WO1995005177A1 - Remede contre les maladies nerveuses - Google Patents

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WO1995005177A1
WO1995005177A1 PCT/JP1994/001342 JP9401342W WO9505177A1 WO 1995005177 A1 WO1995005177 A1 WO 1995005177A1 JP 9401342 W JP9401342 W JP 9401342W WO 9505177 A1 WO9505177 A1 WO 9505177A1
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neurological disease
phenyl
pdmp
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PCT/JP1994/001342
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Jinichi Inokuchi
Yoichiro Kuroda
Kazuyo Muramoto
Haruki Yamada
Seigou Usuki
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Seikagaku Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for a neurological disease, comprising a glycosphingolipid biosynthesis promoting substance as an active ingredient.
  • Glycosphingolipid (hereinafter referred to as GSL) is present as a component of the cell surface membrane of mammalian cells, and it functions through the receptor function of biologically active substances, the mutual recognition function between cells, and the interaction between cells. It is known to be closely related to cell functions such as development, proliferation, differentiation, carcinogenesis and immune response.
  • ganglioside is a GSL containing sialic acid, which is said to have activity in the recovery of peripheral nerve damage and central nervous system disorders, that is, the promotion of nerve regeneration and the process of nerve transmission.
  • the efficacy of exogenous gangliosides has been studied. Already been which the phrase in Lee data re A as a utilizing drug B Nashiaru (Cronassial R) drug market, related patent applications have been made (JP 52- No. 34912). However, due to administration of this drug, that is, exogenous ganglioside, anti-ganglioside antibodies have appeared and clinical cases showing various neurological symptoms have been observed.
  • amyotrophic law sclerosis in which anti-GM2 antibody appears (Lancet, 337, 1109-1110, 1991)
  • ⁇ ⁇ Giran in which anti-GM1 antibody appears ⁇ Bale syndrome (Lancet, 338, 757, 1991) Have been reported.
  • gangliosides are added to the experimental system from outside, but in that case, the relationship with endogenous gangliosides becomes a problem.
  • endogenous gangliosides present in cell membranes have already formed complexes with various cell surface receptors and the like, the results derived by the addition of gangliosides are derived from the true nature of endogenous gangliosides. It may not always reflect the cell physiological significance of this. Therefore, in order to understand the original role of gangliosides in cell physiology, a method was needed to specifically alter the endogenous GSL biosynthesis.
  • the present inventors first synthesized an analog of ceramide, 111-Fe2-ru- 2-decanoylamino-3-morpholino-l-propanol (PDMP), and D-treo PDMP produced glucosyl ceramide. It has been demonstrated that it specifically inhibits synthase and significantly reduces the intracellular content of all GSLs starting from glucosylceramide (Lipid. Res., Vol. 28, 565-571, 1987). In addition, it has been reported that D-True PDMP reduces the GSL content, which suppresses neurite outgrowth (Biochem., 110, 96-103, 1991).
  • L-Treaux PDMP the optical antipode of D-Treo PDMP
  • D-Treo PDMP may promote GSL biosynthesis (J. Cell. Physiol. , 141, 573-583 (1989)) 0
  • L-Threor PDMP increases the level of endogenous gangliosides in neurons, and the increase in endogenous gangliosides activates neuronal functions
  • An object of the present invention is to provide a therapeutic agent for various diseases caused by disorders of the central nervous system and peripheral nervous system using an agent that promotes the biosynthesis of endogenous GSL of nerve cells, particularly ganglioside. .
  • the present inventors have conducted various studies to develop a therapeutic agent for neurological diseases based on a new mechanism.
  • a specific 2-acylaminopropanol derivative promotes GSL biosynthesis, and promotes neurite outgrowth and synapse formation. It has been found that it accelerates remarkably and arrived at the present invention.
  • R 1 represents a phenyl group or a cyclohexyl group which may be substituted with the same or different 1 to 3 substituents selected from the group consisting of alkyl, alkoxy, hydroxy and nitro, Or an alkyl group, and n represents an integer of 0 to 16.] or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the compound of the present invention as a therapeutic agent for a neurological disease caused by a disorder of the peripheral nervous system or the central nervous system.
  • the present invention provides a biosynthesis, a neurite outgrowth, and a Z or synapse formation promotion of sphingolipids of a 2-acylaminobutanol derivative represented by the above general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Effective doses due to peripheral or central nervous system disorders The present invention relates to a method for treating a neurological disease, which comprises administering to a mammal suffering from a neurological disease.
  • the present invention provides a 2-acylaminopropanol derivative represented by the above general formula (I) or a pharmaceutical composition for producing a therapeutic agent for a neurological disease caused by a peripheral nervous system or central nervous system disorder. Or a salt thereof, or a pharmaceutical composition containing them.
  • the present invention relates to a liposomal pharmaceutical composition
  • a liposomal pharmaceutical composition comprising at least a 2-acylaminopropanol derivative represented by the above general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a phospholipid.
  • alkyl or alkoxy as a substituent of the fuunyl group or cyclohexyl group of R 1 preferably has 1 to 4 carbon atoms.
  • the alkyl group of R 1 preferably has 6 to 15 carbon atoms, most preferably 10 to 15 carbon atoms.
  • Examples of the alkyl group include hexyl, heptyl, octyl, nonyl, decyl, pendecyl, dodecyl (lauryl), tridecyl, tetradecyl (myristril), and pentadecyl.
  • n is an integer from 0 to 16 and preferably an integer from 4 to 16, with 6 to I 2 being most preferred.
  • n-phenyl-2-fluoroamino-2-morpholino-11-propanol in which n is 6 to 12, and most preferred is n-phenyl.
  • It is 2-propane 2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol (hereinafter referred to as PDMP).
  • PDMP 2-propane 2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol
  • the compound of the present invention has stereoisomers, and any of the stereoisomers can be used, and a mixture of isomers such as a racemic mixture can be used. Compounds can also be used.
  • the L-threo form (1S, 2S) is preferred because it has a glycolipid biosynthesis promoting effect.
  • the compound represented by the above formula (I) is a known substance (U.S. Pat. No. 5,041,441, Japanese Patent Application Laid-Open No. H11-254623), for example, J. Lipid. Res. , 28, 565-571, (1987) and J. Biochem., 111, 191-196 (1992).
  • the resulting mixture of the four isomers can be fractionated and crystallized with Kuguchiguchi form Z ether to obtain the DL-treo form and the DL-erythro form, respectively. Further, the DL-treo form can be crystallized as a salt of dibenzoyl-D-tartaric acid or dibenzoyl-L-tartaric acid to obtain a D-threo form or an L-threo form, respectively.
  • Examples of the pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by the above formula (I) include inorganic acid salts such as hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, and formic acid; Salts of organic acids such as acid, lactic acid, lingic acid, oxalic acid, maleic acid, fumaric acid, succinic acid, trifluoroacetic acid, methanesulfonic acid and P-toluenesulfonic acid can be mentioned.
  • a human suffering from a neurological disease caused by a disorder of the peripheral nervous system or the central nervous system comprising an effective amount of a 2-acylaminopropanol derivative represented by the general formula (I) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Typical diseases include, for example, stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, cerebral trauma, memory impairment, senile dementia, Alzheimer's disease and Parkinson's disease, etc.
  • Central nervous system diseases; and various peripheral nervous system diseases such as metabolic disorder polyneuropathy, mechanical neuropathy, and toxic neuropathy.
  • the compound of the present invention can be made into a formulation for oral or parenteral administration together with a carrier, excipient, diluent, and other additives.
  • a carrier excipient, diluent, and other additives.
  • the compound of the present invention can cross the blood-brain barrier ( ⁇ Lipid Res., 32, 713-722 (1991)), it is expected to be effective as an injection or oral preparation for neurological diseases of the brain. I can do it.
  • ribosome preparations or lipid emulsion preparations, such as ultrafine lipid particles (lipid nanospheres) carrying the compound of the present invention, pass through the blood-brain barrier about 10 times as much as physiological saline solution. It is effective when the agent of the present invention is used for treating neurological diseases of the brain.
  • oral preparations include solid preparations such as powders, granules, capsules, and tablets; and liquid preparations such as syrups, elixirs, and emulsions. it can.
  • Powders can be obtained by mixing with excipients such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, calcium hydrogen phosphate, magnesium aluminate metasilicate, and caffeic anhydride.
  • the granules may contain, in addition to the above-mentioned excipients, a binder such as sucrose, hydroxypropylcellulose and polybutylpyrrolidone, and a disintegrant such as carboxymethylcellulose and calcium carboxymethylcellulose, if necessary. It can be obtained by wet or dry granulation. Tablets can be obtained by compression of the powder or granules as they are, or by adding a lubricant such as magnesium stearate or talc.
  • excipients such as lactose, starch, crystalline cellulose, calcium lactate, calcium hydrogen phosphate, magnesium aluminate metasilicate, and caffeic anhydride.
  • the granules may contain, in addition to the above-menti
  • the tablets or granules are coated with an enteric base such as hydroxypropyl methylcellulose phthalate, methyl methacrylate copolymer or the like, or coated with ethylcellulose, carnauba wax, hardened oil and the like. It can be an enteric or sustained release formulation.
  • Hard capsules can be obtained by filling the above powders or granules into hard capsules.
