EP0902685A1 - Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren konzentraten enthaltend antitumoral, antiviral und antiparasitär wirksame ester von pentacyclischen triterpenen - Google Patents

Ultramikroemulsionen aus spontan dispergierbaren konzentraten enthaltend antitumoral, antiviral und antiparasitär wirksame ester von pentacyclischen triterpenen

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EP0902685A1
EP0902685A1 EP97900535A EP97900535A EP0902685A1 EP 0902685 A1 EP0902685 A1 EP 0902685A1 EP 97900535 A EP97900535 A EP 97900535A EP 97900535 A EP97900535 A EP 97900535A EP 0902685 A1 EP0902685 A1 EP 0902685A1
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EP
European Patent Office
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weight
esters
acid
formulas
surfactant
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97900535A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Carl Eugster
Conrad Hans Eugster
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Marigen SA
Original Assignee
Marigen SA
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to ultramicroemulsions from spontaneously dispersible concentrates with esters of pentacyclic triterpene compounds, new triterpene esters, processes for their preparation and processing into suitable pharmaceutical dosage forms, and the use of the ester-containing, spontaneously dispersible concentrates and microemulsions as medicaments with effectiveness against tumors, eczema, psoriasis, viral and parasitic infections, as well as for the prevention of tumor formation by increasing the absorption of exogenous activators, modulators and regulators.
  • esters of the selected plant-based raw materials and their transformation products surprisingly have a very good antitumor, antiviral and / or virucidal and antiparasitic activity, and they are also suitable for the treatment of eczema and psoriasis. In preventive and therapy-supporting respects, they are important because they increase the uptake of exogenous activators, modulators and regulators and thereby increase the metabolic as well as the immune performance.
  • Betulinic acid Hatchet: 10 (3), 1059; Aldrich 85.505-7
  • ENOXOLON (3-hydroxy-11-oxoolean-12-en-29-oic acid); 18 ⁇ -glycyrrhetic acid; Uralenic acid; Merck Index 11.3543 L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 26., 2143, 2278 (1943)
  • URSOLIC ACID (ß-Hydroxyurs-12-en-28 oic acid)
  • the compounds of the formulas (I) to (XI) can generally be prepared by the following processes which are known per se: a) Reaction of a compound of the formula (XII):
  • the methyl ester of 18 ⁇ -glycyrrhetinic acid can:
  • esters of the selected pentacyclic triterpene compounds of the formulas (I) to (XI) surprisingly have an excellent antitumor, antiviral, virucidal and antiparasitic activity, and they are also suitable for combating eczema, psoriasis, as well as metabolic and immune Disruptions, especially when they have been incorporated into spontaneously dispersible MARIGENOL® concentrates according to the present invention, which result in thermodynamically stable oil-in-water ultramicroemulsions diluted with distilled water, with 5% glucose solution or with Ringer's solution.
  • the present invention accordingly relates to spontaneously dispersible concentrates in advance with the antitumoral, antiviral, virucidal or antiparasitic esters of the compounds (I) to (XI), which can also induce the apoptosis of tumor or host cells.
  • the designated esters are almost water-insoluble and highly agglomerated compounds. So that such connections pass through the membrane barrier of the tumor or host cells, or the protein sheath of veins or parasites diffuse and inside the
  • Cell or the capsid can be effective, they must first be suitably solubilized in the aqueous medium.
  • thermodynamically stable oil-in-water ultramicroemulsions with the help of specially selected and combined as a system surfactants or solubilizers on the one hand and suitable surfactants on the other hand, it is possible to achieve an optimal degree of solubilization of the therapeutically and prophylactically active esters.
  • the molecules of the designated ester compounds are dissolved in the oily inner phase and are present in the micellar core in monomeric or in oligomeric agglomerated form, which makes a very decisive difference to mere macro-emulsions (e.g. liposomes).
  • the micelles of the ester-containing inner phase of the ultramicroemulsions according to the invention are accordingly on their surface, i.e. protected at its boundary layer with a surfactant coat, which it repairs, easily diffusing through the cell membrane or the protein envelope into the interior of the tumor or host cell.
  • the diffusion through the plasma membrane of abnormal cells occurs exclusively due to thermal molecular movements; the fractal conditions on the cell membrane accommodate her. It can be shown that the speed of the diffusion process or the strength of the active substance transport is determined by the membrane of the target cell:
  • a globular "micelle" with a hydrodynamic radius of one centimeter has a volume of 4.189 cm 3 and a phase surface area of 1 2.564 cm2.
  • 1Q18 micelles with a hydrodynamic radius of only 10-6 cm (10 nm) each, which together make up the same volume of 4.1 87 cm 3 already have a total phase surface of 1 '256.4 m2 .
  • the "packing density" of a spontaneously dispersible, stable MARIGENOL® concentrate increases exponentially with the smaller particle size of the micelles.
  • the right training is crucial the inner phase, its balanced ratio to the total concentrate and the selection of the appropriate surfactants.
  • the concentrates which are spontaneously dispersible according to the invention contain: 0.1 to 10% by weight of individual esters of the formulas (I) to (XI), or combinations of such esters, and
  • a pharmaceutically compatible surfactant or surfactant mixture up to 10% by weight of a vitamin or provitamin, up to 10% by weight of a stabilizer, scavenger, biological vector or penetration enhancer and carriers and the like / or diluent.
  • the surfactants or surfactant mixtures to be used according to the invention can be anion-active, cation-active, amphoteric or non-ionic. They are preferably amphoteric or non-ionic and have an HLB ratio (ie a “hydrophilic-lipophilic balance”) between 2 and 1 8; for mixtures it is preferably between 2 to 6 on the one hand and 1 0 to 15 on the other.
  • HLB ratio ie a “hydrophilic-lipophilic balance”
  • Highly preferred for the production of spontaneously dispersible concentrates according to the invention are, on the one hand, phosphoric acid ester surfactants, such as, for example: the practically anhydrous tristyryl phenol polyoxyethylene-18-phosphoric acid ester TEA salt surfactant:
  • Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), or the identical Sermul® EA 188 (SERVO), a mixed emulsifier, each consisting of 50% of the two compounds with the
  • Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), an alkylphenol polyglycol ether phosphate surfactant
  • Butyl mono-4-ethoxy phosphoric acid ester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), or CH 3 - (CH 2 ) —CH-CH 2 -O (-CH 2 - CH 2 -O) 5 -OCH,
  • betai n associations i.e. amphoteric, salt and water-free imidazole derivatives, e.g. :
  • Me [ + ] stands for hydrogen, alkali and alkaline earth atoms and R x for C 1 -32 -alkyl or C 2-32 -alkenyl groups.
  • multi-functional glucose derivatives such as e.g.
  • Glucate® SS methyl glucose sesq uistearate
  • Glucate® SSE-20 PEG-20
  • Methyl Glucose Sesquistearate from Amerchol, Edison, N.J. , UNITED STATES.
  • solvents which can be used as hydrotropes or as co-emulsifiers can be used, e.g. :
  • an aliphatic carboxylic acid C 10 - 22
  • Hydrocarbons with a straight carbon chain C 12 -32
  • propylene glycol monolaurate and propylene glycol monomyristate such as propylene glycol monolaurate and propylene glycol monomyristate.
  • Esters of an al iphatician alcohol (. C 12 22) with lchklare Mi such as myristyl or preferably Lau ryl-lactate; Mono-, di- or triesters of Gly cerins (neutral oleum) with an ali phatic carboxylic acid (C 6. 22), such as G lyceryl- capryolat, or Miglyol® 812 neutral oil.
  • aliphatic alcohols C ⁇ 2-22
  • dodecanol tetradecanol
  • oleyl alcohol 2-hexyldecanol
  • 2-octyldecanol 2-octyldecanol
  • Ester with at least one free hydroxyl group from poly (2-1 0) glycol with an aliphatic carboxylic acid (C ⁇ - 22 ).
  • Vitamins and provitamins are suitable as additives in the spontaneously dispersible concentrates according to the invention.
  • AII-trans-retinoic acid in 50 ml of dioxane or chloroform are added 650 mg of N, N'-carbonyldiim idazole at 15 ° C. with exclusion of air.
  • the reaction solution is left to stand at 15 ° C. for 24 hours.
  • the solution with the resulting AII-trans-retinoic acid imidazolide is then added dropwise at 20 ° C. to a solution of 900 mg of oleanolic acid, 60 mg of dimethylformamide and 50 mg of p-dimethylamino nopyridine in 50 ml of dioxane or chloroform. After heating for 3 hours at 40 ° C, the solvent is removed by vacuum distillation.
  • the preparation is made from 30,280-dilauroyl betulin analogous to a rule by L. Ruzicka et al. [Helv.Chim.Acta 1938, 21_, 1708]: the solution of 495 mg of 3,28-di-O-lauroylbetulin in 3 ml of benzene was mixed with 6.25 ml of 0.1N KOH in ethanol and while stirring Maintained at 50 ° C for 12 hours. We poured the clear solution on a silica gel column (silica gel Merck, 0.04 - 0.063 mm / 2, 6 x 43 cm, wet filled with ethyl acetate / benzene / acetone 11: 9: 1).
  • the monolaurate has an Rf value of 0.84. Yield 280 mg of colorless, very viscous oil which slowly solidifies to a semi-solid mass when dried at 50 ° C./0.01 Torr.
  • Rf (silica gel Merck, AcOEt / Toluon / Acetone 11: 9: 1): 0.84.
  • Allobetulin was prepared according to the instructions of H. Schulze and K. Pieroh (Ber. Deutsch. Chem. Ges., 1922, 55_, 2332). 0.31 and 0.47 g each of pure Allobetu lin were in 2 ml abs. Dissolved pyridine and 10 ml of 1, 2-dichloroethane, then mixed with a few crystals of 4-dimethylaminopyridine and added dropwise at room temperature via syringe with 1, 2 equivalents of acid chloride. After 2 h at RT, the mixture was heated to 50 ° C. for 30 m, then cooled, sufficient Et2 ⁇ was added and the mixture was shaken out with water, 2N HCl and brine. After drying over Na2SO4, filtering and evaporation, the mixture was taken up in benzene and the solution was filtered through a short column of activated aluminum oxide and the filtrate was evaporated.
  • the methyl ester was prepared from pure betulinic acid by esterifying its solution in THF / MeOh with an excess of freshly prepared ethereal diazomethane solution (cf. V. Bruckner, J. Koväcs, J. Kozka, J. Chem. Soc. 1 948 . 948).
  • a little 4-dimethylaminopyridine was added to pyridine and 10 ml of 1,2-dichloroethane and then acylated and worked up as above under e). 0.75 g of colorless, very viscous oil was obtained which did not crystallize at RT.
  • COMPOSITION EXAMPLES of spontaneously dispersible CONCENTRATES according to the invention which contain the active compounds of the formulas (I) to (VI) and which, if diluted with water or 5% glucose solution or physiological saline (Ringer's solution), thermodynamically stable ULTRAMICROEMULS IONS with a hyd rododynamic radius of 2.2 to 3.0 nm.
  • isopropyl myristate, isopropyl palmitate or neutral oil e.g. Mig lyol® 81 2 (DYNAMIT NOBEL or HÜLS),
  • a phosphoric acid ester surfactant e.g. Diphasol® 3873 (CI BA-GEIGY), tenside 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA-GIGY), Tinovetin® JU (CIBA-G EIGY), Soprophor® FL (RH ⁇ NE-POULENC), 5 up to 90% by weight Invadin JFC 800% (CIBA-GEIGY) and / or Tween®-20 (ICI S specialty Chemicals), up to 10% by weight of a vitamin or provitamin. up to 10% by weight of a stabilizer, radical scavenger, biological vector or penetration enhancer and carriers and / or diluents.
