WO1995029694A1 - Accelerateur d'hydrolyse du collegene - Google Patents

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WO1995029694A1
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fibrosis
hgf
hgfs
liver
collagen
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PCT/JP1995/000822
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Toshikazu Nakamura
Akira Shiota
Nobuaki Fujise
Mitsuo Namiki
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Snow Brand Milk Products Co., Ltd.
Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a collagen degradation promoter and a fibrosis disorder therapeutic agent. More specifically, the present invention relates to a collagen degradation promoter and a therapeutic agent for fibrosis disorders containing HGF (Hepatocyte Growth Facto.r) as an active ingredient.
  • HGF Hepatocyte Growth Facto.r
  • Fibrosis is a disease characterized by excessive accumulation of connective tissue components. Collagen is the central and most remarkable of fibrosis ⁇ Collagen accumulation occurs in various internal organs, such as lung. In the lung and fibrosis in the liver. It also occurs in the skin, for example, in conditions such as skin keloid formation.
  • a variety of medications have been used to treat fibrotic diseases and disorders, but generally they focus on symptomatic treatment of the disorder, with the underlying pathology being the production and production of collagen and other connective tissue components. It was not aimed at overcoming the imbalance among metabolic factors that regulate degradation. Therefore, none of these treatments was particularly effective in improving tissue. That is, for example, if topical corticosteroids have been used with some success in treating the early inflammatory stages of skin keloid production, but the actual production of keloids has resulted from excessive collagen production. At such later stages of fibrosis, such steroids have little or no effect.
  • the prior art treats human fibrosis disorders in a safe and effective manner, preventing further generation of fibrotic tissue and reducing the number of fibrosis lesions already generated. And no method to remove or completely remove Was.
  • An object of the present invention is to provide a collagen degradation promoter capable of inducing the degradation of collagen matrix in connective tissue excessively accumulated in a tissue and a therapeutic agent useful for treating fibrosis disorders.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above problems,
  • the present inventors have found that HGFs have an action of promoting the degradation of collagen, and based on the action, are effective in treating fibrosis disorders, and completed the present invention. That is, the present invention is a collagen degradation promoter comprising at least one HGF as an active ingredient.
  • Another invention of the present invention is a therapeutic agent for fibrosis disorders, comprising at least one HGF as an active ingredient.
  • Still another aspect of the present invention relates to a method for promoting collagen degradation, comprising administering at least one effective amount of HGFs; and treating fibrosis disorders comprising administering at least one effective amount of HGFs.
  • FIG. 1 is a diagram showing a drug administration schedule in Example 1.
  • FIG. 2 is a diagram showing a drug administration schedule in Test A of Example 2.
  • FIG. 3 is a diagram showing a drug administration schedule in Test B of Example 2.
  • FIG. 4 is a diagram showing the measurement results of GOT, GPT, and ⁇ -GTP in Test A of Example 2.
  • FIG. 5 shows the results of the GOT, GPT, hepaplastin test and the measurement of liver Hyp (hydroxyproline) content in Test II of Example 2.
  • FIG. 6 is a graph showing the effect of extending the life of HGF on liver fibrosis rats in Test A of Example 3.
  • n 5).
  • FIG. 7 is a photograph showing the effect of HGF on reducing liver fibrosis in liver fibrosis rats in Test B of Example 3.
  • FIG. 8 is a diagram showing the ratio (%) of the fibrous tissue of each individual liver in Example 4.
  • HGFs refer to proteins having hepatocyte proliferation activity, and include, for example, HGF (Hepatocyte Growth Factor).
  • HGFs used in the present invention those prepared by various methods can be used as long as they are purified to the extent that they can be used as pharmaceuticals.
  • HGF HGF-derived neurotrophic factor
  • organs such as bone marrow, brain, kidney, placenta
  • blood cells such as platelets and leukocytes, plasma, serum, etc. It can be obtained by purification (see FEBS Letters, 224, 312, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989, etc.).
  • HGF can be obtained by culturing primary cultured cells or cell lines that produce HGF and separating and purifying it from cultures (culture supernatants, cultured cells, etc.).
  • the recombinant HGF can be obtained from the culture supernatant of this transformant by integrating the vector into an appropriate vector, inserting it into an appropriate host, and transforming (for example, Nature, 342, 440, 1989, Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989).
  • the host cell is not particularly limited, and various host cells conventionally used in genetic engineering techniques, for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis, yeast, filamentous fungi, plant or animal cells, and the like can be used.
  • HGF human endothelial growth factor
  • carbon tetrachloride is intraperitoneally administered to a rat, and the liver of the rat in a hepatitis state is excised and pulverized.
  • the protein can be purified by conventional protein purification methods such as gel column chromatography such as sepharose and heparin sepharose, and HPLC.
  • animal cells such as Chinese hamster ovary (CHO) cells and mice, are expressed by an expression vector in which the gene encoding the amino acid sequence of human HGF is inserted into a vector such as sipapilloma virus DNA by genetic recombination.
  • C127 cells, monkey COS cells, etc. can be transformed and obtained from the culture supernatant.
  • HGFs thus obtained are substantially equivalent to the HGFs
  • a portion of the amino acid sequence has been deleted or replaced with another amino acid, and the other amino acid sequence has the same amino acid sequence. It may be partially inserted, one or two or more amino acids may be bound to the N-terminal and / or ⁇ -terminal, or the sugar chain may be similarly deleted or substituted.
