ES2289742T3

ES2289742T3 - Uso de hgf para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de fibrosis pulmonar.

Info

Publication number: ES2289742T3
Application number: ES95917466T
Authority: ES
Inventors: Toshikazu Nakamura; Akira Shiota; Nobuaki Fujise; Mitsuo Namiki
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1994-04-28
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2008-02-01
Anticipated expiration: 2015-04-25
Also published as: EP0784980A4; EP0784980A1; EP2163254A1; EP1776959A2; JP3818322B2; US5840311A; US6303126B1; WO1995029694A1; EP1776959A3; ATE372781T1; EP0784980B1; DE69535593D1; DE69535593T2; JPH07300426A

Abstract

ACELERADOR DE LA HIDROLISIS DEL COLAGENO Y REMEDIO PARA LA FIBROSIS QUE CONTIENEN CADA UNO FACTORES DE CRECIMIENTO DE HEPATOCITOS (FCH) COMO INGREDIENTE ACTIVO. UNA VEZ QUE EL FCH PUEDE ACELERAR LA HIDROLISIS DEL COLAGENO (AUMENTAR LA ACTIVIDAD DE LA COLAGENASA) PARA CURAR DE ESTA FORMA EFECTIVAMENTE LA FIBROSIS, ES POSIBLE PREVENIR O TRATAR ENFERMEDADES PROVOCADAS POR UNA ACTIVIDAD DISMINUIDA DE LA COLAGENASA Y LA FIBROSIS CARACTERIZADA POR LA EXCESIVA PRODUCCION DE FIBROBLASTOS DE LA MATRIZ DE TEJIDO CONECTIVO.

Description

Uso de HGF para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de fibrosis pulmonar.

Campo técnico

La presente invención se refiere al uso de Factor de Crecimiento del Hepatocito (HGF) para fabricar un medicamento para el tratamiento de la fibrosis pulmonar.

Técnica de antecedentes

La fibrosis es una enfermedad que se caracteriza por la acumulación excesiva de uno de los componentes del tejido conjuntivo y uno de ellos, que es un componente digno de atención en las fibrosis, es el colágeno. La acumulación de colágeno tiene lugar en diversas vísceras, ocasionando, por ejemplo, la fibrosis pulmonar en el pulmón y la fibrosis hepática en el hígado. Asimismo, en la piel, por ejemplo, la acumulación de colágeno ocasiona afecciones tales como la formación de queloides del cutis.

En muchos casos, la acumulación neta de colágeno en las fibrosis es el resultado de la desproporción existente entre factores que originan la descomposición y la producción de colágeno.

Aun cuando se han realizado diversas medicaciones para tratar la afección y la enfermedad de la fibrosis, éstas han sido principalmente como tratamiento terapéutico sintomático del trastorno, en general, y no han sido aquellas que tienen por objeto la resolución de la patogénesis, es decir, la desproporción existente entre factores metabólicos que regulan la descomposición y la producción de colágeno y los otros componentes del tejido conjuntivo. Por consiguiente, en esas terapias no ha habido un método especialmente eficaz en lo tocante a la reparación de los tejidos. Por ejemplo, aun cuando, se ha empleado la aplicación local de corticosteroides para tratar la fase inicial de inflamación de la formación de queloides del cutis y se ha obtenido éxito hasta cierto punto, tal tratamiento con esteroides ha tenido poco efecto o no ha tenido efecto alguno sobre la fase posterior de la fibrosis tal como en el caso de la formación real de queloides como resultado de la producción excesiva de colágeno.

Según se ha descrito anteriormente en esta memoria, en la técnica anterior no ha existido un método seguro y eficaz que trate trastornos específicos de las fibrosis en los seres humanos, que inhiba la formación de tejido fibroso y que reduzca o retire completamente el foco de fibrosis formado con anterioridad.

