CN105567707A - 一种抗hppd抑制剂基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对HPPD抑制剂具有高抗性的来源于睾丸酮丛毛单胞菌的HPPD抑制剂抗性基因及其在转基因植物中的应用。本发明所提供的将该基因转化植物的方法和其在转基因植株中表现的高抗HPPD抑制剂活性，将在抗HPPD抑制剂植物的研究和开发中发挥重要作用。

Description

一种抗HPPD抑制剂基因及其应用

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域和植物遗传工程学领域，具体涉及一种来源于睾丸酮丛毛单胞菌的抗HPPD抑制剂基因及其在转基因植株中的应用。

背景技术

对羟苯基丙酮酸双氧化酶(4一HPPD，EC1．13．11．27)是大部分生物体内催化酪氨酸代谢的重要的酶lknderDA．AminoAcidMetabolism(2nded)[M]．Lon—don：JohnWiley＆Sons，1985：208—221．它可催化酪氨酸降解产物对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸，尿黑酸是植物体内一种重要物质，它可以进一步脱酸、聚戊二烯基化和烷基化，从而生成光合作用中电子传递所需要的质体醌和生育酚（CrouchN.P.等人1997，Tetrahedron,53,20,6993-7010,Fritze等人，2004，PlantPhysiology134:1388-1400）自从HPPD酶在20世纪30年代被发现以来，已不断从鼠、鸡、猪、狗及人类的肝脏中以及假单细胞菌、玉米、胡萝卜、小麦等体内提取出来BartaI.C.&P.B¨oger，PurificationandCharacterizationof4-HydroxyphenylpyruvateDioxygenasefromMaixe，Pestic.Sci.，1996，48：109-116.［5］。

已经证明HPPD抑制剂作用于靶酶HPPD，可有效抑制对羟苯基丙酮酸转化为尿黑酸，从而导致质体醌和生育酚的合成受阻。质体醌和生育酚是光合作用中电子传递所需要的重要物质，因而HPPD抑制剂同时起着光合作用电子传递抑制剂的角色。此外，质体醌还是八氢番茄红素去饱和酶的关键辅助因素，质体醌的减少使八氢番茄红素去饱和酶的催化作用受阻，从而影响类胡萝卜素的生物合成。类胡萝卜素既可作为光吸收体，又可作为保护性物质，降低三线态叶绿体或单线态氧的激发，类胡萝卜素的生物合成被抑制将导致植物最终死亡。这样HPPD抑制剂同时又起着八氢番茄红素去饱和酶抑制剂的角色，是一类很有前途的除草剂。

早在1985年就有报道指出，HPPD可能是开发除草剂新品种的新靶标；1992年发现，三酮类化合物是HPPD的潜在抑制剂；到目前为止，除了80年代开发的吡唑类品种外，新近又开发出若干广谱高活性新品种，即三酮类的磺草酮与甲基磺草酮以及异恶唑类的百农思。这表明，HPPD作为靶标，涉及的化合物类型不断增多，成为今后开发除草剂新品种的重要领域之一。目前，已经商业化的HPPD抑制型除草剂主要属于四个化学家族：三酮类（例如磺草酮、甲基磺草酮）、二酮腈类、异噁唑类（例如异噁氟草）、吡唑类（例如吡唑特、吡草酮和苄草唑）

目前，HPPD抑制剂型除草剂被广泛应用到对其具有代谢耐受性的植物中（例如玉米可迅速代谢掉HPPD抑制剂），用以防治杂草。为了能扩大HPPD抑制剂型除草剂的应用范围，迫切需要对植物（特别是没有代谢耐受性的植物）进行改造，以赋予其对HPPD抑制剂的耐受性。

已有很多报道通过向植物中转入外源的HPPD抑制剂抗性基因以赋予植物对HPPD抑制剂的耐受性，例如，Dufourmantel等人将假单胞菌属的HPPD抑制剂抗性基因转入烟草和大豆中，获得了对异恶唑草酮的耐受性（DuDufourmantel等人，2007，PlantBiotechnolJ.5(1):118-33）。