  • the collagen degradation promoter of the present invention contains the above HGFs as an active ingredient, and the HGFs have an action of promoting collagen degradation (increase in collagenase activity) as shown in the test examples described later. Therefore, it is useful not only for the treatment of the following fibrosis disorders, but also for its prevention, and also for the treatment and prevention of diseases in which collagenase activity is reduced, for example, osteopetrosis.
  • the therapeutic agent for fibrosis disorder of the present invention also comprises the above-mentioned HGFs as an active ingredient, and excessive fibroblasts of a connective tissue matrix containing collagen, fibronectin and glycosaminoglycan (GAG).
  • HGFs a connective tissue matrix containing collagen, fibronectin and glycosaminoglycan
  • GAG glycosaminoglycan
  • Atherosclerosis chronic glomerulonephritis, skin keloid formation, progressive systemic sclerosis (PSS), liver fibrosis, pulmonary fibrosis, cystic fibrosis, chronic graft-versus-host disease, scleroderma (local and Whole body), Peyroni's disease, penile fibrosis, urethral stenosis after cystoscopy, internal adhesions after surgery, myelofibrosis, idiopathic retroperitoneal fibrosis
  • the agent for promoting collagen degradation and the agent for treating fibrosis disorders of the present invention can be used for promoting collagen degradation and fibrosis in mammals (for example, mice, pigs, sheep, dogs, cats, etc.) in addition to humans. Applied for disability treatment.
  • the collagen degradation promoting agent and the therapeutic agent for fibrosis disorders of the present invention can take various preparation forms (for example, liquid preparation, solid preparation, capsule preparation, etc.). Injections, inhalants, suppositories, or oral preparations together with conventional carriers.
  • the injection can be prepared by a conventional method. For example, after dissolving HGFs in an appropriate solvent (eg, sterilized water, buffer, physiological saline, etc.), sterilize by filtering through a filter or the like. Then, it can be prepared by filling in a sterile container.
  • the HGF content in the injection is usually adjusted to about 0.0002 to 0.2 (W / V%), preferably about 0.001 to UW / V%.
  • Oral drugs include, for example, tablets, granules, fine granules, powders, soft or hard capsules, solutions, emulsions, suspensions, syrups, etc. It can be prepared according to a conventional method of formulation. Suppositories can also be prepared by a conventional method using a conventional base (for example, cabbage fat, lauric fat, glycerinated gelatin, macrogol, witepsol, etc.). Also, inhalants can be prepared according to conventional methods for preparation.
  • the content of HGFs in the preparation can be appropriately adjusted depending on the dosage form, applicable disease and the like.
  • a stabilizer is preferably added.
  • the stabilizer include albumin, globulin, gelatin, glycine, mannitol, glucose, dextran, sorbitol, ethylene glycol and the like.
  • the preparation of the present invention may contain additives necessary for preparation, for example, excipients, solubilizers, antioxidants, soothing agents, isotonic agents and the like.
  • a liquid preparation it is desirable to store it after freezing or freezing it to remove water.
  • the lyophilized preparation is reconstituted with distilled water for injection and used before use.
  • the agent for promoting collagen degradation and the agent for treating fibrosis disorders of the present invention can be administered by an appropriate administration route depending on the form of the preparation.
  • injection form It can be administered to veins, arteries, subcutaneous, intramuscular, etc.
  • the dose is adjusted appropriately depending on the patient's condition, age, weight, etc., but is usually 0.05 mg to 500 ing, preferably 1 mg to 100 mg as HGF, and is divided into once or several times a day. Is appropriate.
  • the HGFs which are the active ingredients of the present invention, promote the degradation of collagen (increase in collagenase activity), and thus can effectively treat fibrosis disorders. Therefore, according to the present invention, prevention of diseases in which collagenase activity is reduced (for example, osteopetrosis) and the above-mentioned fibrotic disorders characterized by excessive fibroblast production of connective tissue matrix. ⁇ Can be treated.
  • the above substance was dissolved in 0.01 M PBS having a pH of 7.0, the total amount was adjusted to 20 ml, and after sterilization, 2 ml each was dispensed into a vial and sealed by freeze-drying.
  • Example 1 HGF suppresses fibrosis and improves symptom on dimethylnitrosamine liver fibrosis rat
  • Dimethylnitrosamine (DMN) was administered intraperitoneally every week on Tuesday, Wednesday and Thursday at a dose of 10 ⁇ g for 4 weeks.
  • HGF was intravenously administered at 500 cg / kg twice a day (1,000 g / kg / day) for 28 days from the first DMN administration.
  • the dosing schedule is shown in FIG. On day 29, the test rat was subjected to the following measurement.
  • Rats were dissected and liver weights were determined.
  • the content of hydroxylamine in liver tissue (Hyp; an indicator of fibrosis) and the activity of collagenase (collagenase) were determined by the method of Kivirikko et al. (Anal. Biochem, 19, 249, 1967) and Murawaki et al. (J. Biochem, 108, 241, 1990).
  • the DNA and protein content in the liver tissue were measured by the modified method of Burton (Biochem, J, 62, 315, 1956) and the protein assay kit (manufactured by Biorat), respectively. The results are shown in Table 1.