Los documentos US-A-5004805, EP-A-0462549, las publicaciones de Odenthal, M. (1) et al., "Cellular distribution of HGF-synthesis in rat liver upon acute intoxication and fibrosis", Pathology Research and Practice, (1949). Vol. 190, No. 3, páginas 238-239, Meeting Info.:78^{th} Meeting of the German Society of Pathology Zurich, Switzerland, Abril 5-9, 1994, XP002123899, Garabedian, H. D. (1) et al., "Recombinant hepatocyte growth factor accelerates endothelial cell regrowth in vivo following arterial injury", Circulation (1995) Vol. 92, No. 8 Suppl., páginas 1750. Meeting Info., 68^{th} Scientific Session of the American Heart Association Anaheim, California, EE.UU., 13-16 Noviembre, 1995, XP002022818, así como los documentos EP-A-0492614, JP-A-6172207 y JP-A-5213733, describen composiciones farmacéuticas que comprenden HGF.

El documento US-A-5.004.805 y Odenthal M. et al., describen el uso de HGF para el tratamiento de la cirrosis/fibrosis hepática. El documento EP-A-0462549 enseña el uso de HGF en estados de nefritis crónica. El documento EP-A-0492614 describe el uso de HGF para la recuperación de la piel después de una operación, con objeto de evitar las cicatrices.

El objeto a resolver mediante la presente invención es proporcionar un agente que acelera la descomposición del colágeno, que puede inducir la descomposición de una matriz de colágeno de tejido conjuntivo excesivamente acumulado en un tejido y, más particularmente, un agente terapéutico útil para el tratamiento de la fibrosis pulmonar (que se denomina en lo sucesivo "trastorno fibrótico").

Descripción de la invención

Los presentes inventores han investigado intensamente para resolver el objeto anteriormente descrito. Como resultado de ello, los inventores han descubierto que el HGF es efectivo para promover la descomposición del colágeno y que es eficaz para el tratamiento de la fibrosis pulmonar, trastorno basado en su acción, con lo cual ha sido completada la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una representación esquemática que muestra el plan del Ejemplo 1 de administración del medicamento.

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La Fig. 2 es una representación esquemática que muestra el plan del Ensayo A del Ejemplo 2 de administración del medicamento.

La Fig. 3 es una representación esquemática que muestra el plan del Ensayo B del Ejemplo 2 de administración del medicamento.

La Fig. 4 es una gráfica que muestra los resultados de medidas de GOT, GPT y \gamma-GTP del Ensayo A del Ejemplo 2.

La Fig. 5 es una gráfica que muestra los resultados de ensayos de GOT, GPT y hepaplasteína y la medida de contenido de Hyp (hidroxiprolina) hepática, del Ensayo B del Ejemplo 2.

La Fig. 6 es una gráfica que muestra el efecto de supervivencia del HGF en una fibrosis hepática (no según la invención), de ratas en el Ensayo A del Ejemplo 3. En la Fig. 6, la línea de puntos indica un grupo (grupo testigo, n = 10) que ha recibido solución salina fisiológica, la línea de trazos indica un grupo (n = 5) que ha recibido HGF en una dosis de 50 \mug/kg de peso, y la línea continua indica un grupo (n = 5) que ha recibido HGF en una dosis de 200 \mug/kg de peso.

La Fig. 7 es una fotografía que muestra el efecto del HGF de alivio de la fibrosis hepática (no según la invención) sobre ratas con fibrosis hepática, en el Ensayo B del Ejemplo 3.

La Fig. 8 es una gráfica que muestra la proporción (%) de tejido fibrótico de cada hígado individual del Ejemplo 4 (no según la invención).

Mejores modos de llevar a cabo la invención

Como el HGF usado en la presente invención, pueden emplearse compuestos preparados por diversos métodos, si son purificados en una extensión tal que puedan ser usados como medicamentos.

Se conocen muchos métodos para preparar HGF, y, por ejemplo, puede obtenerse HGF por extracción y purificación partiendo de órganos tales como hígado, bazo, pulmón, médula ósea, cerebro, riñón, placenta y semejantes; células sanguíneas tales como plaquetas, leucocitos y semejantes; plasma y suero de mamíferos tales como rata ,vaca, caballo, oveja y semejantes (FEBS Letters, 224, 312, 1987; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 5844, 1989).

También es posible obtener HGF por cultivo de células de cultivos primarios o líneas celulares que producen HGF, seguido de separación y purificación desde el producto obtenido del cultivo (por ejemplo, sobrenadante del cultivo, células cultivadas, etc.). Además, puede obtenerse HGF mediante métodos de ingeniería genética que comprenden clonar el gen que codifica HGF, insertarle en un vector adecuado, transfectar el vector para obtener un transformante, y aislar el HGF recombinante deseado desde el sobrenadante del cultivo del transformante (por ejemplo, Nature, 342, 440, 1989; Biochem. Biophys. Res. Commun., 163, 967, 1989). La célula huésped no está limitada específicamente, y pueden emplearse diversas células huésped utilizadas convencionalmente en los métodos de ingeniería genética, que son, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis, levadura, hongos filamentosos y células vegetales o animales.

