WO1998006390A1 - Spontan dispergierbare konzentrate mit antiviral, viruzid und/oder antiparasitisch wirksamen estern von sterolen und vitamin-d-derivaten - Google Patents

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Carl Eugster
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Definitions

  • the present invention relates to spontaneously dispersible concentrates with esters of sterols and vitamin D compounds and ultramicroemulsions prepared therefrom for the production of medicaments with antiviral, virucidal and / or antiparasitic activity
  • ester compounds also have excellent antiviral or directly virucidal and antiparasitic activity, in particular against trypanosomes.
  • the therapeutic properties of these selected esters occur more when they optimally solubilize, i.e. incorporated into spontaneously dispersible concentrates and then diluted with distilled water or 5% glucose solution or physiological saline solution (Ringer's solution), resulting in thermodynamically stable ultramicroemulsions with micelles which have a very small hydrodynamic radius of only 2.2 to 3.0 nm
  • Preferred compounds of the formulas (I) to (V) are those in which R 1 is a C2. 21 alkyl, a C 3 - 2 i-alkenyl, a C. 3 2 -alkapolyene group or a group of the formula (VIII) •
  • An outstanding antiviral / virucidal, or antiparasitic activity are compounds of the formulas (I), (II), (III) or (IV) wherein R is a C 10 - Group 2 ⁇ alkyl, a C 10 7 .i - alkenyl, a C 10 - 17 -Alkapolyenement or Retinoyl distr.
  • R is a C 10 - Group 2 ⁇ alkyl, a C 10 7 .i - alkenyl, a C 10 - 17 -Alkapolyenement or Retinoyl distr.
  • Examples of compounds according to formulas (I) to (VII) include: trans-2-butenoic acid-3
  • Palmitic acid 3 i-hydroxy-5 ⁇ -cholestanyl ester (cholestanyl palmitate)
  • 3p-stigmast-5-en-3-all trans-retinate (ß-sitosteryl-all-trans-retinate).
  • the selected sterol esters and esters of vitamin D compounds of the formulas (I) to (VII) are almost water-insoluble and highly agglomerated compounds. So that they can diffuse through the membrane barrier of the host cells and through the protein envelope of the viruses or the outer membrane of the trypanosomes and become effective in the cell plasma, or in the virus or parasite interior, they first have to be solubilized in a suitable manner in the aqueous medium
  • thermodynamically stable oil-in-water ultra-microemulstones With the help of specially selected cosurfactants or solubilizers on the one hand and suitable surfactants on the other hand, it is possible to achieve an optimal degree of solubilization of the esters described.
  • All experimental observations on ultramicroemulsions designed in this way can be interpreted uniformly by the assumption that the selected surfactants and cosurfactants, taken as a balanced system, form organized aggregates, so-called micelles, in the aqueous phase. These are more or less spherical in shape, with a hydrodynamic radius of 2.2 to 3.0 nm. See “Mode-selective dynamic light scattering; theory versus expe ⁇ mental reaction", Thomas Gisler, et al., Applied Optics / Vol. 34, No 18/20 June 1995, pp. 3546-3553.
  • the surfactants and hydrotropes create a boundary layer between the outer, aqueous phase and the inner, oily phase of the microemulsion [containing the esters of formulas (I) to (VII), dissolved in the biosurfactant solubilizer], as a result of which the mixture of these two Phases is omitted.
  • the molecules of the selected esters are present in the oily, inner phase in monomeric or in oligomeric agglomerated form.
  • the micelles of the sterol- or vitamin D-ester-containing inner phase of the ultramicroemulsions according to the invention are accordingly on their surface, ie on their boundary layer protected by a surfactant coat, which it repairs, easily diffuse through the cell membrane into the interior of the virus or parasite-infected and thus "defective" or "abnormal” cells. Diffusion through the plasma membrane of infected cells occurs exclusively due to thermal molecular movements The direction that a specific diffusion process takes is determined by the difference in concentration that exists on the fractal plasma membrane between outside and inside the host cell. The diffusion continues along the concentration gradient until it is broken down.
  • the concentration of active substance or the active substance system (“multiple drug system”) is balanced between the extracellular zone and the interior of the individual host cell, the virus or the parasite, and delayed release effects (“slow release effects”) can also occur.
  • Such diffusion processes run independently of any energy supply. They have no relation to cellular metabolic energy. The speed of the diffusion process or the strength of the active substance transport through the membrane of the host cell is determined
  • a globular "micelle" with a hydrodynamic radius of one centimeter has a
  • the "packing density" of a spontaneously dispersible, stable MARIGENOL® concentrate increases in exponential function with the smaller particle size of the micelles.
  • the decisive factors are the correct formation of the inner phase, its balanced relationship to the total concentrate and the selection of the appropriate surfactants.
  • the concentrates which are spontaneously dispersible according to the invention contain: 0.5 to 10% by weight of individual esters of the formulas (I) to (VII), or combinations of such esters, and
  • a pharmaceutically acceptable solvent or solvent mixture serving as hydrotrope or co-emulsifier 0 to 40% by weight of a pharmaceutically acceptable solvent or solvent mixture serving as hydrotrope or co-emulsifier, 5 to 90% by weight of a pharmaceutically acceptable surfactant or surfactant mixture,
  • a stabilizer 0 to 10% by weight of a stabilizer, or Radtkalfangers or a penetration enhancer and carriers and / or diluents
  • pharmaceutical active ingredients are to be understood as all active ingredients that can normally be used in human medicine. Pay for this - e.g. beta blockers
  • Pindolol [1- (4-indolyloxy) -3-isopropylamino-2-propanol] propanolol [1-isopropylamino-3- (1-naphthyloxy) -2-propanol] oxprenolol [1- (o-allyloxyphenoxy) -3-isopropylamino-2 2-propanol] metoprolol [D ⁇ - ⁇ (+ -) - 1- ( ⁇ sopropylam ⁇ no) -3- [p- ⁇ 2-methoxyethyl) - phenoxy-2-propanol] -L (+) tartrate ⁇ ]
  • Acetazolamide [5-Acetam ⁇ do-1, 3,4-th ⁇ ad ⁇ azol-2-sulfonam ⁇ d]
  • Chloroquinaldol [5,7-dichloro-8-hydroxyquininaldine]
  • Crotamiton N-crotonyl-N-ethyl-o-toluidine
  • Diamthazole [6 (-) 2-dimethylamino-ethoxy- (ß-diethylamino -) - benzothiazole dihydrochloride]
  • Pindolol [1- (4-indolyloxy-3-isopropylamino-2-propanol] cytostatics
  • Cyclophosphamide [N, -B ⁇ s- (-Chlore thyl) -am ⁇ no-1-oxa-3-aza-2-phosphocyclohexan-2-ox ⁇ d] anti-inflammatory agents
  • Dexamethasone [9-fluoro-11
  • Nifedipine [1,4-dihydro-2,6-dimethyl-4- (o-nitrophenyl) pyrid-3,5-dicarboxylic acid dimethyl ester]
  • Cinnaza ⁇ n [1-trans-Cnamnyl-4-d ⁇ phenylmethyl-p ⁇ peraz ⁇ n]
  • Pentoxyfyl n [3,7-dimethyl-1 - (5-oxo-hexyl) -xanth ⁇ n] antirythmic
  • Domperidone [5-chloro-1 - ⁇ 1- (3- [2-oxo-1-benz ⁇ m ⁇ dazol ⁇ nyl] -propyl) -4- p ⁇ per ⁇ dyl ⁇ 2-benz ⁇ m ⁇ dazol ⁇ non]
  • Betahistin [2- ⁇ 2-Methylam ⁇ noethyl ⁇ py ⁇ din]
  • Metoclopramide [4- Am ⁇ no-5-chloro-N- (2-d ⁇ ethylam ⁇ noethyl) -2-methoxy-benzamide] antihypertensive agents
  • Taxol (Paclitaxel)
  • the surfactants or surfactant mixtures to be used according to the invention can be anionic, cationic, amphoteric or non-ionic. They are preferably amphoteric or non-ionic and have an HLB ratio (i.e. a "hydrophilic-lipophilic balance") between 2 and 18; for mixtures it is preferably between 2 and 6 on the one hand and 10 and 15 on the other. HLB values provide information about the hydrophilic and lipophilic properties of an emulsifier. See “Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments" by Paul Becher in the Journal of Dispersion Science and Technology 5 (1), 81-96 (1984).
  • phosphoric ester surfactants such as: the practically water-free tristyrylphenol polyoxyethylene-18-phosphoric acid ester, TEA salt surfactant:
  • Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), or the identical Sermul® EA 188 (SERVO), a mixed emulsifier, each consisting of 50% of the two compounds with the formulas: O
  • Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), an alkylphenol polyglycol ether phosphate surfactant
  • Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), a hydroxybiphenyl-10-ethoxy phosphoric acid ester
  • Butyl mono-4-ethoxy phosphoric acid ester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), or
  • betaine compounds i.e. amphoteric, salt and water-free imidazole derivatives, such as:
  • Me [ + 1 for hydrogen, alkali and alkaline earth atoms and R x for or C 2 - 32 alkenyl groups are also used, such as, for example, Glucate® SS (methyl glucose sesquistearate, in the CTFA Classification) and Glucamate® SSE-20 (PEG-20 methyl glucose sesquistearate, in the CTFA Classification) AMERCHOL, Edison, NJ, US A.
  • Glucate® SS methyl glucose sesquistearate, in the CTFA Classification
  • Glucamate® SSE-20 PEG-20 methyl glucose sesquistearate, in the CTFA Classification
  • AMERCHOL Edison, NJ, US A.
  • good results can also be achieved by using nonionic compounds from the "TWEEN®” range (Atlas Chem. Ind., Inc .; or ICI Specialty Chemicals), So-called polyoxyethylene sorbitan esters or "polysorbates” 20 to 85 compounds in the CTFA classification [Fluka 93
  • compositions can be used as hydrotropes or as co-emulsifiers, e.g .:
  • an aliphatic carboxylic acid C10 22
  • Hydrocarbons with a straight carbon chain C 12 32 ) which is substituted by 6 to 16 methyl groups and can have 1 to 6 double bonds, of which terpenes such as polymethylbutanes and polymethylbutenes may serve as examples.
  • Mono esters of ethylene glycol or propylene glycol with an aliphatic carboxylic acid (C 6-22) such as propylene lengly kolmonolaurat glykolmonomy ⁇ stat and propylene.
  • Esters of an aliphatic alcohol with lactic acid such as My ⁇ styl- or, preferably, lauryl lactate (C 12. 22); Mono-, di- or T ⁇ ester of Gly ce ⁇ ns with an aliphatic carboxylic acid (C12. 22).
  • lactic acid such as My ⁇ styl- or, preferably, lauryl lactate (C 12. 22); Mono-, di- or T ⁇ ester of Gly ce ⁇ ns with an aliphatic carboxylic acid (C12. 22).
  • C G - 22 aliphatic carboxylic acid
  • Esters with at least one free hydroxyl group from poly (2-10) glycol with an aliphatic carboxylic acid (C 6 22 ).
  • Heterocychic compounds e.g. 1-methyl-2-pyrroleon.