  • Soft capsules can be obtained by dissolving the compound of the present invention in glycerin, polyethylene glycol, sesame oil, olive oil and the like, and coating this with a gelatin film.
  • a syrup can be obtained by dissolving a sweetener such as sucrose, sorbitol, or glycerin and a compound represented by the above general formula or a salt thereof in water.
  • a sweetener such as sucrose, sorbitol, or glycerin
  • An elixir may be prepared by adding an essential oil, ethanol, etc., in addition to the sweetener and water, or an emulsion or suspension may be prepared by adding arabiagom, tragacanth, polysorbate 80, carboxymethylcellulose sodium, etc. It can also be a turbidity agent. Flavoring agents, coloring agents, preservatives, etc. may be added to these liquid preparations as necessary. Can be obtained.
  • Parenteral preparations include injections, rectal administration, pessaries, dermatological preparations, inhalants, aerosols, eye drops and the like.
  • Injectable preparations include the compound of the present invention, a pH adjuster such as hydrochloric acid, sodium hydroxide, lactic acid, sodium lactate, sodium monohydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sodium chloride, glucose, etc. And a distilled water for injection, sterile-filtered, and filled in an ampoule or the like. Further, mannitol, dextrin, cyclodextrin, gelatin and the like are added, and the mixture is freeze-dried in a vacuum to obtain a ready-to-use injection. Further, an emulsifier such as lecithin, polysorbate 80, or polyoxyethylene hydrogenated castor oil may be added to the compound of the present invention, followed by emulsification in water to form an emulsion for injection.
  • a pH adjuster such as hydrochloric acid,
  • Injectable preparations include ribosome preparations that can improve solubility and transfer rate to target organs.
  • nanosphere liposomes can increase blood levels without being taken up by the reticuloendothelial tissues, lowering the minimum effective dose required for onset of the drug, Since it easily passes through the blood-brain barrier, it is suitable for use in treating neurological diseases of the brain.
  • Ribosome preparations can be prepared by a known liposome preparation method (CG Knight, Liposomes: From Physical Structure to Therapeutic Applications, pp.51-82, Elsevier, Amsterdam, 1981; Pro Natl. Acad. Sci., USA, 75, 4194, 1978). )).
  • ampholipids egg yolk lecithin, soy lecithin, sphingomyelin, e
  • Phosphatidylserine phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol, diphosphatidylglycerol, phosphatidylethanolamine, sphingomyelin, cardiolipin, etc.
  • synthetic phospholipids disearoylphosphatidylcholine, dipalmitylphosphatidylcholamine, etc.
  • cholesterol cholesterol, ergosterol, phytosterol, cytostellol, stigmasterol, etc.
  • ribosomes should be negatively charged to improve membrane stability, fluidity, and drug permeability.
  • Substances phosphatidic acid, dicetyl phosphate, etc.), substances known to impart a positive charge (stearilamine, stearylamine acetate), antioxidants (tocofunirole, etc.), oily substances ( Various known additives such as soybean oil, cottonseed oil, sesame oil, and liver oil may be used.
  • Ribosome production can be performed, for example, by the following method.
  • the above-mentioned amphiphilic substance and additive and the compound of the present invention are dissolved in an organic solvent (single or mixed solvent such as chloroform, dichloromethane, ethanol, methanol, hexane or the like), and the both solutions are mixed, and the mixture is mixed with a flask.
  • this thin film is added to a suitable aqueous medium (physiological saline, buffer solution, phosphate buffered saline, etc.) and stirred with a stirrer.
  • a suitable aqueous medium physiological saline, buffer solution, phosphate buffered saline, etc.
  • ribosomes having a small particle size are further dispersed using an ultrasonic emulsifier, a pressurized emulsifier, a French press cell crusher, or the like.
  • the ribosome formation is promoted by treating the liquid in which the amphipathic substance and the like and the compound of the present invention necessary for the preparation are dispersed in an aqueous medium with a membrane filter, and the nanosphere ribosome (ultralipid microparticle; (A particle diameter of about 25 to 50 nm).
  • the ribosome may be subjected to a fractionation treatment such as ultrafiltration, centrifugation, or gel filtration to remove unsupported drugs.
  • 3-methyloctylglucoside, L-tyrosine-17-amido41-methylcoumarin, phenylaminoaminomannoside or sulfatide can be used.
  • the compound of the present invention By allowing the compound of the present invention to be supported on a liposome having a glucose residue, a tyrosine residue, a mannose residue, or a sulfatide on a membrane, which is obtained by adding the compound, it is easy to penetrate the blood-brain barrier. (For the method itself, see JP-A-4-69332).
  • a suppository base such as mono-, di- or triglyceride of cocoa fatty acid, polyethylene glycol or the like is added to the compound of the present invention, which is then heated and melted, poured into a mold and cooled.
  • the compound of the present invention can be obtained by dissolving the compound of the present invention in polyethylene glycol, soybean oil or the like, and coating the resultant with a gelatin film.
  • the external preparation for skin can be obtained by adding white petrolatum, beeswax, liquid paraffin, polyethylene glycol and the like to the compound of the present invention, heating and kneading as necessary.
  • the tape agent can be obtained by kneading the compound of the present invention with a pressure-sensitive adhesive such as rosin or an alkyl acrylate polymer, and spreading this on a nonwoven fabric or the like.
  • Inhalants can be prepared by dissolving the compound of the present invention in a propellant such as a pharmaceutically acceptable inert gas. Are dispersed and can be obtained by filling the pressure-resistant container.
  • the method of administering the drug containing the compound of the present invention as an active ingredient is not particularly limited.
  • intramuscular injection, intravenous injection, subcutaneous injection or intraperitoneal injection Internal injections are preferred.
  • a method of injecting a ribosome preparation or a lipid emulsion preparation is preferred.
  • the dose is determined appropriately according to the administration method, age of the patient, health condition, body weight, etc., but is generally 0.25 to 200 mg / kg, preferably 0.5 to 10 Omg / kg.
  • the dose is given once or more times a day.
  • a solution of L-Threo-PDMP hydrochloride dissolved in a nonionic surfactant (Myrj52) was injected intraperitoneally into ICR mice (male, 6 weeks old, weighing about 28 to 30 g).
  • the LD 50 value was 350 mg / kg.
  • a solution prepared by dissolving (125 mg / ml) DL-Threo PDMP hydrochloride and DL-Erythro PDMP hydrochloride in DMS0 was used for ICR mice (male, 8 weeks old, weighing about 38 to 40 g). Administered intraperitoneally.
  • the LD 50 values were about 250 mg / kg for DL-Threo PDMP and about 700 mg / k for DL-erythro-PDMP.
  • L-Threau PDMP hydrochloride and DL-Treaux PDMP hydrochloride Solutions of each of the salts dissolved in a nonionic surfactant (Myrj 52) were continuously administered (intraperitoneally) to ICR mice at a rate of 10 Omg / kg / day (in terms of PDMP hydrochloride) for 10 days. None of the compounds showed any decrease in body weight or neutrophils and eosinophils due to myelosuppression, and no abnormalities were observed after 3 months of observation.
  • FIG. 1 is a graph showing the action of L-treorw PDMP and its analogs having different acyl chain lengths to promote glycolipid biosynthesis.
  • Fig. 2 is a phase-contrast micrograph of a biological form showing the neurite outgrowth-promoting effect of L-letro-PDMP on primary cultured rat brain neurons (the solid line in the photograph indicates the cell scale). And the total length is 100 nm).
  • FIG. 3 is a graph showing the promoting effect of L-treaux PDMP on neurite outgrowth of primary cultured rat brain neurons.
  • Figure 4 shows the effect of L-treo-PDMP and D-treo-PDMP on the frequency (%) of intracellular Ca2 + fluctuations reflecting the number of synapses formed in primary cultured rat brain neurons. It is a graph.
  • D-Threor P DM P used in the following examples or All L-Threau PDMPs are hydrochlorides, but similar results are obtained when other pharmaceutically acceptable salts are used.
  • the fetus On day 18 of pregnancy of the rat, the fetus is removed, and the basal forebrain of the fetus is aseptically removed and cut into small pieces with scissors.
  • papine phosphate buffer containing 0.02% L-cystine, 180% U-papine, 0.02% ⁇ serum albumin and 0.5% glucose
  • PH 7.4 at 37 ° C for 30 minutes
  • the cells were suspended in DF medium containing serum.
  • the nerve cell suspension is placed in a 24-well culture plate (Falcon, Brimaria) at 1 ⁇ 10 6 cells / well, followed by addition of 20 ⁇ l of D-Threo-PDMP or L-Threo PDMP.
  • Primary culture of neurons was performed for 3 days. After completion of the culture, the cells in each well were washed with a phosphate buffer and collected with a rubber policeman.
  • the ganglioside fraction was extracted by adding form-form methanol / water (1: 2: 0.8) and shaking for 5 minutes. The ganglioside fraction was dissolved in 50 ⁇ 1 of water, and the amount of ganglioside-binding sialic acid was determined by the method of Hara et al. (Anal. Biochem.
  • Example 2 B 16 melanoma cells derived from neural ectoderm were placed in a 12-well culture plate at 1 ⁇ 10 5 cells in a Z-well, and cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum. After incubation for 5 hours, the medium was exchanged with the same culture medium containing 5 ⁇ L of L-treo-PDM ⁇ or an analog having its acyl chain length changed, and 3 H-galactose was added. After 24 hours, the medium was removed, washed with 1 ml of a phosphate buffer containing 0.1% EDTA, 1 ml of 0.25% trypsin was added, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 5 minutes.
  • Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum After incubation for 5 hours, the medium was exchanged with the same culture medium containing 5 ⁇ L of L-treo-PDM ⁇ or an analog having its acyl chain
  • Non label B 1 6 melanoma cells when you recover cells (1. 4 X 1 0 7 cells)
  • cell clumps were obtained.
  • To the cell mass 4 ml of methanol and black form were sequentially added, and all GSL was extracted and dried. The residue was subjected to alkaline hydrolysis with methanol (1: 1) containing 0.2 N sodium hydroxide, neutralized with acetic acid and dried. After the dried matter was dissolved in water, desalting was carried out using Seppak Cartridge C18 (Waters). The adsorbed GSL was eluted with 1 ml of methanol and 4 ml of methanol-form: methanol (1: 1), and then dried under a stream of nitrogen.
  • GSL was purified by a conventional method using acetylation with pyridin monoacetic anhydride, florisil column, and deacetylation (Lipid Res., 12, 257-259, 1971), and then desalted and dried.
  • This purified GSL fraction was dissolved in 50 ⁇ l of chloroform: methanol (1: 1), and 40 ⁇ l thereof was applied to a silica gel plate (TLC), and the form: methanol: ⁇ ⁇ 20 (60: 3 After the development at 5: 8), the positions of glycosyl ceramide, lactosyl ceramide, and ganglioside GIII3 were confirmed by developing the color, scraped off each TLC, and the radioactivity was measured with a liquid scintillation counter. The results are shown in FIG. As is evident from FIG. 1, among the L-threo PD PD ⁇ and the analogs in which the chain length has been changed, the compounds of the general formula (1) in which 11 is 6, 8, 10, and 12 are gangliosides. was found to significantly promote the biosynthesis of.
  • the hippocampus of the rat brain was aseptically excised, treated with papain in the same manner as in Example 1, washed with DF medium, and the nerve cells were cultured at a density of 2 ⁇ 10 4 cells / cm 2 .
  • Coated with poly-L-lysine 9 At the same time as seeding on a 6-well plate, add 5 ⁇ , 20 ⁇ and 40 ⁇ L L-leo PDM ⁇ and culture for 24 hours, fix the nerve cells with paraformaldehyde, and fix the neurites. The extent of extension was observed after recording on a micrograph. As is evident from the micrograph of FIG. 2, L-threo-PDMP has a remarkable neurite outgrowth effect in primary cultures of rat brain nerve cells.
  • the L-threo PDM ⁇ of the present invention and its analog-converted analog chain length according to Examples 1 to 3 significantly increase the level of endogenous gangliosides in nerve cells, thereby causing marked extension of projections to nerve cells. It was strongly suggested that it has a promoting action, that is, a differentiation promoting action.
  • L-threo-PDMP or D-treo-PDMP was added, and the frequency of intracellular Ca 2+ fluctuation was measured to examine the degree of synapse formation.
  • FIG. 4 The results are shown in FIG. 4, and a dose-dependent increase in the number of synapses formed by L-Threo-PDMP was clearly observed. Therefore, it was strongly suggested that L-treorw P DMP is not only effective in promoting neurite outgrowth but also promoting synapse formation, and thus may be effective in treating various neurological diseases.
  • D-threo PDMP which has GSL biosynthesis-inhibiting activity, inhibited synapse formation, endogenous GSLs, especially gangliosides, play important functions in the synapse formation process. There was found.
  • the treatment of the neurological disease of the present invention is performed by using the fetal cerebral cortex on the 16th day of gestation of the rat and performing explant culture by the following method. The effect of the agent was confirmed.
  • the number of the above-mentioned nerve cells in the group to which 10 L / L L-treaux PDMP was administered was about 1.5 times that in the group to which no drug was administered.
  • the neurite outgrowth-promoting effect observed with L-threau PDMP was not observed at all in the group administered with 10 AtM D-treau PDMP.
  • L-Leo-PDMP hydrochloride 100 mg, oleoresin starch 150 mg, light caieous anhydride 50 mg, magnesium stearate 10 mg, and lactose 765 mg were uniformly mixed. This 200 mg was dispensed and filled into hard capsules.
  • L-leutreio PDMP hydrochloride 100 mg, lactose 670 mg, non-starch starch 150 mg, crystalline cellulose 60 mg, and light anhydrous cake 50 mg of an acid was mixed, and a solution of 30 mg of hydroxypropylcellulose in methanol (10% by weight of hydroxypropylcellulose) was added and kneaded, followed by granulation. Next, this was extruded with a screen having a diameter of 0.8 mni to form granules, dried, and then added with magnesium stearate (15 mg) and tableted into tablets in an amount of 200 mg.
  • Propylene glycol was added to 100 mg of L-Threo PDMP hydrochloride to make the total amount 1 Oml, and the L-Threo PDMP hydrochloride was dissolved.After aseptic filtration, 0.2 ml was added. Dispensed into ampoules and sealed.
  • L-erythro-PDMP hydrochloride (10 Omg) was used instead of L-torayaux PDMP hydrochloride to obtain capsules, tablets IJ, and injections.
  • L-treaux PDMP has an effect on central nervous system tissues (the cerebral cortex of the brain and around the hippocampus), it can penetrate the blood-brain barrier by intravenous administration. However, it is required to increase the concentration in the brain.
  • L-Threau P DMP is a fat-soluble substance and has a maximum solubility in physiological saline of 0.5 mg / ml.Solubilized using a surfactant to enable intravenous administration In such a case, it is taken up by the reticuloendothelial tissue before reaching the target organ, and it is not expected that an effective drug concentration will be obtained at the site of action.
  • the present inventor found that central nervous system As a result of examining a method to increase the translocation to the brain (especially in the cerebral cortex and around the hippocampus), as shown in the following experiment, the L-threo-PDMP is contained in the nanosphere liposome. It has been found that this can solve the above problems.
  • the effective concentration of the drug in the brain can be maintained by intravenously administering L-threo-PDMP into the nanosphere ribosome and administering it to the rat.
  • Pharmacokinetic parameters were calculated by the simplex method of the nonlinear least squares program MU LTI. As a result, the elimination half-life was 2.56 minutes (liposome) and 2.77 minutes (saline) in the first phase, and 25.2 minutes (liposome) in the second phase. 7.5 minutes (saline).
  • the simulated continuous intravenous injection (iv injection) of peripheral compartment was performed using the ratio of the blood concentration in the brain in the steady state (60 minutes) of ribosome administration. Note that it can be reached within 1% limit of steady-state concentration in the brain
  • the therapeutic agent for a neurological disease of the present invention promotes neurite outgrowth and synapse formation by increasing the biosynthesis of endogenous GSLs of nerve cells, particularly gangliosides, thereby promoting various diseases of the central nervous system and the peripheral nervous system. It is effective for the treatment of.
  • various central nervous system diseases such as stroke, cerebral infarction, cerebral hemorrhage, cerebral trauma, memory disorders, senile dementia, Alzheimer's disease and Parkinson's disease, which are expected to have therapeutic effects by regenerating nerve fibers, etc.
  • peripheral nervous system diseases such as metabolic disorder polyneuropathy, mechanical neuropathy, and toxic neuropathy.
  • the therapeutic agent for neurological diseases of the present invention can cross the blood-brain barrier (J. Lipid Res., 32, 713-722 (1991)), it can be used as an injection or oral preparation for neurological diseases of the brain. It is valid.
  • nanosphere ribosomes (lipid ultrafine particles) carrying the therapeutic agent for neurological diseases of the present invention are Not only is it possible to increase the blood concentration without being taken up by internal tissues and lower the minimum effective dose required for the onset of the drug effect, but it also crosses the brain-blood barrier about 10 times as much as saline solution, The therapeutic agent for a neurological disease of the present invention is extremely effective when used for treating a neurological disease of the brain.

