t r o g e n¾)の処方に従いプラスミドべ クタ一 PCR2. 1 (I nv i t rogen¾)へサブクローニングした。これを^菌 DH 5ひに導入し、 cDNAをもつクローンをアンピシリンを含む LB寒天培地中で選択した後 、 個々のクローンの配列 した結果、 新規 G蛋白質^ ¾レセプ夕一蛋白質をコードす る cDNA配列（配列番号： 38) を得た。 この cDNAより導き出されるアミノ酸配列 ( 配列番号： 37) を含有する新規 G蛋白質^ ί殳型レセプ夕一蛋白質を r〇T7T022Lと 命名した。
本発明のラット脳幹周辺部由来の G蛋白質共役型レセプ夕一蛋白質 rOT7T022Lを コードする c DNA (配列番号： 38) がサブクローニングされたプラスミド p AK— r O T022Lを、 自体 の方法に従い^菌 (Escherichia coli) DH10Bに導入して、 形質転換体：；^菌 (Escherichia coli) DH 10 BZp AK— r〇T 022 Lを得た。
(2) G蛋白質共役型レセプター蛋白質 r OT 7 T 022 L発現 CHO細胞の樹立 直径 10 cmの 養用シャーレに 1 X 10 Ό個の CHOdh f r—細胞を醒し、 2 4時間培養した。 （1) で得られた1"〇丁7丁022 発現べク夕ー1)八1^ー 1"0丁022
Lを 20 g用い、 リボソーム法による遺^導入キット （ジーントランスファ一、 ニッポ ンジーンネ： fc) を用いて、 DNA-リボソームの複合体を形成させた。 培地を新鮮なものに交 換し、 これに DNA'リボソームの複合体を添加して一晩インキュベートした。 培地を画 なものと交換してさらに 1日間培養した後、 形質,体選^ fflの培地に交換して 2日間培養 した。 さらに、 トリプシン一 EDTA処理によってシャーレ内の細胞を回収し、 細胞密度が 希薄な鍵にて再培養を行うことによって、 形質転換体の割合の増加を図った。 これにより 、 rOT7T022Lを安定に高発現する細胞株 CH〇一 rOT7T022Lのクローンを 得た。
(3) Met- Pro- His-Ser- Phe-Ala- Asn-Leu- Pro- Leu-Arg- Phe-NH2 (配列番号： 39) の合成 市販 p—メチル BHA樹脂（アプライド ノィオシテムズ、現パーキンエルマ一■ 0.5 m mole分をペプチド合疆 （アプライド ノ ィオシテムズ ¾S43 OA) の反 に入れ、 D CMで翻させた後、 最初のアミノ酸 Boc - Pheを HOBt/DCC法で活性化し p—メチル BH A樹脂に導入した。 樹脂を 50%TFA/DCMで処理し、 Boc基を^ ¾してアミノ基を遊 離させ、 DIEAで中和した。 このアミノ基に次のアミノ酸 Boc- Arg(Tos)を HOBt/DCC法 « 合した。 未反応アミノ基の有無をニンヒドリンテス卜で調べ反応完了を確認後同様に、 Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Ala, Boc- Phe、 Boc-Ser (Bzl)> Boc- His (Bom) 、 Boc-Pro, Bodetを順次縮合した。 全配列アミノ酸が導入され樹脂を 50%TF A/D CMで処理し樹脂上の Boc 基を除去後、 樹脂を乾燥し Met- Pro- His (Bom)- Ser(Bzl)- Phe- Ala - Asn-Leu-Pro- Leu-Arg (Tos)- Phe- pMBHA- resin 0.73gを得た。
この樹脂 0. 5gを p—クレゾール 5. lg、 ^m 15mlと共にテフロン製 ?K素反応装 置中で 0°C · 60分間反応させた。 弗化水素を減圧留去し、 残留物にジェチルェ一テル 100mlを加え勝後、 グラスフィルタ一上に濾取、 乾燥した。 これを 50%酢酸水溶液 5( 中に懸獨、 攪拌し、 ペプチドを抽出した後樹脂と分離し ffi下に約 5 ml までに した後 、 セフアデックス G- 25 (2x90 cm) のカラムに付し 50%酢酸 7で展開し主要画分を集め ¾ /結 喿した。 次にこの粗精製ペプチドを 5%チォグリコール酸/ 50%酢酸 1.5ml に溶解し 、 50 : 12時間保持し Met酸化体ペプチドを ¾した後、 LiChroprep (商品名） RP-18 (ME RCKネ ±S を充填した逆相系カラムにつけ 0.1% TFA水と 0.1% TF A含有 33%ァセ トニトリル水溶液を用いたグラジェント溶出での精製をくり返し、 ァセトニトリル 27 %謝麦に溶出される部分を集め凍結懇し、 白色粉末 26mgを得た。
質 »^析による （M+H) + 1428. 7 (理論値 1428. 8)
HP LC溶出時間 18. 0分
カラム条件
カラム： Wakosil (商品名） 5C 18 (4. 6x 10 Omm)
： A液 （0.1% T F A含有 5 %ァセトニトリル水）
B液（0.1% TFA含有 55%ァセトニトリル水） を用い
A ら B液へ直線型難勾配溶出 （ 25分）