  • a stabilizer, radical scavenger, biological vector or penetration enhancer and carriers and / or diluents e.g. Diphasol® 3873 (CI BA-GEIGY), tenside 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN or AT (CIBA
  • ) where R4 is a C 2 - 3 i alkyl, a C 3 . 3 i -Alkenyl or a C 3-3 ⁇ -Alkapolyen- group and R5 citronellyl, farnesyl, geranyl, isophytyl or phytyl mean.
  • INVADIN® J FC 800% (CI BA-GEIGY) is an anhydrous tert. Octylphenyl polyoxyethylene ether surfactant with 9 to 10 oxyethylene groups.
  • TWEEN®-20 is a polyoxyethylene (20) sorbitan monolaurate, or the polysorbate-20 in the CTFA classification.
  • MSR gastric juice resistance.
  • the pellets / granules according to a) can also be filled directly into capsules, which are made from AQOAT® (HPMC-AS-M or HPMC-AS-N), and sealed with acetone / ethanol 1: 1, and so the functions adequately control the MSR and the delayed release (retard).
  • a biological assay system has been developed that works with microtiter plates and dilution series.
  • 1 ⁇ 4 / ml tumor cells are inactivated in RPMI 1640 culture medium with 10% fetal calf serum (GIBCO); they are sown so densely that they can grow in non-confluent monolayers during the assay.
  • the sample is added after 6 to 24 hours, with 100 ⁇ l per row, which is then in the 1st Add 100 ⁇ l of medium to the hole. Half of this is removed and placed in the following hole, again mixed with 100 ⁇ l medium, etc.
  • a geometric series of dilutions n 1 / .. is formed.
  • the samples are incubated in the plaque assay for 3 to 5 days at 37 ° C with 3 1 ⁇ % CO2. Then dye / fix with 0.1% crystal violet (Fluka, Buchs) in a solution of 70% methanol, 1% formaldehyde, 29% water. The evaluation is carried out on a microscope, magnification 300 times. The largest cytotoxic dilution is determined. The quantitative evaluation can also be carried out by means of scanning and absorption measurement on a spectrophotometer.
  • Betulin accounts for up to 35% of the dry weight in the white bark of Betula platyphyl la. [K. Hi rota et al., Chem. Abbstr. 1948, 42., 6090], which suggests that it assumes a protective function for the plant there.
  • the extract from the dry distillation served as a remedy for various applications, and as a "bark tar" for the manufacture of the famous Russian leather.
  • Cytofluor 2300 system Incubation 72h, Alama blue; Plate CoStar 96 treatment: 46 h; Measurement EX filter 530/25; EM filter 590/35, sensitivity 2
  • MTT methyl tetraazole salt
  • Residual values of the Zeil vitality are expressed as a% difference compared to the HIV CPE controls, the mean as zero.
  • the measured titer depends on the dose. It drops from the initial value of 300% CCID50 to 120% CCID50 and down to 2% CCID50.
  • CCID50 cell c_ulture mfective d_ose 50%.
  • CCID50 cell c_ulture mfective d_ose 50%.
  • the HIV titer is given as the reciprocal of the dilution which 4 of 8 samples from a series (50%) infected. The content of a hole is considered infected if the reading of the OD at 550 nm is lower than the mean of the 8 control holes minus 2.8 times the standard deviation (lower 95% confidence limit).
  • ergosteryl-1 0-u-decenoate and ß-sitosteryl-palm itate a very clear inhibition of replication and actual elimination can be determined in vitro as a result of the pretreatment of the strains. Your defense against infection is dose-dependent. There was no inhibition at all after treatment with pure carrier concentrate alone.
  • HIV TITER (CCID50)
  • HIV strain 21/4 (clinical isolate) + 300
  • HIV strain 4/5 (“clinical i solate") + 200
  • HIV (2 strains) + 2 ß-SITOSTERYL-PALM ITAT (mean titer from
  • CMV Cytomegalovirus
  • the test was carried out with human, embryonic lung fibroblasts as host cells, which were then infected with the CMV strain AD 169.
  • the strain "CVM umano AD169” was formulated as a 1% concentrate and then diluted to an aqueous microemulsion 10-3, 10 for 4 h at + 4 ° C. with different concentrations of the test substance C 6: o-ß-sitosterylester -4 and 10-5, incubated and then inoculated as pretreated virus suspensions on cultures of human, embryonic lung fibroblasts. Approach as a confluent culture with 120 * 000 cells per shell vial.
  • the infection was carried out by centrifugation for 45 minutes at 1500 rpm and at RT, whereupon the injection suspension was removed and 1 ml of culture medium MEM with 2% fetal calf serum (as in the case of cultivation) was added; the infected cells were then kept at 37 ° C. and under a 5% CO 2 atmosphere for 20 hours.
  • the medium was removed, the cells were collected, fixed with 2% acetone-methanol (2: 1) and washed 3 times with PBS.
  • the quantification was carried out by means of immunofluorescence measurement.
  • the vials were mixed with the monoclonal antibody "Anti-P-72 CMV" (an immediate precursor protein of the CMV, which can be detected in the infected cells after 6 hours) and incubated for 30 minutes at 37 ° C. in a moist atmosphere. This was followed by 3 washes in PBS, a second incubation with the fluorescence-labeled antibody IgG goat anti-IgG mouse. This is followed by another incubation for 30 minutes at 37 ° C., as indicated above, followed by a 3-wash with PBS. The samples are then mounted on glass slides with 50% glycerol in PBS.
  • controls were prepared with infected cells, which were prepared under the same conditions but without pretreatment with the test substance.
  • the nuclei positive for the CMV-specific antigen are counted using a fluorescence microscope at 25x magnification in the aqueous phase.
  • a dose-dependent, direct virucidal effect can be clearly determined.
  • the virus is no longer virulent enough to infect the sensitive host cells.
  • Herpes virus (herpes simplex, HSV)
  • the antiviral / virucidal effect of an aqueous microemulsion of suitable MARIGENOL ⁇ concentrates is determined using a confluent monolayer culture from VERO cells (ie "African green mon key kidney cells”).
  • the HSV titer is significantly reduced.
  • Herpes virus Herpes Sim plex, HSV
  • HBV Hepatitis B Virus
  • the tests were carried out with immortalized liver hematoma cells which, after infection with the hepatitis B virus, the two antigens Hbs Ag (a "surface antigen” from the outer shell of the virus) and Hbe Ag (a "core antigen” from the core of the DNA) Virus) secrete.
  • Hbs Ag a "surface antigen” from the outer shell of the virus
  • Hbe Ag a "core antigen” from the core of the DNA) Virus
  • Orientative tests in vitro were carried out with a 1% concentrate of the three test substances ß-sitosteryl palmitate, ß-sitosteryl arachidate and ergosteryl isovalerate by Prof. Dott. Antonio Ponzetto and performed by Dotta Rossana Cavallo, Università degli Studi di Torino.
  • MIC minimum inhibitory concentration
  • IC50 50% killi ng rate concentration
  • Control stimulation 1% PHA (Phytohemaggl utinin)
  • Test 1 2% concentrate containing C ⁇ 2: o-cholesteryl ester
  • Test 2 2% concentrate containing Ci 6 : o-ergosteryl ester
  • Test 3 2% concentrate containing C 5: 0 cholecalciferyl ester

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Abstract

Spontan dispergierbare Konzentrate mit ausgewählten, antitumoral, antiviral und antiparasitär einsetzbaren Estern von pentacyclischen Triterpenverbindungen, wässerige Ultramikroemulsionen aus solchen Konzentraten, Verfahren zur Herstellung dieser Ester und zu ihrer Aufbereitung, sowie ihre Verwendung als Mittel zur Erzeugung eines pharmazeutischen Systempräparates mit Wirksamkeit gegen Tumore, Ekzeme, Psoriasis, virale und parasitäre Infektionen, zur anhaltenden Tumorprophylaxe und zur verstärkten Aufnahme von exogenen Aktivatoren, Modulatoren und Regulatoren werden beschrieben.

Description

ULTRAMIKROEMULSIONEN AUS SPONTAN DISPERGIERBAREN KONZENTRATEN ENTHALTEND ANTITUMORAL, ANTIVIRAL UND ANTIPARASITÄR WIRKSAME ESTER VON PENTACYCLISCHEN TRITERPE-
NEN
EINLEITUNG
Die vorliegende Erfind ung betrifft Ultramikroemulsionen aus spontan disper- gierbaren Konzentraten mit Estern von pentacyclischen Triterpenverbindun- gen, neue Triterpenester, Verfahren zu ihrer Herstellung u nd Aufbereitung in geeignete pharmazeutische Darreichungsformen, sowie die Verwendung der Ester-haltigen, spontan dispergierbaren Konzentrate und Mikroemulsionen als Arzneimittel mit Wirksamkeit gegen Tumore, Ekzeme, Psoriasis, virale und parasitäre Infektionen , sowie zur Vorbeugung gegen Tumorbildung im Wege der gesteigerten Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Regulatoren .
Die Ester der ausgewählten, pflanzlichen Grundstoffe und ihrer Transformationsprod ukte haben überraschenderweise eine seh r gute antitumorale, anti- virale und/oder viruzide, sowie antiparasitäre Wirkung , und sie eig nen sich auch zur Behandlung von Ekzemen und Psoriasis. I n vorbeugender und The- rapie-unterstützender Hinsicht sind sie bedeutungsvoll, wei l sie die Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Reg ulatoren erhöhen und dadurch das metabolische wie auch das immunitäre Leistungsvermögen anheben.
Die therapeutischen und prophylaktischen Eigenschaften derartiger Ester treten dann verstärkt auf, wenn sie in spontan dispergierbare MARIGENOL®- Konzentrate eingearbeitet und anschliessend mit destilliertem Wasser oder 5%-iger Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt worden sind , wobei sich thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergeben, welche sehr kleine, globuläre Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm enthalten. BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemässen Ester von ausgewählten, pflanzlichen Grundstoffen mit pentacyclischer Triterpenstruktur haben die allgemeinen Formeln (I) bis (XI) =
BETULIN [Lup-20(29)-en-3,28-diol], iup-20(30)-en-3ß,28-diol; Betulinol. Merck-
Index 11.1212, Sigma B 9757, Aldrich 12,376-5.
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta ü, 506 (1936)
ALLOBETULIN
BETULINSÄURE; Beil: 10(3), 1059; Aldrich 85,505-7
BETULINSAURE-METHYLESTER
ENOXOLON (3-Hydroxy-11-oxoolean-12-en-29-oic acid); 18ß-Glycyrrhetinsäure; Uralenic acid; Merck-Index 11.3543 L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 26., 2143, 2278 (1943)
ENOXOLON-METHYLESTER OLEA ryophyllin.
Merck-Index 11.6787; Aldrich 30,170-1
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta ü, 114 (1936)
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta 29_, 210 (1946)
OLEANOLSÄURE-METHYLESTER
LUPEOL (Fagasterol); Merck-Index 11.5478
URSOLSÄURE (3ß-Hydroxyurs-12-en-28 oic acid)
L. Ruzicka et al., Helv.Chim.Acta, 28, 199 (1945), Beil. 10(2), 202; Merck-Index 11.9802
URSOLSÄURE-METHYLESTER wobei in den Formeln (I) bis (XI) R1 eine C3.3ι-Alkyl-, eine C3-3ι-Alkenyl-, eine C-ι -23-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe ist.
