WO1995006748A1 - Anticorps monoclonal permettant d'induire une apoptose - Google Patents

Anticorps monoclonal permettant d'induire une apoptose Download PDF

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WO1995006748A1
WO1995006748A1 PCT/JP1994/001453 JP9401453W WO9506748A1 WO 1995006748 A1 WO1995006748 A1 WO 1995006748A1 JP 9401453 W JP9401453 W JP 9401453W WO 9506748 A1 WO9506748 A1 WO 9506748A1
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Naoshi Fukushima
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to a novel monoclonal antibody and a fragment thereof, which have the property of inducing apoptosis in myeloid cells and are useful as a therapeutic agent for myeloid leukemia, etc., and to a hybridoma producing the monoclonal antibody. .
  • the monoclonal antibody of the present invention is useful as an antibody that specifically recognizes an antigen that causes apoptosis in myeloid cells, and is useful for discriminating them, and causes apoptosis in myeloid cells. Since it has an effect, it can be used as a therapeutic agent or the like useful in the field of treatment of myeloid leukemia, etc., by utilizing the properties. Background art
  • granulocyte colony stimulating factor for example, recombinant granulocyte colony stimulating factor (rG-CSF) is a humoral factor that mainly promotes differentiation and proliferation of granulocyte cells.
  • rG-CSF recombinant granulocyte colony stimulating factor
  • administration of rG-CSF not only promoted hematopoiesis in the bone marrow, but also caused marked extramedullary hematopoiesis in the spleen and all hematopoietic progenitors, including hematopoietic stem cells. Cells have been reported to grow in the spleen.
  • hematopoietic stromal cell line (CF-1 cell) was established from the spleen of mice to which rG-CSF was continuously injected, and the hematopoietic stromal cells were When the ability to support hematopoiesis was examined, colony stimulating activity at in Vitro 0 and ability to support hematopoietic stem cells in vivo were observed [B] ood, 80, 1914 (1992)].
  • CF-1 cells cell lines
  • the present inventor has conducted intensive studies with the aim of developing a specific antibody capable of discriminating spleen stromal cells based on the above-mentioned findings on spleen stromal cells and the results of previous research.
  • the spleen stromal cell line was used as a sensitizing antigen to produce a monoclonal antibody, a novel monoclonal antibody, which had not been reported before, was obtained.
  • the monoclonal antibody has a property of inducing apoptosis in myeloid cells, and the present invention It was completed. Disclosure of the invention
  • An object of the present invention is to provide a novel monoclonal antibody and a fragment thereof, which have the property of inducing apoptosis in myeloid cells and are useful as a therapeutic agent for myeloid leukemia and the like. It is an object of the present invention to provide a hybridoma that produces the monoclonal antibody.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be used for myeloid cells (my eloid ce 11 1) apoptosis (nucleated chromatin DNA is cleaved in units of nucleosomes (so-called ladder formation), resulting in cell death and also cell death) It is extremely useful as an antibody that specifically recognizes an antigen or the like, that has a function of identifying and identifying them, or that has a function of inducing apoptosis in myeloid cells.
  • Myeloid-like cells include cells other than lymphocytes, such as neutrophils, megakaryocytes, myeloblasts, myelocytes, mast cells, macrophages, monocytes, and erythroblasts.
  • the myeloid-like cells referred to in the present invention also have the same meaning.
  • the monoclonal antibody of the present invention has a property of inducing apoptosis in myeloid cells. Is defined as encompassing all monoclonal antibodies with
  • Such a monoclonal antibody of the present invention can be basically produced, for example, as follows.
  • the monoclonal antibody of the present invention can be immunized, for example, by using spleen stromal cells of an animal to which rG-CSF has been administered as a sensitizing antigen, and basically immunizing it by applying a normal immunization method; It can be produced by cell fusion using a normal cell fusion method and cloning by applying a normal cloning method.
  • the method for producing the monoclonal antibody of the present invention is, for example, a method using the stromal stromal cells of a rG-CSF-administered mouse established by the present inventors as a cultured cell line as the sensitizing antigen.
  • a cultured cell line as the sensitizing antigen.
  • the plasma cells (immune cells) of a mammal immunized with the sensitizing antigen can be used as a mouse or the like.
  • the obtained fused cells (hybridoma) are cloned.
  • a clone producing the antibody of the present invention recognizing the cell line is selected from the cells and cultured.
  • the sensitizing antigen is not limited to the CF-1 cell, but may be similar to that of the CF-1 cell.
  • a cell line derived from the obtained human spleen stromal cells can be used as appropriate, and a monoclonal antibody that binds to a target human myeloid cell can be used in the same manner as in the case of the CF-1 cell. Can be made.
  • the mammal to be immunized with the sensitizing antigen is not particularly limited, but may be determined in consideration of compatibility with the myeloma cells used for cell fusion. It is preferable to select, and generally, mouse, rat, hamster and the like are used as suitable ones.
  • immunization is performed by a general method, for example, by administering the spleen stromal cells such as the CF-1 cells to a mammal by intraperitoneal injection or the like. More specifically, it is preferable to administer several times a month to animals diluted and suspended in an appropriate amount with PBS or physiological saline.
  • the immune cells spleen cells extracted after the final administration of the cell line are preferably used.
  • the cell fusion between the immune cells and myeloma cells is basically performed by a usual method, for example, the method of Milstein et al. (Mi steins Enzymo 1., 73, 3-46) (1981)]].
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal nutrient medium in the presence of a fusion promoter.
  • a fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) and the like are used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide may be appropriately added and used to increase the fusion efficiency. it can.
  • the ratio of the use of the immune cells and the myeloma cells is preferably, for example, about 1 to 10 times the number of the immune cells as compared to the myeloma cells.
  • Examples of the medium used for the cell fusion include, for example, an RPMI-164 medium suitable for the growth of the myeloma cell line, a MEM medium, and other ordinary mediums used for cell culture of this type. It can be used, and a serum replacement solution such as fetal bovine serum (FBS) can be used in combination.
  • FBS fetal bovine serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the medium, and the mixture is heated to about 37 in advance, for example, a PEG solution, for example, having an average molecular weight of about 0000 to 6,000.
  • the PEG is usually added to the medium at a concentration of about 30 to 60% (W / V) and mixed. Subsequently, the desired hybridoma is formed by successively adding an appropriate medium and centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma is selected by culturing it in a normal selection medium, for example, a HAT medium (a medium containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine).
  • a HAT medium a medium containing hypoxanthine, aminobuterin and thymidine.
  • the culture in the HAT medium is continued for a period of time sufficient to kill cells (unfused cells) other than the desired hybridoma, usually several days to several weeks.
  • normal limiting dilution According to the method, screening and monocloning of hybridomas producing the desired antibody are performed.
  • the thus produced hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be subcultured in a usual medium, and can be stored for a long time in liquid nitrogen. .
  • the hybridoma is cultured according to a conventional method, and the hybridoma is obtained from the culture supernatant, or the hybridoma is administered to a mammal compatible with the hybridoma.
  • an appropriate method such as a method for obtaining the ascites from the ascites.
  • the former method is suitable for obtaining high-purity antibodies, while the latter method is suitable for mass production of antibodies.
  • the antibody obtained by the above-mentioned method can be purified to a high purity by applying ordinary purification means such as a salting-out method, a gel filtration method, and an affinity chromatography.
  • the monoclonal antibody of the present invention may be of any type as long as it has the specific properties specifically shown in Examples described later, namely, a function of inducing apoptosis in myeloid cells. Any such sensitizing antigens are included in the scope of the present invention as long as they have the function, and the monoclonal antibody of the present invention can be used for the treatment of myeloid leukemia, etc. It can be used as a therapeutic agent useful in the field of.
  • Such an antibody specifically recognizing an antigen that causes apoptosis in myeloid cells using such a monoclonal antibody of the present invention can be used to identify and identify these antigens.
  • the construction, modification, and application of a specific system for use as a therapeutic agent for myeloid leukemia, etc., utilizing the properties are carried out by applying ordinary methods obvious to those skilled in the art. Needless to say, all of them are included in the scope of the present invention.