Más concretamente, el método de extracción y purificación de HGF a partir de tejidos de nueva aportación, consiste, por ejemplo, en administrar tetracloruro de carbono por vía intraperitoneal a una rata, separar el hígado de la rata con hepatitis, homogeneizarle y purificarle mediante las técnicas ordinarias de purificación de proteínas, tales como cromatografía en columna de gel usando S-Sepharose y Sepharose heparinizada, HPLC y semejantes.

Además, usando el método de ingeniería genética, el gen que codifica la secuencia de aminoácidos del HGF humano, se inserta en un vector tal como DNA del virus del papiloma bovino, y semejante, obteniendo un vector de expresión, usando este vector de expresión son transformadas células animales tales como células de ovario del hámster chino (CHO), células C127 del ratón, células COS del mono, y semejantes, y el HGF puede ser obtenido desde el sobrenadante del cultivo de los transformantes.

En cuanto al HGF obtenido de este modo, existen posibilidades de que una parte de la secuencia de aminoácidos del HGF sea suprimida o sustituida con otro u otros aminoácidos, de que otra secuencia de aminoácidos sea insertada parcialmente, de que uno, dos o más aminoácidos sean fijados a los extremos C y/o N terminales, o de que, de modo semejante, sean suprimidos o sustituidos azúcares.

El agente que acelera la descomposición del colágeno comprende el HGF descrito como ingrediente activo, y el HGF tiene acción acelerante de la descomposición del colágeno (aumento de la actividad de la colagenasa) como se expone en los Ejemplos de Ensayo que se citan más adelante. Por consiguiente, el agente que acelera la descomposición del colágeno es eficaz para el tratamiento de la fibrosis pulmonar, así como para la prevención de la misma.

Además, el agente para el tratamiento terapéutico del trastorno fibrótico comprende, igualmente, el HGF descrito como ingrediente activo y es útil para el tratamiento de los trastornos fibróticos caracterizados por la producción excesiva de una matriz de tejido conjuntivo derivada de fibroblastos, que contiene colágeno, fibronectina y glicosaminoglicano (GAG).

El agente que acelera la descomposición del colágeno y agente terapéutico para tratar los trastornos fibróticos son aplicables al tratamiento de la fibrosis pulmonar y la aceleración de la descomposición del colágeno en mamíferos (por ejemplo, vacas, caballos, cerdos, ovejas, perros, gatos y semejantes) además de los seres humanos.

El agente que acelera la descomposición del colágeno y agente terapéutico para tratar la fibrosis pulmonar puede prepararse en formas farmacéuticas diversas (por ejemplo, líquidos, comprimidos y cápsulas), y en general se prepara en forma de inyección, inhalación, supositorios o preparaciones orales que contienen HGF como ingrediente activo, solo o junto con excipientes usados convencionalmente. La inyección puede prepararse mediante el método convencional y, por ejemplo, el HGF se disuelve en un disolvente apropiado esterilizado (por ejemplo, agua esterilizada, solución tampón, o solución salina fisiológica), se filtra, se esteriliza. y se llena asépticamente en un recipiente. El contenido de HGF en la inyección puede ser habitualmente de 0,0002 a 0,2 % p/v, preferiblemente 0,001 a 0,1% p/v . En cuanto a la preparación oral, se fabrica en diversas formas farmacéuticas, que incluyen comprimidos, gránulos, gránulos finos, polvo, cápsulas blandas o duras, líquidos, emulsiones, suspensiones o jarabes, y estas preparaciones pueden ser fabricadas por los métodos convencionales. En lo referente a los supositorios pueden ser preparados mediante el método farmacéutico convencional usando una base de supositorios (por ejemplo, manteca de cacao, aceite de laurina, glicero-gelatina, macrogol, witepsol, etc.). Además, en cuanto a las inhalaciones, éstas pueden prepararse también mediante el método farmacéutico convencional. El contenido de HGF en la preparación puede ajustarse apropiadamente dependiendo de la forma farmacéutica y de la enfermedad que ha de ser tratada.