  • Good buffer i.e. zwitterionic, N-substituted aminosulfonic acid compounds such as e.g. "HEPES” - 4- (2-hy-hydroxyethyl) -p ⁇ perazin-1-ethanesulfonic acid or "CHAPS", with the formula: 3 - [(3-Cholam ⁇ do- ⁇ ropyl) -d ⁇ methyl-ammon ⁇ o] -pro-pansulfonate.
  • Suitable additives in the spontaneously dispersible concentrates according to the invention are vitamins and provitamins (such as, for example, vitamin A acid, retinol, tocopherols), and also selected penetration enhancers ("flux enhancers”) and radical scavengers.
  • COMPOSITION EXAMPLES of spontaneously dispersible CONCENTRATES according to the invention which contain active compounds of the formulas (I) to (VI) and which, when diluted with water or 5% glucose solution or physiological saline solution (Ringer's solution) in a ratio of 1: 100 and higher, are thermodynamically stable ULTRAMICROEMULSIONS with a hydrodynamic radius of 2.2 to 3.0 nm result.
  • a phosphoric acid ester surfactant e.g. Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), tenside 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA-GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (RH ⁇ NE-POULENC), 5 to 903 weight % Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY), 0 to 10% by weight of a vitamin or provitamin.
  • a phosphoric acid ester surfactant e.g. Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), tenside 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA-GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (RH ⁇ NE-POULENC), 5 to 903 weight % Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY), 0 to 10% by weight of a vitamin or provitamin.
  • ⁇ ) wherein R 5 is a C2-31 alkyl and a C3_3i alkenyl or alkapolyen group and R 6 is citronellyl, farnesyl, geranyl, isophytyl or phytyl, 30 to 45% by weight Invadin® JFC 800%,
  • Soprophor® FL or Diphasol® 3873 30 to 45% by weight of Soprophor® FL or Diphasol® 3873.
  • TWEEN® 20 and / or TWEEN® 65 or TWEEN® 85 50 to 70% by weight of TWEEN® 20 and / or TWEEN® 65 or TWEEN® 85
  • Citronellyl-1 O-undecenoate (Cn i-Citronellylester), 34 to 40% by weight Invadin® JFC 800%, 34 to 40% by weight Soprophor® FL.
  • citronellyl laurate C 12 o -tronellylester
  • Invadin® JFC 800% 34 to 40% by weight Soprophor® FL.
  • INVADIN® JFC 800% (CIBA-GEIGY) is an anhydrous tert. Octyl phenyl polyoxyethylene ether surfactant with 9 to 10 oxyethylene groups. SOPROPHOR®-FL (RH ⁇ NE-POULENC) is a practically anhydrous tristyrylphenol polyoxyethylene-18-phosphoric acid ester TEA salt surfactant.
  • TWEEN® 20 is a polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate surfactant (CAS No. 9005-64-5, "Polysorbate 20" in the CTFA classification). TWEEN® 65 is the tristearate and TWEEN® 85 is the trioleate of this connection box.
  • Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g
  • MSR gastric juice resistance.
  • the pellets / granules according to a) can also be filled directly into capsules, which are made from AQOAT® (HPMC-AS-M or HPMC-AS-N), are sealed with acetone / ethanol 1 1 and thus the functions of the Control MSR and the delayed release (retard) appropriately
  • Tumor cells transformed with 10 ⁇ / ml Py6 virus are inactivated in culture medium RPMI 1640 with 10% fetal calf serum (GIBCO); they are sown so leaky that they can grow during the assay in so-called non-confluent monolayers.
  • the sample is added after 6 to 24 hours, with 100 ⁇ l per row, which is mixed with 100 ⁇ l medium in 1 hole. Half of it is removed and placed in the following hole, again mixed with 100 ⁇ l medium, etc.
  • a geometric thinning row n' ⁇ is created.
  • Immuno-Deficiency Syndrome AIDS ", or against pathologically effective
  • CCID50 cell c_ulture mfective dose 50%. Twice serial dilutions of each of the 6 virus suspensions were made, of which 200 ⁇ l each were incubated with MT4 cell pellets for 90 minutes, as indicated above (see 3.1). At the end of the incubation, the pellets are brought to the original cell concentration by adding the required amount of medium to each sample and then introducing them into 8 holes of a microtiter plate with 200 ⁇ l each. After 5 days of incubation, the vitality of the cells is measured using the MTT test, as shown above.
  • the HIV titer is given as the reciprocal of the dilution which infects 4 out of 8 samples in a row (50%). The content of a hole is considered infected if the reading of the O.D. at 550 nm is lower than the mean of the 8 control holes minus 2.8 times the standard deviation (lower 95% confidence limit).
  • Host cells embryonic cat cells
  • Virus non-human feline leukemia virus
  • Viabihty quantified using the MTT assay from Boehngner (MST-1) and succinate tetrazolium reductase (EC 1.3.99.1) Detection: Enzyme Immuno Assay (EIA) for the p27 virus protein
  • CMV Human cytomegalovirus
  • the test was carried out with human, embryonic lung fibroblasts as host cells, which were then infected with the CMV strain AD 169.
  • the strain "CVM umano AD169" was for 4 hours at + 4 ° C with different concentrations of the test substance C 16: 0- (1-sitosteryl ester, formulated as a 1% concentrate and then diluted to an aqueous microemulsion 10-3, 10- 4 and 10 " 5 , incubated and then inoculated as pretreated virus suspensions on cultures of human, embryonic lung fibroblasts. Approach as confluent culture with 120,000 cells per shell vial.
  • the infection was centrifuged for 45 minutes at 1500 rpm and at RT was completed, the suspension for injection was removed and 1 ml of MEM culture medium with 2% fetal calf serum (as in the cultivation) was added; the infected cells were then kept at 37 ° C. and under a 5% CO 2 atmosphere for 20 h.
  • the medium was removed, the cells were collected, fixed with 2% acetone-methanol (2: 1) and washed 3 times with PBS.
  • the quantification was carried out by means of immunofluorescence measurement.
  • the vials were filled with the monoctonal antibody "Anti-P-72 CMV" (an immediate precursor protein of the CMV that was already in the infected cells after 6 hours can be detected) and incubated for 30 minutes at 37 ° C in a humid atmosphere
  • controls were prepared with infected cells, which were prepared under the same conditions but without pretreatment with the test substance.
  • the nuclei positive for the CMV-specific antigen are paid for using a fluorescence microscope at 25x magnification in the aqueous phase.
  • a dose-dependent, direct virucidal effect can be clearly determined.
  • the virus is no longer virulent enough to infect the sensitive host cells
  • Herpes virus (herpes simplex, HSV)
  • the antiviral / virucidal effect of a watery microemulsion of suitable MARIGENOL® concentrates is determined using a confluent monolayer culture of VERO cells (ie "Af ⁇ can green monkey kidney cells”).
  • results show a clear direct effect on the VERO host cells infected with HS virus.
  • concentration of 10-4 ß-sitosteryl arachidate the number of PIaques appears to be reduced by 76% compared to the controls.
  • the HSV titer is significantly reduced.
  • HBV hepatitis B virus
  • the tests were carried out with immortalized hepatic hematoma cells which, after infection with the hepatitis B virus, the two antigens Hbs Ag (a "surface antigen” from the outer shell of the virus) and Hbe Ag (a "core antigen” from the core of the DNA) Virus) secrete.
  • Hbs Ag a "surface antigen” from the outer shell of the virus
  • Hbe Ag a "core antigen” from the core of the DNA) Virus
  • Orientative experiments in vitro were carried out with a 1% concentrate of the three test substances ß-sitosteryl palmitate, ß-sitosteryl arachidate and ergosteryl isovalerate from Prof. Dott. Antonio Ponzetto and by Dotta Rossana Cavallo, Universita di To ⁇ no.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • IC50 50% killing rate concentration
  • N.B. are the measured values of the concentrates on W.S. - In terms of content, they are 100 times smaller. To be considered when interpreting the MIC values.
  • the characteristic peak appears after about 5 minutes. 6.3 Detection of membrane penetration on the tumor cell or the infected host cell.
  • micellar capillary zone electrophoresis (Beckman Instruments, P / ACE System 2100 or the BioFocus integrator from Bio-Rad).
  • M monocytes (macrophages)
  • N neutrophil granulocytes
  • E eosinophthal granulocytes
  • Test 1 2% concentrate containing C 12: 0-cholesteryl ester
  • Test 2 2% concentrates containing C 16: 0 ergosteryl ester
  • Test 3 2% concentrates containing C 5: 0-cholecalciferyl ester

Abstract

Die Verwendung von ausgewählten Sterolestern und Estern mit Vitamin-D-Verbindungen zur Herstellung von Arzneimitteln mit antiviraler, viruzider und/oder antiparasitärer Wirksamkeit und zur verbesserten Aufnahme externer Aktivatoren, sowie deren pharmazeutische Aufarbeitung zu spontan dispergierbaren Konzentraten und ihre Überführung in therapeutische Systempräparate werden beschrieben.

Description

SPONTAN DISPERGIERBARE KONZENTRATE MIT ANTIVIRAL, VIRUZID UND/ODER ANTIPARASITISCH WIRKSAMEN ESTERN VON STEROLEN UND VITAMIN-D-DERIVATEN
EINLEITUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft spontan dispergierbare Konzentrate mit Estern von Sterolen und Vitamin-D Verbindungen und daraus aufbereitete Ultramikroemulsionen zur Herstellung von Arzneimitteln mit antiviraler, viru- zider und/oder antiparasitischer Wirksamkeit
In den U.S Patentschriften No 5,270,041 (erteilt am 14 Dezember 1993), No. 5,496,813 (erteilt am 1. Mai 1995), Senat No. 08/312,980 (erteilt am 16. September 1995) und Seπal No 08/179,729, sowie den Europaischen Patentschriften No. 0436682 (erteilt am 19 Januar 1994), No. 0548261 (erteilt am 10. Mai 1995) und No. 0550704 (erteilt am 21. Juni 1995) werden spontan dispergierbare Konzentrate, welche Sterolester und/oder Ester von Vitamin-D- Verbindungen enthalten und welche antitumorale Wirksamkeit besitzen, beschrieben
Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass einer ausgewählten Zahl solcher Esterverbindungen auch eine ausgezeichnete antivirale oder unmittelbar viruzide und eine antiparasitische Wirksamkeit, insbesondere gegen Trypanosomen, mnewohnt. Die therapeutischen Eigenschaften dieser ausgewählten Ester treten dann verstärkt auf, wenn sie optimal solubi siert, d.h. in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet und darauf mit destilliertem Wasser oder 5%-Glucoselosung oder physiologischer Kochsalzlosung (Ringerlosung) verdünnt worden sind, wobei sich thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen mit Mizellen ergeben, welche einen sehr kleinen hydrodynamischen Radius von nur 2.2 bis 3.0 nm aufweisen
Beschreibung der Erfindung
Die ausgewählten Sterolester und Ester von Vitamin-D-Verbindungen zur
Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler und/oder viruzider, bzw. mit antiparasitischer Wirksamkeit entsprechen den allgemeinen Formeln (I) bis
(VII)
(I)
Figure imgf000004_0001
(II)
Figure imgf000004_0002
(III)
Figure imgf000004_0003
(IV)
Figure imgf000005_0001
(VI) (VII) wobei in den Formeln (I) bis (VII) R1 eine C2-3i-Alkyl-, eine C3.31-Alkenyl-, eine Cs.ai-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe ist.
Bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bis (V), in denen R1 für eine C2. 21-Alkyl-, eine C3-2i-Alkenyl-, eine C3.2ι-Alkapolyengruppe oder eine Gruppe der Formel (VIII) •
Figure imgf000005_0002
(VIII) steht.
Eine herausragende antivirale/viruzide, bzw. antiparasitische Wirkung haben Verbindungen der Formeln (I), (II), (III) oder (IV), worin R eine C10-2ι-Alkyl- gruppe, eine C10.i7-Alkenyl-, eine C10-17-Alkapolyengruppe oder eine Retinoylgruppe ist. Beispiele für Verbindungen laut den Formeln (I) bis (VII) sind u.a.: trans-2-Butensäure-3|i-hydroxy-5(x-cholestanyl-Ester (Cholestanyl-Crotonat) lsovaleriansäure-3[ι-hydroxy-5 -cholestanyi-Ester (Cholestanyl-iso-Valerat)
10-Undecensäure-3ß-hydroxy-5u-cholestanyl-Ester (Cholestanyl-1 O-Undecenoat) Laurylsäure-3ß-hydroxy-5α-cholestanyl-Ester (Cholestanyl-Laurat)
Palmitinsäure-3(i-hydroxy-5α-cholestanyl-Ester (Cholestanyl-Palmitat)
3ß-Stigmast-5-en-3-laurat (ß-Sitosteryl-laurat) 3 ß -Stigmast -5 -en-3-palmitat (|i-Sitosteryl-pa Imitat) 3ß-Stigmast-5-en-3-stearat ([?-S hoste ryl-stea rat) 3|5-Stigmast-5-en-3-arachidat (ß-Sitosteryl-arachidat) 3|5-Stigmast-5-en-3-behenat (ß-Sitosteryl-behenat) 3ß-Stigmast-5-en-3-10-undecenoat ((i-Sitosteryl-10-undecenoat) 3|S-Stigmast-5-en-3-oleat (fi-Sitosteryl-oleat)
3p-Stigmast-5-en-3-all trans-retinat (ß-Sitosteryl-all-trans-retinat). (3|), 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-10-undecenoat [Ergosteryl-10-undecenoat, Provitamin D2-undecenoat] (3|5, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-laurat [Ergosteryl-Iaurat, Provitamin D2-Iaurat] (3|i, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-all-trans-retinat [Ergosteryl-retinat, Provitamin D2-retinat)
9,10-Secoergosta-5,7,10(19),22-tetra-en-3-ol-laurat
(Vitamin D2-Iaurat, Ergocalciferyl-Iaurat, Ercalciol-Iaurat]
9,10-Secoergosta-5,7,10(19),22-tetra-en-3-ol-palmitat
[Vitamin D2-palmitat, Ergocalciferyl-palmitat, Ercaiciol-palmitat]
9,10-Secoergosta-5,7,10(19),22-tetra-en-3-ol-all trans-retinat
[Vitamin D2-retinat, Ergocalciferyl-retinat, Ercalciol-retinat]
9,10-Secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol-laurat
[Vitamin Dß-Iaurat, Cholecalciferyl-Iaurat, Calciol-Iaurat]
9, 10-Secocholesta-5, 7, 10(19) -trien-3-ol-pa Imitat
[Vitamin Dß-palmitat, Cholecalciferyl-palmitat, Calciol-palmitat] 9,10-Secocholesta-5,7,10(19)-trιen-3-ol-all trans-retιnat [Vitamin Dß-all trans-retinat, Cholecalciferyl-all trans-retinat, Calciol-all trans-retinat]
Die ausgewählten Sterolester und Ester von Vitamin-D Verbindungen der Formeln (I) bis (VII) sind nahezu wasserunlösliche und hoch agglomerierte Verbindungen. Damit sie durch die Membranbarriere der Wirtzellen und durch die Proteinhulle der Viren oder die aussere Membran der Trypanosomen diffundieren und im Zellplasma, bzw. im Virus- oder Parasiteninnenkorper wirksam werden können, müssen sie vorerst in geeigneter Weise im wasserigen Medium solubilisiert werden
Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen Oel-in-Wasser Ultrami- kroemulstonen mithilfe von besonders ausgewählten Cotensiden oder Losungsvermittlern einerseits und geeigneten Tensiden anderseits gelingt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der bezeichneten Ester zu erzielen. Alle experimentellen Beobachtungen an dergestalt ausgebildeten Ultramikroemulsionen lassen sich einheitlich durch die Annahme deuten, dass die ausgewählten Tenside und Cotenside, als ausgewogenes System genommen, in der wasserigen Phase organisierte Aggregate, sog. Mizellen bilden. Diese besitzen mehr oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm. Vgl. "Mode-selective dynamic light scattering; theory versus expeπmental rea zation", Thomas Gisler, et al., Applied Optics/Vol.34, No.18/ 20 June 1995, pp.3546-3553.
Die Tenside und Hydrotrope (Cotenside) lassen zwischen der ausseren, wasserigen Phase und der inneren, öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die Ester der Formeln (I) bis (VII), gelost im biotensiden Losungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung dieser beiden Phasen unterbleibt. In der öligen, inneren Phase liegen die Moleküle der ausgewählten Ester in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor Die Mizellen der Sterol-, bzw. Vitamin D-Ester-haltigen inneren Phase der erfindungsgemassen Ultramikroemulsionen sind demnach an ihrer Oberflache, d.h an ihrer Grenzschicht mit einem Tensidmantel geschützt, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran ins Innere der Virus- oder Parasiten-infizierten und somit "defekten" oder "abnormen" Zellen zu diffundieren. Die Diffusion durch die Plasmamembran von infizierten Zellen erfolgt ausschhesslich aufgrund thermischer Molekularbewegungen Die Richtung, die ein konkreter Diffusionsvorgang einschlagt, wird vom Kon- zentrationsunterschied bestimmt, welcher an der fraktalen Plasmamembran zwischen ausserhalb und innerhalb der Wirtzelle besteht. Die Diffusion verlauft solange entlang dem Konzentrationsgefalle, bis es abgebaut ist. Zwischen der extrazellularen Zone und dem Inneren der einzelnen Wirtzelle, des Virus oder des Parasiten wird die Konzentration an Wirksubstanz, bzw. des Wirkstoffsystems ("multiple drug System") ausgeglichen, wobei auch verzögerte Abgabeeffekte ("slow release effects") auftreten können Derartige Diffusionsvorgange verlaufen unabhängig von jeglicher Energiezufuhr. Sie haben keinen Bezug auf die zellulare Stoffwechselenergie. Die Geschwindigkeit des Diffusionsvorganges, bzw die Starke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Wirtzelle bestimmt wird
1 vom Konzentrationsunterschied Λc in den beiden Kompartimenten
2 vom Teilchenradius des diffundierenden Wirkstoffmolekuls oder
Wirkstoffsystems
3. von der Viskosität der diffundierenden, wasserigen Losung
(Emulsion)
4. von der Temperatur.
Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, hat e e globulare "Mizelle" mit einem hydrodynamischen Radius von einem Centimeter ein Vo-
I u Limmeenn vvoonn 44,,118899 ccmm3-» uunndα eeiinnee P phnaasseennooboeerrftliaacchnee vvoonn 1122,,556644 c cmm'2
D leemgegenuber weisen 10^8 Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von n ur 10-6 cm (10 nm), welche zusammen das gleiche Volumen von 4,189 cm3 a usmachen, schon eine Gesamt-Phasenoberflache von 1'256,4 m2 auf
MIZELLEN: VERHÄLTNIS VOLUMEN ZU GESAMTOBE'RFLÄCHE
Figure imgf000009_0001
Kugelvolumen = — π r«1 3
Kugeloberfläche = 4 π f2
Fazit: Durch die grosse Phasenoberfläche, welche die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm in erfindungsgemässen Ultramikroemulsionen ausbilden, wird zusätzlich zu deren gesteigertem Diffusionsvermögen die rheologische Verteilung (Spreitung oder "spreading") und somit die Bioverfügbarkeit und Bioaktivität der Wirkstoffe, welche in der inneren Phase der Mizellen (dem Mizellkern) in monomer oder oligomer agglomerierter Form vorliegen, ebenfalls stark verbessert. Das kann eine beträchtliche Ermässigung der kritischen Dosierung erlauben und damit unerwünschte, störende Nebenwirkungen vermeiden oder wenigstens verringern helfen.