在WO99/24585中，公开了一个突变的HPPD核苷酸序列及其获得对某些HPPD抑制剂具有耐受性的植物。

为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的HPPD抑制剂抗性基因和以此为基础的抗HPPD抑制剂转基因植物。

本发明所提供的新的HPPD抑制剂抗性基因，是发明人用PCR的方法从发明人筛选的高HPPD抑制剂抗性菌株中克隆得到。本发明进一步在拟南芥、水稻、玉米等植物中证明了这个HPPD抑制剂抗性基因的抗HPPD抑制剂能力及其在发展转基因抗HPPD抑制剂农作物中的用途。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供新的使植物具有HPPD抑制剂抗性的基因及其编码蛋白。另外，本发明还提供了这个基因的基因工程中间体（如表达盒、载体和细胞等），获得具有HPPD抑制剂抗性的植物的方法和应用，并提供了判断植物是否具有HPPD抑制剂抗性的鉴定方法。

具体而言，在第一方面，本发明提供了一种对HPPD抑制剂具有高抗性的新基因，本发明所提供的HPPD抑制剂抗性基因，是发明人筛选并克隆到的一种新的抗HPPD抑制剂基因（以下称为Ct2-HPPD基因）。Ct2-HPPD基因是用PCR方法从发明人筛选的高HPPD抑制剂抗性菌株睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni）中克隆得到的。睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni）H-4为本发明人从喷洒HPPD抑制剂的试验田土壤中经初筛和复筛等大量的实验得到的对HPPD抑制剂具有高耐受活性的菌株。菌株H-4于2015年12月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.11895，保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。Ct2-HPPD基因是下述核苷酸序列之一：

1）序列表中SEQIDNO：1所示的核苷酸序列；

2）与SEQIDNO：1序列具有90％以上相似性且编码相同功能蛋白质的DNA序列；

3）与SEQIDNO：1相比，具有SEQIDNO：1序列的部分、区段和/或片段（包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失）、其变体、突变体、嵌合体和融合物且可编码赋予HPPD抑制剂抗性活性的蛋白质的核苷酸序列；

4）根据SEQIDNO：1，利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码高HPPD抑制剂抗性活性的蛋白质多肽；

5）通过导入SEQIDNO：1所示的核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗HPPD抑制剂能力的蛋白质的核苷酸序列。

本发明第一方面的HPPD抑制剂抗性基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于：1）利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽；2）通过导入核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗HPPD抑制剂能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失的变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。

在第二方面，本发明提供对HPPD抑制剂具有高抗性的一种新的HPPD抑制剂抗性基因的编码蛋白，由本发明第一方面的基因编码，该蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：

1）由SEQIDNo：2代表的氨基酸序列组成的蛋白质，

2）与SEQIDNo：2代表的蛋白序列相比，由具有替代、缺失或添加一个或几个氨基酸的氨基酸序列组成且赋予高HPPD抑制剂抗性活性的蛋白质。

3）与SEQIDNo：2代表的蛋白序列相比，有具有SEQIDNo：2序列的部分、区段和/或片段（包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失）、其变体、突变体、嵌合体和融合物且赋予高HPPD抑制剂抗性活性的蛋白。

在知晓具体序列的前提下，通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的编码如SEQIDNo：2所示的蛋白的核酸分子或其片段。另外，可通过如定点诱变技术等合成与突变体具有相同功能的本发明的突变体基因。

当然，本领域技术人员根据本文的启示，通过缺失、取代和/或添加SEQIDNo：2所示的蛋白中一个或几个氨基酸的方式，或者通过杂交来搜寻能在严紧条件下能与编码SEQIDNo：2所示的蛋白的核酸杂交的核酸，选择出与本发明的基因功能等同的突变体蛋白及其基因，这也纳入本发明的范围之内。