Description

明 細 書
神経疾患治療剤
(技術分野）
本発明は、 スフィ ンゴ糖脂質の生合成促進物質を有効成分とする 神経疾患治療剤に関する。
(背景）
スフイ ンゴ糖脂質 （以下、 G S Lという） は、 ほ乳動物細胞の細 胞表面膜構成成分として存在しており、 生理活性物質のレセプター 機能や細胞間相互認識機能、 及び細胞間相互作用等を介しての発 生、 増殖、 分化、 癌化及び免疫反応等の細胞機能と密接に関係して いることが知られている。
なかでもガングリオシドはシアル酸を含有する G S Lで、 末梢神 経損傷や中枢神経障害の回復、 すなわち神経の再生促進や神経伝達 過程に活性を持つといわれ、 現在までに神経系の種々の病態モデル に対する外因性ガングリ オシ ドの有効性が検討されている。 既に、 これを利用 した薬剤 と してイ タ リ アでク ロ ナシアル ( CronassialR ) なる薬剤が上市され、 関連する特許出願がなされ ている （特開昭 52- 34912号） 。 しかしながら、 本薬剤、 すなわち 外因性ガングリオシドの投与が原因となり、 抗ガングリオシド抗体 が出現し、 種々の神経症状を呈する臨床例が認められている。 例え ば、 抗 G M 2抗体が出現する筋萎縮性則索硬化症 （Lancet, 337， 1109- 1110 , 1991 ) ゃ抗 G M 1抗体が出現するギラン ♦ バーレ症候 群 （Lancet, 338 , 757 , 1991 ) が報告されている。
現在、 ガングリオシドの機能を探る手法として最も多く使われて いるものは、 実験系に外からガングリオシドを添加するというタイ プのものであるが、 その場合内因性ガングリオシドとの関連が問題 となる。 つまり、 細胞膜に存在する内因性ガングリ才シドが種々の 細胞表面受容体等と既に複合体を形成している中に、 さらにガング リオシドを添加して導きだされる結果は、 内因性ガングリオシドの 真の細胞生理学的意義を常に反映しているとは限らないと考えられ る。 従って、 ガングリオシドの細胞生理学上に於ける本来の役割を 知るためには、 内因性 G S Lの生合成を特異的に変化させる方法が 必要であった。 本発明者等は先に、 セラミ ドのアナログである 1 一 フエ二ルー 2 —デカノィルアミノ ー 3—モルホリノ ー 1 一プロパ ノール （P DM P) を合成し、 D— ト レオー P D M Pがグルコシル セラミ ド生合成酵素を特異的に阻害し、 グルコシルセラミ ドを出発 物質とする全ての G S Lの細胞内含量を著しく減少させることを証 明した （ Lipid. Res. , vol. 28, 565-571, 1987) 。 さらに、 D — ト レオー P D M Pによって G S L含量が低下し、 このこ と によ り神経突起の伸展が抑制されるこ とが報告されている （ Biochem.， 110, 96-103, 1991 ) 。
—方、 D— ト レオー P D M Pの光学対掌体である Lー ト レオー P DM Pは G S Lの生合成を促進する可能性があることを我々は見 いだしている （J. Cell. Physiol. , 141， 573-583 (1989) ) 0 しかし ながら、 Lー トレオー P DM Pが神経細胞の内因性ガングリォシド レベルを増加させるか否か、 また内因性ガングリオシドの増加が神 経細胞の機能を活性化するかということに関しては全く未知の問題 であり、 検討がなされていなかった。 本発明の目的は、 神経細胞の内因性 G S L、 特にガングリオシド の生合成を促進する薬剤を用いた、 中枢神経系及び末梢神経系の障 害に起因する各種疾患に対する治療剤を提供することにある。
(発明の開示）
本発明者らは、 新しいメカニズムに基づく神経疾患治療薬を開発 すべく種々検討した結果、 特定の 2—ァシルアミノブロパノール誘 導体が G S Lの生合成を促進し、 神経突起伸展及びシナプス形成を 著しく促進することを見いだし、 本発明に到達した。
即ち、 本発明は、 一般式 （ I ) ：
R1 -CH-CH-CH2- ^ ( I )
OH NHCO (CH2)„ CH3
[式中、 R 1 はアルキル、 アルコキシ、 ヒ ドロキシ及びニトロから なる群から選ばれる同一又は異なる 1〜 3個の置換基で置換されて いてもよいフェニル基又はシク口へキシル基を表わすか、 或はアル キル基を表わし、 nは 0〜 1 6の整数を表わす〕 で示される 2 — ァシルアミノブロパノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩
(以下、 本発明化合物ということもある） を有効成分として含有す る末梢神経系又は中枢神経系の障害に起因する神経疾患の治療剤で ある。
また、 本発明は上記一般式 （ I ) で示される 2—ァシルアミノブ 口パノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩のスフィ ンゴ糖脂 質の生合成促進、 神経突起伸展促進および Zまたはシナプス形成促 進に対して有効な量を、 末梢神経系又は中枢神経系の障害に起因す る神経疾患に罹患した哺乳動物に投与することからなる神経疾患の 治療法に関する。
また、 本発明は、 末梢神経系又は中枢神経系の障害に起因する神 経疾患の治療剤を製造するための、 上記一般式 （ I ) で示される 2ーァシルァミノプロパノール誘導体もしくは薬学的に許容される その塩、 又はそれらを含有する薬剤組成物の使用に関する。
さらに、 本発明は上記一般式 （ I ) で示される 2—ァシルァミノ プロパノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩と リン脂質とか ら少なく とも構成されるリポソ一ム製剤組成物に関する。
以下、 本発明を具体的に説明する。
上記一般式 （ I ) 中、 R 1 のフユニル基又はシクロへキシル基の 置換基としてのアルキル又はアルコキシの炭素数は 1〜4が好まし い。 R 1 のアルキル基の炭素数は 6〜 1 5が好ましく、 1 0〜 1 5 が最も好ましい。 アルキル基としてはへキシル、 ヘプチル、 ォクチ ル、 ノニル、 デシル、 ゥンデシル、 ドデシル （ラウリル） 、 ト リデ シル、 テトラデシル （ミ リスト リル） 、 ペンタデシル等が例示され る。 nは 0〜 1 6の整数であり、 好ましくは 4〜 1 6の整数である が、 6〜； I 2が最も好ましい。
上記式 （ I ) で示される化合物のうち特に好ましいものは、 nが 6〜 1 2の 1 一フエ二ルー 2—ァシルアミノ ー 3—モルホリ ノ ー 1 一プロパノールであり、 最も好ましいのは 1 一フエ二ルー 2—デカ ノィルアミノ ー 3—モルホリノ ー 1 一プロパノール （以下 P D M P という） である。 本発明化合物には立体異性体が存在するが、 その 立体異性体のいずれも使用でき、 またラセミ混合物等の異性体の混 合物も使用できる。 具体的には、 D— ト レオ （threo)体 （ 1 R , 2 R ) Lー ト レオ体 （ 1 S 2 S ) D L— ト レオ体、 D— エリ トロ （ erythro)体 （ I S , 2 R ) 、 L—エリ トロ体 （ 1 R 2 S ) D L—エリ トロ体を挙げることができる。 と りわけ Lー ト レオ体 （ 1 S , 2 S ) は糖脂質生合成促進効果を有する点で好まし い。 上記式 （ I ) で示される化合物は公知物質であり （米国特許第 5 , 04 1 , 44 1号明細書、 特開平 1 一 2 54 6 2 3号公報） 、 例えば、 J. Lipid. Res. , 28, 565-571, (1987) 及び J. Biochem. , 111, 191-196 （1992)に記載された次の方法で合成することができ る。
CH20 HN 0
R1- CO - CH2 \ _ / / ~ \
I ► R1 - CO— CH—CH2 - N 0
NHCO (CH2)n CH3 1 ^ ~ ^
NHCO (CH2)„ CH3
NaBH4 / ~ \
► R CH - CH - CH2 - ^ 0
OH NHCO (CH2)n CH3 得られた 4つの異性体の混合物をク口口ホルム Zエーテルで分別 結晶化して D L— ト レォ体及び D L—エリ トロ体をそれぞれ得るこ とができる。 さらに、 D L— ト レォ体をジベンゾィル— D—酒石酸 又はジベンゾィルー L一酒石酸の塩として結晶化して、 D— 卜 レオ 体又は L— トレォ体をそれぞれ得ることもできる。 上記式 （ I ) で示される化合物の薬学的に許容される塩と して は、 塩酸、 リ ン酸、 硫酸、 硝酸、 ギ酸等の無機酸塩 ； 酢酸、 クェン 酸、 乳酸、 リ ンゴ酸、 シユウ酸、 マレイ ン酸、 フマル酸、 コハク 酸、 ト リ フルォロ酢酸、 メタンスルホン酸、 P — トルエンスルホン 酸等の有機酸の塩を挙げることができる。
一般式 （ I ) で示される 2—ァシルァミノプロパノール誘導体又 は薬学的に許容されるその塩の有効量を末梢神経系又は中枢神経系 の障害に起因する神経疾患に罹患した、 ヒ トを含む哺乳動物に投与 することによって、 該動物を治療することができる。 代表的な疾患 として、 例えば、 脳卒中、 脳梗塞、 脳出血、 脳外傷、 記憶障害、 老 年痴呆、 アルツハイマー病やパーキンソン氏病などの、 神経線維が 再生されることによって治療効果が期待される種々の中枢神経系疾 患； ならびに、 例えば、 代謝障害性多発性神経障害、 機械的神経障 害、 毒性神経障害などの種々の末梢神経系疾患が挙げられる。