  • FIG. 1 shows an analysis by immunofluorescence (control in the absence of antibody, CF-1 cells).
  • FIG. 2 shows the analysis of the binding between the GSPST-1 antibody and CF-11 cells by immunofluorescence.
  • FIG. 3 shows BMA P-1 antibody and C F— by immunofluorescence.
  • Figure 4 shows the analysis by immunofluorescence (control without antibody, bone marrow cells).
  • FIG. 5 shows the analysis of the binding between the GSPST-1 antibody and bone marrow cells by immunofluorescence.
  • FIG. 6 shows analysis of binding between BMA P-1 antibody and bone marrow cells by immunofluorescence.
  • FIG. 7 shows analysis by immunofluorescence (control in the absence of antibody).
  • FIG. 8 shows the binding between GSPST-1 and NFS-60 cells by immunofluorescence.
  • FIG. 9 shows analysis by immunofluorescence (control with rat IgG1).
  • FIG. 10 shows the binding of BMA P-1 to NFS-60 cells by immunofluorescence.
  • FIG 11 shows the cell growth inhibition test (BMA P-1) of the monoclonal antibody.
  • FIG. 12 shows a bone marrow transplantation inhibition test (GSPST-1) of a monoclonal antibody.
  • FIG 13 shows the bone marrow transplantation inhibition test (BMA P-1) of the monoclonal antibody.
  • FIG. 4 is an explanatory diagram showing dead bone marrow cells (2) and a control in the absence of antibody (1). [Microscopic photograph (HE staining) ⁇ (X400)] of a bone marrow specimen (organism morphology) Show.
  • FIG. 15 is an explanatory diagram showing the ladder 'formation of DNA in bone marrow cells observed when the monoclonal antibody BMAP-1 of the present invention was administered (electrophoretic chromatograph).
  • FIG. 16 shows a cytotoxicity test by TNF.
  • Figure 17 shows the cytotoxicity test (BMAP-1) of the monoclonal antibody.
  • Figure 18 shows the analysis by immunofluorescence (control with rat IgG2a).
  • FIG. 19 shows binding of anti-mouse MHC c1assI antibody to BWV1 cells by immunofluorescence.
  • Figure 20 shows the analysis by immunofluorescence (control with rat IgGl).
  • Figure 21 shows the binding of BMAP-1 to BWV1 cells by immunofluorescence.
  • a spleen stromal cell line by continuous administration of rG-CSF was established from primary culture of spleen cells of C57BL / 6J mice to which rG-CSF was administered at 100 ⁇ g / kg for 5 days. That is, after administration of rG-CSF, the spleen was excised under sterile conditions, cultured in a 25 cm 2 plastic flask (C0Rning) for 6 weeks, and 10% inactivated serum (FBS) (III Modified version of Iscove supplemented with 100 UZm1 ⁇ 1010 and gZm1 streptomycin D Ubemco medium (IMDM) (manufactured by Boehringer-Mannheim) in at 37, and incubated in a 5% C 0 2 of Inkyube evening was replaced with fresh media twice a week.
  • IMDM inactivated serum
  • stromal cells Adherent cell population (stromal cells) from confluent culture using free PBS ) was taken and transferred to another flask. This subculture was repeated about once or twice a week. The splitratatio of the cells in the initial subculture (1st to 10th times) was 1Z4 to 1-8, but the ratio thereafter was 1116 to 1Z32. After about the 10th subculture, the stromal cells became homogeneous fibroblast-like. At the 20th passage, stromal cells were collected by the method described above, and cloning of the cells was repeated twice using the limiting dilution method to establish a stromal cell line (CF-11 cell line).
  • spleen stromal cell lines can be established for other mammals.
  • the cells can be transformed with SV-40 adenovirus vector as described above. Human spleen interstitium in the manner It is possible to establish a cell line [J. Cell. Physio 1., 1 48, 2 45 (1991)] 0
  • phagocytosis is latex • Beads (particle size: 1.09 ⁇ m, using S i gm a), also ability to differentiate into fat cells, 2 5 cm 2 after flask Konfuruen preparative cultured in 1 0 - 6 m 0 1/ 1 phosphate Hydro cortisone (S i gma Co.) And add 4 Weekly culture was examined.
  • CF-1 cells were negative for alkaline phosphatase, factor VIII-related antigen, Mac I and poor phagocytic ability, but positive for type I collagen, type III collagen and fibronectin.
  • CF- 1 cells but faintly, including the re-pitch soil, it did not differentiate into fat cells are also depending on the Konfuruen door culture of 4 weeks of 1 0 _ e mo high mud cortisone presence of l / 1.
  • These data indicate that CF-11 cells do not have the characteristics of preadipocytes, macrophages, and vascular endothelial cells, indicating that they are derived from stromal cells different from these. .
  • a CFU-S assay (splenic colony formation method) was performed using the method of Ti11 & McCul1och. 9 in groups of 10 mice 0 0 c G y irradiation (MB R- 1 5 2 0 R , H itachi Co., Tokyo) and then, bone marrow mononuclear cells (BM cells) (1. 0 X 1 0 5 Zh ead, 5. 0 X 1 0 4 head or 2. 5 x 1 0 4 / head) and CF- 1 cells (1. 0 x 1 0 5 Zh ead) injected intravenously, calculate the number of colonies in the spleen 1 day 2 forte CFU—S (spleen colony).
  • BM cells bone marrow mononuclear cells
  • BM cells bone marrow mononuclear cells
  • CF-1 cells CF-1 cells
  • the antigen sensitization was performed using the CF-1 cells obtained in the above Reference Example as the sensitizing antigen.
  • the cell lines used were 10% fetal bovine serum (FBS, manufactured by Sanko Junyaku Co., Ltd.) and Isc0Ve modified Du1becc0 medium (IMDM) (Boehringer-Mannheim). , the following Dai ⁇ 3 ⁇ 4 ⁇ ⁇ one ⁇ this at a temperature of at 37 in a 5% 0 2 Inkyu base Ta.
  • the cells were recovered from the culture flask by pipetting after lmME DTA and PBS treatment.
  • the cells about 1 X 1 0 7 or m
  • the cells were suspended in ImMEDTA / PBS at a cell number of 1, suspended, and immunized against a Wistar Imamich rat (7-week-old, harrah, Animal Breeding Laboratory).
  • the first immunization cell injection 1 m 1 to about 1 X 1 0 7 or Zm 1 to rats intraperitoneally, and boosted the cells 1 m 1 of LXL O 7 or Zm l after 1 month.
  • the obtained fused cells were dispensed into 96 pellets in an IMDM medium containing 20% FBS, and cultured at 37 in a 5% CO 2 incubator. From the next day, the culture was continued by gradually replacing the medium with a HAT selection medium.
  • the supernatant was replaced with a fresh HAT medium twice a week, and the culture was continued to maintain the growth.
  • the fused cells thus obtained were cloned by a conventional method using a limiting dilution method. That is, in the culture supernatant of the fused cells Using the above antibody, the binding to the sensitizing antigen was examined, and only the clones having strong binding to the sensitizing antigen were cloned by the limiting dilution method by a conventional method.
  • the fused cells screened in the above 3) were cultured according to a conventional method, and the antibody produced in the culture supernatant was separated and purified by a conventional method.
  • each of the High Priestess dormer from antibody titers high and was Ueru for the sensitizing antigen were taken out of Ueru, tissue culture Burasuchi' Kdei Mesh 5% spread (C 0 rning Ltd.) C 0 2 in 3 7 e
  • the cells were subcultured in C, expanded, and purified by a conventional method to obtain the monoclonal antibodies GSPST-1 and BMAP-1.
  • GSPST-1 cells For GSPST-1 cells, the obtained cells were intraperitoneally injected into BAL BZc AJc1-nu-nud mice (8 weeks, CLEA Japan) to which priscine was administered. After 10 to 14 days, the ascites produced was collected, salted out with 33% ammonium sulfate, and dialyzed against PBS. .