本发明的基因可以与其他基因和蛋白质融合以产生嵌合或融合蛋白。本发明的有用基因和蛋白质不仅包括具体的示例的全长序列，还包括这些序列的部分、区段和/或片段（包括临近片段和与全长分子相比内部和/或末端缺失）、其变体、突变体、嵌合体和融合物。

只要保留所需的功能活性，本发明的蛋白质可以具有替换的氨基酸。保留了如示例蛋白质相应片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等价物在本发明的范围内。

通过改变蛋白质三维特征和其他未提及的多种特性（例如保守型氨基酸替换）而不对蛋白质的活性/功能性产生不利影响，这些也在本发明的范围内。

通过各种方法，例如通过多种蛋白酶进行切割，而切除蛋白质的部分序列，并在切除后仍保留并表现活性和功能，由这种方法产生的蛋白质也在本发明的范围内。

用于植物表达的序列优化也在本发明范围内。为了在植物中更好的高表达外源基因，可能优选重新设计所述基因以使其在植物细胞中更有效的表达。例如可以利用植物密码子偏好性重新改造外源基因以得到最优表达。

本发明的Ct2-HPPD基因及其编码蛋白赋予微生物的对HPPD抑制剂的高耐受活性，其最大耐受浓度达到21mM。

在第三方面，本发明提供了包含本发明第一方面所述的HPPD抑制剂抗性基因的载体。本文中的术语“载体”是指本领域中常用的细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。根据所应用的目的不同，“载体”在本文中可以分为“克隆载体”、“表达载体”和“转化载体”，指的是所使用的目的分别针对克隆并验证基因、表达相应基因和将相应基因转化。本发明中适用的载体包括但不限于：在细菌中表达用的载体（原核表达载体）、在酵母中表达用的载体（如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等）、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体（痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等）、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。除了在克隆过程中必要的克隆载体之外，还优选本发明第四方面中的载体是转化载体，尤其是植物转化载体，特别是适合农杆菌转化植物的载体。上述重组载体还包含外源基因或外源DNA片段。

在第四方面，本发明提供了包含本发明第一方面所述的Ct2-HPPD基因的细胞。细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。优选的细胞可以是农杆菌细胞，利用它可以将目的基因转化入植物。另外优选的是微生物细胞，如细菌细胞，它们可以作为克隆载体或转化载体的宿主细胞。

在第五方面，本发明提供了植物，其包含本发明第一方面的Ct2-HPPD基因，和/或其表达本发明第二方面的蛋白质。由于引入了本发明第一方面的Ct2-HPPD基因和本发明第二方面的蛋白质，本发明第五方面的植物具有HPPD抑制剂抗性。在本文中，植物指的是借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物就能合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的单个植株、植株群或其繁殖材料，包括植物、植物品种、植株、植物事件、植物后代、植物种子或其他植物的可繁殖部分。其中，植物后代本身就是植物，包括通过转基因技术产生的植物后代、与其他植物品种杂交产生的植物后代、以及回交或自交产生的植物后代，也包括后代的转基因植物细胞、组织、器官、种子。

本发明第五方面的植物可以是双子叶植物，也可以是单子叶植物。优选的植物和植物细胞为拟南芥、烟草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、草坪草及牧草等。还可以根据本发明产生其他类型的转基因植物，如水果、蔬菜和树木。可以将本发明的蛋白质编码基因引入多种微生物或植物宿主中。本发明包括转基因植物细胞和转基因植物。

在第六方面，本发明提供了本发明第一方面所述的基因在获得具有HPPD抑制剂抗性的转基因植物过程中的应用。在已知基因的条件下，培育转基因植物的方法是有先例的，例如可以通过农杆菌转化的方式或者微粒轰击或电穿孔的方式将基因导入植物或其组织中，然后培养该植物或其组织并在存在HPPD抑制剂的环境中筛选。优选在本文中，所述植物是拟南芥、烟草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、草坪草及牧草等。

