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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein neues Mittel zur prophylaktischen
und/oder therapeutischen Behandlung der Alzheimerschen Krankheit
(Morbus Alzheimer).
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Die
Alzheimer Krankheit stellt mit 50-70% aller Demenzerkrankungen die
häufigste
neurodegenerative Erkrankung dar. Neben dem persönlichen Leid handelt es sich
bei der Alzheimer Krankheit um ein enormes sozialmedizinisches und
volkswirtschaftliches Problem, denn die klinische Phase kann sich über einen
Zeitraum von mehr als 15 Jahren erstrecken kann, und die betroffenen
Patienten sind während
dieser Zeit häufig
auf fremde Hilfe angewiesen, so dass gewaltige Pflegekosten entstehen.
Hinzu kommt, dass die durchschnittliche Lebenserwartung aufgrund
der verbesserten Hygiene, Ernährung und
medizinischen Versorgung weiter ansteigt. Mit zunehmendem Alter
steigt aber auch die Zahl der Demenzerkrankten. Im Fall der Alzheimer
Krankheit steigt die Prävalenzrate
von 4 % bei den 70- bis 74-jährigen
auf etwa 30% bei den 85- bis 89 jährigen.
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Neuropathologisch
ist die Alzheimer Krankheit (AD) durch das massive Auftreten von
Proteinablagerungen in den Gehirnen von Alzheimer Patienten gekennzeichnet.
Diese Ablagerungen treten in Form von extrazellulären amyloiden
Plaques (amyloid plaque core, APC), intrazellulären Fibrillen in Neuronen (neurofibrillary
tangles, NFT) und als vaskuläres
Amyloid in den Wänden
der Blutgefäße (amyloid of
the congophilic angiopathy, ACA) auf. Hauptbestandteil der amyloiden
Plaques sowie des vaskulären
Amyloid ist das Peptid Aβ.
Die Primärstruktur
von Aβ und
Isolationsverfahren zur Gewinnung von Aβ sind bekannt.
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Aβ entsteht
durch den enzymatischen Abbau des Amyloid-Vorläufer-Proteins APP (amyloid
precursor protein), eines glykosylierten TypI-Transmembranproteins,
welches Mitglied einer Familie homologer Proteine darstellt.
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APP
wird innerhalb seiner Ektodomäne durch
die Sekretasen α und γ oder β und γ zu Aβ-Peptiden
prozessiert.
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Die γ-Sekretase
Prozessierung führt
primär zur
Freisetzung des 40 bzw. 42 Aminosäuren langen Peptids Aβ (Aβ40 und Aβ42). Aβ Peptide,
die sowohl in der Cerebrospinalflüssigkeit (CSF) als auch im Nährmedium
eukaryontischer Zellkulturen nachgewiesen werden können, enden
zum größten Teil
mit Aminosäure
Val40, lediglich ein kleiner Teil endet mit Aminosäure Ala42.
Dennoch kann Aβ42
aufgrund folgender Befunde als die pathogene Aβ Spezies der Alzheimer Krankheit
bezeichnet werden: Erstens, die amorphen und neuritischen Plaques
im Gehirn von Alzheimer Patienten und Down-Syndrom Patienten enthalten überwiegend
Aβ42. Zweitens,
die beiden zusätzlichen
Aminosäuren
Ile41 und Ala42 führen dazu,
dass Aβ42
deutlich hydrophober ist als Aβ40 und
in vitro schneller aggregiert als Aβ40. Drittens, Patienten mit
einer erblichen Form der Alzheimer Krankheit und frühen klinischen
Symptomen besitzen im Vergleich zu Patienten mit sporadischer Alzheimer Krankheit
erhöhte
Aβ42 Konzentrationen
in der Cerebrospinalflüssigkeit.
Viertens, die meisten Mutationen bei der erblichen Form der Alzheimer
Krankheit (FAD Mutationen) führen
zu einer Verschiebung des Aβ42/40
Verhältnisses
zugunsten der längeren
Aβ Spezies.
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Die
bisherigen Therapien der Alzheimer Krankheit basieren auf einem
symptomatischen Ansatz und lassen sich in folgende Strategien gliedern.
- 1. Cholinerge Strategien: Durch Cholinesterase-Hemmer
und Muskarin-M1-Agonisten
wird die Konzentration des Neurotransmitters Acetylcholin kurz-
und mittelfristig erhöht.
Typische Vertreter sind Donepezil, Rivastigmin und Galanthamin. Diese
führen
zu einer kurzfristigen Unterstützung kognitiver
Fähigkeiten.