Die Verbindungen der Formeln (I) bis (XI) lassen sich allgemein nach folgenden, an sich bekannten Verfahren, herstellen: a) Umsetzung einer Verbindung der Formel (XII) :
R— COOH (XII) worin R2 für eine C3-3ι-Alkyl-, eine C3.3ι-Alkenyl-, eine Cι -23-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe steht, mit 1,1 '-Carbonyldiimidazol oder mit N,N'-Dicyclo- hexylcarbodiimid in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, bei 0 bis 70°C, unter Schutzgaszuleitung und Zusatz einer katalytischen Menge eines Alkoholates, und anschliessende Alkoholyse der gebildeten Imidazole mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (XI).
b) Bildung des Chlorids einer Verbindung der Formel (XII) : R— COOH (XII) worin R2 für eine C3.3ι-Alkyl-, eine C3.31-Alkenyl- oder eine C17.23-Alka- polyengruppe steht, mit einem Chlorierungsmittel, wie z.B. Thionylchlorid oder Oxalylchlorid, und anschliessende Umsetzung mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (X) bei einer Temperatur von 0°C bis 60°C, unter Schutzgaszuleitung, in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z.B. Toluol oder Tetrahydrofuran, und in Gegenwart eines Katalysators, wie z.B. Dimethylformamid und/oder p-Dimethylaminopyridin.
c) Bildung des Allobetulins durch Partialsynthese aus Betulin:
und darauf Acylierung an Position 0-C(3) mit einer aktivierten, gesättigten C5.31- oder einer ungesättigten C8-3i-Carbonsäure:
und anschliessende Aufarbeitung wie nachstehend im Einzelnen beschrieben.
) Bildung des Betulinsäure-Methylesters laut Formel (IV):
und dann Umsetzung an 0-C(3) durch Reaktion mit dem Chlorid einer höheren Carbonsäure, samt anschliessender Aufarbeitung wie nachstehend im Einzelnen beschrieben. In entsprechender Weise kann auch der Methylester der 18ß-Glycyrrhetin- säure:
bzw. der Oleanolsäure:
(VIII) bzw. der Ursolsäure: an 0-C(3) acyliert werden.
Die Ester der ausgewählten, pentacyclischen Triterpenverbindungen der Formeln (I) bis (XI) haben überraschenderweise eine ausgezeichnete antitumo- rale, antivirale, viruzide und antiparasitäre Wirkung, und sie eignen sich auch zur Bekämpfung von Ekzemen, von Psoriasis, sowie von metabolischen und von immunitären Störungen, vornehmlich dann, wenn sie gemass der vorliegenden Erfindung in spontan dispergierbare MARIGENOL®-Konzentrate eingearbeitet worden sind, welche mit destilliertem Wasser, mit 5%-iger Glu- coselösung oder mit Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile Oel-in- Wasser Ultramikroemulsionen ergeben.
Derartige Ultramikroemulsionen weisen kugelförmige Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm auf. [Messungen mit QLS = quasielastischer, dynamischer Lichtstreuung wurden an der E.T.H., Zürich, Institut für Polymere (Prof.Dr. Pier-Luigi LUISI und Prof.Dr. Peter SCHURTENBER- GER) durchgeführt]. Zur angewandten Methodik vgl.:
P. Schurtenberger, R. Scartazzini, P.-L. Luisi, Rheol.Acta 28, 372 (1989). P. Schurtenberger, R. Scartazzini, L.J. Magid, M.E. Leser, P.-L. Luisi, J.Phys. Chem.94, 3695 (1990).
P.-L. Luisi, R. Scartazzini, G. Haering, P. Schurtenberger, Colloid Polym.Sci. 268, 356 (1990) : Organogels from water-in-oil microemulsions. T. Gisler et al.: "Mode-selective dynamic light scattering: theory versus ex- perimental realization". Applied Optics/Vol.34, No. 18.20 June 1995.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind demnach vorab spontan dispergierbare Konzentrate mit den antitumoral, antiviral, viruzid oder antiparasitär wirkenden Estern der Verbindungen (I) bis (XI), welche auch die Apoptosis von Tumor- oder Wirtzellen einleiten können. Die bezeichneten Ester sind nahezu wasserunlösliche und hoch agglomerierte Verbindungen. Damit solche Verbindungen aber durch die Membranbarriere der Tumor- oder Wirtzellen, bzw. die Proteinhü lle von Vi ren oder Parasiten diffundieren und im Innern der
Zelle, bzw. des Capsids wirksam werden kön nen, müssen sie vorerst i n geeigneter Weise im wässerigen Medium solubilisiert werden . Im Wege der Bildung von thermodynamisch stabilen Oel-in-Wasser Ultramikroemulsionen, mithilfe von besonders ausgewählten und als System zusammengefügten Co- tensiden oder Lösungsverm ittlern einerseits und geeig neten Tensiden anderseits geli ngt es, einen optimalen Solubilisierungsgrad der therapeutisch und prophylaktisch wirksamen Ester zu erzielen.
Alle experimentel len Beobachtungen an dergestalt ausgebi ldeten Ultramikroemulsionen lassen sich einheitl ich durch die An nahme deuten, dass die ausgewählten Tenside und Cotenside, als ausgewogene Formulierung genommen, in der wässerigen Phase organisierte Aggregate, sog . Mizellen bilden. Diese besitzen meh r oder weniger kugelförmige Gestalt, mit einem hydrodynam ischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm. Die Tenside u nd Hyd rotrope (Cotenside) lassen zwischen der äusseren, wässerigen Phase u nd der inneren , öligen Phase der Mikroemulsion [enthaltend die Ester der Formeln (I) bis (XI), gelöst im biotensiden Lösungsvermittler] eine Grenzschicht entstehen, wodurch die Mischung d ieser beiden Phasen unterbleibt, also keine Marangoni- Effekte auftreten . In der öligen, i nneren Phase sind d ie Moleküle der bezeichneten Esterverbindu ngen gelöst und liegen im mizel laren Kern in monomerer oder in oligomer agglomerierter Form vor, was einen ganz entscheidenden Unterschied zu blossen Makro-Emulsionen (z.B. Liposomen) ausmacht. Die Mizellen der Ester-haltigen inneren Phase der erfind ungsgemässen Ultramikroemulsionen sind dem nach an ihrer Oberfläche, d .h . an ihrer Grenzsch icht mit einem Tensidmantel gesch ützt, was sie instand setzt, leicht durch die Zellmembran oder die Proteinhülle ins I nnere der Tumor- oder Wirtzelle zu diffundieren. Die Diffusion d urch die Plasmamembran von abartigen Zellen erfolgt aussch liessl ich aufgrund thermischer Moleku larbeweg ungen ; die frak- talen Verhältnisse an der Zel lmembran kommen ihr dabei entgegen . Es lässt sich aufzeigen, dass die Geschwindig keit des Diffusionsvorganges, bzw. die Stärke des Wirkstofftransportes durch die Membran der Zielzelle bestimmt wird :
1 . vom Konzentrationsunterschied zwischen dem intrazellulären u nd dem interzellulären Bereich
2. vom Teilchenradius des diffundierenden Wi rkstoffmoleküls oder
Wirkstoff Systems
3. von der Viskosität der diffund ierenden wässerigen Lösung
(Emulsion)
4. von der Temperatur. Wie aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich ist, hat eine globuläre "Mizelle" mit ei nem hydrodynamischen Radius von einem Centimeter ein Volumen von 4,189 cm3 und eine Phasenoberfläche von 1 2,564 cm2. Demgegenüber weisen 1Q18 Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von je nur 10-6 cm (10 nm), welche zusammen das g leiche Vol umen von 4,1 87 cm3 ausmachen , schon ei ne Gesamt-Phasenoberfläche von 1 '256,4 m2 auf.
MIZELLEN: VERHÄLTNIS VOLUMEN ZU GESAMTOBERFLÄ CHE
Kugelvol umen = — π r3 3
Kugeloberfläche = 4 π r2
Fazit: Durch die enorm grosse Phasenoberfläche, welche die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 1 bis 5 nm in Ultramikroemulsionen ausbilden, wird zusätzlich zu deren gesteigertem Diffusionsvermögen die rheologische Verteilung (Spreitung = "spreading ") und somit die Bioverfügbarkeit und Bioreaktivität der Wirkstoffe, welche in der inneren Phase der Mizellen in monomer oder oligomer agglomerierter Form vorliegen, ebenfalls stark verbessert, weil keine Marangoni-Effekte auftreten. Das kann eine beträchtliche Ermässigung der kritischen Dosierung erlauben und damit unerwünschte Nebenwirkungen ganz vermeiden oder wenigstens verringern helfen.
Die " Packungsdichte" eines spontan disperg ierbaren, stabilen MARIGENOL®- Konzentrates nimmt i n exponentieller Fu nktion mit der kleiner werdenden Teilcheng rösse der Mizellen zu . Entscheidend sind die richtige Ausbildung der inneren Phase, i hr ausgewogenes Verhältnis zum Gesamtkonzentrat und die Auswah l der je dazu passenden Tenside.
ZUSAMMENS ETZUNG der MARIGENOL®-KONZENTRATE Die erfindungsgemäss spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten : 0,1 bis 1 0 Gewichts-% einzelner Ester der Formeln (I) bis (XI), bzw. Kombinationen solcher Ester, sowie
0 bis 5 Gewichts-% einer synergistischen, pharmazeutischen oder kosmetischen Wirksu bstanz, wie i n der Patentschrift CH 683*426 (U.S . 08/179,729, erteilt 03. September 1996) im Einzelnen aufgezählt,
1 bis 25 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträgl ichen Lösu ngsmittels oder Lösu ngsmittelgem isches,
5 bis 90 Gewichts-% ei nes pharmaverträglichen Tensides oder Tensidge- misches, bis zu 1 0 Gewichts-% ei nes Vitamins oder Provitamins, bis zu 10 Gewichts-% eines Stabil isators, Radi kalfängers, biolog ischen Vektors oder Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe u nd/oder Verdünnungsmittel.
Wegen ihrer ausgeprägten Schutzwirkung auf die Wirtzelle und ih rer unmittelbaren Aktivität gegen Viren und Parasiten lassen sich zu r therapeutischen Unterstützung die nachstehend bezeichneten, in der Patentschrift CH 2239-95 besonders genannten , synergistisch wirksamen Esterverbindungen i n die erfind ungsgemässen , spontan d isperg ierbaren Konzentrate m it einarbeiten : trän s-2-B ute nsäu re-3ß-hydroxy-5 -cholestanylester
(Cholestanyl-Crotonat) lsovaleriansäure-3ß-hydroxy-5α-cholestanyl-Ester
(Cholestanyl-iso-Valerat)
1 0-Undecensäure-3ß-hydroxy-5 -cholestanyl -Ester
(Cholestanyl-1 0-Undecenoat)
Laurylsäure-3ß-hydroxy-5α-cholestanyl-Ester
(Cholestanyl-Laurat)
Palmitinsäure-3 ß-hydroxy-5α-cholestanyl -Este r
(Cholestanyl-Pa Imitat)
3ß-Stigmast-5-en-3-laurat (ß-Sitosteryl-laurat)
3ß-Stigmast-5-en-3-palmitat (ß-Sitosteryl-pa Im itat)
3ß-Stigmast-5-en-3-stearat (ß-Sitosteryl-stearat)
3ß-Stigmast-5-en-3-arachidat ( ß-Sitosteryl-arachidat) 3ß-Stigmast-5-en-3-behenat (ß-Sitosteryl-behenat)
3ß-Stigmast-5-en-3-1 0-u ndecenoat (ß-S itosteryl-1 0-undecenoat)
3ß-Stigmast-5-en-3-oleat (ß-Sitosteryl-oleat)
3ß-Stigmast-5-en-3-all trans-reti nat (ß-S itosteryl-all-trans-retinat).