  • BMAP-1 antibody large-scale cultivation is carried out in an IscoV emodified MEM medium containing 10% FBS, the culture supernatant is concentrated, then salted with 33% ammonium sulfate, and PBS is added. After dialysis, purification was performed again using a protein A column kit (manufactured by Amersham), and dialysis was performed using PBS.
  • the case where the CF-1 cells were used as the sensitizing antigen was exemplified.
  • the present invention is not limited to the monoclonal antibody, but includes all monoclonal antibodies having similar properties, and all hybridomas producing the monoclonal antibody. Is included.
  • the hybridoma producing BMA P-1 of the monoclonal antibody of the present invention is a novel antibody prepared using the parental cells of the Wistar Imamich rat spleen cells and the mouse myeloma cell line SP2Z0-Agl4. Institute of Life Science and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the Budapest Treaty on the International Recognition of Deposit of Microorganisms for Patent Procedures under the Budapest Treaty [Address: 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan No. 3 (postal code 3 05)], deposited on August 9, 1993 as BMA P-11 (Lat Mouse Hypri-Doma), Accession No. FE RM BP—4 382 .
  • FIGS. 1 to 3 show The results obtained by examining the reactivity of the monoclonal antibodies GSP ST-1 and BMA P-1 obtained as described above to CF-1 cells by immunofluorescence analysis (Immunofluorescence analysis)
  • Fig. 1 shows the control in the absence of antibody
  • Fig. 2 shows the binding between GSPST-1 and CF-1 cells
  • Fig. 3 shows the binding between BMAP-1 and CF-1 cells
  • Analysis is shown.
  • the vertical axis indicates the relative cell number
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • the monoclonal antibodies GSPST-11 and .BMAP-1 have binding properties to CF-1 cells and recognize the surface antigen of CF-1 cells. I understood that.
  • Fig. 4 shows the analysis of control in the absence of antibody
  • Fig. 5 shows the analysis of GSP ST-1 binding to bone marrow cells
  • Fig. 6 shows the analysis of BMA P-1 binding to bone marrow cells.
  • the vertical axis indicates the relative cell number
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • GSPST-1 did not bind to bone marrow cells at all and BMAP-1 bound to all bone marrow cells.
  • FIGS. 7 to 10 The results of an investigation of the reactivity by flow cytometry (F10 w Cytometry) (FAC Scan, Becton, manufactured by Dickinson Company) are shown in FIGS. 7 to 10.
  • Fig. 7 shows the control in the absence of antibody
  • Fig. 8 shows the binding between GS PST-1 and NFS-60 cells
  • Fig. 9 shows the commercially available rat IgG1
  • FIG. 10 shows the results of analysis of the binding between BMAP-1 and NFS-60 cells.
  • the vertical axis indicates the relative cell number
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity.
  • GSPST-1 does not react with NFS-60 cells, and BMAP-1 binds to NFS-60 cells. It became clear.
  • FIG. 11 the result of investigation by M TT Atsusi method Shown in 9 6 using culture plates in holes, to NF S- 6 0 cells 4 X 1 0 3 Zw e 1 1 Z 1 0 0 1, BMA P- 1 are 0, 1 0, l OO n gZm l, 1, 10 and 10 Oz gZml were added at 10 ⁇ 1 / we 11 respectively, and two days later, the number of viable cells was measured by the MTT method. As a result, as shown in FIG. 11, it was revealed that the proliferation of NFS-60 cells was significantly suppressed by BMAP-1.
  • the IgG subclass of the obtained monoclonal antibody was typed (rat Mo no Ab—ID * Sp kit (Zymed) and biotin-labeled mouse anti-rat IgG). 1 antibody (Zymed)], GSP ST-1 was found to be IgG2a, and BMAP-1 was found to be IgG1.
  • FIGS. 12 to 13 BMAP-1 has an inhibitory effect on bone marrow transplantation, but GSPST-1 has no such effect.
  • the lethal dose of radiation (9 0 0 c G y) C 5 7 B LZ 6 J mice, and two 0 X 1 0 5 Zh ead myeloid and monochrome Naru antibodies of the tail vein And the formation of spleen colonies was observed, and the above results were obtained.
  • “N on-treated” in FIG. 13 shows the case where these were not administered.
  • BMAP-1 completely inhibits transplantation in the bone marrow transplantation inhibition test because this monoclonal antibody It was confirmed that it was caused by apoptosis in response to bone marrow cells. That is, when BMAP-1 producing hybridomas were intraperitoneally administered to nude mice, the mice died when ascites slightly accumulated. In addition, it was found that intravenous administration of 50 igZhead BMAP-1 to normal C57B LZ6 J mice killed all bone marrow cells, and Fig. 14 shows BMAP-1 intravenous injection. A micrograph showing that bone marrow cells had been killed 6 days after administration was shown.
  • lymphocytes not only lymphocytes but also neutrophils, megakaryocytes, myeloblasts, myelocytes, mast cells, macrophages, monocytes, erythroblasts, etc. (so-called myeloid cells) It was confirmed that he had died.
  • myeloid cells DNA of mouse bone marrow cells to which 30 g gZhead of BMAP-1 was administered was examined, ladder formation was clearly observed as shown in Fig. 15, and BMAP-1 was observed. It was confirmed that the above response to bone marrow cells was due to apoptosis.
  • the FMAP region of the IgG of the BMAP-1 antibody was digested with pepsin (manufactured by Sigma) and purified as F (ab ') 2 using a GPC column.
  • Intravenous administration of 33.5 / g / head (equivalent to 5 ⁇ gZhead of complete IgG) to mice showed that 'bone marrow cells were killed in the bone marrow. This demonstrated that BMAP-1 killing of bone marrow cells did not involve antibody-dependent cytotoxicity or complement-dependent cytotoxicity.
  • Fas antigen As an antigen that causes apoptosis, the cell surface protein Fas antigen has already been reported, and this Fas antigen has been found to express mRNA in the thymus, heart, liver, lung, ovary, etc. However, since the mRNA is hardly detected in bone marrow [J.Immu nol... 148, 1274-1279 (1992)], the antigen recognized by BMAP-1 is What is a conventionally known Fas antigen? Obviously they are different.
  • Fig. 18 shows a control using a commercially available rat IgG2a (Zymed)
  • Fig. 19 shows an anti-mouse MHCC1assI antibody (rat IgG2a).
  • 2a, BMA) and BWV1 cells mouse lymphoma derived from BW5147 cells
  • Fig. 20 shows commercially available rat IgGl (Zymed)
  • Figure 21 shows the results of analysis of the binding between BMAP-1 and BWV1 cells.
  • the vertical axis indicates the relative cell number
  • the horizontal axis indicates the fluorescence intensity
  • BMAP-1 was experimentally confirmed to have an action of causing apoptosis in myeloid cells, but according to the knowledge of the present inventors, as described above, Previously, a monoclonal antibody that induces apoptosis in myeloid cells was reported. There is no example, and a monoclonal antibody having such an action is a novel one discovered by the present inventors.
  • the monoclonal antibody kills myeloid leukemia cells which are considered to have high expression of the antigen. Therefore, the monoclonal antibody that induces apoptosis in myeloid cells of the present invention is useful as a therapeutic drug for myeloid leukemia and the like.
  • the monoclonal antibody of the present invention has been specifically described with reference to examples.However, the monoclonal antibody that induces apoptosis in myeloid cells according to the present invention is the one exemplified as the specific example. Is a representative example, but is not necessarily limited to this, and encompasses all monoclonal antibodies having the same properties and functions similarly produced regardless of the type of sensitizing antigen. Needless to say, there is. Industrial applicability
  • the monoclonal antibody of the present invention is useful as an antibody that specifically recognizes an antigen that causes apoptosis in myeloid cells, and is useful for discriminating them, and causes apoptosis in myeloid cells. Since it has an effect, it can be used as a therapeutic agent or the like useful in the field of treatment of myeloid leukemia, etc., by utilizing the properties.

