WO1999004021A1 - Dna-sequenz codierend für eine hydroxyphenylpyruvatdioxygenase und deren überproduktion in pflanzen - Google Patents

Dna-sequenz codierend für eine hydroxyphenylpyruvatdioxygenase und deren überproduktion in pflanzen Download PDF

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plant
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expression
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Harald Seulberger
Jens Lerchl
Ralf-Michael Schmidt
Karin Krupinska
Jon Falk
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Basf Aktiengesellschaft
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    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing plants with an increased vitamin E content by expressing an exogenous or endogenous HPPD gene in plants or parts of plants.
  • the invention further relates to the use of the corresponding nucleic acids coding for an HPPD gene in transgenic plants in order to make them resistant to inhibitors of HPPD, and to the use of the DNA sequence coding for an HPPD for the production of a test system for the identification of inhibitors the HPPD.
  • the eight naturally occurring compounds with vitamin E activity are derivatives of 6-chromanol (Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH
  • the first group (la - d) comes from Tocol
  • the second group consists of tocotrienol derivatives (2a - d):
  • ⁇ -Tocopherol is of great economic importance.
  • the tocopherol biosynthesis in plants and algae is known to proceed as follows:
  • the precursor of the aromatic ring of the tocopherols is p-hydroxyphenylpyruvate (3), which is converted enzymatically with the help of the enzyme hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) into homogentisic acid (4), which reacts with phytylpyrophosphate to eliminate CO 2 to the precursor (6) .
  • HPPD hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
  • the tocotrienol biosynthetic pathway starts with the condensation of homogentisic acid (4) with geranyl geranyl pyrophosphate to the precursor (5).
  • the enzymatic cyclization of precursors 5 or 6 leads to ⁇ - tocotrienol or to ⁇ - tocopherol.
  • PEA3_MOUSE Mus muscula (mouse) PEA3 polypeptide, AC X63190;
  • MELA_SHECO Shewanella colwelliana, melA protein, AC M5 289, WO 96/38567 describes the HPPD DNA sequence from Arabidopsis thaliana and Daucus carota.
  • HPPD-DNA sequences is an essential prerequisite both for use in crop protection for the production of herbicide-resistant plants and for increasing the vitamin E synthesis in plants - for example for the production of feed with increased vitamin E content .
  • the object of the present invention was to develop a transgenic plant with an increased vitamin E content.
  • Another object of the present invention was to develop a transgenic plant which is resistant to inhibitors of HPPD.
  • An additional object of the present invention was to develop a test system for identifying inhibitors of HPPD.
  • This object was achieved by expressing an HPPD gene from barley in a plant or a microorganism and then testing chemicals for inhibiting the HPPD enzyme activity.
  • a first object of the present invention relates to the cloning of the complete HPPD gene from barley via the isolation of the cDNA specific for the HPPD gene (HvSD36).
  • Fig. 1 shows a schematic drawing of the primary barley leaf on different days after sowing. The determined total length of the leaves can be seen on the scale on the left. The differently differentiated leaf areas of the primary leaf selected for the analysis of the gene expression are drawn in and designated I-IV.
  • RNA differentiated areas of the primary leaf of the barley indicate a development-dependent expression of the barley HPPD.
  • a strong accumulation of the approx. 1600 nt long transcript takes place in the meristatic area at the base of the primary sheet (I).
  • the content of this transcript decreases with increasing age of the tissue (Ha and Ilb) and increases again in the fully differentiated cells with mature chloroplasts (III).
  • the content of the 1600 nt long transcript is highest in senescent areas of the primary leaf (IV).
  • an approx. 3100 nt long transcript can only be detected in the meristematic cells at the base of the primary leaf. This transcript is also no longer detectable as the tissue matures.
  • a 207 bp cDNA fragment was first isolated, the corresponding transcript of which is accumulated in the primary leaf of the barley in the case of dark-induced senescence.
  • This fragment (sequence listing: sequence ID NO: 1: nucleotide position 1342-1549) was then used as a probe in order to isolate a cDNA clone with a larger insert from barley senescent flag leaves in a cDNA library (in ⁇ -ZAP-II) .
  • the cDNA fragment (sequence listing: sequence ID NO: 1: nucleotide position 771-1529) was cloned into the EcoRI site of pBluescript (SK "). At both ends of the cDNA there is also a 14 bp adapter sequence which is used for ligation in ⁇ -ZAP-II was required, and selected restriction sites of the vector and the cDNA itself are shown.
  • the 759 bp cDNA fragment was used as a probe for another attempt to obtain a complete sequence of HvSD 36.
  • a cDNA bank from RNA of the meristematic range of 5 day old barley seedlings was available.
  • the Lambda Phage ExCell Eco was used for this cDNA bank RICIP from Pharmacia (Freiburg) (product number: 27-5011, 45.5kb) is used.
  • the 434 amino acid protein sequence has the highest homology to the sequence of the HPPD from Arabidopsis thaliana among the sequences in the databases with 58%.
  • a Lambda FIXII bank of the barley was obtained from the company Stratagene (Heidelberg, product number 946104). DNA from etiolated leaves of winter barley cv was used to produce the bank. Igri. The DNA was partially digested with Sau3AI. Before cloning into the Xhol site of the vector, the fragment ends and the phage arms were filled with nucleotides. Screening the bank for 200,000 pfu in the first round revealed only one clone that hybridized with the cDNA HvSD36.
  • FIG. 3 shows the schematic structure of the barley HPPD gene.
  • the invention relates in particular to expression cassettes, the sequence of which codes for an HPPD or its functional equivalent, and their use for producing a plant with an increased vitamin E content.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or a cDNA sequence. Coding sequences suitable for insertion into an expression cassette according to the invention are, for example, those which code for HPPD and which give the host the ability to overproduce vitamin E.
  • an expression cassette according to the invention also contain regulatory nucleic acid sequences which control the expression of the coding sequence in the host cell.
  • an expression cassette according to the invention comprises upstream, ie at the 5 'end of the coding sequence, a promoter and downstream, ie at the 3' end, a polyadenylation signal and, if appropriate, further regulatory elements which are in between coding sequence for the HPPD gene are operatively linked.
  • An operational link is understood to mean the sequential arrangement of the promoter, coding sequence, terminator and possibly other regulatory elements such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • sequences preferred but not limited to the operative linkage are targeting sequences to ensure subcellular localization in the apoplast, in the vacuole, in plastids, in the mitochondrion, in the endoplasmic reticulum (ER), in the cell nucleus, in oil corpuscles or other compartments and Translation enhancers such as the 5 'guiding sequence from the tobacco mosaic virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8693-8711).
  • the plant expression cassette can be built into the tobacco transformation vector pBinAR-Hyg.
  • Fig. 4 shows the tobacco transformation vectors pBinAR-Hyg with 35S promoter (A) or pBinAR-Hyg with seed-specific promoter Phaseolin 796 (B):
  • any promoter which can control the expression of foreign genes in plants is suitable as promoters of the expression cassette according to the invention.
  • a plant promoter or a plant virus-derived promoter is preferably used.
  • the CaMV 35S promoter from the cauliflower mosaic virus is particularly preferred (Franck et al., Cell 21 (1980) 285-294).
  • this promoter contains different recognition sequences for transcriptional effectors, which in their entirety lead to permanent and constitutive expression of the introduced gene (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195-2202).
  • the expression cassette according to the invention can also contain a chemically inducible promoter, by means of which the expression of the exogenous HPPD gene in the plant can be controlled at a specific point in time.
  • a chemically inducible promoter as for example the PRPl promoter (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), a promoter induced by salicylic acid (WO 95/19443), a promoter induced by benzenesufonamide (EP- A 388186), one that can be induced by tetracycline (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), one that can be induced by abscisic acid (EP-A 335528) or that by ethanol or cyclohexanone.
  • inducible (WO 93/21334) promoter can be used inter alia.
  • promoters are particularly preferred which ensure expression in tissues or parts of plants in which the biosynthesis of vitamin E or its precursors takes place. Promoters that ensure leaf-specific expression should be mentioned in particular.
  • the promoter of the cytosolic FBPase from potatoes or the ST-LSI promoter from potatoes should be mentioned (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989) 2445-245).
  • the expression cassette according to the invention can therefore, for example, be a seed-specific promoter (preferably the phaseolin promoter (US 5504200), the USP- (Baumlein, H. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or LEB4 promoter (Fiedler and Conrad, 1995)), the LEB4 signal peptide, the gene to be expressed and an ER retention signal.
  • a seed-specific promoter preferably the phaseolin promoter (US 5504200), the USP- (Baumlein, H. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) or LEB4 promoter (Fiedler and Conrad, 1995)
  • the structure of such a cassette is shown schematically as an example in Figure 4.
  • An expression cassette according to the invention is produced by fusing a suitable promoter with a suitable HPPD-DNA sequence and preferably a DNA inserted between the promoter and HPPD-DNA sequence, which codes for a chloroplast-specific transit peptide, and a polyadenylation signal according to common recombination and cloning techniques, such as for example in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987).
  • sequences which ensure targeting in the apoplasts, plastids, the vacuole, the mitochondrium, the endoplasmic reticulum (ER) or, due to the lack of corresponding operative sequences, ensuring that the resulting compartment, the cytosol, remains (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423).
  • Proven particularly beneficial for the amount of protein accumulation in transgenic plants has a localization in the ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792).
  • the invention also relates to expression cassettes whose DNA sequence encodes an HPPD fusion protein, part of the fusion protein being a transit peptide which controls the translocation of the polypeptide.
  • Particularly preferred for the chloroplasts are specific transit peptides which, after translocation of the HPPD gene into the chloroplasts, are cleaved off enzymatically from the HPPD part.
  • Particularly preferred is the transit peptide derived from the plastidic transketolase (TK) or a functional equivalent of this transit peptide (e.g. the transit peptide of the Rubisco small subunit or the ferredoxin NADP oxidoreductase).
  • the inserted nucleotide sequence coding for an HPPD can be produced synthetically or obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components.
  • synthetic nucleotide sequences with codons are generated which are preferred by plants. These codons preferred by plants can be determined from codons with the highest protein frequency, which are expressed in most interesting plant species.
  • various DNA fragments can be manipulated in order to obtain a nucleotide sequence which expediently reads in the correct direction and which is equipped with a correct reading frame.
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the promoter and terminator regions according to the invention can expediently be provided in the transcription direction with a linker or polylinker which contains one or more restriction sites for the insertion of this sequence.
  • the linker has 1 to 10, usually 1 to 8, preferably 2 to 6, restriction sites.
  • the linker has a size of less than 100 bp, often less than 60 bp, but at least 5 bp within the regulatory ranges.
  • the promoter according to the invention can be both native or homologous and foreign or heterologous to the host plant.
  • the expression cassette according to the invention contains the promoter according to the invention, any DNA sequence and a region for the transcriptional termination in the 5 '-3' transcription direction. Different termination areas are interchangeable.
  • Preferred polyadenylation signals are plant polyadenylation signals, preferably those which essentially correspond to T-DNA polyadenylation signals from Agrobacterium tumefaciens, in particular gene 3 of T-DNA (octopine synthase) of the Ti plasmid pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835 ff) or functional equivalents.
  • An expression cassette according to the invention can, for example, contain a constitutive promoter (preferably the CaMV 35 S promoter), the LeB4 signal peptide, the gene to be expressed and the ER-
  • the amino acid sequence KDEL (lysine, aspartic acid, glutamic acid, leucine) is preferably used as the ER retention signal.
  • the fused expression cassette which codes for an HPPD gene is preferably cloned into a vector, for example pBin19, which is suitable for transforming Agrobacterium tumefaciens.
  • Agrobacteria transformed with such a vector can then be used in a known manner to transform plants, in particular crop plants, such as tobacco plants, for example, by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • the transformation of plants by agrobacteria is known, inter alia, from FF White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15-38 transformed cells of the wounded leaves or leaf pieces can be regenerated in a known manner transgenic plants which contain a gene integrated into the expression cassette according to the invention for the expression of an HPPD gene.