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-1 0-undecenoat
[Ergosteryl-10-u ndecenoat, Provitamin D2-undecenoat]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-laurat
[Ergosteryl-Iau rat, Provitami n D2-Iaurat]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-palmitat
[Ergosteryl-palmitat, Provitamin D2-palmitat]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-arachidat
[Ergosteryl-Iaurat, Provitamin D2-arachidat]
(3ß, 22E)-Ergosta-5,7,22-trien-3-ol-al l-trans-retinat
[Ergosteryl-retinat, Provitami n D2-retinat]
10-Undecensäure-9,10-Secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol
[Vitamin D3-undecenoat, Cholecalciferyl-undecenoat,
Calciol-undecenoat]
Laurinsäure-9, 10-Secocholesta-5,7,10(1 9)-trien-3-ol
[Vitamin D3-Iaurat, Cholecalciferyl-Iaurat, Calciol-Iaurat]
Palm itinsäure-9,10-Secocholesta-5, 7,10(1 9)-trien-3-ol
[Vitamin D3-palmitat, Cholecalciferyl-palmitat, Calciol-palmitat]
Oelsäure-9,1 0-Secocholesta-5,7,10(19)-trien-3-ol
[Vitamin Dß-oleat, Cholecalciferyl-oleat, Calciol-oleat]
Reti nsäure-9,1 0-Secocholesta-5,7, 10(19)-trien-3-ol
[Vitamin Dß-all trans-retinat, Cholecalciferyl-all trans-retinat,
Calciol-al l trans-retinat]
Z-Gly-Phe-Vitamin D3
[CBO-Glycyl-L-phenylalanin-di peptid Calciol -Ester].
Die erfindungsgemäss einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische kön nen anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Bevorzugt sind sie amphoter oder nicht-ionogen und haben ein HLB-Verhältnis (d.h. eine "hydro- philic-lipophilic balance") zwischen 2 und 1 8; für Gemische liegt es vorzugsweise zwischen 2 bis 6 ei nerseits und 1 0 bis 15 anderseits. In hohem Masse bevorzugt zur Herstellung von erfi ndungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind ei nerseits Phosphorsäu reestertenside, wie z.B. : das praktisch wasserfreie Tristyryl phenolpolyoxyethylen-18-phosphor- säureester TEA-Salz-Tensid :
(Soprophor® FL, RHONE-POULENC);
Ferner.:
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. das identische Sermul® EA 188 (SERVO), ein Mischemulgator, bestehend aus je 50 % der beiden Verbindungen mit den
Formeln:
O
C9H1 (-CH2-CH2-θ7π P— °CH3 OH
O
C9H1! CH3
Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), ein Alkylphenol Polyglycolether- Phosphat-Tensid
Tensi
(Tensid 508, CIBA-GEIGY); Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Ethoxy-Phosphorsäure- ester
Butyl-mono-4-Ethoxy-Phosphorsäureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw. CH3-( CH2 )—CH-CH2-O (-CH2— CH2-O )5 -OCH,
C2 H5
OCH,
(Zerostat ® AN , CI BA-G EIGY) und anderseits Betai nverbi ndungen, d.h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z.B. :
worin Me[+] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome u nd Rx fü r C1 -32-Alkyl oder C2-32-Alkenylgruppen stehen .
Verwendung finden auch sog . "multi-functional g lucose derivatives", wie z.B.
Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesq uistearat) und G l ucamate® SSE-20 (PEG-20
Methyl-Gl ucose-Sesquistearat) von Amerchol , Edison, N.J. , U.S.A.
Gute Ergebn isse sind fallweise auch zu erzielen unter Mitverwendung von nicht-ionogenen Verbi ndu ngen aus der "TWEEN®"-Reihe (Atlas Chem. Ind.,
Inc. ; bzw. ICI Specialty Chemicals), sog. Polyoxyethylen-Sorbitan-Mono- estern oder "Polysorbate" 20 bis 85-Verbind ungen i n der CTFA Classification
[Fluka 93'773 bis 93'783].
Als Hydrotrop, bzw. als Co-Em ulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungsmittel lassen sich einsetzen, z.B. :
Ester eines aliphatischen Alkohols (C3-18) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C10-22). wie etwa Isopropyllaurat, Hexyllaurat, Decyllau rat, Isopropyl- myristat, Isopropylpalmitat und Laurylmyristat; Koh lenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C12 -32), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und 1 bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen. Mono-Ester aus Ethyleng lykol oder Propylenglykol mit ei ner aliphatischen Carbonsäure (C6 -22). wie etwa Propyleng lykolmonolaurat und Propylenglykol- monomyristat.
Ester aus einem al iphatischen Alkohol (C12.22) mit Mi lchsäure, wie z.B. Myristyl- oder vorzugsweise Lau ryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Gly- cerins mit einer ali phatischen Carbonsäure (C6.22), wie z.B. G lyceryl- capryolat, oder Miglyol® 812 Neutralöl (Oleum neutrale). Ester aus ei nem Poly(2-7)ethyleng lykolglyzerinether mit mindestens ei ner freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsäure (C6.22), wie z.B. aliphatische Alkohole (Cι2-22), somit u.a. Dodecanol , Tetradecanol, Oleyl- alkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol.
Ester m it mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-1 0)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäu re (Cβ-22). Monoether aus einem Polyethylen- g lykol mit einem aliphatischen Alkohol (C12-18). wie z.B. Polyoxyethylen (Cι o)-octylether.
Heterocyclische Verbi ndungen , wie z.B. 1 -Methyl-2-Pyrrolidon . Biotenside Ester der allgemeinen Formel (XII) :
R^COO-R 4 (XII), wori n R3 ei ne C .3i -Alkyl-, eine C3.3ι -Alkenyl- oder eine C3.31 -Alkapolyen- gruppe und R4 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten .
Alle techn ischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dispergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Ch romatog raphie über neutralem Alumini umoxyd mit einem inerten Lösungsm ittel wie z.B. Tetrahydrofuran, Ethylalkohol oder Dichlormethan gerei nigt.
Als Zusätze in die erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren Konzentrate eignen sich Vitamine und Provitamine (wie z.B. Vitami n A-Säure, Retinol, To- copherole), sowie auch ausgewählte Penetrationsverbesserer ("Fl ux enhan- cers") und Radikalfänger.
HERSTELLUNG a) Herstellung von 3-O-AII-trans-Retinoyl Oleanolsäure
Zu 600 mg AII-trans-Retinsäure in 50 m l Dioxan oder Chloroform gibt man bei 15°C unter Luftabschluss 650 mg N,N'-Carbonyld iim idazol. Die Reaktionslösung wird bei 15°C während 24h stehen gelassen . Anschliessend wird die Lösung mit dem entstandenen AII-trans-Retinsäure-lmidazolid bei 20°C zu einer Lösung von 900 mg Oleanolsäure, 60 mg Dimethylformamid und 50 mg p-Dimethylami nopyridin in 50 ml Dioxan oder Ch loroform zugetropft. Nach 3- stündiger Erwärmung auf 40°C wi rd das Lösungsmittel durch Vaku umdestillation entfernt. Der Rückstand wi rd i n Essigester oder Dichlormethan aufgenommen , neutral isiert, getrocknet und dan n auf einer Aluminiumoxydsäu le (neutral, Brockman n Aktivität I) mit Cyclohexan/Essigester oder Methylcyclo- hexan/Dichlormethan (90: 10, bzw. 98 :2) als Elu iermittel chromatographiert. Man erhält das Produ kt 3-all-trans-Retinoyl-Oleanolsäure. Smp. 147, 5-149, 5°C; Rf.-Wert auf DC Hexan/Essigester (90: 10): 0,75.
In vergleichbarer Weise können auch folgende Verbindungen hergestellt werden :
3-O-all-trans-Retinoyl Glycyrrhetinsäure,
Smp. 159-160,5 °C; Rf.-Wert auf DC Hexan/Essigester (90: 1 0): 0,70.
3-O-Linoleoyl Glycyrrhetinsäure
3-O-Linolenoyl Glycyrrhetinsäure
3-O-Li noleoyl Oleanolsäure
3-O-Linolenoyl Oleanolsäure
b) Herstellung von 3-O-(10-Undecenoyl) Oleanolsäure
Zu 900 mg Oleanolsäure und 75 mg Dimethylformamid in 50 ml Toluol werden bei 20°C 600 mg 10-Undecenoylchlorid in 30 ml Toluol zugetropft. Die Reaktionslösung wird am Rückfluss während drei Stunden auf 60°C erhitzt. An- schliessend wird das Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt. Der Rückstand wird auf einer Silicalgelsäule mit Cyclohexan/Essigester (95 :5) als Eluiermittel chromatographiert. Man erhält das Produkt:
3-O-(10-Undecenoyl) Oleanolsäure, mit einem Brechungsindex (Bl) von 1 .44455. In vergleichbarer Weise können auch hergestellt werden :
3-lsovaleroyl Oleanolsäure, Bl 1.43150
3-O-Lauroylester Oleanolsäure, Bl 1.43150
3-Oleyl Oleanolsäure
3-Lauroyl Glycyrrhetinsäure
3-Oleyl G lycyrrhetinsäure
3,28-Diundecenoylbetulin
3,28-Dilauroylbetulin
3,28-Dipalmitoylbetulin
c) Herstellung von 3-0, 28-O-Dilauroylbetulin
In einem trockenen Dreihalskolben, versehen mit Magnetrührer, Einlass für Schutzgas, Kühler und Septum wurde die Lösung von 347 mg Betulin in 4 ml abs. Pyridin mit einigen Kristallenen 4-Dimethylaminopyridin versetzt und dann auf 0°C gekühlt. Hierauf erfolgte die tropfenweise Zugabe von 0,3 ml Lauroylchlorid d urch das Septum mittels einer S pritze. Nach dem Entfernen des Kühlbades wurde die Lösung unter ständigem Rühren auf Raumtemperatur gebracht. Nach 12 h wurde sie mit Benzol verdünnt, dann die S uspen- sion filtriert und das Filtrat mit H20, 2N H2S04 und Sole ausgewaschen und die Benzollösung über Na2S04 getrocknet.
DC auf Kieselgel mit Essigester/Toluol/Aceton 11:9:1 und Besprühen mit dem Cer-Ammoniummolybdat-Reagens ergab für Betulin einen Rf-Wert von 0,03 und für das Dilaurat einen solchen von 0,93.
Die weitere Reinigung erfolgte durch Säulenchromatographie an basischem Alox, Aktivität II. Ausbeute 83% an blassgelbem, sehr viskosem Oel nach Trocknen bei 50°C und 0,01 Torr. IR (CH2CI2) : 1722 cm- ss
CIMS (NH3) : m/z 624,2 (6,2%; M+ +1 von Allobetulinlaurat); 608,2 (46,4, M+ +1 - Laurinsäure); 607,2 (100%, M+ - Laurinsäure); 407,2 (31,65% M+ - 2 Laurin- säure); 409,2 (5,32%, M+ von Allobetulinlaurat - Laurinsäure). {Bei der HV-Destillation tritt teilweise Abspaltung von Laurinsäure und Um- lagerung in Allobetulin ein}.