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Description

明細書 アポトーシスを誘起するモノ クローナル抗体 技術分野
本発明は、 骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起する特性を有し、 骨髄性白血病の治療薬等として有用な新規モノ クローナル抗体なら びにその断片、 および当該モノ クローナル抗体を産生するハイプリ ドーマに関するものである。
本発明のモノ クローナル抗体は、 骨髄球様細胞にアポトーシスを 引き起こす抗原等を特異的に認識する抗体として、 これらを識別、 同定するのに有用であると共に、 骨髄球様細胞にアポトーシスを引 き起こす作用を有することから、 当該特性を利用して、 骨髄性白血 病の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し得るもの である。 背景技術
従来、 顆粒球コロニー刺激因子、 例えば、 遺伝子組換え型顆粒球 コロニー刺激因子 （ r G - C S F ) は、 主に顆粒球系細胞の分化、 増殖を促進させる液性因子として知られているものであるが、 マウ スの i n v i v oの実験では、 この r G— C S Fを投与すること により、 骨髄の造血亢進のみならず、 脾臓でも著しい髄外造血が起 こり造血幹細胞を始めとしてすベての造血前駆細胞が脾臓で増殖す ることが報告されている。 そして、 この脾臓での髄外造血のメカ二 ズムとして、 r G— C S Fの刺激により脾臓の造血微小環境が変化 し、 造血支持能力が亢進したことにより造血が生じたものであると PLりれた 0
そこで、 本発明者は、 この脾臓での造血機能を解明するために、 r G— C S F連投後の脾臓の間質細胞に着目し、 間質細胞を介した r G - C S Fによる造血機能亢進の解析を試みるベく、 r G— C S Fを連投したマウス脾臓より造血間質細胞株 （C F— 1細胞） を樹 立し、 かかる造血間質細胞を用いてその造血支持能を検討したとこ ろ、 i n V i t r 0でのコロニー刺激活性および i n v i v o での造血幹細胞支持能が認められた 〔B】 o o d, 8 0, 1 9 1 4 ( 1 9 9 2) 〕 。
しかしながら、 この脾臓間質細胞については、 その一部が細胞株 (C F— 1細胞） として樹立されて、 その細胞学的特性の検討等は なされているものの、 これまでに、 その細胞表面抗原を認識する特 定の抗体を作製することは全く行われておらず、 ま してやその特性 等については未だ全く知られていない状況にあった。
そこで、 本発明者は、 脾臓間質細胞に閩する前記したような知見 とこれまでの研究成果を踏まえ、 この脾臓間質細胞を識別し得る特 定の抗体を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねる中で、 当該脾臓間質細胞株を感作抗原として使用してモノ クローナル抗体 を作製したところ、 これまでに報告された例のない新規モノ クロー ナル抗体が得られた。
そして、 この取得されたモノ クローナル抗体の特性について検討 したところ、 当該モノ クローナル抗体は、 驚くべきことに骨髄球様 細胞にアポトーシスを誘起する特性を有するものであることを見い 出し、 本発明を完成するに至った。 発明の開示
本発明は、 骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起させる特性を有し 、 骨髄性白血病の治療薬等として有用な新規モノ クローナル抗体お よびその断片を提供することを目的とするものであり、 更には、 当 該モノ クローナル抗体を産生させるハイプリ ドーマを提供すること を目的とするものである。
本発明のモノ クローナル抗体は、 骨髄球様細胞 （my e l o i d c e 1 1 ) のアポトーシス （a p o p t o s i s ) 〔核クロマチ ン DNAがヌク レオソーム単位で切断 （いわゆるラダー · フォーメ ーシヨ ン） され、 その結果、 細胞を死に至らしめる現象で、 钿胞自 滅とも云う〕 を引き起こす抗原等を特異的に認識する抗体として、 これらを識別、 同定する機能を有するものとして、 あるいは骨髄球 様細胞にアポト一シスを誘起させる機能を有するものとして極めて 有用なものである。 尚、 骨髄球様細胞には、 リ ンパ球以外の細胞、 例えば、 好中球、 巨核球、 骨髄芽球、 骨髄球、 肥満細胞、 マクロフ ァージ、 単球、 赤芽球が含まれるが、 本発明で云う骨髄球様細胞も これと同義のものを意味する。 従来、 一般に、 骨髄球様細胞にアポ トーシスを誘起する特性を有するモノ クローナル抗体は全く知られ ておらず、 従って、 本発明のモノ クローナル抗体は、 骨髄球様細胞 にアポト一シスを誘起する特性を有するすべてのモノ クローナル抗 体を包括するものとして定義される。
かかる本発明のモノ クローナル抗体は、 基本的には、 例えば、 次 のようにして作製することができる。
すなわち、 本発明のモノ クローナル抗体は、 例えば、 r G— C S F投与動物の脾臓間質細胞を感作抗原として使用して、 基本的には 、 これを通常の免疫法を応用して免疫し、 通常の細胞融合法を応用 して細胞融合させ、 通常のクローン化法を応用してクローン化する ことによって作製することができる。
本発明のモノ クローナル抗体の作製方法は、 より具体的には、 例 えば、 前記感作抗原として、 本発明者らによって培養細胞株として 樹立された r G— C S F投与マウスの脾臓間質細胞である C F一 1 細胞 〔 B l o o d, V o l . 8 0 , 1 9 1 4 ( 1 9 9 2) 〕 を使用 し、 当該感作抗原で免疫した哺乳動物の形質細胞 （免疫細胞） を、 マウス等の哺乳動物のミエローマ細胞と融合させ、 得られた融合細 胞 （ハイプリ ドーマ） をクローン化し、 その中から前記細胞株を認 識する本発明の抗体を産生するクローンを選別し、 これを培養して 目的とする抗体を回収する方法が好適なものとして例示される。 し かしながら、 本発明においては、 かかる方法はあく まで一例に過ぎ ず、 例えば、 この場合、 前記感作抗原としては、 前記 C F— 1細胞 に限らず、 C F— 1細胞の場合に準じて得られるヒ ト脾臓間質細胞 由来の細胞株を使用することも適宜可能であり、 前記 C F— 1細胞 の場合と同様にして目的とするヒ ト骨髄球様細胞と結合するモノ ク ローナル抗体を作製することができる。
このようなモノ クローナル抗体の作製方法において、 前記感作抗 原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが 、 細胞融合に使用する ミエローマ細胞との適合性などを考慮して選 択するのが好ましく、 一般的には、 マウス、 ラッ ト、 ハムスター等 が好適なものとして使用される。
次に、 免疫は、 一般的方法により、 例えば、 前記 C F - 1細胞等 の脾臓間質細胞を哺乳動物に腹腔内注射等により投与することによ り、 行われる。 より具体的には、 P B Sや生理食塩水等で適当量に 希釈、 懸濁したものを、 動物に 1 ヶ月毎に数回投与することが好ま しい。 免疫細胞としては、 前記細胞株の最終投与後に摘出した脾細 胞を使用するのが好ましい。
