WO1997031103A1 - Methode de determination du 1,5-anhydroglucitol - Google Patents

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glucose
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trehalase
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Kazuo Aisaka
Sakae Tazoe
Katsuhiko Ando
Keiko Ochiai
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for enzymatic quantification of 1,5-anhydroglucitol, a reagent for use in the method, and a novel trehalase suitable for use in an enzymatic method for quantification of 1,5-anhydroglucitol. And a method for producing the same. Quantification of 1,5-anhydroglucitol concentration is useful for diagnosing diabetes.
  • 1,5-Anhydroglucitol is present in human cerebrospinal fluid and plasma, and its amount is known to be changed in diseases, particularly in diabetes, and is important as a diagnostic marker for diabetes.
  • methods for quantifying 1,5-anhydroglucitol include methods for quantification using special analytical instruments such as gas chromatography, and enzymes that specifically oxidize 1,5-anhydroglucitol. (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No.
  • sample analysis is complicated in instrumental analysis such as liquid chromatography and gas chromatography, and special and expensive analyzers are required.
  • analysis takes a long time, so it is difficult to measure many samples. It is.
  • an enzyme that specifically acts on 5-anhydroglucitol it is difficult to prepare the enzyme, and it is not easy to lead to an appropriate detection system.
  • the substrate specificity of viranosoxidase is not sufficient.
  • the present invention provides an enzyme whose activity is inhibited in a concentration-dependent manner by 1,5-anhydroglucitol in the presence of 1,5-anhydroglucitol in a sample.
  • Quantitative method of 1,5-anhydroglucitol characterized by measuring elementary activity, an enzyme whose activity is inhibited in a concentration-dependent manner by 1,5-anhydroglucitol, a substrate of the enzyme,
  • the present invention relates to a reagent for quantifying 1,5-anhydroglucitol comprising a reagent for quantifying a substance produced by the enzymatic reaction.
  • the Ki value for 1,5-anhydroglucitol is 0.333 mM or less, and the physicochemical properties are
  • Substrate specificity It acts specifically on trehalose.
  • Substrate affinity The Km value for trehalose is 6.7 mM.
  • Optimum pH and stable pH The optimum pH is 5-6, and the stable pH range is 5-10 when treated at 50 ° C for 30 minutes.
  • Optimum temperature and thermal stability The optimum temperature is around 45 ° C. This enzyme is stable up to 50 when treated at pH 5.0 for 30 minutes.
  • Inhibitors 1,10-phenanthroline, ethylenediaminetetraacetic acid (hereinafter abbreviated as EDTA), 2, -metal-chelating reagents such as biviridyl, p-mercuribenzoic acid, acetic acid amide
  • SH inhibitors such as, hydroxylamine and nickel sulfate.
  • Molecular weight The molecular weight of the subject of this enzyme measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is about 90,000, and the molecular weight measured by gel filtration is about 400,000.
  • Trehalase characterized by culturing in a medium a strain belonging to the genus Trehalase and the genus Nocardia and capable of producing a novel trehalase having the above physicochemical properties, and collecting the trehalase from the culture.
  • the present invention relates to a method for producing Ize.
  • the sample used in the present invention is not particularly limited as long as it contains 1,5-anhydroglucitol, and a biological sample such as cerebrospinal fluid, serum, plasma, urine and the like and these samples were processed.
  • a processing liquid is exemplified.
  • Enzymes whose activity is inhibited by 1,5-anhydroglucitol in a concentration-dependent manner include insects, as long as the enzyme activity is inhibited by 1,5-anhydroglucitol in a concentration-dependent manner.
  • Any enzyme of any origin, such as animals, plants, and microorganisms, can be used.
  • suitable enzymes include enzymes using trehalose as a substrate, such as trehalase and trehalose phosphorylase. These enzymes may be used in the form of a commercially available product.
  • the enzyme may be prepared by culturing a microorganism.
  • microorganisms that produce Trehalase include Streptomyces
  • microorganisms belonging to the genus Streptomyces include Streptomyces * Aureofaciens ATCC 10762 and Streptomyces' Streptomyces chromofuscus ATCC 23896.
  • Examples of the microorganism belonging to the genus Nocardia include Nocardia trans valensis ATCC 6865.
  • Microorganisms belonging to the genus Rhodococcus include, for example, Rhodococcus loberulus ATCC 14898, Rhodococcus loberulus ATCC 14898, Rhodococcus globerulus ATCC 15076, Rhodococcus rhodochrous ATCC, etc.
  • Can be Microorganisms that produce trehalose phosphorylase include, for example, microorganisms belonging to the genus Catellatospora, Kineosporia, and the like.
  • Microorganisms belonging to the genus Catellatospora include, for example, Catellatospora ferruginea (FERM BP-4329) and the like.
  • Microorganisms belonging to the genus Kineosporia include, for example, Kineosporia aurantiaca ATCC 29727 and the like.
  • Streptomyces Aureo-Faciens is based on the Beggie's Manual, Obs cis Ama ⁇ ⁇ ic * eyBergey's Manual of Systematic
  • Rhodococcus globerlas —Gizman's Manual of Systematic Pectorolone ( Bergey's Manual of Systematic Bacteriology), Vol. 2, p. 1479 (1986) and Vol. 4, p. 2369 (1989), see Rhodococcus' Rhodkraus, a basic manual of systematics.
  • Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, p. 2365-2367 (1989) the force Teratospora ferguinea is an international journal of ob ⁇ sys tematicic bacteriology (Int. J. Syst.
  • Microorganisms that produce trehalase such as Streptomyces, Nocardia
  • the cultivation of microorganisms belonging to the genus Genus, Mouth dococcus, etc. and microorganisms producing trehalose phosphorylase, for example, microorganisms belonging to the genus Teratosusbora, Kineosporia, etc., is performed by the usual culture method used in the culture of actinomycetes, bacteria, etc. Used.
  • any natural medium or synthetic medium can be used as long as it contains, for example, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt and the like.
  • the carbon source for example, carbohydrates, sugar alcohols, organic acids and the like are used.
  • carbohydrate include glucose, sucrose, maltose, trehalose, starch, molasses and the like.
  • sugar alcohols include glycerol, sorbitol, mannitol and the like.
  • organic acid include acetic acid, lactic acid, pyruvic acid, and citric acid.
  • an inorganic or organic ammonium salt for example, an inorganic or organic ammonium salt, a nitrogen-containing organic substance, or the like is used.
  • the inorganic or organic ammonium salts include ammonia, ammonium chloride, ammonium carbonate, ammonium phosphate, and ammonium acetate.
  • nitrogen-containing organic substances include urea, amino acids, peptone,
  • NZ-amine, meat extract, corn starch, casein hydrolyzate, yeast extract and the like are used.
  • first phosphoric acid rim for example, first phosphoric acid rim, second phosphoric acid rim, chlorinated lime, sodium chloride, magnesium sulfate, ferrous sulfate and the like are used.
  • a liquid culture method particularly a submerged stirring culture method is suitable.
  • the cultivation is performed at pH 6.0 to 8.0 and at a temperature of 25 to 37 for 1 to 7 days while standing or with aeration and stirring.
  • trehalase or trehalose phosphorylase is produced and accumulated in the culture, mainly in the orchid. Collection of trehalase or trehalose phosphorylase from the culture is performed, for example, as follows.
  • the cells are collected from the culture by centrifugation or filtration.
  • the cells are disrupted by an ultrasonic disrupter or the like to obtain a crude enzyme extract.
  • This crude enzyme extract is The treatment is carried out by a method used for purification, for example, salting out, organic solvent precipitation, dialysis, ion exchange column chromatography, gel filtration, lyophilization and the like.
  • purified trehalase or purified trehalose phosphorylase can be collected.
  • the physicochemical properties of the novel trehalase of the present invention are as follows.
  • the enzymes of the invention the presence of water, the trehalose molecule by hydrolysis, to produce a D- glucose 2 molecules, represented by the general formula (I) trehalose + H 2 0 2 D- glucose (I) Catalyze the reaction.
  • Table 1 shows that it acts specifically on trehalose.
  • the inhibitory specificity of this enzyme for 1,75 mM of various saccharides was examined using trehalose as a substrate.
  • C showing the results in Table 2
  • the K i value of this enzyme for 15-anhydroglucitol is 0.33 mM, as determined from the line and the plot (Lineweaver-Burk plot). .
  • the activity was determined using a phosphate buffer until pH 5.0 8.0, and the optimum pH was examined.
  • the pH-activity curve shown in Fig. 1 was obtained.
  • the optimal pH of this enzyme is 5-6.
  • thermostability of this enzyme the remaining activity was measured after maintaining at each temperature for 30 minutes with a phosphate buffer at pH 5.0. As a result, as shown in Fig. 3, it is stable up to 50 ° C.
  • the optimal temperature of the enzyme was measured using a phosphate buffer of pH 5.5.
  • Figure 4 shows the results.
  • the optimum temperature is around 45 ° C.
  • This enzyme is a metal chelating reagent such as 1,10-phenanthroline, ethylenediaminetetraacetic acid, 2,2'-bipyridyl, ⁇ -mercuribenzoic acid, Inhibited by SH inhibitors such as amides, hydroxylamine, nickel sulfate, etc.
  • the molecular weight of the subunit of this enzyme measured by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis is about 90,000, and the molecular weight measured by gel filtration using high performance liquid chromatography is about 400,000. .
  • This enzyme produced a single band by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. That is, after performing electrophoresis for about 60 minutes in a Tris-glycine buffer (pH 8.3), a single protein band was observed by staining with Kumasi-stain solution.
  • the enzyme titer is measured by the following method.
  • Glucose oxidase (Toyobo, Grade III) final concentration 0.04 mg, m1, Peroxidase (Toyobo, Grade III) final concentration 0.04 mg / m 1.
  • 4-aminoantipyrine final concentration 1.2 mM Dissolve the fuel in water to a final concentration of 21 mM.
  • the unit of trehalase is defined as the amount of enzyme capable of hydrolyzing 1 mol of trehalose per minute at 37 ° C. Therefore, the titer per lml of enzyme solution (UZml) is determined by the net difference in absorbance (enzyme solution-control solution), and so on.
  • the microorganisms used are those belonging to the genus Nocardia and have the ability to produce the above-mentioned novel trehalase, and specific examples thereof include Nocardia sp. (Nocardia sp.) NK-2067. .
  • This strain is a strain isolated from the soil by the present inventors, and its bacteriological properties are as follows. The experimental method for identification of mycological properties was mainly carried out by Takeji Hasegawa, "Classification and Identification of Microorganisms", University of Tokyo Press (1975). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 1 to Vol.
  • the NK-2067 strain shows normal or vigorous growth on commonly used synthetic and natural media, and the underlying mycelium exhibits a white to pale pink color.
  • the medium may produce a brown soluble dye.
  • the characteristics of growth and color when cultured at 28 ° C for 14 days in various cultures ⁇ are shown below.
  • the color display is based on the color classification according to the Color Harmony Manual [Container Corporation of America, 4th edition (1958)].
  • Soluble pigment slightly produced (ocher)
  • the physiological properties of the NK-260 strain are shown below.
  • the growth temperature range is for 14 days after cultivation, and the others are for cultivation at 28 ° C for 2-3 weeks.
  • a basal medium a pure Ham Gott Kunststoff agar medium was used. In the following, + indicates use, and one indicates not use.
  • a basal medium a nutrient agar medium was used.
  • + indicates decomposition, and indicates not decomposition.
  • a liquid medium in Peptone water was used (promotimolubul was used as an indicator).
  • promoter indicates production, and one indicates no production.
  • Sorbitol one Arabinose; one
  • a basal medium a nutrient agar medium was used.
  • + indicates growth
  • 1 indicates no growth.
  • strain Nocardia sp. NK—2067, and it was named 1-3-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan on January 11, 1996 (postal code 305).
  • FERM joins the Biotechnology Research Institute of the Ministry of International Trade and Industry Deposited as BP-5 3 5 9
  • the method for producing the novel trehalase which belongs to the genus Nocardia, uses the same method as the aforementioned method for culturing microorganisms and purifying the enzyme produced by the microorganism. It is characterized in that the enzyme whose activity is inhibited in a concentration-dependent manner by a citrate is used in combination with 1,5-anhydroglucitol in a sample to measure the enzyme activity of the enzyme. A method for quantifying anhydroglucitol will be described.
  • the 1,5-anhydroglucitol concentration in the sample depends on the concentration of 1,5-anhydroglucitol when coexisting with a known amount of 1,5_anhydroglucitol prepared in advance. Using a calibration curve showing the enzyme activity of the enzyme whose activity is inhibited and the 1,5-anhydroglucitol concentration, the activity can be quantified from the enzyme activity when a sample coexists with the enzyme.
  • the enzyme activity of the enzyme whose activity is inhibited by 1,5-anhydroglucitol in a concentration-dependent manner can be measured by a conventional enzyme activity measuring method.
  • the enzyme reaction is carried out in an aqueous medium, in a reaction solution containing the enzyme and a substrate of the enzyme, and if necessary, an activity regulator of the enzyme at 10 to 50 ° C for 1 to 60 minutes, preferably 1 to 50 minutes. It is carried out for 20 minutes, more preferably at 25 to 40 for 5 to 15 minutes.
  • Enzyme activity measurement was performed by enzymatic reaction under certain conditions.
  • the product concentration, L is obtained by directing the reduced substrate concentration to another compound, and measuring its concentration.
  • aqueous medium examples include a liquid containing water such as a buffer solution and physiological saline, and a buffer solution is preferable.
  • Buffers include, for example, lactate buffer, citrate buffer, acetate buffer, succinate buffer, phthalate buffer, phosphate buffer, triethanolamine buffer, dietanolamine buffer, lysine buffer, Barbitur buffer, Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer, imidazole buffer, malate buffer, oxalate buffer, glycine buffer, borate buffer, carbonate buffer, good buffer, etc. It is.
  • Enzyme activity regulators include EDTA, metal chelating agents such as 1,10-phenanthroline, sugar alcohols such as mannitol and glycerol, metal ions such as zinc and copper, eosindromic acid, and iodoacetamide. SH inhibitors.
  • Trehalase is an enzyme that mediates the reaction of formula (I), and produces two molecules of D-glucose from one molecule of trehalose and one molecule of water.
  • the activity of this enzyme may be detected by a method for detecting D-glucose, and a chemical method or a biochemical method is used.
  • the amount of increase in D-glucose is a power that can chemically measure the increase in direct reducing power, etc., and is converted to another substance as necessary and measured. can do.