1H-NMR (CDCI3), 300 MHz): 4,69 (d, J=2,1 , 1H von C = CH.2); 4,60 (q, J = 1,3 , 1H von C=CH.2); 4,48 (d,d, J=9,5 und 10,6 (H-C(3)); 4,27 (d, breit, J = 10,3 , 1H von H2-C(28); 3,84 (d, J = 11,0, 1H von CH2; 1,69 (s, CH3(29); 1,26 (s, Rest der (CH2)-Protonen.
13C-NMR ; 174,3 und 173,7 (je ein Lauroyl-CO), 150,2 (C(22)); 109,8 (C(30)); 80,6 (C(3)); 62,5 (C(28)).
d) Herstellung von 3-O-Lauroylbetulin
Die Darstellung erfolgt aus 30,280-Dilauroylbetulin analog einer Vorschrift von L. Ruzicka et al. [Helv.Chim.Acta 1938, 21_, 1708]: die Lösung von 495 mg 3,28-Di-O-lauroylbetulin in 3 ml Benzol wurde mit 6,25 ml 0,1N KOH in Etha- nol versetzt und unter Rühren während 12h bei 50°C gehalten. Die klar gewordene Lösung gaben wir auf eine Kieselgelsäule (Kieselgel Merck, 0,04 - 0,063 mm/2, 6 x 43 cm, nass gefüllt mit Essigester/Benzol/Aceton 11:9:1). De- tektion der gesuchten Substanz mit dem Cer-Ammoniummolybdat-Reagens. Das Monolaurat hat einen Rf-Wert von 0,84. Ausbeute 280 mg farbloses, sehr zähes Oel, das beim Trocknen bei 50°C/0,01 Torr langsam zu einer halbfesten Masse erstarrt.
Rf (Kieselgel Merck, AcOEt/Toluon/Aceton 11:9:1) : 0,84. Zum Vergleich: Betulin 0,63; 3,28-Di-O-Lauroylbetulin: 0,94. IR (CH2CI2) : 3615 (OH frei), 2930, 2858, 1720; (CHCI3) : 3627, 3492, 2954, 2856, 1717.
CIMS / NH3) : m/z 425,3 (100%, M+ +1 - Laurinsäure);
1H-NMR : weitgehend analog zu dem von c), charakteristisch sind die Signale von H2-C(28) bei 3,80 (d,d, J = 1,5 und 10,8), und bei 3,34 (d, J = 10,8) e) Herstellung von 3-O-Lauroylallobetuli n
Allobetulin wurde nach der Vorschrift von H. Schulze und K. Pieroh (Ber. Deutsch. Chem . Ges., 1922, 55_, 2332) dargestellt. Je 0,31 und 0,47 g von reinem Allobetu lin wurden in 2 ml abs. Pyridin und 10 ml 1 ,2-Dichlorethan gelöst, dann mit einigen Kriställchen 4-Dimethylaminopyridin versetzt und bei RT via Spritze m it je 1 ,2 Äquivalenten Säurechlorid tröpfchenweise versetzt. Nach 2 h bei RT wurde während 30 m in. auf 50°C erwärmt, dann gekühlt, mit genügend Et2θ versetzt und mit Wasser, 2N HCI und Kochsalzlösung ausgeschüttelt. Nach Trocknen ü ber Na2Sθ4, Filtrieren und Eindampfen wurde in Benzol aufgenommen und die Lösung durch eine kurze Säule von aktiviertem Aluminiumoxid filtiert und das Filtrat eingedampft.
3-O-Lauroylallobetulin (n = 10) : farbloses, zähes Öl , das im Vaku um allmählich erstarrt. Rf 0,85
IR (CH2CI2) : keine OH-Banden , 2925, 2855, 1 720 ( Estercarbonyl) CIMS (NH3) : 425,3 (100%, M+ +1 - Lau rinsäure) ; NMR: analog zu 3-O-Palmitoylbetulin (n = 14)
3-O-Palmitoylallobetul in (n = 14): farblose Kristalle aus Tetrahydrofuran/Pen- tan/Methanol, Smp. (Vak.) 185-189°C; Ausbeute 82%. Rf Laurat : 0,92, Palmitat 0,93 (Allobetulin 0,72, Betulin 0,65) IR (CHCI3) : keine OH-Banden, 2959, 2927, 2855, 1 717 ; (CH2CI2) : keine OH- Banden, 2950, 2931 , 2855, 1767, 1720.
1 H-NMR (CDCI3), 300 MHz, Auswah l von strukturbeweisenden Signalen): 4,487 (d,d, H-C3)); 3,775 und 3,444 (je d , J=8,2 , H2-(28)) ; 3,530 (s breit, H-C(19)); 2,294 (t, J = 7,3 , α-CH2).
CIMS (NH3) : 425,4 m/z (1 00%, M + 1 - Palmitinsäure); 13C-NMR : 171 ,4 Palmitoyl-CO); 87,8 (C(3)); 71 ,2 (C(28)); 80,4 (C(19).
f) Herstellung von 3-O-Palmitoyl-Betulinsäure-Methylester
Aus reiner Betu linsäure wurde der Methylester durch Verestern ihrer Lösung in THF/MeOh m it frisch hergestellter etherischer Diazomethanlösung im Ü ber- schuss hergestellt (vgl. V. Bruckner, J . Koväcs, J. Kozka, J.Chem.Soc. 1 948. 948). Die Lösu ng von 0,62 g reinem Methylester in 2 m l abs. Pyridin u nd 10 ml 1 ,2-Dichlorethan wurde mit wenig 4-Dimethylaminopyridin versetzt und hierauf wie oben unter e) acyliert und aufgearbeitet. Erhalten wurden 0,75 g farbloses, sehr zähes Öl , das bei RT nicht kristall isierte. Rf : 0,91 (Betulinsäuremethylester 0,74) IR (CHCI3) : 2928, 2855,171 9, 1641 , 1465. In entsprechender Weise kann auch der Methylester der Oleanolsäure, der 18ß-Glycyrrhetinsäure (Enoxolon), bzw. der Ursolsäure hergestellt und an O- C(3) mit einer aktivierten, gesättigten oder ungesättigten Carbonsäure acy- liert werden. Vgl. dazu auch A. Winterstein, W. Hämmerle, Z.Physiol.Chem., 1931, 199.71.
g) 3-O-Palmitoyloleanolsäuremethylester (n = 14)
Farblose Kristalle aus Diisopropylester/Pentan, Smp.62-63°C, Rf 0,88 (Oelanolsäuremethylester 0,69; Oleanolsäure 0,60). IR (CHCI3) : 2928, 2855, 1717, 1464.
h) 3-O-Palmitoylglycyrrhetinsäuremethylester (n = 14)
Farblose Kristalle aus Diisopropylether/Pentan; Smp. 130°C.
UV (CH2CI2) : λmax 247 nm (ε 14'500)
IR (CHCI3) : keine OH-Banden, 2928, 2855, 1722, 1653, 1465 cm-
CIMS (NH3) : 724,6 m/z (50%, M+ +1), 723,5 (100%, M + ), 467,4 (14%, M+ -
Palmitinsäure).
1H-NMR (600 MHz, CDCI3), Auswahl von Banden): 5,662 (s, H-C(12); 4,48 (dd,
J = 11,3 und 5,0, H-C(3); 3,68 (s, OCH3); 2,80 (m, H-C(18); 1,254 (s, CH2).
13C-NMR : 200,0 (C-11); 176,9 (C-30), 173,6 (Palmitoyl-CO); 169,1 (C-13); 128,5
(C-12); 80,2 (C-3); 51,7 (OCH3).
ZUSAMMENSETZUNGSBEISPIELE von erfindungsgemässen, spontan dispergierbaren KONZENTRATEN, welche die Wirkstoffe der Formeln (I) bis (VI) enthalten und welche, wen n sie mit Wasser oder 5%-iger G lucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung (Ringerlösung) verdünnt werden , thermo- dynamisch stabile ULTRAMIKROEMULS IONEN mit ei nem hyd rodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm ergeben.
g) 0,1 bis 10 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von ausgewählten pentacyclischen Triterpenverbindungen der Formeln (I) bis (XI),
0 bis 5 Gewichts-% ei ner bekannten , pharmazeutsichen Wirksu bstanz,
1 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Neutralöl , wie z.B. Mig lyol® 81 2 (DYNAMIT NOBEL oder HÜLS),
0 bis 45 Gewichts-% eines Phosphorsäureester-Tensides, wie z.B. Diphasol® 3873 (CI BA-GEIGY), Tensid 508 (CIBA-G EIGY), Zerostat® AN oder AT (CIBA- GEIGY), Tinovetin® JU (CIBA-G EIGY), Soprophor® FL (RHÖNE-POULENC), 5 bis 90 Gewichts-% Invadin JFC 800 % (CIBA-GEIGY) und/oder Tween®-20 (ICI S pecialty Chemicals), bis zu 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins. bis zu 1 0 Gewichts-% eines Stabil isators, Radikalfängers, biologischen Vektors oder Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel .
h) 0,5 bis 5 Gewichts-% eines oder mehrerer Wirkstoffe der Formeln (I) bis
(XI),
5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen
Formel (XIII) :
R— COO— R 5 (X| | |) worin R4 eine C2-3i -Alkyl-, eine C3.3i -Alkenyl- oder eine C3-3ι -Alkapolyen- gruppe und R5 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten.
30 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% und/oder Tween®-20, 30 bis 45 Gewichts-% Soprophor® FL oder Diphasol® 3873.
N.B.: INVADIN® J FC 800% (CI BA-GEIGY) ist ei n wasserfreies tert. Octylphe- nylpolyoxyethylenether-Tensid mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen. TWEEN®-20 ist ei n Polyoxyethylen-(20)-sorbitan-monolaurat, bzw. das Poly- sorbate-20 in der CTFA-Classification. BEISPIEL für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemässen Konzentraten in der Form von "multiple units". i) Granulierung
Metolose® 90 SH-4000 (SHIN-ETSU CHEMICAL) 90.0 g
Avicel® PH-101 80.3 g
Erfindungsgemässes MARIGENOL®-KONZENTRAT 139.4 g
Aerosil® 200 80.3 g
Σ 390.0 g
Granulieren/formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40 °C.
k) MSR- und RETARD-Ausrüstung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (SHIN-ETSU CHEMICAL) und Talk
I) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets
Kernmaterial 44 %
Erfindungsgemässes MARIGENOL®-KONZENTRAT 25 %
MSR-Beschichtung 31 %
Σ 100 %
N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemass a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1:1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzögerten Abgabe (Retard) angemessen steuern.
BIOLOGISCHE PRÜFUNGEN
Die antitumorale/antivirale/antiparasitäre Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wi rkstoffen gemass den Herstellungsbeispielen a) bis e), sowie den Aufarbeitungsbeispielen f) und g) wi rd anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt:
1. In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien
Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiter- platten und Verdün nungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 1 θ4/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum inaktiviert (GIBCO); sie werden so u ndicht ausgesät, dass sie während des Assays in nichtkonfluenten Monolayers wachsen kön nen . Die Probenzugabe erfolgt nach 6 bis 24 Stunden , mit 100 μl pro Reihe, die man dann im 1 . Loch mit 100 μl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen u nd in das folgende Loch ei ngebracht, wieder mit 100 μl Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdü n nungsreihe n1/..