Al producir la preparación es preferible añadir un agente de estabilización, y ejemplos de ellos incluyen albúmina, globulina, gelatina, glicocola, manitol, glucosa, dextrano, sorbitol, etilenglicol y semejantes. Además, la preparación puede contener otros aditivos necesarios para la preparación farmacéutica tales como un excipiente, un medio de ayuda para la disolución, un antioxidante, un agente de alivio del dolor, un agente de isotonicidad, y semejantes. En preparados líquidos es preferible almacenarlos en condiciones de congelación o después de la separación de agua mediante un proceso tal como la liofilización. La preparación liofilizada se usa disolviendo de nuevo en agua destilada para inyección y semejante, antes del uso.

El agente que acelera la descomposición del colágeno y agente terapéutico para tratar la fibrosis pulmonar se administran mediante vías diversas dependiendo de la forma farmacéutica de preparación. Por ejemplo, la inyección se administra por vía intravenosa, intraarterial, subcutánea, intramuscular y semejante. La dosis se ajusta apropiadamente dependiendo de los síntomas, la edad y el peso del paciente, y, en general, es de 0,05 mg a 500 mg, de preferencia 1 mg a 100 de HGF, administrada una vez al día o varias veces al día.

Aplicabilidad industrial

El HGF, el ingrediente activo, acelera la descomposición del colágeno (aumento de la actividad de la colagenasa), y puede tratar eficazmente la fibrosis pulmonar. Por tanto, según la presente invención, son posibles la prevención y tratamiento de una enfermedad que se debe a una actividad reducida de colagenasa y la afección fibrótica antes descrita, que se caracteriza por la producción excesiva de matriz del tejido conjuntivo derivada de fibroblastos.

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Ejemplos

Los Ejemplos que siguen no son según la invención pero son útiles para la comprensión de la invención.

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Ejemplo de Preparación 1

Ejemplo de producción de formulación de HGF

(1)	HGF	20 \mug
	Albúmina sérica humana	100 mg

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Las sustancias descritas se disolvieron en PBS 0,1 M (pH 7,0) y el volumen de la solución resultante se completó hasta 20 ml con el mismo disolvente. La mezcla resultante se esterilizó y luego partes alícuotas de 2 ml de la mezcla se vertieron en viales, por separado, y se liofilizaron y cerraron herméticamente.

(2)	HGF	40 \mug
	Tween 80	1 ng
	Albúmina sérica humana	100 mg

Las sustancias descritas se disolvieron en solución salina fisiológica para inyección, preparando una mezcla que tenía un volumen total de 20 ml. La mezcla resultante se esterilizó y después partes alícuotas de 2 ml de la mezcla se vertieron en viales, por separado, y se liofilizaron y cerraron herméticamente.

Ejemplo 1 Efectos de prevención y mejora del HGF sobre la fibrosis hepática de ratas inducida con dimetilnitrosamina 1. Método de ensayo

(1) Animales usados: Ratas Wistar, macho, de 5 semanas de edad.

(2) Plan del ensayo

Se administró dimetilnitrosamina (DMN) por vía intraperitoneal a ratas en una dosis de 10 \mul/kg cada Martes, Miércoles y Jueves durante 4 semanas. Se administró HGF por vía intravenosa a las ratas en una dosis de 500 \mug/kg dos veces al día (1000 \mug/kg/día) durante 28 días desde la primera administración de DMN. El plan de administración se muestra en la Fig. 1. El 29º día, las ratas del ensayo fueron sometidas a la medida siguiente.

(3) Medida

Las ratas fueron diseccionadas para medir el peso del hígado. Después, el contenido de hidroxiprolina (Hyp; un índice de la fibrosis) y la actividad de la colagenasa (enzima de descomposición del colágeno), en el tejido hepático, fueron medidas, respectivamente, mediante el método de Kivirikko et al., (Anal. Biochem., 19, 249, 1967) y el método de Murawaki et al., (J. Biochem., 108, 241, 1990). Además, los contenidos de DNA y de proteína del tejido hepático fueron medidos, respectivamente, mediante el método de Dishe modificado por Burton (Biochem. J., 62, 315, 1958) y el kit de análisis de Proteínas (fabricado por Bio-Rad Ltd.). Los resultados se exponen en la Tabla 1.