在本文中，获得包括制备、培育、生产或以其他方式产生得到，包括通过转基因育种方式获得，如将本发明第一方面的基因转入植物后使之表达本发明第二方面的蛋白质；也包括通过非转基因育种方式获得，如通过杂交、回交、自交或无性繁殖本发明第五方面的植物并分选出仍旧包含本发明第一方面的基因并表达本发明第二方面的蛋白质的植物。因此，本发明的第六方面提供的应用包括，在获得具有HPPD抑制剂抗性的转基因植物过程中的应用和在获得具有HPPD抑制剂抗性的非转基因植物过程中的应用。

在第七方面，本发明提供了获得具有HPPD抑制剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）使植物包含本发明第一方面的基因；和/或，

（2）使植物表达本发明第二方面的蛋白质。

可以采用前述或者本领域技术人员能获知的转基因和非转基因方法，使植物包含本发明第一方面的基因，或者使植物表达本发明第二方面的蛋白质。实施本发明第七方面的方法，能够获得本发明第五方面的植物。优选在本发明的第七方面中，可以采用的步骤包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。这些步骤本身对于转基因或非转基因育种领域的技术人员来说，都是可以获知并实施的。

在第八方面，本发明提供了鉴定本发明第五方面的植物或者本发明第七方面的方法获得的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）测定所述植物是否包含本发明第一方面的基因；和/或，

（2）测定所述植物是否表达本发明第二方面的蛋白质。

测定的步骤可以通过常规的核酸检测和/或蛋白质检测方法来进行，只需要能够检测出基因或其编码蛋白的方法都可以。示例性的方法包括蛋白质测序、核酸测序、聚合酶链式反应（PCR）检测、探针杂交检测等。

如从所述转基因植物或其后代、种子中进行本发明第一方面所述的Ct2-HPPD基因或其同源序列的扩增，对扩增出的序列进行序列分析并与本发明第一方面所述的Ct2-HPPD基因序列相比较。其中扩增的方法是公知的，如PCR扩增。由于本发明第一方面所述的Ct2-HPPD基因是从细菌中分离得到的，天然的植物或其种子中并不含有该基因，如果能够从植物或其种子中扩增出序列而且该序列与本发明第一方面所述的Ct2-HPPD基因相同，那么该植物或其种子就是导入了本发明第一方面所述的Ct2-HPPD基因的HPPD抑制剂抗性的转基因植物或其后代、种子。

本发明涉及来自转基因植物的转基因植物细胞、组织、器官、种子或植物体部分。本发明也包括转基因植物后代及后代的转基因植物细胞、组织、器官、种子和植物部分。

为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，并不构成对本发明范围的限制。显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。

附图说明

图1为将Ct2-HPPD基因插入到植物表达载体PTG2获得的PTG2-Ct2HPPD载体构建示意图。

图2为T1代转基因拟南芥苗喷洒1mMHPPD抑制剂实验。拟南芥苗长出4片叶时喷洒1mMHPPD抑制剂，经过7天后转基因苗和未转基因苗存活情况：转Ct2-HPPD基因苗存活（A）；未转基因苗枯死（B）。

图3为PCR检测转基因拟南芥T1代电泳图。1-6为转基因拟南芥，M为marker，P为质粒对照，WT为野生型对照。

图4为T2代转基因拟南芥苗喷洒HPPD抑制剂实验。拟南芥苗长出4片叶时分别喷洒2mM、5mM和10mM的HPPD抑制剂，经过7天后的存活情况，在10mM浓度下转基因株系仍表现抗性。

图5为T1代水稻浸泡HPPD抑制剂筛选实验。转基因水稻萌发至1cm时使用1mMHPPD抑制剂浸泡，经过7天后的存活情况。非转基因水稻已经干枯（B），转基因水稻未受影响（A）。

图6为T2代转基因水稻苗喷洒HPPD抑制剂实验。转基因水稻苗长出3-4片叶时，喷洒5mMHPPD抑制剂，经过10天后的存活情况。野生型（WT）枯死，转基因水稻苗（Ct2HPPD-4、Ct2HPPD-16、Ct2HPPD-31）生长良好。