Die Proben werden im Plaque Assay wäh rend 3 bis 5 Tagen bei 37°C mit 31Λ% CO2 inkubiert. Anschliessend färben/fixieren mit 0,1 % Kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70% Methanol, 1 % Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen , Verg rösserung 300-fach. Man bestimmt d ie g rösste cytotoxische Verd ünnung. Die quantitative Auswertung lässt sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessung am S pektrophoto- meter vornehmen .
2.0 Prüfung auf Zytotoxizität
2.1 Zytotoxizität der MARIGENOL®-KONZENTRATE geprüft an Py6-Zel len (Virus infizierten 3T3 Maus-Fibroblasten)
FORTSETZUNG
') 72 h Verdünnungen: Erste Zeile auf Konzentrat berechnet
Zweite Zeile auf Aktivsubstanz-Gehalt berechnet
WIEDERHOLUNG in-vitro Test auf Py6-Zellen
N.B. Verdünnungen: Obere Zahl auf Konzentrat berechnet
Untere Zahl auf Wirksubstanzgehalt berechnet 3.0 In-Vitro-Prüfung mit humanen Tumor-Zeil-Linien
VITALITÄTSTEST mit humanen Tumorzell-Linien 1% Konzentrat mit 3-O-Lauroyl-Oleanolsäure Proliferationstest (Tritium: 1 μCi/pro well H + )
Verdünnungen LC 89 U 937 T O M cpm % cpm % cpm %
10-2 474 16 583 0.3 788 0.4
10-3 775 26 1*370 0.7 8*328 4.4
10-4 7*265 (?) 250 88*61 45.5 17'766 9.5
10-5 2*782 95 175*127 89.7 22*895 12.2
10-6 2'926 100 191*432 98.0 46*602 24.8
10-7 3*800 131 198*796 101.0 159'207 84.9
cpm-Kontrollen 2'906 195*125 187*601 Zeil-Linien: LC 89: Lungenadenocarcinom
U 938: Leucemia mieloide acuta
TOM: Melanoma umano
AUSWEIS: %-Vitalität nach 48h mit 1% MARIGENOL®-KONZENTRATEN, als wässerige Ultramikroemulsion dem Medium einmalig beigegeben. Bei der Beurteilung beachte man die verhältnismässig kurze Expositionszeit. Tests durchgeführt von Dottoressa Anna-Rita Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica, Torino, März-April 1995.
3.1 Übrige Befunde
Zu den für die unveresterten Grundkörper von Lupeol, Betulin, Betulinsäure und Ursolsäure festgestellten pharmakologischen Wirkungen vgl. u.a.:
Bhattacharyya J. et al., Phytochemistry, 1976, 15, 431.
Aszalos Adorjan: "Antitumor Compounds of Natural Origin", CRC Press, Boca
Raton, Florida, 1980, N° 220, 221, 222, 224.
Recio Maria delCarmen et al., Planta Medica, 57 (1991)
Yasukawa K. et al., Oncology 48, 72-76
Macias F.A. et al., Phytochemistry, 1994, 36_, 1369 Recio Maria delCarmen et al. : "Investigations on the Steroidal anti-inflamma- tory Activity of Triterpenoids from Diospyros leucomelas", Planta Medica, 61 (1995) pp. 9-12
Pisha Emily et al. : "Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of h uman melanoma that fu nctions by induction of apoptosis", Nature Medicine 1 , (1995), 1046-51 .
Vgl. auch : O. Gessner: " Die Gift- u nd Arzneipflanzen von Mitteleuropa", Verlag Winter, Heidelberg , 1953.
Betulin macht in der weissen Rinde von Betula platyphyl la bis zu 35% des Trockengewichtes aus. [K. Hi rota et al., Chem .Abstr. 1948, 42., 6090], was nahelegt, dass es dort eine Schutzfunktion fü r d ie Pflanze übern immt. Der Extrakt aus der trockenen Destillation diente als Heilmittel fü r verschiedene Anwendu ngen , sowie als "Bi rkenteer" zu r Herstell ung des berühmten russischen J uchten leders.
Therapeutisch ganz besonders bedeutsam scheinen u nter den pentacycli- schen Triterpenverbindungen der Lupanreihe die Wi rkungen der Allobetulin- Monoester, deren G rundgerüst mit seinen fünf anellierten , trans-konfigu- rierten Cyclohexanringen und mit der polaren Hydroxylgruppe auf der einen und dem diagonal dazu stehenden Tetrahydrofuran ri ng auf der anderen Seite über einen ausgesprochen flachen Molekülbau verfügt. Dessen Zentralteil ("Core") wird in seiner Lipophilie durch die sen krecht stehenden Methylgruppen noch verstärkt, während gleichzeitig die hyd rophilen (polaren) Gruppen des Moleküls an entgegengesetzten Seiten des "Core"-Tei ls zu liegen kommen. Damit ist eine Bindung an relativ entfernt l iegende polare Gruppen des Rezeptors möglich geworden . Der Mittelteil dient demnach gewissermas- sen als "Spacer" ; er übernimmt die Haftu ng' an ausgedehnte lipophile Bezirke.
3.2 APOPTOSE TEST mit Py6-Virus transformierten Mausfibroblasten
%-Zellvitalität
Cytofluor 2300 System; Inkubation 72h, Alama blue; Platte CoStar 96 Behandlung: 46 h; Messung EX Filter 530/25; EM Filter 590/35, Sensitivity 2
Konzentrat Verdünnungen: 1:10*000 (100 ppm) bis 1:160*000 (6,6 ppm) Wirksubstanzgehalt: 1 ppm bis 67 ppb
Versuch durchgeführt beim STI, Basel, 15. bis 20. Dezember 1996 (File 201296-001/03).
4.0 Prüfung auf Stimulierung der Immunresponse
Mit humanen Tumorzellen (Lungencarcinom LC 89)
cpm 27*360, Exposition 48 h Tests durchgeführt von Dottoressa Anna-Rita Guarini, Universitä degli Studi di Torino, Clinica medica, Torino, 21.-24.3.1995
5.0 Prüfung auf antivirale Wirkung.
5.1 Prüfung auf Schutz- und antivirale Wirkung gegenüber sensitiven MT4- Zellen, infiziert mit dem AIDS-VIRUS HIV ("Human Immunodeficiency Virus"). Die Tests wurden am Institut für Infektionskrankheiten der Universität Turin vorgenommen (Direktor: Prof.Dott. P. GIOANNINI), und von Prof.Dott. Alberto BIGLINO, Leiter der Abteilung für Infektionskrankheiten am Ospedale di Asti, U.S.L. 19, unter Mitarbeit von Dotta. Brunella FORNO und Dotta. Annamaria POLLONO durchgeführt. Juni/Juli 1994 und März/April 1995.
5.2 Schutzeffekt auf die Wirtzellen (MT4-Lymphozyten)
MT4-Zellen (eine eternalisierte T-Zell-Linie, welche sehr empfindlich gegen den HIV zytopathogenen Effekt "CEP" ist) aus einer 24h-alten Kultur wurden bei einer Konzentration von 2x1θ5/ml suspendiert, in 1.2 ml aliquote Teile in Polypropylen Röhrchen aufgeteilt und mittels Zentrifugierung pelletiert. Die Pellets wurden dann entweder infiziert mit 200 μl einer Stammlösung von HIV III B Zellen (Titer: 600 CCIDso/ml) oder scheininfiziert mit reinem Medium, für 90 Min. bei 37°C inkubiert und anschliessend mit 1 ml reinem Medium versetzt, um die anfängliche Zellkonzentration wieder einzustellen und die HIV- Konzentration auf 100 CCIDδo/ml zu bringen. [CCIDso/ml = 50% cell -culture mfective d.ose].
100 μl-Volumina der im Test eingesetzten MARIGENOL®-Konzentrate, verdünnt zu wässerigen Ultramikroemulsionen 10-3 und dann zusätzlich verdünnt von 10-3 auf 10-5 mit Medium RPMI 1640, wurden dreifach eingebracht in flachbödige Mikrotiterplatten mit 96 Löchern. In jedes Loch wurden 100 μl der HlV-infizierten oder der scheininfizierten MT4-Kultur eingegeben, um so 4 Versuchsreihen aufzustellen:
- einfache Kultur (Kontrollen; Prüfung auf Lebensfähigkeit der MT4
Zellen: 1θ5 Zellen/ml oder 2x1θ4/Loch)
- Kultur + HIV (Virus CPE-Kontrolle; Konzentration 50 CCIDso/ml oder
10 CCIDso/Loch)
- Kultur + Wirksubstanz in Mikroemulsion
- Kultur + HIV + Wirksubstanz-Mikroemulsion in den
Verdünnungen 10-3 bis 10-5 ( = 1'000 ppm, 100 ppm und 10 ppm, bzw. 10 ppm, 1 ppm und 0.1 ppm W.S. -Gehalt) Inkubation der Kulturen bei 37°C in einer Atmosphäre von 5% CO2 + 95% Luftfeuchte. 5 Tage nach der Infektion werden 100 μl der Überstandes in jedem Loch entfernt und die Lebensfähigkeit der Zellen mithilfe eines Methyltetra- azolsalzes überprüft (MTT, Sigma, 25 μl/Loch in 5 mg/ml Lö-sung), in einem 2-h Inkubationstest, dem sich eine Solubilisierung mit 100 μl DMSO/Loch und die photometrische Ablesung auf optische Dichte bei 550 nm anschliesst. Restwerte der Zeil-Vitalität (Überlebenstest) werden ausgedrückt als %-Dif- ferenz gegenüber den HIV CPE-Kontrollen, das Mittel als Null gesetzt. Der gemessene Titer ist Dosis-abhängig. Er sinkt vom Anfangswert von 300% CCID50 auf 120% CCID50 und bis auf 2% CCID50.
Die beste Schutzwirkung auf die Wirtzellen wurde bislang mit einem 1%-igen Konzentrat von ß-Sitosteryl-Palmitat bei einer Konzentration von 10-4 (= 100 ppm Konzentrat in wässeriger Ultramikroemulsion) erzielt; sehr beachtenswert sind auch die Ergebnisse mit 1%-igen Konzentraten, enthaltend ß-Sito- steryl-Caproylat, ß-Sitosteryl-Laurat, ß-Sitosteryl-Arachidat oder ß-Sitosteryl- Behenat.
5.3 Wirkung auf die HlV-Infizierbarkeit. (Virulenz, direkte antivirale, bzw. viruzide Wirkung gegen die erworbene Immunschwäche, das humane "Aquired Immuno-Deficiency Syndrome: AIDS", bzw. gegen pathologisch wirksame Pri- onen).
Aliquote Mengen von 2 klinisch aufbereiteten Präparaten von Aids-Patienten ("Isolates" mit den Stämmen 21/4 und 4/5) wurden in vollständigem RPMI Medium bei einem Titer von 300 CCIDso/ml resuspendiert und während 3 h bei +4°C inkubiert mit einem MARIGENOL®-Konzentrat, als Mikroemulsionen in komplettem Medium auf die Konzentratioen 10-2 bis 10-5 verdünnt, und sodann zusammen mit einem "leeren" Trägerkonzentrat und mit reinem Medium allein auf ihre Wirkung geprüft.