  • a dehydrogenation reaction of D-glucose in the presence of dinucleotide (hereinafter abbreviated as NAD) or nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (hereinafter abbreviated as NADP), and a coenzyme produced in the reaction A method of detecting the absorbance of NAD H or NADP H, which is a reduced form of NAD H with a spectrophotometer, 4) phosphorylating D-glucose with hexokinase or glucokinase in the presence of adenosine triphosphate, The resulting D-glucose-6-phosphate is dehydrogenated with glucose-6-phospho-dehydrogenase in the presence of coenzyme NADP, and the absorbance of the coenzyme NADPH produced by the reaction is detected with a spectrophotometer. There is a method of doing.
  • NAD dinucleotide
  • NADP nicotinamide
  • D-glucose is enzymatically converted into a detectable intermediate substance, for example, hydrogen peroxide or a coenzyme such as NADH or NADPH described above, and finally, the intermediate substance is quantitatively determined.
  • D-glucose is quantified.
  • Hydrogen peroxide can be quantified by, for example, a colorimetric method, a fluorescent method, a chemiluminescent method, an electrode method, and the like
  • the coenzyme NADH or NADPH can be quantified by, for example, a colorimetric method.
  • Examples of the colorimetric method include a method in which a color reagent is colored with hydrogen peroxide by an enzyme such as peroxidase and then measured with a spectrophotometer.
  • Examples of the color reagent include a cylinder type 1 color reagent and a leuco type color reagent.
  • Tring type 1 color reagent examples include phenolic compounds such as phenol, 3-hydroxy-2,4,6-triodebenzoic acid and N-ethyl-N- (2- (Doxy 3-sulfopropyl) —m—toluidine, N—ethyl-N— (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -1,3,5-methoxyaniline, N— (2-hydroxy-13-sulfopropyl)
  • Aniline-based compounds such as 1,3,5-dimethylethoxylinoline sodium, N-ethyl-1-N- (3-methylphenyl) -1-N'-succinylethylenediamine (hereinafter abbreviated as EMSE) And 4-aminoantipyrine.
  • leuco-type color reagents include 10-N-carboxymethylcarbamoyl 3,7-bis (dimethylamino) -10H-phenothiazine and ⁇ ⁇ - ⁇ -methylcarbamoyl-3,7-bis (dimethylamino) 10H-phenothiazine, N- (carboxymethylaminocarbonyl) 1,4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium salt, 4,4'-bis (dimethylamino) diphenylamine, bis [3-bis (4-phenylphenyl) methyl-4-dimethylaminophenyl] amine and the like.
  • Examples of the fluorescence method include a method in which a fluorescent reagent is converted into a fluorescent substance with hydrogen peroxide by an enzyme such as peroxidase, and the measurement is performed with a fluorometer.
  • Examples of the fluorescent reagent include p-hydroxyphenylacetic acid, p-hydroxyphenylpropionic acid, coumarin and the like.
  • Examples of the chemiluminescence method include a method in which a luminescent reagent is colored with hydrogen peroxide using an enzyme such as peroxidase and then measured with a luminometer or the like.
  • Examples of the luminescent reagent include compounds such as luminol, isorluminol, lucigenin, and acridinium ester.
  • Coenzymes such as NADH-HADPH can be quantified by directly measuring absorbance, but can also be quantified by conversion to other compounds.
  • NADPH can be quantified by a method in which a formazan dye produced by reacting with tetrazolium salts is measured with a spectrophotometer.
  • Trehalase enzyme The activity is determined by producing the quinonimine dye by reacting the compound of the formula (II) and measuring the concentration of the dye with a spectrophotometer.
  • the phosphate buffer is preferably at pH 5.0 to 8.0, more preferably at pH 6.0 to 7.0, and the concentration is preferably at 10 50500 mM, more preferably 50-25 OmM.
  • Trehalase is preferably 0.001 to 10 U / m1, more preferably 0.01 to 1 U / ml, and glucose oxidase is preferably 1 to 10 OU / m.
  • a sample containing 1,5-anhydroglucitol is added to the above-mentioned reaction solution, and the reaction is carried out at 10 to 50 ° C for 1 to 20 minutes, more preferably at 25 to 40 ° C for 5 to: Do for 5 minutes.
  • Enzyme activity can be determined by measuring the absorbance at 550 nm of the quinone imine dye produced by the reaction.
  • D-glucose is present in the sample, It is preferable to eliminate D-glucose in the sample.
  • Samples in which D-glucose is present include blood, serum, plasma, and the like.
  • the D-Dalcohols conversion method described in the above-mentioned D-glucose detection method can be used as it is.
  • 1) method of converting D-glucose to D-darcono-5-lactone using glucose oxidase 2) conversion of D-glucose to 2-dehydro-D-glucose using vilanose oxidase.
  • Glucose Dehydrogenase Using D-glucose to convert to D-Dalconor (5-lactone) using oral genase, 4) Hexokinase or glucokinase and glucose-6-phosphate dehydrogenase A method of converting D-glucose into D-glucono-5-lactone-6-phosphate by using zeolites.
  • D-glucose present in the sample is converted into another compound by the above-mentioned reaction method 1) or 2), the generated hydrogen peroxide is, for example, disclosed in JP-A-57-83287.
  • D-glucose generated by elimination by the hydrogen peroxide elimination method described above and subsequent reaction with trehalase can be quantified.
  • the resulting NADH or NADPH is converted to an enzyme such as NADH oxidase or NADPH oxidase.
  • adenosine triphosphate remaining in the reaction solution is converted to another compound with an enzyme such as diaphorase or adenosine triphosphatase.
  • D-glucose produced by the action of trehalase can be quantified, for example, by the above-mentioned method 1) or 2).
  • D-glucose in a sample is converted into D-darcono 5-lactone and hydrogen peroxide by glucose oxidase.
  • D-glucose in a sample is subjected to a reaction solution containing dalcos-oxidase, peroxidase, EMSE, etc. in a buffer solution, for example, a phosphate buffer solution, for 10 to 20 minutes at 10 to 50 ° C. More preferably, the reaction is carried out at 25 to 40 ° C for 5 to 15 minutes to eliminate D-dalcos.
  • a reagent containing trehalose, trehalase, 4-aminoantipyrine and the like is added to the reaction solution, and the trehalase activity is measured by the method described above.
  • concentrations of the reagents used are the same as described above.
  • D-glucose in a sample is converted to D-dalconose-16-phosphate by dalcokinase together with adenosine triphosphate
  • the D-dalconose-6-phosphate is converted to glucose-6- together with NADP.
  • adenosine triphosphate is reacted with adenosine triphosphatase to decompose ATP.
  • D-glucose in a sample is transferred to a buffer solution, for example, a reaction solution containing dalcokinase, ATP, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and NADP in a phosphate buffer solution at 10 to 50 ° C. Perform for 1 to 20 minutes, more preferably 25 to 40 for 5 to 15 minutes to eliminate D-glucose. Then, after adding adenosine triphosphatase to decompose adenosine triphosphate remaining in the reaction solution, the reaction solution contains rehalose, trehalase, peroxidase, 4-aminoantipyrine and EMSE. By adding a reagent and measuring the trehalase activity by the method described above. it can. The concentrations of the reagents used are the same as described above. Glucokinase is preferably 0.
  • glucose-16-phosphate dehydrogenase is preferably 0.1 to: I 00 U / ml, more preferably 1 to 10 U / ml, adenosine triphosphatase is preferably 0.1 to 10 O UZm
  • NADP is preferably 1 to 100 mM, more preferably 10 to 5 OmM
  • adenosine triphosphate is preferably 1 to 100 mM, more preferably 1 to 100 mM.
  • Other compounds and enzyme concentrations are the same as described above.
  • Trehalose phosphorylase is an enzyme that reversibly catalyzes the reaction of formula (I I I).
  • Trehalose + Phosphate —- ⁇ D-Glucose + / SD-Glucose-1-phosphate This enzyme activity is measured using D-glucose, S-D-glucose-1-phosphate, trehalose or phosphate Force that can be obtained by directly measuring the change in the concentration of the compound by a known method. The concentration may be measured by inducing another compound.
  • the enzyme activity in the right reaction of the formula (III) can be determined, for example, by generating NADPH by the reaction formula of the formula (IV) and optically measuring the concentration.
  • the reaction solution for measuring this enzyme activity is a buffer, for example, trehalose phosphorylase in a phosphate buffer. Includes S-phosphoglucomutase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, trehalose, NADP, etc.
  • the phosphate buffer is preferably at pH 5.
  • the concentration is preferably 10-5 0 OmM, more preferably 50 to 25 OmM.
  • Trehalose phosphorylase is preferably from 0.001 to 10 UZm, preferably from 0.01 to 1 UZmI, and phosphodal commutase is preferably from 0.1 to 50 U / m1. More preferably, 1 to 10 U / m1, glucose-16-phosphate dehydrogenase is preferably 0.1 to 50 UZm1, more preferably 1 to 10 U / m1, and trehalose is preferably Is preferably 1 to 100 mM, more preferably 10 to 5 OmM, and NADP is preferably 1 to 50 mM, more preferably 5 to 20 mM.
  • a sample containing 1,5-anhydroglucitol is added to the above reaction solution, and the reaction is carried out at 10 to 50 ° C for 1 to 20 minutes, more preferably at 25 to 40 ° C for 5 to 10 minutes. Perform for 15 minutes.
  • the enzymatic activity can be determined by measuring the absorbance of NADPH produced by the reaction at 340 nm.
  • the enzyme activity in the left reaction of the formula (III) can be determined, for example, by forming a quinonimine dye by the reaction formula of the formula (V) and optically measuring the density.
  • the reaction solution for the measurement of this enzyme activity is a buffer solution, for example, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, peroxidase, dalcose, S-glucose-monophosphate, inosine, 4-aminoantipyrine, E Including MSE etc.
  • the imidazolate buffer is preferably at pH 5.0-8.0, more preferably at pH 6.0-7.0, at a concentration of preferably 10-200 mM, more preferably 50-: 1. 00 mM.
  • Purine nucleoside phosphorylase is preferably 0.1 to 10 U / ml, more preferably 1 to 5 UZm1, and xanthine oxidase is preferably 1 to 50 Um1, more preferably 5 Um1.
  • ⁇ 20 UZm1 peroxidase is preferably ⁇ U / m1, more preferably 1-50 UZm1
  • glucose is preferably 5-200 mM, more preferably 20-100 mM
  • ⁇ - Gose mono-monophosphate is preferably from 5 to 200 mM, more preferably from 20 to 100 mM
  • inosine is preferably from 0.5 to 50 mM, more preferably from 1 to 10 mM
  • Aminoantipyrine is added preferably in an amount of 0.5 to 50 mM, more preferably 1 to 10 mM
  • EMSE is added in an amount of preferably 0.5 to 50 mM, more preferably 1 to 10 mM.
  • a sample containing 1,5-anhydroglucitol is added to the above reaction solution, and the reaction is performed at 10 to 50 for 1 to 20 minutes, more preferably at 25 to 40 ° C for 5 to 15 minutes.
  • Enzyme activity can be determined by measuring the absorbance at 550 nm of the quinone imine dye produced by the reaction.
  • the present invention comprises an enzyme whose activity is inhibited by 1,5-anhydroglucitol in a concentration-dependent manner, a substrate of the enzyme, and a reagent for quantifying a substance produced by the enzyme activity.
  • the reagent for quantifying anhydroglucitol will be described.
  • the substrate is trehalose. 1 shows a reagent for quantifying glucose.
  • the substrates are trehalose and phosphate or D-glucose and ⁇ -glucose-1.
  • -Phosphoric acid and the substances produced are D-glucose and -glucose-1 monophosphate or trehalose and phosphoric acid, respectively. is there. Therefore, the reagent for quantification of the produced substance means any reagent for trehalose, phosphoric acid, D-glucose or; 3-glucose-1-monophosphate.
  • the reagent for quantifying trehalase activity is composed of reagents for quantifying trehalose and D-glucose, and includes buffers, other enzymes, substrates, coenzymes and the like as necessary.
  • the reagents for quantifying trehalose phosphorylase activity include reagents for quantifying trehalose, phosphate and D-dalcos, or reagents for quantifying iS-glucose-11-phosphate or D-glucose, —glucose-11-phosphate. Consists of reagents for acid and trehalose quantification or phosphate quantification, and contains buffers, other enzymes, substrate supplements, enzymes, etc. as necessary.
  • the reagents for D-glucose quantification the reagents for quantifying glucose-1 and monophosphate, the reagents for quantifying trehalose, and the reagents for quantifying phosphoric acid, for example, the substances used in the methods described in the above-mentioned methods for quantifying each substance are used.
  • the substances used in the methods described in the above-mentioned methods for quantifying each substance are used.
  • D-glucose eliminating reagent for example, the substance described in the above-mentioned method for converting D-glucose to another substance using an enzyme is used.
  • the D-dalcos elimination reagent includes, for example, glucose oxidase, peroxidase, and EMSE, and the buffer described above as necessary. Solution, other enzymes, substrates, coenzymes, etc.
  • the D-glucose removing reagent for removing D-glucose in a sample by the method of 4) described above includes, for example, glucokinase, glucose-16-phosphate dehydrogenase, and adenosine triphosphatase. , Adenosine triphosphate, NADP, and if necessary, the above-mentioned buffer, other enzymes, substrates, coenzymes, etc.
  • the D-glucose quenching reagent may be prepared as a kit incorporated in the aforementioned reagent for quantifying 1,5-anhydroglucitol.
  • Glucose oxidase glucose dehydrogenase, pyranose oxidase, glucokinase, hexokinase, used phosphoglucose, purine nucleoside phosphorylase, xanthine oxidase, oxidase, Commercially available products such as adenosine triphosphatase may be used, or these enzymes may be used. May be used obtained by culturing a microorganism or the like that produces the same. Commercially available products such as the above-mentioned buffers, substrates, coenzymes, enzyme substrates, color reagents, fluorescent reagents, and luminescent reagents can be used.
  • Trehalose 1 OmgZm 1 was added to the reaction solution, and the mixture was stirred. Then, the change in absorbance at 550 nm was measured with a spectrophotometer.
  • FIG. 1 shows the pH-activity curve of trehalase from Nocardia sp. NK-2067.
  • FIG. 2 shows a pH-stability curve of trehalase derived from Nocardia sp. NK-2070.
  • FIG. 3 shows a thermostability curve of trehalase derived from Nocardia sp. NK-2067.
  • FIG. 4 shows a temperature-activity curve of trehalase derived from Nocardia sp. NK-2607.
  • FIG. 5 shows a calibration curve using the activity of degrading trehalose phosphorylase derived from Catellatospora ferruginea FERM BP-4329 as an index.