- 2. Nicht-cholinerge Ansätze
(Nootropika): Hierzu gehören
Neuroprotektiva und Antioxidantien wie Gingko und Vitamin E, zentrale
Calciumblocker (Nimodipin), Glucose-Stoffwechsel-„Enhancer" (Piracetam), Glutamat-Modulatoren (Memantin), Vasotherapeutika
und Antiphlogistika (NSAR).
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Durch
die Gabe der genannten Medikamente kann kurzfristig die Lebensqualität der Patienten gesteigert
werden, jedoch ohne dass dauerhaft die Progression der Krankheit
aufgehalten werden kann. Eine Heilung der Alzheimerschen Krankheit
ist mit den bekannten medikamentösen
Ansätzen
nicht möglich.
Zudem besitzen diese Medikamente teilweise gravierende Nebenwirkungen.
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Bedingt
durch die immense Bedeutung der Alzheimerschen Krankheit wurden
in der Vergangenheit immer wieder chemische oder biochemische Substanzen
publiziert, denen eine therapeutische Wirkung (auch) bei der Behandlung
der Alzheimerschen Krankheit zugeschrieben wurde. So ist auch in der
WO 94/03178, die die Substanz Phosphoryl-L-Serin-N-Acyl-Sphingosin
als universell einsetzbaren Wirkstoff zur Behandlung diverser Krankheiten beschreibt,
die Eignung von Phosphoryl-L-Serin-N-Acyl-Sphingosin zur Behandlung der Alzheimerschen
Krankheit erwähnt.
Nachweise für
eine tatsächliche
Beeinflussung der Alzheimerschen Krankheit durch diese Substanz
sind jedoch nicht beschrieben, ebensowenig diesbezügliche Tests
oder sonstige Beobachtungen, die die Behauptung ihrer Eignung als
Arzneimittel gegen Morbus Alzheimer stützen könnten. Die Lehre der WO 94/03178
betrifft Derivate der Sphingosine, d.h. modifizierte Sphingosine,
und zwar ausschließlich
solche, die als Modifikation Phosphoryl-L-Serin beinhalten. Zur
Herstellung bzw. Synthese dieser Phosphoryl-L-Serin-N-Acyl-Sphingosin
Derivate werden Sphingosine als Ausgangssubstanzen eingesetzt. Die
Herstellung dieser Sphingosin Derivate erfolgt im Zuge eines komplexen,
merhstufigen Syntheseverfahrens, welches Sphingosine als Ausgangsprodukte
voraussetzt.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen,
das eine kausale Therapie der Alzheimerschen Krankheit ermöglicht.
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Eine
Lösung
dieser Aufgabe besteht in dem Mittel der eingangs genannten Art,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass es (a) wenigstens ein Sphingosin
und/oder (b) einen Aktivator der körpereigenen Sphingosine-Synthese
und/oder (c) einen Inhibitor des körpereigenen Sphingosine-Abbaus
als Wirkstoff enthält.
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Die
Erfindung basiert auf der überraschenden
Erkenntnis, daß eine
Erhöhung
der Sphingosine-Konzentration im menschlichen bzw. tierischen Körper, insbesondere
im Nervengewebe (neuronalen Gewebe), zu einer Absenkung der Konzentration
an pathogenem Aβ (insbesondere
auch an Aβ42)
führt bzw.
die Bildung von pathogenem Aβ hemmt.
Aufwendige Modifikationen der Sphingosine, wie sie die WO 94/03
lehrt, sind offenbar nicht nötig
oder sogar nachteilig für
die Morbus Alzheimer bekämpfende Wirkung
von Sphingosinen.
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Die
Erhöhung
des Sphingosine-Spiegels, d.h. der Gesamtkonzentration an (üblicherweise mehreren
verschiedenen) Sphingosinen, kann durch Einnahme bzw. Verabreichung
von Sphingosinen, beispielsweise im Zuge einer entsprechenden Diät, eventuell
als Nahrungsergänzungsstoff,
erfolgen. Alternativ besteht die Möglichkeit, durch die Verabreichung
von Aktivatoren der Sphingosine-Synthese(n) oder von Hemmstoffen
des Sphingosine-Abbaus indirekt die Sphingosine-(Gesamt-)Konzentration im Körper der
betreffenden Alzheimer Patienten oder Alzheimer gefährdeter
Personen zu erhöhen.