  • blood was collected from the posterior vena cava and the collected serum was analyzed for clinical biochemistry by a Hitachi 7150 automatic analyzer.
  • the blood test was performed using a multi-item automatic blood cell counter (E-400, Sysmex) to measure the platelet count, white blood cell count, red blood cell count, hematocrit value, and hemoglobin concentration using EDT A-added blood collected from the posterior vena cava. ).
  • Plasma mixed with a 3.8% aqueous solution of sodium citrate and blood collected from the posterior vena cava at a ratio of 1: 9 was used for plasma coagulation (prothrombin time, fibrinogen content, hepaplasmin test and The coagulation time according to the thrombotest was measured using an automatic coagulation ability measuring device (KC-40). The results are shown in Table 2.
  • Table 1 Plasma mixed with a 3.8% aqueous solution of sodium citrate and blood collected from the posterior vena cava at a ratio of 1: 9 was used for plasma coagulation (prothrombin time, fibrinogen content, hepaplasmin test and The coagulation time according to the thrombotest was measured using an automatic coagulation ability measuring device (KC-40). The results are shown in Table 2. Table 1
  • a male liver rat (6 weeks old) was orally administered with carbon tetrachloride every month and Thursday at a dose of 0.7 m 1 / kg for 12 weeks to prepare a liver fibrosis model.
  • This carbon tetrachloride liver fibrosis rat was subjected to the following two tests.
  • HGF was added to the above carbon tetrachloride hepatic fibrosis rats (13-14 animals per group) twice daily at 50 and 500 ⁇ gZkg (100 and 1 OOO ⁇ g / kg / day). It was administered intravenously for 7 days.
  • the dosing schedule is shown in FIG. Changes in serum GOT, GPT, and ⁇ -GTP levels on days 3, 5, and 7 from the start of HGF administration were compared with those of the vehicle-administered group (control).
  • Fig. 4 shows the results.
  • HGF hepatic fibrosis rats of 12 to 13 animals per group
  • HGF was continuously instilled at a rate of 100 and 1000 Atg / kg / day from a catheter placed in the jugular vein. Dissection was performed 72 hours after the start of HGF administration.
  • the dosing schedule is shown in FIG. GOT, GPT, serum total protein and albumin in serum were mixed with a 3.8% aqueous solution of sodium citrate and blood collected from the posterior vena cava at a ratio of 1: 9 using a Hitachi 71500 automatic analyzer.
  • the coagulation time of the hepaplastin test was measured by an automatic coagulation ability measuring apparatus (KC-140).
  • the hydroxyproline content (Hyp) in liver tissue as an indicator of fibrosis was measured by the method of Kivirikko et al. The results are shown in Table 3 and Figure 5.
  • HGF showed a dose-dependent improvement in liver function test values, recovery of hypoproteinemia, and improvement of fibrosis after 100 ⁇ g / kg g day or more. A decrease in the medium hydroxyproline content was observed.
  • the survival rate of the HGF-administered group and the non-administered group on liver fibrosis rats induced by DMN was examined.
  • the administration schedule of the drug is shown in the upper part of FIG. DMN dissolved in physiological saline at a concentration of 1% was combined with DMN that weighed 1 kg SD male rat. Then, intraperitoneal administration was performed at a rate of 11 times three times a week for 6 weeks on the day indicated by the arrow. Human HGF or physiological saline was intravenously administered daily from the 21st day after the start of DMN administration for the period indicated by the hatched band, and the survival rate (%) of the test rats was examined daily. Figure 6 shows the results. In FIG.
  • the rat was killed on day 42 and the liver was collected for the detection of fibrotic substrate.
  • the liver was quickly frozen in an OTC compound, and the prepared sections were anti-rat collagen type I antibody derived from Egret (LSL) and anti-Egret Ig from fluorescently labeled goats. After reacting with the G antibody, the specimen was photographed.
  • Figure 7 shows the results.
  • Prothrombin time PT
  • albumin A lb
  • plasma glutamate oxalate acetate Serum
  • DMN was intraperitoneally administered to a 5-week-old male SD rat at a dose of g three times a week (month, fire, water) for 4 weeks to prepare a liver / fibrotic rat.
  • One mg / kg of HGF or 1 ml / kg of a solvent (phosphate buffered saline containing HSA 2.5 nigZm1, 800.01% Tween) was added to this rat for 5 weeks.
  • Time (Mon, Tue, Wed, Thu, Fri) Administered from the start of DMN administration until 4th day of 4th week.
  • the rat was sacrificed, and the liver was collected and fixed in neutral formalin.
  • the tissue was stained with Matsuson trichrome to stain fibrous tissues.
  • the liver of a healthy rat was similarly stained.
  • an image analyzer T. Watanabe et al. Analytical Cellular Pathology 4 (3), 248, 1992
  • the area of fibrotic tissue in the total area of the tissue section was determined for the liver tissue specimen of each stained individual.
  • the degree of fibrillation was calculated and compared.
  • the number of individuals used in the analysis was 8 in healthy rats, 8 in DMN + solvent-administered group (DMN), and 8 in DMN + HGF-administered group (HGF + DMN). There were 6 cases excluding the affected individuals.
  • DMN increased the percentage of fibrous tissue in liver tissue to 7.3% compared to an average of 1.3% when compared to healthy rats.