次に、 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物 のミエローマ細胞としては、 すでに公知の種々の細胞株、 例えば、 P 3 (P 3 X 6 3 A g 8. 6 5 3 ) C J. I mmu n o l . , 1 2 3, 1 5 4 8 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 ρ 3 - U l 〔 Cu r r e n t T o p i c s i n M i c r o - b i o l o g y a n d I m m u n o 1 o g y , 8 1 , 1 - 7 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 NS— 1 〔E u r . J. I mmu n o l . , 6 , 5 1 1 - 5 1 9 ( 1 9 7 6 ) 〕 、 MP C一 1 1 〔C e l l， 8 , 4 0 5 - 4 1 5 ( 1 9 7 6 ) 〕 、 S p 2 /Ό - A 1 4 (N a t u r e, 2 7 6, 2 6 9 - 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 F O 〔J. I mmu n o l . e t h. , 3 5, 1 - 2 1 ( 1 9 8 0 ) 〕 、 S 1 9 4 〔J. E x p. Me d. , 1 4 8， 3 1 3— 3 2 3 ( 1 9 7 8 ) 〕 、 および R 2 1 0 〔 N a t u r e, 2 7 7, 1 3 1 — 1 3 3 ( 1·9 7 9 ) 〕 等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には通常 の方法、 例えば、 ミルシュタインら （M i 1 s t e i n e t a 1. ) の方法 〔 Me t h o d s E n z y m o 1. , 7 3, 3 - 4 6 ( 1 9 8 1 ) 〕 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば、 融合促進剤の存在下 に通常の栄養培地中で実施される。 融合促進剤としては、 例えば、 ボリエチレングリ コール （P E G) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に、 所望により融合効率を高めるためにジメチル スルホキシ ド等の補助剤を適宜添加使用することもできる。 免疫紬 胞と ミエローマ細胞との使用割合は、 例えば、 ミエローマ細胞に対 して、 免疫細胞を 1〜 1 0倍程度とするのが好ましい。 また、 前記 細胞融合に用いる培地としては、 例えば、 前記ミエローマ細胞株の 増殖に好適な R PM I - 1 6 4 0培地、 MEM培地、 その他、 この 種の細胞培養に使用される通常の培地が使用可能であり、 更に、 牛 胎児血清 （F B S) 等の血清補液を併用することも可能である。 細胞融合は、 前記免疫細胞と ミエローマ細胞との所定量を前記培 地内でよく混合し、 予め 3 7て程度に加温した P E G溶液、 例えば 、 平均分子量し 0 0 0〜 6, 0 0 0程度の P E Gを、 通常、 培地 に約 3 0〜 6 0 % (W/V) の濃度で添加し、 混合することによつ て行われる。 続いて、 適当な培地を逐次添加し、 遠心して上清を除 去する操作を操り返すことにより目的とするハイプリ ドーマが形成 される。
当該ハイプリ ドーマは、 通常の選択培地、 例えば、 HAT培地 （ ヒポキサンチン、 アミ ノブテリ ンおよびチミ ジンを含む培地） で培 養することにより選択される。 当該 HAT培地による培養は、 目的 とするハイプリ ドーマ以外の紬胞 （未融合細胞） が死滅するのに充 分な時間、 通常、 数日〜数週間継铳する。 次いで、 通常の限界希釈 法に従って、 目的とする抗体を産生するハイプリ ドーマのスク リー ニングおよび単一クローン化が実施される。
このようにして作製される本発明のモノ クローナル抗体を産生す るハイプリ ドーマは、 通常の培地で継代培養することが可能であり 、 また、 液体窒素中で長期保存するこ とが可能である。
当該ハイプリ ドーマから本発明のモノクローナル抗体を採取する には、 当該ハイプリ ドーマを常法に従って培養し、 その培養上清か ら得る方法、 あるいはハイプリ ドーマをこれと適合性のある哺乳動 物に投与して増殖させその腹水から得る方法など適宜の方法が採用 される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適した方法であり 、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適した方法である。
更に、 前記した方法により得られる抗体は、 塩析法、 ゲル濾過法 、 ァフィ二ティークロマ トフラフィ一等の通常の精製手段を応用し て高純度に精製することができる。
本発明のモノ クローナル抗体は、 後記する実施例において具体的 に示す固有の特性、 すなゎぢ骨髄球様細胞にアポトーシスを誘起す る機能を有するものであれば、 如何なるものであってもよく、 当該 機能を有するものであれば、 感作抗原の種類を問わず本発明の範囲 に含まれるものであり、 本発明のモノ クローナル抗体は、 当該特性 を利用して、 骨髄性白血病の治療等の分野において有用な治療薬剤 等として使用し得るものである。
このような本発明のモノ クローナル抗体を利用して骨髄球様細胞 にアポトーシスを引き起こす抗原等を特異的に認識する抗体として 、 これらを識別、 同定するための、 あるいは、 当該モノ クローナル 抗体の固有の特性を利用して骨髄性白血病治療薬剤等として使用す るための具体的システムの構築、 その改変および応用等は、 当業者 にとつて自明の通常の方法を応用して実施されるものである限り、 いずれも本発明の範囲に含まれるものであることは云うまでもない 図面の簡単な説明
図 1 はィムノフルォレッセンスによる解析 （抗体非存在下の対照 , C F - 1細胞） を示す。
図 2はィムノフルォレツセンスによる G S P S T— 1抗体と C F 一 1細胞との結合性の解析を示す。
図 3はィムノフルォレツセンスによる BMA P— 1抗体と C F—
1細胞との結合性の解析を示す。
図 4はィムノフルォレツセンスによる解析 （抗体非存在下の対照 , 骨髄細胞） を示す。
図 5はィムノフルォレツセンスによる G S P S T— 1抗体と骨髄 細胞との結合性の解析を示す。
図 6はィムノフルォレツセンスによる BMA P— 1抗体と骨髄細 胞との結合性の解析を示す。
, 図 7はィムノフルォレツセンスによる解析 （抗体非存在下の対照 ) を示す。
図 8はィムノフルォレツセンスによる G S P S T— 1 と N F S— 6 0細胞との結合性を示す。
図 9はィムノ フルォレツセンスによる解析 （ラッ ト I g G 1 によ る対照） を示す。
図 1 0はィムノ フルォレツセンスによる BMA P— 1 と N F S— 6 0細胞との結合性を示す。
図 1 1 はモノ クローナル抗体の細胞増殖抑制試験 （BMA P— 1 ) を示す。
図 1 2はモノ クローナル抗体の骨髄移植阻害試験 （G S P S T— 1 ) を示す。
図 1 3はモノ クローナル抗体の骨髄移植阻害試験 （BMA P— 1 ) を示す。
図 1 4は本発明のモノ クローナル抗体の BMA P— 1投与 6 日後 の死滅した骨髄細胞 （ 2 ) 、 抗体非存在下の対照 （ 1 ) 、 を示す説 明図である 〔骨髄標本 （生物の形態） の顕微鏡写真 （H. E. 染色 )· ( X 4 0 0 ) 〕 を示す。
図 1 5は本発明のモノ クローナル抗体の BMAP— 1を投与した 場合にみられる骨髄細胞の DN Aのラダー ' フォーメーショ ンを示 す説明図である （電気泳動クロマ トグラフィーの泳動写真） を示す 図 1 6は TNFによる細胞障害試験を示す。
図 1 7はモノ クローナル抗体の細胞障害試験 （B MAP— 1 ) を 示す。
図 1 8はィムノ フルォレツセンスによる解析 （ラ ッ ト I g G 2 a による対照） を示す。
図 1 9はィムノ フルォレツセンスによる抗マウス MHC c 1 a s s I抗体と BWV 1細胞との結合性を示す。
図 2 0はィ厶ノフルォレツセンスによる解析 （ラッ ト I g G l に よる対照） を示す。
図 2 1 はィムノ フルォレツセンスによる BMAP— 1 と BWV 1 細胞との結合性を示す。
符号の説明
a BMA P— 1投与したマウス胸腺の DN A ( 2 4時間）
b BMA P— 1投与したマウス骨髄の DNA ( 2 4時間）
c BMA P— 1投与したマウス骨髄の DNA ( 8時間）
d BMA P— 1投与したマウス骨髄の DNA ( 4時間） ' e 無処理マウスの骨髄の DNA (骨髄細胞）
f 分子量マーカー 次に、 本発明を参考例および実施例に基づいて更に具体的に説明 するが、 本発明は当該実施例に限定されるものではない。 参考例
脾臓間質細胞株の樹立とその性質