Die "Packungsdichte" eines spontan dispergierbaren, stabilen MARIGENOL®- Konzentrates nimmt in exponentieller Funktion mit der kleiner werdenden Teilchengrosse der Mizellen zu. Entscheidend sind die richtige Ausbildung der inneren Phase, ihr ausgewogenes Verhältnis zum Gesamtkonzentrat und die Auswahl der je dazu passenden Tenside. Die erfindungsgemass spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten: 0,5 bis 10 Gewιchts-% einzelner Ester der Formeln (I) bis (VII), bzw Kombinationen solcher Ester, sowie
0 bis 10 Gewιchts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe wie nachstehend umschrieben,
0 bis 40 Gewιchts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmavertraglichen Losungsmittels oder Losungsmittelgemisches, 5 bis 90 Gewιchts-% eines pharmavertraglichen Tensides oder Tensidgemi- sches,
0 bis 10 Gewιchts-% eines Vitamins oder Provitamins,
0 bis 10 Gewιchts-% eines Stabilisators, bzw Radtkalfangers oder eines Pe- netrationsverbesserers und Tragerstoffe und/oder Verdünnungsmittel
Unter pharmazeutischen Wirkstoffen sind im vorliegenden Falle alle üblicherweise in der Humanmedizin verwendbaren Wirkstoffe zu verstehen. Hiezu zahlen z.B - Beta-Blocker
Pindolol [1-(4-lndolyloxy)-3-ιsopropylamιno-2-propanol] Propanolol [1-lsopropylamιno-3-(1-naphthyloxy)-2-propanol] Oxprenolol [1-(o-Allyloxyphenoxy)-3-ιsopropylamιπo-2-propanol] Metoprolol [Dι-{( + -)-1-(ιsopropylamιno)-3-[p-{2-methoxyethyl)- phenoxy-2-propanol]-L ( + ) tartrat}]
Labeta lol [5-[1-Hydroxy-2{(1-methyl-3-phenylpropyl-amιnoethyl} sa cylamid] Diuretica
Acetazolamid [5-Acetamιdo-1 ,3,4-thιadιazol-2-sulfonamιd]
Hydrochlorothιazιd [6-Chlor-3,4-dιhydro-2H-1,2,4-benzothιadιazιn-7- sulfonamιd-1,1-dιoxιd]
Chlort alidon [1-Oxo-3-(3-sulfamyl-4-chlorρhenyl)-3-hydroxy- isoindolin] Metolazon [7-Chlor-1,2,3,4-tetrahydro-2-methyl-4-oxo-3-o-tolyl-6- chinazolinsulfonamid] Schwache Beruhigungsmittel
Dιazepam [7-Chlor-1,3-dιhydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4- benzodιazepιn-2-on] Medazepan [7-Chlor-2,3-dιhydro-1-methyl-5-phenyl-2H-1,4-benzo- dιazepιn-2-on] Starke Beruhigungsmittel
Suipirid [N-(1-Ethyl-2-pyrrolidinyl-methyl)-2-methoxy-5-sulfamoyl- benzamid] Muskelentspannende Mittel
Baclofen [ß-(Aminoaethyl)-p-chlorhydrozimtsäure] Antibiotica
Sulfamethoxazol [5-Methyl-3-sulfanilamido-isoxazol]
Trimethoprim [2,4-Diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl)-pyrimidin]
Chloramphenicol [D (-)-threo-2-dichlor-acetamido-1-(4-nitrophenyl)-
1,3-propandiol]
Cefaclor [3-Chloro -7 -D(2-phenyl-glycinamido)-cephalosρo ransäure - monohydrat]
Cefradin [7-{D-2-Amino-2-(1,4-cyclohexadien-1-yl)-acetamido}-3-me- thyl-cephalospo ransäure]
Bacampicillin [1-Ethoxycarbonyloxy-ethyl-6-(D-α-aminophenyl- acetat-amido)-penicillinat]
Minocyclin [7-Diethylamino-6-desoxy-6-desmethyltetracyclin]
Sulfadoxin [N'-(5,6-Dimethoxy-4-pyrimidinyl)-sulfanilamid]
Sulfamethoxazol [3-Methyl-3-sulfanil-amido-isoxazol]
Sulfisoxazol [3,4-Dimethyl-5-sulfanil-amido-isoxazol]
Sulfadimethoxin [2,4-Dimethoxy-6-sulfanilamido-1,3,diazin] Dermatologica
Chlorquinaldol [5,7-Dichlor-8-hydroxy-chinaldin]
Crotamiton [N-Crotonyl-N-ethyl-o-toluidin]
Diamthazol [6(-)2-Dimethylamino-ethoxy-(ß-diethylamino-)-benzo- thiazol-dihydrochlorid]
Flumethason-pivalat [6α,9-Difluor-11 [5,17,21 -trihydroxy-16α-methy I- pregna-1,4-dien-3,20,dion-21-ρivalat]
Tretinoin [Vitamin-A-Säure] Corticosteroide
Cortison [17α-21,Dihydroxy-pregn-4-en-3,11 ,20-trien-21 -acetat]
Prednison [11 [i-17,21-Trihydroxy-pregna-1 ,4-dien-3,20-dion]
Dexamethason [9-Fluor-11fi,17,21-dihydroxy-16α-methyl-pregna-1 ,4- dien-3,20-dion]
Desoxycorton-acetat [21-Hydroxy-pregn-4-en-3,20-dion -acetat] Endokrine Regulation
Melatonin [N-{2-(5- ethoxy-1H-indol-3yl)ethyl}acetamid]; N-acetyl-5- methoxytryptamin Coronarmittel
Pentaerythrityltetramtrat (PETN)
Nιtroglycerιn (Glyceryltrιnιtrat)
Pindolol [1-(4-lndolyloxy-3-ιsopropylamιno-2-propanol] Cytostatica
Melphalan [p-Dι-(2-chlorethyl)-amιno-L-phenylalanιn]
Procarbazin [p-(N'-Methyl-hydrazιnomethyl)-N-ιsopropyl-benzamιd]
Dactinomycin [Actinomycin D]
Polyostradiolphosphat
Cyclophosphamid [N, -bιs-( -Chlore thyl)-amιno-1 -oxa-3-aza-2- phosphocyclohexan-2-oxιd] Entzündungshemmende Mittel
Mefenaminsaure [3-Xylyl-2-amιnobenzoesaure]
Dexamethason [9-Fluor-11|i,17,21-trιhydroxy-16α-methyl-pregna- 1,4-dιen-3,20-dιon]
Hydrocortison [17 -Hydroycortιcosteron] Coronardilatoren
Nifedipin [1 ,4-Dιhydro-2,6-dιmethyl-4-(o-nιtrophenyl)-pyrιdιn-3,5- dicarbonsaure-dimethylester]
Isosorbid-dinitrat [1 ,4,3,6-Dιanhydrosorbιt-2,5-dιnιtrat]
Nιtroglycerιn (Glyceryl-trιnιtrat)
Dipyramidol [2,6-Bιs-(dιethanolamιno)-4,8-dιpιperιdιno (5,4- dipyπmidin)] Periphere Vasodilatoren
Cinepazid [4-(-3,4,5-Trιmethoxy-cιnnamoyl)-1-pιperazιn-essιgsaure- pyrro did]
Cyclandelat [3,3,5-Trιmethyl-cyclohexylmandelat]
Cinnazaπn [1-trans-Cιnnamyl-4-dιphenylmethyl-pιperazιn]
Pentoxyfyl n [3,7-Dιmethyl-1 -(5-oxo-hexyl)-xanthιn] Antirythmica
Procainamid [4-Amιnobenzoesaure-ß-dιethylamιnoäthylamιd]
Disopyramid [4-Dιιsoρropylamιno-2-phenyl-2-(2-pyrιdyl)-butyramιd] Antigichtmittel
Allopurιnol [1H-Pyrazolo-(3,4-d)-pyrιmιdιn-4-ol] Antiepileptica
Phenytoιn {Dtphenylhydantoιn}, [5,5-Dιphenyl-2,4-ιmιdazolιdιn-dιon]
Carbamazepin [5-Carbamoyl-5H-dιbenz(b,f)azepιn] Antihistammica
Chlorphenamιn[{3-(p-Chlorphenyl)-3-(2-pyrιdyl)-ρropyldιmethyl-
Clemastin {Hydrogenfumarat}; [1-Methyl-2-{2-(α-methyl-p-chlor-dι- phenylmethoxy) ethyl}pyrrolιdιn]
Mequitazin [10-(3-Chιnuclιdιnylmethyl) phenothiazin]
Alιmemazιn [10-(3-Dιmethylamιno-2-methyl-propyl)-phenothiazin] Mittel gegen Übelkeit und Schwindel
Domperidon [5-Chlor-1 -{1-(3-[2-oxo-1-benzιmιdazolιnyl]-propyl)-4- pιperιdyl}2-benzιmιdazolιnon]
Betahistin [2-{2-Methylamιnoethyl} pyπdin]
Metoclopramid [4- Amιno-5-chlor-N-(2-dιethylamιnoethyl)-2-me- thoxy-benzamid] Blutdrucksenkende Mittel
Reserpin [3,4,5-Trιmethoxybenzoyl-methylreserpat]
Rescinnamin [3,4,5-Trιmethoxy-methylreserpat]
Methyldopa {L-u-Methyldopa}; [L-3-(3,4-Dιhydroxyphenyl)-2-methyl- alanin]
Clomidinhydrochlorid [2,6-Dιchlor-N-2-ιmιdazoιdιnylιden-benzamιn hydrochloπd] Sympathomimetica
Isoproterenol [N -Isopro pyl-nor-adrenahn]
Etilefπn [DL-1-{α-Ethylamιnomethyl}-m-hydroxy-benzylalkohol] Expectorantien
Carbocystein [(S-Carboxymethyl) cystein]
Bromhexιn[N-Cyclohexyl-N-methyl-(2-amιno-3,5-dιbrom-benzyl)
Figure imgf000013_0001
L-Ethylcystein
L-Methylcystein Orale Antidiabetica
Glibenclamid [N-4-2-(5-Chlor-2-methoxy-benzamιdo)-ethyl-phenyl- sulfonyl-N'-cyclohexyl-harnstoff]
Tolbutamid [N-(4-Tolylsulfonyl)-N'-n-butyl-harn Stoff] Cardiovasculare Mittel
Ubidecarenon
Aden os in [6-Amιno-9-ß-D-πbo-furanosyl-9H-purιn] Immunsuppressivum
Cyclosporin A Antitumormittel
Taxol (Paclitaxel)
Baccatin-Ill und seine Ester
10-Deacetylbaccatin-lll und seine Ester
14-OH-10-Deacetylbaccatin-lll und seine Ester
Cyclosporin D-oxyd Antivirale Mittel (AIDS)
4-lsoleucin -Cyclosporin
Cyclosporin G
Die erfindungsgemass einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhaltnis (d.h. eine "hydro- philic-lipophihc balance") zwischen 2 und 18; für Gemische liegt es vorzugsweise zwischen 2 und 6 einerseits und 10 und 15 anderseits. HLB-Werte geben Auskunft über die hydrophilen und lipophilen Eigenschaften eines Emul- gators. Vgl. dazu "Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments" von Paul Becher im Journal of Dispersion Science and Technology 5 (1), 81-96 (1984).
In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfindungsgemassen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsäureestertenside, wie z.B.: das praktisch wasserfreie Tristyrylphenolpolyoxyethylen-18-phosphor- saureester, TEA-Salz Tensid:
0
II
Figure imgf000014_0001
(Soprophor® FL, RHÖNE-POULENC);
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50% der beiden Verbindungen mit den Formeln: O
C9H1! OCH3
Figure imgf000015_0001
C9H1 (— CH2-CH2-Oτr5-P OCHj
Figure imgf000015_0002
OCH,
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), ein Alkylphenol Polyglycolether- Phosphat-Tensid
Tensid 508 (CIBA-GEIGY)
Figure imgf000015_0003
(Tensid 508, CIBA-GEIGY);
Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Ethoxy-Phosphorsäu- reester
Butyl-mono-4-Ethoxy-Phosphorsaureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw.
O
CH3-( CH2 )j— CH-CH2-0 (-CH2--CH2-0 )5~ IPI— -OCH,
C2 HH5.
OCH,
(Zerostat ® AN , CIBA-GEIGY) und anderseits Betainverbindungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B.:
Figure imgf000015_0004
worin Me[+1 für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und Rx für
Figure imgf000015_0005
oder C2-32-Alkenylgruppen stehen. Verwendung finden auch sog "multif unctional glucose derivatives", wie z.B. Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesquistearat, in der CTFA Classification) und Glucamate® SSE-20 (PEG-20 Methyl-Glucose-Sesquistearat, in der CTFA Classification) von AMERCHOL, Edison, N.J., U.S A. Gute Ergebnisse sind fallweise auch zu erzielen unter Mitverwendung von nicht-ionogenen Verbindungen aus der "TWEEN®"-Reιhe (Atlas Chem. Ind., Inc.; bzw. ICI Spe- cialty Chemicals), sog. Polyoxyethylen-Sorbitan-Estern oder "Polysorbate" 20 bis 85-Verbιndungen in der CTFA Classification [Fluka 93*773 bis 93'783]
Als Hydrotrop, bzw. als Co-Emulgator dienende, pharmavertragliche Losungsmittel lassen sich einsetzen, z.B.:
Ester eines aliphatischen Alkohols (C3.ι8) mit einer aliphatischen Carbonsaure (C1022). wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Iso- propylmyπstat, Isopropylpalmitat und Laurylmyπstat; Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C12 32), welche mit 6 bis 16 Methyl-gruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen. Mono-Ester aus Ethylenglykol oder Propylenglykol mit einer aliphatischen Carbonsaure (C6-22), wie etwa Propy lengly kolmonolaurat und Propylen- glykolmonomyπstat.