  • an expression cassette according to the invention is inserted as an insert into a recombinant vector whose vector DNA contains additional functional regulation signals, for example sequences for replication or integration.
  • Suitable vectors are inter alia in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology” (CRC Press), Chap. 6/7, pp. 71-119 (1993).
  • the expression cassettes according to the invention can be cloned into suitable vectors which enable their multiplication, for example in E. coli.
  • suitable cloning vectors include pBR332, pUC series, M13mp series and pACYC184.
  • Binary vectors which can replicate both in E. coli and in agrobacteria are particularly suitable.
  • the invention further relates to the use of an expression cassette according to the invention for transforming plants, cells, tissues or parts of plants.
  • the aim of the use is preferably to increase the vitamin E content of the plant.
  • the expression can take place specifically in the leaves, in the seeds or in other parts of the plant.
  • Such transgenic plants, their reproductive material and their plant cells, tissue or parts are a further subject of the present invention.
  • the expression cassette according to the invention can also be used to transform bacteria, cyanobacteria, yeast, filamentous fungi and algae with the aim of increasing vitamin E production.
  • transformation The transfer of foreign genes into the genome of a plant is called transformation.
  • the methods described for the transformation and regeneration of plants from plant tissues or plant cells for transient or stable transformation are used. Suitable methods are protoplast transformation by polyethylene glycol-induced DNA uptake, the biolistic method with the gene gun - the so-called particle bombardment method, electroporation, and incubation dry embryos in DNA-containing solution, microinjection and gene transfer mediated by agrobae.
  • the methods mentioned are described, for example, in B. Jenes et al. , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, edited by SD Kung and R. Wu, Academic Press (1993) 128 - 143 and in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol.
  • the construct to be expressed is preferably cloned into a vector which is suitable for transforming Agro acterium tumefaciens, for example pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984) 8711).
  • Agrobacteria transformed with an expression cassette according to the invention can also be used in a known manner for transforming plants, in particular crop plants, such as cereals, maize, oats, soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomato , Rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • crop plants such as cereals, maize, oats, soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potatoes, tobacco, tomato , Rapeseed, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species can be used, e.g. by bathing wounded leaves or leaf pieces in an agrobacterial solution and then cultivating them in suitable media.
  • Functionally equivalent sequences which code for an HPPD gene are, according to the invention, those sequences which, despite a different nucleotide sequence, still have the desired functions.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. Artificial nucleotide sequences obtained by chemical synthesis and adapted to the codon use of a plant.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations of an originally isolated sequence coding for an HPPD, which furthermore show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • the present invention also encompasses those nucleotide sequences which are obtained by modifying this nucleotide sequence. The aim of such a modification can e.g. further narrowing down the coding sequence contained therein or e.g. also be the insertion of further restriction enzyme interfaces.
  • amino acids are also those variants whose function is weakened or enhanced compared to the original gene or gene fragment.
  • artificial DNA sequences are suitable as long as, as described above, they impart the desired property of increasing the vitamin E content in the plant by overexpressing the HPPD gene in crop plants.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins constructed using molecular modeling, which have HPPD activity, or by in vitro selection. Coding DNA sequences which are obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host plant are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person skilled in plant genetic methods by computer evaluations of other, known genes of the plant to be transformed.
  • Sequences which code for fusion proteins are to be mentioned as further suitable equivalent nucleic acid sequences according to the invention, a component of the fusion protein being a plant HPPD polypeptide or a functionally equivalent part thereof.
  • the second part of the fusion protein can e.g. be another polypeptide with enzymatic activity or an antigenic polypeptide sequence that can be used to detect HPPD expression (e.g. myc-tag or his-tag).
  • this is preferably a regulatory protein sequence, such as e.g. a signal or transit peptide that directs the HPPD protein to the desired site of action.
  • the invention also relates to the expression products and fusion proteins produced according to the invention from a transit peptide and a polypeptide with HPPD activity.
  • increasing the vitamin E content means the artificially acquired ability of an increased vitamin E biosynthesis capacity by functional overexpression of the HPPD gene in the plant compared to the non-genetically modified plant for the duration of at least one plant generation.
  • the biosythesis site of vitamin E is generally the leaf tissue, so that leaf-specific expression of the HPPD gene makes sense.
  • the vitamin E bio-synthesis does not have to be restricted to the leaf tissue, but can also be tissue-specific in all other parts of the plant, for example in fatty seeds.
  • constitutive expression of the exogenous HPPD gene is advantageous.
  • inducible expression may also appear desirable.
  • the effectiveness of the expression of the transgenically experimented HPPD gene can be determined, for example, in vitro by multiplication of the shoot meristem.
  • a change in the type and level of expression of the HPPD gene and its effect on the vitamin E biosynthesis performance on test plants can be tested in greenhouse experiments.
  • the invention also relates to transgenic plants transformed with an expression cassette according to the invention, and to transgenic cells, tissues, parts and propagation material of such plants.
  • Transgenic crop plants such as e.g. Barley, wheat, rye, corn, oats, soy, rice, cotton, sugar beet, canola, sunflower, flax, hemp, potato, tobacco, tomato, rape, alfalfa, lettuce and the various tree, nut and wine species.
  • Plants in the sense of the invention are mono- and dicotyledonous plants or algae.
  • HPPD is a suitable target for herbicides of the sulcotrione type.
  • the complete cDNA sequence of the barley HPPD is cloned into an expression vector (pQE, Qiagen) and overexpressed in E. coli.
  • HPPD protein expressed with the aid of the expression cassette according to the invention is particularly suitable for the detection of inhibitors specific for HPPD.
  • the HPPD can be used, for example, in an enzyme test in which the activity of the HPPD is determined in the presence and absence of the active substance to be tested. By comparing the two activity determinations, a qualitative and quantitative statement can be made about the inhibitory behavior of the active substance to be tested.
  • test system With the help of the test system according to the invention, a large number of chemical compounds can be checked quickly and easily for herbicidal properties.
  • the method makes it possible to selectively reproducibly select those with great potency from a large number of substances in order to use these sub- then perform further in-depth tests that are familiar to the specialist.
  • the invention further relates to herbicides which can be identified using the test system described above.
  • cloning steps carried out in the context of the present invention such as, for example, restriction cleavages, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria Multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6).
  • the bacterial strains used below (E. coli, XL-I Blue) 5 were obtained from Stratagene or Pharmacia in the case of NP66.
  • the agrobacterial strain used for plant transformation (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 with the plasmid pGV2260 or pGV3850 can) was developed by Deblaere et al. in (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777). Alternatively, the agrobact
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a 20 laser fluorescence DNA sequencer from Licor (sales by MWG Biotech, Ebersbach) according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) , 5463-5467).
  • nucleotides 11749-11939 was isolated as a PvuII-HindIII fragment and added after addition of Sphl linkers cloned the PvuII interface between the SpHI-HindIII interface of the vector pBmAR-Hyg. It was born
  • the reaction mixtures (20 ⁇ l) also contained 20 ⁇ M dNTPs, 10 ⁇ M DTT, 1 ⁇ RT buffer and 1 ⁇ M (dT) 12VN primer each.
  • the anchor primers required for these reactions were synthesized on the basis of Liang and Pardee:
  • the PCR reaction mixtures each contained 20 ⁇ l of lxPCR buffer, 2 ⁇ M dNTPs, 2.5 ⁇ Ci ( ⁇ 33 P) -dATP, 1 ⁇ M (dT) ⁇ 2 VN “primers”, 1/10 vol. RT mix (Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 1989), 1 U Taq DNA polymerase (Boehringer, Mannheim) and 1 uM 10-mer random "primer”.
  • the PCR reactions were carried out in a Uno block (Biometra) according to the following program:
  • Steps 2, 3 and 4 were carried out 40 times in succession. This resulted in approximately 100 cDNA bands per reaction and "primer" combination.
  • the amplified cDNA fragments were separated in non-denaturing polyacrylamide gels of the following composition: 6% (w / v) acrylamide (Long Ranger, AT Biochem), 1.2 x TBE buffer, 0.005% (v / v) TEMED and 0.005% (w / v) APS (Bauer et al, Nucl. Ac. Res. (1993) 21, 4272-4280).
  • RNA preparations (9 and 9 'and 11 and 11') were made from the primary leaves of the barley harvested on days 9 and 11 and used in parallel in the subsequent analysis.
  • the result is shown for two different primer combinations (A and B), two differences in the band pattern between the sample from days 9 and 11 being highlighted by arrows. Only those bands that appeared equally in the two samples from senescent plants and did not appear in the two comparative samples were observed in the later analysis of the gels.
  • the electrophoresis was carried out over a period of 2.5 hours at 40 watts (0.8 W / cm 3 ) in 1 x TBE buffer. After separation of the cDNA fragments, the gel was transferred to filter paper (Schleicher & Schüll, Dassel).
  • the samples for the RNA analysis were harvested in the middle of the original night phase.
  • RNA from flag leaves collected at seven different times in the field (Fig. 6). The leaves were fully grown on May 29 and had less than 10% of the original chlorophyll content on June 21. The beginning of the senescence processes is indicated by an arrow in Figure 6 (i.e. 17 days after reaching its full length on June 15). The day on which photosystem II efficiency decreased (Humbeck et al., Plant Cell Environment (1996) 19: 337-344) was defined as the beginning of senescence.
  • FIG. 6 shows the hybridization of "Northern blots" A and B with the cDNA HvSD36 and a probe specific for the rbcS gene.
  • Filter A carries RNA from barley primary leaves after 9 days of L / D change (9), after one or two days of dark incubation (10, 11) and then again for one day (12).
  • Filter B contains RNA from flag leaves, the 1992 in the period from 29.05. until June 21 were harvested outdoors. The arrow indicates the beginning of the sequence on June 15th. on.
  • the amount of r cS-specific RNA is high when the amount of the mRNA specific for the HPPD is relatively small.
  • the mRNA specific for HPPD is not detectable in primary leaves of nine-day-old plants before transfer to the dark and clearly accumulates during the dark phase. When the plants are re-exposed, the amount of this mRNA decreases significantly.
  • small amounts of the mRNA specific for the HPPD can already be detected in fully grown, non-senescent leaves. An increased expression occurs 4 days before the actual start of senescence. The highest amount of this mRNA is in senescent leaves.
  • RNA species A size comparison with known RNA species showed that the transcript detected with the cDNA probe HvSD36 (S: senescence; D: dark, fragment number 36 in the DDRT gel) has a length of approximately 1.6 kb.
  • DDRT-PCR independently obtained three cDNA fragments that gave this expression pattern and actually represent the same transcript based on the sequence analysis. The longest fragment was 230 bp in size.
  • the 230 bp PCR product was finally cloned with the "Sure Clone TM Ligation Kit" (Pharmacia, Freiburg) according to the manufacturer's instructions into the Smal interface of the vector pUC18.
  • the recombinant plasmid was transformed into competent cells of the E. coli strain DH5 ⁇ .
  • the sequence information was initially insufficient to find clear homology with a sequence in the databases.
  • a lambda ZAPII bank (Stratagene, Heidelberg) from RNA senescent flag leaves was screened using the 230 bp fragment as a probe.
  • the probe was labeled with Dig-dUTP according to the "DNA Labeling and Detection Kit” (Boehringer, Mannheim).
  • the bank was examined according to the protocol of the "ZAP-cDNA Synthesis Kit” (Stratagene, Heidelberg).
  • the insert in question could be cut out of the Bluescript plasmid using EcoRI.
  • the cDNA clone obtained in the case of the HvSD36 cDNA contains an "insert" with a size of approx. 800 bp.
  • the cDNA was completely sequenced using the "SequiTherm Excel Long-Read DNA Sequencing Kit” (Epicenter Technologies, Biozym Diagnostic, Oldendorf) using universal "primers” labeled with IRD41, which bind to sequence regions in the Bluescript vector.
  • the DNA fragments were detected using the infrared laser of the 4000L automatic sequencer from Licor.
  • the protein sequence HvSD36 which has a total of 180 amino acids, has the highest homology to the sequence of human HPPD of 41% of the sequences in the databases. In view of the length of the transcript detected in the "Northern blot" (approx. 1600 nt), it can be assumed that the cDNA still lacks 850-900 bp.