猶： 1.0 ml/分
(4) Va 1 -Pr o-Asn-Leu-Pr o-G 1 n-Arg-Phe-NH2 (配列番号： 40) の合成
± の実施例 7 (3) と同様にして、 Boc- Phe， Boc-Arg(Tos), Boc-Gln, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Val を順次縮合し、 Boc- Va卜 Pro- Asn-Leu- Pro- Gin- Arg(Tos)-Phe- pMBHA - resin0.43gを得た。 この樹脂 0.22gを同様に ¾ffc7j<素処理、 カラムクロマト精製し 白色粉末の目的物 46mgを得た。
質 析による （M+H) + 969. 5 (理論値 969. 6)
HP LC溶出時間 1 1. 8分
カラム条件
カラム： Wakosil (商品名） 5 C 18 (4. 6x 10 Omm)
： A液 （0. \% T F A含有 5 %ァセトニ卜リル水） B液 （0.1% T FA含有 55%ァセトニトリリレ水） を用い
A¾ ^ら B液へ直線型 勾配溶出 （25分）
麵： 1.0 ml/分
(5) Ser-Ala-Gly-Ala-Thr-Ala-Asn-Leu-Pro-Arg-Ser-NH2 (配列番号： 41) の合成 ±iiの実施例 7 (3) と同様にして、 Boc-Ser(Bzl), Boc-Arg(Tos), Boc-Leu, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asn, Boc-Ala, Boc-Thr (Bzl), Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Ala, Boc - Ser (Bzl)を 順次縮合 し 、 Boc- Ser (Bzl)- Ala~Gly- Ala- Thr (Bzl)- Ala- Asn-Leu- Pro-Leu- Arg(Tos)- Ser (Bzl)-pMBHA-res in 0.62gを得た。 この樹脂 0.23gを同様に は素処理、 力ラムクロマ ト精製し白色粉末の目的物 71mgを得た。
質 *^析による （M+H) + 1156. 4 (理論値 1156. 6)
HP LC溶出時間 11. 8分
カラム条件
カラム： Wakosil (商品名） 5C18 (4. 6x10 Omm)
»¾:A液 （0.1 TF A含有 5%ァセトニトリル水）
B液 （0.1% TF A含有 55%ァセトニトリル水） を用い
A¾ ^ら B液へ直線型離勾配溶出 （25分）
猶： 1.0 ml,分
(6) rOT7T022 L (配列番号： 37) とペプチド MPHS F ANL P LRF am i d e (配 墦号： 39) およびペプチド VPNL PQRF am i d e (配列番号： 40) のサイトセ ンサ一による反応
上述の実施例 7 (2) で得られた ΓΟΤ7Τ022 L受容体発現 C HO細胞を、 2.7X lO^cells/capsuleの密度でサイトセンサー用カプセルに漏し、一晩培養した後にサイトセ ンサ一のヮ一クステーションに装着した。 サイトセンサーの流路にセットしたアツセィ用の 培地 （0.1%のゥシ血清アルブミンを含有する low buffered RPMI1640 medium) を、 ポンプ ON (80秒間） ポンプ OFF (40秒間） のサイクル 胞に供給し、 各サイクルごとにポ ンプ停止 8秒後から 30秒間の細 の変化率を acidification rateとして算出した。 acidification rateの経時変化をモニタ一し、 安定した値を示すようになったところで の切り換えによって細胞に各ペプチドを 7分 2秒間暴露した。 各ゥエルの Acidification Rateの値をペプチドを暴露する直前の 3サイクルの値を 100%として標 匕し、 細胞の反応 の比較を行なったところ、 ΓΟΤ7Τ022 L発現CH〇細胞はぺプチドMPHSFANLPLRF ami d e (配列番号： 39) およびべプチド VPNL PQRF am i d e (配列番号： 4 0) に対して強く用量依存的な反応を示す事が明らかになった （図 8) 。
¾5S例 8 ヒト新規生理活性べプチド«スプライシングバリアント c Aを保持する形質 繊体の作成