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Bei
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
ist wenigstens einer der Wirkstoffe ein Aktivator für wenigstens
eines der körpereigenen
Sphingosine synthetisierenden Enzyme. Zu diesen Enzymen zählen insbesondere
die Serin-Palmitoyl-CoA-Transferase,
die Sphingosine modifizierende Sphingosin-Acyltransferase (EC 2.3.2.24), die Sphingosine
modifizierende Sphingosin-Cholinphosphotransferase
(EC 2.7.8.10), die Acylsphingosin-Desacylase (EC 3.5.1.23), die
Sphingomyelin-Phosphodiesterase (EC 3.1.4.12) und Ceramidasen.
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Bei
einer ebenso bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Mittels
ist wenigstens einer der Wirkstoffe ein Inhibitor wenigstens eines der
körpereigenen
Sphingosine abbauenden Enzyme. Zu diesen abbauenden Enzymen zählen insbesondere
die Ceramidsynthasen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt damit ein sehr effektives, einfach
herzustellendes und unaufwendig zu verabreichendes Mittel – das heißt insbesondere
Arzneimittel oder Nahrungsergänzungsmittel – für einen
kausalen und nicht nur symptomatischen Therapieansatz zur Behandlung
der Alzheimerschen Krankheit zur Verfügung. Sie offenbart darüber hinaus
neue Zielenzyme zur Bekämpfung
der Alzheimerschen Krankheit, nämlich
die am Auf- und Abbau von Sphingosinen beteiligten Enzyme, insbesondere
die Serin-Palmitoyl-CoA-Transferase, die Sphingomyelin-Phosphodiesterase
(EC 3.1.4.12), die Sphingosin-Acyltransferase (EC 2.3.2.24), die Sphingosin-Cholinphosphotransferase
(EC 2.7.8.10) und die Acylsphingosin-Desacylase (EC 3.5.1.23) sowie die Ceramidasen
und Ceramidsynthasen.
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Die
erfindungsgemäße Verabreichung
von Sphingosinen) an die betreffenden Patienten findet vorzugsweise
im Rahmen einer Diät
statt. Die Verabreichung durch eine Diät ist kostengünstig und
für den
Patienten und die Pfleger einfach und schonend. Eine solche Diät eignet
sich außerdem
sehr gut als präventive
Maßnahme
zur Vermeidung einer Erkrankung an Morbus Alzheimer. Bei der Behandlung
von Alzheimer Patienten durch die Gabe von Sphingosinen sind nur
geringe Nebenwirkungen zu erwarten, da es sich um ein körpereigenes
Molekül
handelt.
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Die
Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen und graphischen
Darstellungen näher
erläutert.
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Bei
den graphischen Darstellungen zeigen
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1:
Die schematische Darstellung der proteolytischen Prozessierung des
in die Zellmembran integrierten Amyloid-Vorläufer-Proteins APP [Graues Kästchen:
Aβ Domäne; weißer Balken:
restlicher Teil des APP-Moleküls; hellgrauer
Balken: Transmembrandomäne
(TM)).
Die Schnittstellen der Sekretasen sind durch senkrechte
Pfeile und die griechischen Buchstaben α, β und γ symbolisiert. Die Spaltung
von APP innerhalb der Aβ Domäne durch
die α-Sekretase
führt zur
Freisetzung von α-sekretorischem APP
(sAPPα)
und dem C-terminalen Fragment α-CTF.
Eine nachfolgende γ-Sekretase
Prozessierung des membranständigen α-CTF führt zur
Freisetzung von p3. Die Prozessierung von APP durch die β-Sekretase
führt zur
Bildung von β-sekretorischem
APP (sAPPβ)
sowie der häufigen
C-terminalen Fragmente β1-CTF und β11-CTF. γ-Sekretase
Spaltung der membranständigen
C-terminalen Fragmente β1-CTF
und β11-CTF führt zur
Freisetzung von Asp1-Aβ und
Glu11-Aβ.
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2:
Exposition von primären
Neuronen, die mit Hilfe des Semliki-forest-Virus mit APP695 bzw.
SPA4CT infiziert wurden, mit 10 μM
Sphingosin (D (+) – erythro-1,3-Dihydroxy-2-amino-4-trans-octadecene).
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3:
Strukturformel von Sphingosinen
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Beispiel: Untersuchung
der Wirkung von Sphingosinen auf die Aβ-Konzentration in Zellkultursystemen
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Als
Zellsystem wurden primäre
Neurone aus E14-Mäusen
(Stamm C57B16) präpariert
und in einer Dichte von 106 Neurone pro
10 cm-Zellkulturschale für
7 Tage kultiviert.
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Mit
Hilfe des Semliki-forest-Virus wurden diese primären Neurone mit humanem SPA4CT
infiziert.