製剤
本発明化合物を、 担体、 賦形剤、 希釈剤、 その他の添加物と共 に、 経口又は非経口的に投与する製剤とすることができる。 また、 本発明化合物は、 脳血液関門を通過し得る （丄 Lipid Res . , 32， 713-722 (1991 ) ) ことから、 注射剤や経口剤として脳の神経疾患に 対しての有効性が期待出来る。 特に、 本発明化合物を担持させた、 脂質超微粒子 （リ ピッ ドナノスフェア） 等の微小径のリボソーム製 剤または脂質ェマルジヨン製剤は、 生理食塩水溶液に比べて 1 0倍 程度脳血液関門を通過するので、 本発明の薬剤を脳の神経疾患の治 療に使用する場合、 有効である。
経口製剤としては、 散剤、 顆粒剤、 カプセル剤、 錠剤等の固形製 剤 ； シロップ剤、 エリキシル剤、 乳剤等の液状製剤を挙げることが できる。
散剤は、 例えば乳糖、 デンプン、 結晶セルロース、 乳酸カルシゥ ム、 リ ン酸水素カルシウム、 メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、 無水ケィ酸等の賦形剤と混合して得ることができる。 顆粒剤は、 上 記賦形剤のほか、 必要に応じ、 例えば白糖、 ヒ ドロキシプロピルセ ルロース、 ポリ ビュルピロリ ドン等の結合剤や、 カルボキシメチル セルロース、 カルボキシメチルセルロースカルシウム等の崩壊剤を さらに加え、 湿式又は乾式で造粒して得ることができる。 錠剤は、 上記散剤又は顆粒剤をそのまま、 或はステアリ ン酸マグネシウム、 タルク等の滑沢剤を加えて打錠して得ることができる。 また、 上記 錠剤又は顆粒剤は、 ヒ ドロキシプロピルメチルセルロースフタレー ト、 メタアクリル酸メチルコポリマー等の腸溶性基剤で被覆し、 或 はェチルセルロース、 カルナゥバロウ、 硬化油等で被覆し、 これら を腸溶性或は持続性製剤にすることができる。 硬カプセル剤は、 上 記散剤又は顆粒剤を硬カプセルに充填して得ることができる。 また 軟カプセル剤は、 本発明化合物を、 グリセリン、 ポリエチレングリ コール、 ゴマ油、 ォリーブ油等に溶解し、 これをゼラチン膜で被覆 して得ることができる。 シロップ剤は、 白糖、 ソルビトール、 グリ セリ ン等の甘味剤と上記一般式で示される化合物又はその塩とを、 水に溶解して得ることができる。 また、 甘味剤及び水のほかに、 精 油、 エタノール等を加えてエリキシル剤とするか、 或はァラビヤゴ ム、 トラガント、 ポリソルベー卜 8 0、 カルボキシメチルセルロー スナト リ ゥム等を加えて乳剤又は懸濁剤にすることもできる。 また これらの液状製剤には必要に応じ、 矯味剤、 着色剤、 保存剤等を加 えることができる。
非経口製剤としては、 注射剤、 直腸投与剤、 ペッサリー、 皮膚外 用剤、 吸入剤、 エアゾール剤、 点眼剤等を挙げることができる。 注射剤は、 本発明化合物に、 塩酸、 水酸化ナト リウム、 乳酸、 乳 酸ナト リウム、 リン酸一水素ナト リ ウム、 リン酸二水素ナト リ ウム 等の pH調整剤 塩化ナト リ ウム、 ブドウ糖等の等張化剤 ； 及び注射 用蒸留水を加え、 滅菌濾過した後、 アンプル等に充填して得ること ができる。 またさらにマンニトール、 デキスト リ ン、 シクロデキス ト リ ン、 ゼラチン等を加えて真空凍結乾燥し、 用時溶解型の注射剤 とすることができる。 また本発明化合物に、 レシチン、 ポリ ソル ペート 8 0、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の乳化剤を加えた 後、 水中で乳化させた注射用乳剤にすることもできる。
また、 注射剤としては溶解性、 目標臓器への移行速度の改善が可 能なリボソーム製剤が挙げられる。 特に、 ナノスフヱアーリポソ一 ム （脂質超微粒子） は網内系組織に取り込まれることなく血中濃度 を高め、 薬効発現に必要な最小有効投与量を低下させることができ るだけでなく、 脳血液関門を通過しやすいので、 脳の神経疾患の治 療に使用する場合、 好適である。 リボソーム製剤は公知のリポソ一 ム調製法 ( C. G. Knight, Liposomes： From Physical Structure to Therapeutic Applications, pp.51-82, Elsevier, Amsterdam, 1981 ; Pro Natl. Acad. Sci. , USA, 75, 4194, 1978 ) に従って調製す ることができる。
すなわち、 リボソーム膜を形成する両親媒性物質としては、 天然 リ ン脂質 （卵黄レシチン、 大豆レシチン、 スフイ ンゴミエリ ン、 ホ スファチジルセリ ン、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジ ルイノシトール、 ジホスファチジルグリセロール、 ホスファチジル エタノールァミ ン、 スフイ ンゴミエリ ン、 カルジォリ ピンなど） 、 合成リ ン脂質 （ジステアロイルホスファチジルコリン、 ジパルミ ト ィルホスフ ァチジルコ リ ン、 ジパルミ トイルホスフ ァチジルエタ ノールァミンなど） などのリ ン脂質を使用する。 また、 膜の安定 性、 流動性、 薬剤の膜透過性を改善するために、 コレステロール類 (コレステロール、 エルゴステロール、 フィ トステロール、 シトス テロール、 スチグマステロールなど） 、 リボソームに負荷電を付与 するこ とが知られている物質 （ホスフ ァチジン酸、 ジセチルホス フェートなど） 、 正荷電を付与することが知られている物質 （ステ ァリルァミン、 ステアリルアミンアセテート） 、 酸化防止剤 （ トコ フニロールなど） 、 油性物質 （大豆油、 綿実油、 ゴマ油、 肝油等） など、 公知の種々の添加剤を使用しても良い。
リボソームの製造は、 例えば以下の方法で行うことができる。 上 記両親媒性物質および添加剤と本発明化合物を有機溶媒 （クロロホ ルム、 ジクロロメタン、 エタノール、 メタノール、 へキサンなどの 単独または混合溶媒） にそれぞれ溶解し、 両溶液を混合し、 フラス コなどの容器中において不活性ガス （窒素ガス、 アルゴンガスな ど） 存在下で有機溶媒を除去し、 器壁に薄膜を付着させる。 次い で、 この薄膜を適当な水性媒体 （生理食塩水、 緩衝液、 リ ン酸緩衝 生理食塩水など） に加え、 攪拌機で攪拌する。 小粒径のリボソーム を得るためには、 超音波乳化機、 加圧型乳化機、 フレンチプレス細 胞破砕機などを用いてさらに分散させる。 このようにリボソーム化 に必要な両親媒性物質等と本発明化合物が水性媒体に分散した液を メ ンブランフィ ルター処理することによってリボソーム化が進行 し、 粒系分布が制御されたナノスフ ア一リボソーム （脂質超微粒 子 ； 粒子径 2 5〜5 0 n m程度） を得ることができる。 また、 リボ ソームを限外濾過、 遠心分離、 ゲル濾過などの分画処理に付し、 担 持されなかった薬剤を除去しても良い。
また、 膜形成物質と して上記両親媒性物質、 添加剤のほかに、 3 —才クチルグルコシド、 L—チロシン一 7—アミ ドー 4一メチル クマリ ン、 フエニルァミノマンノシドまたはスルファチドを添加す るこ とによって得られる、 グルコース残基、 チロシン残基、 マン ノース残基またはスルファチドを膜上に有するリポソ一ムに本発明 化合物を担持させることによって、 脳血液関門を透過しやすくする こともできる （方法自体は特開平 4 - 6 9 3 3 2号公報参照） 。 直腸投与剤は、 本発明化合物に、 カカオ脂肪酸のモノ、 ジ又は ト リグリセリ ド、 ポリエチレングリコール等の坐剤用基剤を加えた 後、 加温して溶融し、 これを型に流し込んで冷却するか、 或は本発 明化合物を、 ポリエチレングリ コール、 大豆油等に溶解した後、 ゼラチン膜で被覆して得ることができる。
皮膚外用剤は、 本発明化合物に、 白色ワセリ ン、 ミツロウ、 流動 パラフィ ン、 ポリエチレングリ コール等を加え、 必要に応じ加温 し、 混練して得るこ とができる。 テープ剤は、 本発明化合物に、 ロジン、 ァクリル酸アルキルエステル重合体等の粘着剤を混練し、 これを不織布等に展延して得ることができる。 吸入剤は、 例えば薬 学的に許容される不活性ガス等の噴射剤に、 本発明化合物を溶解又 は分散し、 これを耐圧容器に充填して得ることができる。
投与方法
本発明化合物を有効成分とする薬剤の投与方法は、 特に限定され ないが、 中枢神経系の障害に起因する神経疾患の治療に使用する場 合、 筋肉内注射、 静脈内注射、 皮下注射または腹腔内注射が好まし い。 特に脳の神経疾患の治療に使用する場合、 リボソーム製剤また は脂質ェマルジョン製剤を注射する方法が好ましい。
投与量
投与量は投与方法、 患者の年令、 健康状態、 体重等に応じ適宜 決定するが、 一般には、 0. 2 5〜 2 0 0 mg/kg 、 好ま し く は 0. 5〜 1 0 Omg/kg を一日 1回あるいはそれ以上に分けて投与す る。