Ester aus einem aliphatischen Alkohol (C12.22) mit Milchsaure, wie z.B. Myπstyl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Tπester des Gly- ceπns mit einer aliphatischen Carbonsaure (C12.22). wie z.B. Glyceryl- Caprylat, oder Miglyol® 812 Neutralol (Oleum neutrale).
Ester aus einem Poly(2-7)ethylenglykolglyzerιnether mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsaure (CG-22), wie z.B. aliphatische Alkohole (C12.22), somit u.a. Dodecanol, Tetradecanol, Oleyl- alkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol.
Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer aliphatischen Carbonsaure (C6 22). Monoether aus einem Poly- ethylenglykol mit einem aliphatischen Alkohol (C12 iβ). wie z.B. Polyoxy- ethylen (C1 o)-octylether
Heterocychsche Verbindungen, wie z.B. 1-Methyl-2-Pyrrolιdon.
Good-Puffer, d.h. zwitterionische, N-substituierte Aminosulfonsaure-Verbin- dungen wie z.B. "HEPES"- 4-(2-Hy-droxyethyl)-pιperazin-1 -ethansulfonsaure oder "CHAPS", mit Formel: 3-[(3-Cholamιdo-ρropyl)-dιmethyl-ammonιo]-pro- pansulfonat.
Biotenside Ester der allgemeinen Formel (IX) : 5 6
R COO — R ()X) worin R5 eine C2-3-ι-Alkyl- und eine C3_3i-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe und R6 Citronellyl, Fart,-„yl, Geranyl, Isophytyl oder Phytyl bedeuten. Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dispergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Chromatographie über neutralem Aluminiumoxyd mit einem inerten Losungsmittel wie z.B. Tetrahydro- furan, Ethylalkohol oder Dichlormethan gereinigt.
Als Zusätze in die erfindungsgemassen spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitamin A-Saure, Retinol, Tocopherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Flux en- hancers") und Radikalfanger.
ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemassen, spontan dispergierbaren KONZENTRATEN, welche Wirkstoffe der Formeln (I) bis (VI) enthalten und welche, wenn sie mit Wasser oder 5%-Glucoselosung oder physiologischer Kochsalzlosung (Ringerlosung) im Verhältnis 1:100 und hoher verdünnt werden, thermodynamisch stabile ULTRAMIKROEMULSIONEN mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm ergeben.
a) 0,1 bis 10 Gewichts-% einer oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (VII),
0 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe,
1 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, HEPES, CHAPS, Neutralol, wie z.B. Miglyol® 812 (Dynamit Nobel oder Hüls), oder TWEEN® 20 bis TWEEN® 85 (ICI) und/oder Glucamate® SSE-20 (AMERCHOL),
0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsaureester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-GEIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA- GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), Soprophor® FL (RHÖNE-POULENC), 5 bis 903ewichts-% Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY), 0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins.
b) 0,5 bis 2 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (VII),
0 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe, 0 bis 10 Gewichts-% CHAPS, und/oder TWEEN® 20
5 bis 30 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (IX)
R COO R (|χ) worin R5 eine C2-31 -Alkyl- und eine C3_3i-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe und R6 Citronellyl, Farnesyl, Geranyl, Isophytyl oder Phytyl bedeuten, 30 bis 45 Gewιchts-% Invadin® JFC 800%,
30 bis 45 Gewichts-% Soprophor® FL oder Diphasol® 3873.
c) 1 bis 10 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis (VII),
0 bis 10 Gewιchts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe,
10 bis 20 Gewichts-% 2-Pentanol,
50 bis 70 Gewιchts-% TWEEN® 20 und/oder TWEEN® 65 oderTWEEN® 85,
0 bis 30 Gewιchts-% Invadin JFC 800%/Soprophor FL (1:1), bzw. Invadin JFC
800% allein.
d) 1 bis 4 Gewichts-% eines Wirkstoffes laut einer der Formeln (I) bis (VII), 3 bis 12 Gewichts-% Alkohol (C2H5OH) oder 2-Pentanol,
16 Gewichts-% Citronellyl-1 O-Undecenoat (Cn i-Citronellylester), 34 bis 40 Gewιchts-% Invadin® JFC 800%, 34 bis 40 Gewichts-% Soprophor® FL.
e) 1 bis 4 Gewιchts-% eines Wirkstoffes laut einer der Formeln (I) bis (VII), 3 bis 12 Gewichts-% Alkohol (C2H5OH) oder 2-Pentanol,
16 Gewichts-% Citronellyl-Laurat (C12 o-Cιtronellylester), 34 bis 40 Gewichts-% Invadin® JFC 800%, 34 bis 40 Gewιchts-% Soprophor® FL.
N.B.: INVADIN® JFC 800% (CIBA-GEIGY) ist ein wasserfreies tert. Octyl- phenylpolyoxyethylenether-Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen. SOPROPHOR®-FL (RHÖNE-POULENC) ist ein praktisch wasserfreies Tristy- rylphenolpolyoxyethylen-18-phosphorsaureester TEA-Salz-Tensid. TWEEN® 20 isi ein Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monolaurat-Tensιd (CAS-Nr. 9005-64-5, "Polysorbate 20" in der CTFA-Classification). TWEEN® 65 ist das Tristearat und TWEEN® 85 das Trioleat dieser Verbindungskiasse.
BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempraparates mit erfindungsgemassen Konzentraten in der Form von "multiple units". a) Granulierung
Metolose® 90 SH-4000 (Shin-Etsu Chemical) 90.0 g
Avicel® PH-101 80.3 g
Erfindungsgemasses MARIGENOL®-KONZENTRAT 139.4 g
Aerosil® 200 80.3 g
Σ 390.0 g
Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40°C.
b) MSR- und RETARD-Ausrustung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk
c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets Kernmateπal 44 Gewιchts-% Erfindungsgemasses KONZENTRAT 25 Gewιchts-% MSR-Beschichtung 31 Gewichts-%
I 100 Gewιchts-%
N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemass a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1 1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern
BIOLOGISCHE PRÜFUNGEN
Die antivirale Wirkung vo,ι spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wirkstoffen gemass den Aufarbeitungsbeispielen für ihre Bildung a) bis c) wird anhand folgender Prufungsergebnisse bestätigt:
1.0 In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Lmien
Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiter- platten und Verdunnungsreihen arbeitet Angesetzt werden je lO^/ml Py6- Virus transformierte Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, dass sie wahrend des Assays wachsen können, in sog. nichtkonfluenten Monolayers. Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden, mit 100 μl pro Reihe, die man im 1 Loch mit 100 μl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch eingebracht, wieder mit 100 μl Medium versetzt, usf Es entsteht eine geometrische Verdunnungsreihe n'Λ.
Die Proben werden im Plaque Assay wahrend 3 bis 5 Tagen bei 37°C mit 3%% CO2 inkubiert. Ansch essend färben/fixieren mit 0,1% Kristallviolett (Fluka,
Buchs) in einer Losung von 70% Methanol, 1% Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen, Vergrosserung 300-fach. Man bestimmt die grosste cytotoxische Verdünnung. Die quantitative Auswertung lasst sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessung am Spektrophoto- meter vornehmen.
2.0 Prüfung auf Zelltoxizitat
2.1 Zelltoxizitat der MARIGENOL®-KONZENTRATE geprüft an Py6-Zellen (Virus transformierten 3T3 Maus-Fibroblasten)
Figure imgf000021_0001
Verdünnungen: Erste Zeile auf Konzentrat-Verdünnung 1:100 = wässerige Mikroemulsion (M.E.) berechnet Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet
N.B.: Zu den eternalisierten Py6-Zellen vgl.: "Biochemistry", Coordinating Editor Geoffrey L. Zubay, Addison-Wesley Publishing Company, 1983. p.1079. 2.2 Zelltoxizitat: Vergleichsprufungen mit anderen, hochwirksamen Naturstoffen, bzw. deren Estern
(entsprechend aufgearbeitet zu MARIGENOL®-KONZENTRATEN) geprüft an Py6-Zellen (Polyoma-Virus transformierten 3T3 Maus-Fibroblasten)
Figure imgf000022_0001
Verdünnungen: Erste Zeile auf Konzentrat-Verdünnung 1:100 = wasserige Mikroemulsion (M.E.) berechnet Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet
3.0 Prüfung auf Schutz- und antivirale Wirkung gegenüber sensitiven MT4- Zellen, infiziert mit dem AIDS-VIRUS HIV ("Human Immunodeficiency Virus") Tests wurden durchgeführt am Institut für Infektionskrankheiten der Universität Turin (Direktor: Prof. Dr. Paolo GIOANNINI), von Prof.Dott. Alberto BIGLI- NO, Leiter der Abteilung für Infektionskrankheiten am Ospedale di Asti, U.S.L. 19, unter Mitarbeit von Dotta. Brunella FORNO und Dotta. Annamaria POLLONO. Juni/Juli 1994 und Marz/Apπl 1995. 3.1 Schutzeffekt auf die Wirtzellen (MT4-Lymρhozyten)
MT4-Zellen (eine eterna sierte T-Zell-Lmie, welche sehr empfindlich ist gegen den HIV zytopathogenen Effekt "CPE", aus einer 24h-alten Kultur wurden bei einer Konzentration von 2x1θ5/ml suspendiert, in 1.2 ml aliquote Teile in Polypropylen Rohrchen aufgeteilt und mittels Zentnfugierung pelletiert Die Pellets wurden dann entweder infiziert mit 200 μl einer Stammlosung von HIV III B Zellen (Titer: 600 CCIDso/ml) oder scheininfiziert mit reinem Medium, für 90 Min bei 37°C inkubiert und anschliessend mit 1 ml reinem Medium versetzt, um die anfangliche Zeilkonzentration wieder einzustellen und die HIV- Konzentration auf 100 CCIDso/ml zu bringen. [CCIDso/ml = 50% c_ell ulture fective rJose]
100 μl-Volumina der im Test eingesetzten MARIGENOL®-Konzentrate, verdünnt zu wasserigen Ultramikroemulsionen 10-3 und dann zusätzlich verdünnt von 10-3 auf 10-5 m,t Medium RPMI 1640, wurden dreifach eingebracht in flachbodige Mikrotiterplatten mit 96 Lochern In jedes Loch wurden 100 μl der HlV-infizierten oder der scheininfizierten MT4-Kultur eingegeben, um so 4 Versuchsreihen aufzustellen-
- einfache Kultur (Kontrollen, Prüfung auf Lebensfähigkeit der MT4
Zellen: 1θ5 Zellen/ml oder 2x1θ4/Loch)
- Kultur + HIV (Virus CPE-Kontrolle; Konzentration 50 CCIDso/ml oder
10 CCIDso/Loch)
- Kultur + Wirksubstanz in Mikroemulsion
- Kultur + HIV + Wirksubstanz-Mikroemulsion in den
Verdünnungen 10-3 bis 10-5 ( = 1*000 ppm, 100 ppm und 10 ppm, bzw 10 ppm, 1 ppm und 0.1 ppm W.S. -Gehalt)
Inkubation der Kulturen bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 + 95% Luftfeuchte. 5 Tage nach der Infektion werden 100 μl der Uberstandes in jedem Loch entfernt und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines Methyltetrazolsalzes überprüft (MTT, Sigma, 25 μl/Loch in 5 mg/ml Losung), in einem 2-h Inkubationstest, dem sich eine Solubilisierung mit 100 μl DMSO/Loch und die photometrische Ablesung auf optische Dichte bei 550 nm anschliesst. Restwerte der Zell-Vitahtät (Uberlebenstest) werden ausgedruckt als %-Dιfferenz gegenüber den HIV CPE-Kontrollen, das Mittel als Null gesetzt. Der gemessene Titer ist Dosis-abhangig. Er sinkt vom Anfangswert von 300% CCID50 auf 120% CCID50 und bis auf 2% CCID50.