  • 400,000 pfu were checked with the 759 bp long HvSD36 probe, 5 phages being detected by the probe. Excision of the "phagemids" from the phage was carried out in vivo using the bacterial strain NP66 according to the information from Pharmacia (Freiburg). The recombinant pExCell plasmids were isolated from individual bacterial colonies and transferred to the bacterial strain D115 ⁇ for propagation.
  • the longest cDNA clone HvSD36 isolated in this way has a length of 1565 bp and has been completely sequenced (see sequence listing).
  • a Lambda FiXII bank of the barley was obtained from the company Stratagene (Heidelberg). DNA from etiolated leaves of winter barley cv was used to produce the bank. Igri. The DNA was partially digested with Sau3AI. Before cloning into the Xhol site of the vector, the fragment ends and the phage arms were filled with nucleotides. Screening the bank for 200,000 pfu in the first round revealed only one clone that hybridized with the cDNA HvSD36.
  • the bank was screened according to the instructions given for the HybondN membrane.
  • the labeling of the probe for the screening of the bank and for "Southern” blot hybridizations was carried out by "random priming" with 32 P-dATP using the Klenow enzyme (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
  • the lengths of the fragments were estimated by comparison with a DNA size standard (Kb ladder from GibcoBRL, Eggenstein).
  • HPPD_PSESP PIFEIMGFTK VATHRSKDV- HLYRQGAINL ILN — NE
  • PEA3_M0USE PGNGSLGEAL MVPQGKLMDP GSLPPSDSED LFQDLSHFQE TWLAEAQVPD
  • HPPD_PSESP IDFV FLEG VDRHPVGA— GLKIIDH LTHNVYRGRM -A YWANF
  • HPPD_Ath Arabidopsis thaliana 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
  • HPPD_HUMAN H. sapiens 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
  • HPPD_PIG Pig 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
  • HPPD_RAT Rat F alloantigen
  • HPPD_MOUSE Mouse 4-hydroxyphenylpyruvate dioxy- genese
  • MELA_SHECO S. colwelliana melA protein
  • HPPD_PSESP Pseudomonas sp. (strain P.J.874) 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
  • PEA3_M0USE Mus musculus (mouse)
  • Barley seedlings (Hordeum vulgäre L., cv.Carina, Ackermann Saatzucht, Irbach, Germany) were grown over a period of 15 days under controlled conditions in the climatic chamber in so-called Mitscherlich pots in soil, the 4 g per liter Osmocote 5M (Urania, Hamburg , Germany), attracted. To ensure uniform growth, the seeds were germinated on moist filter paper in the dark for 2 days at 4 ° C and 1 day at 21 ° C and only those seedlings that showed the same length growth of the primary root were used. After transferring these seedlings to earth, they were covered with 1.5 cm of sieved earth.
  • the plants were then incubated for 9 days with 16 hours of light (120 ⁇ m-m- 2 -s _1 ) and 8 hours of darkness in conjunction with a temperature chart (21 ° C. during the day, 16 ° C. at night). To induce senescence, the plants are kept in the dark at the above temperature after 9 days for 2 days (days 10 and 11).
  • the tobacco plants were grown using a known method.
  • the variety of tobacco used is Nicotiana tabacum, cv. Xanthi.
  • the expression cassette according to the invention containing the HPPD gene with the sequence 1 was cloned into the vector pBinAR-Hyg
  • the HPPD cDNA was provided with a CaMV35S promoter and overexpressed in tobacco using the 35S promoter.
  • the seed-specific promoter of the phaseolin gene was used to specifically increase the tocopherol content in the tobacco seed.
  • Tobacco plants transformed with the appropriate constructs were grown in the greenhouse.
  • the ⁇ -tocopherol content of the whole plant or the seeds of the plant was then determined. In all cases the ⁇ -tocopherol concentration was increased compared to the non-transformed plant.

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Abstract

Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Vitamin E Biosyntheseleistung durch Überexpression eines pflanzlichen HPPD-Gens aus Gerste.

Description

DNA- Sequenz codierend für eine Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase und deren Überproduktion in Pflanzen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Expression eines exogenen oder endogenen HPPD-Gens in Pflanzen oder Pflanzen- teilen. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der entsprechenden Nukleinsäuren kodierend für ein HPPD-Gen in trans- genen Pflanzen, um diese resistent gegenüber Hemmstoffen der HPPD zu machen, sowie die Verwendung der DNA- Sequenz codierend für eine HPPD zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der HPPD.
Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant wäre auch die Ent- wicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitaminen, wie z.B. der Erhöhung des Vitamin E-Gehaltes.
Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Aktivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH
Verlagsgesellsphaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E) . Die erste Gruppe (la — d) stammt von Tocol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a - d) :
Figure imgf000003_0001
la , α -Tocopherol : R1 = R2 = R3 = CH3 lb, ß -Tocopherol [148 - 03 - 8] : R1 = R3 = CH3 , R2 = H lc , γ - Tocopherol [54 - 28 - 4 ] : R1 = H, R2 = R3 = CH3 ld, δ - Tocopherol [119 - 13 - 1] : R1 = R2 = H, R3 = CH3
Figure imgf000004_0001
2a, α-Tocotrienol [1721-51-3] : R1 = R2 = R3 = CH3 2b, ß-Tocotrienol [490-23-3] : R1 = R3 = CH3, R2 = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2] : R1 = H, R2 = R3 = CH3
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3] : R1 = R2 = H, R3 = CH3
Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol.
Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits der Vitamin E-Gehalt bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipuliert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zellkulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teilweise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre die Erhöhung des Vitamin E Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt.
Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, ein für die Vitamin E Syntheseleistung kodierendes, essentielles Biosynthese - gen zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflussen, identifiziert werden.
Die Tocopherol-Biosynthese in Pflanzen und Algen verläuft bekannt wie folgt:
Figure imgf000005_0001
4 -Hydroxyphenylpyruvat Ho ogentisinsäure (3) (4)
Figure imgf000005_0002
(5) (6]
\ , δ -Tocotrienol (2d) δ-Tocopherol (ld)
! ,
ß- or Y" Tocotrienol ß- or Y- Tocopherol (2b or 2c) (lb or lc)
Figure imgf000005_0003
α -Tocotrienol (2a) α -Tocopherol (la)
Vorstufe des aromatischen Rings der Tocopherole ist p-Hydroxy- phenylpyruvat (3) , das enzymatisch mit Hilfe des Enzyms Hydroxy- phenylpyruvatdioxygenase (HPPD) in Homogentisinsäure (4) umgewandelt wird, die mit Phytylpyrophosphat unter Eliminierung von C02 zur Vorstufe (6) reagiert. Der Tocotrienolbiosyntheseweg beginnt mit der Kondensation von Homogentisinsäure (4) mit Gera- nylgeranylpyrophosphat zur Vorstufe (5) . Die enzymatische Cycli- sierung der Vorstufen 5 oder 6 führt zu δ - Tocotrienol bzw. zu δ - Tocopherol. Einige dieser Biosyntheseenzyme wurden isoliert. 5
Bei der Suche nach Arabidopsis-Mutanten, die Defekte in der Caro- tinoidbiosynthese aufweisen, wurde eine Mutante mit weißem Phäno- typ identifiziert, die keine aktive HPPD bilden kann. Wenn die als pds2 bezeichnete Mutante in Gegenwart von Homogentisinsäure
10 angezogen wird, bildet sie wie der Wildtyp Carotinoide und er- grünt (Norris et al . , Plant Cell (1995) 7: 2139 - 2149). Diese Untersuchung zeigt, daß die Aktivität der HPPD Voraussetzung für die Ausbildung photosynthetisch aktiver Chloroplasten ist. Ohne dieses Enzym werden keine Plastochinone gebildet, die als Akzep-
15 toren für freigesetzte Reduktionsäquivalente während der Caroti - noidbiosynthese erforderlich sind (Phytoendesaturierung) . Die Schlüsselrolle der HPPD im plastidären Stoffwechsel macht sie zu einem interessanten Target für Herbizide. Sulcotrione hemmen die Aktivität des Enzyms effektiv (Schultz et al . , FEBS Lett. (1993)
20 318: 162 - 166) .
Von den im folgenden genannten Organismen sind bereits Sequenzen HPPD spezifischer Gene bekannt:
25
30
5
Figure imgf000006_0001
0 Desweiteren sind folgende Sequenzen mit deutlicher Homologie zu HPPD-Sequenzen in den Datenbanken zu finden:
PEA3_MOUSE: Mus muscula (Maus) PEA3 polypeptide, AC X63190;
5 MELA_SHECO: Shewanella colwelliana, melA Protein, AC M5 289, In WO 96/38567 wird die HPPD DNA-Sequenz aus Arabidopsis thaliana und Daucus carota beschrieben.
Sowohl für die Anwendung im Pflanzenschutz zur Erzeugung Herbi- zid-resistenter Pflanzen als auch für die Erhöhung der Vitamin E-Synthese in Pflanzen - beispielsweise zur Erzeugung von Futtermitteln mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt - ist die Kenntnis der HPPD-DNA-Sequenzen unbedingte Voraussetzung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt.
Weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer gegen Inhibitoren der HPPD resistenten transgenen Pflanze.
Beide Aufgaben wurden überraschenderweise gelöst durch die Überexpression eines HPPD-Gens in den Pflanzen.
Zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Ent- Wicklung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der HPPD.
Diese Aufgabe wurde gelöst durch die Expression eines HPPD-Gens aus Gerste in einer Pflanze bzw. einem Mikroorganismus und anschließende Testung von Chemikalien auf Hemmung der HPPD- Enzymaktivität .
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Klonierung des vollständigen HPPD-Gens aus Gerste über die Isolierung der für das HPPD-Gen spezifischen cDNA (HvSD36) .
Während der Blattseneszenz tritt eine deutliche Erhöhung des Vitamin E-Gehalts in den Blättern auf (Rise et al., Plant Physiol. (1989) 89: 1028 - 1030). Das monokotyle Blatt der Gerste stellt einen Gradienten von Zellen unterschiedlichen Alters dar, da das Blatt ein basal gelegenes Meristem hat, von dem sich sukzessive neue Zellen abspalten. Somit liegen die ältesten Zellen an der Spitze des Blattes und die jüngsten an der Basis. Abb. 1 zeigt eine schematische Zeichnung des Primärblattes der Gerste an verschiedenen Tagen nach Aussaat. Die ermittelte Gesamtlänge der Blätter ist in der Skala links zu entnehmen. Eingezeichnet und mit I - IV benannt sind die für die Analyse der Genexpression ausgewählten verschieden weit differenzierten Blattbereiche des Primärblattes. Die Pflanzen wurden in einem täglichen Licht/Dunkel -Wechsel (L/D) angezogen bzw. zur Induktion der Seneszenz nach 6 Tagen abgeschnitten und für 2 Tage dunkel (2 nD) inkübiert. Eine "Northern blot" -Analyse mit RNA aus verschieden weit differenzierten Bereichen des Primärblattes der Gerste (siehe Abb. 2) deuten auf eine entwicklungsabhängig gesteuerte Expression der HPPD der Gerste hin. So findet eine starke Akkumulation des ca. 1600 nt langen Transkriptes im meri- stematischen Bereich an der Basis des Primärblattes (I) statt. Der Gehalt an diesem Transkript fällt mit zunehmendem Alter des Gewebes ab (Ha und Ilb) und steigt in den voll ausdifferenzierten Zellen mit ausgereiften Chloroplasten (III) wieder an. In seneszierenden Bereichen des Primärblattes (IV) ist schließlich der Gehalt am 1600 nt langen Transkript am höchsten. Zusätzlich ist nur in den meristematischen Zellen an der Basis des Primär - blattes ein ca. 3100 nt langes Transkript zu detektieren. Auch dieses Transkript ist in zunehmender Reifung des Gewebes nicht mehr nachweisbar.