急性毒性
Lー トレオ— P DM P塩酸塩を非ィォン性界面活性剤 （M y r j 5 2 ) に溶解した溶液を、 I C Rマウス （雄、 6週齢、 体重約 2 8〜 3 0 g ) の腹腔内に投与した。 L D 50値は 3 5 0 mg/kg で めった。
D L - ト レオー P D M P塩酸塩及び D L -エリ トロー P D M P 塩酸塩を D M S 0に溶解 （ 1 2 5 mg/ml)した溶液を I C Rマウス (雄、 8週齢、 体重約 3 8〜4 0 g ) の腹腔内に投与した。 L D 50 値は、 D L - トレオー P DM Pが約 2 5 0 mg/kg 、 D L—エリ トロ 一 P DM Pが約 7 0 0 mg/k であった。
―般母性
Lー トレオー P D M P塩酸塩および D L - ト レオー P D M P塩酸 塩を、 それぞれ非イオン性界面活性剤 （Myrj 52)に溶解した溶液を I C Rマウスに 1 0 Omg/kg/日 （上記 P D M P塩酸塩換算） の割合 で 1 0日間連続投与 （腹腔内） した。 いずれの化合物についても体 重減少、 骨髄抑制による好中球、 好酸球等の減少は全く認められ ず、 3箇月にわたる観察の結果異常は全く認められなかった。
(図面の簡単な説明）
図 1 は、 Lー トレオー P D M P及びそのァシル鎖長の異なる類縁 体の糖脂質生合成促進作用を示すグラフである。
図 2 は、 初代培養ラ ッ 卜脳神経細胞に対する L 一 卜 レオー P DM Pの神経突起伸展促進効果を示す生物形態の位相差顕微鏡写 真である （写真中の実線は細胞のスケールを示すものであり全長が 1 0 0 nmを示す） 。
A ： コン トロール
B ： 5 jLi M L一 卜 レオー P DM P添カロ
C ： 2 0 M Lー ト レオー P DM P添カロ
D ： 4 0 Μ Lー ト レオー P D M P添加
図 3は、 初代培養ラッ 卜脳神経細胞の神経突起伸展に対する L一 卜レオー P DM Pの促進効果を示すグラフである。
図 4は、 初代培養ラッ ト脳神経細胞のシナプス形成数を反映した 細胞内 C a 2 +の変動の頻度 （％) に対する L一 卜レオー P DM P及 び D— トレオー P DM Pの影響を示すグラフである。
(発明を実施するための最良の形態）
以下、 本発明の実施例を示すが、 本発明はこれに限定されるもの ではない。 なお、 以下の実施例で使用した D— トレオー P DM P又 は Lー トレオー P DMPは全て塩酸塩であるが、 他の薬学的に許容 される塩を使用した場合も同様の結果が得られる。
実施例 1
ラヅ 卜の妊娠 1 8日目胎児を取り出し、 その胎児の前脳基底部 を無菌的に摘出し、 ハサミで小片にする。 これをパパイ ン処理後 ( 1 8 0 Uのパパイ ンを含有する 0. 0 2 % L—システィ ン、 0. 02 %ゥシ血清アルブミン及び 0. 5%のグルコースを含んだ リ ン酸緩衝液、 pH7. 4、 の中で 37°C、 30分間） 、 ダルベッコ 改変イーグル培地とハム F 1 2培地の 1対 1の混液 （ D F培地） で 洗浄し、 5%ゥシ胎児血清、 5%ゥマ血清を含む D F培地に懸濁し た。 この神経細胞懸濁液を 24穴培養プレート （Falcon, ブライマ リア） に 1 X 1 06 細胞 /穴で入れ、 続いて 20 μΜ の D—トレオ 一 P DMP又は Lー ト レオー P DMPを添加し、 3日間神経細胞の 初代培養を行った。 培養終了後、 リ ン酸緩衝液で各々の穴の細胞を 洗浄し、 ラバーポリスマンで回収した。 さらに、 ガングリオシド画 分をクロ口ホルム メタノール 水 （ 1 ： 2 ： 0. 8) を加えて 5 分間振盪するこ とによ り抽出した。 このガングリ.オシ ド画分を 50 Μ 1 の水に溶解し、 ガングリオシド結合性シアル酸量を原らの 方法 （Anal. Biochem. 179， 162-166, 1989)により測定し、 ガング リオシ ド含量と した。 その結果を無添加群 （ コ ン ト ロール） を 1 00 %として試験群と比較し、 表 1に示した。 表 1 D— トレオー P DM P及び Lー トレオー P DM Pの 初代培養ラッ ト脳神経細胞のガングリオシド含量に 対する影響 ガングリオシド含量 コン トロール 1 00 %
D - トレオー P DM P 6 3. 4 %
Lー トレオー P DM P 1 2 7. 1 %
2 0 の D— トレオー P D M P処理では予想どおりグルコシル セラミ ド生合成酵素の阻害に基づくガングリオシドレベルの減少が 明らかに認められた。 一方、 2 0 μΜ の L一 トレオー P DM Pで 3 日間の処理を行った神経細胞ではガングリオシドレベルがコントロ ールより約 3 0 %増加していた。 従って、 Lー トレオー P DM Pは ラッ ト脳神経細胞に対して G S L生合成促進効果を有しており、 内 因性ガングリォシドのレベルを上昇させることが判明した。 実施例 2 神経外胚葉由来の B 1 6メラノーマ細胞を 1 2穴培養プレートに 1 X 1 05 細胞 Z穴で入れ、 1 0 %ゥシ胎児血清を含むダルべヅ コ改変イーグル培地で 2 4時間培養後、 5 μ Μ の L一 ト レオー P DM Ρ又はそのァシル鎖長を変換した類縁体を含む同培養液で培 地交換し、 3H—ガラク ト一スを加えた。 24時間後に培地を除去 し、 0. 1 % E D T Aを含むリ ン酸緩衝液 1 mlで洗浄し、 0. 2 5 % ト リプシン 1 mlを加え、 3 7 °Cで 5分間放置した。 細胞を回収す る際に非ラベルの B 1 6メラノーマ細胞 （ 1. 4 X 1 07 細胞） を 加え、 リ ン酸緩衝液で洗浄後、 細胞塊を得た。 細胞塊に 4mlのメタ ノールとクロ口ホルムを順次加え、 全 G S Lを抽出し、 乾固した。 残さを 0. 2 N 水酸化ナト リウムを含むクロ口ホルム ： メタノール ( 1 : 1 ) でアルカリ加水分解し、 酢酸で中和後、 乾固した。 乾固 物を水に溶解後、 セップパックカート リ ッジ C 1 8 ( Waters) によ り脱塩した。 メタノール 1 ml及びクロ口ホルム ： メタノール （ 1 ： 1 ) 4 mlで吸着した G S Lを溶出させた後、 窒素気流下で乾固し た。 次にピリ ジン一無水酢酸によるァセチル化、 フロ リジルカラ ム、 脱ァセチル化による常法 （ Lipid Res. , 12, 257-259, 1971) で G S Lを精製後、 脱塩、 乾固した。 この精製 G S L画分を クロ口ホルム ： メタノール （ 1 ： 1 ) 50 μ1 に溶解し、 その 40 μ ΐ をシリカゲルプレート （T L C ) に付し、 クロ口ホルム ： メタ ノール ： Η 2 0 ( 60 : 3 5 : 8 ) で展開した後、 ョード発色でグ ルコシルセラミ ド、 ラク トシルセラミ ド、 ガングリオシド G Μ 3の 位置を確認し、 各々 T L Cからかき取り、 その放射能を液体シンチ レーシヨ ンカウンターで測定した。 その結果を図 1に示した。 図 1 から明らかなように Lー トレオー P D Μ Ρ及びそのァシル鎖長を変 換した類縁体の中で、 一般式 （ 1 ) の 11が6、 8、 1 0及び 1 2の 化合物は、 ガングリオシドの生合成を著しく促進させることが判明 した。
実施例 3
生後 0日ラッ ト脳の海馬体を無菌的に摘出し、 これを実施例 1 と 同様にパパインによる酵素処理後、 D F培地で洗浄し、 神経細胞を 2 X 1 04 細胞/ cm2の密度でポリ ー L一リジンで被覆しておいた 9 6穴プレートに蒔く と同時に、 5 μ Μ 、 2 0 Μ および 4 0 ΑΙ Μ L一卜レオー P D M Ρをそれぞれ添加して 2 4時間培養後、 パラホ ルムアルデヒ ドで神経細胞を固定し、 神経突起伸展の程度を顕微鏡 写真に記録後観察した。 図 2の顕微鏡写真で明らかなように L一ト レオ— P D M Pは、 ラッ 卜脳神経細胞の初代培養において著しい神 経突起伸展作用を示している。
さらに、 図 3に示したように神経突起の長さを各々の実験群 4枚 の写真を用いて計測し、 統計処理を行うと、 L一卜レオ— P D M P は広い濃度範囲 （ 1〜4 0 μΜ ) にわたつて Ρ < 0 . 0 0 5の有意 差で神経突起伸展を促進することが明らかになった。
従って、 実施例 1〜 3により本発明の Lー トレオー P D M Ρ及び そのァシル鎖長を変換した類縁体は、 神経細胞の内因性ガングリォ シドレベルを増加させる作用によって、 神経細胞に対し著明な突起 伸展促進作用、 即ち分化促進作用を有するこ とが強く示唆され た。
実施例 4
( 1 ) 最近、 本発明者らは、 ヒ ト成熟脳でもシナプス結合のダイナ ミ ッ クな変化が起こ り、 回路外シナプスの選択的除去と回路内 シナプスのシナプス結合数の増加がヒ 卜長期記憶のメ力二ズムで あるとする "tracing circuit " モデルを提唱した （Kuroda Y. , Neurochem. Intern. , 14， 309-319, 1989 ) 。