También, se recogió sangre de la vena cava posterior al mismo tiempo, y se realizó el ensayo bioquímico clínico del suero recogido, por análisis en un aparato automático de análisis tipo Hitachi 7150. Luego, usando la sangre recogida de la vena cava posterior a la que se había adicionado EDTA, se midieron el número de plaquetas, el número de leucocitos, el número de eritrocitos, el valor hematocrito y la concentración de hemoglobina, mediante un aparato automático de recuento de células sanguíneas, de muchos parámetros (E-4000) fabricado por Sysmex). Asimismo, usando el plasma obtenido mezclando una solución acuosa de citrato de sodio al 3,8% y la sangre recogida de la vena cava posterior, en una relación de 1:9, se midió la capacidad de coagulación del plasma (tiempo de protrombina, contenido de fibrinógeno, tiempo de coagulación mediante el ensayo de hepaplasteína y el ensayo de trombos) mediante un aparato automático de medida de la capacidad de coagulación (KC-40). El resultado se expone en la Tabla 2.

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TABLA 1

1

TABLA 2

2

2. Resultados

Como muestran la Tabla 1 y la Tabla 2, debido a la administración repetida de DMN, se observaron una progresión notable de la fibrosis hepática y de la contracción del hígado en el grupo al que se había administrado disolvente (testigo), y se confirmó una depresión clara de la función hepática mediante los valores de los ensayos clínicos de la bioquímica de la sangre y del ensayo de coagulación. Por otra parte, los valores de los ensayos de la función hepática del grupo al que se había administrado HGF se manifestaron cercanos a los de los valores de los animales normales con diferencia significante en comparación con los valores del grupo al que se había administrado disolvente, y revelaron un efecto claro de mejora. Además, debido a la administración del HGF, la actividad de la colagenasa, el contenido de proteína y el contenido de DNA en el tejido hepático habían aumentado significativamente, el contenido de hidroxiprolina, que es el índice de la fibrosis, había disminuido significantemente, y el peso del hígado se había recuperado alcanzando aproximadamente el nivel normal.

Ejemplo 2 Acción del HGF sobre la fibrosis hepática de ratas inducida con tetracloruro de carbono

Se administró tetracloruro de carbono por vía oral a ratas Wistar, macho, (de 6 semanas de edad) en una dosis de 0,7 ml/kg todos los Lunes y Jueves durante 12 semanas, para preparar modelos de fibrosis hepática. Estas ratas con fibrosis hepática inducida con tetracloruro de carbono, fueron sometidas a los dos ensayos que siguen.

(1) Ensayo A Ensayo de administración repetida

Se administró HGF por vía intravenosa a las ratas antes descritas, con fibrosis hepática inducida con tetracloruro de carbono (un grupo incluye 13-14 individuos) en dosis de 50 y 500 \mug/kg, dos veces al día (100 y 1000 \mug/kg/día), durante 7 días. El plan de administración se expone en la Fig. 2. Los cambios de los valores de GOT, GPT y \gamma-GTP en el suero los días 3, 5 y 7 después del comienzo de la administración de HGF, fueron comparados con los del suero del grupo al que se había administrado disolvente (testigo). Los resultados se exponen en la Fig. 4.

Como muestra la Fig. 4, el efecto de aceleración del HGF sobre la recuperación se observó en el día 5, en una dosis de 1000 \mug/kg/día y en el día 7, en una dosis de 100 \mug/kg/día.

(2) Ensayo B Ensayo de inyección por goteo

Se infundió HGF en las ratas antes descritas con fibrosis hepática inducida con tetracloruro de carbono (n= 12-13 por grupo), en dosis de 100 y 1000 \mug/kg/día, por medio de un catéter colocado en la vena cervical, y fueron sometidas a disección 72 horas después de iniciar la infusión de HGF. El plan de infusión del HGF se expone en la Fig. 3.

La GOT, GPT, la proteína sérica total y la albúmina del suero se determinaron mediante un aparato de análisis automático Hitachi tipo 7150, y con respecto a la capacidad de coagulación del plasma obtenido mezclando una solución acuosa de citrato de sodio al 3,8% y la sangre recogida desde la vena cava posterior, en una relación de 1:9, el tiempo de coagulación en el ensayo de hepaplasteína se midió mediante un aparato automático de medida de la capacidad de coagulación (KC-40).