  • the vertical axis is the enzyme activity inhibition rate (%), and the horizontal axis is 1,5-anhydroglucite ⁇ represents the concentration (mM).
  • FIG. 6 shows a calibration curve using as an index the activity of synthesizing trehalose phosphorylase derived from Catellatospora ferruginea FERM BP-4329.
  • the vertical axis represents the inhibition rate (%) of the enzyme activity, and the horizontal axis represents the 1,5-anhydroglucitol concentration (mM).
  • Figure 7 shows Streptomyces aureofaciens (reptomyce).
  • aureofaciens shows a calibration curve when trehalase derived from ATCC 10762 was used as a test enzyme.
  • the vertical axis indicates the inhibition rate (%) of the enzyme activity, and the horizontal axis indicates the 1,5-anhydroglucitol concentration (mM).
  • FIG. 8 shows a calibration curve when trehalase derived from Rhodococcus globerulus ATCC 14898 was used as a test enzyme.
  • the vertical axis represents the inhibition rate (%) of the enzyme activity, and the horizontal axis represents the 1,5-anhydroglucitol concentration (mM).
  • FIG. 9 shows a calibration curve when trehalase derived from Nocardia sp. K-2607 is used as a test enzyme.
  • the vertical axis represents the enzyme activity inhibition rate (%), and the horizontal axis represents the 1,5-anhydroglucitol concentration (mM).
  • Figure 10 shows the calibration curve of 1,5-anhydroglucitol in the presence of glucose, using the inhibition rate against Nocardia sp. NK-2070-derived Trehalase as an index. Is shown. The vertical axis represents the value obtained by subtracting the absorbance with 1,5-anhydroglucitol from the absorbance without 1,5-anhydroglucitol (absorbance difference). Represents the concentration of 5-, anhydroglucitol (g / m 1).
  • Trehalose Phosphorylase from Capellatospora ferruginea FERM BP-4329.
  • Test solutions containing various concentrations of 1,5-anhydroglucitol were added to prepare reaction solutions. . After adding 1 Omg / ml of trehalose to the reaction solution and stirring, the increase in absorbance at 340 ⁇ m was measured with a spectrophotometer.
  • the increase in absorbance for 10 minutes after the start of the reaction was measured, and the increase in absorbance when 1,5-anhydroglucitol was not added was defined as A.
  • the increase in absorbance was designated as B, and the inhibition rate (%) was calculated from the formula [(A-B) / Ax100].
  • Fig. 5 when the inhibition rate was plotted against the concentration of 1,5-anhydroglucitol in the sample, a good linear relationship was obtained, and the 1,5-anhydroglucitol was obtained. was obtained.
  • Trehalose phosphorylase 1 OmUZml glucose 5 OmM prepared in Reference Example 1 in 50 mM imidazole buffer (pH 7.0), glucose 5 OmM. Kit for measuring inorganic phosphorus (Kyowa Medex) 2 ml, various A test solution containing 1,5-anhydroglucitol at a concentration of 1 was added to prepare a reaction solution (3 m). After adding 50 mM of -glucose_1-phosphoric acid to the reaction solution and stirring, an increase in absorbance at 550 nm was measured with a spectrophotometer.
  • Trehalase 1 OmU / m 1 prepared in Reference Example 2 in 10 O mM phosphate buffer (pH 7.0), 1-OmU / m 1, 4-aminoantipyrine 0.8 1 mg / ml, EMS E 1 mg / m 1
  • a test solution containing 30 U / ml glucose oxidase, 10 UZm1 glucose oxidase, and various concentrations of 1,5-anhydroglucitol was added to prepare a reaction solution.
  • Trehalose 1 Omg Zm 1 was added to the reaction solution, and the mixture was stirred. Then, the change in absorbance at 550 nm was measured with a spectrophotometer.
  • Example 3 The test was conducted in the same manner as in Example 3 except that trehalase derived from Mouth dococcus .globerlus prepared in Reference Example 3 was used. As shown in Fig. 8, when the inhibition rate was plotted against the concentration of 1,5-anhydroglucitol in the sample, a good linear relationship was obtained, and 1,5-anhydroglucitol was obtained. Was obtained.
  • Nocardia sp.Nocardia sp. NK2 067 is sucrose 1 g / cU, NZ amine 0.5 gZdl, peptone 0.2 g / d 1, yeast extract 0.1 g Zd and meat extract 0 1 gZd 1 force, 1 ml of medium (pH 7.2) Inoculate 1 liter Erlenmeyer flask containing 30 liters. C. The cells were cultured with shaking for 48 hours. Place 125 ml of this culture in a 5 liter jar fermenter containing 23 75 ml of medium of the same composition as above and agitate with aeration. C cultivated for 2 days.
  • This solution was dialyzed against 5 liters of GP buffer for 24 hours.
  • the dialysis solution was passed through a DE AE-Cell Mouth Fine (Seikagaku Corporation) column (1 L, diameter 5 cm) equilibrated with GP buffer. By this operation, trehalase is adsorbed on the column. Further, impure proteins were washed away with the same buffer. Next, elution was performed with a concentration gradient of salt from the GP buffer to the GP buffer containing 1 M salt.
  • the active fractions eluted at about 0.4-0.6 M are combined, ammonium sulfate is added to the active fractions, and the portion that precipitates at 70% saturation with ammonium sulfate is centrifuged (12, 000 X g, 20 Min) and dissolved in 50 ml of GP buffer. This solution was dialyzed against 2 liters of GP buffer for 24 hours to obtain a purified trehalase enzyme preparation.
  • the specific activity of the enzyme preparation was 21 mUZmg.
  • Example 7 The test was performed in the same manner as in Example 3 except that trehalase derived from Nocardi R. sp. Prepared in Example 5 was used. As shown in Fig. 9, when the inhibition rate was plotted against the concentration of 1,5_anhydroglucitol in the sample, a good linear relationship was obtained, and the calibration curve of 1,5-anhydroglucitol was obtained. was gotten.
  • Example 7 When the inhibition rate was plotted against the concentration of 1,5_anhydroglucitol in the sample, a good linear relationship was obtained, and the calibration curve of 1,5-anhydroglucitol was obtained. was gotten.
  • a reagent kit for quantifying 1,5-anhydroglucitol comprising the following first reagent, second reagent and third reagent was prepared.
  • a test solution containing 1,5-anhydroglucitol at a concentration of 0 to 500 g / m1 and D-glucose at a concentration of 1 mgm1 was prepared.
  • the first reagent 3001 prepared in Example 7 was added and incubated at 30 ° C. for 10 minutes to convert D-glucose to D-dalconone ⁇ 5. —Converts to hydrogen and eliminates hydrogen peroxide produced at the same time.
  • the second reagent 1001, prepared in Example 7 was added, and then the third reagent 101, prepared in Example 7, was added.
  • the absorbance was increased with a Hitachi 770 automatic analyzer. It was measured.
  • the value obtained by subtracting each absorbance from the absorbance when 1,5-anhydroglucitol is 0 was calculated, and the value was calculated with respect to the concentration of 1,5-anhydroglucitol in the sample.
  • the absolute value is plotted, a good linear relationship is obtained. It was shown that the 1,5-anhydroglucitol concentration can be measured even in samples containing glucose.
  • the following reagent kit for the determination of 1,5-anhydroglucitol consisting of the fourth, fifth, sixth and seventh reagents was prepared.
  • a test solution containing 1,5-anhydroglucitol at a concentration of 500 g / m1 and D-glucose at a concentration of 1 Omg / m1 from 1 mgZm1 was prepared.
  • the fourth reagent 3001 prepared in Example 9 was added to 101 of each of these specimens, and the mixture was incubated at 30 for 10 minutes. Further, the fifth reagent 101 prepared in Example 9 was added, and the mixture was incubated for 5 minutes to decompose adenosine triphosphate, thereby stopping the glycokinase reaction.
  • glucose is converted to D-Dalconor ⁇ -lactone-6-phosphate via glucose-6-phosphate.
  • Treha-mouth monophosphorylase by the force teratosusbora 'Ferguinea (Catellatospora ferniginea) FERM BP-4329
  • the resulting precipitate was dissolved in a small amount (about 200 ml) of 200 mM phosphate buffer (pH 7.0), and the resulting solution was dialyzed against 5 liters of the same buffer for 24 hours and then subjected to 65 ° C. Heat treatment with C for 15 minutes and centrifugation (12,000 xg, 20 minutes) Toyopearl HW65 F (Toso-Ichisha) gel filtration agent equilibrated with the same buffer and supernatant obtained (1 L, diameter 5 cm).
  • the eluted active fractions were combined, ammonium sulfate was added to 50% saturation, the precipitate was collected by centrifugation (12,000 rpm, 20 minutes), and 200 mM phosphate buffer (p H7.0) dissolved in 20 ml. The resulting solution was dialyzed against 2 L of the same buffer for 24 hours to obtain a trehalose-phosphorylase enzyme preparation.
  • the specific activity of the enzyme preparation was 100 mU Zmg.
  • Streptomyces aureofaciens ATCC 10762 with sucrose 1 g Zdl, NZ-amine 0.5 gZd, peptone 0.2 g Zd 1, yeast extract 0.lg / dl, meat extract 0.1 gZd 1 was inoculated into a 1-liter Erlenmeyer flask containing 125 ml of a culture medium (pH 7.2), and cultured with shaking at 30 ° C. for 48 hours. Add 25 ml of this culture medium containing 2375 ml of medium with the same composition as the above medium. Put in a 5 liter jar armmenter and agitate with aeration. C. The cells were cultured for 2 days.
  • This solution was dialyzed against 5 liters of GP buffer for 24 hours.
  • the dialysis solution was passed through a column of DEAE-Cell Mouth Fine (manufactured by Seikagaku Corporation) (1 and 5 cm in diameter) equilibrated with GP buffer. By this operation, trehalase is adsorbed on the column. Further, impure proteins were washed away with the same buffer. Next, elution was performed with a concentration gradient of salt from the GP buffer to the GP buffer containing 1M salt.
  • the active fractions eluted at about 0.4-0.6 M are combined, ammonium sulfate is added to the active fractions, and the portion that precipitates at 70% saturation with ammonium sulfate is centrifuged (1,200 X g, 20 min) and dissolved in 50 ml GP buffer. This solution was dialyzed against 2 liters of GP buffer for 24 hours to obtain a purified trehalase enzyme preparation.
  • the specific activity of the enzyme preparation was 21 mU / mg.
  • the specific activity of the enzyme preparation was 15 mU Zmg.
  • a method for enzymatic quantification of 1,5-anhydroglucitol, a reagent for use in the method, and a method for enzymatic quantification of 1,5-anhydroglucitol are provided.
  • a novel trehalase suitable for use and a method for producing the same are provided.
  • the quantification of 1,5-anhydroglucitol concentration is useful for the diagnosis of diabetes, and according to the present invention, 1,5-anhydroglucitol can be accurately and rapidly quantified. it can.