また、 シナプス形成を比較的簡便に測定できる方法と して F u r a - 2を用いた神経細胞内 C a 2 +の多点観察系が開発され、 シナプス形成数と同期した細胞内 C a 2+変動の頻度は正比例してい るこ とが確認されている （Br. J. Pharmacol.， 89， 191-198, 1986; Neurosci. Lett. , 78, 69-74, 1987) 。 我々は、 この方法を 用いてラヅ 卜大脳皮質神経細胞間のシナプス形成に及ぼす L一 トレ ォー P DM P及び D—ト レオー P DM Ρの影響を検討し、 その結果 を以下に示す。
ラッ トの妊娠 1 8〜 1 9日の胎児の大脳皮質の神経細胞を、 実施 例 1 と同様にパパインによる酵素処理で細胞を単離 ·培養した。 培 養初日から L一 トレオー P DM Pまたは D—ト レオー P DM Pを添 加し、 細胞内 C a 2+変動の頻度を測定することによって、 シナプス の形成度合いを検討した。 その結果を図 4に示したが、 Lー トレオ 一 P DM Pによる用量依存的なシナプス形成数の増加が明瞭に認め られた。 従って、 Lー トレオー P DM Pは神経突起の伸展促進作用 のみならず、 シナプスの形成を促進することから種々の神経疾患の 治療に有効である可能性が強く示唆された。 また、 G S L生合成阻 害作用を有する D—トレオー P DM Pがシナプス形成に対して抑制 的に作用したこ とから、 内因性 G S L、 特にガングリォシ ドが シナプス形成過程において重要な機能を果たしていることが判明し た。
( 2 ) ( 1 ) と同様にラッ トの妊娠 1 6 日の胎児の大脳皮質を用 レ、、 以下の方法で移植培養 （explant culture ) を行うことによつ て、 本発明の神経疾患治療剤の効果を確認した。
すなわち、 J. Neurochem.，61,2155-2163 (1993)に記載された方法 に従い、 上記大脳皮質を小片とし、 無血清培地中でこれを培養して 大脳皮質ニューロンを含む組織の培養を行う際に、 薬剤投与群とし て培地中に L一 ト レオー P D M Pまたは D— ト レオー P D M Pを 5〜2 0 β Μ となるように添加して 2日間培養した。 培養後の薬剤 投与による神経突起伸展 （neurites extention) の効果を、 移植片 (培養組織） 中に存在する神経突起を有する神経細胞の数を測定す ることによって判定した。 '
その結果、 1 0 / M の L一卜レオー P D M P投与群における上記 神経細胞数は、 薬剤非投与群の約 1 . 5倍であった。 一方、 1 0 AtM の D トレオー P D M P投与群では Lー トレオー P D M Pで認 められた神経突起伸展促進効果は全く認められなかった。
以上の通り、 大脳皮質の組織培養においても、 神経突起伸展に対 する L一 トレオー P D M Pの有効性が示されたことから、 ヒ トを含 む哺乳動物に本発明の神経疾患治療剤を投与した際に生体内で同様 の作用を示すことによって、 アルツハイマー病等の大脳皮質ニュー 口ンの退行性変化を伴う神経疾患の治療に有効であることが強く示 唆された。
実施例 5
カプセル剤の製剤例
L一 卜 レオ ー P D M P塩酸塩 1 0 0 mg、 ノ レイ シ ョ デンプン 1 5 0 mg, 軽質無水ケィ酸 5 0 mg、 ステアリン酸マグネシウム 1 0 mg、 及び乳糖 7 6 5 mgを均一に混合し、 この 2 0 0 mgを分取して硬 カプセルに充填した。
錠剤の製剤例
L一 卜 レオー P D M P塩酸塩 1 0 0 mg、 乳糖 6 7 0 mg、 ノ レイ ショデンプン 1 5 0 mg、 結晶セルロース 6 0 mg、 及び軽質無水ケィ 酸 5 0 mgを混合し、 これにヒ ドロキシプロピルセルロース 3 0 mgを メタノールに溶解した溶液 （ヒ ドロキシプロピルセルロース 1 0重 量％) を加えて混練した後、 造粒した。 次に、 これを径 0. 8mniの スク リーンで押出して顆粒状にし、 乾燥した後、 ステアリ ン酸マグ ネシゥム 1 5mgを加え、 2 0 0mgづっ打錠した。
注射剤の製剤例
Lー ト レオー P DM P塩酸塩 1 0 0 mgに、 プロピレングリ コール を全量が 1 Omlになるように加えて Lー トレオー P D M P塩酸塩を 溶解し、 これを無菌濾過した後、 0. 2mlづっアンプルに分注し密 封した。
上記各製造例において、 L - 卜 レオー P D M P塩酸塩の代りに L一エリ トロー P DM P塩酸塩 1 0 Omgを使用し、 カプセル剤、 錠 斉 IJ、 注射剤の各製剤を得た。
実施例 6
リポソーム製剤および体内動態
実施例 3および 4において示された様に、 L一卜レオー P D M P は中枢神経系組織 （脳の大脳皮質および海馬周辺） に対して作用を 示すことから、 静脈内投与で脳血液関門を透過させ、 脳内濃度を上 昇させることが要求される。 Lー トレオー P DM Pは脂溶性物質で あり生理食塩水での溶解性は最大 0. 5mg/ml であることから、 静 脈内投与を可能にするために界面活性剤を使用して可溶化した場合 には目標臓器へ到達する以前に網内系組織に取り込まれ、 作用部位 で有効な薬効濃度を得ることが期待できない。
以上のような事情に鑑みて、 本発明者は血液中から中枢神経組織 (特に脳の大脳皮質および海馬周辺） への移行を上昇させる方法を 検討した結果、 以下の実験に示されるように、 ナノスフヱアーリポ ソ一ム中に L一トレオー P DM Pを含有させることによつて上記の 問題点を解決できることを見出した。
すなわち、 ナノスフエアーリボソーム中に Lー トレオー P DM P を含有させてラッ トに静脈内投与することによって、 脳内における 薬効発現有効濃度を維持できることを見出した。
( 1 ) リボソーム製剤の調製
ホスファチジルコ リ ン （ 1 8 At mol ) 、 ホスファチジルセリ ン
( 3 Aimol ) およびコレステロール （ 9 Atmol ) を含有するクロ口 ホルム溶液と [ 14C] 一 Lー ト レオー P DMP ( 0. 5mg、 5. 5 Ci) のクロ口ホルム ： メタノール （ 2 ： 1 ) 溶液を混合し、 フラ スコ内において窒素気流下で濃縮乾固した。 これに生理食塩水 1 ml を加え、 撹拌し、 1 0分の超音波処理した後、 メ ンブランフィ ル ター ( CORNING Disposable Sterile Syringe Filter, 2 5 mm, 0. 2 u , Cellulose Acetate Membrane) を通過させることによつ て、 Lー トレオー P DM Pを含有するナノスフエアーリポソ一ム液 を調製した。 なお、 ナノスフエアーリボソームを調製する方法自体 は公知の方法である （日本薬学会第 114 年会、 講演要旨集 4、 p.32、 演題番号 13-127 ( 1994年） 参照） 。
( 2 )' 体内動態
上記 （ 1 ) の方法で調製した [14C] 一 Lー ト レオー P D M Pの リボソーム液 （4. 54 ixCi) 及び、 0. 5mg/ml [14C] - L - ト レオー P DM Pの生理食塩水溶液 （ 4. 54 μθί) を大腿静脈よ り ウイスター系雄性ラッ ト （ 1 0週令） に各々 30秒で静脈内投与 し、 経時的に血液を採取した。 血液試料よ り常法 （J. Lipid. Res. , vol.32, 713-722， 1991)に従って Lー トレオー P D M Pを定 量した。 血中濃度の経時変化を調べた結果、 典型的な 2 -コンパ一 トメントモデルで解析できる結果を得た。 非線形最小 2乗法プログ ラム MU L T Iのシンプレックス法により薬動態学的パラメータを 算出した。 その結果、 消失半減期は第 1相目が 2 . 5 6分 （リポ ソーム） 、 2. 7 7分 （生理食塩水） であり、 第 2相目が 2 5. 2 分 （リポソーム） 、 2 7. 5分 （生理食塩水） であった。
上記の結果から、 薬物血中濃度時間曲線下面積 （AUC;area under the concentration curve)はリボソームィ匕により 9倍弱増大し、 リボソーム化により血中での Lー トレオー P DM Pの残留性が上昇 するこ とが認められた。 2 —コンパートメン トモデルの末梢コン パートメント濃度が最大になる時間をシミユレーシヨンにより求め た結果、 1 0分であったので脳内濃度も 1 0分で最大になると予想 された。 そこで、 1 0分とコンパートメントの平衡状態が成立した 6 0分での脳内濃度と血中濃度を測定した。 脳内濃度も常法 （丄 Lipid. Res. , vol.32， 713-722, 1991) に従って Lー ト レオー P D M Pを定量した。 表 2に結果を示す。 表 2 L— ト レオー P D M Pのラッ トへの静脈内投与後の 血中濃度及び脳内濃度 リ ポ ソ 一 ム 生理食塩溶液
1 0分 6 0分 1 0分 6 0分 血中濃度 (pmol/ml) 1789. 1 170. 5
脳内濃度 （ μ Μ ) 25. 7 1. 0 2. 5 ND 血中 Ζ脳内濃度比 0. 0144 0. 0060 0. 0056 ND