Mit Hilfe des sogenannten "Differential Display"-Verfahrens wurde zunächst ein 207 bp cDNA-Fragment isoliert, dessen entsprechendes Transkript bei dunkelinduzierter Seneszenz im Primärblatt der Gerste akkumuliert. Dieses Fragment (Sequenzprotokoll: Sequenz ID NO:l: Nukleotidposition 1342 - 1549) wurde anschließend als Sonde verwendet, um in einer cDNA-Bank (in λ-ZAP-II) aus seneszierenden Fahnenblättern der Gerste einen cDNA-Klon mit größerem Insert zu isolieren.
Schematische Darstellung des cDNA-Teilklons HvSD 36 aus der λ-ZAP-II-Bank:
T7 →XhoI SaU Hindm EcoRI Ncol PstI EcoRI PstI BamHI Xbal *- T3
14 bp 759 bp 14 bp
Das cDNA-Fragment (Sequenzprotokoll: Sequenz ID NO:l: Nukleotidposition 771 - 1529) wurde in die EcoRI Schnittstelle von pBlues- cript(SK") kloniert. An beiden Enden der cDNA befindet sich zusätzlich eine 14 bp Adaptorsequenz, die zur Ligation in den λ-ZAP- II benötigt wurde. Eingezeichnet sind ausgewählte Restriktions- schnittstellen des Vektors sowie der cDNA selbst.
Das 759 bp lange cDNA-Fragment wurde als Sonde für einen weiteren Versuch verwendet, um eine vollständige Sequenz von HvSD 36 zu erlangen. Zu diesem Zweck stand eine cDNA Bank aus RNA des meristematischen Bereichs 5 Tage alter Gerstenkeimlinge zur Verfügung. Für diese cDNA Bank wurde der Lambda Phage ExCell Eco RICIP von Pharmacia (Freiburg) (Produkt Nummer: 27-5011, 45.5kb) verwendet.
Es konnte ein 1565 bp langer cDNA-Klon isoliert werden, siehe Sequenzprotokoll: Sequenz ID N0:1: und 2.
Die 434 Aminosäuren lange Proteinsequenz weist unter den in den Datenbanken befindlichen Sequenzen mit 58 % die höchste Homologie zur Sequenz der HPPD aus Arabidopsis thaliana auf.
Zur Auffindung eines genomischen Klones, der die vollständige Gensequenz der HPPD beinhaltet, wurde eine Lambda FIXII-Bank der Gerste von der Firma Stratagene (Heidelberg, Produkt Nummer 946104) bezogen. Zur Herstellung der Bank diente DNA aus etiolierten Blättern der Wintergerste cv. Igri. Die DNA wurde partiell mit Sau3AI verdaut. Vor der Klonierung in die Xhol- Schnittstelle des Vektors erfolgte eine Auffüllung der Fragmentenden und der Phagenarme mit Nukleotiden. Die Durchmusterung der Bank mit 200.000 pfu in der ersten Runde ergab nur einen Klon, der mit der cDNA HvSD36 hybridisierte. Nach Restriktions- verdau dieses rekombinanten Phagen mit PstI und Sacl konnten anschließend Fragmente mit Größen von 5400, 3800 und 1800bp isoliert werden, die bei einer "Southern"-Blot-Hybridisierung mit der HvSD36-Sonde detektierbar sind. Diese Subfragmente liegen kloniert im Bluescript-Vektor vor. Abbildung 3 zeigt den schematischen Aufbau des HPPD-Gens der Gerste.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere Expressionskassetten, deren Sequenz für eine HPPD oder deren funktionelles Äquivalent kodiert, sowie deren Verwendung zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Vitamin E Gehalt. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine erfindungsgemäße Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine HPPD kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Vitamin E verleihen.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nukleinsäuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressions - kassette stromaufwärts, d.h. am 5 ' -Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d.h. am 3' -Ende, ein Polyadeny- lierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemen- te, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das HPPD-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüpfung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokalisation im Apoplasten, in der Vakuole, in Piastiden, im Mitochondrium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Ölkörperchen oder anderen Kompar- timenten und Translationsverstärker wie die 5 ' -Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaic-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987) 8693 - 8711) .
Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Tabak-transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 4 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S- Promotor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin 796 (B) :
- HPT: Hygromycin-Phosphotransferase - OCS: Octopin-Synthase-Terminator
- PNOS: Nopalin-Synthase-Promotor
- außerdem sind solche Restriktionsschnittstellen eingezeichnet, die nur einmal den Vektor schneiden.
Als Promotoren der erfindungsgemäßen Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al . , Cell 21 (1980) 285 - 294) . Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche ErkennungsSequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitu- tiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989) 2195 - 2202).
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen HPPD-Gens in der Pflanze zu einem be- stimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren wie z.B. der PRPl-Promotor (Ward et al . , Plant. Mol. Biol . 22 (1993) , 361-366) , ein durch Salizylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443) , ein durch Benzenesufonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer (Gatz et al . , (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzier- barer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon- induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u.a. verwendet werden.
Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen die Biosynthese von Vitamin E bzw. dessen Vorstufen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al . , EMBO J. 8 (1989) 2445 - 245).
Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd- protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67 % des gesamten löslichen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen exprimiert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094) . Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin-Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al. Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459 - 467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten. Der Aufbau einer derartigen Kassette ist in der Abbildung 4 schematisch beispielhaft dargestellt.
Die Herstellung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten HPPD-DNA Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und HPPD-DNA-Sequenz inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezifisches Transitpeptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.
Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Piastiden, die Vakuole, das Mitochondrium, das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen entsprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sei. 15, 4 (1996), 285 - 423). Für die Menge der Proteinakkumulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al. , Plant Mol. Biol. 30 (1996) , 781 - 792) .
Gegenstand der Erfindung sind auch Expressionskassetten, deren DNA- Sequenz für ein HPPD-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Besonders bevorzugt sind für die Chloroplasten spezifische Transitpeptide, welche nach Translokation des HPPD-Gens in die Chloroplasten vom HPPD-Teil enzymatisch abgespalten werden. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären Transketolase (TK) oder einem funktioneilen Äquivalent dieses Transitpeptids (z.B. das Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) abgeleitet ist.
Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine HPPD kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten. Im allgemeinen werden synthetische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert werden. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Sequenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Richtung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Zweckmäßigerweise können die erfindungsgemäßen Promotor- und die Terminator-Regionen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion dieser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktionsstellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatorischen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der erfindungsgemäße Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die erfindungsgemäße Expressionskassette beinhaltet in der 5 ' -3' -Transkriptionsrichtung den erfindungsgemäßen Promotor, eine beliebige DNA- Sequenz und eine Region für die transkriptionale Termination. Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar. Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnittstellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restriktionsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z.B. Transitionen und Trans - Versionen in Frage kommen, können in vifcro-Mutagenese, "primer- repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z.B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "bluntends" , können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.
Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u.a. das Anhängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schouten, A. et al . Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781 - 792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natürlicherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt werden.
Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyaden- ylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al . , EMBO J. 3 (1984) 835 ff) oder funktioneile Äquivalente.
Eine erfindungsgemäße Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor) , das LeB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und das ER-
Retentionssignal enthalten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.
Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein HPPD-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBinl9, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z.B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlosung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F.F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15 - 38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die erfindungsgemäße Expressionskassette integriertes Gen für die Expression eines HPPD-Gens enthalten.
Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine HPPD kodierenden DNA wird eine erfindungsgemäße Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzliche funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71 - 119 (1993) beschrieben.
Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonie- rungstechniken können die erfindungsgemäßen Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli , ermöglichen. Geeignete Klonierungs- vektoren sind u.a. pBR332, pUC-Serien, M13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren können.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer er indungsgemäßen Expressionskassette zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Vitamin E-Gehaltes der Pflanze.
Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze erfolgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäße Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamen- tösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung der Vitamin E- Produktion eingesetzt werden.
Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten- transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobae erzürn vermittelte Gentransfer. Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al . , Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S.D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993) 128 - 143 sowie in Potrykus Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42 (1991) 205 - 225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agro acterium tumefaciens zu trans- formieren, beispielsweise pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res . 12 (1984) 8711) .
Mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transforma- tion von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z.B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlosung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.
Funktionen äquivalente Sequenzen, die für ein HPPD-Gen kodieren, sind erfindungsgemäß solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.
Unter einem funktioneilen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine HPPD kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation dieser Nukleotidsequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z.B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnittstellen sein.
Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist. Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft der Erhöhung des Vitamin E Gehaltes in der Pflanze durch Überexpression des HPPD-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA- Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die HPPD Aktivität aufweisen oder durch in vi tro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.
Als weitere erfindungsgemäße geeignete äquivalente Nukleinsäure- Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Bestandteil des Fusionsproteins ein pflanzliches HPPD-Polypeptid oder ein funktionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusionsproteins kann z.B. ein weiteres Poly- peptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf HPPD-Expression möglich ist (z.B. myc-tag oder his-tag) . Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine regulative Proteinsequenz, wie z.B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das HPPD-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.
Gegenstand der Erfindung sind aber auch die erfindungsgemäß erzeugten Expressionsprodukte sowie Fusionsproteine aus einem Transitpeptid und einem Polypeptid mit HPPD-Aktivität .
Erhöhung des Vitamin E-Gehaltes bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Vitamin E-Biosyntheseleistung durch funktionelle Überexpression des HPPD-Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gentechnisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.
Der Biosytheseort von Vitamin E ist im allgemeinen das Blatt - gewebe, so daß eine blattspezifische Expression des HPPD-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Vitamin E-Bio - synthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze -beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann. Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen HPPD- Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine induzierbare Expression wünschenswert erscheinen.
Die Wirksamkeit der Expression des transgen experimierten HPPD- Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristemvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Expression des HPPD-Gens und deren Auswirkung auf die Vitamin E-Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, transformiert mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflanzen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z.B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.
Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.
Wie bereits erwähnt ist die HPPD ein geeignetes Target für Herbizide vom Typ der Sulcotrione. Um noch effizientere Hemm- Stoffe der HPPD finden zu können, ist es notwendig, geeignete Testsysteme, mit denen Inhibitor-Enzym-BindungsStudien durchgeführt werden können, zur Verfügung zu stellen. Hierzu wird beispielsweise die komplette cDNA-Sequenz der HPPD aus Gerste in einen Expressionsvektor (pQE, Qiagen) kloniert und in E. coli überexprimiert.
Das mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassette expri- mierte HPPD-Protein eignet sich besonders zur Auffindung von für die HPPD spezifischen Hemmstoffen.
Dazu kann die HPPD beispielsweise in einem Enzymtest eingesetzt werden, bei dem die Aktivität der HPPD in An- und Abwesenheit des zu testenden Wirkstoffs ermittelt wird. Aus dem Vergleich der beiden Aktivitätsbestimmungen läßt sich eine qualitative und quantitative Aussage über das Hemmverhalten des zu testenden Wirkstoffes machen.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Testsystems kann eine Vielzahl von chemischen Verbindungen schnell und einfach auf herbizide Eigenschaften überprüft werden. Das Verfahren gestattet es, reproduzierbar aus einer großen Anzahl von Substanzen gezielt solche mit großer Wirkstärke auszuwählen, um mit diesen Sub- stanzen anschließend weitere, dem Fachmann geläufige vertiefte Prüfungen durchzuführen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind Herbizide, die mit dem oben beschriebenen Testsystem identifizierbar sind.
Durch Überexpression der für eine HPPD kodierenden Gensequenz Seq ID NO: 1 in einer Pflanze wird eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der HPPD erreicht. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Weitere Gegenständer der Erfindung sind:
- Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekennzeich- net, daß man eine erfindungsgemäße Expressionskassette in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.
Verwendung einer Pflanze zur Herstellung pflanzlicher HPPD.
Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der HPPD durch verstärkte Expression einer erfindungsgemäßen DNA-Sequenz.
- Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Expression einer erfindungsgemäßen DNA- Sequenz in Pflanzen.