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Description

明細書
1 , 5—アンヒドログルシトールの定量法
技術分野
本発明は、 1， 5—アンヒドログルシトールの酵素的定量方法及びそれに用い る定量用試薬並びに 1， 5—アンヒドログルシトールの酵素的定量方法に利用す ると好適な新規なトレハラ一ゼ及びその製造方法に関する。 1， 5—アンヒドロ グルシトール濃度の定量は、 糖尿病の診断に有用である。
背景技術
1 , 5—アンヒドログルシトールは、 ヒト髄液及び血漿中に存在し、 疾患特に 糖尿病においてその量が変化することが知られており、 糖尿病の診断マーカ一と して重要である。 従来、 1 , 5—アンヒドログルシトールの定量方法としては、 ガスクロマトグラフィー等の特殊な分析機器を用いて定量する方法、 1， 5—ァ ンヒドログルシトールを特異的に酸化する酵素を用いて定量する方法 （特開昭 6 2 - 7 9 7 8 0号公報） 、 サンプル中に共存するグルコースなどを種々の酵素を 用いて別の物質に変換した後、 残存する 1 , 5—アンヒドログルシトールをビラ ノースォキシダ一ゼ又は L—ソルボースォキシダ一ゼを用いて定量する方法 （特 開昭 6 3— 1 8 5 3 9 7号公報） 等が知られている。
一般に液体クロマトグラフィーやガスクロマトグラフィー等の機器分析では検 体前処理が煩雑であり、 しかも特殊で高価な分析装置が必要なうえ、 分析に長時 間を要することから多数の検体の測定は困難である。 また 5—アンヒドログ ルシトールに特異的に作用する酵素を用いる方法では、 酵素の調製が難しく、 適 当な検出系に導くのも容易ではない。 また、 ビラノースォキシダ一ゼを用いる方 法では、 ビラノ一スォキシダ一ゼの基質特異性が十分ではない。
発明の開示
本発明は、 1， 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害さ れる酵素に、 試料中の 1， 5—アンヒドログルシトールを共存させて該酵素の酵 素活性を測定することを特徴とする 1， 5—アンヒドログルシトールの定量方法 並びに 1, 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素、 該酵素の基質及び該酵素反応により生成する物質の定量用試薬からなる 1， 5—アンヒドログルシトール定量用試薬に関する。 また、 1， 5—アンヒドログ ルシトールに対する K i値が 0. 3 3 mM以下であって、 理化学的性質が、
(1) 作用：水の存在下、 1分子のトレハロースを加水分解して、 2分子の D - グルコースを生成する、 一般式 （I) トレハロース + H20 " 2 D-グルコース （I) に示される反応を触媒する。
(2) 基質特異性： トレハロースに特異的に作用する。
(3) 基質親和性： トレハロースに対する Km値は、 6. 7mMである。
(4) 至適 pH及び安定 pH：至適 pHは 5〜6であり、 安定 pH範囲は、 5 0°C、 3 0分間の処理で pH 5〜1 0である。
( 5 ) 至適温度及び熱安定性：至適温度は 45 °C付近である。 また本酵素は p H 5. 0で 3 0分間の処理では、 50 まで安定である。
( 6 ) 阻害剤： 1 , 1 0—フエナント口リ ン、 エチレンジアミンテトラ酢酸 （以 下、 EDTAと略記する。 ） 、 2， —ビビリジル等の金属キレート試薬、 p 一メルクリ安息香酸、 ョ一ドアセトアミ ド等の SH阻害剤、 ヒ ドロキシルァミ ン、 硫酸二ッケル等で阻害される。
( 7 ) 分子量： ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルァミ ドゲル電気泳動で測 定した本酵素のサブュニッ卜の分子量は、 約 90, 000であり、 ゲルろ過法で 測定した分子量は、 約 4 00, 000である新規トレハラ一ゼ並びにノカルディ ァ属に属し、 上記理化学的性質を有する新規トレハラーゼを生産する能力を有す る菌株を培地に培養し、 その培養物から該トレハラ一ゼを採取することを特徴と するトレハラ一ゼの製造方法に関する。 本発明に用いられる試料としては、 1 , 5—アンヒドログルシトールを含むも のであれば特に制限はなく、 生体試料、 例えば髄液、 血清、 血漿、 尿等及びこれ らの試料を処理した処理液が例示される。
1 , 5—アンヒ ドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵素と しては、 1， 5 —アンヒドログルシトールでその酵素活性が濃度依存的に阻害さ れるものであれば、 昆虫、 動物、 植物、 微生物等如何なる起源の如何なる酵素で も用いうる。 具体的に好適な酵素としては、 例えばトレハラ一ゼ、 卜レハロース ホスホリラーゼ等トレハロースを基質とする酵素があげられる。 これらの酵素は 市販品を用いることもできる力 微生物を培養して該酵素を調製して用いてもよ い。
卜レハラ一ゼを生産する微生物としては例えば、 ストレブトマイセス
(Streptomvces) 、 ノカノレアィァ (Nocardia; 厲、 ロ トコッカス
(Rhodococcus ) 属等に属する微生物があげられる。
ストレプトマイセス (Streptomyces) 属に属する微生物としては、 例えばスト レプトマイセス *オーレオファシエンス （Streptomvces aureofaciens) ATCC 10762 、 ス トレプトマイセス ' クロモフスカス（Streptomyces chromofuscus) ATCC 23896等があげられる。 ノカルディア (Nocardia) 属に属する微生物として は、 例えばノカルディア ' トランスバレンシス (Nocardia trans valensis) ATCC 6865 等があげられる。 ロドコッカス (Rhodococcus) 属に属する微生物としては、 例えば口ドコッカス 'グロベルラス (Rhodococcus loberulus) ATCC 14898、 口 ドコッカス 'グロベルラス （Rhodo occus globerulus) ATCC 15076、 口 ドコッ力 ス， ロドクラウス (Rhodococcus rhodochrous) ATCC 17895等があげられる。 また、 トレハロースホスホリラ一ゼを生産する微生物としては、 例えば力テラ トスボラ (Catellatospora) 属、 キネォスポリア (Kineosporia) 属等に属する微 生物があげられる。
力テラ卜スポラ （Catellatospora) 属に属する微生物としては、 例えば力テラ トスボラ ·フェルギネア (Catellatospora ferruginea) FERM BP- 4329 等があげ られる。 キネォスポリア (Kineosporia) 属に属する微生物としては、 例えばキネ ォスポリア *ォウランチア力 (Kineosporia aurantiaca) ATCC 29727等があげら れる。
これら微生物の属する種の菌学的性質は、 次の文献に記載されている。 ストレ プトマイセス ·オーレオファシエンスは、 バ一ジーズ ·マニュアル，ォブ · シス アマアイ ック * ヽクァリオロジ一 (Bergey s Manual of Systematic
Bacteriology) , Vol. 4 p. 2478 (1989)に、 ストレプトマイセス · クロモフス カスは、 バ一ジ一ズ'マニュアル ·ォブ · システマティ ック ·バクテリオロジ一 (Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology) Vol. 4, p. 2472 (1989)に、 ノカルディァ · トランスバレンシスは、 バ一ジ一ズ ·マニュアル ·ォブ · システ マティ ック · 7テリォロシ一 (Bergey s Manual of Systematic
Bacteriology) , Vol. 2 p. 1469 (1986)と Vol. 4, p. 2359 (1989)に、 ロドコ ッカス ·グロベルラスは、 —ジ一ズ ·マニュアル ·ォブ · システマティ ック · ヽクテリォロン一 (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology) Vol. 2, p. 1479 (1986)と Vol. 4, p. 2369 (1989)に、 ロドコッカス 'ロドクラウスは、 バ —ジ一ズ ·マニュアル ·ォブ · システマティ ック ·パクテリォロジ一 （Bergey' s Manual of Systematic Bacteriology) , Vol. 4, p. 2365 - 2367 (1989)に、 力 テラトスポラ ·フェルギネアは、 ィンターナショナル · ジャーナル ·ォブ♦ シス テマティ ック ·バクテリオ口ジ一 （Int. J. Syst. Bacteriol. ) , 36, 512-517 (1986)に、 キネォスポリア ·ォウランチア力は、 バ一ジ一ズ ·マニュアル ·ォ ブ · システマティ ック · 'クテリオロン一 (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology) Vol. , p. 2504-2506 (1989)に記載されている。
次に、 該微生物の培養方法及び該微生物の生産する酵素の精製方法について述 ベる。
トレハラ一ゼを生産する微生物、 例えばストレブトマイセス属、 ノカルディア 属、 口ドコッカス属等に属する微生物及びトレハロースホスホリラ一ゼを生産す る微生物、 例えば力テラトスボラ属、 キネォスポリア属等に属する微生物の培養 は放線菌、 細菌等の培養において用いられる通常の培養方法が用いられる。
培地としては、 例えば炭素源、 窒素源、 無機塩等を含有するものであれば、 天 然培地又は合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、 例えば炭水化物、 糖アルコール、 有機酸等が用いられる。 炭 水化物としては、 例えばグルコース、 シュクロース、 マルト一ス、 トレハロース、 澱粉、 糖蜜等をあげることができる。 糖アルコールとしては、 例えばグリセ口一 ル、 ソルビトール、 マンニトール等をあげることができる。 有機酸としては、 例 えば酢酸、 乳酸、 ピルビン酸、 クェン酸等をあげることができる。
窒素源としては、 例えば無機又は有機アンモニゥム塩、 窒素含有有機物質等が 用いられる。 無機又は有機アンモニゥム塩としては、 例えばアンモニア、 塩化ァ ンモニゥム、 炭酸アンモニゥム、 燐酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム等をあげ ることができる。 窒素含有有機物質としては、 例えば尿素、 アミノ酸、 ペプトン、
N Z—ァミン、 肉エキス、 コーンスチ一プリカ一、 カゼイン加水分解物、 酵母ェ キス等が用いられる。
無機塩としては、 例えば燐酸第一力リゥム、 燐酸第二力リゥム、 塩化力リゥム、 塩化ナトリゥム、 硫酸マグネシウム、 硫酸第一鉄などが用いられる。
培養方法としては、 液体培養方法、 特に深部攪拌培養方法が適している。 培養 は、 p H 6 . 0〜8 . 0、 温度2 5〜3 7でで、 1 ~ 7日間静置又は通気攪拌し ながら行う。
このように培養することにより、 培養物中、 主に蘭体中にトレハラ一ゼ又はト レハロースホスホリラ一ゼが生成蓄積する。 培養物中からのトレハラ一ゼ又はト レハロースホスホリラ一ゼの採取は例えば次の様に行う。
培養終了後、 培養液より遠心分離あるいは濾過により菌体を集める。 菌体を超 音波破砕機等により破砕し、 粗酵素抽出液を得る。 この粗酵素抽出液を通常酵素 精製に用いられる方法、 例えば、 塩析、 有機溶媒沈殿、 透析、 イオン交換カラム クロマトグラフィー、 ゲル濾過、 凍結乾燥等の方法にて処理する。 このようにし て精製トレハラ一ゼ又は精製トレハロースホスホリラ一ゼを採取することができ る。
本発明の新規なトレハラーゼの理化学的性質は下記の通りである。
( 1 ) 作用
本発明の酵素は、 水の存在下、 1分子のトレハロースを加水分解して、 2分子 の D—グルコースを生成する、 一般式 （ I ) トレハロース + H20 2 D-グルコース （ I ) に示される反応を触媒する。
( 2 ) 基質特異性及び阻害特異性
p H 5 · 5の 1 0 0 mMリン酸緩衝液中、 基質濃度 1 . 7 5 mMの条件下で本酵 素の各種基質に対する活性を測定し、 トレハロースに対する活性を 1 0 0として 相対活性を調べた結果を第 1表に示す。
第 1 表 糖 相対活性 (%) 卜レハ口一ス 0 0
トレハロサミ ン 0
コージビオース 0
ニゲロース 0
マルトース 0
ラクトース 0
シユークロ一ス 0 第 1表からトレハロースに特異的に作用することがわかる。 また、 本酵素の 1 , 7 5 mMの各種糖類に対する阻害特異性をトレハロースを基質に用いて調べた結 果を第 2表に示す c
第 2 表 糖 阻害率 (%)
1, 5—アンヒ ドログルシトール 8 0
コージビオース 0
ニゲロース 0
マルトース 0
ラク 卜ース 0
シユークロ一ス 0
( 3 ) 基質親和性
p H 5. 5の条件下、 本酵素のトレハロースに対する Km値をラインゥヱーバ —ク · プロッ ト (Lineweaver— Burk plot) [ンャ一ナノレ ·オフ' ' アメ リカ ン * ケミカル · ソサイャティ一 （J. Am. Chem. Soc. ) 56, 658(1934) ] により求 めると、 6. 7mMである。
(4) P且害剤親和性
p H 5. 5の条件下、 本酵素の 1 5—アンヒドログルシトールに対する K i 値をラインゥ く'—ク '、 ·プロッ 卜（Lineweaver—Burk plot) ίこより求めると 0. 33mMである。
(5) 至適 p H
pH 5. 0 8. 0までリン酸緩衝液を用いて活性を求め， 至適 pHを調べた ところ図 1に示すような p H -活性曲線が得られた。 本酵素の至適 p Hは 5 ~ 6 である。
(6) pH安定性
p H 2. 6— 1 2. 0のユニバーサル緩衝液 （Johnson- Lindsay緩衝液、 基礎 生化学実験法、 6巻、 丸善） 中にて 50°C、 30分間の処理した後、 残存活性を 測定した。 その結果、 図 2に示すとおり、 pH 5~l 0の範囲で安定である。 ( 7 ) 熱安定性
本酵素の熱安定性を調べるため、 p H 5. 0のリン酸緩衝液で各温度に 3 0分 曰保った後、 残存活性を測定した。 その結果、 図 3に示すとおり、 5 0°Cまで安 定である。
(8) 至適温度
p H 5. 5のリン酸緩衝液を用いて本酵素の至適温度を測定した。 その結果を 図 4に示す。 至適温度は 4 5 °C付近である。
(9) 阻害剤及び金属イオンの影響
本酵素に及ぼす金属キレート試薬、 酵素の阻害剤及び金属イオン等の影響を、 各種 ImMの濃度で調べた。 結果を第 3表に示す。
第 3 表 化合物 阻害率 (%) ジェチルジチ才力ルバミン酸 5 1. 0
2, 2' 一ビビリジル 6 0. 0
EDTA 6 7. 6
1, 1 0—フエナント口リン 8 8. 5