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SPA4CT
ist eine verkürzte
Form des APP-Gens und codiert für
ein verkürztes
APP-Proteine, welches
nur noch durch die gamma-Sekretase (γ-Sektretase) prozessiert wird.
Das APP-Gen ist dem Fachmann aus dem Stand der Technik bekannt (Kang,
J., Lemaire, H.-G., Unterbeck, A., Salbaum, J.M., Masters C.L.,
Grzeschik K.-H., Multhaup, G., Beyreuther K., Müller-Hill, B., 1987, Nature,
325: 733-736,
US 20020104104 ).
Gleiches gilt für
das Zielgen SPA4CT (Dyrks, T., Dyrks, E., Mönning, U., Urmoneit, B., Turner,
J., Beyreuther, K., FEBS 13297, 335: 89-93).
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Das
Semliki-forest-Virus als Shuttle-System für das Zielgen SPA4CT ist aus
Tienari et al. bekannt (Tienari, P.J., De Strooper, B., Ikonen,
E., Simons, M., Weidemann, A., Czech, C., Hartmann, T., Ida, N., Multhaup,
G., Masters, C.L., Van Leuven, F., Beyreuther, K., Dotti, C.G.,
1996, EMBO J. 15: 5218-5229), seine Benutzung erfolgte analog der
von Fassbender et al. beschriebenen Vorgehensweise (Fassbender,
K., Simons, M., Bergmann, C., Stroick, M., Lutjohann, D., Keller,
P., Runz, H., Kuhl, S., Bertsch, T., von Bergmann, K., Hennerici,
M., Beyreuther, K. & Hartmann,
T., 2001, Proc Natl Acad Sci LISA. 98: 5856-5861). Auf die Inhalte
der zitierten Publikationen wird ausdrücklich Bezug genommen.
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Die
Neurone wurden in N2-MEM kultiviert. Während des Lipidexpositionsexperimentes
wurden die Neurone in N-MEM inkubiert.
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Verabreichung von Sphingosginen:
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Die
Inkubation mit Sphingosinen (Strukturformel siehe 3)
erfolgte für
24 h in einem Konzentrationsbereich von 10 μM. Das Medium wurde alle 12
h gewechselt.
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Bestimmung des Aβ-Gehalts:
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Zur
Aβ Bestimmung
wurden nach erfolgter Sphingosininkubation die Zellen auf Eis gestellt
und das Zellkulturmedium (konditioniertes Medium) zum Nachweis von
Aβ in Eppendorf-Reaktionsgefässe überführt. Anschließend wurden
die Zellen dreimal mit 5 ml 4°C
kaltem DMEM (Dulbecco's
modified eagles medium) gewaschen. Nach jedem Waschschritt wurde
das Medium verworfen. Danach wurden die Zellen in 5 ml DMEM mit
einem Gummizellschaber von der Zellkulturschale abgelöst und in
ein Falcon-Gefäß überführt und
bei 750 g, 4°C
zentrifugiert. Der Überstand
wurde verworfen, das Zellsediment in 1 ml Lyse-Puffer [150 mM NaCl;
50 mM Tris/HCl pH 7,5 – 8;
1% (v/v) Nonidet-P40 ; 1% (v/v) Triton X-100; 2 mM EDTA; vor dem
Aufschluss der Zellen wurde dem Lyse-Puffer ein Protease-Inhibitor-Mix
(10fach Stocklösung;
Roche, Mannheim) im Verhältnis
1:10 zugegeben] resuspendiert und für 30 min auf Eis inkubiert.
Nach erfolgter Lyse der Zellen wurde die Suspension in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und
die Zellkerne sowie Zelltrümmer
bei 13000 g, 4°C
abzentrifugiert. Der Überstand
wurde in der Immunpräzipitation
eingesetzt.
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Zur
Konzentrationsbestimmung der erhaltenen Proteinlösung (Zell-Lysat) wurde zu
2 μl Probe 200 μl BCA-Reagenz
gegeben, welches durch eine 1:40 Verdünnung einer 4%igen CuSO4 × 5
H2O-Lösung
in der BCA-Lösung
der Firma SIGMA zuvor hergestellt wurde. Nach einer Inkubation für 15 min
bei 37°C
und anschließend
für 15
min bei Raumtemperatur (RT) wurde die Probe bei einer Wellenlänge von 562
nm in einem Spektralphotometer vermessen. Zur Erstellung einer Eichkurve
wurden verschiedene BSA-Verdünnungen
eingesetzt, die analog behandelt wurden. Somit konnte für den Aβ-Nachweis
für jede Probe
eine definierte Proteinmenge eingesetzt werden.