- Verwendung der erfindungsgemäßen Expressionskassette zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der HPPD.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:
Allgemeine Klonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie- rungsschritte wie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gel- elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombi- nanter DNA wurden wie bei Sambrook et al . (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6) beschrieben durchgeführt.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue) 5 wurden von Stratagene bzw. Pharmacia im Fall von NP66 bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kann) wurde von Deblaere et al. in (Nucl. Acids Res. 13 (1985) 4777) beschrieben. Alternativ können auch der Agrobakte-
10 rienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish- Perron, Gene 33 (1985), 103 - 119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega) , pZerO (Invitrogen) , pBinl9 (Bevan et al . , Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711 - 8720) und pBinAR (Höfgen und Will-
15 mitzer, Plant Science 66 (1990) 221 - 230) benutzt werden.
Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem 20 Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74 (1977), 5463 - 5467).
Erzeugung pflanzlicher Expressionskassetten
25
In das Plasmid pBinl9 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. (1984) 12, 8711) wurde ein 35S CaMV Promotor als EcoRI-Kpnl-Fragment entsprechend den Nukleotiden 6909 - 7437 des Cauliflower-Mosaik- Virus (Franck et al. Cell 21 (1980) 285) inseriert. Das Polyade-
30 nylierungsSignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmides pTiACH5 (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984) 835), Nukleotide 11749 - 11939 wurde als PvuII-Hindlll-Fragment isoliert und nach Addition von Sphl-Linkern an die PvuII-Schnittstelle zwischen die SpHI-Hindlll Schnittstelle des Vektors pBmAR-Hyg kloniert. Es entstand das
35 Plasmid pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990) 221 - 230) .
Anwendungsbeispiele
40 Beispiel 1
Isolierung von HPPD-spezifischen cDNA Sequenzen
Mit Hilfe der von Liang und Pardee (Science (1992) 257, 967 - 45 972) publizierten Methode der DDRT-PCR wurde die Zusammensetzung der RNA-Population aus Primärblättern von neun Tage in einem L/D-Wechsel (16 h Licht/ 8 h Dunkel) angezogenen Gerstenpflanzen verglichen mit der von Primärblättern 11 Tage alter Gerstenpflanzen, in denen nach neun Tagen Anzucht anschließend Seneszenz durch zweitägige Dunkelbehandlung induziert wurde (Humbeck und Krupinska, J. Photochem. Photobiol. 36 (1996), 321 - 326). Jeweils 0,2 μg der gesamten RNA wurde mit dem Enzym "Superskript RT" (Gibco BRL, Eggenstein) in cDNA umgesetzt. Dabei enthielten die Reaktionsansätze (20 μl) neben der RNA außerdem 20 μM dNTPs, 10 μM DTT, lxRT-Puffer und je 1 μM (dT) 12VN-Primer . Die Synthese der für diese Reaktionen erforderlichen Anker-"Primer" erfolgte aufgrund der Angaben von Liang und Pardee:
1. 5 ' -TTTTTTTTTTTTAG-3 '
2. 5 ' -TTTTTTTTTTTTCA-3 '
3. 5 ' -TTTTTTTTTTTTAC-3 ' 4. 5'-ττTTTTTTTTTTGT-3'
Nach Synthese der cDNAs erfolgte die Amplifikation der entsprechenden Sequenzen in jeweils zehn Ansätzen, die sich durch Verwendung der im folgenden angegebenen Zufalls-" Primer" unter - scheiden:
1. 5 ' -TACAACGAGG-3 ' 2. 5 ' -GGAACCAATC-3 '
3. 5 ' -AAACTCCGTC-3 ' 4. 5 ' -TGGTAAAGGG-3 '
5. 5 ' -CTGCTTGATG-3 ' 6. 5 ' -GTTTTCGCAG-3 ' 7. 5'-GATCTCAGAC-3' 8. 5 ' -GATCTAACCG-3 '
9. 5 ' -GATCATGGTC-3 ' 10. 5 ' -GATCTAAGGC-3 '
Die PCR-Reaktionsansätze enthielten in einem Volumen von jeweils 20 μl lxPCR-Puffer, 2 μM dNTPs, 2,5 μCi (α 33P)-dATP, 1 μM (dT) ι2VN-" Primer" , 1/10 Vol. RT-Mix (Sambrook et al . Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 1989), 1 U Taq DNA-Polymerase (Boehringer, Mannheim) und 1 μM 10-mer Zufalls-"Primer" . Die PCR- Reaktionen liefen nach folgendem Programm in einem Uno-Block (Biometra) ab:
1. 94°C 2 min
2. 94°C 30 s
3. 40°C 2 min
4. 72°C 30 s
5. 72°C 5 min
6. 4°C Aufbewahrung bis zur weiteren Bearbeitung
Die Schritte 2, 3 und 4 wurden 40-mal nacheinander durchgeführt. Dabei ergaben sich etwa 100 cDNA-Banden pro Reaktion und "Primer" -Kombination. Abweichend von der Vorschrift von Liang und Pardee erfolgte die Auftrennung der amplifizierten cDNA-Fragmente in nichtdenaturie- renden Polyacrylamidgelen folgender Zusammensetzung: 6 % (w/v) Acrylamid (Long Ranger, AT Biochem) , 1,2 x TBE-Puffer, 0,005 % (v/v) TEMED und 0,005 % (w/v) APS (Bauer et al, Nucl. Ac. Res. (1993) 21, 4272 - 4280) .
Je 3,5 μl jedes PCR-Ansatzes wurden mit 2 μl Probenpuffer (dye II, Sambrook et al . , 1989) versetzt und dann auf das Gel aufgetragen. Um die Reproduzierbarkeit der cDNA-Bandenmuster zu erfassen
(Abb. 5), wurden von an den Tagen 9 und 11 geernteten Primärblättern der Gerste jeweils zwei unabhängige RNA-Präparationen angefertigt (9 und 9' bzw. 11 und 11') und parallel in der nachfolgenden Analyse eingesetzt. Dargestellt ist das Ergebnis für zwei verschiedene Primerkombinationen (A und B) , wobei exemplarisch zwei Unterschiede im Bandenmuster zwischen der Probe von Tag 9 und 11 durch Pfeile hervorgehoben wurden. Nur solche Banden, die in den beiden Proben aus seneszierenden Pflanzen gleichermaßen und in den beiden Vergleichsproben nicht vorkamen, wurden bei der späteren Analyse der Gele beachtet. Die Elektrophorese erfolgte über einen Zeitraum von 2,5 h bei 40 Watt (0,8 W/cm3) in 1 x TBE- Puffer. Nach erfolgter Trennung der cDNA-Fragmente wurde das Gel auf Filterpapier (Schleicher & Schüll, Dassel) übertragen. Nach Trocknung des Gels bei 50°C wurde ein Röntgenfilm aufgelegt. cDNA- Banden, die im Autoradiogramm nur bei den Proben 11 und 11' auftraten, wurden mittels eines Skalpells aus dem trockenen Gel herausgeschnitten und die DNA durch Kochen in 100 μl 1 x TE-Puffer eluiert. Die mit Ethanol gefällte DNA wurde für die weiteren Untersuchungen in 10 μl Wasser resuspendiert. Nach Reamplifikation mit den für diesen Ansatz zuvor verwendeten "Primern" konnte die DNA kloniert und sequenziert sowie auch als Sonde für Norther - Blot-Hybridisierungen eingesetzt werden.
Um zu prüfen, ob das entsprechende cDNA-Fragment tatsächlich ein seneszenzspezifisch auftretendes Transkript repräsentiert, erfolgten Hybridisierungen mit RNA aus Blättern verschiedener Entwicklungsstadien:
A. 1. RNA aus Primärblättern von 9 Tage im L/D-Wechsel angezogenen Pflanzen
A. 3. RNA aus Primärblättern von 10 Tage alten Pflanzen, bei deren Anzucht am Tag 10 die Lichtphase ausfiel
A. 4 RNA aus Primärblättern von 11 Tage alten Pflanzen, die am Tag 10 und 11 keine Lichtphase mehr hatten A. 5 RNA aus Primärblättern von 12 Tage alten Pflanzen, die nach 2 Tagen Dunkelheit wieder eine Lichtphase erfahren haben
Die Proben für die RNA-Analyse wurden jeweils in der Mitte der ursprünglichen Nachtphase geerntet.
B. RNA aus Fahnenblättern, die zu sieben verschiedenen Zeitpunkten im Freiland gesammelt wurden (Abb. 6). Die Blätter waren am 29. Mai voll ausgewachsen und wiesen am 21. Juni weniger als 10 % des ursprünglichen Chlorophyll - gehalts auf. Der Beginn der Seneszenzprozesse ist in Abbildung 6 durch einen Pfeil angegeben (d.h. 17 Tage nach Erreichen der vollen Länge am 15. Juni) . Als Seneszenz- beginn wurde der Tag definiert, an dem die Photosystem II-Effizienz abnahm (Humbeck et al., Plant Cell Environment (1996) 19: 337 - 344).
Zur Hybridisierung eines Filters mit den beschriebenen RNA-Proben wurde neben der HPPD-Sonde zum Vergleich auch eine spezifische Sonde für das r cS-Gen, das für die kleine Untereinheit der Ribulose-l,5-bisphosphat-Carboxylase kodiert, eingesetzt. Abbildung 6 zeigt die Hybridisierung der "Nothern-Blots" A und B mit der cDNA HvSD36 und einer für das rbcS-Gen spezifischen Sonde. Filter A trägt RNA aus Primärblättern der Gerste nach 9 Tagen Anzucht im L/D-Wechsel (9), nach anschließender ein- bzw. zweitägiger Dunkelinkubation (10, 11) und nach daran anschließender erneuter Belichtung für einen Tag (12) . Filter B enthält RNA aus Fahnenblättern, die 1992 im Zeitraum vom 29.05. bis 21.06. im Freiland geerntet wurden. Der Pfeil gibt den Beginn der Sequenz am 15.06. an. Wie aus der Abbildung 6 ersichtlich, ist die Menge an r cS-spezifischer RNA dann hoch, wenn die Menge an der für die HPPD spezifischen mRNA relativ gering ist. Die für die HPPD spezifische mRNA ist in Primärblättern neun Tage alter Pflanzen vor dem Transfer ins Dunkel nicht nachweisbar und akkumuliert deutlich während der Dunkelphase. Bei Wiederbelichtung der Pflanzen nimmt die Menge an dieser mRNA deutlich ab. Im Fall der Fahnenblätter sind bereits in voll ausgewachsenen, nicht seneszenten Blättern geringe Mengen der für die HPPD spezifischen mRNA nach- weisbar. Zu einer verstärkten Expression kommt es bereits 4 Tage vor dem eigentlichen Seneszenzbeginn. Die höchste Menge dieser mRNA liegt in seneszenten Blättern vor. Ein Größenvergleich mit bekannten RNA-Spezies ergab, daß das mit der cDNA-Sonde HvSD36 (S: Seneszenz; D:Dunkel, Fragmentnummer 36 im DDRT-Gel) detek- tierte Transkript eine Länge von ca. 1,6 kb aufweist. Durch DDRT-PCR wurden unabhängig voneinander drei cDNA-Fragmente erhalten, die dieses Expressionsmuster ergaben und aufgrund der Sequenzanalyse tatsächlich dasselbe Transkript repräsentieren. Das längste Fragment hatte eine Größe von 230 bp. Das 230 bp große PCR-Produkt wurde schließlich mit dem "Sure Clone™ Ligation Kit" (Pharmacia, Freiburg) nach den Angaben des Herstellers in die Smal-Schnittstelle des Vektors pUC18 kloniert. Das rekombinante Plasmid wurde in kompetente Zellen des E. coli- Stamms DH5 α transformiert. Da das Fragment, methodisch bedingt, das 3 '-Ende des zugehörigen Transkripts repräsentiert, reichte die Sequenzinformation zunächst nicht aus, um eine eindeutige Homologie mit einer Sequenz in den Datenbanken ausfindig zu machen. Um eine längere zugehörige cDNA zu isolieren, wurde eine Lambda ZAPII-Bank (Stratagene, Heidelberg) aus RNA seneszenter Fahnenblätter unter Verwendung des 230 bp großen Fragments als Sonde durchmustert. Für diesen Arbeitsschritt erfolgte eine Markierung der Sonde mit Dig-dUTP nach Angaben des "DNA-Labeling and Detection Kit" (Boehringer, Mannheim) . Die Untersuchung der Bank erfolgte nach dem Protokoll des "ZAP-cDNA Synthesis Kit" (Stratagene, Heidelberg) .