1 ) 脾臓間質細胞株の樹立
r G— C S F連続投与による脾臓間質細胞株は、 r G— C S F 1 0 0 〃 g/k gを 5 日間投与した C 5 7 B L/ 6 Jマウスの脾臓細 胞の初代培養から樹立された。 すなわち、 r G— C S F投与後に無 菌条件下に脾臓を摘出し、 2 5 c m2 ブラスチック · フラスコ （ C 0 r n i n g社製） で 6週間培養し、 1 0 %非働化血清 （ F B S ) (三光純薬社製、 東京） 、 1 0 0 UZm 1 ぺニシリ ンぉよび 1 0 0 / gZm l ス ト レプトマイシンを添加した I s c o v eの改変 D u l b e c c o培地 ( I M D M) ( B o e h r i n g e r -M a n n h e i m社製） で 3 7で、 5 % C 02 のィンキュベー夕内で培養し 、 週 2回新鮮培地に交換した。
コンフルェン ト培養から 0. 0 5 % ト リプシン + 0. 0 2 % Ε Ώ TA ( S i gm a C h e m i c a l社製） 、 C a— Mg - ： f r e e P B Sを用いて付着性細胞集団 （間質細胞） を分取して別なフ ラスコに移した。 この継代培養を週に約 1〜 2回繰り返した。 初期 の継代培養 （ 1 〜 1 0回目） での細胞の s p l i t r a t i 0は 1 Z 4〜 1ノ 8であったが、 その後の比率は 1 1 6〜 1 Z 3 2 と した。 約 1 0回目の継代培養後に間質細胞は均質な線維芽細胞様と なった。 2 0回目の継代時に上述の方法で間質細胞を採集し、 限界 希釈法を用いて細胞のクローニングを 2回操返して間質細胞株 （ C F一 1細胞株） を樹立した。
次いで、 これらの細胞を 1 0 %非働化 F B Sを加えた I MDM 5 m l を入れた 2 5 c m2 フラスコ （C o r n i n g社製） 内で維持 培養し、 5 日毎に s p l i t r a t i o 1 / 3 2で継代培養し た。 尚、 他の哺乳動物についても、 その脾臓間質細胞株を樹立する ことができ、 例えば、 ヒ トの場合には、 細胞を S V— 4 0アデノウ ィ ルスべクターで形質転換すれば前述と同様の方法でヒ ト脾臓間質 細胞株を樹立することが可能である 〔J. C e l l . P h y s i o 1. , 1 4 8, 2 4 5 ( 1 9 9 1 ) 〕 0
2 ) C F - 1細胞の特性
前記の如く して細胞株として樹立された C F— 1細胞については 、 標準的な細胞化学的手法を用いてアル力リ ' ホスファターゼ、 酸 性ホスファターゼ、 ；3—グルクロニダーゼ、 な一ナフチルァセティ トエステラーゼおよびオイル · レツ ド 0を検索すると共に下記のモ ノ クローナルおよびボリ クローナル抗体を用いて免疫酵素組織化学 検索によりその特性を検討した ： Ma c I (S e r o T e c . 社 製） 、 第 V I I I関連抗原 （D a k 0 p a t t s社製） 、 I型コラ 一ゲン、 I I I型コラーゲンおよびフイブロネクチン （C h em i c o n I n t e r n a t i o n a 1社製） 、 貪食能はラテックス • ビーズ （粒子径 ： 1. 0 9〃m, S i gm a) を用い、 また、 脂 肪細胞への分化能は、 2 5 cm2 フラスコでコンフルェン ト培養後 1 0 -6m 0 1 / 1の燐酸ハイ ドロコルチゾン （S i gma社製） を 添加し、 4週間の培養で検討した。
その結果、 C F— 1細胞は、 アルカ リ · ホスファターゼ、 第 V I I I因子関連抗原、 M a c Iおよび貧食能は陰性であつたが、 I型 コラーゲン、 I I I型コラーゲンおよびフイブロネクチンは陽性で あった。 C F— 1細胞は、 微かにリ ピッ ドを含むが、 1 0 _emo l / 1のハイ ドロコルチゾン存在下の 4週間のコンフルェン ト培養に よっても脂肪細胞には分化しなかった。 これらのデータから、 C F 一 1細胞は、 前脂肪細胞、 マクロファージおよび血管内皮細胞の特 徵を備えていないと云えることから、 これらとは異なる間質細胞由 来であることが明らかとなった。
3) C F— 1細胞による造血幹細胞の維持
造血幹細胞が C F一 1細胞によって維持されるか否かを検討する ため、 T i 1 l &Mc C u l 1 o c hの方法による C F.U— S a s s a y (脾コロニー形成法） を行なった。 マウス 1 0匹 群に 9 0 0 c G yを照射 （MB R— 1 5 2 0 R, H i t a c h i社製， 東 京） した後、 骨髄単核細胞 （ BM細胞） （ 1 . 0 X 1 0 5 Zh e a d、 5. 0 X 1 0 4 h e a dまたは 2 . 5 x 1 0 4 /h e a d ) および C F— 1細胞 （ 1 . 0 x 1 0 5 Zh e a d ) を静注し、 1 2 日目に脾臓内のコロニー数を算えて C F U— S (脾臓コロニー） と した。
その結果、 骨髄単核細胞 （ BM細胞） と C F - 1細胞とを放射線 照射したマウスに同時に移植すると、 いずれの BM細胞群について も脾コロニー数は、 C F— 1細胞を移植しなかったマウスに比し有 意に増加し （ 1 . 4〜 1 . 8倍） 、 また、 BM細胞と C F— 1細胞 とを同時に移植したマウスの移植後 1 2 日目の生存率は、 BM細胞 を単独移植したマウスよりも高く、 死亡率が低下することから、 造 血幹細胞が C F一 1細胞によって維持されることが明らかとなつた
発明を実施するための最良の形態
以下に本発明の実施例について具体的に記載する。 実施例
モノ クローナル抗体の作製
1 ) 感作抗原と免疫法
感作抗原として、 前述の参考例で取得した C F— 1細胞を用いて 抗原感作を行った。 細胞株は、 1 0 %牛胎児血清 （F B S、 三光純 薬社製） 、 I s c 0 V e改変 D u 1 b e c c 0培地 （ I MDM) ( B o e h r i n g e r -M a n n h e i m社製） を培地として使用 し、 5 % 02 ィンキュべーター中で 3 7での温度条件下で継代培 ¾■ ίΓΓつ τこ。
紬胞は、 l mME DTA、 P B S処理後、 柽ぃピベッティ ングに よって培養フラスコより回収した。 この細胞を約 1 X 1 0 7 個 m 1 の細胞数で I mME DTA · P B Sに懸濁し、 浮遊さ 、 W i s t a r I m a m i c h系ラッ ト （ 7週令、 罕、 動物繁殖研究所） に免疫した。 初回免疫には、 約 1 X 1 07 個 Zm 1 の細胞 1 m 1 を ラッ ト腹腔内に注射し、 1 ヶ月後に l x l O 7 個 Zm lの細胞 1 m 1 を追加免疫した。 更に、 1 ヶ月間隔にて 1 X 1 07 個 Zm 1 の細 胞 1 m 1 を数回追加免疫し、 免疫されたラッ ト抗体と C F— 1細胞 との反応性を確認後、 最終免疫として、 1 X 1 08 個 Zm 1 の細胞 1 m 1 を免疫した。 最終免疫 3 日後にラッ トを屠殺して脾臓を摘出 した。
2 ) 細胞融合
1 匹のラッ トから摘出した脾臓を細切後、 遊離した脾細胞を遠沈 した後、 I MDM培地 （ B o e h r i n g e r - a n n h e i m 社製） 中に懸濁し、 浮遊させ、 充分に洗浄を行った。 一方、 マウス • ミエローマ細胞株 S p 2 0 - A g 1 4 CN a t u r e , 2 7 6 , 2 6 9 - 2 7 0 ( 1 9 7 8 ) 〕 を、 1 0 %牛胎児血清 （F B S、 三光純薬社製） を含有する I MDM (B o e h r i n g e r - M a n n h e i m社製） 培地にて培養して得た細胞を、 同様に前記 I M DM培地で洗浄後、 その 1 X 1 0 8 個と、 前記脾細胞 2 X 1 0 8 個 とを遠心管に入れ混合し、 ポリエチレングリ コール 4 0 0 0 (半井 化学社製） によって常法 〔C l i n . E x p . I mm u n o l . , 4 2 , 4 5 8 - 4 6 2 ( 1 9 8 0 ) 〕 に従い細胞融合させた。