上記難例 3で行った P C R後の反応産物は 1. 2 %のァガロースゲルを用いて分離し、 目的とする大きさの DNA断片の増幅を確認した後、 Quigen PCR purification kit ( Quiagen) を用いて DNAを回収した。 TAクローニングキット （インビトロゲンネ ±) の贴 に従い、 回収した DNAをプラスミドベクター pCR™2.1へサブクロ一ニングした。 これ を大腸菌 JM109 competent cell (宝酒造） に導入して形質転換したのち、 cDNA挿入 断片を持つクローンをアンピシリン、 I PTGおよび X— g a 1を含む LB寒天培地中で選 択し、 白色を呈するクローンのみを滅菌した爪楊枝を用いて分離した。 個々のクローンをァ ンピシリンを含む LB培地で一晩培養し、 自動プラスミド抽出装置 （クラボウ） を用いてプ ラスミド DNAを調製した。 調製した DNAの一部を用いて E coRIによる切断を行い、 挿入されている cDNA断片の大きさを確認した。 残りの DNAの をさらに RNa s e 処理、 フエノール 'クロ口ホルム抽出し、 エタノール «によって灘した。 配列の決 定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (AB I¾) を用いて行 ( 、 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読し、形 Μ¾換体工シェリヒア コリ（Escherichia col i ) JM109/phRF 2を得た。 m 9 ゥシ新^理活性べプチド CDNAを^する形 換体の作成
¾fS例 4で作製したゥシ視床下部 cDNA 1 mlを铸型として、 次の二つのプライマー （bFF 、 bFR) を用いて PCRによる増幅を行った。
bFF： 5'-TTCTAGATTTTGGACAAAATGGAAATT-3' (配列番号： 52)
bFR： 5'-CGTCTTTAGGGACAGGCTCCAGATTTC-3' (配列番号： 53)
反 ϋ£¾の糸滅は合成プライマー （bFFおよび bFR) 各 20 pM、 0.25 mM dNTPs、 Ex Taq DNA polymerase 0.5 mlおよび酵素に付属のバッファ一で総反応液量は 50 mlとした。 増幅のた めのサイクルはサ一マルサイクラ一ひ、。一キンエルマ一） を用い、 98t 10秒、 65t 20 秒、 72 · 20秒のサイクルを 40回くりかえした。 増幅産物の確認は 1.2¾ァガロース電^: 動および工チジゥムブロミド染色によって行った。 実施例 3で行った P C R後の反脑物は 1. 2%のァガロースゲルを用いて分離し、 目的とする大きさの DNA断片の増幅を確認し た後、 Quigen PCR purification kit (Quiagen) を用いて DNAを回収した。 TAクロー ニングキット （インビトロゲンネ： t) の処方に従い、 回収した DNAをプラスミドベクタ一 p CR™ 2.1へサブクローニングした。 これを大腸菌 J Ml 09 competent cell (宝涵 g) に 導入して形質 したのち、 cDNA挿入断片を持つクローンをアンピシリン、 I PTGお よび X-g a 1を含む LB寒天培地中で選択し、 白色を呈するクローンのみを菌した爪楊 枝を用いて分離した。 個々のクローンをアンピシリンを含む LB培地で一晩培養し、 自動プ ラスミド抽出装置 （クラボウ） を用いてプラスミド DNAを調製した。 調製した DNAを用 いて E c o R Iによる切断を行い、 挿入されている c DNA断片の大きさを確認した。 さら に調製した DNAを RNa s e処理、 フエノール 'クロ口ホルム抽出し、 エタノールのに よって濃縮した。塩 ¾IE列の決定のための反応は DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (AB I¾) を用いて行い、 蛍光式自動シーケンサ一を用いて解読し、 形質転換体ェシエリ ヒア コリ （Escherichia col i) J M 109 p b RF 2を得た。 鍾例 10 ペプチド MPHSFANLPLRFami de (配列番号： 39 ) およびべ プチド VPNLPQRFami de (配列番号： 40) の ΓΟΤ7Τ022 L (配列番号： 37) 発現 CHO細胞に対する c AMP産生抑制活性
実施例 7 (3) および（4) で合成したペプチド MPHSFANLPLRFamide (配列番号： 39) 、 VP LPQRFamide (配列番号： 40) ifi rOT7T022L受容体に対して特¾¾に反 iSTることが 実施例 7 (6) のサイトセンサーによる実験で確認できた。 次に上述したペプチドの rOT7T022L発現 CH0細胞に対する cAMP産生抑制活性の測定を行った。
雄例 7(2)で得られた rOT7T022L発現 CH0細胞を 1.0 x 105 cells/wellの '離で 24wel 1 プレートに巻き、 37度で 2日間培養した。ハンクスバッファー（HBSS)に 0.05¾ BSAと 0.2mM IBMXを加えたバッファーで細胞を洗浄したのち、同じバッファ一で 30分間 37度で放置した 。 30分後細胞を上記のバッファ一に Forskolin 10"6 Mを加えたアツセィバッファ一と同時 にさまざまな濃度の上述したぺプチドを添加し、 37度 30分間ィンキュベーションをした。
30分後各 wellの細胞内の cAMP濃度を cAMP EIA Kit (アマシャムネ： fc) の方法にしたがつ て視定した。 その結果、 図 9に示すようにペプチド MPHSFANLPLRFamide (配列番号： 39) 、 VPNLPQRFamide (配列番号： 40) は r0T7T022L受容体発現 CH0細胞に対して cAMP 制効果を示し、 その I 値はそれぞれ 0.5nM、 0.7nMと非常に低離で強い効果を示した。 mi ι ヒトι¾下部の G蛋白質 ¾βレセプ夕一蛋白質をコードする CDNAのクロ一 ニングと塩基配列の決定