Im Fall der hier beschriebenen Sonde wurden 150.000 pfu überprüft. Davon gaben 39 Phagenplaques ein positives Signal. Davon wurden 12 Phagenpopulationen weiter bearbeitet. Nach einer Pha- genpräparation konnten die inserierten Fragmente über PCR angereichert und elektrophoretisch aufgetrennt werden. Durch Sou- thern-Blot Hybridisierung mit der HvSD36-Sonde wurden aus den so behandelten 12 Phagenpopulationen diejenigen ausgewählt, die die größten "Inserts" mit positivem Signal aufwiesen. Nach erneutem Ausplattieren wurden die Phagen einer weiteren Hybridisierung unterzogen. Vereinzelte Phagenplaques wurden ausgestochen und nach Elution unter Verwendung eines Helferphagen einer In vivo Excision nach dem Protokoll von Stratagene (Exassist™ Interferen- ce-Resistant Helper Phage with SOLR ™ Strain) unterzogen. Die aus dieser Behandlung hervorgehenden sogenannten "Phagemide" enthalten die im pBLueskript (SK-) klonierte cDNA.
Nach einer anschließenden Plasmidpräparation konnte das betreffende "Insert" mit EcoRI aus dem Bluescript-Plasmid herausge- schnitten werden. Der im Fall der HvSD36 cDNA erhaltene cDNA-Klon enthält ein "Insert" mit einer Größe von ca. 800 bp. Die vollständige Sequenzierung der cDNA erfolgte mit dem "SequiTherm Excel Long-Read DNA-Sequenzierungs-Kit" ( Epicentre Technologies, Biozym Diagnostic, Oldendorf ) unter Verwendung von mit IRD41 markierten Universal-"Primern" , die an Sequenzbereiche im Bluescript-Vektor binden. Die Detektion der DNA-Fragmente erfolgte über den Infrarotlaser des automatischen Sequenzierers 4000L der Firma Licor. Nach Sequenzierung lag eine genau 759 bp lange Sequenz vor, die an den Seiten von einer jeweils 14 bp langen Adaptorsequenz flankiert ist. Diese AdaptorSequenzen dienten bei der Herstellung der cDNA-Bank zur Ligation der cDNA-Fragmente mit den Armen des Phagen Lambda ZAPII (Stratagene, Heidelberg) .
Die Proteinsequenz HvSD36, die insgesamt über 180 Aminosäuren verfügt, weist unter den in den Datenbanken befindlichen Sequenzen mit 41 % die höchste Homologie zur Sequenz der HPPD des Menschen auf. In Anbetracht der Länge des im "Northern-Blot" detektierten Transkripts (ca. 1600 nt) ist anzunehmen, daß von der cDNA noch 850-900 bp fehlen.
Zur Vervollständigung der cDNA wurde eine weitere cDNA Bank un- tersucht. Aus dem basalen meristematischen Bereich 5 Tage alter Gerstenkeimlinge wurde mit Hilfe von "Dynabeads" (Dynal, Hamburg) mRNA isoliert und mit dem "Time Saver cDNA SyntheseKit" (Pharmacia, Freiburg) in cDNA überschrieben. Es folgte eine Ligation von EcoRI/Notl-Adaptoren (Pharmacia, Freiburg) an die cDNA mit anschließender Ligation in den Lambda ExCell Vektor (Pharmacia, Freiburg) . Schließlich wurde die rekombinante Phagen-DNA mit Hilfe des "Gigapack II Gold Set" (Stratagene, Heidelberg) in Phagenproteine verpackt. Mit der 759 bp langen Sonde HvSD36 wurden 400000 pfu überprüft, wobei 5 Phagen von der Sonde detektiert wurden. Eine Excision der "Phagemids" aus dem Phagen erfolgte in vivo mit Hilfe des Bakterienstammes NP66 nach den Angaben von Pharmacia (Freiburg) . Aus einzelnen Bakterienkolonien wurden die rekombinanten pExCell-Plasmide isoliert und zur Vermehrung in den Bakterienstamm D115 α überführt.
Der längste auf diesem Weg isolierte cDNA-Klon HvSD36 hat eine Länge von 1565 bp und wurde vollständig sequenziert (siehe Sequenzprotokoll) .
Beispiel 2
Charakterisierung der genomischen Sequenz
Zur Auffindung eines genomischen Klones, der die Gensequenz der HPPD beinhaltet, wurde eine Lambda FiXII-Bank der Gerste von der Firma Stratagene (Heidelberg) bezogen. Zur Herstellung der Bank diente DNA aus etiolierten Blättern der Wintergerste cv. Igri. Die DNA wurde partiell mit Sau3AI verdaut. Vor der Klonierung in die Xhol-Schnittstelle des Vektors erfolgte eine Auffüllung der Fragmentenden und der Phagenarme mit Nukleotiden. Die Durchmusterung der Bank mit 200.000 pfu in der ersten Runde ergab nur einen Klon, der mit der cDNA HvSD36 hybridisierte. Nach Restriktionsverdau dieses rekombinanten Phagen mit PstI und Sacl konnten anschließend Fragmente mit Größen von 5400, 3800 und 1800 bp isoliert werden, die bei einer "Southern"-Blot-Hybridi- sierung mit der HvSD36-Sonde detektierbar sind. Diese Subfrag- mente liegen kloniert im Bluescript-Vektor vor.
Die Durchmusterung der Bank erfolgte nach der für die HybondN- Membran angegebenen Vorschrift. Die Markierung der Sonde für die Durchmusterung der Bank sowie für "Southern" -Blot-Hybridisierun- gen erfolgte über "Random Priming" mit 32P-dATP unter Verwendung des Klenow-Enzyms (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
Es wurde ein genomischer "Southern-Blot" mit gesamter DNA aus Gerste (Carina) durchgeführt (Abb. 7) . Je 15 μg DNA wurden mit BamHI (B) , EcoRI (E) , Hindin (H) oder XBAI (X) verdaut und in einem 0.75 % Agarose Gel aufgetrennt. Nach Transfer auf eine Hybond N+ Membran (Amersham, Braunschweig) erfolgte eine Hybridisierung mit der unvollständigen 759bp langen cDNA Sonde von HvSD36 nach Angaben des Herstellers der Membran. Dabei konnten folgende Fragmente detektiert werden:
BamHI : 6.0,3.9 und 3.0 kbp
EcoRI: >10kbp Hindlll : 8.3,2.6,1.1 und 1.0 kbp
Xbal: 9.0,5.2 und 4.2kbp
Die Längen der Fragmente wurden durch Vergleich mit einem DNA Größenstandard (Kb-Leiter von GibcoBRL, Eggenstein) abgeschätzt.
Beispiel 3
Homologievergleich der Proteinsequenz von HvSD36
Ein Vergleich der Proteinsequenz von HvSD36 mit Proteinsequenzen in den Datenbank ergab Homologien zu folgenden bisher bekannten Proteinsequenzen:
10 20 30 40 50
HPPD_Hv MP PTPTTPAATG
HPPD_Ath MGHQNAA VSENQNHDDG
HPPD_HUMAN
HPPD_RAT
HPPD_PIG
HPPD_MOUSE
HPPD_PSESP
ME A_SHECO
PEA3_M0USE MTKSSNHNCL LRPENKPGLW GPGAQAASLR PSPATLWSS PGHAΞHPPAA 60 70 80 90 100
HPPD_Hv AAAAVTPEHA RPHRMVRFNP RSDRFHTLSF HHVEFWCADA ASAAGRFAFA
HPPD_Ath AASSPGFKLV GFSKFVRKNP KSDKFKVKRF HHIEFWCGDA TNVARRFSWG
HPPD_HUMAN M TTYSDKGAKP ERGRFLH—F HSVTFWVGNA KQAASFYCSK
HPPD_RAT YWDKGPKP ΞRGRFLH—F HSVTFWVGNA KQAASFYCNK
HPPD_PIG M TSYSDKGEKP ERGRFLH—F HSVTFWVGNA KQAASYYCSK
HPPD_MOUSΞ M TTYNNKGPKP ERGRFLH—F HSVTFWVGNA KQAASFYCNK
HPPD_PSESP AD YENP MGLMGFEFIE LASPTPNTLE
MELA_SHECO MASEQNP LGLLGIEFTE FATPDLDFMH
PEA3_M0USE PAQTPGPQVS ASARGPGPVA GGSGRMERRM KGGYL DQ RVPYTFCSKS
110 120 130 140 150
HPPD_Hv LGAPLAARSD LSTGNSAHAS QLLRSGSLAF LFT—APYAN G-CDAA
HPPD_Ath LGMRFSAKSD LSTGNMVHAS YLLTSGDLRF LFT—APYSP S-LSAGEIKP
HPPD_HUMAN MGFEPLAYRG LΞTGSREWS HVIKQGKIVF VLS—SA LNP
HPPD_RAT MGFEPLAYKG LETGSREWS HVIKQGKIVF VLC—SA LNP
HPPD_PIG IGFEPLAYKG LETGSREWS H KQDKIVF VFS—SA LNP
HPPD_MOUSE MGFEPLAYRG LΞTGSREWS HVIKRGKIVF VLC—SA LNP
HPPD_PSESP PIFEIMGFTK VATHRSKDV- HLYRQGAINL ILN—NE
MELA_SHECO KVFIDFGFSK LKKHKQKDI- VYYKQNDINF LLN—NE
PEA3_M0USE PGNGSLGEAL MVPQGKLMDP GSLPPSDSED LFQDLSHFQE TWLAEAQVPD
160 170 180 190 200
HPPD_Hv — ASLPSFS ADAARRFSAD HGIAVRSVAL RVADAAEAFR ASRRRGARPA
HPPD_Ath TTTASIPSFD HGSCRSFFSS HGLGVRAVAI EVEDAESAFS ISVANGAIPS
HPPD_HUMAN WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCDYIVQ KARERGAKIM