图7为T1代转基因玉米苗喷洒HPPD抑制剂实验。转基因玉米苗长出4片叶时，喷洒5mMHPPD抑制剂，经过14天后的存活情况。非转基因玉米已经干枯（B），转基因玉米未受影响（A）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，培养基中的溶剂均为水，具体步骤可参见：《MolecularCloning:ALboratoryManual》（Sambrook，J.，Russell,DavidW.，MolecularCloning:ALaboratoryManual，3^rdedition，2001，NY，ColdSpringHarbor）。所用引物及DNA序列均由上海英骏生物技术有限公司合成。

1780改培养基（1L）：K₂HPO₄0.61g，KH₂PO₄0.39g，KCl0.25g，MgSO₄·7H₂O0.13g，微量元素液1.0ml。灭菌冷却后添加HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）至所需终浓度。

其中每1000ml微量元素液包括CaCl₂·2H₂O0.0004g，FeSO₄·7H₂O0.04g，MnSO₄·4H₂O0.04g，ZnSO₄·7H₂O0.02g，CuSO₄·5H₂O0.005g，CoCl₂·6H₂O0.004g，NaCl1.0g，Na₂MoO₄·2H₂O0.005g。

1/10LB液体培养基（1L）：酵母粉0.5g，蛋白胨1g，NaCl10g；灭菌冷却后添加HPPD抑制剂至所需终浓度。

LB液体培养基（1L）：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl10g。

2×YT培养基（1L）：酵母提取物16g，蛋白胨16g，NaCl5g，琼脂粉12g。

YEB培养基（1L）：牛肉提取物5g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，NaCl5g，固体培养基添加15g琼脂粉。

如需要，在以上培养基中添加相应的抗生素。卡那霉素终浓度50μg/ml，利福平终浓度40μg/ml。

实施例1HPPD抑制剂抗性菌株-睾丸酮丛毛单胞菌ComamonastestosteroniH-4的分离、纯化和鉴定

1、土壤样品来源

从喷洒HPPD抑制剂的实验田土层下5cm处采集土壤样品。

2、HPPD抑制剂抗性菌株的分离、纯化

菌株的富集：分别称取20克土壤样品，其中一份土壤样品加入到含0.3mMHPPD抑制剂的1/10LB液体培养基中（装液量为50ml/300ml三角瓶），另一份土壤样品加入到含0.3mMHPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）的1780改液体培养基中（装液量为50ml/300ml三角瓶），置30^oC摇床中200rpm进行富集培养。

菌株的驯化与纯化：每次富集培养7天，将培养物3000rpm离心10min，弃上清，沉淀中重新加入培养基，继续驯化。驯化四个周期后，开始逐步提高培养基中HPPD抑制剂浓度（HPPD抑制剂浓度梯度为：0.6mM，0.9mM，1.5mM，2.25mM，2.4mM，2.7mM，3mM和3.6mM），7天为一个驯化周期，并同时在每个驯化周期结束时取培养液在1780改固体平板上涂布，30^oC恒温培养，挑取单菌落，反复划线分离纯化，得到单一菌落。其中，在HPPD抑制剂驯化浓度为2.25mM时筛选到本发明的菌株H-4。

3、HPPD抑制剂耐受实验：

在HPPD抑制剂抗性菌株筛选过程中共分离到12株抗性菌株，分别对它们进行了HPPD抑制剂耐受实验。HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）耐受浓度梯度分别为（mM）：0.3、0.6、1.5、3、3.6、9、15、16.5、18、19.5和21，耐受培养基为LB液体培养基，置30^oC摇床中200rpm培养三天，测定培养液的OD₆₀₀。结果：可以耐受15mMHPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）浓度的抗性菌有6株，其中的4株可以最高耐受21mMHPPD抑制剂，其中本发明的H-4可以耐受HPPD抑制剂的浓度最高为21mM。

4、HPPD抑制剂抗性菌株H-4总DNA的提取及菌种鉴定

将分离获得的H-4在3ml液体LB培养基中培养16h，用细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技有限公司）提取菌体总DNA。