Die beste Schutzwirkung auf die Wirtzellen wurde bislang mit einem 1%- Konzentrat von (i-Sitosteryl-Palmitat bei einer Konzentration von 10-4 /= 100 ppm Konzentrat in wasseriger Ultramikroemulsion) erzielt; sehr beachtenswert sind auch die Ergebnisse mit 1%-Konzentraten, enthaltend ß-Sitosteryl- Caproylat, ß-Sitosteryl-Laurat, |i-Sitosteryl-Arachidat oder ß-Sitosteryl-Behe- nat.
3.2 Wirkung auf die HlV-Infizierbarkeit. (Virulenz, direkte antivirale, bzw. viruzide Wirkung gegen die erworbene Immunschwache, das humane "Aquired
Immuno-Deficiency Syndrome: AIDS", bzw. gegen pathologisch wirksame
Virionen).
Aliquote Mengen von 2 klinisch aufbereiteten Präparaten von Aids-Patienten
("Isolates" mit den Stammen 21/4 und 4/5) wurden in vollständigem RPMI
Medium bei einem Titer von 300 CCIDso/ml resuspendiert und wahrend 3 h bei
+4°C mit einem MARIGENOL®-Konzentrat inkubiert, als Mikroemulsionen in komplettem Medium auf die Konzentratioen 10-2 bis 10-5 verdünnt, und sodann gleichzeitig mit einem "leeren" Tragerkonzentrat und mit reinem Medium allein auf ihre Wirkung geprüft.
Nach der Vorinkubation wurde der HIV Titer mittels der CCIDso-Methode er- fasst (CCID50 = cell c_ulture mfective dose 50 %). Von jeder der 6 Virus-Suspensionen wurden kurz zweifache Reihenverdunnungen angefertigt, wovon je 200 μl wahrend 90 Min. mit MT4-Zellen Pellets inkubiert wurden, wie oben angegeben (Siehe 3.1). Am Schluss der Inkubierung werden die Pellets auf die ursprungliche Zellkonzentration gebracht, indem man jeder Probe die nötige Menge Medium zufugt und sie anschliessend mit je 200 μl in 8 Löcher einer Mikrotiterplatte einbringt. Nach der Inkubation wahrend 5 Tagen wird die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen, wie oben dargestellt. Der HIV Titer wird als reziproker Wert jener Verdünnung angegeben, welche 4 von 8 Proben einer Reihe (50%) infiziert. Der Inhalt eines Lochs gilt als in-fiziert, wenn die Ablesung der O.D. bei 550 nm tiefer ausfällt als das Mittel der 8 Kontoll-Locher minus 2.8 Mal die Standard-Abweichung (untere 95% Vertrauensgrenze).
Mit den Wirksubstanzen Ergosteryl-10-Undecenoat und -Sitosteryl-Palmitat. lasst sich in-vitro als Folge der Vorbehandlung der Stämme eine sehr deutliche Replikationshemmung und eine eigentliche Elimination feststellen. Ihre Abwehrwirkung gegen eine Infektion ist Dosis-abhangig. Gar keine Hemmung trat nach der Behandlung mit reinem Carrier-Konzentrat allein ein. Auswertung der Prufergebnisse:
Figure imgf000025_0001
Restwerte des HIV-1 Titers nach Vorinkubation wahrend 3 h bei + 4°C Für die angewandte Prufmethodik vgl. u.a.: Rudi Pauwels, Erik De Clercq et al.. "Sensitive and rapid assay on MT-4 cells for detection of antiv ' com- pounds against the AIDS virus". Rega Institute for Medical Research, Katho- eke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934/87/503.50). J.Virol.Methods 1987. 16: 171-85
A. Bergamini, C.F. Perna, et al.: A tretrazo um-based colorimetric assay for quantification of HlV-mduced cytopathogenirity in monocyte-macrophages exposed to macrophage colony-stimulating factor. J.Virol.Methods, 1992: 40(3): 275-86.
Jay A. Levy: "HIV research. a need to focus on the πght target", The Lancet, Vol. 345, June 24, 1995, pp.1619-21.
Molecular Cell Biology, second Edition, by J. Darneil, H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5- Viruses, Structure and Func- tions, pp 177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co )
Vgl. auch die technische Beilage 1/1: Prüfung an humanen MT-4 Lympho- zyten.
3.3 Prüfung gegen Katzen-AIDS
Angewandt wurde das von Prof. Dr. med.vet. Hans Lutz (Universität Zürich) entwickelte FEA-Fel.V-System. Durchfuhrung der Testreihen Dr. Peter Joller,
ANAWA, Wangen, Juni-Juli 1996
Wirtzellen: embryonale Katzenzellen
Virus: nicht-menschenpathogenes felines Leukamie-Virus
Viabihty: quantifiziert mittels MTT-Assay von Boehngner (MST-1) und Succinat-Tetrazolium Reduktase (EC 1.3.99.1) Nachweis: Enzyme Immuno Assay (EIA) für das p27 Virusprotein
Figure imgf000027_0001
Bei einer Konzentrat-Konzentration von 0,1 ppm, enthaltend 1,53 nM W.S., tritt eine deutliche Verminderung des Virustiters auf, gemessen an der OD für das Virusprotein p27. Sie ist etwas ausgeprägter für das ß-Sitosteryl- Arachidat als für das -Sitosteryl-Palmitat.
4.0 Andere Viren
4.1 Humaner Cytomegalie-Virus (CMV)
Die Prüfung wurde mit humanen, embryonalen Lungenfibroblasten als Wirtzellen vorgenommen, die dann mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert wurden. Der Stamm "CVM umano AD169" wurde wahrend 4h bei +4°C mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prufsubstanz C 16:0-(l-Sitosterylester, formuliert als 1%-ιges Konzentrat und dann verdünnt zu einer wasserigen Mikroemul- sion 10-3, 10-4 und 10"5, inkubiert und daraufhin als vorbehandelte Virus- Suspensionen auf Kulturen von menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten uberimpft. Ansatz als konfluente Kultur mit 120O00 Zellen pro shell-vial. Die Infektion wurde mittels Zentrifugation wahrend 45 Minuten bei 1500 rpm und bei RT vollzogen, worauf die Injektionssuspension entfernt und 1 ml Kulturmedium MEM mit 2% fötalem Kalbserum (wie bei der Anzucht) beige-geben wurde; die infizierten Zellen wurden sodann wahrend 20 h bei 37°C und unter 5%-Cθ2-Atmosphare gehalten.
Am Schluss der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen gesammelt, mit 2% Aceton-Methanol (2:1) fixiert und 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte mittels Immunofluoreszenz-Messung. Die Vials wurden mit dem monoktonalen Antikörper "Anti-P-72 CMV" (einem unmittelbaren Vorlauferprotein des CMV, das schon nach 6 h in den infizierten Zellen nachgewiesen werden kann) versetzt und wahrend 30 Minuten bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert
Es folgten 3 Waschungen in PBS, eine zweite Inkubation mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper IgG Ziege anti-IgG Maus. Es schliesst sich eine nochmalige Inkubation wahrend 30 Minuten bei 37°C, wie oben angegeben, an, gefolgt von einer 3-malιgen Waschung mit PBS. Die Proben werden dann mit 50% Glycerol in PBS auf Glastrager montiert.
Gleichzeitig wurden Kontrollen aufbereitet mit infizierten Zellen, die unter gleichen Bedingungen, aber ohne Vorbehandlung mit der Prufsubstanz aufbereitet worden sind.
Gezahlt werden die für das CMV-spezifische Antigen positiven Nuclei, mithtlfe eines Fluoreszenz-Mikroskopes bei 25-facher Vergrosserung in wasseriger Phase.
Es lasst sich ganz eindeutig eine Dosis-abhangige, direkt viruzide Wirkung feststellen Das Virus ist nicht mehr virulent genug, um die empfindlichen Wirtzellen zu infizieren
ERGEBNIS
VIRUZIDE WIRKUNG des fl-SITOSTERYL-PALMITATES
(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)
Figure imgf000028_0001
Anzahl der "Nuclei positivi per P-72" (der infizierten Fibroblasten)
Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universita di Toπno, Juli-November 1995
4.2 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)
Die antivirale/viruzide Wirkung einer wasserigen Mikroemulsion von geeigneten MARIGENOL®-Konzentraten wird mithilfe einer konfluenten Monolayer- Kultur von VERO-Zellen (d h "Afπcan green monkey kidney cells") festgestellt. Die Wirtzellen werden wahrend 3 h bei 4°C mit der Mikroemulsion oder mit dem Kulturmedium allein vorbehandelt und dann mit einer konstanten Dosis von 10* Herpes Simplex Viren, sog. "plaque forming units" = PFU in- fiziert. Dauer der Virus-Absorption 1 h. Dann Zugabe von 2% Methylcellulose zur Verhinderung dei Spreitung des Virus; es entsteht ein elastisches Vlies im Kulturmedium MEM + 2% Kalbserum. Anzuchtung wahrend 48 h, dann Fixieren und Farben der Monolayers mit 1% Kristallviolett in Methanol. Die antivirale Wirkung korreliert mit der Zahl von "pIaques" von lysierten Zellen, die sich im Kulturmedium MEM + 2% FCS noch bilden. Die Herabsetzung des viralen Titers wird im %-Verhaltnιs zu den Kontrollen (21 PIaques pro Zelle) angegeben.
Als Prufsubstanzen wurden folgende Konzentrate in wasseriger Verdünnung (ausgehend von einer Mikroemulsion 1:100) eingesetzt:
1 % C 20:0-SITOSTERYL-ESTER
1 % QUERCETIN-PENTA-10-UNDECENOAT
1 % C 16:0-SITOSTERYL-ESTER
1 % C 12:0-ERGOSTERYL-ESTER
Auswertung:
Figure imgf000029_0001
Die Ergebnisse zeigen eine deutliche direkte Wirkung auf die HS-Virus- infizierten VERO-Wirtzellen. Bei einer Konzentration von 10-4 ß-Sitosterylara- chidat erscheint die Zahl der PIaques, im Vergleich mit den Kontrollen, um 76% herabgesetzt. Der HSV-Titer ist deutlich vermindert.