P—メルクリ安息香酸 9 4. 7
N—ェチルマレイミ ド 2 1. 9
ョ—ドアセトアミ ド 8 3. 6
N—ブロモスクシンィミ ド 2 3. 4
ヒドロキシルァミン 8 1. 2
アジ化ナトリウム 22. 8
C o C 1 2 2 0. 4
N i SO, 62. 1
Zn S04 53. 4
B a C 1 , 4 0. 7 本酵素は、 1, 1 0—フエナント口リン、 エチレンジアミンテトラ酢酸、 2， 2 ' —ビピリジル等の金属キレート試薬、 ρ—メルクリ安息香酸、 ョ一ドアセト アミ ド等の S H阻害剤、 ヒドロキシルァミン、 硫酸ニッケル等で阻害される。
(1 0) 分子量
ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で測定した本酵素 のサブュニットの分子量は、 約 9 0， 000であり、 高速液体クロマトグラフィ —によるゲルろ過法で測定した分子量は、 約 400， 00 0である。
(1 1)均一性
本酵素は、 ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により 単一のバンドが得られた。 すなわち、 トリス一グリシン緩衝液 （p H 8. 3 ) 中 で約 6 0分間泳動を行ったのち、 クマシ一染色液で染色することにより単一の蛋 白質のバンドが観察された。
(1 2) 力価の測定方法
酵素の力価の測定は下記の方法で行う。
1 ) 試薬
①基質溶液
トレハロースを 1 2. 5mMになるように 1 00 mMリン酸緩衝液 （p H 5. 5) に溶解する。
②発色試薬
グルコースォキシダーゼ （東洋紡、 Grade Π) を最終濃度 0. 04 m g , m 1、 ペルォキシダーゼ （東洋紡、 Grade III) を最終濃度 0. 0 4 mg/m 1. 4-アミノアンチピリンを最終濃度 1. 2 mM、 フユノ一ルを最終濃度 2 1 mM になるように水に溶解する。
2) 操作
基質溶液 1 m 1に酵素溶液 0. 02m lを添加し、 3 7 °Cで 3 0分反応させ た後、 1 00°Cで 3分加熱して反応を止める。 次にその反応液に発色試薬 lm 1を添加し、 37°Cで 2 0分反応させた後 500 nmにおける吸光度を測定す る。 なお対照液は、 酵素溶液の代りに水を添加する以外は、 前記と同様にした ものである。
3 ) 力価の計算方法
トレハラーゼの単位は、 3 7°Cで 1分間に 1 mo 1のトレハロースを加水 分解できる酵素量を 1単位と定義する。 それ故、 酵素溶液 lm l当りの力価 (UZm l) は正味の吸光度差 （酵素溶液一対照液） 力、ら、 次式で求められる。
2. 0 2m l X 吸光度差
力価 （U,ra 1 ) =
5. 3 3 X 0. 0 2 m l x 3 0分 X 2 次に、 本発明の新規トレハラーゼの製造方法について説明する。 使用される微 生物は、 ノカルディア属に属し、 前述の新規トレハラ一ゼの生産能を有する菌株 であり、 その具体例としては、 ノカルディア 'エスピー (Nocardia sp. ) NK— 206 7があげられる。 この菌株は本発明者らが土壌より分離した菌株でありそ の菌学的性質は以下に示すとおりである。 なお菌学的性質の同定のための実験方 法は主に長谷川武治著「微生物の分類と同定」 東京大学出版会 （1 9 7 5年） に よって行なった。 また、 分類、 同定の基準として、 バージーズ ·マニュアル'ォ ブ · システマティ ック · ヽクテリオロン一 (Bergey s Manual of Systematic Bacteriology) ( 1卷〜 4巻） （ 1 9 8 6 - 1 98 9年） などを参考にした。 本発明者らは土壌より新たに分離したノカルディア (Nocardia) に属する放線 菌 NK— 206 7株が 1， 5—アンヒドログルシトール高感受性トレハラーゼを 生産することを見いだした。
上記の放線菌 NK - 206 7株の形態、 培養、 生理学的性質における特徴を記 述する。
1. 形態学的性質
1) 菌糸
気菌糸形成；単純分岐
気菌糸の分断；分断が認められる 基生菌糸の分断；分断が認められる
2) 胞子
胞子の形成の有無及び着生位置；気菌糸に胞子形成する
胞子囊の形成の有無及び着生位置；形成しない
胞子柄上で連鎖する胞子の数； 1 0個以上
胞子の特徴
表面構造；平滑
形状及び大きさ ；桿状形、 約 0. 7〜1. 0 //mx 0. 7〜2. 0 運動性及び鞭毛の存在；無
3) その他
厚膜胞子；無
集束菌糸；無
疑似胞子囊；無
菌糸の分裂様式；単純分岐
2. 培養学的性質
NK- 2 06 7株は、 一般に使用されている合成及び天然培地で普通もしくは 旺盛な生育を示し、 基生菌糸は白色から薄桃色系を示す。 培地により茶色系の可 溶性色素が産生されることもある。
各種培¾±での 28°C、 1 4日間培養したときの生育及び色の特徴を下記に示 す。 なお、 色の表示は、 カラ一♦ハーモニー♦マニュアル （Color Harmony Manual) [コンテイナ一 ·コーポレーション ·ォブ 'アメリカ （Container Corporation of America) 、 第 4版 （ 1 95 8年） ] による色の分類に従った。
1) シュクロース ·硝酸塩寒天培地
生育状態；貧弱
基生菌糸の色調；ホワイト （a)
気菌糸の着生状態とその色調；着生しない 可溶性色素；無
2) グルコース ·ァスパラギン寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；フレツシュピンク （4 c a) 〜ダスティ―ピ一チ （5 e c)
気菌糸の着生伏態とその色調；普通、 ホワイト （a)
可溶性色素；無
3) グリセリン .ァスパラギン寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調； フレッシュピンク （ 5 c a ) 〜ライトローズべ—ジュ (4 e c)
気菌糸の着生状態とその色調；貧弱、 ホワイ ト （a)
可溶性色素；無
4) スターチ ·無機塩寒天培地
生育状態；貧弱
基生菌糸の色調；オートミール （ 2 e c )
気菌糸の着生状態とその色調；着生しない
可溶性色素；無
5) チロシン寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；ヌードタン （4 g c) 〜コーク夕ン （4 i e) 気菌糸の着生状態とその色調；貧弱、 ホワイト （a)
可溶性色素；産生 （赤褐色）
6 ) 栄養寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；ライトマスタードタン （2 i e) 気菌糸の着生状態とその色調；着生しない
可溶性色素；無
7) イースト ·麦芽寒天培地
生育状態；旺盛
基生菌糸の色調；シナモン （3 1 e)
気菌糸の着生状態とその色調；着生しない
可溶性色素；わずかに産生 （黄土色）
8) ォ—トミ一ル寒天培地
生育状態；貧弱
基生菌糸の色調；オートミール （ 2 e c )
気菌糸の着生状態とその色調；着生しない
可溶性色素；無
3. 生理学的性質
NK- 2 0 6 7株の生理学的諸性質を以下に示す。 生育温度範囲は 1 4日間培 養後、 その他は 2 8°C、 2〜 3週間培養後の結果を記述する。
1 ) 生育温度範囲； 6 °C〜 3 6 °C
2) ゼラチンの液化；有
3) スターチの加水分解；無
4 ) 脱脂粉乳の凝固及びぺプトン化；無
5) メラニン様色素の生成
(1) ペプトン .イースト ·鉄寒天培地；有
(2) チロシン寒天培地；有
6 ) 炭素源の利用'性
基礎培地はプリ一ドハム ·ゴトリーブ寒天培地を使用した。 以下、 +は利用す ることを、 一は利用しないことを示す。
Lーァラビノース ； 一 D—キシロース ； 一
D—グルコース ； +
シュクロース ； +
ラフイノ一ス ； ー
D—フルク トース ； +
ラムノース ； 一
イノシトール ； +
D—マンニトール ； 一
7 ) 分解能
基礎培地はニュー トリエント寒天培地を使用した。 以下、 +は分解することを、 は分解しないことを示す。
チロシン ； 一
アデニン ；一
キサンチン ； +
ヒポキサンチン ； +
尿素 ； +
8 ) 酸産生能
基礎培地はぺプトン水における液体培地を使用した （指示薬としてプロモチモ ルブル—を使用） 。 以下、 +は産生することを、 一は産生しないことを示す。
グルコース ； +
ガラク トース ； 一
イノシトール； 一
マルトース
マンノース
ラムノース
ソルビトール； 一 ァラビノース ； 一
アド二トール； 一
9) 食塩耐性
基礎培地はニュートリエント寒天培地を使用した。 以下、 +は生育することを、 一は生育しないことを示す。
0 %N a C 1 ： +
1 %N a C 1 ； +
2 %N a C 1 ； +
4 %N a C 1
6 % a C 1
1 0 %N a C 1 ； ー
4. 化学分類学的性質
1 ) 菌体中のジァミノピメリン酸の光学異性体； メソ （m e s o) 型
2) 菌体脂質の主要キノン ； MK (メナキノン） 一 8 ( I I， I I I— H 4， ω—サイクル）
3) 菌体脂質のミコ—ル酸；有する
4) 全菌体主要糖成分；ァラビノ―ス及びガラク トースを有する
以上、 形態学的には基生菌糸の分断が認められ、 気菌糸に胞子鎖が形成された こと、 化学分類学的には細胞壁からメソージァミノピメリン酸、 ァラピノ一ス及 びガラクト一スが検出されたが、 グリシンは認められず、 主要キノンがメナキノ ンー 8の 2飽和型、 オメガサイクル [ΜΚ— 8 (1 1， I I I -Η 4, ω—サイ クル） ] で、 ミコール酸を有したことから、 本菌株は放線菌の中でノカルディア (Nocardia) 属に属することを確認した。
従って、 本菌株をノカルディ了 ·エスピー (Nocardia sp. ) NK— 2 06 7と 命名し、 1 996年 1月 1 1日付けで日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号 (郵便番号 305 ) 通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM B P— 5 3 5 9として寄託してある。
ノカルディア属に属し、 前述の新規トレハラーゼを製造する方法は、 前述の微 生物の培養方法及びその微生物の生産する酵素の精製方法と同様な方法が用いら 次に、 1 , 5—アンヒドログルシト一ルにより濃度依存的に活性が阻害される 酵素に、 試料中の 1， 5—アンヒドログルシトールを共存させて該酵素の酵素活 性を測定することを特徴とする 1， 5—アンヒドログルシトールの定量方法につ いて説明する。
試料中の 1， 5 -アンヒドログルシトール濃度は、 予め作成した既知濃度の 1 , 5 _アンヒドログルシトール量を共存させたときの 1， 5—アンヒドログルシ卜 ールにより濃度依存的に活性が阻害される酵素の酵素活性と 1， 5 -アンヒドロ グルシトール濃度を示す検量線を用いて、 該酵素に試料を共存させたときの該酵 素活性から定量できる。
上記酵素活性の代わりに、 1， 5—アンヒドロダルシト一ル非存在下での該酵 素の酵素活性 （ A ) と 1 , 5—アンヒドログルシトール存在下での該酵素の酵素 活性 （B ) との差 （A— B ) を用いる方法や次式により求められる阻害率を用い ることもできる。 阻害率 (%) = [ (A - B ) /A x 1 0 0 ]
A： 1 , 5 一アンヒ ドログルシ トール非存在下での該酵素の酵素活性 B： 1 , 5—アンヒ ドログルシ トール存在下での該酵素の酵素活性
1 , 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵素の 酵素活性は、 通常の酵素活性測定方法で測定できる。 酵素反応は、 水性媒体中、 該酵素及び該酵素の基質、 必要に応じて該酵素の活性調節剤を含む反応溶液中で 1 0〜 5 0 °Cで 1〜 6 0分、 好ましくは 1〜 2 0分間、 より好ましくは 2 5〜4 0 で5 ~ 1 5分間行う。 酵素活性測定は、 一定条件下酵素反応により生成した 生成物の濃度ある L、は減少した基質の濃度を直接ある L、は他の化合物に導きその 濃度を測定することにより行う。
水性媒体としては、 緩衝液、 生理食塩水等水を含有する液体を例示できるが緩 衝液が好ましい。
緩衝液としては、 例えば乳酸緩衝液、 クェン酸緩衝液、 酢酸緩衝液、 コハク酸 緩衝液、 フタル酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 トリエタノールァミン緩衝液、 ジエタ ノールァミン緩衝液、 リジン緩衝液、 バルビツール緩衝液、 トリス （ヒドロキシ メチル） ァミノメタン緩衝液、 イミダゾ一ル緩衝液、 リンゴ酸緩衝液、 シユウ酸 緩衝液、 グリシン緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 炭酸緩衝液、 グッド緩衝液等があげら れる。
酵素活性調節剤としては、 E D T A、 1 , 1 0—フヱナント口リン等の金属キ レート剤、 マンニトール、 グリセロール等の糖アルコール、 亜鉛、 銅等の金属ィ オン、 ョード醉酸、 ョ一ドアセトアミ ド等の S H阻害剤があげらる。
1 , 5—アンヒドログルシトールで活性が阻害される酵素としてトレハラ一ゼ を用いる場合の 1 , 5 —アンヒドログルシトールの定量方法について以下に詳細 に説明する。
トレハラ一ゼは式 （I ) の反応を角虫媒する酵素であり、 トレハロース 1分子と 水 1分子から 2分子の D—グルコースを生成させる。 トレハロース + H20 " 2 D -グルコース （ I ) 酵素反応は、 前述の水性媒体中、 トレハロース、 トレハラ一ゼ及び必要に応じ て前述の酵素活性調節剤を含む反応液中で 1 0〜5 0 °Cで 1〜2 0分間、 より好 ましくは 2 5〜 4 0 °Cで 5〜 1 5分間行う。
本酵素の活性は、 D—グルコースを検出する方法で検出すればよく化学的な方 法や生化学的な方法が用いられる。 D—グルコースの増加量は、 直接還元力等の 増加を化学的に測定することができる力く、 必要に応じて別の物質に変換して測定 することができる。 特に好ましくは、 D—グルコースに対して特異性に優れ、 汎 用型の自動生化学測定装置に適用可能な、 酵素を利用する D—グルコースの検出 方法がある。
具体的な例として、 1) グルコースォキシダ一ゼを用いて D—グルコースを酸 化し、 その反応で生成した過酸化水素を比色方法等を用いて検出する方法、 2) ビラノースォキシダ一ゼを使用して D—グルコースを酸ィ匕しその反応で生成した 過酸化水素を比色方法等を用いて検出する方法、 3) グルコースデヒドロゲナ一 ゼを使用し、 補酵素ニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチド （以下、 NADと略 記する。 ） 又はニコチンアミ ドアデニンジヌクレオチドリン酸 （以下、 NADP と略記する。 ） の存在下に D—グルコースを脱水素反応し、 その反応で生成した 補酵素の還元体である NAD H又は NADP Hの吸光度を分光光度計で検出する 方法、 4) アデノシン三リン酸の存在下、 へキソキナーゼ又はグルコキナーゼで D—グルコースをリン酸ィ匕し、 生成した D—グルコース— 6 -リン酸を補酵素 N ADPの存在下にグルコース— 6—ホスフヱ一トデヒドロゲナ一ゼで脱水素反応 し、 その反応により生成した補酵素 N A D P Hの吸光度を分光光度計で検出する 方法などがあげられる。