Nach der Vorinkubation wurde der HIV Titer mittels der CCIDso-Methode erfasst (CCID50 = cell c_ulture mfective d_ose 50 %). Von jeder der 6 Virus-Suspensionen wurden kurz zweifache Reihenverdünnungen angefertigt, wovon je 200 μl während 90 Min. mit MT4-Zellen Pellets inkubiert wurden, wie oben angegeben (Siehe 5.1). Am Schluss der Inkubierung werden die Pellets auf die ursprüngliche Zellkonzentration gebracht, indem man jeder Probe die nötige Menge Medium zufügt und sie anschliessend mit je 200 μl in 8 Löcher einer Mikrotiterplatte einbringt. Nach der Inkubation während 5 Tagen wird die Vitalität der Zellen mittels MTT-Test gemessen, wie oben dargestellt. Der HIV Titer wird als reziproker Wert jener Verdünnung angegeben, welche 4 von 8 Proben einer Reihe (50%) infiziert. Der Inhalt eines Lochs gilt als infiziert, wenn die Ablesu ng der O.D. bei 550 nm tiefer ausfäl lt als das Mittel der 8 Kontoll-Löcher mi nus 2.8 Mal die Standard-Abweichung (untere 95% Vertrauensgrenze). Mit den Wirksubstanzen Ergosteryl-1 0-U ndecenoat und ß-Si- tosteryl-Palm itat lässt sich in-vitro als Folge der Vorbehandlung der Stämme eine sehr deutl iche Repl ikationshemmung und ei ne eigentliche Elimination feststellen . Ihre Abweh rwirkung gegen eine Infektion ist Dosis-abhängig. Gar keine Hemmung trat nach der Behandlung mit reinem Carrier-Konzentrat allein ein.
Auswertu ng der Prüfergebnisse :
TESTSUBSTRAT RESTWERTE im
HIV-TITER (CCID50)
(Mittelwert aus
3 Kulturen)
HIV-Stamm 21 /4 ("Cli nical isolate") + 300
Medium
HIV-Stamm 4/5 ("Cli n ical i solate") + 200
Medium
HIV (2 Stämme) + 200
CARRIER-KONZENTRAT (Mittlerer Titer aus 2 Stämmen)
HIV (2 Stämme) + 25
ERGOSTERYL-1 0-U NDECENOAT (Mittlerer Titer aus
KONZENTRAT 1 *000 ppm 2 Stämmen)
WIRKSUBSTANZ 10 ppm
HIV (2 Stämme) + 2 ß-SITOSTERYL-PALM ITAT (Mittlerer Titer aus
KONZENTRAT 1 *000 ppm 2 Stämmen)
WIRKSUBSTANZ 10 ppm
HIV (2 Stämme) + 50 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (Mittlerer Titer aus
KONZENTRAT 1 00 ppm 2 Stämmen)
WIRKSUBSTANZ 1 ppm
HIV (2 Stämme) + 76 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (Mittlerer Titer aus
KONZENTRAT 50 ppm 2 Stämmen)
WIRKSUBSTANZ 0.5 ppm
HIV (2 Stämme) + 120 ß-SITOSTERYL-PALMITAT (Mittlerer Titer aus
KONZENTRAT 10 ppm 2 Stämmen)
WIRKSUBSTANZ 0.1 ppm
Restwerte des H IV-1 Titers nach Vorinkubation während 3 h bei + 4°C Für die angewandte Prüfmethodik vgl. u.a.: Rudi Pauwels, Erik De Clercq et al.: "Sensitive and rapid assay on MT-4 cells for detection of antiviral com- pounds against the AIDS virus". Rega Institute for Medical Research, Katho- lieke Universiteit Leuven, 3000 Leuven, Belgium, Elsevier Science Publishers
B.V. (Biomedical Division), 1987 (0166-0934/87/503.50); J.Virol. Methods 1987;
16, 171-85.
A. Bergamini, C.F. Perna, et al.: A tetrazolium-based colorimetric assay for quantification of HlV-induced cytopathogenicity in monocyte-macrophages exposed to macrophage colony-stimulating factor. J.Virol. Methods, 1992:
40(3), 275-86.
Jay A. Levy: "HIV research: a need to focus on the right target", The Lancet, Vol.345, June 24, 1995, pp.1619-21.
Molecular Cell Biology, second Edition, by J. Darneil, H. Lodish, D. Baltimore; Scientific American Books, Chapter 5: Viruses, Structure and Functions, pp.177-188. New York, 1990 (W.H. Freeman & Co.)
6.0 Andere Viren
6.1 Cytomegalie-Virus (CMV)
Die Prüfung wurde mit humanen, embryonalen Lungenfibroblasten als Wirtzellen vorgenommen, die dann mit dem CMV-Stamm AD 169 infiziert wurden. Der Stamm "CVM umano AD169" wurde während 4h bei +4°C mit unterschiedlichen Konzentrationen der Prüfsubstanz Cι6:o-ß-Sitosterylester, formuliert als 1%-iges Konzentrat und dann verdünnt zu einer wässerigen Mikroemul- sion 10-3, 10-4 und 10-5, inkubiert und daraufhin als vorbehandelte Virus- Suspensionen auf Kulturen von menschlichen, embryonalen Lungenfibroblasten überimpft. Ansatz als konfluente Kultur mit 120*000 Zellen pro shell- vial. Die Infektion wurde mittels Zentrifugation während 45 Minuten bei 1500 rpm und bei RT vollzogen, worauf die Injektionssuspension entfernt und 1 ml Kulturmedium MEM mit 2% fötalem Kalbserum (wie bei der Anzucht) beigegeben wurde; die infizierten Zellen wurden sodann während 20h bei 37°C und unter 5%-iger Cθ2-Atmosphäre gehalten.
Am Schluss der Inkubation wurde das Medium entfernt, die Zellen gesammelt, mit 2% Aceton-Methanol (2:1) fixiert und 3 Mal mit PBS gewaschen. Die Quantifizierung erfolgte mittels Immunofluoreszenz-Messung. Die Vials wurden mit dem monoklonalen Antikörper "Anti-P-72 CMV" (einem unmittelbaren Vorläuferprotein des CMV, das schon nach 6 h in den infizierten Zellen nachgewiesen werden kann) versetzt und während 30 Minuten bei 37°C in feuchter Atmosphäre inkubiert. Es folgten 3 Waschungen in PBS, eine zweite Inkubation mit dem Fluoreszenz-markierten Antikörper IgG Ziege anti-IgG Maus. Es schliesst sich eine nochmalige Inkubation während 30 Minuten bei 37°C, wie oben angegeben , an, gefolgt von einer 3-maligen Waschung mit PBS . Die Proben werden dann mit 50% Glycerol i n PBS auf Glasträger montiert.
Gleichzeitig wurden Kontrollen aufbereitet mit infizierten Zellen, die unter gleichen Bed ingu ngen , aber ohne Vorbehandlung mit der Prüfsubstanz aufbereitet worden sind.
Gezählt werden die für das CMV-spezifische Antigen positiven Nuclei , mithilfe eines Fluoreszenz-Mikroskopes bei 25-facher Vergrösserung in wässeriger Phase.
Es lässt sich ganz eindeutig eine Dosis-abhängige, direkt viruzide Wirkung feststellen. Das Virus ist nicht mehr virulent genug , um die empfindl ichen Wirtzellen zu infizieren .
ERGEBNIS :
VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-PALMITA TES
(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)
Anzahl der "Nuclei positivi per P-72" (der infizierten Fibroblasten)
Prüfungen d urchgefü hrt von Dottoressa Rossäna CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä di Torino, J uli-November 1 995.
6.2 Herpes-Virus (Herpes Simplex, HSV)
Die antivirale/viruzide Wirkung einer wässerigen Mikroemulsion von geeigneten MARIGENOLΘ-Konzentraten wird mithilfe einer konfluenten Monolayer- Kultur von VERO-Zel len (d.h . "African green mon key kidney cells") festgestellt. Die Wirtzellen werden während 3 h bei 4°C mit der Mikroemulsion oder mit dem Ku lturmedi um allei n vorbehandelt und dann mit einer konstanten Dosis von 104 Herpes Simplex Viren , sog. "plaque forming units" = PFU infiziert. Dauer der Virus-Absorption 1 h. Dan n Zugabe von 2% Methylcellulose zur Verhinderu ng der Spreitung des Virus; es entsteht ei n elastisches Vlies im Kulturmedium MEM + 2% Kalbserum . Anzüchtung wäh rend 48h , dann Fixieren und Färben der Monolayers mit 1 % Kristallviolett i n Methanol. Die antivirale Wirkung korreliert mit der Zahl von "pIaques" von lysierten Zellen , die sich im Kulturmedium MEM + 2% FCS noch bilden . Die Herabsetzung des viralen Titers wird im %-Verhältnis zu den Kontrollen (21 PIaques pro Zelle) angegeben.
Als Prüfsubstanzen wurden folgende Konzentrate i n wässeriger Verd ünnung (ausgehend von einer Mikroemulsion 1 : 100) eingesetzt:
1 % C2o:θ-ß-SITOSTERYL-ESTER
1 % QUERCETIN-PENTA-10-U NDECENOAT
1 % C16 :o-ß-SITOSTERYL-ESTER
1 % C 2 :o-ERGOSTERYL-ESTER
Auswertung :
Die Ergebnisse zeigen eine deutliche direkte Wirkung auf die HS-Virus- infizierten VERO-Wirtzel len. Bei einer Konzentration von 10-4 ß-Sitosterylara- chidat erscheint die Zah l der PIaques, im Verg leich mit den Kontrollen, um
76% herabgesetzt. Der HSV-Titer ist deutlich vermindert.
Bei dieser Konzentration der geprüften S ubstanzen findet auch keine
Lysierung von eternalisierten Lym phozyten vom Typus MT-4, noch der VERO-
Zellen selber statt. (Siehe oben unter 5.0)
Prüfungen durchgefü hrt von Dottoressa Rossana CAVALLO, Istituto di Micro- biologia, Universitä deg li Studi d i Torino, Juli 1995.
6.3 Herpes-Virus (Herpes Sim plex, HSV)
Wiederholu ng der Prüfung mit Fluoreszenz-Markierung wie beim CMV-Ver- such. Vg l. oben. Ergebnis: VIRUZIDE WIRKUNG des ß-SITOSTERYL-ARACHIDATES
(als MARIGENOL®-KONZENTRAT formuliert)
6.4 Hepatitis B Virus (HBV)
Die Tests wurden mit immortalisierten Leberhämatom-Zellen vorgenommen, die nach Infektion mit dem Hepatitis B Virus die beiden Antigene Hbs Ag (ein "surface antigen" aus der äusseren Hülle des Virus) und Hbe Ag (ein "core antigen" aus dem Kern des DNA Virus) sezernieren. Orientierende Versuche in-vitro wurden mit je einem 1%-igen Konzentrat der drei Prüfsubstanzen ß- Sitosteryl-Palmitat, ß-Sitosteryl-Arachidat und Ergosteryl-Isovalerat von Prof. Dott. Antonio Ponzetto und von Dotta Rossana Cavallo, Universitä degli Studi di Torino, durchgeführt .
Bei einer Verdünnung von 10-5 und Inkubation über 72h zeigte bislang das ß- Sitosteryl-Palmitat Konzentrat die stärkste Wirksamkeit. Die Ergebnisse sind deutlich Dosis-abhängig und variieren auch mit der Inkubationszeit. Besonders ausgeprägt tritt die Wirkung beim Oberflächen-Antigen Hbs Ag in Erscheinung.