  • DMN + HGF decreased to 2.8%, indicating that administration of HGF reduced liver fibrosis by DMN.

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Description

明 細 書 コラーゲン分解促進剤 技術分野
本発明は、 コラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤に関する。 よ り詳細には、 H G F (Hepatocyte Growth Facto.r)類を有効成分としたコ ラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤に関する。 背景技術
線維症とは、 結合組織成分の過度の蓄積で特徴づけられる疾患であリ. 線維症においてその中心をなし最も注目すべきものはコラーゲンである < コラーゲンの蓄積は種々の内臓で生じ、 例えば、 肺においては肺線維症, 肝臓においては肝線維症のような病態で生じる。 また、 皮膚においても, 例えば、 皮膚ケロイ ド生成のような病態で生じる。
多くの場合、 線維症におけるコラーゲンの正味の蓄積は、 コラーゲン の生産及び分解を起す因子の間の不均衡の結果である。
線維症の疾患及び障害を治療するために種々の投薬法が行われてきた が、 一般にそれらは障害の対症療法が中心であり、 そのもとである病理 すなわちコラーゲンその他の結合組織成分の生産及び分解を調節する代 謝因子のなかの不均衡を解消することを目指したものではなかった。 そ れゆえ、 これらの治療法のなかには、 組織の改善という点で特に有効と されるものはなかった。 すなわち、 例えば、 皮膚ケロイ ド生成の初期の 炎症段階を治療するのに局部コルチコステロイ ドが使用されて或る程度 成功したが、 過度のコラーゲン生産の結果としてケロイ ドが実際に生成 した場合のような後期の線維症の段階ではそのようなステロイ ドは殆ど 又は全く効果がない。
このように、 従来技術では、 安全で有効な方法でヒ卜の線維症障害を 治療して、 それ以上の線維症の組織の生成を阻止し、'既に生成している 線維症の病巣を減少させ又は完全に除去するような方法は見出せなかつ た。
本発明が解決しょうとする課題は、 組織内における過度に蓄積された 結合性組織のコラーゲンマ卜リックスの分解を誘導することのできるコ ラーゲン分解促進剤及び線維症障害の治療に有用な治療剤を提供するこ とにある。 発明の開示
本発明者等は、 上記の課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、
HGF類がコラーゲンの分解を促進する作用を有し、 その作用に基づき 線維症障害の治療に有効であることを見出し、 本発明を完成させた。 すなわち、 本発明は、 HGF類の少なくとも一種を有効成分として含 有することからなるコラ一ゲン分解促進剤である。
また、 本発明の他の発明は、 HGF類の少なくとも一種を有効成分と して含有することからなる線維症障害治療剤である。
本発明の更なる他の発明は、 HGF類の少なくとも一種の有効量を投 与することからなるコラーゲン分解促進方法； HGF類の少なくとも一 種の有効量を投与することからなる線維症障害の治療方法； コラーゲン 分解促進剤を製造するための HGF類の少なくとも一種の使用 ； 線維症 障害治療剤を製造するための HGF類の少なくとも一種の使用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における薬剤投与スケジュールを示す図である。 図 2は、 実施例 2の試験 Aにおける薬剤投与スケジュールを示す図で ある。
図 3は、 実施例 2の試験 Bにおける薬剤投与スケジュールを示す図で ある。
図 4は、 実施例 2の試験 Aにおける、 GOT、 G PT及び γ— GT P の測定結果を示す図である。
図 5は、 実施例 2の試験 Βにおける、 GOT、 G PT、 へパプラスチ ンテスト及び肝臓 Hy p (ヒ ドロキシプロリン） 含量の測定結果を示す 図である。
図 6は、 実施例 3の試験 Aにおける、 肝線維化ラッ 卜に対する HGF の延命効果を示す図である。 図 6において、 点線は生理食塩液投与群 (対照群、 n = 1 0) 、 破線は HGF 5 0 /z g/k g体重投与群 （n = 5) 、 実線は HGF 2 00 gXk g体重投与群 （n = 5 ) を示す。 図 7は、 実施例 3の試験 Bにおける、 肝線維化ラッ 卜に対する HGF の肝線維化軽減効果を示す写真である。
図 8は、 実施例 4における、 各個体肝臓の線維組織の割合 （％) を示 す図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明において、 HGF類とは、 肝細胞増殖活性を示す蛋白質をいい、 例えば、 H G F (Hepatocyte Growth Factor)などが挙げられる。
本発明で使用される HGF類としては、 医薬として使用できる程度に 精製されたものであれば、 種々の方法で調製されたものを用いることが できる。