以提取的总DNA为模板，利用细菌16SrRNA通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）扩增抗性菌株16SrRNA基因。PCR产物1%琼脂糖凝胶回收后连接pEASYBlunt载体，转化DH5α，挑取阳性克隆送至英骏公司测序。测序结果在NCBI中进行序列比对，结果显示H-4属于睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni），所以命名为ComamonastestosteroniH-4。。

实施例2高耐受HPPD抑制剂的DNA片段克隆

PCR方法获得部分高耐受HPPD抑制剂的DNA片段

根据NCBI中公布的ComamonastestosteroneHPPD抑制剂抗性基因序列设计

引物1-F：5′-ATGACCGATTTGTTCGAAAACC-3′

引物1-R：5′-TCACTCCTTGGCGGTTTCG-3′

用高保真Taq酶KOD-FX从Comamonastestosteroni基因组中扩增抗HPPD抑制剂基因的部分序列，PCR程序：98^oC10sec，60^oC30sec，68^oC2min，共30个循环。

引物1-F（SEQIDNo：3所示）和引物1-R（SEQIDNo：4所示）的PCR产物为1089bp的DNA片段，为获得高耐受HPPD抑制剂的DNA片段。

从Comamonastestosteroni基因组DNA中，用Taq酶KOD-FX高保真酶，利用引物引物1-F和1-RPCR扩增高耐受HPPD抑制剂的DNA片段的完整序列。结果获得PCR产物共1089bp，命名为Ct2-HPPD基因。Ct2-HPPD基因有1089个核苷酸组成，如SEQIDNo：1所示；Ct2-HPPD基因编码的蛋白质由362个氨基酸组成，如SEQIDNo：2所示。

实施例3植物表达载体PTG2-Ct2HPPD的构建

根据Ct2-HPPD基因序列，设计引物2-F和2-R

引物2-F:5′-GTCGACATGACCGATTTGTTCGAAAACC-3′

引物2-R:5′-CCCGGGTCACTCCTTGGCGGTTTCG-3′

用引物2-F（SEQIDNo：5所示）和2-R（SEQIDNo：6所示）对Ct2-HPPD基因序列进行PCR扩增，然后用SalI和XmaI酶切，得到插入片段；取公司自保存的PTG1载体用SalI和XmaI酶切，然后用连接酶连接上述插入片段和载体，将连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，经含有50mg/L卡那霉素的2×YT培养基培养筛选后挑选阳性克隆，抽取质粒后经测序选择序列正确的克隆，得具有目标基因的质粒，命名为PTG2-Ct2HPPD，见附图1。

实施例4：植物转化、苗期筛选

植物转化：将构建好的植物表达载体转化农杆菌AgL₀，用于转化植（作）物：拟南芥、烟草、棉花、水稻、玉米、大豆、小麦、油菜、草坪草及牧草等。通过农杆菌液浸花法转化拟南芥和玉米；通过农杆菌侵染愈伤后分化再生获得转基因水稻。

转化拟南芥结果如下：

T1代拟南芥苗筛选：含有重组载体的农杆菌转化拟南芥，收获T0代种子并播种，在其长出4片叶时喷洒1mM的HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）。7天后，未转基因的拟南芥苗枯死，转基因阳性苗生长状态良好。结果见附图2。用引物1-F和1-R进行PCR，进一步在分子水平验证转基因株系的阳性。每株取两片嫩叶，用CTAB法提取植物基因组DNA。分别利用引物1-F和1-R，以抗性植株基因组DNA为模板，扩增Ct2-HPPD基因片段。对PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，可以检测到1089bp的目的片段（结果见附图3）。我们随机对6个株系进行了PCR实验，结果全部呈阳性。这进一步证明了我们获得的拟南芥植株为具有HPPD抑制剂抗性的转基因阳性株系。