次いで、 得られた融合細胞を、 2 0 %F B Sを含む I MDM培地 にて 9 6個のゥエルプレー トに分注し、 5 % C 02 インキュベータ 一中で 3 7でで培養した。 翌日より HAT選択培地に徐々に置換さ せて培養を続けた。
培養開始後、 上清を週 2回の頻度に、 それぞれ新しい HAT培地 に代え、 培養を継続し、 増殖維持させた。
次に、 このようにして得られた融合細胞を常法により限界希釈法 を用いてクローニングした。 すなわち、 前記融合細胞の培養上清中 の抗体を利用して、 感作抗原との結合性を調べ、 感作抗原と強い結 合性を有するクローンだけを常法により限界希釈法を用いてクロー エングした。
3 ) スク リーニング
融合細胞 （ハイプリ ドーマ） のスク リーニングは、 フローサイ ト メ ト リー （F l ow C y t om e t r y) を使った間接蛍光抗体 法により行った。
目的の抗体を産生するクローンのスク リーニングは、 ターゲッ ト 細胞として、 C F— 1細胞を用いて行った。 すなわち、 反応バッフ ァー 〔2 %F B S, 0. 0 2 %N a N3 を含む P B S〕 に懸濁した 細胞を遠心し、 ペレッ トとして回収した後、 ハイプリ ドーマ培養上 清 1 0 0〃 1中に浮遊させ （約 1 X 1 06 個 Z 1 0 0 1 ) 、 4 °C にて 1時間反応させた。 前記バッファーにより 1回洗浄した後、 F I TC標識ャギ抗ラッ ト I g G (F C) 抗体 （C h em i c o n 社製） を加えて 1時間インキュベーショ ンした。 1回洗浄した後、 フローサイ トメ ト リー （F l '0w C y t om e t r y) (FAC S c a n, べク トン · デッキンソン社製） にて解析した。
4 ) 抗体の精製
前記 3 ) でスク リーニングした融合細胞を常法に従って培養し、 培養上清中に産生される抗体を常法により^:離し、 精製した。
すなわち、 各ゥエルのうち前記感作抗原に対する抗体価の高かつ たゥエルからハイプリ ドーマを採取し、 組織培養ブラスチッ クディ ッシュ （ C 0 r n i n g社製） に広げて 5 % C 02 中で 3 7 eCにて 継代培養を行い、 増殖させ、 常法により精製することにより、 モノ クローナル抗体 G S P S T— 1、 BMA P— 1を得た。
G S P S T— 1 については、 得られた細胞をプリス夕ン投与を施 行した BAL BZc A J c 1 — n u系ヌー ドマウス （ 8週合， 日本ク レア社製） に腹腔内注入した。 1 0〜 1 4日後、 産生された 腹水を採取し、 3 3 %硫酸ァンモニゥムで塩析し P B Sで透析した 。 また、 BMAP— 1抗体については、 1 0 %F B Sを含む I s c 0 V e mo d i f i e d M E M培地にて、 大量培養し、 培養上 清を濃縮後、 3 3 %硫酸アンモニゥムで塩折し、 P B Sで透析後、 プロテイン Aカラムキッ ト （アマシャム社製） により再度精製し、 P B Sにより透析を行った。 尚、 上記の実施例においては、 感作抗 原として、 前記 C F— 1細胞を使用した場合について例示したが、 他の造血幹細胞支持能を有する間質細胞を使用した場合にも同様に してモノ クローナル抗体を作製することが可能であり、 本発明は、 前記モノ クローナル抗体に限らず、 それと同様の特性を有するすべ てのモノ クローナル抗体、 および当該モノ クローナル抗体を産生す るすべてのハイプリ ドーマを包含するものである。
本発明のモノ クローナル抗体の BMA P— 1を産生するハイプリ ドーマは、 W i s t a r I m am i c h系ラッ ト脾細胞とマウス • ミエローマ細胞株 S P 2Z0— A g l 4を親細胞として作製され た新規な融合細胞であり、 特許手続上の微生物の寄託の国際的承認 に関するブダペス ト条約に基づく国際寄託当局である工業技術院生 命工学工業技術研究所 〔あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1丁目 1 番 3号 （郵便番号 3 0 5 ) 〕 に 1 9 9 3年 8月 9 日付で、 BMA P 一 1 (ラッ ト マウス ハイプリ ドーマ） ， 受託番号 F E RM B P— 4 3 8 2として国際寄託されている。
5 ) 抗体の性質
①抗体の反応性
(C F— 1細胞に対する反応性）
上記のようにして得られたモノ クローナル抗体 G S P ST— 1、 BMA P— 1 の C F - 1細胞に対する反応性について免疫蛍光分析 ( I mmu n o f l u o r e s c e n c e a n a l y s i s ) に より検討した結果を図 1〜図 3に示す。 ここで、 図 1 は、 抗体非存 在下のコン トロール、 図 2は、 G S P S T— 1 と C F— 1細胞との 結合性、 図 3は、 BMA P— 1 と C F— 1細胞との結合性、 の解析 果を示す。 尚、 図中、 縦軸は相対細胞数を、 横軸は蛍光強度を、 示す。
図 1〜図 3から明らかなとおり、 モノ クローナル抗体 G S P S T 一 1、 .BMAP— 1は C F— 1細胞に対して結合性を有しており、 C F - 1細胞の表面抗原を認識するものであることが分った。
(骨髄細胞に対する反応性）
次に、 G S P ST— 1、 BMA P— 1の正常の骨髄細胞に対する 反応性をフローサイ トメ ト リー （ F 1 0 w C t om e t r y) (FAC S c a n, べク トン · デッキンソン社製） により検討した 結果を図 4〜図 6に示す。 ここで、 図 4は、 抗体非存在下のコン ト ロール、 図 5は、 G S P ST— 1 と骨髄細胞との結合性、 図 6は、 BMA P - 1 と骨髄細胞との結合性、 の解析結果を示す。 尚、 図中 、 縦軸は相対細胞数を、 横軸は蛍光強度を、 示す。
図 4〜図 6に示すように、 G S P ST— 1 は、 骨髄細胞とは全く 結合せず、 BMAP— 1 は、 すべての骨髄細胞と結合することが明 らかとなつた。
(骨髄性白血病細胞株 （NF S— 6 0 ) に対する反応性）
G S P S T— 1および BMAP— 1の NF S— 6 0細胞 〔P r o c . N a t l . A c a d. S c i . USA, 8 2, 6 6 8 7 - 6 6 9 1 ( 1 9 8 5 ) 〕 に対する反応性をフローサイ トメ ト リー （ F 1 0 w C y t om e t r y) (FAC S c a n, べク トン ， デッキ ンソン社製） により検討した結果を図 7〜図 1 0に示す。 ここで、 図 7は、 抗体非存在下のコン トロール、 図 8は、 GS P ST— 1 と NF S - 6 0細胞との結合性、 図 9は、 市販のラッ ト I g G 1 (Z ym e d社製） を用いたコン トロール、 図 1 0は、 BMAP— 1 と NF S— 6 0細胞との結合性の解析結果を示す。 尚、 図中、 縦軸は 相対細胞数を、 横軸は蛍光強度を、 示す。
図 7〜図 1 0に示すように、 G S P S T— 1 は、 NF S— 6 0紬 胞とは反応せず、 BMAP— 1 は、 NF S— 6 0細胞と結合するこ とが明らかとなった。
(BMAP - 1の NF S - 6 0細胞に対する細胞増殖抑制試験）
BMAP— 1の NF S— 6 0細胞に対する作用を、 G— C S F 1 0 0 n gZm 1およびサイクロへキジミ ド 1 0 _9M存在下にて、 M TTアツセィ法により検討した結果を図 1 1に示す。 9 6穴の培養 プレー トを用い、 NF S— 6 0細胞を 4 X 1 03 Zw e 1 1 Z 1 0 0 1 に対し、 BMA P— 1は 0 , 1 0, l O O n gZm l , 1 , 1 0, 1 0 O z gZm l濃度のものをそれぞれ 1 0〃 1 /w e 1 1 添加し、 その 2日後に、 MTT法により生細胞数を測定した。 その 結果、 図 1 1 に示すように、 N F S— 6 0細胞は B M A P— 1 によ り著しく増殖が抑制されていることが明らかとなった。