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Zur
Analyse der freigesetzten Aβ Menge wurde
die entsprechende Menge konditioniertes Medium bzw. Zell-Lysat mit
5 μg/ml
Antikörper
W02 (The Genetics Company, 8952 Schlieren, Schweiz), der ein Epitop
im Bereich der Aminosäuren
1 bis 10 der Aβ-Sequenz
erkennt, und mit 20 μl
Protein-G-Sepharose versetzt und über Nacht bei 4°C in einem Überkopfschüttler inkubiert.
Nach erfolgter Antikörperinkubation
wurden die Immunpräzipitate
1 min bei 13000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das
Sediment je einmal mit 1 ml Waschpuffer A (10 mM Tris/Cl pH 7,5;
150 mM NaCl; 0,2% (v/v) Nonidet P-40; 2 mM EDTA), Waschpuffer B
(10 mM Tris/Cl pH 7,5; 500 mM NaCl; 0,2% (v/v) Nonidet P-40; 2 mM
EDTA) und Waschpuffer C (10 mM Tris/Cl pH 7,5) gewaschen. Nach jedem
Waschschritt wurde 1 min bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand
verworfen. Das Sediment wurde nach dem letzten Waschvorgang mit
15 μl Proteinprobenpuffer (187,5
mM Tris/HCl pH 6,8; 6% (w/v) SDS; 30% (v/v) Glyzerin; 15% β-Mercaptoethanol;
0,03% (w/v) Bromphenolblau) versetzt und 10 min bei 95°C erhitzt.
Es wurde erneut 1 min bei 13000 g zentrifugiert und der Überstand
auf ein 10-20%iges Tricine-Gel der Firma Invitrogen aufgetragen.
Nach der elektrophoretischen Auftrennung der Proteine im verwendeten
Gelsystem wurden die Proteine mittels Western Blot Transfer auf
eine Nitrozellulosemembran transferiert. Der 45-minütige Transfer
der Proteine erfolgte im Wet-Blot-Verfahren bei einer Stromstärke von
380 mA bei 4°C
in 1-mal Transferpuffer (25 mM Tris; 192 mM Glycin; 20% Methanol;
0,025% (w/v) SDS; pH 8,7). Die durch SDS negativ geladenen Proteine wandern
in Richtung positiver Ladung (Anode) und werden dadurch auf die
Nitrozellulose transferiert.
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Auf
der Nitrozellulosemembran erfolgte der spezifische Nachweis der
Proteine durch Inkubation mit geeigneten Erst- und Zweitantikörpern. Nach
erfolgtem Transfer der Proteine auf die Nitrozellulosemembran wurde
diese für
5 min in 400 ml PBS (8,1 mM Na2HPO4 × 2
H2O; 1,5 mM KH2PO4; 0,137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; der pH-Wert
liegt bei pH 7,5) in der Mikrowelle gekocht. Um unspezifische Bindungen
des Antikörpers
zu vermeiden, wurde die Membran anschließend mit 10% Milchpulver in
PBS inkubiert. Nach erfolgter Inkubation wurde zweimal für 5 min
mit PBS gewaschen. Anschließend
wurde die Membran 1,5 h mit dem Antikörper W02 (1 μg/ml in PBS)
inkubiert. Danach wurde dreimal für 5 min mit PBS gewaschen.
Die Inkubation mit dem Zweitantikörper (rabbit-anti-mouse der
Firma DAKO), der an das Enzym Meerrettich-Peroxidase gekoppelt ist,
erfolgte für
45 min in 1-mal PBS. Für
die Inkubation wurde der Zweitantikörper 1:5000 in PBS verdünnt. Anschließend wurde
erneut viermal für
10 min mit PBS gewaschen. Die Nitrozellulosemembran wurde 1 min
in Amersham ECL-Lösung
(1:1) inkubiert. Die Membran wurde im Fotolabor auf ECL-Hyperfilm
exponiert und entwickelt.
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Die
Inkubation mit Sphingosin im Konzentrationsbereich von 10μM ergab bei
SPA4CT transfizierten Zellen eine signifikante Absenkung des Aβ Spiegels
um 90% (siehe hierzu 2).