拟南芥T2代转基因阳性苗HPPD抑制剂耐受实验及PCR检测

将阳性转基因T1代拟南芥扩繁单株收获T2代，每个种植盆中种植收获种子最多的3个株系并重复3盆，长出4片叶时3个种植盆分别喷洒2mM、5mM和10mM的HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）。7天后获得生长良好的转基因T2代（结果见附图4）。其中，转Ct2-HPPD基因的转基因拟南芥能耐受10mM的HPPD抑制剂。

转化水稻结果如下：

T1代水稻株系的抗性筛选：

用含有重组载体的农杆菌转化水稻，收获T0代种子并播种，在T1代水稻萌发至1cm时使用1mM的HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）浸泡。7天后获得生长良好的转基因T1代（结果见附图5）。从上面的结果可以看出：转Ct2-HPPD基因的水稻可以表现HPPD抑制剂耐受性，该基因在水稻中实现了表达。

₂代水稻株系的抗性筛选：

T₂代水稻长出3-4片叶时分别喷洒5mM的HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）。10天后获得生长良好的转基因T2代（结果见附图6）。结果发现：5mM时野生型水稻枯萎，转基因水稻生长良好。从上面的结果可以看出：转Ct2-HPPD基因的水稻部分株系也表现出了很好的HPPD抑制剂耐受性，该基因在水稻中实现了很好的表达，耐受浓度是田间喷洒浓度的5倍。

转化玉米结果如下：

T1代转基因玉米筛选：含有重组载体的农杆菌转化玉米纯合亲本，收获T0代种子并播种，在其长出4片叶时喷洒5mM的HPPD抑制剂（75%异恶唑草酮水分散粒剂）。14天后，未转基因的玉米苗枯死，转基因阳性苗生长状态良好（附图7）。结果发现：5mM时野生型玉米枯萎，转基因玉米生长良好，表现出很好的抗HPPD抑制剂能力。

从上面的结果可以看出：转Ct2-HPPD基因的玉米部分株系也表现出了很好的HPPD抑制剂耐受性，该基因在玉米中实现了很好的表达，耐受浓度是田间喷洒浓度的5倍。

最后，还需要强调的是，以上举例的仅是本发明其中的几个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

SEQUENCELISTING

<110>北京未名凯拓作物设计中心有限公司

<120>一种抗HPPD抑制剂基因及其应用

<130>

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1089

<212>DNA

<213>睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni）

<400>1

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cagcccgtggacattcccaccggccccatggagctgcgcctgcccgccatcaagggcatc360