HPPD_RAT WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCEHIVQ KARERGAKIV
HPPD_PIG WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCDYIVQ KARERGAIIV
HPPD_MOUSE WN KEMGDHL-VK HGDGVKDIAF EVEDCDHIVQ KARERGAKIV
HPPD_PSΞSP P HSVASYFAAE HGPSVCGMAF RVKDSQKAYK RALELGAQPI
MELA_SHECO K QGFSAQFAKT HGPAISSMGW RVEDANFAFE GAVARGAKPA
PEA3_M0USE SDEQFVPDFH SENLAFH SPTTRIKKEP QSPRTDPALS CSRKPPLPYH
210 220 230 240 250
HPPD_Hv FAPV DLGRG FAFAEVELYG —D LRFVS HP—DG—TD
HPPD_Ath SPPI VLNEA VTIAEVKLYG —DWLRYVS YKAEDT—EK
HPPD_HUMAN REP -WVEQDKFGK VKFAVLQTYG —DTTHTLVE KMN YI
HPPD_RAT REP -WVEEDKFGK VKFAVLQTYG --DTTHTLVE KIN YT
HPPD_PIG REEVC-CAAD VRGHHTPLDR AR QVWE —GT LVE KMT FC
HPPD_MOUSE REP -WVEQDKFGK VKFAVLQTYG —DTTHTLVE KIN YT
HPPD_PSESP HI ETGPME LNLPAIKGIG —GAPLYLID RFGEGSSIYD
MELA_SHECO AD EV—KD LPYPAIYGIG —DSLIYFID TFGDDNNIYT
PEA3_M0USE HGEQCLYSRQ IAIKSPAPGA PGQSPLQPFS RAEQQQSLLR ASSSSQSHPG
260 270 280 290 300
HPPD_Hv VPFLPGFEGV TNPDA VDYGLTRFDH WGNVP—EL -APAAAYIAG
HPPD_Ath SEFLPGFERV EDASSF P LDYGIRRLDH AVGNVP—EL -GPALTYVAG
HPPD_HUMAN GQFLPGYEAP AFMDPLLPKL PKCSLEMIDH IVGNQPDQEM -VSASEW
HPPD_RAT GRFLPGFEAP TYKDTLLPKL PSCNLEIIDH IVGNQPDQEM -ESASΞW
HPPD_PIG LDSRPQPSQT LLHRLLLSKL PKCGLEIIDH IVGNQPDQEM -ESASQW
HPPD_MOUSE GRFLPGFEAP TYKDTLLPKL PRCNLEIIDH IVGNQPDQEM -QSASEW
HPPD_PSESP IDFV—FLEG VDRHPVGA— GLKIIDH LTHNVYRGRM -A YWANF
MELA_SHECO SDF EA LDEPIITQ— -EKGFIEVDH LTNNVHKGTM -E YWSNF
PEA3_M0USE HGYLGEHSSV FQQPVDMCHS FTSPQGGGRE PLPAPYQHQL SEPCPPYPQQ
310 320 330 340 350
HPPD_Hv FT GFHEF AEFTAEDVGT TESGLNSWL ANNSEGVLLP LNEPVHGTKR
HPPD_Ath FT GFHQF AEFTADDVGT AESGLNSAVL ASNDEMVLLP INEPVHGTKR
HPPD_HUMAN YLKNLQFHRF WSVDDTQVHT EYSSLRSIW ANYEESIKMP INEPAPG-KK
HPPDJAT YLKNLQFHRF WSVDDTQVHT EYSSLRSIW ANYEESIKMP INEPAPG-RK
HPPD_PIG YMRNLQFHRF WSVDDTQIHT EYSALRSWM ANYEESIKMP INEPAPG-KK HPPD_MOUSE YLKNLQFHRF WSVDDTQVHT EYSSLRSIW TNYEESIKMP INEPAPG-RK
HPPD_PSESP YEKLFNFREI RYF DIKG EYTGLTSKAM TAPDGMIRIP LNE—ESSKG
MELA_SHECO YKDIFGFTEV RYF DIKG SQTALISYAL RSPDGSFCIP INE—-GKGDD
PEA3_MOUSE NFKQ-EYHDP LYEQAGQPAS SQGGVSGHRY PGAGWIKQΞ RTDFAYDSDV
360 370 380 390 400
HPPD_Hv RSQIQTFLEH HGGPGVQH-I AVASSDVLRT LRKMRARSAM GGFDFLPPPL
HPPD_Ath KSQIQTYLEH NEGAGLQH-L ALMSEDIFRT LREMRKRSSI GGFDFMPSPP
HPPD_HUMAN KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALKTEDUTA IRHLRER -GLEFLSVP-
HPPD_RAT KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALRTEDIITT IRHLRER -GMEFLAVP-
HPPD_PIG KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALKTEDIITA IRSLRER -GVΞFLAVP-
HPPD MOUSE KSQIQEYVDY NGGAGVQH-I ALKTEDIITA IRHLRER -GTEFLAAP-
HPPD_PSESP AGQIEEFLMQ FNGEGIQH-V AFLSDDLIKT WDHLKSI -GMRFMTAPP
MELA_SHECO RNQIDEYLKE YDGPGVQH-L AFRSRDIVAS LDAMEGS -SIQTLDIIP
PEA3_MOUSE PGCASMYLHP EGFSGPSPGD GVMGYGYEKS LRPFPDDVCI VPKKFEGDIK
410 420 430 440 450
HPPD_Hv PKYYEGVRRL AGD—VLSEA QIKECQELGV LVDRDDQG— —VLL
HPPD_Ath PTYYQNLKKR VGD— LSDD QIKECEELGI LVDRDDQG— — LL
H PD_HUMAN STYYKQLREK LKTAKIKVKE NIDALEELKI LVDYDEKG— —YLL
HPPD_RAT SSYYRLLREN LKTSKIQVKE NMDVLEELKI LVDYDEKG— —YLL
HPPD_PIG FTYYKQLQEK LKSAKIRVKE SIDVLEELKI LVDYDEKG— —YLL
HPPD_MOUSE SSYYKLLREN LKSAKIQVKE SMDVLEELHI LVDYDEKG— —YLL
HPPD_PSESP DTYYEMLEGR LPN HGE PVGELQARGI LLDGSSESGD KRLLL
MELA_SHECO E-YYDTIFEK LPQ VTE DRDRIKHHQI LVDGDEDG— —YLL
PEA3_MOUSE QEGIGAFREG PPYQR -RGALQLWQF LVALLDDPTN AHFIAWTGRG
460 470 480 490 500
HPPD_Hv QIFTKPVGDR PTLFLEMIQR IGCMEKDERG EE YQKG GCGGFGKGNF
HPPD_Ath QIFTKPLGDR PTIFIEIIQR VGCMMKDEEG KA YQSG GCGGFGKGNF HPPD_HUMAN QIFTKPVQDR PTLFLEVIQR mTun —
HPPD_RAT QIFTKPMQDR PTLFLEVIQR HNHQ GFGAGNF HPPD_PIG QIFTKPMQDR PTVFLEVIQR M TUΠ ~ P Ä MP HPPD_MOUSE QIFTKPMQDR PTLFLEVIQR HPPD_PSESP QIFSETLMGP —VFFEFIQR KGDD- T- ,T?ΠN«TT
MELA_SHECO QIFTKNLFGP —IFIEIIQR KNNL- GFGEGNF
PEA3_MOUSE MEFKLIEPEE VARLWGIQKN RPAMNYDKLS RSLRYYYEKG IMQKVAGERY
510 520 530 540 550
HPPD_Hv SE LFK-SIE-DY —EKS—LEA KQSAAV-QGS
HPPD_Ath SE LFK-SIE-EY —EK —LEA KQLVG
HPPD_HUMAN NS LFK-AFEEEQ —NLRGNLTN METNG PGM
HPPD_RAT NS LFK-AFEEEQ —ALRG
HPPD_PIG NS LFK-AFEEEQ —ELRGNLTD TDPNGVPFRL
HPPD_MOUSE NS LFK-AFEEEQ —ALRGNLTD LEPNGVRSGM
HPPD_PSESP KA LFE-SIERDQ —VRRGVLST -D
MELA_SHECO KA LFE-SIERDQ --VRRGVL
PEA3_MOUSE VYKFVCEPEA LFSLAFPDNQ RPALKAEFDR PVSEEDTVPL SHLDESPAYL 560 570
HPPD_Hv
HPPD_Ath
HPPD_HUMAN
HPPD_RAT
HPPD_PIG
HPPD_MOUSE
HPPD_PSESP
MELA_SHECO PEA3_MOUSE PELTGPAPPF GHRGGYSY Erläuterung: HPPD_Hv: Hordeum vulgäre 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HvSD36)
HPPD_Ath: Arabidopsis thaliana 4-hydroxyphenylpy- ruvate dioxygenase HPPD_HUMAN: H. sapiens 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase
HPPD_PIG: Pig 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase HPPD_RAT: Rat F alloantigen
HPPD_MOUSE: Mouse 4-hydroxyphenylpyruvate dioxy- genäse
MELA_SHECO: S. colwelliana melA protein HPPD_PSESP: Pseudomonas sp. (strain P.J.874) 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase PEA3_M0USE: Mus musculus (mouse) PEA3 polypeptide
Die größte Homologie wurde zu der Arabidopsis Sequenz gefunden mit 58 % über die gesamte Sequenz (62 % über 412 As), gefolgt von HPPD_RAT mit 35 % (über 365 As), HPPD_HUMAN 34 % (über 365 AS) , HPPD_MOUSE 34 % (über 371 As) .
Beispiel 4
Anzucht von Gerste (Hordeum vulgäre)
Gerstensetzlinge (Hordeum vulgäre L.,cv. Carina, Ackermann Saatzucht, Irbach, Germany) wurden über einen Zeitraum von 15 Tagen unter kontrollierten Bedingungen in der Klimakammer in sogenannten Mitscherlich-Töpfen in Erde, die 4 g pro Liter Osmocote 5M (Urania, Hamburg, Germany) enthielt, angezogen. Um einheitliches Wachstum sicherzustellen, wurden die Samen auf feuchtem Filterpapier im Dunkeln für 2 Tage bei 4°C und 1 Tag bei 21°C ausgekeimt und nur solche Setzlinge eingesetzt, die gleiches Längenwachstum der Primärwurzel zeigten. Nach dem Transfer dieser Setzlinge auf Erde wurden diese mit 1.5 cm gesiebter Erde bedeckt. Danach wur- den die Pflanzen über 9 Tage bei 16 Stunden Licht (120 μm-m-2-s_1) und 8 Stunden Dunkelheit verbunden mit einem Temperaturschift (21°C bei Tag, 16°C bei Nacht) inkubiert. Um Seneszenz zu induzieren, werden die Pflanzen nach 9 Tagen für 2 Tage (Tag 10 und 11) im Dunkeln bei der obengenannten Temperatur gehalten.
Beispiel 5 Anzucht von Tabak
Die Tabakpflanzen wurden nach bekannter Methode angezogen. Die verwendete Tabaksorte ist Nicotiana tabacum, cv. Xanthi. Beispiel 6 Transformation von Tabak
Die erfindungsgemäße Expressionskassette enthaltend das HPPD-Gen mit der Sequenz 1 wurde in den Vektor pBinAR-Hyg kloniert
(Abb. 4). Mit diesem Vektor wurden Tabakpflanzen gemäß Beispiel 5 anschließend nach bekannter Methode transformiert.
Beispiel 7 Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Tabak
Die cDNA der HPPD wurde mit einem CaMV35S- Promotor versehen und in Tabak unter Verwendung des 35S-Promotors überexprimiert . Parallel dazu wurde der samenspezifische Promotor des Phaseolin- genes verwendet, um den Tocopherolgehalt spezifisch im Tabaksamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Tabakpflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherol- konzentration im Vergleich zur nicht transformierten Pflanze erhöht .