HGFの調製方法としては、 各種の方法が知られている。 例えば、 ラ ッ ト、 ゥシ、 ゥマ、 ヒッジなどの哺乳動物の肝臓、 脾臓、 肺臓、 骨髄、 脳、 腎臓、 胎盤等の臓器、 血小板、 白血球等の血液細胞や血漿、 血清な どから抽出、 精製して得ることができる（FEBS Letters, 224, 312， 198 7、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989など参照）。
また、 HGFを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、 培養物 (培養上清、 培養細胞等） から分離精製して HGFを得ることもできる あるいは遺伝子工学的手法により H G Fをコードする遺伝子を適切なベ クタ一に組込み、 これを適当な宿主に挿入して形質転換し、 この形質転 換体の培養上清から目的とする組換え H G Fを得ることができる（例え ば、 Nature, 342, 440, 1989、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 163, 967， 1989など参照）。 上記の宿主細胞は特に限定されず、 従来から遺 伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、 例えば大腸菌、 枯草 菌、 酵母、 糸状菌、 植物又は動物細胞などを用いることができる。 よリ具体的には、 HGFを生体組織から抽出精製する方法としては、 例えば、 ラッ 卜に四塩化炭素を腹腔内投与し、 肝炎状態にしたラッ 卜の 肝臓を摘出して粉砕し、 S—セファロース、 へパリンセファロースなど のゲルカラムクロマ卜グラフィ一、 H P L C等の通常の蛋白質精製法に て精製することができる。
また、 遺伝子組換え法を用い、 ヒト HGFのアミノ酸配列をコードす る遺伝子を、 ゥシパピローマウィルス DNAなどのベクターに組み込ん だ発現ベクターによって動物細胞、 例えば、 チャイニーズハムスター卵 巣 （CHO) 細胞、 マウス C 1 2 7細胞、 サル CO S細胞などを形質転 換し、 その培養上清より得ることができる。
かく して得られた HGF類は、 HGF類と実質的に同効である限り、 そのアミノ酸配列の一部が欠失又は他のアミノ酸によリ置換されていた リ、 他のアミノ酸配列が一部挿入されていたり、 N末端及び/又は〇末 端に 1又は 2以上のアミノ酸が結合していたり、 あるいは糖鎖が同様に 欠失又は置換されていてもよい。
本発明のコラーゲン分解促進剤は上記の HGF類を有効成分とし、 H GF類は後記試験例に示されるように、 コラーゲンの分解 （コラゲナー ゼ活性の増加） を促進する作用を有する。 従って、 下記の線維症障害の 治療の他、 その予防にも有用であり、 またコラゲナ一ゼ活性が低下した 疾患、 例えば、 大理石骨病などの治療 ·予防に有用である。
また、 本発明の線維症障害治療剤は、 同様に上記の HGF類を有効成 分とし、 コラーゲン、 フイブロネクチン及びグリコサミノグリカン （G AG) を含む結合性組織マ卜リックスの過度の線維芽細胞生産によって 特徴づけられる線維症障害の治療に有用である。 これには下記の障害が 包含される。
動脈硬化、 慢性糸球体腎炎、 皮膚ケロイ ド生成、 進行性全身性硬化症 (P S S) 、 肝線維症、 肺線維症、 嚢胞性線維症、 慢性の対宿主移植片 疾患、 硬皮症 （局部及び全身） 、 ペイロニ一氏病、 陰茎の線維症、 膀胱 鏡検査後の尿道狭窄症、 外科手術後の内部癒着、 骨髄線維症、 特発性後 部腹膜線維症 本発明のコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤は、 ヒ卜の他、 哺乳動物 （例えば、 ゥシ、 ゥマ、 ブタ、 ヒヅジ、 ィヌ、 ネコ等） におけ るコラーゲン分解促進及び線維症障害治療に適用される。
本発明のコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤は種々の製剤形 態 （例えば、 液剤、 固形剤、 カプセル剤等） をとリうるが、 一般的には 有効成分である H G F類のみ又はそれと慣用の担体と共に注射剤、 吸入 剤、 坐剤又は経口剤とされる。 当該注射剤は常法により調製することが でき、 例えば、 H G F類を適切な溶剤 （例えば、 滅菌された水、 緩衝液、 生理食塩水等） に溶解した後、 フィルタ一等で濾過して滅菌し、 次いで 無菌的な容器に充填することにより調製することができる。 注射剤中の H G F類含量としては、 通常 0. 0002〜0. 2 (W/V%)程度、 好ましくは 0. 001 〜 UW/V%)程度に調整される。 また、 経口薬としては、 例えば、 錠剤、 顆粒剤、 細粒剤、 散剤、 軟又は硬カプセル剤、 液剤、 乳剤、 懸濁剤、 シ ロップ剤などの剤形に製剤化され、 これらの製剤は製剤化の常法に準じ て調製することができる。 坐剤も慣用の基剤 （例えば、 カ^オ脂、 ラウ リン脂、 グリセ口ゼラチン、 マクロゴール、 ウイテツプゾル等） を用い た製剤上の常法によって調製することができる。 また、 吸入剤も製剤上 の常套手段に準じて調製することができる。