Bei dieser Konzentration der geprüften Substanzen findet auch keine Lysierung von eterna sierten Lymphozyten vom Typus MT-4, noch der VERO- Zellen selber statt. (Siehe oben unter 3.0)
Prüfungen durchgeführt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä di Torino, Juli 1995. 4.3 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)
Wiederholung der Prüfung mit Fluoreszenz-Markierung wie beim CMV-
Versuch. Vgl. oben 4.1
VIRUZIDE WIRKUNG des μ-SITOSTERYL-ARACHIDATES
(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)
Figure imgf000030_0001
Prüfungen durchgeführt von Dotta Rossana CAVALLO, Istituto di Microbiolo- gia, Universita di Toπno, November-Dezember 1995.
44 Hepatitis B Virus (HBV)
Die Tests wurden mit immortalisierten Leberhamatom-Zellen vorgenommen, die nach Infektion mit dem Hepatitis B Virus die beiden Antigene Hbs Ag (ein "surface antigen" aus der ausseren Hülle des Virus) und Hbe Ag (ein "core antigen" aus dem Kern des DNA Virus) sezernieren. Orientierende Versuche in-vitro wurden mit je einem 1%-ιgen Konzentrat der drei Prufsubstanzen ß- Sitosteryl-Palmitat, ß-Sitosteryl-Arachidat und Ergosteryl-Isovalerat von Prof. Dott. Antonio Ponzetto und von Dotta Rossana Cavallo, Universita di Toπno, durchgeführt .
Bei einer Verdünnung von 10-5 und Inkubation über 72h zeigte bislang das ß- Sitosteryl-Palmitat Konzentrat die stärkste Wirksamkeit. Die Ergebnisse sind deutlich Dosis-abhangig und variieren auch mit der Inkubationszeit. Besonders ausgeprägt tritt die Wirkung beim Oberflachen-Antigen Hbs Ag in Erscheinung.
HEPATITIS B Sezernierte Antigene
Figure imgf000031_0001
5.0 Antiparasitare Wirkungen
Orientierende Prüfungen wurden am Schweizerischen Tropeninstitut Basel (PD. Dr. Ronald Kaminsky und Frau Yvonne Grether) durchgeführt. Es wurde in ersten Testreihen untersucht, ob signifikante Ergebnisse in-vitro zu verzeichnen seien gegen Trypanosoma rhodesiense (den Erreger von Schlafkrankheit), gegen Trypanosoma cruzi (den Erreger der Chagas-Krankheit) und gegen Leishmania donovani (den Erreger von Leishmaniose). Eine beachtliche antiparasitare Wirksamkeit liess sich vorab für ausgewählte Cholestanyl-Ester-Konzentrate nachweisen, bei Konzentrationen, welche keine basale zytotoxische Wirkung auf murine Muskelzellen oder Makrophagen erzeugen. Sie ist spezifisch gegen Leishmania donovani.
Vorlaufige Ergebnisse:
SWISS TROPICAL INSTITUTE, BASEL In-vitro assays, WHO-screenmg SOP
Figure imgf000031_0002
All values as: μg/ml
Legend* r = active on T.b.rhodesinense d = active on L. donovani t = cytotoxic on mammalian cells c = active on T. cruzi - = inactive or low activity
MIC = minimum inhibitory concentration IC50 = 50% killing rate concentration
Figure imgf000032_0001
EP 1 1% Konzentrat CHOLESTANYL-ISOV ALERAT EP 2 1% Konzentrat CHOLESTANYL-10-UNDECENOAT EP 3 1% Konzentrat CHOLESTANYL-PALMITAT EP 4 1% Konzentrat CHOLESTERYL-n-V ALERAT EP 5 1% Konzentrat CHOLESTERYL-LAURAT
EP 6 1% Konzentrat CHOLESTERYL-PALMITAT
EP 7 1% Konzentrat SITOSTERYL-LAURAT
EP 8 1%-Konzentrat SITOSTERYL-PALMITAT
EP 9 1%-Konzentrat SITOSTERYL-ARACHIDAT
EP 10 1%-Konzentrat SITOSTERYL-BEHENAT
EP 11 1%-Konzentrat STIGMASTERYL-LAURAT
EP 12 1%-Konzentrat STIGMASTERYL-PALMITAT ERGOSTERYL-n-VALERAT
ERGOSTERYL-LAURAT
ERGOSTERYL-PALMITAT
ERGOSTERYL-BEHENAT
SITOSTERYL-PALMITAT
SITOSTERYL-PALMITAT
C ι:ι-CITRONELLYL-ESTER (COEMULGATOR) COEMULGATOR + TENSIDE SITOSTERYL-PALMITAT SITOSTERYL-ARACHIDAT
Figure imgf000033_0001
ERGOSTERYL-LAURAT
N.B. Werden die Messwerte der Konzentrate auf W.S. -Gehalt bezogen, sind sie um den Faktor 100 kleiner. Zu beachten bei der Interpretation der MIC-Werte.
6.0 Analytischer Nachweis
6.1 Identifikation von erfindungsgemasser Ester-Wirksubstanz Kapillarzonen-Elektrophorese mit einem Gerat P/ACE 2100 von Beckman Instruments, bzw. einem BioFocus Integrator von BIO-RAD Laboratories. Bedingungen: Puffer pH = 7.0 50 mM Na-phosphat
100 mM Borsaure 50 mM SDS filtriert 0.2 μm Zu 20 ml Puffer werden 5 ml Methanol gegeben Kapillare: HP bubble cell FS 50 mm 0, 37 cm Injektion: 20 psi'sec. Run 15 kV, Messung bei 192 nm Der Ester peak erscheint nach gut 4 Minuten Detektionsgrenze 0.5 ppm, sehr hohe Auflosung
6.2 Identifikation der Konzentrat-Mizellen in der wasserigen Mikroemulsion, bzw. im gereinigten und hochzentrifugierten Überstand des Zellplasmas der Tumor-oder der infizierten Wirtzellen.
Gleiche Methodik wie 5.1
Der charakteristische Peak erscheint nach ca.5 Minuten. 6.3 Nachweis der Membran-Penetration an der Tumorzelle, bzw. der infizierten Wirtzelle.
Am Lichtmikroskop (wie auch am Elektronenmikroskop) lasst sich aufzeigen, dass wenige Stunden nach der Inkubation (Beispiel Py6-Zellen = Polyoma- Virus transformierte 3T3-Mausfιbroblasten; dünn ausgesät, mittlere Verdünnung der Wirkstoff-Konzentrate) sich ein Kranz von Vakuolen um den Zellkern der Wirtzelle herum ausbildet. Als Markiersubstanz kann dem Konzentrat eine kleine Menge Canthaxanthin beigegeben werden, das eine deutlich bestimmbare Fluoreszenz besitzt. Es eignen sich auch Phenosafranin, Tinopal® GS oder Uvitex® CF, bzw. EBF. (CIBA-GEIGY).
Der analytische Nachweis, dass diese Vakuolen die erfindungsgemassen Ester als Wirksubstanz enthalten, erfolgt ebenfalls mittels mizellarer Kapil- lar-Zonen-Elektrophorese "MECC", (Beckman Instruments, P/ACE System 2100 oder dem BioFocus Integrator von Bio-Rad).
Vgl. im übrigen: Koji Otsuka et al.: "Separation of lipophile compounds by micellar electrokinetic chromatography with organic modifiers", Electro- phoresis, 1994, 75, 1280-83 (VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim).
7.0 Allgemeine Verträglichkeit von MARIGENOL®-Konzentraten
AUSWIRKUNG auf das BLUTBILD
TOXIZITAT von MARIGENOL®-KONZENTRATEN an der BALB/c-Maus
%-Anteιl der Blutkörperchen
Figure imgf000035_0001
G 17 2 %-Konzentrat mit C 5:0-ιso-CHOLESTERYL-ESTER
(Cholesteryl-iso-Valerat)
G 41 2 %-Konzentrat mit C 11 :1-ERGOSTERYL-ESTER
(Ergosteryl-10-Undecenoat)
G 44 2 %-Konzentrat mit C 18:2-CHOLECALCIFERYL-ESTER
(C 18:2-D3 ; Vitamin-D3-Linolat)
G 55 2 %-Konzentrat mit C 4:1-CHOLECALCIFERYL-ESTER
(C 4:1-D3 ; Vitamin-D3-Crotonat)
Verdünnungen: 10-7 = o,1 ppm Konzentrat; 0,002 ppm Wirksubstanz 10-5 = 10 ppm Konzentrat; 0,200 ppm Wirksubstanz 10-3 = 1'000 ppm Konzentrat; 20,000 ppm Wirksubstanz (auf die wassrige Mikroemulsion berechnet) Legende:
L = Lymphocyten
M = Monocyten (Makrophagen)
N = Neutrophile Granulocyten
E = Eosinophtle Granulocyten
B = Basophile Granulocyten
Durchfuhrung der Proben: Prof.Dott. Guido FORNI, Dotta Stefania VAI, Universita di Torino, Dipartimento di Scienze Cliniche e Bioiogiche, Ospedale San Luigi Gonzaga, I-10O43 ORBASSANO (TO), August/September 1993.
Test mit normalen 8-wochιgen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mausen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Wahrend 4 Wochen taglich zweimalige Injektion i.v von je 0,250 ml wassπger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiologischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grunwald-Giemsa
Zeit der Behandlung: 28 Tg.
Blutanalyse: nach der letzten Injektion
Anzahl Tiere: 13 Gruppen zu 5 je Tieren
RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede auf zu den Kontrollen. Es konnte keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche.
7.1 UNTERSUCHUNG DES BLUTBILDES
Auswirkung der MARIGENOL®-KONZENTRATE auf normale humane Lymphomonocyten
Zellen: normale humane phagozytische weisse Blutzellen
(Macrophagen); 2 x 1θ5 Zellen pro well
Stimulation der Kontrollen: 1 % PHA (Phytohemagglutinin)
Figure imgf000037_0001
Test 1 . 2 %-Konzentrat enthaltend C 12:0-Cholesteryl Ester
Test 2 : 2 %-Konzentrate enthaltend C 16:0-Ergosteryl Ester
Test 3 : 2 %-Konzentrate enthaltend C 5:0-Cholecalciferyl Ester
(Vitamin D3-ιso-Valerat)
Tests durchgeführt von Dottoressa Anna GUARINI, Universita di Torino, Chnica medica, 1-10*126 TORINO, 21. bis 24. März 1994.

Claims

P A T E N TA N S P R Ü C H E
1. Spontan dispergierbares Konzentrat, enthaltend Ester der allgemeinen Formeln (I) bis (VII), zur Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler, viru- zider und/oder antiparasitarer Wirksamkeit:
(D
Figure imgf000038_0001
(II)
Figure imgf000038_0002
(III)
Figure imgf000039_0001
(IV)
Figure imgf000039_0002
(VI) (VII), wobei in den Formeln (I) bis (VII) R1 eine C∑-ai-Alkyl-, eine C3.3i-Alkenyl-, eine C3-3i-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe darstellt.
2. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1, dadurch umschrieben, dass es aus folgenden Komponenten zusammengefügt ist: 0,001 bis 15 Gewichts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VII) oder einer Kombination solcher Verbindungen,
0 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe, 0 bis 40 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Coemulgator dienenden, pharmavertraglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, 0,001 bis 90 Gewιchts-% eines pharmavertraglichen Tensides oder Tensid- gemisches,
0 bis 10 Gewιchts-% eines Vitamines oder Provitamines,
0 bis 10 Gewιchts-% eines Stabilisators, Radikalfangers oder pharmazeutisch ublicherTragerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.
3. Wasserige Ultramikroemulsion von hervorragender Phasenstabilitat und überaus deutlich erhöhtem Permeations- und Spreitungsvermogen, enthaltend ein Konzentrat gemass Anspruch 2, verdünnt mit destilliertem Wasser, 5%-Glucoselosung oder Ringerlosung im Verhältnis 1:20 bis 1:1*000*000, zur Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler, viruzider und/oder antiparasitarer Wirksamkeit und zur verbesserten Aufnahme externer Aktivatoren
4 Spontan dispsrgierbares Konzentrat gemass Anspruch 1, enthaltend Ester der Formeln (I) bis (VII), mit der Massgabe, dass R1 für eine Cn.∑i-Alkyl- gruppe, eine C-io 17-Alkenylgruppe oder eine Gruppe der Formel (VIII) :
Figure imgf000040_0001
(VIII) steht.
5. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1, zur Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler und/oder viruzider Wirksamkeit und zur verbesserten Aufnahme externer Aktivatoren, dadurch bestimmt, dass es als Wirkstoff ß-Sitosteryl-caproylat, ß-Sitosteryl-laurat, ß-Sitosteryl-palmitat, ß- Sitosteryl-stearat, ß-Sitosteryl-arachidat, ß-Sιtosteryl-behenat, ß-Sitosteryl- 10-undecenoat, ß-Sitosteryl-oleat, ß-Sitosteryl-all trans-retinat, Ergosteryl-10- undecenoat, Ergosteryl-Iaurat, Ergosteryl-behenat, Ergosteryl-all-trans- retinat, Ergocalcιferyl-10-undecenoat, Ergocalciferyl-Iaurat, Ergocalciferyl- pal-mitat, Ergocalciferyl-all trans-retinat, Cholecalciferyl-10-undecenoat, Cholecalciferyl-Iaurat, Cholecalciferyl-palmitat, Cholecalciferyl-all trans- retinat oder eine Mischung solcher Komponenten enthalt
6. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1, zur Verwendung als Arzneimittel mit Wirksamkeit gegen Parasiten, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff einen oder mehrere Cholestanyl-, Cholesteryl- oder Sitosteryl-Carbonsaureester enthalt.
7. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 2, dadurch bestimmt, dass es
1 bis 10 Gewιchts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VII), sowie 1 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyπstat, Isopropylpalmitat, CHAPS, HEPES, Neutralol, Polyoxyethylen-(20)-sorbιtan-monolaurat, PEG-20 Methyl Glucose Sesquistearat oder eines oder mehrerer biotensider Terpenester der Formel (IX) :
R COO R (IX) worin R5 eine C2.31-Alkyl-, und eine Cj.31-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe und
R6 Citronellyl, Farnesyl, Geranyl, Isophytyl oder Phytyl bedeuten,
20 bis 45 Gewιchts-% Trιstyrylphenolpolyoxyethylen-18-phosphorsaureester
TEA-Salz-Tensid und
20 bis 45 Gewιchts-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyethylenether
Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylengruppen enthalt.
8 Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 2, dadurch bestimmt, dass es
1 - 10 Gewιchts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VII), sowie 10 bis 20 Gewιchts-% 2-Pentanol
50 bis 70 Gewιchts-% Isopropylmyπstat, Isopropylpalmitat, CHAPS, Neutralol, Polyoxyethylen-(20)-sorbιtan-monolaurat, PEG-20 Methylglucose-sesqui- stearat oder eines oder mehrerer biotensider Terpenester der Formel (IX) :
R COO R (|X) worin R5 eine C2.31-Alkyl-, und eine C3.3i-Alkenyl- oder Alkapolyengruppe und
R6 Citronellyl, Farnesyl, Geranyl, Isophytyl oder Phytyl bedeuten, 0 bis 30 Gewιchts-% tert. Octylphenylpolyoxyethylenether Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylengruppen, wasserfrei, und/oder Alkylphenol Polyglycolether-Phos- phat-Tensid und/oder Tristyrylphenolpolyoxyethylen-18-phosphorsaureester TEA-Salz-Tensid enthalt.
9. Therapeutisches Systempraparat, welches 1 bis 95 Gewιchts-% des spontan dispergierbaren Konzentrates gemass einem der Ansprüche 1, 2 und 4 bis 8 enthalt und welches in Dosis-Einheitsform als Micropellets, Granulat, Dragees, Suppositorien, Ampullen oder als Kapseln vorliegt.
10. Therapeutisches Systempraparat gemass Anspruch 9 , 'welches 64 Teile Kernmaterial für die Granulat-, bzw. Pellet-Bildung und 36 Teile eines erfindungsgemassen Konzentrates enthalt und in pharmazeutisch geeignete Kapseln aus Hydroxylpropyl-Methylcellulose-Acetat-Succinat abgefüllt ist.
GEÄNDERTE ANSPRUCHE
[beim Internationalen Büro am 27 Mai 1997 (27.05.97) eingegangen, ursprüngliche Ansprüche 2,7 und 8 geändert; alle weiteren
Ansprüche unverändert (5 Seiten)]
1. Spontan dispergierbares Konzentrat, enthaltend Ester der allgemeinen
Formeln (I) bis (VII), zur Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler, viruzider und/oder antiparasitärer Wirksamkeit:
(D
Figure imgf000043_0001
(II)
Figure imgf000043_0002
(III)
Figure imgf000044_0001
(IV)
Figure imgf000044_0002
(VI) (VII), wobei in den Formeln (I) bis (VII) R1 eine C2.3i -Alkyl-, eine C3.31 -Alkenyl-, eine C3.3i -Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe darstellt.
2. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1 , dadurch umschrieben, dass es aus folgenden Komponenten zusammengefügt ist: 0,1 bis 5 Gewichts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VII) oder einer Kombination solcher Verbindungen, 0 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer pharmazeutischer Wirkstoffe, 2 bis 25 Gewichts-% eines als Hydrotrop, d.h. als Coemulgator dienenden, pharmavertraglichen Losungsmittels oder Losungsmittelgemisches,
5 bis 90 Gewichts-% eines pharmavertraglichen Tensides oder Tensid- gemisches, und wahlweise
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamines oder Provitamines,
0 bis 10 Gewichts-% eines Stabilisators, Radikalfangers oder Penetrations- verbesserers.
3. Wässerige Ultramikroemulsion von hervorragender Phasenstabilitat und überaus deutlich erhöhtem Permeations- und Spreitungsvermogen, enthaltend ein Konzentrat gemass Anspruch 2, verdünnt mit destilliertem Wasser, 5%-Glucoselosung oder Ringerlösung im Verhältnis 1 :20 bis 1 : 10'000, zur Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler, viruzider und/oder antiparasitarer Wirksamkeit und zur verbesserten Aufnahme externer Aktivatoren.
4. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1 , enthaltend Ester der Formeln (I) bis (VII), mit der Massgabe, dass R1 für eine C11 -2ι - Alkylgruppe, eine Cι o-1 7-Alkenylgruppe oder eine Gruppe der Formel (VIII) :
Figure imgf000045_0001
(VIII) steht.
5. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1 , zur Verwendung als Arzneimittel mit antiviraler und/oder viruzider Wirksamkeit und zur verbesserten Aufnahme externer Aktivatoren, dadurch bestimmt, dass es als Wirkstoff ß-Sitosteryl-caproylat, ß-Sitosteryl-laurat, ß-Sitosteryl-palmitat, ß- Sitosteryl-stearat, ß-Sitosteryl-arachidat, ß-Sitosteryl-behenat, ß-Sitosteryl- 10-undecenoat, ß-Sitosteryl-oleat, ß-Sitosteryl-all trans-retinat, Ergosteryl-10- undecenoat, Ergosteryl-Iaurat, Ergosteryl-behenat, Ergosteryl-all-trans-reti- nat, Ergocalciferyl-10-undecenoat, Ergocalciferyl-Iaurat, Ergocalciferyl-palmitat, Ergocalciferyl-all trans-retinat, Cholecalciferyl-10-undecenoat, Cholecal- ciferyl-laurat, Cholecaiciferyl-palmitat, Cholecalciferyl-all trans-retinat oder eine Mischung solcher Komponenten enthält.
6. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1 , zur Verwendung als Arzneimittel mit Wirksamkeit gegen Parasiten, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff einen oder mehrere Cholestanyl-, Cholesteryl- oder Sitosteryl-Carbonsaureester enthält.
7. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 2, dadurch bestimmt, dass es
1 bis 5 Gewichts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VII), sowie
3 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, CHAPS, HEPES,
Neutralöl, oder eines oder mehrerer biotensider Terpenester der Formel (IX) :
R COO R (lX) worin R eine C2-3i -Alkyl-, eine C3-31 -Alkenyl- oder eine Alkapolyengruppe ist und R Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeutet,
20 bis 45 Gewichts-% Tristyrylphenolpolyoxyethylen-18-phosphorsaureester TEA-Salz-Tensid und
20 bis 45 Gewichts-% des wasserfreien tert. Octylphenyl polyoxyethylenether Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylengruppen enthält.
8. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 2, dadurch bestimmt, dass es
1 bis 5 Gewichts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VII), sowie
3 bis 20 Gewichts-% Ethanol oder 2-Pentanol
6 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat, CHAPS, Neutralόl und/oder eines oder mehrerer biotensider Terpenester der Formel (IX) :
R COO R (IX) worin R eine C2.3ι -Alkyl-, eine C3.3ι -Alkenyl- oder eine Alkapolyengruppe ist und R6 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeutet, 10 bis 60 Gewichts-% tert. Octylphenylpolyoxyethylenether Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylengruppen, wasserfrei, und/oder Alkylphenol Polyglycolether- Phosphat-Tensid und/oder Tristyrylphenolpolyoxyethylen-18-phosphorsaure- ester TEA-Salz-Tensid enthält.
9. Therapeutisches Systempraparat, welches 1 bis 95 Gewichts-% des spontan dispergierbaren Konzentrates gemass einem der Ansprüche 1 , 2 und
4 bis 8 enthält und welches in Dosis-Einheitsform als Micropellets, Granulat, Dragees, Suppositorien, Ampullen oder als Kapseln vorliegt.
10. Therapeutisches Systempräparat gemass Anspruch 9 , welches 64 Teile Kernmaterial für die Granulat-, bzw. Pellet-Bildung und 36 Teile eines erfin- dungsgemässen Konzentrates enthält und in pharmazeutisch geeignete Kapseln aus Hydroxylpropyl-Methylcellulose-Acetat-Succinat abgefüllt ist.
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