ヒト 下部 cDNA ( CL0NTECH社） を麵とし、 2個のプライマ一、
プライマー 1 ： 5'- GTCGACATGG AGGGGGAGCC CTCCCAGCCT C -3' (配列番号： 57) およびプラ イマ一 2： 5'- ACTAGTTCAG ATATCCCAGG CTGGAATGG -3' (配列番号： 58) を用いて PC R反応 を行った。 該 こおける反«の ¾βΚ«±記 cDNA を 10分の 1量を^ として使用し、 Advantage- HF Polymerase Mix (CL0 TECHネ ±) 1/50量、 プライマー 1 (配列番号： 57) お よびプライマ一 2 (配列番号： 58) を各 0· 2 M、 dNTPs 200 M、 Dimethyl Sulfoxide 4¾ , および博素に酣のバッファーを加え、 25 lの とした。 PCR反応は、 ① 94 >2 分の後、 ② 94°C'20秒、 12V - 1分 30秒のサイクルを 3回、 ③ 94 · 20秒、 67 · 1分 30 秒のサイクルを 3回、 ④ 94t>20秒、 62 >20秒、 · 68 · 1分 30秒のサイクルを 38 回繰り返し、 最後に 68 : · 7分の伸長 を行った。 該 PC R反応後の反応産物を T Aクロ 一二ングキット （Invitrogenネ ±) の処方に従いプラスミドベクター pCR2.1 (Invitrogen ¾t) へサブクロ一ニングした。 これを:^ i菌 DH5 ひに導入し、 cDNAを持つクローンをアンピシリ ンを含む LB寒天培地中で選択した。個々のクローンの配列を膨した結果、新規 G蛋白質共 ¾レセプ夕一蛋白質をコードする cDNA配列 (配列番号： 5 5および 5 6 ) を得た。 これ ら 2種類の配列は、 第 597魁で一^ Sなるが、 導き出されるアミノ隱列は同一 （配列 番号： 5 7 ) であり、 このアミノ^ SH列を含 る新規 G蛋白質 Λ¾Μレセプ夕一蛋白質を hOT7T022 と命名した。 また 2 種類の形質転換体を大腸菌 (Escherichia col i)DH5 a I pCR2. l-hOT022T (配列番号： 5 5で表される c DNAを含 ¾ る） 、 ならびに (Escherichia col i)DH5 / pCR2. l-hOT022G (配列番号： 5 6で表される c DNAを含^ る） と命名した
錢上の利用可能性
本発明のポリペプチド、 レセプ夕一蛋白質などは、 例えば、 iMfflss ij艇性などを るため、 治療薬などとして することが、できる。 また、 本発明のポリペプチドま たはレセプ夕一蛋白質は、 本発明のポリべプチドまたはレセプ夕一蛋白質の活性を促進もし くは阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニングのための試薬として有用であり、 スクリ 一二ングによって得られる化合物は »疾患の予防 '治«』として期待される。 さらに、 本 発明のポリぺプチドまたはレセプ夕一蛋白質に対する抗体は、 本発明のポリぺプチドまたは レセプ夕一蛋白質を特異的に認識することができるので、 被検波中の本発明のポリぺプチド またはレセプ夕一蛋白質の定量などに使用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 配列番号： 1で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含有することを特徴とするポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩。
2. 実質的に同一のアミノ酸配列が 列番号： 8、 配列番号： 1 4、 配列番号： 1 8、 配 列番号： 3 3また《@Ξ列番号： 5 0で表されるアミノ^ IH列である請求項 1記載のポリぺプ チドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩。
3. 請求項 1記載のポリぺプチドの部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステ ルまたはその塩。
4. 配列番号： 1の第 8 1番目 （Met) ないし第 9 2番目 （Phe) のアミノ酸残基を含有し てなる請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩
5. 配列番号： 1の第 1 0 1番目 （Ser) ないし第 1 1 2番目 （Ser) のアミノ酸歹錢を含 有してなる請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩。