②抗体のタイビング
次に、 得られたモノ クローナル抗体の I g Gのサブクラスをタイ ビングしたところ 〔ラッ ト Mo n o Ab— I D * S pキッ ト （Z y m e d社製） 、 およびビォチン標識マウス抗ラッ ト I g G 1抗体 (Z ym e d社製） を使用〕 、 G S P ST— 1 は I g G 2 a、 BM A P— 1 は I g G 1であることが明らかとなった。
③骨髄移植阻害作用
次に、 これらの抗体を用いて骨髄移植阻害実試験を行い、 その特 性について検討した。 その結果を図 1 2〜図 1 3に示す。 図 1 2〜 図 1 3に示されるように、 BMAP— 1 は、 骨髄移植阻害効果を有 するが、 G S P S T— 1には、 その効果は認められなかった。 すな わち、 致死量の放射線照射 （ 9 0 0 c G y) をした C 5 7 B LZ 6 Jマウスに、 に 0 X 1 05 Zh e a dの骨髄細胞およびモノ クロ ーナル抗体を、 尾静脈より投与し、 脾臓コロニーの形成を観察した ところ、 上記の結果を得た。 尚、 図 1 3の N o n— t r e a t e d は、 これらを投与しなかった場合を示す。
図 1 3に示されるように、 B M A P— 1が、 骨髄移植阻害試験に おいて、 移植を完全に抑制するのは、 このモノ クローナル抗体が、 骨髄細胞に反応しアポトーシスを引き起こすことに因るものである ことが確認された。 すなわち、 BMAP— 1産生のハイプリ ドーマ をヌー ドマウスに腹腔内投与すると腹水がわずかに貯留する時期に マウスは死亡した。 また、 正常の C 5 7 B LZ6 Jマウスに、 5 0 igZh e a dの BMAP— 1を静脈内投与することにより骨髄細 胞がすべて死滅することが判明し、 図 1 4に BMAP— 1静脈内投 与 6 日後の骨髄細胞が死滅したことを裏付ける顕微鏡写真を示した 。 この顕微鏡写真から明らかなように、 リ ンパ球ばかりでなく、 好 中球、 巨核球、 骨髄芽球、 骨髄球、 肥満細胞、 マクロファージ、 単 球、 赤芽球等 （いわゆる骨髄球様細胞） が死滅していることが確認 された。 また、 3 0〃 gZh e a dの BMA P— 1 を投与したマウ スの骨髄細胞の DNAを検討したところ、 図 1 5に示すように、 明 らかにラダー · フォーメーショ ンが認められ、 B M A P— 1の骨髄 細胞に対する前記反応は、 アポトーシスに因るものであることが確 認された。
なお、 BMAP— 1抗体について、 その I g Gの F c領域をぺプ シン （S i gm a社製） により切断し、 F ( a b ' ) 2 として G P Cカラムにより精製した後、 〇 5
Figure imgf000019_0001
マゥスにその 3 3. 5 / g/h e a d (完全な I g Gの 5 Ο gZh e a dに相当する 量） を静脈内投与した結果、 骨髄において、 '骨髄細胞が死滅するこ とが認められた。 このことにより、 B M A P— 1 による骨髄細胞の 死滅には、 抗体依存性細胞障害および補体依存性細胞障害は関与し ていないことが明らかとなった。
ところで、 アポトーシスを引き起こす抗原としては、 細胞表面蛋 白質の F a s抗原が既に報告されているが、 この F a s抗原は、 胸 腺、 心臓、 肝臓、 肺、 卵巣などで mRNAの発現が認められている が、 骨髄ではその mRNAがほとんど検出されないことから 〔J. I mmu n o l . . 1 4 8 , 1 2 7 4 - 1 2 7 9 ( 1 9 9 2 ) 〕 、 BMAP - 1が認識する抗原は、 従来知られている F a s抗原とは 異なるものであることは明らかである。
さらに、 BMA P— 1が認識する抗原が、 TN Fレセブターか否 かを明らかにするため、 TN Fに反応し細胞死を起こす L一 9 2 9 細胞を用い、 BMA P— 1 の作用を検討した。 マウス TN F a ( G e n z ym e社製） の最終濃度は、 0 , 1 , 1 0， l O O p gZm 1 , 1 , 1 0 , 1 0 0 n /m 1 , l 〃 gZm l とし、 BMA P— 1 の最終濃度は、 0 , 1 0 , l O O p gZm し 1 , 1 0 , 1 0 0 n g/m 1 , 1 , 1 0 〃 gZm 1 とし、 TN Fひおよび ΒΜΑ Ρ— 1添加後 2 日目に、 L一 9 2 9細胞の生細胞数を ΜΤ Τ法により測 定した。 その結果、 図 1 6、 1 7に示すように、 TN F ひにより L 一 9 2 9細胞は著明に減少するのに対し、 BMA P— HiL— 9 2 9細胞に対し作用を及ぼさなかった。 従って、 B MA P— 1 が認識 する抗原は TN Fレセブターでないことが明らかとなった。
BMA P - 1 が認識する抗原が、 MH C c 1 a s s I抗原である か否かをフローサイ トメ ト リー （ F 1 o w C y t o m e t r y ) (F A C S c a n, べク トン ' デッキンソン社製） により検討した 結果を図 1 8〜図 2 1 に示す。 ここで、 図 1 8は、 市販のラッ ト I g G 2 a (Z y m e d社製） を用いたコン トロール、 図 1 9は、 抗 マウス MH C c 1 a s s I抗体 （ラ ッ ト I g G 2 a , B MA社製） と BWV 1細胞 （ BW 5 1 4 7細胞由来のマウスリ ンパ腫） との結 合性、 図 2 0は、 市販のラッ ト I g G l ( Z y m e d社製） を用い たコン トロール、 図 2 1 は、 BMA P - 1 と BWV 1細胞との結合 性の解析結果を示す。 尚、 図中、 縦軸は相対細胞数を、 横軸は蛍光 強度を、 示す。 その結果、 B MA P— 1 は BWV 1細胞を認識しな いが、 MH C c 1 a s s I抗体は、 BWV 1細胞と反応した。
以上のように、 B MA P— 1 は、 骨髄球様細胞にアポトーシスを 引き起こす作用を有するものであることが実験的に確認されたが、 本発明者の知るところによれば、 前述の如く、 従来、 骨髄球様細胞 にアポトーシスを誘起するモノ クローナル抗体について報告された 例はなく、 かかる作用を有するモノ クローナル抗体は、 .本発明者が 見い出した新規なものである。 そして、 この B M A P— 1 に代表さ れる本発明のモノ クローナル抗体の骨髄細胞に対するアポトーシス 作用を利用することにより、 当該モノ クローナル抗体は、 その抗原 の発現が高いと考えられる骨髄性白血病細胞を死滅させることが可 能であると考えられることから、 本発明の骨髄球様細胞にアポト一 シスを誘起するモノ クローナル抗体は、 骨髄性白血病治療薬等とし て有用なものである。
以上、 本発明のモノ クローナル抗体について実施例を示して具体 的に説明したが、 本発明で云う ところの骨髄球様細胞にアポトーシ スを誘起するモノ クローナル抗体は、 前記具体例として例示したも のが代表的なものとしてあげられるものの、 必ずしもこれに限定さ れるものではなく、 感作抗原の種類を問わず同様に作製された同様 の特性および機能を有するすべてのモノ クローナル抗体を包含する ものであることは云うまでもない。 産業上の利用可能性
本発明のモノ クローナル抗体は、 骨髄球様細胞にアポトーシスを 引き起こす抗原等を特異的に認識する抗体として、 これらを識別、 同定するのに有用であると共に、 骨髄球様細胞にアポトーシスを引 き起こす作用を有することから、 当該特性を利用して、 骨髄性白血 病の治療等の分野において有用な治療薬剤等として使用し得るもの である。

Claims

請求の範囲
1. 骨髄球様細胞と結合し、 骨髄球様細胞にアポトーシス （a p o p t o s i s ) を誘起するモノ クローナル抗体。
2. 骨髄球様細胞と結合し、 骨髄球様細胞にアポトーシス （a p o p t o s i s ) を誘起するモノ クローナル抗体断片。
3. 請求項 1記載のモノ クローナル抗体を産生するハイブリ ドーマ
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