以上のように D—グルコースを検出しゃすい中間物質、 例えば過酸化水素や上 述の NADH又は NADP H等の補酵素に酵素的に変換し、 最終的にはこれら中 間物質を定量することにより、 D—グルコースが定量される。 過酸化水素は、 例 えば比色方法、 蛍光方法、 化学発光方法、 電極方法等で、 補酵素 NADH又は N A D P Hは、 例えば比色方法で定量できる。
比色方法としては、 ペルォキシダーゼ等の酵素により過酸化水素で呈色試薬を 発色させた後、 分光光度計で測定する方法があげられる。 呈色試薬としては、 ト リンダ一型呈色試薬又はロイコ型呈色試薬があげられる。
トリング一型呈色試薬としては、 例えばフエノール、 3—ヒドロキシー 2, 4， 6—トリョード安息香酸などのフエノール系化合物や N—ェチルー N— (2—ヒ ドロキシー 3—スルホプロピル） —m— トルイジン、 N—ェチルー N— (2—ヒ ドロキシ— 3—スルホプロピル） 一 3， 5—メ トキシァニリ ン、 N— (2—ヒ ド ロキシ一 3—スルホプロピル） 一 3, 5—ジメ 卜キシァ二リ ンナトリウム、 N— ェチル一 N— （3—メチルフエニル） 一N' —スクシニルエチレンジァミ ン （以 下、 EMS Eと略記する。 ） 等のァニリン系化合物と 4ーァミノアンチピリンと の組み合わせ試薬があげられる。
ロイコ型呈色試薬としては、 例えば 1 0—N—カルボキシメチルカルバモイ ルー 3， 7 -ビス （ジメチルァミノ） 一 1 0H—フエノチアジン、 Ι Ο—Ν—メ チルカルバモイルー 3, 7—ビス （ジメチルァミノ） 一 1 0H—フエノチアジン、 N— （カルボキシメチルァミ ノカルボニル） 一 4， 4' —ビス （ジメチルアミ ノ） ジフエニルァミ ン ナトリウム塩、 4， 4' —ビス （ジメチルァミノ） ジフエ ニルァミ ン、 ビス [3—ビス （4一クロ口フエニル） メチルー 4—ジメチルアミ ノフヱニル] ァミ ン等があげられる。
蛍光方法としては、 ペルォキシダーゼ等の酵素により過酸化水素で蛍光試薬を 蛍光物質に変換させた後、 蛍光光度計で測定する方法があげられる。 蛍光試薬と しては、 p—ヒ ドロキシフエニル酢酸、 p—ヒ ドロキシフエニルプロピオン酸、 クマリン等があげられる。
化学発光方法としては、 ペルォキシダ一ゼ等の酵素により過酸化水素で発光試 薬を発色させた後、 ルミノメータ等で測定する方法があげられる。 発光試薬とし ては、 例えばルミノール、 イソルミノール、 ルシゲニン、 ァクリジニゥムエステ ル等の化合物があげられる。
NADHゃHADPH等の補酵素は、 直接吸光度を測定して定量できるが、 さ らに他の化合物に変換させて定量できる。 例えば NADPHはテトラゾリゥム塩 類とを反応させて生成するホルマザン色素を分光光度計で測定する方法で定量で きる。
前述の 1) の方法による具体的測定方法を以下に述べる。 トレハラ一ゼの酵素 活性は、 式 （I I) の反応を行わせることにより、 キノンィミン色素を生成させ 該色素の濃度を分光光度計で測定することにより行われる。 トレハラーゼ
トレハロース + H„0 ·· 2D-グルコース
(I I) グルコースォキシダ一ゼ
D -グルコース + 02 " D-ダルコノ -5-ラクトン + H202 パーォキシダーゼ
2H202 + 4-ァミノアンチピリン + EMSE ^ キノンイミン色素 + 5H20 本測定法による反応液は、 緩衝液、 例えばリン酸緩衝液中にトレハラーゼ、 グ ルコースォキシダーゼ、 パ一ォキシダ一 "l、 トレハロース、 4ーァミノアンチピ リン、 EMSE等を含む。 リン酸緩衝液は、 好ましくは pH 5. 0〜8. 0、 よ り好ましくは pH 6. 0〜7. 0、 濃度は、 好ましくは 1 0〜50 0 mM、 より 好ましくは 50〜25 OmMである。
トレハラ一ゼは好ましくは 0. 0 0 1〜 1 0 U/m 1、 より好ましくは 0. 0 l〜l U/m l、 グルコースォキシダ一ゼは、 好ましくは 1~1 0 O U/mし より好ましくは 1 0〜 50 UZm 1、 パ一ォキシダ一ゼは、 好ましくは 1〜50 U/m 1、 ょり好ましくは5〜2 011 111 1、 トレハロースは、 好ましくは 1 ~ 1 0 OmM、 より好ましくは 1 0〜50 mM、 4ーァミノアンチピリンは、 好ま しくは 0. 5〜50 mM、 より好ましくは 1〜 1 0 mM、 E M S Eは、 好ましく は 0. 5〜5 OmM. より好ましくは 1〜1 0 mMとなるように添加する。
反応は 1， 5—アンヒドログルシトールを含む試料を前述の反応液に添加し、 1 0〜 50 °Cで 1〜 2 0分間、 より好ましくは 2 5〜 40 °Cで 5〜： I 5分間行う。 酵素活性は、 反応で生成するキノンィミン色素を 550 nmの吸光度を測定する ことにより求めることができる。
試料中に D—グルコースが存在する場合は、 次に述べる方法によりあらかじめ 試料中の D—グルコ一スを消去することが好ましい。 D—グルコースが存在する 試料としては、 血液、 血清、 血漿等をあげることができる。
試料中の D—グルコースを消去する方法としては、 カラム等の物理的方法によ つて D グルコースを吸着、 除去する方法と、 化学的又は生化学的方法によって D—グルコースを他の物質に変換する方法があげられる。 自動生化学測定装置で 測定する場合は、 酵素を使用する生化学的な変換方法が好ましい。
D—グルコースを他の物質に変換する方法の具体例としては、 前述の D—グル コースの検出方法で述べた D -ダルコ一スの変換方法がそのまま利用できる。 例 えば、 1) グルコースォキシダーゼを使用して D—グルコースを D—ダルコノ— 5—ラクトンに変換する方法、 2) ビラノースォキシダーゼを使用して D—グル コースを 2—デヒドロー D—グルコースに変換する方法、 3) グルコースデヒド 口ゲナ一ゼを使用して D—グルコースを D—ダルコノー（5—ラクトンに変換する 方法、 4) へキソキナーゼ又はグルコキナーゼとグルコース— 6 -リン酸デヒド 口ゲナ一ゼを使用して D—グルコースを D—グルコノ— 5—ラクトン— 6—リン 酸に変換する方法、 などがあげられる。
試料中に D—グルコースが存在する場合の具体的な測定方法について述べる。 例えば、 試料に存在している D—グルコースを前述の 1) 又は 2) の反応方法で 他の化合物に変換した後、 生成した過酸化水素を例えば、 特開昭 57 - 83 28 7号公報に記載の過酸化水素消去方法で消去し、 次いで卜レハラーゼを作用させ て生成する D—グルコースを定量することができる。 また、 試料に存在している D—グルコースを前述の 3) 又は 4) の反応方法で他の物質に変換した後、 生成 する N ADH又は NADPHを N ADHォキシダーゼ又は NADPHォキシダー ゼ等の酵素で他の化合物に変換する。 このとき、 4) の方法を用いる場合は反応 液中に残存するアデノシン三リン酸をジァホラーゼ又はアデノシン卜リホスファ タ一ゼ等の酵素で他の化合物に変換する。 次いでトレハラ一ゼを作用させて生成 する D—グルコースを例えば前述の 1) 又は 2) の方法で定量することができる。 試料中の D—グルコースを消去し 1 , 5 —アンヒドログルシトールを定量する 具体的方法としては、 例えば試料中の D -グルコースをグルコースォキシダーゼ により D—ダルコノー 5—ラクトンと過酸化水素に変換し、 生成する過酸化水素 をパーォキシダーゼによりと E M S E等の過酸化水素消去化合物と反応させ過酸 化水素を消去した後、 前述の式 （I I ) 方法によりトレハラーゼの活性を測定す る方法があげられる。
即ち、 試料中の D—グルコースを、 緩衝液、 例えばリン酸緩衝液中にダルコ一 スォキシダ一ゼ、 パーォキシダ一ゼ、 E M S E等を含む反応液で 1 0〜5 0 °Cで 1〜2 0分間、 より好ましくは 2 5〜4 0 °Cで 5〜1 5分間行い、 D—ダルコ一 スを消去する。 次いで、 該反応液に、 トレハロース、 トレハラーゼ及び 4—アミ ノアンチピリン等を含む試薬を添加しトレハラ一ゼ活性を前述の方法で測定する ことにより行うことができる。 用いる試薬の濃度は前述と同様である。
また、 例えば試料中の D—グルコースをアデノシントリホスフヱ一卜とともに ダルコキナーゼにより D—ダルコノース一 6—リン酸に変換し、 該 D—ダルコノ —ス— 6—リン酸を N A D Pと共にグルコース— 6—リン酸デヒドロゲナーゼで D—ダルコノー <5—ラクトン— 6—リン酸と N A D P Hに変換したのち、 アデノ シントリホスフヱートを、 アデノシントリホスファタ一ゼを作用させて A T Pを 分解し、 次いで、 前述の式 （I I ) 方法によりトレハラ一ゼの活性を測定する方 法があげられる。
即ち、 試料中の D _グルコースを、 緩衝液、 例えばリン酸緩衝液中にダルコ一 キナーゼ、 A T P、 グルコース— 6 -リン酸脱水素酵素、 N A D Pを含む反応液 で 1 0〜 5 0 °Cで 1〜 2 0分間、 より好ましくは 2 5— 4 0 で 5 ~ 1 5分間行 い、 D—グルコースを消去する。 次いで、 アデノシントリホスファタ一ゼを添カロ し反応液に残存するアデノシン三リン酸を分解した後、 該反応液に、 レハロース、 トレハラ—ゼ、 パーォキシダ—ゼ、 4—ァミノアンチピリン及び E M S E等を含 む試薬を添加しトレハラ一ゼ活性を前述の方法で測定することにより行うことが できる。 用いる試薬の濃度は前述と同様である。 グルコキナーゼは好ましくは 0.
1-1 00 U/m 1、 より好ましくは 1〜 1 0 UZm 1、 グルコース一 6—リン 酸脱水素酵素は、 好ましくは 0. 1〜： I 00U/m l、 より好ましくは 1~1 0 U/m l、 アデノシントリホスファターゼは、 好ましくは 0. 1~1 0 O UZm
1、 より好ましくは 1〜1 0U/m l、 NADPは、 好ましくは 1〜 1 00 mM、 より好ましくは 1 0〜5 OmM、 アデノシン三リン酸は、 好ましくは 1~1 00 mM、 より好ましくは 1 0〜5 OmMとなるように添加する。 他の化合物及び酵 素濃度は前述と同様である。
次にトレハロースホスホリラ一ゼについて述べる。 トレハロースホスホリラ 一ゼは式 （I I I ) の反応を可逆的に触媒する酵素である。
トレハロース + リン酸 —-► D-グルコース +/S-D -グルコース- 1-リン酸 （I I I) 本酵素活性の測定は、 D—グルコース、 S - D—グルコース— 1—リン酸、 ト レハロース又はリン酸の濃度変化を公知の方法で直接測定することにより行い得 る力 他の化合物に誘導して濃度を測定してもよい。 式 （I I I) の右反応での 酵素活性は、 例えば式 （I V) の反応式により NADPHを生成させ光学的に濃 度を測定することにより求められる。
トレハ口一スホスホリラ一ゼ
トレハロース + リン酸 —— - D-グルコース + S-D -グルコース- 1-リン酸
(I V) β-ホスホグルコムタ一ゼ
/3-D-グルコース- 1-リン酸 " D-グルコース- 6-リン酸 グルコース- 6-リン酸デヒ ドロゲナ一ゼ
D-グルコース- 6-リン酸 + NADP― D -ダルコノ- ラク トン -6-リン酸 + NADPH 本酵素活性の測定反応液は、 緩衝液、 例えばりン酸緩衝液中にトレハロースホ スホリラ一ゼ、 S—ホスホグルコムターゼ、 グルコース— 6—リン酸デヒドロゲ ナ一ゼ、 トレハロース、 NADP等を含む。 リン酸緩衝液は、 好ましくは pH 5.
0〜 8. 0、 より好ましくは p H 6. 0-7. 0、 濃度は、 好ましくは 1 0〜 5 0 OmM、 より好ましくは 50〜2 5 OmMである。
トレハロースホスホリラ一ゼは、 好ましくは 0. 00 1〜 1 0 UZmし ょり 好ましくは 0. 0 1〜l UZm l、 ーホスホダルコムタ一ゼは、 好ましくは 0. 1〜50 U/m 1、 より好ましくは 1〜1 0 U/m 1、 グルコース一 6—リン酸 デヒドロゲナ一ゼは、 好ましくは 0. 1〜50 UZm 1、 より好ましくは 1〜1 0 U/m 1、 トレハロースは、 好ましくは 1〜 1 00 mM、 より好ましくは 1 0 〜5 OmM、 NADPは、 好ましくは 1〜 50 mM、 より好ましくは 5~2 0 m M添加する。
反応は， 1， 5—アンヒドログルシトールを含む試料を前述の反応液に添加し， 1 0~5 0°Cで 1〜2 0分間、 より好ましくは 2 5〜40°Cで 5〜1 5分間行う。 酵素活性は、 反応で生成する NAD PHを 34 0 n mの吸光度を測定することに より求めることができる。
また式 （ I I I ) の左反応での酵素活性は、 例えば式 (V) の反応式によりキノ ンィミン色素を生成させ光学的に濃度を測定することにより求められる。 トレハロースホスホリラーゼ
D -グルコース + -グルコース- 1-リン酸 ^ トレハロース + リン酸
(V) プリンヌクレオシドホスホリラーゼ
リン酸 + イノシン ► ヒポキサンチン + リボース- 1-リン酸 キサンチンォキシダ一ゼ
ヒポキサンチン + 202 + 2H20 " 尿酸 + 2¾02 パーォキシダーゼ
2 02 + 4-アミノアンチピリン + EMSE キノンイミン色素十 5B20 本酵素活性の測定反応液は、 緩衝液、 例えばィミグゾール緩衝液中にプリンヌ クレオシドホスホリラーゼ、 キサンチンォキシダーゼ、 パーォキシダ一ゼ、 ダル コース、 S—グルコース一 1一リン酸、 イノシン、 4—ァミノアンチピリン、 E M S E等を含む。 ィミダゾ一ル酸緩衝液は、 好ましくは pH5. 0〜8. 0、 よ り好ましくは pH 6. 0〜7. 0、 濃度は、 好ましくは 1 0〜2 00 mM、 より 好ましくは 50〜： 1 00 mMである。
プリンヌクレオシドホスホリラ一ゼは、 好ましくは 0. 1〜1 0 U/m l、 よ り好ましくは 1~5 UZm 1、 キサンチンォキシダ一ゼは、 好ましくは 1~50 U m 1、 より好ましくは 5〜2 0 UZm 1、 パーォキシダ一ゼは、 好ましくは 〜U/m 1、 より好ましくは 1〜50 UZm 1、 グルコースは、 好ましくは 5〜 2 00 mM、 より好ましくは 20〜1 00 mM、 β—ゲ コース一 1一リン酸は 好ましくは 5〜 2 00 mM、 より好ましくは 20〜： 1 00 mM、 イノシンは、 好 ましくは 0. 5〜50mM、 より好ましくは 1〜1 0 mM、 4—ァミノアンチピ リンは、 好ましくは 0. 5〜50mM、 より好ましくは 1〜1 0 mM、 EMS E は、 好ましくは 0. 5〜50mM、 より好ましくは 1〜1 OmM添加する。
反応は、 1, 5—アンヒドログルシトールを含む試料を前述の反応液に添加し， 1 0〜 50でで 1〜 20分間、 より好ましくは 25〜 40 °Cで 5〜 1 5分間行う。 酵素活性は、 反応で生成するキノンィミン色素を 5 50 nmの吸光度を測定する ことにより求めることができる。