Además, el contenido de hidroxiprolina del tejido hepático (Hyp), que es el índice de la fibrosis, se midió mediante el método de Kivirikko et al., anteriormente descrito. Los resultados se exponen en la Tabla 3 y en la Fig. 5.

Como muestran la Tabla 3 y la Fig. 5, cuando se administró HGF en una dosis superior a 100 \mug/kg/día, se observó la mejora del valor del ensayo de la función hepática, la recuperación de la hipoproteinemia y la reducción del contenido de hidroxiprolina del tejido hepático, lo que indica mejoría de la fibrosis, cada uno de ellos dependiendo de la dosis.

TABLA 3

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Ejemplo 3 Efecto del HGF sobre la fibrosis hepática de ratas inducida con DMN y sobre la insuficiencia de la función hepática acompañante (1) Ensayo A

El grupo de ratas al que se había administrado HGF y el grupo al que no se había administrado HGF, con fibrosis hepática inducida con DMN, fueron ensayados para determinar sus tasas de supervivencia.

El plan de administración de los medicamentos se expone en la parte superior de la Fig. 5. DMN disuelto en solución salina fisiológica en una concentración de 1%, fue administrado por vía intraperitoneal a ratas SD, macho, tres veces al día durante 6 semanas, según indican las flechas, en una dosis de 10 \mul de DMN por kg de peso. El HGF humano o la solución salina fisiológica se administró por vía intravenosa a las ratas todos los días durante el período indicado por una banda sombreada, desde el 21^{er} día después de iniciar la administración de DMN, examinando el curso del tiempo de supervivencia de las ratas sometidas al ensayo. Los resultados se exponen en la Fig. 6. En la Fig. 6 la línea de puntos indica el grupo al que se administró solución salina fisiológica (grupo testigo, n = 10), la línea de trazos indica un grupo al que se administró HGF en la dosis de 50 \mug/kg de peso (n = 5), y la línea continua indica un grupo al que se administró HGF en la dosis de 200 \mug/kg de peso (n = 5).

Como muestra la Fig. 6, mediante la administración de HGF, las tasas de supervivencia habían mejorado y, en especial, no se observó muerte alguna en el grupo al que se había administrado HGF en la dosis de 200 \mug/kg de peso.

(2) Ensayo B

La deposición de colágeno de tipo I (observación histológica) del hígado de la rata a la que se había administrado DMN, se examinó con la administración o sin administración de HGF.

A saber, para la detección de fibras de colágeno, las ratas fueron sacrificadas y los hígados fueron extraídos el día 42º en los ensayos expuestos en la Fig. 6. Para realizar la tinción inmunofluorescente del colágeno, el hígado fue congelado rápidamente en compuesto OTC, y los cortes preparados se hicieron reaccionar con un anticuerpo de conejo anti-colágeno de tipo I de rata (obtenido de LSL Ltd.) y un anticuerpo de cabra anti-IgG de conejo marcado fluorescente, y después las muestras fueron fotografiadas. Los resultados se exponen en la Fig. 7.

Como muestra la Fig. 7 había una diferencia importante entre la administración y la no administración de HGF en las deposiciones de colágeno de tipo I en el hígado. En el grupo de ratas testigo al que se había administrado la solución salina fisiológica, la deposición de colágeno de tipo I en el hígado era evidente, haces gruesos o delgados de una fibra de colágeno de tipo I se habían depositado con profusión en torno a los vasos sanguíneos y los hepatocitos.

Estos acaecimientos desaparecieron mediante la administración de HGF de un modo dependiente de la dosis y la mejora de la estructura del lóbulo era notable en el grupo al que se había administrado HGF De este modo, se demostró el efecto de prevención del HGF sobre la fibrosis hepática mediante la observación histológica de la sección del hígado.

(3) Ensayo C

Fueron examinados los cambios en los tiempos de protrombina, y de los contenidos de enzima ligada a los hepatocitos e hidroxiprolina hepática, obtenidos mediante la administración de HFG.