製剤中の H G F類含量は、 剤形、 適用疾患などに応じて適宜調整する ことができる。
製剤化に際して、 好ましくは安定化剤が添加され、 安定化剤としては、 例えば、 アルブミン、 グロブリン、 ゼラチン、 グリシン、 マンニトール、 グルコース、 デキストラン、 ソルビトール、 エチレングリコールなどが 挙げられる。 さらに、 本発明の製剤は製剤化に必要な添加物、 例えば、 賦形剤、 溶解補助剤、 酸化防止剤、 無痛化剤、 等張化剤等を含んでいて もよい。 液状製剤とした場合は凍結保存、 又は凍結乾燥等により水分を 除去して保存するのが望ましい。 凍結乾燥製剤は、 用時に注射用蒸留水 などを加え、 再溶解して使用される。
本発明のコラーゲン分解促進剤及び線維症障害治療剤は、 その製剤形 態に応じた適当な投与経路により投与され得る。 例えば、 注射剤の形態 にして静脈、 動脈、 皮下、 筋肉内などに投与することができる。 その投 与量は、 患者の症状、 年齢、 体重などにより適宜調整されるが、 通常 H G F類として 0.05mg〜500ing、 好ましくは 1 mg〜 lOOmgであり、 これを 1 日 1回ないし数回に分けて投与するのが適当である。 産業上の利用可能性
本発明の有効成分である H G F類は、 コラーゲンの分解 （コラゲナー ゼ活性の増加） を促進し、 もって線維症障害を有効に治療することがで きる。 従って、 本発明によれば、 コラゲナーゼ活性が低下した疾患 （例 えば、 大理石骨病など） や、 結合性組織マ卜リックスの過度の線維芽細 胞生産によって特徴づけられる前記の線維症障害の予防 ·治療を行うこ とができる。 実施例
以下、 製造例及び実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、 本発明はこれらの例に限定されるものではない。
製造例 1
HG F製剤の生産例
(1) H G F 2 0 μ g
ヒ ト血清アルブミン l O O m g
上記物質を p H 7. 0の 0. 0 1 Mの P B Sで溶解し、 全量を 2 0 m 1に調製し、 滅菌後、 パイアル瓶に 2 m 1ずつ分注し、 凍結乾燥密封し た。
(2) H G F 4 0 g
ツイ一ン 8 0 1 m g
ヒ卜血清アルブミン l O O m g
上記物質を注射用生理食塩水に溶解し、 全量を 2 0 m 1に調製し、 滅 菌後、 バイアル瓶に 2 m lずつ分注し、 凍結乾燥密封した。 実施例 1 ジメチルニトロサミン肝線維化ラッ 卜に対する HGFの線維化抑制作用 と症状改善効果
1. 試験方法
①使用動物： ウィスター系雄ラッ 卜、 5週齢
②試験スケジュール
ジメチルニトロサミン （DMN) を毎週火、 水、 木曜日に 1 0 μ 1 k gの用量で 4週にわたり腹腔内投与した。 HGFは DMN初回投与時 より 5 00 c g/k gを 1 日 2回 （ 1 000 g/k g /日） 2 8日間 静脈内投与した。 投与スケジュールを図 1に示す。 29日目に試験ラッ 卜を下記の測定に供した。
③測定
ラッ トを解剖して肝重量を測定した。 また、 肝組織中のヒドロキシプ 口リン含量（Hyp;線維化の指標）及びコラゲナ一ゼ （コラーゲン分解酵素） 活性を、 それぞれ Kivirikkoらの方法（Anal. Biochem, 19, 249, 1967) 及び Murawakiらの方法（J. Biochem, 108, 241, 1990)により測定した。 更に、 肝組織中の DN A及び蛋白含量は、 それぞれ Dishe法の Burtonに よる変法（Biochem, J, 62, 315， 1956)及びプロテインアツセィキッ ト (バイオラッ 卜社製）により測定した。 その結果を表 1に示す。
また、 同時に後大静脈より採血し、 採取した血清の臨床生化学検査は 日立 7150型自動分析装置により分析した。 血液検査は、 後大静脈より採 取した EDT A加血液で血小板数、 白血球数、 赤血球数、 へマトクリツ 卜値、 ヘモグロビン濃度を多項目自動血球計数装置 (E- 4 0 00， S y s me x) を用いて測定した。 また、 3. 8 %クェン酸ナトリウム水 溶液と後大静脈より採取した血液を 1 ： 9の割合で混合した血漿で、 血 漿凝固能 （プロ卜ロンビン時間、 フイブリノ一ゲン量、 へパプラスチン テストとトロンボテストによる凝固時間） を自動凝固能測定装置 （KC - 4 0) を用いて測定した。 その結果を表 2に示す。 表 1
Figure imgf000010_0001
平均値土標準誤差 （ n = 1 0 )
* ·· Ρ<0. 0 5， * * ·· Ρ<0. 0 1 溶媒投与群との有意差
表 2
Figure imgf000011_0001
平均値土標準誤差 （n = 1 0)
氺 ： P< 0. 0 5, * * ： P < 0. 0 1 溶媒投与群との有意差 2. 結果
表 1及び表 2に示すように、 DMNの反復投与により、 溶媒投与群 (対照） では顕著な肝の線維化の伸展と萎縮が観察され、 臨床生化学、 血液及び凝固系検査値から明らかな肝機能の低下が認められた。 これに 対し、 HGF投与群の肝機能検査値は溶媒投与群のそれらの値より有意 な差で健常動物に近い値を示し、 明らかな改善効果を示していた。 また, HGF投与により肝組織中の DNA、 蛋白量、 コラゲナ一ゼ活性が有意 に上昇し、 線維化の指標であるヒ ドロキシプロリン含量は有意に低下し、 肝重量はほぼ正常レベルまで回復した。 実施例 2