次に本発明の、 1, 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻 害される酵素、 該酵素の基質及び該酵素活性により生成する物質の定量用試薬か らなる 1， 5—アンヒドログルシトール定量用試薬について説明する。
1, 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵素と してトレハラ一ゼを用いる場合は、 基質がトレハロースであり、 従って生成する 物質の定量用試薬とは、 D—グルコースの定量用試薬を示す。
1, 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵素と してトレハロースホスホリラ一ゼを用いる場合は、 基質は卜レハロースとリン酸 又は D—グルコースと^一グルコース— 1―リン酸であり、 生成する物質はそれ ぞれ D—グルコースと ーグルコース— 1一リン酸又は卜レハロースとリン酸で ある。 従って生成する物質の定量用試薬とは、 卜レハロース、 リン酸、 D—グル コース又は ;3—グルコース一 1 一リン酸のいずれかの定量用試薬を示す。
トレハラ一ゼ活性の定量用試薬は、 トレハロース及び D—グルコース定量用試 薬からなり必要に応じて緩衝液、 他の酵素、 基質、 補酵素等を含む。 トレハロー スホスホリラ一ゼ活性の定量用試薬は、 卜レハロース、 リン酸及び D—ダルコ一 ス定量用試薬もしくは iS—グルコース一 1―リン酸定量用試薬或いは D—グルコ ース、 —グルコース— 1 一リン酸及びトレハロース定量用試薬もしくはリン酸 定量用試薬からなり必要に応じて緩衝液、 他の酵素、 基質補、 酵素等を含む。
D—グルコース定量用試薬、 一グルコース一 1 一リン酸定量用試薬、 トレハ ロース定量用試薬、 リン酸定量用試薬には、 例えば前述の各物質の定量法で述べ た方法に使用する物質が用いられる。
また、 D—グルコース消去試薬には、 例えば前述の D—グルコースを酵素を用 いて他の物質に変換する方法に記載された物質が用いられる。
前述の 1 ) の方法で、 試料中の D—グルコースを消去する場合の D—ダルコ一 ス消去試薬には、 例えばグルコースォキシダ一ゼ、 パ一ォキシグーゼ、 E M S E を含み必要に応じて前述の緩衝液、 他の酵素、基質、 補酵素等を含む。 また、 前 述の 4 ) の方法で、 試料中の D—グルコースを消去する場合の D—グルコース消 去試薬には、 例えばグルコキナーゼ、 グルコース一 6—リン酸脱水素酵素、 アデ ノシントリホスファタ一ゼ、 アデノシン三リン酸、 N A D Pを含み必要に応じて 前述の緩衝液、 他の酵素、 基質、 補酵素等を含む。 D -グルコース消去試薬は、 前述の 1， 5—アンヒドログルシトール定量用試薬に組み込んだキットとして調 製されていてもよい。
使用するグルコースォキシグーゼ、 グルコースデヒドロゲナ—ゼ、 ピラノース ォキシダ一ゼ、 グルコキナーゼ、 へキソキナーゼ、 —ホスホグルコム夕一ゼ、 プリンヌクレオシドホスホリラ一ゼ、 キサンチンォキシダ一ゼ、 パ一ォキシダ一 ゼ、 アデノシントリホスファタ一ゼ等は市販品を使用いてもよいし、 これら酵素 を生産する微生物等を培養して得たものを使用してもよい。 また、 上述の緩衝液、 基質、 補酵素、 酵素の基質、 呈色試薬、 蜇光試薬、 発光試薬等は市販品を用いる ことができる。
1, 5—アンヒドログルシトールにより活性が阻害される酵素の一例として、 口ドコッカス 'グロベルラス (Rhodococcus globerulus) ATCC 14898のトレハラ ーゼについて試験例で説明する。
試験例 1 ( 1， 5—アンヒドログルシトールによる阻害の特異性）
1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 0 ) に参考例 3で調製したトレハラ一ゼ 1 OmUZm 1、 4ーァミノアンチピリン 0. 8 1mgZm l、 EMSE 1 mg/m 1. グルコースォキシダ一ゼ 30U/m l、 パ一ォキシダ一ゼ 1 0U Zm 1、 第 4表に示す被験糖 1 mMを加えて、 反応液を調製した。 この反応液に トレハロース 1 OmgZm 1を加えて攪拌後、 分光光度計にて 550 nmの吸光 度変化を測定した。
反応開始後から 1 0分間の吸光度の増加を測定し、 被験糖を添加しない場合の 吸光度の増加を Aとし、 被験糖 1 mMを添加した場合の吸光度の増加を Bとし、 それから阻害率 （％) を式 [ (A— B) ZAX 1 0 0 ]より算出した。 結果を第 4表に示す。
第 4 表 被験糖 ( 1 mM) 阻害率 (%)
1 , 5—アンヒドログルシトール 4 5 . 0
D—グルコサミン 0
N—ァセチルー D—ダルコサミン 0
D—マンノース 0. 5
D—ガラク ト一ス 0. 2
D—フルク ト一ス 0
D—フコース 0
Lーフコース 0
D—キシロース 0
マルトース 0
スクロース 0 ロドコッカス 'グロベルラス (Rhodococcus globerulus) ATCC 14898のトレノヽ ラ一ゼは、 1 , 5—アンヒドログルシトールに特異的に阻害される。
図面の簡単な説明
図 1は、 ノカルディァ ·エスピ一 (Nocardia sp. ) N K - 2 0 6 7由来のトレ ハラ一ゼの p H -活性曲線を示す。
図 2は、 ノカルディ了 ·エスピー (Nocardia sp. ) N K - 2 0 6 7由来のトレ ハラ一ゼの p H—安定性曲線を示す。
図 3は、 ノカルディ了 ·エスピー (Nocardia sp. ) N K - 2 0 6 7由来のトレ ハラ一ゼの熱安定性曲線を示す。
図 4は、 ノカルディア 'エスピー (Nocardia sp. ) N K - 2 0 6 7由来のトレ ハラ一ゼの温度一活性曲線を示す。
図 5は、 力テラトスポラ 'フェルギニァ (Catellatospora ferruginea ) FERM BP- 4329由来の卜レハロースホスホリラーゼの分解活性を指標とした場合の検量 線を示す。 縦軸は酵素活性の阻害率 （％) 、 横軸は 1 , 5—アンヒドログルシト —ル濃度 （mM) を表わす。
図 6は、 力テラトスポラ · フェルギニァ (Catellatospora ferruginea ) FERM BP - 4329由来のトレハロースホスホリラ一ゼの合成活性を指標とした場合の検量 線を示す。 縦軸は酵素活性の阻害率 （％) 、 横軸は 1， 5—アンヒドログルシト ール濃度 （mM) を表わす。
図 7は、 ストレプトマイセス .オーレオファシエンス （ reptomyce
aureofaciens ) ATCC 10762 由来のトレハラ一ゼを被験酵素とした場合の検量線 を示す。 縦蚰は酵素活性の阻害率 （％) 、 横軸は 1， 5—アンヒドログルシト一 ル濃度 （mM) を表わす。
図 8は、 ロドコッカス 'グロベルラス (Rhodococcus globerulus) ATCC 14898 由来のトレハラ一ゼを被験酵素とした場合の検量線を示す。 縦軸は酵素活性の阻 害率 （％) 、 横軸は 1 , 5—アンヒドログルシトール濃度 （mM) を表わす。
図 9は、 ノカルディァ ·エスピー (Nocardia sp. ) K - 2 0 6 7由来のトレ ハラーゼを被験酵素とした場合の検量線を示す。 縦軸は酵素活性の阻害率 （％) 、 横軸は 1， 5—アンヒドログルシトール濃度 （mM) を表わす。
図 1 0は、 ノカルディァ ·エスピー (Nocardia sp. ) N K - 2 0 6 7由来のト レハラ一ゼに対する阻害率を指標とした場合のグルコース存在下での 1， 5—ァ ンヒドログルシト一ルの検量線を示す。 縦軸は 1， 5 —アンヒドログルシトール 無添加時の吸光度から 1 , 5—アンヒドログルシトールを添加した場合の吸光度 を引いた値 （吸光度差） を、 横軸はサンプル中の 1 , 5—アンヒドログルシトー ル濃度 （ g /m 1 ) を表わす。
以下に、 実施例をあげて本発明を具体的に説明する。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1
力テラトスポラ 'フヱルギネア (Catellatospora ferruginea) FERM BP- 4329 のトレハロースホスホリラ一ゼを用いる 1， 5 —アンヒドログルシトールの定量。 1 0 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 0) に参考例 1で調製した力テラ卜スポ ラ ·フェルギネア由来のトレハロースホスホリラ一ゼ 1 OmUZm 1、 yS—ホス ホダルコムターゼ （ベックマン社製） 2. 5 UZm 1、 グルコース一 6—リン酸 デヒドロゲナ一ゼ （シグマ社製） 5 UZm 1、 NADP 1 OmM. 種々の濃度の 1, 5—アンヒドログルシトールを含む被験液を加えて反応液を調製した。 この 反応液にトレハロース 1 Omg/m lを加えて攪拌後、 分光光度計にて 340 η mの吸光度の増加を測定した。
反応開始後から 1 0分間の吸光度の増加を測定し、 1， 5—アンヒドログルシ ト一ル無添加の場合の吸光度の增加を Aとし、 1 , 5—アンヒドログルシトール 各濃度存在下での吸光度の増加を Bとし、 それから阻害率 （％) を式 [ (A— B) /Ax 1 00] より算出した。 図 5に示すように、 サンプル中の 1， 5—ァ ンヒドログルシトールの濃度に対して阻害率をプロッ トした場合、 良い直線関係 が得られ、 1， 5—アンヒドログルシト一ルの検量線が得られた。
実施例 2
力テラトスポラ 'フェルギネア (Catellatospora ferruginea) FER BP-4329 のトレハロースホスホリラ一ゼを用いる 1 , 5—アンヒドログルシトールの定量。
50 mMイミダゾ一ル緩衝液 （ p H 7. 0) に参考例 1で調製したトレハロー スホスホリラ一ゼ 1 OmUZm l、 グルコース 5 OmM. 無機リン測定用キッ ト (協和メデックス社製） 2 m I、 種々の濃度の 1 , 5—アンヒドログルシトール を含む被験液を加えて反応液 （3m】） を調製した。 この反応液に ーグルコー ス _ 1—リン酸 50 mMを加えて攪拌後、 分光光度計にて 550 nmの吸光度の 増加を測定した。
反応開始後から 1 0分間の吸光度の増加を測定し、 実施例 1と同様に阻害率 (%) を算出した。 図 6に示すように、 サンプル中の 1， 5—アンヒドログルシ トールの濃度に対して阻害率をプロッ卜した場合、 良い直線関係が得られ、 1，
5—アンヒドログルシトールの検量線が得られた。 実施例 3
ストレプトマイセス *ォ一レオファシエンス (Streptomyces aureofacience) ATCC 10762の卜レハラ一ゼを用いる 1 , 5—アンヒドログルシトールの定量。
1 0 O mMリン酸緩衝液 （pH 7. 0) に参考例 2で調製したトレハラ一ゼ 1 OmU/m 1、 4ーァミノアンチピリン 0. 8 1 mg/m l、 EMS E 1 mg /m 1、 グルコースォキシダーゼ 3 0 U/m 1、 パ一ォキシダ一ゼ 1 0 UZm 1、 種々の濃度の 1 , 5—アンヒドログルシトールを含む被験液を加えて、 反応液を 調製した。 この反応液にトレハロース 1 Omg Zm 1を加えて攪拌後、 分光光度 計にて 5 5 0 nmの吸光度変化を測定した。
反応開始後から 1 0分間の吸光度の増加を測定し、 実施例 1と同様に阻害率 (%) を算出した。 図 7に示すように、 サンプル中の 1， 5—アンヒドログルシ トールの濃度に対して阻害率をプロッ卜した場合、 良い直線関係が得られ、 1， 5—アンヒドログルシト一ルの検量線が得られた。
実施例 4
ロドコッカス 'グロベルラス (Rhodococcus globerulus) ATCC 14898の卜レハ ラーゼを用いる 1， 5—アンヒドログルシトールの定量
参考例 3で調製した口ドコッカス .グロベルラス由来のトレハラ一ゼを用いる 他は実施例 3と同じ方法で試験した。 図 8に示すように、 サンプル中の 1， 5 - アンヒドログルシトールの濃度に対して阻害率をプロッ 卜した場合、 良い直線関 係が得られ、 1， 5 -アンヒドログルシト一ルの検量線が得られた。
実施例 5
ノカルディァ ·エスピー (Nocardia sp. ) NK 2 0 6 7による卜レハラ一ゼの 製造
ノカルディ Ύ♦エスピー (Nocardia sp. ) NK 2 0 6 7をシュクロース 1 g/ cU、 NZアミン 0. 5 gZd l、 ペプトン 0. 2 g/d 1、 酵母エキス 0. 1 gZd し 肉エキス 0. 1 gZd 1力、ら成る培地 （p H 7. 2) 1 2 5 m lを 含む 1リッ トルのエルレンマイヤ一フラスコに植菌し、 3 0。Cで 48時間振盪培 養した。 この培養液 1 2 5m lを上記培地と同じ組成の培地 23 75 m lを含む 5リッ トルのジャーファーメンタ一に入れ、 通気攪拌しつつ、 30。Cで 2日間培 養 行つた。
この培養物 2. 5リッ トルを遠心分離 （1 2， 00 0 X g, 2 0分） し、 菌体 画分を得た。 この菌体を 1 0%グリセロールを含む 5 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 0) (以下これを GP緩衝液と称する） 50 0 m 1に懸濁し、 ダイノミル （W. A. Bachofen社） にて菌体を破砕し、 遠心分離 （1 2， 000 x g, 2 0分） 後、 上清を採取した。 この上清に硫安を加え、 硫安 7 0%飽和で沈殿する部分を採取 した。 この沈殿を少量 （約 1 00m l ) の GP緩衝液に溶解した。 この溶液を G P緩衝液 5リットルで 2 4時間透析した。 この透析内液を GP緩衝液で平衡化し た DE AE—セル口ファイン （生化学工業製） のカラム （1 L、 口径 5 cm) に 通塔した。 この操作でトレハラ一ゼはカラムに吸着される。 更に同緩衝液で不純 蛋白質を洗い流した。 次に GP緩衝液から 1 M食塩を含む GP緩衝液までの食塩 の濃度勾配で溶出を行った。 約 0. 4 - 0. 6 Mで溶出してくる活性画分を合わ せて、 これに硫安を加えて硫安 7 0%飽和で沈殿する部分を遠心分離 （1 2， 0 00 X g, 20分） で集め、 GP緩衝液 50 m 1に溶解した。 この溶液を GP緩 衝液 2リッ トルで 24時間透析し、 精製トレハラ一ゼ酵素標品を得た。
酵素標品の比活性は、 2 1 mUZm gであつた。
実施例 6
ノカルディァ ·エスピー (Nocardia sp. ) NK 2 06 7由来のトレハラ一ゼを 用いる 1， 5—アンヒドログルシトールの定量
実施例 5で調製したノカルディ了 ·エスピー由来のトレハラ一ゼを用いる他は 実施例 3と同じ方法で試験した。 図 9に示すように、 サンプル中の 1, 5 _アン ヒドログルシトールの濃度に対して阻害率をプロットした場合、 良い直線関係が 得られ、 1 , 5—アンヒドログルシトールの検量線が得られた。 実施例 7