ggtggtgcgccgctttacctgatcgatcgctacgaagacggcaagtccatctacgacatc420

gacttcgagtttctgcccggtgtggaccgcaatcccaagggccacggtttccaggtcgtc480

gatcacctcacgcacaacgtttaccgcggccgcatggcctactgggccgacttctacaac540

aagctgttcaacttccaggaaatccgctacttcgacatccagggcgagtacacgggcctg600

acctccaaggccatgactgcgcctgacggcctgatccgcattcctctgaacgaggaagcc660

aagcagggcggtggccagatcgaggaattcctgatgaagttcaatggcgagggcatacag720

cacatcgcgctgctgtgcgaagacctgcccacggccatcgacagcctgcagatggctggc780

attccgctgctgactgcgcccaacgacatctattacgagaacctcgccaagcgccttccc840

ggccacggccagcccgtgggcgagttgcagtcgcgtggcatcttgctggatggcaccacc900

gaaggcggccagccacgcctgctgttgcagatcttctccgagccgctgttgggccccgtg960

ttcttcgagttcatcgagcgcaagggcaactaccgcgaaggcttcggcgagggcaatttc1020

aaggcgctgttcgagtccatggaacgcgaccagatcaaccgcggcgtgctcgaaaccgcc1080

aaggagtga1089

<210>2

<211>362

<212>PRT

<213>睾丸酮丛毛单胞菌（Comamonastestosteroni）

<400>2

MetThrAspLeuPheGluAsnProMetGlyLeuCysGlyPheGluPhe

151015

ValGluPheAlaSerProAlaAspGlyValLeuGluProLeuPheGlu

202530

LysLeuGlyPheThrLeuValAlaLysHisArgSerLysAspValVal

354045

LeuTyrArgGlnGlyGlyIleAsnPheIleIleAsnArgGluProArg

505560

SerGlnAlaAlaTyrPheThrAlaGluHisGlyProSerAlaCysGly

65707580

LeuAlaPheArgValLysAspAlaHisLysAlaTyrLysArgAlaLeu

859095

GluLeuGlyAlaGlnProValAspIleProThrGlyProMetGluLeu

100105110

ArgLeuProAlaIleLysGlyIleGlyGlyAlaProLeuTyrLeuIle

115120125

AspArgTyrGluAspGlyLysSerIleTyrAspIleAspPheGluPhe

130135140

LeuProGlyValAspArgAsnProLysGlyHisGlyPheGlnValVal

145150155160

AspHisLeuThrHisAsnValTyrArgGlyArgMetAlaTyrTrpAla

165170175

AspPheTyrAsnLysLeuPheAsnPheGlnGluIleArgTyrPheAsp

180185190

IleGlnGlyGluTyrThrGlyLeuThrSerLysAlaMetThrAlaPro

195200205

AspGlyLeuIleArgIleProLeuAsnGluGluAlaLysGlnGlyGly

210215220

GlyGlnIleGluGluPheLeuMetLysPheAsnGlyGluGlyIleGln

225230235240

HisIleAlaLeuLeuCysGluAspLeuProThrAlaIleAspSerLeu

245250255

GlnMetAlaGlyIleProLeuLeuThrAlaProAsnAspIleTyrTyr

260265270

GluAsnLeuAlaLysArgLeuProGlyHisGlyGlnProValGlyGlu

275280285

LeuGlnSerArgGlyIleLeuLeuAspGlyThrThrGluGlyGlyGln

290295300

ProArgLeuLeuLeuGlnIlePheSerGluProLeuLeuGlyProVal

305310315320

PhePheGluPheIleGluArgLysGlyAsnTyrArgGluGlyPheGly

325330335

GluGlyAsnPheLysAlaLeuPheGluSerMetGluArgAspGlnIle

340345350

AsnArgGlyValLeuGluThrAlaLysGlu

355360

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

atgaccgatttgttcgaaaacc22

<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tcactccttggcggtttcg19

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtcgacatgaccgatttgttcgaaaacc28

<210>6

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cccgggtcactccttggcggtttcg25

Claims (11)

1.使植物具有HPPD抑制剂抗性的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

2.权利要求1所述的基因，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

3.使植物具有HPPD抑制剂抗性的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

4.表达盒、载体或细胞，其包含权利要求1-2所述的基因。

5.权利要求1-2所述的基因、权利要求3所述的蛋白质、权利要求4所述的表达盒、载体或细胞、包含权利要求1-2所述的基因的植物、或表达权利要求3所述的蛋白质的植物在获得具有HPPD抑制剂抗性的植物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，其包括在获得具有HPPD抑制剂抗性的转基因植物过程中的应用和在获得具有HPPD抑制剂抗性的非转基因植物过程中的应用。

7.根据权利要求5-6所述的应用，其特征在于，通过转基因育种方式或者非转基因育种方式获得具有HPPD抑制剂抗性的植物。

8.获得具有HPPD抑制剂抗性的植物的方法，其包括如下步骤：

（1）使植物包含权利要求1-2所述的基因；和/或，

（2）使植物表达权利要求3所述的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖步骤。

10.鉴定植物的方法，其中植物包含权利要求权利要求1或2所述的基因的植物、表达权利要求3所述的蛋白质的植物或者权利要求8或9所述的方法获得的植物，其包括如下步骤：

（1）测定所述植物是否包含权利要求1或2所述的基因；和/或，

（2）测定所述植物是否表达权利要求3所述的蛋白质。

11.根据权利要求1-10任一项所述，其特征在于：所述植物包括单子叶植物或双子叶植物，其中单子叶植物为水稻、玉米、小麦，双子叶植物为拟南芥、烟草、棉花、大豆。