Para ello, fueron tratadas ratas según el plan de experimentación expuesto en la Fig. 6. El tiempo de protrombina (PT), los valores en el suero (plasma) de albúmina (Alb), de la transaminasa glutámica oxaloacético (GOT), de la transaminasa glutámico pirúvica (GPT) y de la fosfatasa alcalina (ALP), así como el contenido de la hidroxiprolina hepática (HYP) fueron medidos, respectivamente, en un grupo de ratas normales (n = 5, indicado como ratas normales en la Tabla 4), un grupo en el que había sido llevado a cabo un tratamiento con DMN durante 5 semanas y solamente se le había administrado solución salina fisiológica (n = 5, indicado como 5W en la Tabla 4), un grupo en el que el tratamiento con DMN había sido llevado a cabo durante 6 semanas y solamente se le había administrado solución salina fisiológica (n = 5, indicado como 6W en la Tabla 4) o grupos a los que se había administrado HGF en dosis de 50 \mug/kg de peso (n = 3, indicado como 50 en la Tabla 4) y 200 \mug/kg de peso (n = 5, indicado como 200 en la Tabla 4), en lugar de la solución salina fisiológica. Los resultados se exponen en la Tabla 4. En ella, los valores indicados como 5W fueron obtenidos sacrificando ratas el dia 35º y los otros valores se obtuvieron sacrificando ratas el día 42º después de la iniciación del tratamiento con DMN.

Como muestra la Tabla 4, debido a la administración de HGF, se observó que la fibrosis hepática y la insuficiencia funcional del hígado habían mejorado.

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Ejemplo 4 Efecto de la administración de HGF sobre la mejora de la fibrosis hepática de ratas inducida con DMN (1) Método

Se administró DMN por vía intraperitoneal a ratas SD, macho, (de 5 semanas de edad) en una dosis de 10 \mul/kg tres días consecutivos a la semana (Lunes, Martes, Miércoles) durante 4 semanas obteniendo ratas con fibrosis hepática. A estas ratas se administró 1 mg/kg de HGF ó 1 ml/kg de un disolvente (solución salina tamponada con fosfato comprendiendo 2,5 mg/ml de HSA y Tween 80 al 0,01%) cinco días consecutivos de la semana (Lunes, Martes, Miércoles, Jueves y Viernes) desde el comienzo de la administración de DMN hasta el 4º día de la 4ª semana. El 5º día de la 4ª semana las ratas fueron sacrificadas, los hígados fueron retirados y fijados en formalina neutra, y después de la preparación de secciones, éstas fueron sometidas al ensayo de tinción tricrómica de Masson que tiñe el tejido fibroso y que no tiñe otros tejidos. Para comparar, fueron teñidos, asimismo, los hígados de ratas normales. En lo que respecta a las muestras de tejido hepático de los respectivos individuos, la superficie de tejido fibroso en la superficie total de la sección de tejido se calculó, respectivamente, mediante un aparato de análisis de imagen (T. Wanatabe et al., Analytical Cellular Pathology, 4 (3), 248, 1992), y se compararon los grados de tejido fibroso del tejido normal. Las muestras usadas para el análisis incluían 8 muestras de las ratas normales, 8 muestras del grupo al que se había administrado DMN + disolvente, y 6 ejemplos del grupo al que se había administrado DMN + HGF (HGF + DMN), excepto las muestras de ratas en las que la actividad de neutralización del HGF había sido generada en su suero.

(2) Resultado

Los resultados se exponen en la Fig. 8. Cada punto de la figura indica la relación (%) de tejido fibroso en cada uno de los hígados individuales de las ratas normales (n = 8), las ratas a las que se había administrado DMN (n = 8) o las ratas a las que se había administrado DMN + HGF (n = 6). La barra horizontal indica los valores medios.

Como muestra la Fig. 8, en comparación con las ratas normales, la relación de tejido fibroso en el tejido hepático del grupo al que se había administrado DMN, había aumentado a 7,3% desde 1,3% (media, ratas normales). Por otra parte, en el caso del grupo al que se había administrado DMN + HGF, la relación había disminuido a 2,8% en comparación con la del grupo al que se había administrado DMN. Este fenómeno indica la mejora de la fibrosis hepática inducida con DMN, mediante la administración de HGF.

Claims

1. El uso del Factor de Crecimiento del Hepatocito para fabricar un medicamento para el tratamiento de la fibrosis pulmonar.