四塩化炭素肝線維化ラッ 卜に対する HGFの作用
ウィスター系雄ラッ ト （6週齢） に四塩化炭素を毎週月、 木曜日に 0. 7 m 1 /k gの用量で 1 2週間経口投与して肝線維化モデルを作成した。 この四塩化炭素肝線維化ラッ トを下記の 2つの試験に供した。
①試験 A
反復投与試験
上記の四塩化炭素肝線維化ラッ ト （ 1群 1 3〜 1 4匹） に、 HGFを 5 0及び 5 00 ^ gZk gで 1 日 2回 （ 1 00及び 1 O O O ^ g/k g ノ日） 7 日間静脈内投与した。 投与スケジュールを図 2に示す。 HGF 投与開始から 3、 5、 7 日目の血清中の GO T、 G P T、 γ— GT P値 の変化を溶媒投与群 （対照） と比較した。 その結果を図 4に示す。
図 4に示されるように、 l O O O /x gZk gZ日で 5日目、
gZk g.Z日で 7 日目から回復促進作用が認められた。
②試験 B
点滴注入試験
各群 1 2〜 1 3匹の上記四塩化炭素肝線維化ラッ 卜を用い、 頸静脈に 留置したカテーテルより、 HGFを 1 00及び 1 000 At g/k g/日 の割合で持続点滴注入し、 HGF投与開始から 7 2時間後に解剖した。 投与スケジュールを図 3に示す。 血清中の GOT、 GP T、 血清総蛋白、 アルブミンは日立 7 1 5 0型 自動分析装置により、 3. 8 %クェン酸ナトリウム水溶液と後大静脈よ り採取した血液を 1 ： 9の割合で混合した血漿の凝固能については、 へ パプラスチンテストの凝固時間を自動凝固能測定装置 （KC一 4 0) で 測定した。 また、 線維化の指標として肝組織中ヒドロキシプロリン含量 (Hyp)は、 前掲の Kivirikkoらの方法により測定した。 その結果を表 3及 び図 5に示す。
表 3及び図 5に示されるように、 HGFは 1 00 μ g/k gZ日以上 で用量に依存した肝機能検査値の改善、 低蛋白血症の回復及び線維化の 改善を示唆する肝組織中ヒドロキシプロリン含量の低下が観察された。
表 3
Figure imgf000013_0001
平均値土標準偏差 （n = 1 2〜； 1 3 )
* ： P < 0. 0 5, * * ： P < 0. 0 溶媒投与群との有意差
実施例 3
DMNによって惹起されたラッ ト肝線維化とそれに伴う肝機能不全に対 する HGFの効果
①試験 A
D M Nによって惹起された肝線維化ラッ 卜に対する H G F投与群及び 非投与群における生存率を試験した。
薬剤の投与スケジュールを図 6の上方に示す。 生理食塩水に 1 %の濃 度で溶解した DMNを、 S D系雄性ラッ 卜の体重 1 k gあたリ DMNと して 1 1の割合で、 1週間に 3回ずつ 6週間矢印で示した日に腹腔 内投与した。 ヒト HGF又は生理食塩液は、 DMN投与開始後 2 1 日目 よりハッチングした帯で示した期間毎日静脈内投与し、 試験ラッ 卜の生 存率 （％) を経日的に調べた。 その結果を図 6に示す。 図 6において、 点線は生理食塩液投与群 （対照群、 η= 1 0) 、 破線は HGF 5 0 g Zk g体重投与群 （n= 5) 、 実線は HGF 2 00 μ gZk g体重投与 群 （n= 5) を示す。
図 6に示されるように、 HGFの投与により生存率が向上し、 特に H GF 200 g/k g体重投与群においては死亡例は認められなかった。 ②試験 B
HGF投与又は非投与下において、 DMNを投与したラッ ト肝臓のタ イブ Iコラーゲン沈着 （組織所見） を調べた。
即ち、 線維化基質の検出のために、 図 6に示した試験において 4 2日 目にラッ トを殺し肝臓を採取した。 コラーゲンの免疫蛍光染色には、 肝 臓を OTC化合物のなかですばやく凍結し、 作成した切片はゥサギ由来 抗ラッ トコラーゲンタイプ I抗体 （L S L社製） 、 そして蛍光標識化ャ ギ由来抗ゥサギ I g G抗体と反応させた後、 標本の写真撮映を行った。 その結果を図 7に示す。
図 7に示されるように、 肝臓におけるタイプ Iコラーゲンの沈着には 有意な違いがあった。 生理食塩液投与群の対照ラッ トでは、 タイプ I コ ラ一ゲンの肝臓での沈着は明瞭であリ、 血管や肝細胞周囲に太い或いは 細いタイプ Iコラーゲン線維の束が広範に集積していた。
これらの所見は HGFの投与によって用量依存的に消失し、 また小葉 構造の改善は HGF投与群においてより顕著であった。 このように、 H G Fの肝線維化防止効果は肝臓切片の組織所見から明らかになった。 ③試験 C
HGF投与による、 プロトロンビン時間、 肝細胞逸脱酵素及び肝ヒド ロキシプロリン含量の変化を調べた。