SEQUENZPROTOKOLL
(1) ALGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: BASF AG
(B) STRASSE: Carl Bosch
(C) ORT: Ludwigshafen
(D) BUNDESLAND: Germany
(F) POSTLEITZAHL: 67056
(G) TELEPHON: 0621-60-52698
(ii) ANMELDETITEL: HPPD Sequenz aus Gerste (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Floppy disk
(B) COMPUTER: IBM PC compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (EPA)
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 1:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 1565 Basenpaare
(B) ART: Nukleinsäure
(C) STRANGFORM: Doppel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: cDNS
(iii) HYPOTHETISCH: NEIN
(iii) ANTISENSE: NEIN
(vi) URSPRÜNLICHE HERKUNFT:
(A) ORGANISMUS: hppd aus Gerste
(D) ENTWICKLUNGSSTADIUM: senescence
(vii) UNMITTELBARE HERKUNFT:
(A) BIBLIOTHEK: lambda FIXII-Bank der Gerste
(B) CLON: pHvSD36.seq
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: CDS
(B) LAGE: 9..1313
(x) VERÖFFENTLICHUNGSINFORMATION:
(A) AUTORS: Krupinska, Karin
(B) TITEL: Overexpression of HPPD
(C) ZEITSCHRIFT: overexpression of HPPD (G) DATUM : 1998
(K) BELANGREICHE RESTE IN SEQ ID NO: 1: VON 1 BIS 1565
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
CGCACACC ATG CCG CCC ACC CCC ACC ACC CCC GCG GCT ACC GGC GCC GCC 50 Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Ala Ala 1 5 10
GCC GCG GTG ACG CCG GAG CAC GCG CGA CCG CAC CGA ATG GTC CGC TTC 98 Ala Ala Val Thr Pro Glu His Ala Arg Pro His Arg Met Val Arg Phe 15 20 25 30
AAC CCG CGC AGC GAC CGC TTC CAC ACG CTC TCC TTC CAC CAC GTC GAG 146 Asn Pro Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ser Phe His His Val Glu
35 40 45
TTC TGG TGC GCG GAC GCC GCC TCC GCC GCC GGC CGC TTC GCG TTC GCG 194 Phe Trp Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ala Phe Ala 50 55 60
CTC GGC GCG CCG CTC GCC GCC AGG TCC GAC CTC TCC ACG GGG AAC TCC 242 Leu Gly Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser 65 70 75
GCG CAC GCC TCC CAG CTG CTC CGC TCG GGC TCC CTC GCC TTC CTC TTC 290 Ala His Ala Ser Gin Leu Leu Arg Ser Gly Ser Leu Ala Phe Leu Phe 80 85 90
ACC GCG CCC TAC GCC AAC GGC TGC GAC GCC GCC ACC GCC TCC CTG CCC 338 Thr Ala Pro Tyr Ala Asn Gly Cys Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Pro 95 100 105 110
TCC TTC TCC GCC GAC GCC GCG CGC CGG TTC TCC GCC GAC CAC GGG ATC 386 Ser Phe Ser Ala Asp Ala Ala Arg Arg Phe Ser Ala Asp His Gly Ile 115 120 125
GCG GTG CGC TCC GTA GCG CTG CGC GTC GCA GAC GCC GCC GAG GCC TTC 434 Ala Val Arg Ser Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Glu Ala Phe 130 135 140
CGC GCC AGT CGT CGA CGG GGC GCG CGC CCG GCC TTC GCC CCC GTG GAC 482 Arg Ala Ser Arg Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Val Asp 145 150 155
CTC GGC CGC GGC TTC GCG TTC GCG GAG GTC GAG CTC TAC GGC GAC GTC 530 Leu Gly Arg Gly Phe Ala Phe Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val 160 165 170
GTG CTC CGC TTC GTC AGC CAC CCG GAC GGC ACG GAC GTG CCC TTC TTG 578 Val Leu Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Thr Asp Val Pro Phe Leu 175 180 185 190 CCG GGG TTC GAG GGC GTA ACC AAC CCG GAC GCC GTG GAC TAC GGC CTG 626
Pro Gly Phe Glu Gly Val Thr Asn Pro Asp Ala Val Asp Tyr Gly Leu 195 200 205
ACG CGG TTC GAC CAC GTC GTC GGC AAC GTC CCG GAG CTT GCC CCC GCC 674 Thr Arg Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Ala 210 215 220
GCA GCC TAC ATC GCC GGG TTC ACG GGG TTC CAC GAG TTC GCC GAG TTC 722 Ala Ala Tyr Ile Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe 225 230 235
ACG GCG GAG GAC GTG GGC ACG ACC GAG AGC GGG CTC AAC TCG GTG GTG 770 Thr Ala Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val 240 245 250
CTC GCC AAC AAC TCG GAG GGC GTG CTG CTG CCG CTC AAC GAG CCG GTG 818 Leu Ala Asn Asn Ser Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val 255 260 265 270
CAC GGC ACC AAG CGC CGG AGC CAG ATA CAG ACG TTC CTG GAA CAC CAC 866 His Gly Thr Lys Arg Arg Ser Gin Ile Gin Thr Phe Leu Glu His His 275 280 285
GGC GGC CCG GGC GTG CAG CAC ATC GCG GTG GCC AGC AGT GAC GTG CTC 914 Gly Gly Pro Gly Val Gin His Ile Ala Val Ala Ser Ser Asp Val Leu 290 295 300
AGG ACG CTC AGG AAG ATG CGT GCG CGC TCC GCC ATG GGC GGC TTC GAC 962 Arg Thr Leu Arg Lys Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Asp 305 310 315
TTC CTG CCA CCC CCG CTG CCG AAG TAC TAC GAA GGC GTG CGA CGC CTT 1010 Phe Leu Pro Pro Pro Leu Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Leu 320 325 330
GCC GGG GAT GTC CTC TCG GAG GCG CAG ATC AAG GAA TGC CAG GAG CTG 1058 Ala Gly Asp Val Leu Ser Glu Ala Gin Ile Lys Glu Cys Gin Glu Leu 335 340 345 350
GGT GTG CTC GTC GAT AGG GAC GAC CAA GGG GTG TTG CTC CAA ATC TTC 1106 Gly Val Leu Val Asp Arg Asp Asp Gin Gly Val Leu Leu Gin Ile Phe 355 360 365
ACC AAG CCA GTA GGG GAC AGG CCG ACC TTG TTC CTG GAG ATG ATC CAG 1154 Thr Lys Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Leu Phe Leu Glu Met Ile Gin 370 375 380
AGG ATC GGG TGC ATG GAG AAG GAC GAG AGA GGG GAA GAG TAC CAG AAG 1202 Arg Ile Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Glu Glu Tyr Gin Lys 385 390 395 GGT GGC TGC GGC GGG TTC GGC AAA GGC AAC TTC TCC GAG CTG TTC AAG 1250
Gly Gly Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys 400 405 410
TCC ATT GAA GAT TAC GAG AAG TCC CTT GAA GCC AAG CAA TCT GCT GCA 1298 Ser Ile Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu Ala Lys Gin Ser Ala Ala 415 420 425 430
GTT CAG GGA TCA TAGGATAGAA GCTGGTCCTT GTATCATGGT CTCATGGAGC 1350
Val Gin Gly Ser
435
AAAAGAAAAC AATGTTGTTT GTAATATGCG TCGCACAATT ATATCAATGT TATAATTGGT 1410
GAAGCTGAAG ACAGATGTAT CCTATGTATG ATGGGTGTAA TGGATGGTAG AGGGGCTCAC 1470
ACATGAAGAA AATGTAGCGT TGACATTGTT GTACAATCTT GCTTGCAAGT AAAATAAAGA 1530
ACAGATTTTG AGTTCTGCAA AAAAAAAAAA AAAAA 1565
(2) INFORMATION ZU SEQ ID NO: 2:
(i) SEQUENZ CHARAKTERISTIKA:
(A) LÄNGE: 434 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure (D) TOPOLOGIE: linear
(ii) ART DES MOLEKÜLS: Protein
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Met Pro Pro Thr Pro Thr Thr Pro Ala Ala Thr Gly Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15
Val Thr Pro Glu His Ala Arg Pro His Arg Met Val Arg Phe Asn Pro 20 25 30
Arg Ser Asp Arg Phe His Thr Leu Ser Phe His His Val Glu Phe Trp 35 40 45
Cys Ala Asp Ala Ala Ser Ala Ala Gly Arg Phe Ala Phe Ala Leu Gly 50 55 60
Ala Pro Leu Ala Ala Arg Ser Asp Leu Ser Thr Gly Asn Ser Ala His 65 70 75 80
Ala Ser Gin Leu Leu Arg Ser Gly Ser Leu Ala Phe Leu Phe Thr Ala
85 90 95
Pro Tyr Ala Asn Gly Cys Asp Ala Ala Thr Ala Ser Leu Pro Ser Phe 100 105 110
Ser Ala Asp Ala Ala Arg Arg Phe Ser Ala Asp His Gly Ile Ala Val 115 120 125 Arg Ser Val Ala Leu Arg Val Ala Asp Ala Ala Glu Ala Phe Arg Ala 130 135 140
Ser Arg Arg Arg Gly Ala Arg Pro Ala Phe Ala Pro Val Asp Leu Gly 145 150 155 160
Arg Gly Phe Ala Phe Ala Glu Val Glu Leu Tyr Gly Asp Val Val Leu 165 170 175
Arg Phe Val Ser His Pro Asp Gly Thr Asp Val Pro Phe Leu Pro Gly 180 185 190
Phe Glu Gly Val Thr Asn Pro Asp Ala Val Asp Tyr Gly Leu Thr Arg 195 200 205
Phe Asp His Val Val Gly Asn Val Pro Glu Leu Ala Pro Ala Ala Ala 210 215 220
Tyr Ile Ala Gly Phe Thr Gly Phe His Glu Phe Ala Glu Phe Thr Ala 225 230 235 240
Glu Asp Val Gly Thr Thr Glu Ser Gly Leu Asn Ser Val Val Leu Ala 245 250 255
Asn Asn Ser Glu Gly Val Leu Leu Pro Leu Asn Glu Pro Val His Gly 260 265 270
Thr Lys Arg Arg Ser Gin Ile Gin Thr Phe Leu Glu His His Gly Gly 275 280 285
Pro Gly Val Gin His Ile Ala Val Ala Ser Ser Asp Val Leu Arg Thr 290 295 300
Leu Arg Lys Met Arg Ala Arg Ser Ala Met Gly Gly Phe Asp Phe Leu 305 310 315 320
Pro Pro Pro Leu Pro Lys Tyr Tyr Glu Gly Val Arg Arg Leu Ala Gly 325 330 335
Asp Val Leu Ser Glu Ala Gin Ile Lys Glu Cys Gin Glu Leu Gly Val 340 345 350
Leu Val Asp Arg Asp Asp Gin Gly Val Leu Leu Gin Ile Phe Thr Lys 355 360 365
Pro Val Gly Asp Arg Pro Thr Leu Phe Leu Glu Met Ile Gin Arg Ile 370 375 380
Gly Cys Met Glu Lys Asp Glu Arg Gly Glu Glu Tyr Gin Lys Gly Gly 385 390 395 400
Cys Gly Gly Phe Gly Lys Gly Asn Phe Ser Glu Leu Phe Lys Ser Ile 405 410 415 Glu Asp Tyr Glu Lys Ser Leu Glu -Ala Lys Gin Ser Ala Ala Val Gin 420 425 430
Gly Ser

Claims

Patentansprüche
1. DNA-Sequenz SEQ ID N0:1 und damit hybridisierende DNA- 5 Sequenzen kodierend für eine HPPD.
2. Expressionskassette enthaltend einen Promotor und eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.
10 3. Expressionskassette nach Anspruch 2, enthaltend den CaMV35S- Promotor .
4. Expressionskassette nach Anspruch 2, enthaltend den samenspezifischen Phaseolin- Promotor.
15
5. Expressionskassette nach Anspruch 2, wobei die DNA- Sequenz gemäß Anspruch 1 funktioneil mit einem anderen Protein so verknüpft ist, daß ein gemeinsames Translationsprodukt entsteht.
20
6. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 2 zur Transformation von Pflanzen.
7. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn- 25 zeichnet, daß man eine Expressionskassette gemäß Anspruch 2 in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzenzellen einbringt.
8. Verfahren zur Transformation von Pflanzen, dadurch gekenn- 30 zeichnet, daß man
1) die Expressionskassette nach Anspruch 2 in einen Agro- bakterienstamm transferiert,
2) die entstandenen rekombinanten Klone isoliert und 35 3) diese zur Transformation von Pflanzen verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Transformation mit Hilfe des Stammes Agrobacterium tumefaciens erfolgt.
40 10. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe der Elektroporation erfolgt.
45
(Zeichn.
11. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe der particle bombardment Methode erfolgt.
5 12. Pflanze mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt enthaltend eine Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 2 bis 5.
13. Pflanze gemäß Anspruch 12, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais oder Sonnenblume.
10
14. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1 in Pflanzen exprimiert wird.
15 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA- Sequenz in einer Tabakpflanze exprimiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 und 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Expression in den Blättern oder den Samen der Pflanze
20 erfolgt.
17. Verwendung von Expressionskassetten gemäß den Ansprüchen 2 bis 5 zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Vitamin E-Gehalt durch Expression einer DNA- Sequenz gemäß Anspruch 1
25 in Pflanzen.
18. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 2 zur Herstellung eines Testsystems zur Identifizierung von Inhibitoren der HPPD.
30
19. Testsystem basierend auf der Expression einer Expressions- kassette gemäß Anspruch 2 zur Identifizierung von Inhibitoren der HPPD.
35 20. Herbizide Wirkstoffe, identifizierbar mittels eines Testsystems gemäß Anspruch 19.
21. Verwendung einer Pflanze gemäß Anspruch 12 zur Herstellung pflanzlicher HPPD.
40
22. Verwendung der Expressionskassette gemäß Anspruch 2 zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der HPPD durch verstärkte Expression einer DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.
45
23. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der HPPD durch verstärkte Expression einer DNA- Sequenz gemäß Anspruch 1.
24. Pflanze mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der HPPD enthaltend eine Expressionskassette gemäß den Ansprüchen 2 bis 5.
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