HEPATITIS B Virus
Sezernierte Antigene
7.0 Antiparasitäre Wirkungen
Orientierende Prüfungen wurden am Schweizerischen Tropeninstitut Basel (PD. Dr. Ronald Kaminsky und Frau Yvonne Grether) durchgefü hrt. Es wurde in ersten Testrei hen untersucht, ob signifi kante Ergebnisse in-vitro zu verzeichnen seien gegen Trypanosoma rhodesiense (den Erreger von Schlafkrankheit), gegen Trypanosoma cruzi (den Erreger der Chagas-Kran kheit) und gegen Leishmania donovani (den Erreger von Leishmaniose). Eine beachtliche antiparasitäre Wirksam keit Hess sich vorab für ausgewäh lte Cholestanyl- und Bioflavonoid-Ester-Konzentrate, sowie für das Z-Gly-Phe- D3-Esterkonzentrat nachweisen , bei Konzentrationen, welche keine basale zy- totoxische Wirku ng auf mu rine Muskelzellen oder Makrophagen erzeugen. Sie ist spezifisch gegen Leishmania donovani.
Vorläufige Ergebn isse :
SWISS TROPICAL I NSTITUTE, BASEL In-vitro assays, WHO-screeni ng as SOP
All values as: μg/ml
Legend* r = active on T.b.rhodesinense d = active on L. donovani t = cytotoxic on mammalian cells c = active on T. cruzi - = i nactive or low activity
MIC = minimum inhibitory concentration IC50 = 50% killi ng rate concentration
EP 1 1% Konzentrat CHOLESTANYL-ISOVALERAT
EP 2 1% Konzentrat CHOLESTANYL-10-UNDECENOAT
EP 3 1% Konzentrat CHOLESTANYL-PALMITAT
EP 4 1% Konzentrat CHOLESTERYL-n-VALERAT
EP 5 1% Konzentrat CHOLESTERYL-LAURAT
EP 6 1% Konzentrat CHOLESTERYL-PALMITAT
EP 7 1% Konzentrat SITOSTERYL-LAURAT
EP 8 1%-Konzentrat ß-SITOSTERYL-PALMITAT
EP 9 1%-Konzentrat ß-SITOSTERYL-ARACHIDAT
EP 10 1%-Konzentrat ß-SITOSTERYL-BEHENAT
EP 11 1%-Konzentrat STIGMASTERYL-LAURAT EP 12 1 %-Konzentrat STIGMASTERYL-PALMITAT
EP 13 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-n-VALERAT
EP 14 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-LAURAT
EP 15 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-PALMITAT
EP 16 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-BEHENAT
1 N 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-PALMITAT
2N 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-PALMITAT
TO 100% Cι ι : ι -CITRONELLYL-ESTER (COEMULGATOR)
T1 1 00% COEMULGATOR + TENSIDE
T10 1 %-Konzentrat ß-S ITOSTERYL-PALMITAT
T1 1 1 %-Konzentrat ß-SITOSTERYL-ARACHIDAT
T12 1 %-Konzentrat ERGOSTERYL-LAURAT
Werden die Messwerte der Konzentrate auf W.S. -Gehalt bezogen, sind sie um den Faktor 100 kleiner.
8.0 Allgemeine Verträglichkeit der MARIGENOL®Präparate
8.1 Toxizität i n-vivo
Test mit normalen 8-wöchigen weiblichen BALB/c nAncr (H-2d)-Mäusen, geliefert von Charles River Laboratories, Calco (Italien). Während 4 Wochen täglich zweimalige Injektion i.v. von je 0,250 ml wässeriger Mikroemulsion, gebildet aus den angegebenen Konzentraten, bzw. mit physiologischem Puffer für die Kontrollen. Färbung mit May Grünwald-G iemsa. Zeit der Behandlung : 28 Tg. Blutanalyse : nach der letzten Injektion
Anzahl Tiere: 1 3 Gruppen zu 5 je Tieren
RESULTAT: Es treten keine signifikanten Unterschiede zu den Kontrollen auf. Es konnte zudem keine Toxizität der Konzentrate auf die Leukozyten-Population festgestellt werden. Auch die Erythrozyten-Population zeigte normale Werte. Alle Tiere waren und blieben gesund bis zum Schluss der Versuche.
Durchführu ng der Proben : Prof. Dott. Guido FORNI, Dotta stefania VAI, Universitä di Torino, Dipartimento di Scienze Cli niche e Biologiche, Ospe- dale San Luigi Gonzaga, I-10O43 ORBASSANO (TO). 8.2 Untersuchung des Blutbildes
Effekt auf normale humane LYMPHOMONOCYTEN
Zel len : normale humane phagozytische weisse Blutzellen
(Macrophagen); 2 x 105 Zellen pro well
Stimulation der Kontrol len : 1 % PHA (Phytohemaggl utinin)
Test 1 : 2 %-Konzentrat enthaltend Cι2:o-Cholesteryl Ester
Test 2 : 2 %-Konzentrat enthaltend Ci6:o-Ergosteryl Ester
Test 3 : 2 %-Konzentrat enthaltend C5 :0-Cholecalciferyl Ester
(Vitamin D3-iso-Valerate) Tests du rchgefüh rt von Dottoressa Anna-Rita G UARINI, Universitä degli Studi di Torino, Clin ica medica, 1-10'1 26 TORINO, 21 . bis 24. März 1994.

Claims

PAT E N TAN S P R Ü C H E
1. Spontan dispergierbares Konzentrat, welches mit Wasser, mit 5%-iger Glucoselösung oder mit Ringerlösung verdünnt, thermodynamisch stabile Ultramikroemulsionen ergibt, die Mizellen mit einem hydrodynamischen Radius von 2.2 bis 3.0 nm aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass folgende Bestandteile zu einem pharmazeutisch verwendbaren System zusammengefügt sind:
0,1 bis 10 Gewichts-% einzelner oder mehrerer Ester von pentacyclischen Triterpenverbindungen laut den Formeln (I) bis (XI), bzw. einer Kombination solcher Wirkstoffe:
(III)
(VII) wobei in den Formeln (I) bis (XI) R1 eine C3.3ι-Alkyl-, eine C3.3ι-Alkenyl-, eine Ci7-23-Alkapolyen- oder eine Retinoylgruppe ist, 0 bis 5 Gewichts-% einer synergistischen, pharmazeutischen Wirksubstanz, 1 bis 25 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden , pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches, 0,1 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidge- misches, bis zu 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins, bis zu 1 0 Gewichts-% eines Stabilisators, Radikalfängers, biologischen Vektors oder Penetrationsverbesserers und Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.
2. Spontan dispergierbares Konzentrat, enthaltend Verbindungen der Formeln (I) bis (XI) gemass Anspruch 1 , als Mittel zur Herstellung von pharmazeutischen Präparaten mit Wirksamkeit gegen Tumore, Ekzeme und Psoriasis, sowie gegen virale u nd parasitäre Infektionen.
3. Spontan disperg ierbares Konzentrat, enthaltend Verbindu ngen der Formeln (I) bis (XI) gemass Anspruch 1 , als Mittel zu r Herstellung von pharmazeutischen und paramedizinischen Präparaten mit anhaltender prophylaktischer Wirksamkeit gegen Tumore, virale und parasitäre I nfektionen, sowie zur Unterstützung der Aufnahme exogener Aktivatoren , Modulatoren und/oder Regulatoren.
4. Spontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass folgende Bestandteile verei nigt sind :
0,5 bis 2 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von pentacyclischen Triterpenverbindungen laut den Formeln (I) bis (XI),
5 bis 25 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Neutralöl (Oleum neutrale), oder eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XIII) :
R-^COO-R 4 (χ| | l) worin R3 eine C2.3ι -Alkyl-, eine C3.31 -Al kenyl- oder eine C3.31 -Alkapolyen- gruppe und R4 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten,
0 bis 45 Gewichts-% eines pharmaverträg lichen Phosphorsäureester-Tensides,
5 bis 90 Gewichts-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyethylenether Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylen Gruppen und/oder Polysorbate 20.
5. S pontan dispergierbares Konzentrat gemass Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass folgende Bestandteile zusammengefügt sind :
0,5 bis 2 Gewichts-% eines oder mehrerer Ester von pentacyclischen Triterpenverbindungen laut den Formeln (I) bis (XI),
5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer biotensider Ester der allgemeinen Formel (XIII) :
R-COO-R 4 (XIII) worin R3 eine C2.31 -Alkyl-, eine C3.31 -Alkenyl- oder eine C3.3 -Al kapolyen- g ruppe und R4 Citronellyl-, Farnesyl-, Geranyl-, Isophytyl- oder Phytyl- bedeuten.
30 bis 45 Gewichts-% des wasserfreien tert. Octylphenylpolyoxyethylenether Tensids mit 9 bis 10 Oxyethylen G ruppen und/oder Polysorbate 20, 30 bis 45 Gewichts-% ei nes Alkylphenolpolyg lykolether Phosphat-Tensides oder des Tristyrylphenol-Polyoxyethylen-18-phosphorsäureester, TEA-Salz- Tensides.
6. Therapeutisches Systempräparat, welches 1 bis 95 Gewichts-% des spontan dispergierbaren Konzentrates gemass einem de Ansprüche 1 , 4 oder 5 und bis zu 10 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Zusatzstoffes, Lösungsmittels oder Stabilisators oder eines Gemisches davon enthält und welches in Dosis-Einheitsform als Micropellets, Granulat, Dragees, Suppositorien, Ampullen oder als Kapseln vorliegt.
7. Ein Verfahren zu r Herstellung von Estern von pentacyclischen Triterpenverbindungen gemass Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel (XII) :
R— COOH (XM ) worin R2 eine C3.3 -Alkyl-, eine C3.3i -Alkenyl-, eine Cι7-23-Alkapolyengruppe oder eine Retinoylguppe bezeichnet, mit 1 , 1 '-Carbonyldiimidazol oder mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in einem indifferenten Lösungsmittel umsetzt und anschliessend das entstandene Imidazolid mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (X) reagieren lässt.
8. Ein Verfahren zu r Herstellung von Estern von pentacyclischen Triterpenverbindungen gemass Anspruch 1 , darauf beruhend, dass eine Verbindung der Formel (XII):
R— COOH (XM) worin R2 eine C3.3ι -Alkyl-, eine C3.3ι -Alkenyl- oder einer Ci7.23-Alkapolyen- gruppe bezeichnet, mit einem Chlorierungsmittel umgesetzt wird und man anschliessend das entstehende Produkt mit einer Verbindung der Formeln (I) bis (X) reagieren lässt.
9. Ein Verfahren zur Herstellung von Allobetuli n-Carbonsäureestern, darin bestehend, dass man das Transformationsprodukt Al lobetuli n durch Kochen am Rückfluss mit 85% Ameisensäure gewinnt und anschliessend mit dem Säurechlorid einer Carbonsäure C5.3-ι in abs. Pyridi n unter Zusatz von 4- Dimethylaminopyridin acyliert.
1 0. Ein Verfahren zur Veresterung des Betu linsäuremethylesters, des 18ß- Glycyrrhetinsäuremethylesters und des Oleanolsäuremethylesters an Position 0-C(3), darin bestehend , dass man diese Produkte mit ei ner aktivierten Carbonsäure in abs. Pyridin unter Zusatz von 4-Dimethylaminopyridin acyliert.
1 1 . Die Verwend ung eines spontan dispergierbaren Konzentrates gemass Anspruch 1 oder einer daraus bereiteten wässerigen M ikroemulsion als Heilmittel mit Wi rksamkeit gegen Tumore, Psoriasis, Ekzeme, virale und parasitäre Infektionen und zur verstärkten Aufnahme exogener Aktivatoren, Modulatoren und Regulatoren.
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