表 2の結果から、 脳内濃度もリポソーム化により生理食塩水溶液 投与に比較して 1 0倍程度上昇することが明らかになった。
リボソーム投与の定常状態 （ 6 0分） の脳内濃度ノ血中濃度の比 を用いて末梢コ ンパー トメ ン トの持続静脈注射 （静注） のシユミ レーションをおこなった結果、 4時間の持続静注で定常状態の脳内 濃度の 1 %限界以内に到達できることが明らか
になった。
in vitro 実験により、 神経外胚葉由来の B 1 6メラノーマ細胞 では 2 5 μ Μ 、 2 4時間の培養で、 ラッ トの胎児の大脳皮質の神経 細胞の培養では 4 0 、 8日間の培養で、 ラッ トの胎児の大脳皮 質片の培養では 5〜 2 0 範囲で薬効が認められている。 これら の条件を in vivo 実験にあてはめ、 シミュレーショ ンを行った。 所 定の定常脳内濃度に到達させるために必要な持続静注速度と液量を シユミレ一シヨンにより算出した結果を表 3に示した。 表 3 定常脳内濃度に到達させる持続静注速度と液量
定常状態の リ ボソーム リポソーム液量 （tnl) 生理食塩溶液 生理食塩溶液液量 （ml) 脳内濃度 持続静注速度 持続静注速度
(μ ) (pmol/h) (ml/h) 4時間 * 28時間 （pmol/h) (ml/h) 4時間 28時間
50 177620.0 0.152 0.608 4.256 1672200.0 1.427 5.708 39.956
25 88810.0 0.076 0.304 2.128 836100.0 0.713 2.852 19.964
10 35524.0 0.030 0.120 0.840 334440.0 0.285 1.142 7.980
17762.0 0.015 0.060 0.420 167220.0 0.143 0.572 4.004
*， **： 4時間で定常状態の脳内濃度の 1 %以内に到達
上記シユミレーショ ンの結果から、 生理食塩水溶液では定常脳内 濃度 5 0 M の場合、 3 9. 9 5 6 ml, 2 8時間であり、 2 5 w M の場合、 1 9 . 9 6 4 mlZ 2 8時間であり、 ラッ トの総体液量に対 して持続静注の液量と しては多すぎるこ とが分かる。 一方、 リポ ソーム溶液では定常脳内濃度 5 0 M の場合、 4 . 2 5 6 ml/ 2 8 時間であり、 2 5 μ Μ の場合、 2 . 1 28mlZ 2 8時間であり、 こ の液量は生理的範囲内の投与液量であると言える。
以上の結果により、 Lー トレオー P DM Pをリボソームすること によって、 適正な液量を持続静注することによってヒ トを含む哺乳 動物でも有効な薬効を示すことが明らかである。
(産業上の利用可能性）
本発明の神経疾患治療剤は、 神経細胞の内因性 G S L、 特にガン グリオシドの生合成を上昇させることにより、 神経突起の伸展及び シナプス形成を促進し、 中枢神経系及び末梢神経系の種々の疾患の 治療に有効である。 例えば、 脳卒中、 脳梗塞、 脳出血、 脳外傷、 記 憶障害、 老年痴呆、 アルツハイマー病やパーキンソン氏病などの、 神経線維が再生されることによって治療効果が期待される種々の中 枢神経系疾患などに対して有効である。 また、 例えば、 代謝障害性 多発性神経障害、 機械的神経障害、 毒性神経障害などの種々の末梢 神経系疾患に有効である。
本発明の神経疾患治療剤は、 脳血液関門を通過し得る （ J. Lipid Res., 32， 713-722 (1991) ) ことから、 注射剤や経口剤とし て脳の神経疾患に対しての有効である。 特に、 本発明の神経疾患治 療剤を担持させたナノスフユア一リボソーム （脂質超微粒子） は網 内系組織に取り込まれることなく血中濃度を高め、 薬効発現に必要 な最小有効投与量を低下させることができるだけでなく、 生理食塩 水溶液に比べて 1 0倍程度脳血液関門を通過するので、 本発明の神 経疾患治療剤を脳の神経疾患の治療に使用する場合、 極めて有効で ある。

Claims

請求の範囲
1. 一般式 （ I )
R1 -CH-CH-CH2- N ( I )
OH NHCO (CH2)n CH3
[式中、 R 1 はアルキル、 アルコキシ、 ヒ ドロキシ及びニトロから なる群から選ばれる同一又は異なる 1〜 3個の置換基で置換されて いてもよいフェニル基又はシクロへキシル基を表わすか、 或はアル キル基を表わし、 nは 0〜 1 6の整数を表わす〕 で示される 2 —ァ シルアミノプロパノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩を有 効成分として含有する末梢神経系又は中枢神経系の障害に起因する 神経疾患の治療剤。
2. —般式 （ I ) の nが 6~ 1 6である請求項 1の神経疾患の治療 剤。
3. 一般式 （ I ) の R 1 がフユニル基である請求項 1の神経疾患の 治療剤。
4. 一般式 （ I ) で示される 2 —ァシルアミノブロバノール誘導体 が、 L - 卜レオ体である請求項 1の神経疾患の治療剤。
5. 2 —ァシルァミノプロパノール誘導体が、 1 —フヱニル _ 2 — デカノィルァミノ — 3 —モルホリ ノ — 1 一ブロパノールの L— ト レ ォ体又はその塩である請求項 4の神経疾患の治療剤。
6. 一般式 （ I ) :
R1 -CH-CH-CH2- N O ( I
OH NHCO (CH2)n CH3 〔式中、 R 1 はアルキル、 アルコキシ、 ヒ ドロキシ及びニトロから なる群から選ばれる同一又は異なる 1〜 3個の置換基で置換されて いてもよいフェニル基又はシク口へキシル基を表わすか、 或はアル キル基を表わし、 nは 0〜 1 6の整数を表わす〕 で示される 2—ァ シルアミノブロパノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩のス フィ ンゴ糖脂質の生合成促進、 神経突起伸展促進および Zまたはシ ナプス形成促進に対して有効な量を、 末梢神経系又は中枢神経系の 障害に起因する神経疾患に罹患した哺乳動物に投与することからな る神経疾患の治療法。
7. 一般式 （ I ) の nが 6〜 1 6である請求項 6の神経疾患の治療 法。
8. 一般式 （ I ) の R 1 がフユニル基である請求項 6の神経疾患の 治療法。
9. —般式 （ I ) で示される 2—ァシルァミノプロパノール誘導体 が、 L - ト レオ体である請求項 6の神経疾患の治療法。
10. 2 —ァシルァミノプロパノール誘導体が、 1 —フエ二ルー 2— デカノィルァミノ— 3—モルホリノー 1 —プロパノールの L— ト レ ォ体又はその塩である請求項 9の神経疾患の治療法。
11. 末梢神経系又は中枢神経系の障害に起因する神経疾患の治療剤 を製造するための、 一般式 （ I ) ：
R1 -CH-CH-CH2- N ( I )
Figure imgf000029_0001
[式中、 R 1 はアルキル、 アルコキシ、 ヒ ドロキシ及びニトロから なる群から選ばれる同一又は異なる 1 ~ 3個の置換基で置換されて いてもよいフェニル基又はシクロへキシル基を表わすか、 或はアル キル基を表わし、 nは 0〜 1 6の整数を表わす〕 で示される 2—ァ シルアミノブロパノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩、 又 はそれらを含有する薬剤組成物の使用。
12. —般式 （ I ) の nが 6〜 1 6である請求項 1 1の使用。
13. 一般式 （ I ) の R 1 がフユニル基である請求項 1 1の使用。
14. 一般式 （ I ) で示される 2—ァシルァミノプロパノール誘導体 、 L— 卜レオ体である請求項 1 1の使用。
15. 2—ァシルアミノブロパノール誘導体が、 1 —フエ二ルー 2— デカノィルァミノー 3—モルホリノー 1 一プロパノールの L一 トレ ォ体又はその塩である請求項 1 4の使用。
16. 一般式 （ I ) :
/~\
R1 -CH-CH-CH2- N 0 ( T )
I I N _ / )
OH NHCO (CH2)n CH3
〔式中、 R 1 はアルキル、 アルコキシ、 ヒ ドロキシ及びニトロから なる群から選ばれる同一又は異なる 1〜 3個の置換基で置換されて いてもよいフェニル基又はシク口へキシル基を表わすか、 或はアル キル基を表わし、 nは 0〜 1 6の整数を表わす〕 で示される 2 —ァ シルァミノプロパノール誘導体又は薬学的に許容されるその塩と リ ン脂質とから少なく とも構成される神経疾患の治療用リボソーム製 剤組成物。
17. 一般式 （ I ) の nが 6〜 1 6である請求項 1 6のリボソーム製 剤組成物。
18. 一般式 （ I ) の R 1 がフヱニル基である請求項 1 6のリポソ一 ム製剤組成物。
19. 一般式 （ I ) で示される 2—ァシルァミノプロパノール誘導体 力 s、 Lー トレオ体である請求項 1 6のリポソ一ム製剤組成物。
20. 2 —ァシルァミノプロパノール誘導体が、 1一フエ二ルー 2— デカノィルアミノー 3—モルホリノー 1一プロパノールの L一トレ ォ体又はその塩である請求項 1 9のリボソーム製剤組成物。
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