下記の、 第 1試薬、 第 2試薬及び第 3試薬からなる 1, 5—アンヒドログルシ トール定量用試薬キットを作成した。
第 1試薬
グルコースォキシダーゼ 3 0 U/'m l
[ァスペルギルス ·二ガー （Aspergillus niger) 由来、 東洋紡]
パーォキシダ一ゼ （西洋ヮサビ由来、 東洋紡） 1 0 Uノ m 1 EMS E 1 m g m 1 リン酸緩衝液 (pH 5. 5) 1 0 0 mM 第 2試薬
トレハラ—ゼ （実施例 5で製造した酵素） 1 UZm 1
4ーァミノアンチピリン 0 8 m g 1 リン酸緩衝液 (pH 5. 5) 1 0 0 mM 第 3試薬
トレ /ヽロース 2 mM 実施例 8
0〜 5 0 0 g /m 1の濃度の 1 , 5—アンヒドログルシ卜一ノレと 1 m g m 1の濃度の D—グルコースを含む被験液を調製した。 これらの検体のそれぞれ 1 0 1に、 実施例 7で調製した第 1試薬 3 0 0 1を添加して 3 0°Cで 1 0分間 ィンキュベ一トし、 D—グルコースを D—ダルコノ一 <5—ラク卜ンに変換すると ともに、 同時に生成する過酸化水素を消去する。 その後、 実施例 7で調製した第 2試薬 1 0 0 1を添加し、 次に実施例 7で調製した第 3試薬 1 0 1を添加し 日立 7 0 7 0型自動分析装置で吸光度の増加を測定した。
図 1 0に示すように、 1 , 5—アンヒドログルシトールが 0の場合の吸光度か らそれぞれの吸光度を引いた値を算出し、 サンプル中の 1, 5—アンヒドログル シトールの濃度に対してその絶対値をプロッ卜した場合、 良い直線関係が得られ グルコ一スの存在するサンプル中でも 1， 5—アンヒドログルシトール濃度の測 定が可能であることが示された。
実施例 9
下記の、 第 4試薬、 第 5試薬、 第 6試薬及び第 7試薬からなる 1 , 5—アンヒ ドログルシトール定量用試薬キッ トを作成した。
第 4試薬
ダルコキナーゼ 5 \J/m 1 [ビー 'ステア口サ一モフィ リス （ . Stearothermophilus) 由来、 シグマ社] アデノシン三リン酸 1 O mM
Mg C 1 2 2 OmM グルコース一 6 -リン酸脱水素酵素 1 0 UZm 1
(パン酵母由来、 シグマ社）
NADP 1 OmM リン酸緩衝液 (p H 7. 0) 1 0 O mM 第 5試薬
アデノシントリホスファタ一ゼ 3 UZm l
(ブタ脳由来、 シグマ社）
第 6試薬
トレハラ一ゼ l U/m l グルコースォキシダ一ゼ 3 0 UZm 1 パーォキシダ一ゼ l O UZm l
4—ァミノアンチピリン 0. 8mg,Zm l
EMS E 1 mg/m 1 リン酸緩衝液 (p H 7. 0) 1 0 OmM 第 7試薬
トレハロース 2 mM 実施例 1 o
50 0 g/m 1の濃度の 1 , 5—アンヒドログルシトールと 1 mgZm 1か ら 1 Om g/m 1の濃度の D—グルコースを含む被験液を調製した。 これらの検 体のそれぞれ 1 0 1に実施例 9で作成した第 4試薬 3 0 0 1を添加して 3 0 で 1 0分間ィンキュベ一卜した。 更に実施例 9で作成した第 5試薬 1 0 1 添加して 5分ィンキュベ一卜してアデノシン三リン酸を分解することによってグ ルコキナーゼ反応を停止した。 この操作によって、 グルコースはグルコース— 6 ―リン酸を経て、 D—ダルコノー δ—ラクトン— 6—リン酸に変換される。 その後、 実施例 9で調製した第 6試薬 1 0 0 ;/ 〗を添加し、 次に実施例 9で調 製した第 7試薬 1 0 μ 1を添加し、 3 0°Cで 1 0分間反応し、 日立 7 0 7 0型自 動分析装置で吸光度の増加を測定した。
実施例 8と同様に吸光度の差を算出し、 サンプル中のグルコースの濃度に対す るそれらの値を比校した。 第 5表に示すように、 サンプル中に含まれるダルコ一 ス濃度に関係なく一定の吸光度の差を示しグルコース存在下でも 1， 5—アンヒ ド口グルシト一ル濃度の測定が可能である。 第 5 表 添加グルコース濃度 （mgZm 1 ) 吸光度差 （mAb s)
0 5 5
1. 0 55
2. 5 5 6
5. 0 5 5
7. 5 54
1 0. 0 56
実施例 1 1
正常人の血清及びこの血清に 0〜 5 0 0 g / m 1の濃度の 1 , 5—アンヒド ログルシトールを添加したもの 2 0 1を検体として、 それらに実施例 9で作成 した第 4¾^ 300 μ 1を添加して 3 0 °Cで 1 0分間インキュベートし、 更に実 施例 9で作成した第 5試薬 1 0 μ 1添加し 5分間ィンキュベ一トした。 その後、 実施例 9で調製した第 6試薬 1 00 1を添加し、 次に実施例 9で調製した第 7 試薬 1 1を添加し、 30 で 1 0分間反応し、 日立 70 7 0型自動分析装置 で吸光度の増加を測定した。 また同時に 0〜 500 m g Zm 1の濃度の 1， 5— アンヒドログルシトールを含むサンプルについて同じ操作を行い、 検量曲線を作 成した。 その検量曲線から各種検体中の 1, 5—アンヒドログルシトール濃度を 算出した。 その結果を表 6に示す。
第 6 表 添加 1 , 5—アンヒドログルシト一ル 実測値 回収率
(β g/m 1 ) ( g/m 1 ) (%)
0 2 5
1 0 0 1 2 4 9 6
2 0 0 22 4 9 6
3 0 0 3 2 5 1 00
4 0 0 4 2 6 1 04
5 0 0 5 2 6 1 04 正常人の血清中の 1, 5—アンヒドログルシトール濃度は、 ほぼ文献値どうり であった。 また 1， 5—アンヒドロダルシト一ル添加血清での測定値は、 ほぼ理 論値に近い回収率であった。 本方法により血清中での 1， 5 -アンヒドログルシ トールが測定可能である。
参考例 1
力テラトスボラ 'フェルギネア (Catellatospora ferniginea) FERM BP- 4329 によるトレハ口一スホスホリラーゼの製造
力テラトスポラ ·フェルギネアをシュクロース 3 gZd l、 NZ—ァミ ン 0. 5 gZd l、 ペプトン 0. 2 g/d 1、 酵母エキス 0. 13/ 11、 肉ェキス0. 1 g/d 1を含有する培地 （p H 7. 0 ) 3 00 m 1の入った 2リットルのエル レンマイヤ一フラスコに植菌し、 30°Cで 4 8時間、 振とう培養を行った。 得ら れた培養液 6 00 m lを上記培地と同じ組成の培地 1 5リツトルを含む 3 0リツ トルのジャーフアーメンターに植菌し、 30°Cで 3日間、 通気撹拌培養を行った。 培養終了後、 培養液 1 5リツ トルを遠心分離 （1 2， 000 X g, 2 0分） し て得られた菌体を 200 mMリン酸緩衝液 （pH 7. 0 ) 1, 000 m lに懸濁 し、 ダイノミル （W. A. Bachofen社製） にて菌体を破砕後、 遠心分離 （1 2， 0 0 0 X g, 20分） して上清を採取した。 この上清に硫安を 50%飽和になるよ うに加え、 沈殿物を採取した。 得られた沈殿物を少量 （約 200m l ) の 200 mMリン酸緩衝液 （ p H 7. 0) に溶解し、 得られた溶液を同緩衝液 5リットル で 2 4時間透析後、 6 5°Cで 1 5分間加熱処理し、 遠心分離 （1 2， 000 x g, 20分） して得られた上清を同緩衝液で平衡化したゲル濾過剤トヨパール HW6 5 F (東ソ一社製） のカラム （1 L、 口径 5 cm) に通塔した。 溶出した活性画 分をあわせ、 これに硫安を 50%飽和になるように加え、 沈殿物を遠心分離 （1 2， 000 r pm, 2 0分） で採取し、 200 mMリン酸緩衝液 （ p H 7. 0) 2 0m lに溶解した。 得られた溶液を同緩衝液 2 Lで 24時間透析し、 トレハロ —スホスホリラ一ゼ酵素標品を得た。
酵素標品の比活性は、 1 00 m U Zm gであった。
参考例 2
ストレプトマ セス ·ォ一レオファシエンス (Streptomyces aureofaciens) ATCC 10762 によるトレハラーゼの製造
ス卜レプトマイセス ·オーレオファシエンス ATCC 10762 をシュクロース 1 g Zd l、 NZ—ァミン0. 5 gZd し ペプトン 0. 2 g Z d 1、 酵母エキス 0. l g/d l、 肉エキス 0. 1 gZd 1から成る培地 （p H 7. 2) 1 25m l を含む 1リッ トルのエルレンマイヤ一フラスコに植菌し、 30°Cで 48時間振盪 培養した。 この培養液 1 25m lを上記培地と同じ組成の培地 2375 m 1を含 む 5 リツ トルのジャーフアーメンターに入れ、 通気攪拌しつつ、 3 0。Cで 2日間 培養を行った。
この培養物 2. 5リットルを遠心分離 （ 1 2, 0 0 0 X g, 2 0分） し、 菌体 画分を得た。 この菌体を 1 0%グリセロールを含む 5 OmMリン酸緩衝液 （pH 7. 0) (以下これを GP緩衝液と称する） 5 0 Om 1に懸濁し、 ダイノミル （W. A. Bachofen社） にて菌体を破砕し、 遠心分離 （1 2, 0 0 0 x g, 2 0分） 後、 上清を採取した。 この上清に硫安を加え、 硫安 7 0%飽和で沈殿する部分を採取 した。 この沈殿を少量 （約 1 0 0m l ) の GP緩衝液に溶解した。 この溶液を G P緩衝液 5リットルで 2 4時間透析した。 この透析内液を GP緩衝液で平衡化し た DE A E—セル口ファイン （生化学工業製） のカラム （1し、 口径 5 cm) に 通塔した。 この操作でトレハラ一ゼはカラムに吸着される。 更に同緩衝液で不純 蛋白質を洗い流した。 次に GP緩衝液から 1M食塩を含む GP緩衝液までの食塩 の濃度勾配で溶出を行った。 約 0. 4 - 0. 6 Mで溶出してくる活性画分を合わ せて、 これに硫安を加えて硫安 7 0%飽和で沈殿する部分を遠心分離 （1 2, 0 0 0 X g, 2 0分） で集め、 GP緩衝液 5 0m 1に溶解した。 この溶液を GP緩 衝液 2リットルで 2 4時間透析し、 精製トレハラ一ゼ酵素標品を得た。
酵素標品の比活性は、 2 1 mU/mgであった。
参考例 3
ロドコッカス ·グロベルラス (Rhodococcus globerulus) ATCC 14898 による トレハラーゼの製造
ロドコッカス .グロベルラス (Rhodococcus globerulus) ATCC 14898 を用い る以外は参考例 2と同様に培養し精製トレハラーゼ酵素標品を得た。
酵素標品の比活性は、 1 5 m U Zm gであつた。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 1 , 5—アンヒドログルシト一ルの酵素的定量方法及びそれ に用いる定量用試薬並びに 1 , 5—アンヒドログルシトールの酵素的定量方法に 利用すると好適な新規なトレハラーゼ及びその製造方法が提供される。 1， 5— アンヒドログルシトール濃度の定量は、 糖尿病の診断に有用なものであり、 本発 明によれば、 1， 5 —アンヒドログルシトールを、 正確かつ迅速に定量すること ができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1. 1， 5—アンヒドログルシ卜一ルにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素に、 試料中の 1, 5—アンヒドログルシトールを共存させて該酵素の酵素活性 を測定することを特徵とする 1 , 5—アンヒドログルシトールの定量方法。
2. 1， 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素が、 トレハラ一ゼである請求の範囲 1記載の 1， 5—アンヒドログルシトール の定量方法。
3. 1, 5 _アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素が、 トレハロースホスホリラ一ゼである請求の範囲 1記載の 1， 5 _アンヒド 口グルシトールの定量方法。
4. 1， 5—アンヒドログルシトールに対する K i値が 0. 33 mM以下であ り、 下記の理化学的性質を有するトラハラーゼ。
(1) 作用：水の存在下、 1分子のトレハロースを加水分解して、 2分子の D - グルコースを生成する、 一般式 （I)
トレハロース + H20 ► 2 D-グルコース （I) に示される反応を触媒する。
(2) 基質特異性： トレハロースに特異的に作用する。
(3) 基質親和性： トレハロースに対する Km値は、 6. 7mMである。
(4) 至適 pH及び安定 pH：至適 pHは 5〜6であり、 安定 pH範囲は， 5 0 °C、 30分間の処理で p H 5〜 1 0である。
( 5 ) 至適温度及び熱安定性：至適温度は 45 °C付近である。 また本酵素は p H 5. 0で 30分間の処理では、 50°Cまで安定である。
( 6 ) 阻害剤： 1 , 1 0—フエナン卜口リ ン、 エチレンジアミンテトラ酢酸、 2， 2 ' 一ビピリジル等の金属キレート試薬、 p—メルクリ安息香酸、 ョ一ドアセト アミ ド等の SH阻害剤、 ヒドロキシルアミン、 硫酸ニッケル等で阻害される。
( 7 ) 分子量： ドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動で測 定した本酵素のサブュニッ 卜の分子量は、 約 9 0， 0 0 0であり、 ゲルろ過法で 測定した分子量は、 約 4 0 0， 0 0 0である。
5 . ノカルディア属に属し、 請求の範囲 4記載のトレハラ一ゼを生産する能力 を有する菌株を培地に培養し、 その培養物から該トレハラ一ゼを採取することを 特徴とするトレハラ一ゼの製造方法。
6 . 1 , 5 -アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素、 該酵素の基質及び該酵素活性により生成する物質の定量用試薬からなる 1， 5—アンヒ ドロダルシト一ル定量用試薬。
7 . 1， 5—アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素が、 請求の範囲 4記載の酵素である請求の範囲 1記載の方法。
8 . 1 , 5 —アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素が、 トレハラーゼである請求の範囲 6記載の定量用試薬。
9 . 1， 5 —アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される酵 素が、 トレハロースホスホリラ一ゼである請求の範囲 6記載の定量用試薬。
1 0 . 1， 5 —アンヒドログルシトールにより濃度依存的に活性が阻害される 酵素が、 請求の範囲 4記載の酵素である請求の範囲 6記載の定量用試薬。
1 1 . 試料が、 D一グルコースと 1， 5 —アンヒドログルシトールを含む試料 であり、 D—グルコースを消去する前処理を施した試料である請求の範囲 2又は 7記載の定量方法。
1 2 . D -グルコース消去試薬を含む請求の範囲 8又は 1 0記載の定量用試薬。
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