即ち、 ラッ 卜は図 6で示した実験計画に従い処置した。 プロトロンビ ン時間 （PT) 、 アルブミン （A l b) 、 グルタミン酸ォキサ口酢酸卜 ランスアミナ一ゼ （GOT) 、 グルタミン酸ピルビン酸卜ランスァミナ —ゼ （G P T) 及びアルカリフォスファターゼ （A L P) の血清 （血漿） 中の値、 並びに肝ヒドロキシプロリン含量 （HY P) は、 健常ラッ 卜群 (n = 5、 表 4において健常ラットと表示). 、 DMN処理を 5週間し生 理食塩液のみを投与した群 （n= 5、 表 4において 5Wと表示） 、 DM N処理を 6週間し生理食塩液のみを投与した群 （n= l、 表 4において 6Wと表示） 又は生理食塩液の代りに HGFを 5 0 μ g/k g体重 （n = 3、 表 4において 5 0と表示） と 2 00 gZk g体重 （n= 5、 表 4において 2 00と表示） で投与した群でそれぞれ測定した。 その結果 を表 4に示す。 なお、 表中、 5 Wと表示した値は 3 5 日目にラットを屠 殺して得た値であり、 これ以外の値は DM N処置開始後 4 2日目にラッ トを屠殺し得たものである。
表 4に示されるように、 HGFの投与により、 肝臓の線維化及び肝機 能不全の緩和が図られていることが判明した。
t t
o
表 4
PT Alb GPT HYP
(SBC.) (mg/dl) (IU/L) (Mg g Liver) ほ常ラツ卜 (Π=5) 14.2 ± 2.7 4.5土 0.04. 76 .± 16 19 ± 3 459.6士 65 224 ± 89
^理食 01» BW (n=5) 314± 71 132士 16 1967 ± 236 740 ± 211
6W (n: :1) 80く 2.6 162 49 1268 1011
H G F 50 (n= :3) 32.0 ±11.2 2.6土 0.8 165± 38 42 ± 14 1081 土 523 789士 58
200 (n= =5) 21.4土 5.2 3.1 土 OJ 164土 38 40 土 12 1053 土 448 666士 11 B
ド 2
a. J
実施例 4
DMN肝線維化ラッ トでの HGF投与による肝線維減少効果
①方法
5週齢の S D系雄性ラッ 卜に、 DMNを gの用量で週 3 回 （月、 火、 水） 4週間腹腔内投与し肝.線維化ラッ トを作製した。 この ラッ 卜に.1 m gZk gの H G F又は 1 m 1 Zk gの溶媒 （H SA 2. 5 nigZm 1、 ツイ一ン 8 0 0. 0 1 %を含むリン酸緩衝生理食塩水） を週 5回 （月、 火、 水、 木、 金） DMN投与開始時より投与し、 4週目 の 4日目まで投与した。 4週目の 5 日目にラッ トを屠殺、 肝臓を採取後 中性ホルマリンに固定し、 切片作製後に線維組織を染め分けるマツソン トリクローム染色を施した。 なお、 比較のために健常ラッ 卜の肝臓も同 様に染色した。 染色した各個体の肝臓組織標本について、 画像解析装置 (T. Watanabe et al. Analytical Cellular Pathology 4 (3), 248, 19 92)を用い、 組織切片の全面積中の線維化した組織の面積を計算して線 維化の程度を比較した。 なお、 解析に用いた個体数は、 健常ラッ 卜 8例、 DM N +溶媒投与群 （DMN) 8例、 DMN + HGF投与群 （HGF + DMN) については血清中に H GF中和活性の生成した個体を除いた 6 例であった。
②結果
結果を図 8に示した。 図中の各点は、 健常ラッ ト （n = 8) 、 DMN 投与ラッ 卜 (n = 8 ) 、 DMN + HGF投与ラッ 卜 （n = 6 ) の各個体 肝臓の線維組織の割合をパーセントで示したものである。 また、 横線の バーは平均値を示す。
図 8に示されるように、 健常ラッ トと比較すると、 DMNでは肝臓組 織中の線維組織の割合が、 平均 1. 3 %に対して 7. 3 %に増加した。 これに対して DMN + HGFでは 2. 8 %に低下し、 HG Fの投与によ つて DMNによる肝線維化軽減が示された。

Claims

請 求 の 範 囲
1. HGF類の少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴と するコラーゲン分解促進剤。
2. HGF類として、 HGFを含有する請求項 1記載のコラーゲン分解 促進剤。
3. HGF類の少なくとも一種を有効成分として含有することを特徴と する線維症障害治療剤。
4. 上記線維症障害が、 動脈硬化、 慢性糸球体腎炎、 皮膚ケロイ ド生成、 進行性全身性硬化症 （P S S) 、 肝線維症、 肺線維症、 嚢胞性線維症、 慢性の対宿主移植片疾患、 硬皮症 （局部及び全身） 、 ペイロニ—氏病、 陰茎の線維症、 膀胱鏡検査後の尿道狭窄症、 外科手術後の内部癒着、 骨 髄線維症及び特発性後部腹膜線維症からなる群から選ばれることを特徴 とする請求項 3記載の線維症障害治療剤。
5. HGF類として、 HGFを含有する請求項 3又は 4記載の線維症障 害治療剤。
6. HGF類の少なくとも一種の有効量を投与することからなるコラ一 ゲン分解促進方法。
. HGF類の少なくとも一種の有効量を投与することからなる線維症 障害の治療方法。
8. コラーゲン分解促進剤を製造するための HGF類の少なくとも一種 の使用。
9. 線維症障害治療剤を製造するための HGF類の少なくとも一種の使 用。
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