6. 配列番号： 1の第 1 2 4番目 （Val) ないし第 1 3 1番目 （Phe) のアミノ酸残基を含 有してなる請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩。
7. 請求項 1記載のポリペプチドの部分ペプチドのアミドまたはその塩。
8. 請求項 1記載のポリペプチドをコードする;^ S列を有する DNAを含有する DNA
9. 配列番号： 2、 配列番号： 9、 配列番号： 1 5、 配列番号： 1 9、 配麵号： 3 4ま たは配列番号： 5 1で表される塩基配列を る請求項 8記載の DNA。
1 0. 請求項 3記載の部分ペプチドをコードする DNAを含有する DNA。
1 1. 配列番号： 2で表される塩基配列の第 2 4 1番目ないし第 2 7 6番目の：^ Sを含有 してなる請求項 1 0記載の DNA。
1 2. 配列番号： 2で表される; ^SgH列の第 3 0 1番目ないし第 3 3 6番目の塩基を含有 してなる請求項 1 0記載の D N A。
1 3. 配列番号： 2で表される塩基配列の第 3 7 0番目ないし第 3 9 3番目の ¾Sを含有 してなる請求項 1 0記載の D N A。
1 4. 請求項 8または請求項 1 0記載の D N Aを含¾1"る纖えべクタ一。
1 5. 請求項 1 4記載の,えベクターで形質 された形質転換体。
1 6. 請求項 1 5記載の形 体を培養し、 請求項 1記載のポリペプチドまたは請求項 3記載の部分ペプチドを生成 ·蓄積せしめることを特徴とする請求項 1記載のポリペプチド もしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩、 または請求項 3記載の部分べプチ ドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩の 法。
1 7. 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩に対する抗体。
1 8. 請求項 8もしくは請求項 1 0記載の D N Aまたは請求項 1 7記載の抗体を含有してな る診断薬。
1 9. 請求項 8または請求項 1 0記載の D N Aに相補的または実質的に相補的な塩 SSB列 を有し、 該 DNAの発現を抑制し得る作用を るアンチセンス DNA。
2 0. 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩を含有してなる剤。
2 1. 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩を含有してなる医薬。
2 2. 請求項 1記載のポリペプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩を用いることを;! ^とする請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそ のエステルまたはその塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくは そのエステルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリ一ニン グ方法。
2 3. 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 およ Ό¾Ξ列番号： 3 7で表されるアミノ薩列と同一もしくは実質的に同一のァミノ ¾@5列を含有する蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのアミドもしく はそのエステルまたはその塩を用いることを とする請求項 2 2記載のスクリ一ニング方 法。
2 4. 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩を含有してなる請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩のスクリーニング用キット 。
2 5. 請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステルまたはその 塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルまたはそ の塩、 および配列番号： 3 7で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ 列を含有するする蛋白質またはその塩、 またはその部分べプチドもしくはそのァミドも しくはそのエステルまたはその塩を含有してなる請求項 2 4記載のスクリ一ニング用キット
2 6. 請求項 2 2記載のスクリーニング方法または請求項 2 4記載のスクリーニング用キ ットを用レて得られる請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのァミドもしくはそのエステ ルまたはその塩、 請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の活性を促進または阻害する化合物またはその塩。
2 7. 請求項 2 2記載のスクリ一ニング方法または請求項 2 4記載のスクリ一ニング用キ ットを用レ、て得られる請求項 1記載のポリぺプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステ ルまたはその塩、 または請求項 3記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエス テリレまたはその塩の活性を «または阻 ¾ "る化合物またはその塩を含有してなる医薬。
2 8. 配列番号： 3 7で表わされるァミノ ¾E列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を含 ることを とする蛋白質またはその塩。
2 9. 配列番号： 3 7で表わされるアミノ^ Ξ列と実質的に同一のアミノ^ Ξ列が 1E列番 号： 5 4で表されるアミノ酸配列である請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩。
3 0. 請求項 2 8記載の蛋白質の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステル またはその塩。
3 1. 請求項 2 8記載の蛋白質または請求項 3 0記載の部分ペプチドをコードする塩基配 列を る D N Aを含^ る D N A。
3 2. 配列番号： 3 8、 配列番号： 5 5また《12列番号： 5 6で表される; ¾配列を ¾ る請求項 3 1記載の DNA。
3 3. 請求項 3 1記載の DNAを含 ¾fる えべクタ一。
3 4. 請求項 3 3記載の SMえべクターで形 «¾換させた形質転換体。
3 5. 請求項 3 4記載の形質転換体を培養し、 請求項 2 8記載の蛋白質または請求項 3 0 記載の部分ペプチドを生成'蓄積せしめることを特徴とする請求項 2 8記載の蛋白質または その塩、 または請求項 3 0記載の部分べプチドもしくはそのアミドもしくはそのエステルま たはその塩の 法。
3 6. 請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩、 または請求項 3 0記載の部分ペプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩に対する抗体。
3 7. 請求項 3 1記載の DN Aまたは請求項 3 6記載の抗体を含有してなる診断薬。
3 8. 請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩、 または請求項 3 0記載の部分べプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることにより得られる請求項 2 8 記載の蛋白質またはその塩に対するリガンド。
3 9 · 請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩、 または請求項 3 0記載の部分べプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを; ^とする請求項 2 8記 載の蛋白質またはその塩に対するリガンドの決定方法。
4 0. 請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩、 または請求項 3 0記載の部分べプチドもし くはそのァミドもしくはそのエステルまたはその塩を用いることを特徴とするリガンドと請 求項 2 8記載の蛋白質またはその塩との結合性を変化させる化合物またはその塩のスクリー ニング方法。
4 1. 請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩、 または請求項 3 0記載の部分べプチドもし くはそのアミドもしくはそのエステルまたはその塩を含 「することを とするリガンドと 請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩との 性を変化させる化合物またはその塩のスクリ 一二ング用キッ卜。
4 2. 請求項 4 0記載のスクリ一二ング方法または請求項 4 1記載のスクリ一ニング用キ ットを用いて得られる、 リガンドと請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩との 性を変化 させる化合物またはその
4 3. 請求項 4 0記載のスクリ一二ング方法または請求項 4 1記載のスクリ一ニング用キ ットを用いて得られる、 リガンドと請求項 2 8記載の蛋白質またはその塩との 性を変化 させる化合物またはその塩を含有してなる医薬。
4 4. 請求項 3 6記載の抗体を用いることを とする請求項 2 8記載の蛋白質またはそ の塩の定 m。
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